AT401061B - Benutzung einer menschlichen monozytenartigen zellinie zur identifikation und bestimmung von substanzen zur hemmung des menschlichen enzyms cyclooxygenase-2 - Google Patents
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Description
<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft die stimulierte Expression von human-COX-2 in Zellen eines Subklons einer humanen monozytenartigen Zellinie und dessen Verwendung in einem Verfahren zum Suchen nach und zur Charakterisierung und Bestimmung von Stoffen, die geeignet sind, die Aktivität des human-COX-2 zu hemmen.
Das Enzym Cyclooxygenase (COX) (Synonyme : Prostaglandin-endoperoxid Synthase, EC 1. 14. 99. 1, Prostaglandin H Synthase (PGHS), Prostaglandin Synthase (PGS)) wandelt Arachidonsäure in Prostaglandin H2 um, das dann von verschiedenen Enzymen zu den entsprechenden Prostaglandinen (z. B PGE2, PGFa).
Prostacyclinen und Thromboxanen (z. B. TXAz, TXBz) weiter verstoffwechselt wird (Thiemermann, Eicosa- noids, Bd. 4, Jg. 1991, S. 187-202). Zwei Formen, d. h. Isoenzyme, der COX sind bisher beschrieben worden, die mit COX-1 und COX-2 bzw. PGHS-1 und PGHS-2 bezeichnet werden. Diese beiden Isoenzyme werden durch zwei distinkte Gene mit unterschiedlicher Regulation codiert (Batt) Stini et al., DN & P, Bd. 7 (8), Jg. 1994, S. 501-512, Smith et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., Bd. 714, Jg. 1994, S. 136-142). So ist COX-1 permanent in fast allen Zellen exprimiert und katalysiert z. B. die Bildung von Prostacyclin, das, sekretiert von Magenschleimhautzellen, diese vor der Magensäure schützt (Whittle et al.
Nature, Bd. 284, Jg. 1980, S. 271-273). Hingegen wird COX-2 erst auf inflammatorische Stimuli hin in Makrophagen, Fibroblasten, Keratinozyten der Haut und anderen Zellen nachweisbar. Diese Stimuli erhöhen die COX-2-Expression um das 10 bis 80-fache (Smith et al., a. a. o.). Inflammatorische Stimuli in vivo sind pro-inflammatorische Cytokine oder bakterielle Endotoxine, in vitro sind es Mitogene, Cytokine und Lipopolysaccharid (LPS). Die dann sekretierten Mediatoren, wie z. B. PGE2 sind u. a. für das entzündliche Geschehen verantwortlich. Die Unterdrückung der Bildung dieser Mediatoren trägt im Wesentlichen zur Wirkung der nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Substanzen (NSAIDS) bei.
Die meisten NSAIDS hemmen die Aktivität beider COX Isoenzyme. Die Hemmung der COX-2 wird der antiinflammatorischen Wirkung der NSAIDS zugeschrieben, während die Hemmung der COX-1 unter den Nebenwirkungen, wie z. B. Magenschleimhauterosionen, geführt wird. Zur Vermeidung dieser Nebenwirkung von NSAIDS ist es bedeutsam, Medikamente zu entwickeln, die selektiv die COX-2 Aktivität hemmen können (Wallace & Cirino, Bd. 15, Jg. 1994, S. 405-406).
Tests zur Messung der COX-2 Aktivität wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen beschrieben.
(Übersicht siehe Battistini et al., a. a. o.).
1. ) Gentechnologische Verfahren zur Testung der murinen und human COX-2 Aktivität
Gentechnologische Verfahren beinhalten Expressionsvektoren der munnen (Meade et al 1993) und
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(African green monkey kidney cells) transfiziert und die entsprechenden Gene entweder stabil oder transient zur Expression gebracht. Danach werden diese Zellen zur Bestimmung der COX-2 Aktivität benutzt.
