AT402732B - Benutzung der menschlichen megakaryozytenartigen zellinie dami zur identifikation und bestimmung vonsubstanzen zur hemmung der enzymatischen aktivitätdes enzyms cyclooxygenase-1 - Google Patents
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Description
<Desc/Clms Page number 1>
Erfindungsgegenstand
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von Substanzen, die das Enzym Cyclooxygenase-1 hemmen, sowie zur quantitativen Bestimmung dieser Hemmung, unter Verwendung einer menschlichen, nicht gentechnologisch veränderten Zellinie.
Technologischer Hintergrund
Das Enzym Cyclooxygenase (COX) (Synonyme. Prostaglandinendoperoxid Synthase, EC 1 14. 99. 1, Prostaglandin H Synthase (PGHS). Prostaglandin Synthase (PGS)) wandelt Arachidonsäure in Prostaglandin H2 um, welches dann von verschiedenen Enzymen zu den entsprechenden Prostaglandinen (z. B. PGE2,
EMI1.1
B. TXA ?. TXBs) weiter verstoffwechseit w"Pharmacology of prostaglandin endoperoxide synthase isoenzymes-1 and -2", Annals New York Academy of Sciences 714,136-142). So ist COX-1 permanent In vielen Zellen exprimiert und katalysiert z. B. die Bildung von Prostacyclin, das, sekretiert von Magenschleimhautzellen. diese vor der Magensäure schützt (Whittle et al. (1980), Nature 284,271-273). Hingegen wird COX-2 erst auf inflammatorische Reize hin In Makrophagen, Fibroblasten, Keratinozyten der Haut und anderen Zellen gebildet.
Diese Reize erhöhen die Expression von COX-2 um das 10-80-fache (Smith et al., a.a.O.). Solche inflammatorische Reize sind pro- inflammatorische Cytoklne, bakterielle Endotoxine in vivo, sowie Mitogene, Cytokine und Lipopolysaccharid (LPS) in vitro. Die dann sekretierten Mediatoren wie z. B. PGE2 sind u. a. für das entzündliche Geschehen verantwortlich. Die Unterdrückung der Bildung dieser Mediatoren trägt im Wesentlichen zur Wirkung der nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Substanzen (NSAIDs) bei.
Die meisten NSAIDs hemmen die Aktivität beider COX Isoenzyme. Die Hemmung der COX-2 wird der antl- inflammatonschen Wirkung der NSAIDs zugeschrieben, während die Hemmung der COX-1 den Nebenwir-
EMI1.2
B Magenschleimhauterosionen,inflammatory drugs", TIPS 15, 405-406). Um dies zu erreichen, war es notwendig, Testsysteme zu entwickeln, die eine potentielle Hemmung der Aktivität der COX-1 durch potentielle Arzneistoffe erfassen können.
Tests zur Messung der COX-1 Aktivität wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen beschrieben (Übersicht siehe Battistini et al., a. a. 0.) : 1. Gentechnische Verfahren zur Testung der murinen und human COX-1 Aktivität in vitro
Gentechnologische Verfahren beinhalten Expressionsvektoren des muonen und humanen COX-1 Gens.
Diese wurden z. B. m COS-Zellen (Afncan green monkey kidney cells) transfiztert und die entsprechenden Gene entweder stabil oder transient zur Expression gebracht. Danach werden diese Zellen zur Bestimmung der COX-1 Aktivität benutzt.
EMI1.3
Expression des COX-2 Gens zu unterdrücken.
3. Nicht-gentechnologische Verfahren zur Testung der human COX-1 Aktivität in vitro
Zur Testung auf Inhibition der humanen COX-1 sind Verfahren beschrieben worden, die sich Thrombozyten bedienen, welche aus menschlichem Blut isoliert werden. Des weiteren sind Verfahren beschrieben worden, die die COX-1 Aktivität Im menschlichen Blut direkt messen, ohne dass Thrombozyten Isoliert werden müssen.
EMI1.4
<Desc/Clms Page number 2>
allerdings umständlichAufgabenstellung
Aufgrund der beschriebenen Nachteile ist es wünschenswert, ein Testsystem zur Verfügung zu haben,
EMI2.1
eineArzneistoffe erfassen kann. Besonders wünschenswert Ist es, hierfür eine menschliche, gentechnologisch unveränderte Zellinie verwenden zu können.
Überraschenderweise konnte diese Aufgabe durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Suchen nach und zur Charakterisierung und Bestimmung von Stoffen, die geeignet sind, die Aktivität des humanen COX-1 zu hemmen, gelöst werden. Dieses Verfahren verwendet die menschliche Megakaryozytenzeilnte DAMI (Greenberg et al., (1988)), welche COX-1 Enzymaktivität, aber keine Aktivität des Enzyms COX-2 aufweist.
Es handelt sich hierbei um ein nicht-gentechnologisches Verfahren.
