AT402936B - Benutzung einer menschlichen zellinie zur identifikation und bestimmung von substanzen zur hemmung der induktion der expression des cyclooxygenase-2-genes - Google Patents
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Description
<Desc/Clms Page number 1> Erfindungsgegenstand Die Erfindung betrifft die Hemmung der Expression von human-COX-2 In Zellen einer humanen monozytenartigen Zellinie und dessen Verwendung In einem Verfahren zum Suchen nach und zur Charaktensierung und Bestimmung von Stoffen, die geeignet sind, die Expression des COX-2 Genes und/oder die Induktion der COX-2 Genexpression zu hemmen. Technologischer Hintergrund Das Enzym Cyclooxygenase (COX) (Synonyme : Prostaglandin-endoperoxid Synthase, EC 1. 14. 99. 1, Prostaglandin H Synthase (PGHS), Prostaglandin Synthase (PGS)) wandelt Arachidonsäure in Prostaglandin H2 um, das dann von verschiedenen Enzymen zu den entsprechenden Prostaglandinen (z. B. PGEz, PGFi ), Prostacyclinen und Thromboxanen (z. B. TXAz. TXBz) weiter verstoffwechseit wird (Thiemermann, Eicosanoids, Bd. 4, Jg. 1991, S. 187-202). Zwei Formen, d. h. Isoenzyme, der COX sind bisher beschrieben worden, die mit COX-1 und COX-2 bzw. PGHS-1 und PGHS-2 bezeichnet werden. Diese belden Isoenzyme werden durch zwei distinkte Gene mit unterschiedlicher Regulation codiert (Battistini et al., DN & P, Bd. 7 (8), Jg. 1994, EMI1.1 Smithne, in vitro sind es Mitogene, Cytokine und Lipopoiysaccharid (LPS). Die dann sekretierten Mediatoren, wie z. B. PGE2 sind u. a. für das entzündliche Geschehen verantwortlich. Die Unterdrückung der Bildung von COX-2 ist eine Wirkung von steroidhaltigen Medikamenten wie zum Beispiel Dexamethason und trägt wesentlich zur entzündungshemmenden Wirkung dieser Stoffe bei Verfahren zur Testung der Hemmung der COX-2 Gen Expression Zur Expression von human COX-2 und Testung auf Inhibition der human COX-2 sind Verfahren beschneben worden, die sich peripherer Makrophagen/Monozyten bedienen, die nach Isolierung aus dem Blut von Spendern mit LPS stimuliert werden. Dieses Verfahren ist umständlich und zeitraubend. Humane Zehnten (U937, THP -1, HL60), die nach Stimulation mit Phorbolestern (TPA, PMA) COX-2 exprimieren, sind ebenfalls beschrieben worden (Hoff et al., FEBS, Bd. 320, Jg. 1993, S. 38 -42, Sanduja et al., Blood, Bd. 78, Jg. 1991, S. 3178-3185), und der Gebrauch von Zellinien stellt insofern eine Verbesserung dar, indem der Schntt der Isolierung von Monozyten aus dem Spenderblut und die grosse Streuung der Stimulierbarkelt der Spendermonozyten entfallen. Der Nachteil der PMA-Stimulation der beschriebenen human Zellinie besteht jedoch In der Gefährlichkeit im Umgang mit PMA, sodass diese Verfahren nicht für einen Routinegebrauch geeignet sind. Des weiteren Ist PMA kein natürlicher Stimulus zur Aktivierung von Makrophagen. Überraschenderweise konnte ein Verfahren gefunden werden, das die Nachteile der oben angeführten Verfahren umgeht, da es einfacher durchzuführen und somit zeitsparender ist, die Handhabung der cocarcinogenen Phorbolester unnötig macht, und vor allem aber Stimulantien benutzt, die auch in der Natur vorkommen. Die Erfindung beschreibt die durch beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS) stimulierte Expression von human-COX-2 in Zellen einer humanen monozytenartigen Zellinie und dessen Anwendung In einem Verfahren zum Suchen nach und zur Charakterisierung und Bestimmung von Stoffen, die geeignet sind die Induktion der Expression und/oder die Expression des human-COX-2 Genes zu hemmen. