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Die vorliegende Erfindung betrifft ein entzündungshemmendes Arzneimittel
Entzündungshemmende Arzneimittel sind bekannt. In der Literatur sind eine Reihe von Substanzen mit entzündungshemmender Wirkung, wie z. B- Indomethacin, beschrieben, welche als Arzneimittel verwendet werden.
Die entzündungshemmende Wirkung der bekannten Substanzen ist vom therapeutischen Standpunkt jedoch nicht immer zufriedenstellend, da die Anwendung ausreichender Konzentrationen dieser Substanzen wegen des Risikos von Nebenwirkungen limitiert wird Es besteht somit der Bedarf nach neuen entzündungshemmenden Wirkstoffen bzw Arzneimitteln, welche bereits in niedriger Konzentration eine starke entzündungshemmende Wirkung entfalten
Die vorliegende Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, einen entzündungshemmenden Wirkstoff bzw ein entzündungshemmendes Arzneimittel mit einer weit stärkeren entzündungshemmenden Wirkung als jener der bekannten Substanzen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemass dadurch gelöst, dass ein Komplex, gebildet aus 5-Hydroxypyrrolidin-2-on der Formel I
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und Pyrimidin-2, 4-dion der Forme ! t !
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bereitgestellt wird.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die chemischen Verbindungen der Formeln (I) und (11) im erfindungsgemässen Komplex über Wasserstoffbrücken miteinander verbunden sind
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auch ein Arzneimittel, welches den erfindungsgemässen Komplex oder sein pharmakologisch akzeptables Salz enthält
In Standardtests an Ratten hat sich gezeigt, dass der erfindungsgemässe Komplex 2000-fach entzündungshemmender wirkt als die Standardsubstanz Indomethacin. Weiterführende Tests bezüglich der Wirkungsweise ergaben, dass keine direkte Hemmung der Cyclooxygenase und der Lipoxygenase erfolgt Ohne Festlegung auf eine bestimmte Theorie wird angenommen, dass möglicherweise die Freisetzung von Arachidonsäure oder verschiedener Mediatoren durch den erfindungsgemässen Komplex blockiert wird.
Die Erfindung umfasst weiters auch die Verwendung des erfindungsgemässen Komplexes oder seines pharmakologisch akzeptablen Salzes zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Entzündungen.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Komplexes oder seines pharmakologisch akzeptablen Salzes mittels Extraktion aus den gegebenenfalls zerkleinerten Blättern von Jatropha curcas und anschliessende chromatographische Fraktionierung des Extraktes und/oder Ausschütteln des Extraktes mit Wasser bereit.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielhaft noch näher beschrieben, wobei Herstellung und physikalisch-chemische Daten des erfindungsgemässen Komplexes sowie die mit diesem durchgeführten pharmakologischen Untersuchungen erläutert werden.
1. Herstellung des erfindungsgemässen Komplexes
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Der erfindungsgemässe Komplex kann aus Blattem der tropischen Pflanze Jatropha curcas isoliert werden, wie nachfolgend beschrieben wird.
1. 1 Extraktion mit Ethylacetat
Zur Herstellung des Ethylacetat-Extraktes wurden 100 g der frischen Blatter von Jatropha curcas mit Hilfe eines Wiegemessers zerkleinert und anschliessend durch eine neunstündige Soxhlet- Extraktion mit Petrol benzin entfettet
Die entfettete Blätter wurden viermal hintereinander mit je 500 ml Ethylacetat eine Stunde bei Raumtemperatur am Magnetrührer extrahiert. Die erhaltenen Extrakte wurden vereinigt und am Rotavapor bei 30 C eingeengt. Der Blätterrückstand wurde 48 Stunden einer Soxhlet- Extraktion mit Ethylacetat unterzogen.
Der daraus erhaltene Extrakt wurde mit dem Kaltextrakt vereinigt und auf genau 100 ml aufgefüllt
1 2 Isolierung des Komplexes aus dem Ethvlacetat-Extrakt
1 2. 1 Saulenchromatoaraphie an Sephadex LH 20 Saulenmaterial Sephadex LH 20 (Pharmacia Biotech AB, Schweden) Das Säuienmateriai wurde vor Verwendung über Nacht im Elutionsmittel aufgequollen SÅaulendlmensionen Durchmesser 3 cm
Fullhöhe 60 cm
Elutionsmittel Ethylacetat-Methanol 3. 2 Auftragevolumen : 20 ml des Ethylacetat-Extraktes (siehe Punkt 1. 1.) entsprechend 20 g
Droge
Nach 150 ml Vorlauf wurden 30 Fraktionen zu je 20 ml gesammelt Alle Fraktionen wurden durch kaltes Abfönen des Elutionsmittels auf 1 bis 2 ml eingeengt.
