AT376421B

AT376421B - Verfahren zur herstellung neuer 2-hydroxymethyl-3,4,5-trihydroxypiperidinderiva e

Info

Publication number: AT376421B
Application number: AT415383A
Authority: AT
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1977-08-27
Filing date: 1983-11-28
Publication date: 1984-11-26
Also published as: ATA415383A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer 2-Hydroxymethyl-3, 4, 5-trihydroxy- piperidinderivate, bzw. ihre Salze und Stereoisomeren.

Die neuen Verbindungen können als Arzneimittel, insbesondere als Mittel gegen Diabetes, Hyperlipämie und Adipositas, sowie in der Tierernährung zur Beeinflussung des Fleisch/Fettver- hältnisses zugunsten des Fleischanteiles Verwendung finden.

Die neuen Derivate lassen sich durch die Formel (I) und insbesondere durch die Formel (Ib), die die bevorzugte stereoisomere Form beschreibt,
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wiedergegeben, in denen R, gegebenenfalls durch OH, NH2, COOH, Phenyl, Nitrophenyl, Carboxyphenyl, Sulfophenyl, Halogenphenyl, C 1-6-Alkylphenyl, Phenoxy, Halogenphenoxy, Pyridyl, Oxyranyl, N-Phthalimido, Glucopyranosylmercapto, Cycloalkyl oder Cycloalkenyl mit bis zu 6 C- - Atomen, Norbornenyl, Biphenyl, Alkoxy, Alkylthio, Alkoxyalkoxy, Alkoxyalkoxysulfonyl, Alkoxycarbonylphenyl mit jeweils bis zu 6 C-Atomen in den Alkylgruppen, substituiertes Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl mit bis zu 18 C-Atomen, bedeutet bzw. mit der benachbarten CHz-OH-Gruppe eine - CHz-CO-O-CHz-Gruppe bildet.

Die Erfindung betrifft somit auch die Herstellung pharmazeutisch annehmbarer Salze der Verbindungen der Formeln (I) und (Ib) wie Chloride, Sulfate, Acetate, Carbonate, Oxolate usw., und Bio-Vorläufer, wobei unter Bio-Vorläufer Verbindungen verstanden werden, deren Struktur sich von der aktiven Verbindung unterscheidet, die jedoch nach Verabreichung an Mensch oder Tier im Körper des Patienten in die aktive Verbindung umgewandelt werden.

Es wurde gefunden, dass die neuen Verbindungen der Formel (I), (Ib) potente Inhibitoren für a-Glucosidasen, insbesondere für Disaccharidasen sind. Daher sind die neuen Verbindungen wertvolle Mittel zur Beeinflussung einer Vielzahl von Stoffwechselvorgängen und bereichern somit den Arzneimittelschatz. Gegenüber dem aus der DE-OS 2656602 bekannten 2-Hydroxymethyl-3, 4, 5- - trihydroxypiperidin weisen die neuen Verbindungen vorteilhafte therapeutische Eigenschaften auf.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Formel (I), (Ib) ist vor allem dadurch gekennzeichnet, dass man 1-Desoxynojirimycin der Formel
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mit reaktiven Alkylierungsmitteln der allgemeinen Formel Z-R2, (Irl) in der R2 die für R, angegebene Bedeutung besitzt und Z eine bei Alkylierungsmitteln gebräuchliche, leicht austretende Gruppe, z. B.. eine Halogenidgruppe darstellt, umsetzt, gegebenenfalls in einer so erhaltenen Verbindung der Formel (I), in der Ri-CHz-COOR'ist, worin R'H, Alkyl, Aralkyl oder Aryl bedeutet, in bekannter Weise einen Laktonringschluss mit der benach-

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-CH2OH-Gruppeden.

Diese Aminogruppe kann man in an sich bekannter Weise mit Aldehyden oder Ketonen in Gegenwart eines Wasserstoffdonors, mit Alkylhalogeniden, Carbonsäure-oder Sulfonsäurechloriden, Chlorkohlensäureestern, Isocyanaten und Senfölen derivatisieren.