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Identifikation und quantitativen Bestimmung von Substanzen, die die Genexpression des menschlichen Enzyms Cyclooxygenase-2 hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass a) Zellen der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit geeigneten Wachstums-und/oder Differenz erungs- faktoren stimuliert werden, und unter der Stimulation potentielle Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2 Genexpression mit-inkubiert werden oder b) Zellen der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit potentiellen Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2 inkubiert werden, diese Zellen anschliessend mit geeigneten Wachstums-und/oder Differenz ! erungsfakto- ren stimuliert werden. EMI1.2 <Desc/Clms Page number 2> \ H¯C ItA:R HQr tAOnnYnoczeeinn HPC ft: volnnYvnanaeQ GisnRe Hadtlrr:h hRstlmmt wlrd dassc. 1) nach Zugabe von Arachidonsäure am Ende der Stimulationsphase die Konzentration oder Menge der Produkte des Cyclooxygenasestoffwechsels im Kulturüberstand dieser Zellen mittels eines geeig- neten Detektionsverfahrens gemessen wird, oder c. 2) am Ende der Stimulationsphase die Zellen mittels geeigneter Detergentien Iysiert werden, der Gehalt von spezifischen Cyclooxygenase-2 Protein in den Lysaten vermittels Western Blot Analyse, Proteindot blot Analyse, ELISA oder ähnlich geeigneter spezifischer Proteinnachweisverfahren be- stimmt wird. oder c. 3) am Ende der Stimulationsphase die Zellen mittels geeigneter Methoden Iysiert werden, Boten- Ribonukleinsäuren (mRNS) isoliert werden und der Gehalt von spezifischen Cyclooxygenase-2 mRNS mittels Northern Blot Analyse, mRNS Dotblot Analyse, oder reverser Transkription (RT) und Polymer- se Kettenreaktion (PCR) oder S1 Nukleasenprotektionstest oder irgendeinem sonstigen geeignetem spezifischen mRNS-Nachweisverfahren bestimmt wird, oder c. 4) Zeiten der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit einem Reportergenhaltigem Plasmid oder Vector, das die genregulativen Sequenzen des menschlichen Cyclooxygenasegens zur Expression eines Reportergenes z. B. des Fireflyluciferase-Gens, des ss-Gaiaktosidase-Gens oder irgendeines anderen geeigneten Reportergens stabil oder transient transfiziert wurden, dann wie unter a) oder b) stimuliert wurden und sodann die Expression des Reportergenproduktes mittels geeigneter Verfahren z. B. Chemilumineszens oder Farbstoffentwicklung oder ähnlich geeigneter Verfahren als Mass der Cyclooxygenase-2 Genexpression bestimmt wird. In der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 (MM6) (Ziegler-Heitbrock et al., Int. J. Cancer, Bd. 41, Jg. 1988, S. 456-461) wurde überraschenderweise nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) COX-2 im Zytoplasma gefunden. Vorhandensein von COX-2 in MM6 Zellen nach Stimulation durch LPS wurde einerseits mittels zytoplasmatischer Immunfluoreszenz unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen menschliches COX-2 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA) und 2) mittels SDSPolyacrylamid-Gelelectrophorese des Zellysates und nachfolgendem Westernblot unter Verwendung des oben genannten spezifischen Antikörpers gegen menschliches COX-2 gezeigt. Des weiteren wurden die Produkte PGF, PGE :. und TXB2 des Stoffwechselweges der Cyclooxygenasen im Kulturüberstand von EMI2.1 USA) bestimmt und eine vielfach höhere Konzentration dieser Stoffe in den mit LPS stimulierten Kulturen gefunden. Weiters wurde sowohl mittels Northernblotanalyse als auch mittels Reversertranskripton und Polymerasenkettenreaktion (PCR) gefolgt von Southernblot analyse der PCR-Produkte das stimulations- abhängiges Auftreten und Ansteigen der Cox-2 spezifischen mRNA gefunden. Diese Befunde zeigen klar, dass sich das Enzym COX-2 in diesen Zellen durch Stimulierung mit LPS Induzieren lässt. Im Gefolge dessen wurde ein Verfahren zum Suchen und Bestimmen von Hemmstoffen der Cox-2 Genexpression bzw der Induktion der Cox-2 Genexpression entwickelt. Dazu werden beispielsweise Zellen mit potentiellen Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2 Genexpression, gelöst in Kulturmedium oder einem Zet ! kutturverträgtichen Lösungsmittel, beispielsweise phosphat gepufferter Saline, inkubiert und mit einem geeigneten Faktor, wie Lipopolysaccharaid die Zellen stimuliert. Danach kann mit verschieden Nachweisverfahren die Hemmung der Cox-2 Genexpression bzw. die Hemmung