Fraktionen mit ähnlichem DC-Fingerprint wurden zu Sammelfraktionen vereinigt und mit Hilfe des Rattenpfotenödem-Tests auf ihre entzündungshemmende Wirkung getestet. Jene Fraktionen, die wirksam waren, wurden als aktive Fraktionen für die weitere Isolierung verwendet.
1 2 2 Säulenchromatoaraphie an Kieselael
Säulenmaterial. Kieselgel 60 (Merck, BRD) Das Säulenmaterial wurde vor Verwendung eine
Stunde in Ethylacetat-Ethylmethylketon (5. 3) aufgeschlämmt
Säulendimensionen : Durchmesser 3 cm
Füllhöhe 60 cm
Elutionsmittel.
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<tb>
<tb>
Ethylacetat-Ethylmethylketon <SEP> 5-3 <SEP> 380mi <SEP>
<tb> Ethylacetat-Ethylmethylketon-Methanol <SEP> 5-3. <SEP> 2 <SEP> 100M1 <SEP>
<tb> Ethylacetat-Ethylmethylketon-Methanol-Ameisensäure <SEP> 53 <SEP> : <SEP> 20, <SEP> 5 <SEP> 400ml <SEP>
<tb>
Auftragevolumen : 20 mi entsprechend 20 g Droge der aktiven Fraktionen nach der Trennung über Sephadex LH 20 (siehe Punkt 1. 2 1. )
Die Substanzen wurden hintereinander mit den oben genannten Elutionsmittein eluiert. Nach einem Vorlauf von 180 ml wurden 40 Fraktionen zu je 10 ml und 20 Fraktionen zu je 20 mi gesammelt Alle Fraktionen wurden durch kaltes Abfönen des Elutionsmittels zur Trockne eingeengt und anschliessend mit 500 pl MethanollEthylacetat 1. 1 aufgenommen.
Fraktionen mit ähnlichem DC-Fingerprint wurden zu Sammelfraktionen vereinigt und mit Hilfe des Rattenpfotenödem-Tests auf ihre entzündungshemmende Wirkung getestet. Jene Fraktionen, die wirksam waren, wurden als aktive Fraktionen für die weitere Isolierung verwendet.
1. 2 3. Säulenchromatographie an Fractoget TSK HW40 (F)
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<tb>
<tb> Saulenmaterial. <SEP> Fractogel <SEP> TSK <SEP> HW40 <SEP> (F) <SEP> (Merck, <SEP> BRD). <SEP> Das <SEP> Säulenmaterial <SEP> wurde <SEP> vor
<tb> Verwendung <SEP> über <SEP> Nacht <SEP> im <SEP> Elutionsmittel <SEP> gequollen. <SEP>
<tb>
Saulendimensionen <SEP> : <SEP> Durchmesser <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> cm
<tb> Füllhöhe <SEP> 40 <SEP> cm <SEP>
<tb> Elutionsmittel <SEP> Wasser-Ethanol <SEP> 3. <SEP> 2 <SEP>
<tb>
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Auftragevolumen. 5 ml der aktiven Fraktionen nach der Trennung über Kieselgel bzw nach
Ausschütteln mit Wasser (siehe unten) entsprechend 10g Droge
Es wurden 20 Fraktionen zu je 10 ml gesammelt und das Lösungsmittel bis auf 500 ul kalt abgefont Fraktionen mit ähnlichem DC-Flngerprint wurden zu Sammelfraktionen vereinigt und mit Hilfe des Rattenpfotenödem-Tests auf ihre entzündungshemmende Wirkung getestet Jene Fraktionen, die wirksam waren,
wurden als aktive Fraktionen für die weitere Isolierung verwendet 1 2 4 Ausschütteln des Ethvlacetat-Extraktes mit Wasser
Als alternativer Reinigungsschritt zur Trennung über Sephadex LH 20 und Kieselgel wurde der Ethylacetat-Extrakt viermal mit der Hälfte seines Volumens an Wasser ausgeschüttelt Die wässerigen Phasen wurden vereinigt, am Rotavapor bei 400C im Vakuum eingeengt und dünnschichtchromatographisch analysiert
1 2. 5 Hochdruckflüssiakeitschromatooraphie (HPLC)
Zur Analyse der Säulenfraktionen mittels HPLC wurde ein Gerät der Firma Waters verwendet.