Für die Reaktion von 1-Desoxynojirimycin mit Alkylierungsmitteln sei die Reaktion mit Allylbromid als Beispiel angegeben :
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Das als Ausgangsprodukt der Formel (II) eingesetzte 1-Desoxynojirimycin wird entweder durch katalytische Hydrierung aus dem durch Fermentation erhältlichen Nojirimycin (s. S. INOUYE et. al, Tetrahedron 23,2125-2144 [1968]) oder durch Extraktion aus Maulbeerbaumrinde (s.

DE-OS 2656602) oder aber vollsynthetisch gewonnen. Nach einen neuen vorteilhaften Verfahren kann man 1-Desoxynojirimycin auch dadurch herstellen, dass man Organismen der Familie Bacillaceae in üblichen Nährlösungen bei Temperaturen von etwa 15 bis etwa 80 C etwa 1 bis etwa 8 Tage unter Belüftung in üblichen Fermentationsgefässen kultiviert, die Zellen abschleudert und die Desoxyverbindung aus der Kulturbrühe oder den Zellextrakten durch übliche Reinigungsverfahren isoliert (DE-AS 2658563 - [Le A 17587]).

Die reaktiven Alkylierungsmittel der Formel (III) sind bekannt oder können nach gängigen Verfahren hergestellt werden. Die Umsetzung mit dem 1-Desoxynojirimycin erfolgt in inerten organischen Lösungsmitteln bei Raum- bis Siedetemperatur mit oder ohne Zusatz eines säurebindenden Mittels.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen der Formel (I), (Ib) sind Inhibitoren und eignen sich als Therapeutica für folgende Indikationen :
Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies, Infektionen des Gastro-Intestinaltraktes, Meteorismus, Flatulenz, Hypertension, Atherosklerose und besonders Adipositas, Diabetes und Hyperlipo- protämie.

Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums kann es sich empfehlen, Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, die sich gegenseitig in ihrer Wirkung ergänzen, zu kombinieren, sei es, dass es sich um Kombinationen der erfindungsgemäss erhaltenen Inhibitoren untereinander oder um Kombinationen der erfindungsgemäss erhaltenen Inhibitoren mit bereits bekannten behandelt. So kann es beispielsweise zweckmässig sein, erfindungsgemäss erhaltene Saccharase-Inhibitoren mit bereits bekannten Amylase-Inhibitoren zu kombinieren.

Vorteilhaft sind in manchen Fällen auch Kombinationen der neuen Inhibitoren mit bekannten oralen Antidiabetica (ss-cytotrope Sulfonylharnstoffderivate und/oder blutzuckerwirksame Biguanide) sowie mit blutlipid-senkenden Wirstoffen wie z. B. Clofibrat, Nicotinsäure, Cholestyramin u. a.

Die Wirkstoffe können ohne Verdünnung, z. B. als Pulver oder in einer Gelatinehülle oder in Kombination mit einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung appliziert werden.

Pharmazeutische Zubereitungen können eine grössere oder kleinere Menge des Inhibitors enthalten, z. B. 0, 1 bis 99, 5%, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen,

inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff eine oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nichttoxisches, inertes und pharmazeutisch verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten kann. Solche pharmazeutischen Zubereitungen liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten vor, d. h. physikalisch diskreten, eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis entsprechen, die zur Herbeiführung der gewünschten Hemmwirkung erforderlich sind.

Die Dosierungseinheiten können 1, 2,3, 4 oder mehr Einzeldosen oder 1/2,1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff, um bei einer Applikation gemäss eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer oder mehrerer Dosierungseinheiten die gewünschte Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine ganze, eine halbe, oder ein Drittel oder ein Viertel der Tagesdosis gewöhnlich zu allen, Haupt- und Nebenmahlzeiten am Tage verabreicht wird. Andere therapeutische Mittel können auch eingenommen werden.

Obgleich die Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abgewogen werden sollte, unter Anwendung gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters, des Gewichtes und des Zustandes des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich zwischen etwa 1 bis etwa 1 x 10 4 SIE/kg des Körpergewichtes/Tag liegen. In manchen Fällen wird man dabei eine ausreichende therapeutische Wirkung mit einer geringeren Dosis erreichen, während in andern Fällen eine grössere Dosis erforderlich sein wird.

Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssiger Dosierungseinheiten durchgeführt werden, wie z. B. Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulate, Suspensionen, Lösungen u. dgl.

Pulver wird durch Zerkleinerung des Wirkstoffes in einer geeigneten Grösse und Vermischen mit einem ebenfalls zerkleinerten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt. Obgleich ein essbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke, Lactose, Saccharose oder Glucose normalerweise zu diesem Zwecke Verwendung findet und auch hier benutzt werden kann, ist es wünschenswert ein nicht metabolisierbares Kohlenhydrat, wie z. B. ein Cellulosederivat zu benutzen.

Süssmittel, Geschmackszusätze, Konservierungsstoffe, Dispergiermittel und Färbemittel können auch mitverwendet werden.

Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschriebenen Pulvermischung und durch Füllung bereits gebildeter Gelatinehüllen hergestellt werden. Die Pulvermischung kann man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln, wie z. B. Kieselgel, Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat oder festen Polyäthylenglykol versetzen. Die Mischung kann man ebenfalls mit einem Desintegrator oder Lösungsvermittler, wie z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat versetzen, um bei Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors zu verbessern.

Die Anfertigung der Tabletten erfolgt z. B. durch Herstellung einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und Hinzufügung eines Gleitmittels und Desintegrators. Aus dieser Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet man vor durch Mischung des Wirkstoffes, welcher in geeigneter Weise zerkleinert wurde und ergänzt ein Verdünnungsmittel oder eine andere Trägersubstanz wie oben beschrieben. Gegebenenfalls fügt man ein Bindemittel hinzu : z. B. Carboxymethyl-
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sungen aus Cellulose- oder Polymerenmaterialien. Danach presst man das Produkt durch ein grobes Sieb. Als Alternative hiezu kann man die Pulvermischung durcheine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich ergebenden ungleichmässig geformten Stücke bis auf Korngrösse zerkleinern.

Damit die entstandenen Körner nicht in den tablettenbildenden Düsen stecken bleiben, kann man sie mit einem Gleitmittel versetzen, wie z. B. Stearinsäure, Stearatsalz, Talkum oder Mineralöl.

Diese gleitfähig gemachte Mischung wird dann in Tablettenform gepresst. Die Wirkstoffe können auch mit freifliessenden inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in Tablettenform ge-
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können diesen Überzügen beigefügt werden, damit zwischen den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschieden werde kann.

Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z. B. Lösungen, Sirup und Elixiere, lassen sich in Dosierungseinheiten herstellen, so dass eine bestimmte Menge Präparat eine bestimmte Menge Wirkstoff enthält. Sirup kann so hergestellt werden, dass der Wirkstoff in einer wässerigen Lösung, welche geeignete Geschmacksstoffe enthält, gelöst wird ; Elixiere werden unter Verwendung nichttoxischer, alkoholischer Trägerstoffe erhalten ; Suspensionen kann man durch Dispergieren der Verbindung in einem nichttoxischen Trägerstoff darstellen. Lösungsvermittler und Emulgiermittel, wie z. B. äthoxylierte Isostearylalkohole und Polyoxyäthylensorbitester, Konservierungsmittel, geschmacksverbessernde Zusätze wie z. B. Pfefferminzöl oder Saccharin u. dgl. können auch zugegeben werden.

Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, dass der Wirkstoff verzögert abgegeben wird, z. B. durch Einhalten des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen, Wachse od. dgl.

Zusätzlich zu den oben erwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen lassen sich auch diese Wirstoffe enthaltende Lebensmittel herstellen : beispielsweise Zucker, Brot, Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere Konfektartikel, und Konserven, wie z. B. Marmelade, wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch-wirksame Menge mindestens eines der erfindungsgemäss erhaltenen Inhibitoren gegeben wurde.

Die unter Verwendung der neuen Wirkstoff hergestellten Nahrungsmittel eignen sich sowohl zur Diät bei Patienten, die an Stoffwechselstörungen leiden als auch zur Ernährung gesunder Personen im Sinne einer Stoffwechselstörungen vorbeugenden Ernährungsweise.