der Induktion der der Cox-2 Genexpression erfasst werden : a) Bestimmung der Cox-2 Enzymakti- vität, b) Bestimmung der Cox-2 Proteinmengen, c) Bestimmung der Cox-2 spezifischen BotenRNA. Eine Reduktion der gemessenen Cox-2 spezifischen Enzymaktivität oder der Cox-2 Proteinmengen oder der Cox-2 spezifischen BotenRNA im Vergleich zu einem Kulturansatz, der statt potentieller Hemmstoffe nur Lösungsmittel enthielt, wird als Hemmung der Cyclooxygenase-2 Genexpression gewertet. Anstelle der Messung der Cyclooxygenase-2 spezifischen Enzymaktivität oder der Cox-2 Proteinmengen oder der Cox-2 spezifischen Boten-RNA werden beispielsweise die Zellen mittels eines PromotorReportergenkonstrukts gentechnologisch so verändert, dass die Expression des Cox-2 Genes auch zur Expression eines leichter erfassbaren Genprodukts führt, nämlich das eines Reportergens zB. des Gens das für das Enzym Firefly Luziferase kodiert. Aus einer cDNA-Bibliothek wird mittels PCR ein geeignetes DNAFragment aus den Cox-2 genregulativen Sequenzen (Promotorregion) amplifiziert, kloniert und in ein EMI2.2 ferter Sahne, inkubiert und mit einem geeigneten Faktor, wie Lipopolysaccharaid stimuliert. Danach wird die Aktivität der Firefly Luziferase durch Hinzugabe von Substrat beispielsweise Luziferin mittels Chemolumineszenz bestimmt. Eine Reduktion der Chemolumineszenz Im Vergleich zu einem Kulturansatz, der statt potentieller Hemmstoffe nur Lösungsmittel enthielt, wird als Hemmung der Cyclooxygenase-2 Genexpression gewertet. <Desc/Clms Page number 3> Beispiel 1 Mono Mac 6 Zellen werden mit potentiellen Hemmstoffen der Expression des Cyclooxygenase-2 Genes, gelöst in Kulturmedium (RPMI 1640 angereichert mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 160 ug/ml nichtessentielle Aminosäurenmischung (Sigma), 10000 U/ml Penizillin, 10 ng/ml StreptomYCin, 8. 2 u. g/ml Insulin, 1 mM Oxaiessigsäure 1 mM Pyruvat) inkubiert (10 min, Brutschrank bei 37. C, 5% CO2 angereicherte Atmosphäre und annähernd 100% Luftfeuchtigkeit), und dann mit LPS (100ng/ml) für 6 Stunden stimuliert (Brutschrank bei 37. C, 5% CO2 angereicherte Atmosphäre und annähernd 100% Luftfeuchtigkeit). Danach wird das Kulturmedium erneuert, Arachidonsäure wird hinzugefügt und 15 Minuten weiter inkubiert. Der Kulturüberstand der Zellen wird abgehoben und auf seinen. Gehalt an Produkten des Cyciooxygenasestoffwechseis hin mittels ELISA gemessen als Mass der Cox-2 Enzymaktivität, das unter diesen Umständen das Mass der Cox-2-Genexpression reflektiert. Tabelle 1 EMI3.1 <tb> <tb> PGE2 <SEP> PGF1 <SEP> TXB2 <tb> Zellen <SEP> nicht <SEP> stimuliert <SEP> 5. <SEP> 2% <SEP> 6% <SEP> 4. <SEP> 3% <SEP> <tb> Zellen <SEP> plus <SEP> Dexamethason <SEP> stimuliert <SEP> 27% <SEP> 40% <SEP> 34% <tb> Zellen <SEP> plus <SEP> Cycloheximid <SEP> stimuliert <SEP> 7% <SEP> 9% <SEP> 5% <tb> (Prozentsatz <SEP> der <SEP> maximalen <SEP> Eicosanoidproduktion <SEP> von <SEP> LPS-stimulierten <SEP> Zellen <SEP> Ist <SEP> angegeben) <tb> Beispiel 2 Mono Mac 6 Zellen werden mit potentiellen Hemmstoffen der Expression des Cyclooxygenase-2 Genes, gelöst in Kulturmedium (RPMI 1640 angereichert mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 160 ug/ml nichtessentielle Aminosäurenmischung (Sigma), 10000 U/ml Penizillin, 10 ng/ml Streptomycin, 8. 2 ug/ml Insulin, 1 mM Oxalessigsäure 1 mM Pyruvat) inkubiert (10 min, Brutschrank bel 37. C, 5% CO2 angereicherte Atmosphäre und annähernd 100% Luftfeuchtigkeit), und dann mit LPS (100ng/ml) für 6 Stunden stimuliert (Brutschrank bei 37 C, 5% CO2 angereicherte Atmosphäre und annähernd 100% Luftfeuchtigkeit). Danach werden die Zellen Iysiert, normalisierte Mengen des Zellysates einer Westernblotanalyse unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen human Cox-2 unterzogen. Die quantitative Bestimmung der Cox-2 Protemmengen als Mass der Genexpresion wird mittels Densitometne der 72-74KD Doppelbande durchgeführt. **WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.