Die analytischen Trennungen erfolgten über eine LiChrospher RP-18 Säule (5 pm, Durchmesser 4 mm, Länge 250 mm) bel Raumtemperatur und bei einem Fluss von 1 mlimin. Präparative Trennungen wurden ebenfalls über eine LiChrospher RP-18 Saule (5 pm, Durchmesser 10 mm, Länge 250 mm) bei einem Fluss von 4 mllmin durchgeführt Als mobile Phase diente bel allen Trennungen Wasser/Acetonitril im Verhältnis 9 : 1 Die Detektion erfolgte bei allen Analysen mit einem Photo-Array-Detektor und einem Scanning-Fluoreszenz-Detektor.
Nach der oben beschriebenen Durchführung der HPLC konnte der Peak mit einer Retentionszeit von 2, 38 Minuten und einem Absorptionsmaximum von 257, 9 nm als erfindungsgemässer Komplex identifiziert werden
Auf diese Weise wurde eine wässerige Lösung des erfindungsgemässen Komplexes erhalten.
Der erfindungsgemässe Komplex wurde schliesslich durch Tieffrieren der Lösung bei-18"C und anschliessende Gefriertrocknung als Trockensubstanz gewonnen.
2 Phvsikalisch-chemische Daten
2. 1MorphologieundLösungsverhalten
Der gemäss Punkt 1. hergestellte Komplex ist weiss, kristallin und löst sich in Wasser und Methanol.
2. 2. Schmelzverhalten
Ab 2080C Nadeln, Nadelbüschel und Plättchen, die zwischen 240 und 2470C schmelzen Bei 275 bis 2800C Einschmelzen geringer Teile des amorphen Produktes. Der Hauptanteil verkohlt bis 330oC.
2. 3 Strukturaufklärung
2. 3. 1. Massenspektrometrie (MS).
- Direkteinlass-Massenspektrometrie :
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<tb>
<tb> Massenspektrometer <SEP> : <SEP> MAT <SEP> 8500
<tb> Datensystem <SEP> MAT <SEP> SS <SEP> 300
<tb> Ionisierungsenergie <SEP> : <SEP> 70eV <SEP>
<tb> Ergebnisse <SEP> Die <SEP> Ergebnisse <SEP> sind <SEP> in <SEP> Tabelle <SEP> 1 <SEP> dargestellt
<tb>
Tabelle 1 : MS-Daten für C4H7N02 und C4H4N202
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<tb>
<tb> m/z <SEP> Relative <SEP> Intensität <SEP> (%)
<tb> 112 <SEP> 98 <SEP>
<tb> 101 <SEP> 91 <SEP>
<tb> 84 <SEP> 36 <SEP>
<tb> 69 <SEP> 58 <SEP>
<tb> 57 <SEP> 100 <SEP>
<tb> 46 <SEP> 95
<tb> 32 <SEP> 43 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> - <SEP> GC/MS-Kopplung <SEP> :
<SEP>
<tb> Massenspektrometer <SEP> Finnigan <SEP> MAT <SEP> 95, <SEP> doppelt <SEP> fokussierend <SEP> mit <SEP> inverser <SEP> Nier-Johnson
<tb> Geometrie <SEP> und <SEP> El-Ionenquelle
<tb> Ionisierungsenergie <SEP> : <SEP> 70eV <SEP>
<tb> datensystem <SEP> lcis
<tb> Gaschromatograph <SEP> : <SEP> Hewlett <SEP> Packard <SEP> 5890 <SEP> Series <SEP> 11 <SEP>
<tb> Kapillarsäule <SEP> : <SEP> Fused <SEP> silica <SEP> DB-05, <SEP> J & W <SEP> Scientific, <SEP> Länge <SEP> : <SEP> 30m,
<tb> Innendurchmesser <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> mm
<tb> Trägergas <SEP> :
<SEP> Wasserstoff
<tb> Temperaturprogramm <SEP> 3 <SEP> min <SEP> isotherm <SEP> bei <SEP> 50 C, <SEP> 40C/min <SEP> bis <SEP> 100 C, <SEP> 3 C/min <SEP> bis <SEP> 300oC,
<tb> 10 <SEP> min <SEP> isotherm <SEP> bei <SEP> 300 C
<tb> Derivatisierung <SEP> Zur <SEP> Derivatisierung <SEP> wurde <SEP> N-Methyltrimethyl-silyltrifluoracetamid
<tb> (MSTFA) <SEP> verwendet
<tb> Ergebnisse <SEP> Die <SEP> Ergebnisse <SEP> sind <SEP> in <SEP> den <SEP> Tabellen <SEP> 2 <SEP> und <SEP> 3 <SEP> dargestellt