Die erfindungsgemäss hergestellten Inhibitoren weisen weiterhin die Eigenschaft auf, in Tieren das Verhältnis des Anteiles an unerwünschtem Fett zum Anteil des erwünschten fettarmen Fleisches (mageres Fleisch) zugunsten des mageren Fleisches in hohem Masse zu beeinflussen. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von landwirtschaftlichen Nutztieren, z. B. in der Schweinemast, aber auch von erheblicher Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von sonstigen Nutztieren und Ziertieren. Die Verwendung der Inhibitoren kann weiterhin zu einer erheblichen Rationalisierung der Fütterung der Tiere führen, sowohl zeitlich, mengenmässig wie auch qualitätsmässig.

Da sie eine gewisse Verzögerung der Verdauung bewirken, wird die Verweildauer der Nährstoffe im Verdauungstrakt verlängert, wodurch eine mit weniger Aufwand verbundene ad libitum-Fütterung ermöglicht wird. Weiterhin ergibt sich bei der Verwendung der erfindungsgemässen Inhibitoren in vielen Fällen eine erhebliche Einsparung von wertvollem Proteinfutter.

Die Wirkstoffe können somit praktisch in allen Bereichen der Tierernährung als Mittel zur Reduzierung des Fettansatzes sowie der Einsparung von Futtereiweiss verwendet werden.

Die Wirksamkeit der Wirkstoffe ist hiebei weitgehend unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe bei Tierarten, die überhaupt oder in bestimmten Lebensabschnitten zu stärkerer Fetteinlagerung neigen.

Als Tiere, bei denen die Inhibitoren zur Reduzierung des Fettansatzes und/oder zur Einsparung von Futtereiweiss eingesetzt werden können, seien beispielsweise folgende Nutz- und Ziertiere genannt : Warmblüter wie Rinder, Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z. B. Nerze, Chinchilla, andere Ziertiere, z. B. Meerschweinchen und Hamster, Labor- und Zootiere, z. B. Ratten, Mäuse, Affen usw. Geflügel, z. B. Broiler, Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel und Kaltblüter, wie Fische, z. B. Karpfen und Reptilien, z. B. Schlangen.

Die Menge der Wirkstoffe, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften der Wirkstoffe weitgehend variiert werden.

Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0, 5 mg bis 2, 5 g, insbesondere 10 bis 100 mg/kg Futter/Tag. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende Dauer der Verabreichung stehen in engem Zusammenhang mit dem Fütterungsziel. Sie hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Wirkstoffe werden den Tieren nach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Allgemeinzustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich, in regelmässigen oder unregelmässigen Abständen oral, erfolgen. Aus Zweckmässigkeitsgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere im Rhythmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.

Die Wirkstoffe können als Reinstoffe oder in formulierter Form verabreicht werden, wobei die formulierte Form sowohl als Premix, also in Mischung mit. nichttoxischen inerten Trägerstoffen beliebiger Art, als auch als Teil einer Gesamtration in Form eines Beifutters bzw. als Mischungsbestandteil eines alleinigen Mischfutters zu verstehen ist. Mit eingeschlossen ist auch die Applikation geeigneter Zubereitungen über das Trinkwasser.

Die Wirkstoffe können gegebenenfalls in formulierter Form auch zusammen mit andern Nährund Wirkstoffen, z. B. Mineralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen, Eiweissstoffen, Energieträgern (z. B. Stärke, Zucker, Fette), Farbstoffen und/oder Geschmacksstoffen oder andern Futterzusatzstoffen, wie z. B. Wachstumsförderern, in geeigneter Form verabreicht werden. Die Wirkstoffe können den Tieren vor, während oder nach der Nahrungsaufnahme gegeben werden.

Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit dem Futter und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters und/oder Trinkwassers zugegeben werden.

Die Wirkstoffe können nach üblichen Methoden durch einfaches Mischen als Reinstoffe, vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form in Mischung mit essbaren, nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls auch in Form eines Premix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/oder dem Trinkwasser beigefügt werden.

Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise die erfindungsgemässen Wirkstoffe in einer Konzentration von etwa 0, 001 bis 5, 0%, insbesondere 0, 02 bis 2, 0% (Gewicht) enthalten.

Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffes im Futter und/oder Trinkwasser in insbesondere abhängig von der Menge der Futter- und/oder Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden.

Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hiebei ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen oder speziellen Futterzusammensetzungen verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogende Ernährung notwendige Gleichgewicht aus Energieund Eiweissstoffen, einschliesslich Vitaminen und Mineralstoffen enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen, z. B. Ölkuchenschroten, Getreideschroten, Getreidenebenprodukten, aber auch aus Heu, Gärfutter, Rüben und andern Futterpflanzen, aus
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Jod usw.

Premixe können vorzugsweise etwa 0, 1 bis 50%, insbesondere 0, 5 bis 5, 0% (Gewicht) Wirk-
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B. N-Methyl-1-desoxynojirimycingestellt.

Mischfutter enthalten vorzugsweise 0, 001 bis 5, 0%, insbesondere 0, 02 bis 2, 0% (Gewicht) Wirkstoff, beispielsweise N-Methyl-1-desoxynojirimycin neben den üblichen Rohstoffkomponenten eines Mischfutters, z. B. Getreideschrote oder-nebenprodukte, Ölkuchenschrote, tierisches Eiweiss, Mineralien, Spurenelemente und Vitamine. Sie können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.

Vorzugsweise in Premixen und Mischfuttermitteln können die Wirkstoffe gegebenenfalls auch durch ihre Oberfläche bedeckenden geeigneten Mitteln, z. B. mit nichttoxischen Wachsen oder Gelatine vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt werden.

Beispiel für die Zusammensetzung eines fertigen Mischfutters, für Geflügel, das einen erfindungsgemässen Wirkstoff enthält :
200 g Weizen, 340 g Mais, 360, 3 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat,

10 g Calciumcarbonat, 4 g jodiertes Kochsalz, 7, 5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3, 2 g Wirkstoff- - Premix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus :
6000 I. E. Vitamin A, 1000 I. E. Vitamin Da, 10 mg Vitamin E, 1 mg Vitamin Ks, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 mcg Vitamin B, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure,
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20 mg CuS04 x 5H O. Der Wirkstoff-Premix enthält z. B. N-Methyl-l-desoxynojirimycin in der gewünschten Menge, z. B. 1600 mg und zusätzlich 1 g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl, dass 3, 2 g Premix entstehen.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweinemischfutters, das einen Wirkstoff der Formel (I), (Ib) enthält :
630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais, 150 g Gerste, 150 g Hafer - und
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kuchenmehl, 30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Premix (Zusammensetzung z. B. beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur Aufzucht und Mast von Küken bzw.

Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.

Die Inhibitoren können einzeln oder aber auch in beliebigen Mischungen untereinander verwendet werden.

Saccharase-Inhibitionstest in vitro
Der Saccharase-Inhibitionstest in vitro ermöglicht die Bestimmung der enzyminhibitorischen Aktivität einer Substanz durch den Vergleich der Aktivität des solubilisierten intestinalen Disaccharidasen-Komplexes in Gegenwart bzw. in Abwesenheit (sogenannter 100% Wert) des Inhibitors.

Als Substrat, welches die Spezifität des Inhibitionstestes bestimmt, dient dabei eine praktisch glucosefreie Saccharose (Glucose 100. ppm) : die Enzymaktivitätsbestimmung basiert auf der spektrophotometrischen Bestimmung freigesetzter Glucose mittels Glucose-Dehydrogenase und Nicotinamid- - adenin-dinucleotid als Cofaktor.

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als diejenige inhibitorische Aktivität, welche in einem definierten Testansatz eine vorgegebene saccharolytische Aktivität um eine Einheit (Saccharase-Einheit = SE) reduziert ; die Saccharase-Einheit ist dabei als diejenige Enzymaktivität definiert, welche unter vorgegebenen Bedingungen ein ! lMol Saccharose/min spaltet und damit zur Freisetzung von je en idol Glucose, welche in Test bestimmt wird, und Fuctose, welche im Test nicht erfasst wird, führt.