Claims (3)
- Tabelle 2 EMI3.2 <tb> <tb> Densitometnsche <SEP> Einheiten <tb> Zellen <SEP> nicht <SEP> stimuliert <SEP> 53248 <tb> Zellen <SEP> LPS-stimuliert <SEP> 216373 <tb> Zellen <SEP> plus <SEP> Dexamethason <SEP> dann <SEP> LPS-stimuliert <SEP> 140846 <tb> Patentansprüche 1. Verfahren zur Identifikation und quantitativen Bestimmung von Substanzen, die die Expression des Cyclooxygenase-2 Genes oder dessen Induktion der Expression hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 gleichzeitig oder nacheinander mit potentiellen Hemm- EMI3.3 des Cyclooxygenase-2muliert werden und a)nach Zugabe von Arachidonsäure die Konzentration der Produkte des Cyclooxygenasestoffwech- sels Im Kulturüberstand dieser Zellen mittels eines geeigneten Detekt ! onsverfahrens gemessen wird, oder <Desc/Clms Page number 4> b) die von den Zellen gebildete Menge an Cox-2 Protein mittels Westernblot Analyse, Protein Dotblot Analyse, ELISA zur quantitativen Cox-2 Protein Bestimmung oder ähnlich geeigneter spezifischer Proteinnachweisverfahren gemessen wird, oder c) die von den Zellen gebildete Menge an Cox-2 spezifischer BotenRNS mittels Northernblot Analyse, RNA Dotblot Analyse, quantitativer PCR nach reverser Transkription oder ähnlich geeigne- ter spezifischer BotenRNS-Nachweisverfahren gemessen wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenzeichnet, dass Zellen der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit einem Promotor-Reportergen bestehend aus den genregulativen Sequenzen des humanen Cox- 2 Genes gekoppelt an ein geeignetes Reportergen, bevorzugt das Gen für Firefly Luziferase, stabil oder transient transfiziert sind, die so gentechnologisch modifizierten Zellen der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit potentiellen Hemmstoffen inkubiert werden, die solchermassen behandelten Zellen mit geeigneten Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren der Cyclooxygenase-2 Genexpression stimuliert werden und die Expression des Reportergenes mittels eines geeigneten Detektionsverfahrens, bevorzugt Chemilumineszenz, gemessen wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Wachstums- und/oder Differenzie- rungsfaktoren Interleukin-1, TNF-alpha, Lipopolysaccharid oder Interferon-y oder Kombinationen davon, bevorzugt Lipopolysaccharid, verwendet werden.
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| ATA93296A ATA93296A (de) | 1997-02-15 |
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|---|---|
| AT (1) | AT402936B (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1187934A4 (de) * | 1999-06-16 | 2002-07-31 | Univ Temple | Auf zellen basierter assay zum screening von cox-2-inhibitoren |
| US6933128B1 (en) | 1999-06-16 | 2005-08-23 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Cell-based assay for screening cox-2 inhibitors |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994014977A1 (en) * | 1992-12-22 | 1994-07-07 | Merck Frosst Canada Inc. | HUMAN CYCLOOXYGENASE-2cDNA AND ASSAY FOR EVALUATING INHIBITION OF CYCLOOXYGENASE-2 |
| AT401061B (de) * | 1995-01-26 | 1996-06-25 | Hafslund Nycomed Pharma | Benutzung einer menschlichen monozytenartigen zellinie zur identifikation und bestimmung von substanzen zur hemmung des menschlichen enzyms cyclooxygenase-2 |
-
1996
- 1996-05-29 AT AT93296A patent/AT402936B/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO1994014977A1 (en) * | 1992-12-22 | 1994-07-07 | Merck Frosst Canada Inc. | HUMAN CYCLOOXYGENASE-2cDNA AND ASSAY FOR EVALUATING INHIBITION OF CYCLOOXYGENASE-2 |
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| Title |
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| US6933128B1 (en) | 1999-06-16 | 2005-08-23 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Cell-based assay for screening cox-2 inhibitors |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATA93296A (de) | 1997-02-15 |
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