<tb>
Tabelle 2 MS-Daten für das Derivat von Pyrimdin-2,4-dion (C10H20N2O3Si2)
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<tb>
<tb> m/z <SEP> Relative <SEP> Intensität <SEP> (%)
<tb> 256 <SEP> 56 <SEP>
<tb> 241 <SEP> 100 <SEP>
<tb> 207 <SEP> 10 <SEP>
<tb> 147 <SEP> 26 <SEP>
<tb>
Tabelle 3 :
MS-Daten für das Derivat von 5-Hydroxypyrrolidin-2-on
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<tb>
<tb> m/z <SEP> Relative <SEP> Intensität <SEP> (%)
<tb> 245 <SEP> 30 <SEP>
<tb> 230 <SEP> 26 <SEP>
<tb> 156 <SEP> 21
<tb> 147 <SEP> 100
<tb> 73 <SEP> 42
<tb>
232. Kernresonanzspektroskopie (NMR)
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<tb>
<tb> Derivatisierung <SEP> : <SEP> Zu <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> mg <SEP> Probe <SEP> im <SEP> Spitzbodenglas <SEP> wurden <SEP> 10 <SEP> ul <SEP> N-Methyltrimethylsilyltrifluoracetamid <SEP> (MSTFA) <SEP> gegeben <SEP> und <SEP> 1 <SEP> h <SEP> bei <SEP> Raumtemperatur
<tb> inkubiert
<tb> NMR-Spektrometer <SEP> Varian <SEP> UNITYplus-400
<tb> Probenkopf. <SEP> Invers-Breitband-Kopf
<tb> Temperatur. <SEP> 300C <SEP>
<tb> Losungsmittel <SEP> : <SEP> [D4]MeOH
<tb> 1 <SEP> D <SEP> Experimente: <SEP> 1H, <SEP> 13C, <SEP> NOE-Diff.
<tb>
2 <SEP> D <SEP> Experimente <SEP> COSY45, <SEP> HSQC, <SEP> HMBC
<tb>
Die NMR-Daten für den gemäss Punkt 1. hergestellten Komplex sind in Tabelle 4 angeführt.
Tabelle 4
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<tb>
<tb> 5-Hydroxypyrrolidin-2-on
<tb> Position <SEP> x <SEP> # <SEP> (1H)[ppm] <SEP> Mult. <SEP> J(Hz) <SEP> #(13C)[ppm]
<tb> 2 <SEP> CO---182, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 3 <SEP> CH2 <SEP> 2, <SEP> 19 <SEP> m <SEP> 3, <SEP> 5,9,7;16,7 <SEP> 29,5
<tb> 2, <SEP> 48 <SEP> m <SEP> 7, <SEP> 9, <SEP> 9, <SEP> 9 <SEP> ; <SEP> 16, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 4 <SEP> CH2 <SEP> 1, <SEP> 90 <SEP> m <SEP> 1, <SEP> 7;3,5;7,9,13,5 <SEP> 31,3
<tb> 2, <SEP> 37 <SEP> m <SEP> 6, <SEP> 3, <SEP> 9, <SEP> 7 <SEP> ;
<SEP> 9, <SEP> 9, <SEP> 13, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 55, <SEP> 24dd1, <SEP> 7, <SEP> 3, <SEP> 680, <SEP> 9 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Pyrimidin-2, <SEP> 4-dion <SEP> (Uraci <SEP> !) <SEP>
<tb> Positionx6 <SEP> ( <SEP> H) <SEP> [ppm1 <SEP> MuttJ <SEP> (Hz) <SEP> S <SEP> ( <SEP> C) <SEP> fppm] <SEP>
<tb> 2 <SEP> CO-"--153, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 4 <SEP> CO---167, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 5 <SEP> CH <SEP> 5, <SEP> 59 <SEP> d <SEP> 7, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 6 <SEP> CH <SEP> 7, <SEP> 38d <SEP> 7 <SEP> 143, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
3.
Pharmakologische Untersuchungen
3 1 Versuchsanordnung des Carrageenin-induzlerten Rattenpfotenödem-Modells
Zu den pharmakologischen Untersuchungen wurden weibliche Ratten des Stammes SpragueDawley (Versuchstierzucht und-haltung, Hlmberg, Niederösterreich) mit einem Gewicht von 170 g bis 200 g herangezogen. Vor Versuchsbeginn wurden die nüchternen Versuchstiere (20 Stunden ohne feste Nahrung) mit Phenobarbiton (50 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal) anaesthesiert.