Der intestinale Disaccharidasen-Komplex wird aus Schweinedünndarm-Mucosa durch tryptische Verdauung, Fällung aus 66% Äthanol bei -20oC, Aufnehmen des Fällungsproduktes in 100 mMol Phosphat-Puffer, PH 7, 0 und abschliessende Dialyse gegen denselben Puffer gewonnen.

10 lil einer Probelösung, die so angesetzt ist, dass die Extinktion des Testansatzes mindestens 10%, jedoch nicht mehr als 25% unter der des 100% Wertes liegt, werden mit 100 gel einer Verdünnung des intestinalen Disaccharidasen-Komplexes in 0, 1 Mol Maleinat-Puffer, PH 6, 25, versetzt und für 10 min bei 37 C vorinkubiert. Die Verdünnung des Disaccharidasen-Komplexes ist auf eine Aktivität von 0, 1 SE/ml einzustellen.

Anschliessend wird die saccharolytische Reaktion durch Zugabe von 100 gel einer 0, 4 Mol Lösung von Saccharose ("SERVA 35579") in 0, 1 Mol Maleinat-Puffer, PH 6, 25 gestartet und nach einer Inkubationsdauer von 20 min bei 37 C durch die Zugabe von 1 ml Glucose-Dehydrogenase- - Reagens (l Fläschchen Glucose-Dehydrogenase-Mutarotase-Gemisch lyophilisiert ("MERCK 14053") und 331, 7 mg ss -Nicotinamid-adenin-dinucleotid (freie Säure, "BOEHRINGER" Reinheitsgrad I) in 250 ml 0, 5 Mol Tris-Puffer, PH 7, 6 gelöst) abgestoppt. Zum Nachweis der Glucose wird 30 min bei 37 C inkubiert und schliesslich bei 340 nm gegen einen Reagenzienblank (mit Enzym, jedoch ohne Saccharose) photometriert.

Die Berechnung der Hemmaktivität von Inhibitoren ist dadurch erschwert, dass schon geringfügige Änderungen im Testsystem, beispielsweise ein geringfügig von Bestimmung zu Bestimmung

variierender 100% Wert, von nicht mehr zu vernachlässigendem Einfluss auf das Testergebnis sind.

Man umgeht diese Schwierigkeiten, indem man bei jeder Bestimmung einen Standard mitlaufen lässt, als Standard dient ein Saccharase-Inhibitor der Formel C2s H43 0, N, welcher eine spezifische Hemmaktivität von 77700 SIE/g aufweist und bei eingesetzten Mengen von 10 bis 20 ng im Test zu einer Hemmung von oben spezifizierter Grössenordnung führt. Bei Kenntnis der Differenz der Extinktionen bei 340 nm von 100% Wert und durch Standard gehemmtem Ansatz lässt sich aus der Extinktionsdifferenz von 100% Wert und durch die Probelösung gehemmtem Ansatz unter Berücksichtigung der eingesetzten Menge an Inhibitor in bekannter Weise dessen spezifische Hemmaktivität errechnen, ausgedrückt in Saccharase-Inhibitor-Einheiten/g (SIE/g).

Spezifische saccaraseinhibitorische Aktivität in vitro
1-Desoxynojirimycin 465000 SIE/g
N-Methyl-1-desoxynojirimycin 2330000 SIE/g
Beispiel 1 : N-Allyl-1-desoxynojirimycin
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5 g 1-Desoxynojirimycin in 30 ml Dimethylformamid und 30 ml H20 wurden mit 5 g Ag20 und 5 g Allylbromid 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurden die Silbersalze abfiltriert und das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Der Rückstand wurde aus Äthanol umkristallisiert.

Ausbeute : 4, 5 g N-Allyl-1-desoxynojirimycin vom Fp. : 131 bis 132OC.