Einen weiteren Vorteil stellt die Benutzung von Zellinie, die per se COX-1 enthalten, dar, da das Isolieren von Zellen aus Blut, bzw. das Gewinnen von Blut überhaupt entfällt.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Identifikation von Substanzen, die das Enzym Cyclooxygenase-1 hemmen, sowie zur quantitativen Bestimmung dieser Hemmung, dadurch gekennzeichnet, dass potentielle Hemmstoffe der Cyclooxygenase-1 mit Zellen der menschlichen Zellinie DAMI oder mit einem Subklon derselben oder mit deren Lysaten Inkubiert werden, Arachidonsäure hinzugegeben wird und die Konzentration an Prostaglandin E2 und/oder Thromboxan B2 und/oder anderer Produkte des Cyclooxy- genase-Stoffwechselweges im Kulturüberstand mittels einer geeigneten Detektionsmethode für Eicosanolde und Prostaglandine oder alternativ der Verbrauch an Arachidonsäure im Kulturüberstand gemessen wird.
In der menschlichen Megakaryozytenzellinie DAMI wurde das Protein Cyclooxygenase-1 mittels zytoplasmatische Immunfluoreszenz unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen COX-1 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA) und mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der Proteine des Zellysates und nachfolgender Westernblot Analyse unter Verwendung des oben genannten spezifischen Antikörpers gegen menschliches COX-1 vorgefunden. Des weiteren wurden die Produkte TXB2, PGF, und PGE2 des Stoffwechselweges der Cyclooxygenasen im Kulturüberstand dieser Zellen mittels ELISA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA) nachgewiesen. Diese Befunde zeigen, dass das Enzym COX-1 In diesen Zellen vorhanden 1St.
Unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gerichtet gegen human COX-2, mittels zytoplasmatischer Immunfluoreszenz und mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der Proteine des Zellysates und nachfolgender Westernblot Analyse unter Verwendung des oben genannten spezifischen Antikörpers gegen menschliches COX-2 wurde das Vorhanden sein von COX-2 ausgeschlossen.
Beispiel
Zellen der menschlichen Megakaryozytenzellinie DAMI werden in RPMI 1640, angereichert mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 10000 U/ml Penizillin, 10 ng/ml Streptomycin und 1 mM Pyruvat im Brutschrank bel 37. C, mit 5% C02 angereicherter Atmosphäre und 100% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Danach wird das Kulturmedium erneuert und potentielle Hemmstoffe der Cyclooxygenase-1, gelöst In Kulturmedium oder PBS oder einem anderen Zellkultur-verträglichen Lösungsmittel, hinzugefügt und 30 Minuten wie oben Im Brutschrank Inkubiert. Arachidonsäure wird hinzugegeben und 15 Minuten weiter inkubiert.
Der Kulturüberstand der Zellen wird abgehoben und sein Gehalt an Produkten des Cyclooxygenasestoffwechsels mittels ELISA bestimmt.
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
<tb>
<tb>
Hemmstoff <SEP> COX-1 <SEP> Aktivität
<tb> Zellen <SEP> allein <SEP> 100%
<tb> Diclofenac <SEP> 8, <SEP> 4% <SEP>
<tb> Indomethacin <SEP> 2, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Aspirin <SEP> 88%
<tb> Flosulide <SEP> 96, <SEP> 9% <SEP>
<tb> 100% <SEP> COX-1 <SEP> Aktivität <SEP> entsprechen <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> ng/ml <SEP> TXB2. <SEP> Alle <SEP> Substanzen <SEP> wurden <SEP> mit <SEP> 1 <SEP> umolll <SEP> getestet.
<tb>
Patentansprüche 1. Ein Verfahren zur Identifikation von Substanzen, die das Enzym Cyclooxygenase-1 hemmen, sowie zur quantitativen Bestimmung dieser Hemmung, dadurch gekennzeichnet, dass potentielle Hemmstoffe der Cyciooxygenase-1 mit Zellen der menschlichen Zellinie DAMI oder mit einem Subklon derselben oder mit deren Lysaten inkubiert werden,
Arachidonsäure hinzugegeben wird und die Konzentration an Prostaglandin Ez und/oder Thromboxan B2 und/oder anderer Produkte des
Cyclooxygenase-Stoffwechselweges im Kulturüberstand mittels einer geeigneten Detektionsmethode für
Eicosanoide und Prostaglandine oder alternativ der Verbrauch an Arachidonsäure im Kulturüberstand gemessen wird.
Claims (1)
- 2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Zugabe der potentiellen Hemmstoffe der Cyclooxygenase-1 Zellen der menschlichen Zellinie DAMI oder eines Subklons derselben Iysiert werden, Cyclooxygenase-1 mittels geeigneter biochemischer Aufreinigungsverfahren Isoliert wird, diese In einem geeigneten Reaktionspuffer zu einem Reaktionsgemisch aufgenommen wird, und die weiteren Verfahrensschritte an dem Reaktionsgemisch vorgenommen werden
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| WO1990002197A1 (en) * | 1988-08-17 | 1990-03-08 | Brigham And Women's Hospital | Establishment, characterization and differentiation of a new megakaryocytic cell line, the dami cells |
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1996
- 1996-02-16 AT AT27696A patent/AT402732B/de not_active IP Right Cessation
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| ATA27696A (de) | 1996-12-15 |
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