2. ) Nicht-gentechnologische Verfahren zur Testung der murinen COX-2 Aktivität
Nicht-gentechnologische Verfahren bedienen sich munner Makrophagenzellinien, die zur munnen COX-
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Zur Expression von human COX-2 und Testung auf Inhibition der human COX-2 sind Verfahren beschrieben worden, die sich penpherer Makrophagen/Monozyten bedienen, die nach Isolierung aus dem Blut von Spendern mit LPS stimuliert werden. Dieses Verfahren ist umständlich und zeitraubend.
Humane Zelinien (U937, THP-1, HL60), die nach Stimulation mit Phorbolestern (TPA. PMA) COX-2
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beschriebenBlood, Bd. 78, Jg 1991, S. 3178-3185), und der Gebrauch von Zellinie stellt insofern eine Verbesserung dar, indem der Schntt der Isolierung von Monozyten aus dem Spenderblut und die grosse Streuung der Stimulierbarkeit der Spendermonozyten entfallen. Der Nachteil der PMA-Stimulation der beschriebenen human Zellinie besteht jedoch in der Gefährlichkeit im Umgang mit PMA, sodass diese Verfahren nicht für einen Routinegebrauch geeignet sind.
Überraschenderweise konnte ein Verfahren gefunden werden, das die Nachteile der oben angeführten Verfahren umgeht, da es einfacher durchzuführen und somit zeitsparender ist und die Handhabung der cocarcinogenen Phorbolester unnötig macht
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Die Erfindung beschreibt die durch LPS-stimulierte Expression von human-COX-2 In Zellen eines Subklons einer humanen monozytenartigen Zellinie und dessen Anwendung in einem Verfahren zum Suchen nach und zur Charakterisierung und Bestimmung von Stoffen, die geeignet sind die Aktivität des human-COX-2 zu hemmen. Es handelt sich hierbei um ein nicht gentechnologisches Verfahren.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Identifikation und quantitativen Bestimmung von Substanzen, die das menschliche Enzym Cyclooxygenase-2 hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass a) Zellen eines nicht gentechnologisch manipulierten Klones der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit geeigneten Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren stimuliert werden, die solchermassen stimulierten Zellen zusammen mit potentiellen Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2 inkubiert werden und nach Zugabe von Arachidonsäure die Konzentration oder Menge der Produkte des Cyclooxygenasestoff- wechsels im Kulturüberstand dieser Zellen mittels eines geeigneten Detektionsverfahrens gemessen wird, oder b)
Zellen eines nicht gentechnologisch manipulierten Klones der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit potentiellen Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2 inkubiert werden, diese Zellen anschliessend mit geeig- neten Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren stimuliert werden, und nach der Zugabe von
Arachidonsäure die Konzentration oder Menge der Produkte des Cyclooxygenasestoffwechsels im
Kulturüberstand dieser Zellen mittels eines geeigneten Detektionsverfahrens gemessen wird.
Durch Subklonierung der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 (Ziegler-Heitbrock et al., Int. J. Cancer, Bd. 41, Jg. 1988, S. 456-461) und anschliessendem Suchen nach Klonen, die nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) unter anderem auch COX-2 im Zytoplasma aufweisen, wurden überraschenderweise mehrere positive Klone gefunden. Der Zellklon mit dem weitergearbeitet wurde, wurde mit MonoMac-6. X-2 (MM6. X-2) bezeichnet. Vorhandensein von COX-2 in MM6.
X-2 Zellen nach Stimulation durch LPS wurde einerseits mittels zytoplasmatischer Immunfluoreszenz unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen menschliches COX-2 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA) und 2) mittels SDSPolyacrylamid-Gelelectrophorese des Zellysates und nachfolgendem Westernblot unter Verwendung des oben genannten spezifischen Antikörpers gegen menschliches COX-2 gezeigt. Des weiteren wurden die Produkte PGF", PGE2 und TXB2 des Stoffwechselweges der Cyclooxygenasen im Kulturüberstand von stimulierten und unstimulierten Zellen mittles ELISA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA) bestimmt und eine vielfach höhere Konzentration dieser Stoffe in den mit LPS stimulierten Kulturen gefunden.