Einer Gruppe von Versuchstieren wurden die verschiedenen zu testenden Extrakte bzw Fraktionen mittels einer Magensonde verabreicht, die Kontrollgruppe erhielt nur Wasser Zwei Stunden nach Applikation der Testlösungen wurde den Ratten 0, 1 ml eine 2%igen Carrageeninlösung in die Plantarregion der rechten hinteren Pfote injiziert.
Als Mass für die entzündungshemmende Wirkung wurde die Volumszunahme der Rattenpfote herangezogen Die Bestimmung der Volumina der Rattenpfote erfolgte mittels der Quecksilberverdrängungsmethode Bei den Messungen wurde die Rattenpfote jedesmal genau bis zu einer Markierung an der Pfote in einen mit Quecksilber gefüllten Zylinder getaucht, der mit einem Statham Druck-Transducer P 23 Db verbunden war. Die von der Odembildung abhängigen Druckunterschiede wurden auf einem Multi Pen Recorder (Rikadenski) aufgezeichnet.
Das absolute Pfotenvolumen (= Kontrollpfote, linke hintere Rattenpfote) wurde auf dieselbe Weise 30 Minuten vor der Carrageeninjektion ermittelt und für die statistischen Berechnungen mit 100% angenommen Bei allen pharmakologischen Kontrollen erfolgten mindestens 4 Einzelmessungen. Diese Ergebnisse der pharmakologischen Untersuchungen wurden als Mittelwert ausgedrückt, die Berechnung der Signifikanzen erfolgte mit Hilfe der Varianzanalyse 3. 2 Dosisabhängige Wirkung auf die akute Entzünc.
ig
Die dosisabhängige Wirkung des gemäss Punkt 1 hergestellten Komplexes auf die akute Entzündung wurde mit Hilfe des oben beschriebenen Carrageenin-induzierten RattenpfotenödemTests festgestellt
Dazu wurden den Versuchtieren folgende Konzentrationen des Komplexes peroral verabreicht 30 ng/kg, 300 nglkg, 3 llg/kg und 10 pg/kg Körpergewicht.
Die dosisabhängige Ödemhemmung ist in Fig 2 dargestellt. Darin ist auf der Abszisse die Zelt nach Applikation von Carrageenin in Stunden und auf der Ordinate die Hemmung der Ödembildung in Prozent aufgetragen. Aus Fig 2 ist ersichtlich, dass bei einer Gabe von 30 ng/kg Körpergewicht noch keine entzündungshemmende Wirkung festgestellt werden konnte. Ab einer Gabe von 300 ng/kg Körpergewicht trat jedoch eine signifikante Wirkung auf die Carrageenininduzierte Odembildung auf.
Mit der oben beschriebenen Versuchsanordnung wurde auch das Ausmass der Entzündungshemmung des erfindungsgemassen Komplexes in Relation zum Cyclooxygenasehemmer Indomethacin überprüft. Anhand der Ergebnisse wurde eine Dosiswirkungskurve erstellt und die Konzentration errechnet, bei der eine 50% Hemmung eintritt (IC 50)
Die Dosis-Wirkungskurve im Vergleich mit Indomethacin ist in Fig. 3 dargestellt. Darin ist auf der Abszisse die verabreichte Dosis von erfindungsgemässem Komplex (C) bzw. Indomethacin (I) in pg/kg Ratte und auf der Ordinate die Hemmung der Ödembildung in Prozent aufgetragen.
Aus Fig. 3 ist ersichtlich, dass der erfindungsgemässe Komplex mit einem IC 50 - Wert von 300 ng/kg Ratte etwa 2000-fach wirksamer ist als Indomethacin mit einem IC 50 - Wert von 630 ug/kg Ratte
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Pharmakologische Untersuchungen mit reinem Pyrimidin-2, 4-dion (Uracil) in Konzentrationen bis zu 1 mg/kg Ratte zeigten, dass diese Verbindung allein keine entzündungshemmende Wirkung aufweist
Weitere pharmakologische Untersuchungen haben gezeigt, dass der erfindungsgemasse Komplex keine direkte Hemmung auf Cyclooxygenase und keine nennenswerte Wirkung auf 5Lipoxygenase ausübt Patentansprüche :
1 Komplex, gebildet aus 5-Hydroxypyrrolldin-2-on der Formel
EMI6.1
und Pyrimidin-2, 4-dion der Formel II
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