Diese Befunde zeigen klar, dass sich das Enzym COX-2 in diesen Zellen durch Stimulierung mit LPS induzieren lässt. Im Gefolge dessen wurde ein Verfahren zum Suchen und Bestimmen von Hemmstoffen entwickelt.
Dazu werden beispielsweise mit einem geeigneten Faktor, wie Interleukin-1 oder Lipopolysaccharaid, stimulierte Zellen mit potentiellen Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2, gelöst in Kulturmedium oder einem Zellkultur-verträglichen Lösungsmittel, beispielsweise phosphat gepufferter Saline, inkubiert. Eine weitere Vorgehensweise besteht darin, zunächst unstimulierte Zellen zuerst mit potentiellen Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2 zu inkubleren und erst danach mit einem geeigneten Faktor zu stimulieren.
Nachdem Arachidonsäure hinzugegeben wurde, wird weiter inkublert. Der Kulturüberstand der Zellen wird abgehoben und mittels eines geeigneten Detektionsverfahrens, beispielsweise Radioimmunoassay oder ELISA, auf seinen Gehalt an Produkten des Cyclooxygenasestoffwechsels gemessen. Eine Reduktion der gemessenen Produkte des Cyclooxygenasestoffwechsels im Vergleich zu einem Kulturansatz, der statt potentieller Hemmstoffe nur Lösungsmittel enthielt, wird als Hemmung der Cyclooxygenase-2 gewertet.
Beispiel 1
Zellen des Klones MM6. X-2 werden mit LPS (100ng/ml) für 6 Stunden stimuliert (Brutschrank bel 37 C, 5% C02 angereicherte Atmosphäre und 100% Luftfeuchtigkeit), um COX-2 zu induzieren. Danach wird das Kulturmedium (RPMI 1640 angereichert mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 10 000 U/ml Penizillin, 10 ng/ml Streptomycin und 1 mM Pyruvat) erneuert und potentielle Hemmstoffe der Cyclooxygenase-2, gelöst in phosphat gepufferter Saline, hinzugefügt und eine halbe Stunde wie oben beschrieben inkublert. Arachidonsäure wird hinzupippettiert und 15 Minuten weiter inkubiert Der Kulturüberstand der Zellen wird abgehoben und auf seinen Gehalt an Produkten des Cyclooxygenasestoffwechsels hin mittels ELISA gemessen.
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<tb>
<tb>
Konz. <SEP> PGF,.
<tb>
Zellen, <SEP> unstimuliert <SEP> 0. <SEP> 22 <SEP> ng/ml <SEP>
<tb> Zellen, <SEP> stimuliert <SEP> 12 <SEP> ng/ml
<tb> Zellen, <SEP> stimuliert, <SEP> inkubiert <SEP> mit <SEP> Diclofenac <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> ng/ml <SEP>
<tb> Zellen, <SEP> stimuliert, <SEP> inkubiert <SEP> mit <SEP> Lornoxicam <SEP> 1. <SEP> 3 <SEP> ng/ml <SEP>
<tb> Zellen, <SEP> stimuliert, <SEP> inkubiert <SEP> mit <SEP> Aspirin <SEP> 12. <SEP> 2 <SEP> ng/ml <SEP>
<tb> Alle <SEP> Substanzen <SEP> wurden <SEP> mit <SEP> 1 <SEP> mol/1 <SEP> getested
<tb>
Beispiel 2
Zellen des Klones MM6.
X-2 werden mit potentiellen Hemmstoffen der Expression des Cyclooxygenase- 2 Genes, gelöst in Kulturmedium (RPM ! 1640 angereichert mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 160 ng/ml nicht-
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1 mM Oxalessigsäure 1 mM Pyruvat) inkubiert (10 min, Brutschrank bei 37 C, 5% C02 angereicherte Atmosphäre und annähernd 100% Luftfeuchtigkeit), und dann mit LPS (100ng/ml) für 6 Stunden stimuliert (Brutschrank bei 37 C, 5% C02 angereicherte Atmosphäre und annähernd 100% Luftfeuchtigkeit), um COX-2 zu induzieren. Danach wird das Kulturmedium erneuert, Arachidonsäure wird hinzugefügt und 15 Minuten weiter inkubiert. Der Kulturüberstand der Zellen wird abgehoben und auf seinen Gehalt an Produkten des Cyclooxygenasestoffwechsels hin mittels ELISA gemessen.
Claims (3)
- Patentansprüche 1. Ein Verfahren zur Identifikation und quantitativen Bestimmung von Substanzen, die das menschliche Enzym Cyclooxygenase-2 hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass a) Zellen eines nicht gentechnologisch manipulierten Klones der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit geeigneten Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren stimuliert werden, die solchermassen stimulierten Zellen zusammen mit potentiellen Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2 inkubiert werden und nach Zugabe von Arachidonsäure die Konzentration oder Menge der Produkte des Cyclooxyge- nasestoffwechsels im Kulturüberstand dieser Zellen mittels eines geeigneten Detektionsverfahrens gemessen wird, oder b)Zellen eines nicht gentechnologisch manipulierten Klones der menschlichen Zellinie Mono Mac 6 mit potentiellen Hemmstoffen der Cyclooxygenase-2 inkubiert werden, diese Zellen anschliessend mit geeigneten Wachstums- urdloder Differenzlerungsfaktoren stimuliert werden, und nach der Zugabe von Arachidonsäure die Konzentration oder Menge der Produkte des Cyclooxygenasestoffwechsels im Kulturüberstand dieser Zellen mittels eines geeigneten Detektionsverfahrens gemessen wird
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen des Subklons X-2 der menschli- chen Zellinie Mono Mac 6 verwendet werden.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Wachstums- und/oder Differenzie- rungsfaktoren Interleukin-1, Lipopolysaccharid oder Interferon-T oder Kombinationen davon, bevorzugt Llpopolysacchand, verwendet werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| AT13695A AT401061B (de) | 1995-01-26 | 1995-01-26 | Benutzung einer menschlichen monozytenartigen zellinie zur identifikation und bestimmung von substanzen zur hemmung des menschlichen enzyms cyclooxygenase-2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| AT13695A AT401061B (de) | 1995-01-26 | 1995-01-26 | Benutzung einer menschlichen monozytenartigen zellinie zur identifikation und bestimmung von substanzen zur hemmung des menschlichen enzyms cyclooxygenase-2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| ATA13695A ATA13695A (de) | 1995-10-15 |
| AT401061B true AT401061B (de) | 1996-06-25 |
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ID=3482487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| AT13695A AT401061B (de) | 1995-01-26 | 1995-01-26 | Benutzung einer menschlichen monozytenartigen zellinie zur identifikation und bestimmung von substanzen zur hemmung des menschlichen enzyms cyclooxygenase-2 |
Country Status (1)
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|---|---|
| AT (1) | AT401061B (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT402936B (de) * | 1996-05-29 | 1997-09-25 | Nycomed Austria Gmbh | Benutzung einer menschlichen zellinie zur identifikation und bestimmung von substanzen zur hemmung der induktion der expression des cyclooxygenase-2-genes |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994014977A1 (en) * | 1992-12-22 | 1994-07-07 | Merck Frosst Canada Inc. | HUMAN CYCLOOXYGENASE-2cDNA AND ASSAY FOR EVALUATING INHIBITION OF CYCLOOXYGENASE-2 |
-
1995
- 1995-01-26 AT AT13695A patent/AT401061B/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994014977A1 (en) * | 1992-12-22 | 1994-07-07 | Merck Frosst Canada Inc. | HUMAN CYCLOOXYGENASE-2cDNA AND ASSAY FOR EVALUATING INHIBITION OF CYCLOOXYGENASE-2 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT402936B (de) * | 1996-05-29 | 1997-09-25 | Nycomed Austria Gmbh | Benutzung einer menschlichen zellinie zur identifikation und bestimmung von substanzen zur hemmung der induktion der expression des cyclooxygenase-2-genes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATA13695A (de) | 1995-10-15 |
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