Beispiel 2 : N-Benzyl-1-desoxynojirimycin
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Zu 13, 04 g 1-Desoxynojirimycin und 15, 48 g K2C03 (wasserfrei) in 130 ml getrocknetem Dimethylformamid wurden bei 200C 17, 1 g Benzylbromid in 20 ml getrocknetem Dimethylformamid zugetropft. Dann wurde 2 h bei 25 bis 30 C gerührt und danach aufgearbeitet. Man entfernt die Salze aus dem Reaktionsgemisch durch Filtrieren, versetzt die klare Dimethylformamidlösung mit 150 ml H20 und extrahiert mit Diäthyläther, um das überschüssige Benzylbromid zu entfernen. Das Dimethylformamid-Wasser Gemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand wurde mit Äthanol zum Sieden erhitzt und über Kieselgur geklärt. Beim Abkühlen kristallisierte das Produkt aus. Es wurde abgesaugt, mit Äthanol nachgewaschen und getrocknet.

Ausbeute : an N-Benzyl-1-desoxynojirimycin 10, 5 g mit einem Fp. : von 185 C.

Analog Beispiel 1 oder 2 wurden die folgenden Verbindungen hergestellt :
Dabei erfolgte die Isolierung und Reinigung der Endprodukte gegebenenfalls auch durch eine Chromatographie über Ionenaustauscher.

Beispiel 3: N-Propargyl-1-desoxynojirimycin
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Fp.: 160 C (aus Aceton) Beispiel 4 : N-(3',4'-Dichlorbenzyl)-1-desoxynojirimycin
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Fp. : 130 bis 1320C Beispiel 5 : N- (p-Nitrobenzyl)-l-desoxynojirimycin
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Fp. : 144 bis 146 C Beispiel 6 : N- (m-Nitrobenzyl)-l-desoxynojirimycin
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Fp. : 168 bis 170 C Beispiel 7 :

N-Methyl-l-desoxynojirimycin
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Fp. : 1530C (Äthanol)

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: N-n-Butyl-1-desoxynojirimycinMassenspektrum : Der wichtigste Peak im oberen Massenbereich liegt bei m/e = 230 (M-CH2OH).

Ausserdem findet man Peaks bei m/e = 262 (M+H) und 260 (M-H).

Beispiel 13 : N- (2-Pyridyl)-methyl-l-desoxynojirimycin
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Massenspektrum : Die wichtigsten Peaks im oberen Massenbereich findet man bei m/e = 255 (M+H), m/e = 236 (M-H20) und m/e = 223 (M-CH20H).

Fp. : 174 bis 175 C (Äthanol)
Beispiel 14 : N-2-Hydroxyäthyl-l-desoxynojirimycin
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Fop. : 114C (Äthanol)
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und m/e = 176. Die Substanz ist ein Gemisch zweier diastereomerer Verbindungen.

Beispiel 16 :N-(S-ss-D-Glucopyranosyl-2-mercaptoäthyl)-1-desoxynojirimycin
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:funden.

Die Verbindung wurde durch Auskochen mit Aceton und Umkristallisation aus Äthanol gereinigt.

Fp. : 208 bis 210 C
Beispiel 19 : N- (3-Amino-n-propyl)-l-desoxynojirimycin
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Massenspektrum : Die wichtigsten Peaks im oberen Massenbereich liegen bei m/e = 189' (M-CH2OH) und m/e = 146. Die Verbindung wurde aus obiger Phthalimidoverbindung durch Hydrazinolyse in Methanol gewonnen.

Beispiel 20 : N- (l-Desoxynojirimycin-yl)-essigsäure
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:(M-H2O), m/e = 159, m/e = 145 und m/e = 100.

Die Reinigung der Verbindung erfolgte durch Umkristallisation aus Methanol/Wasser.

Fp. : 187 bis 188 C

Beispiel 21 : N-o-Nitrobenzyl-l-desoxynojirimycin
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Rf-Wert : 0, 85 (auf DC-Fertigplatten der Firma Merck Kieselgel 60 ; Fliessmittel : Essigester/ Methanol/H2O/25%iger Ammoniak 100 : 60 : 40 : 2).

Zum Vergleich : Rf-Wert von 1-Desoxynojirimycin : 0, 3.

Beispiel 22 : N-o-Carboxybenzyl-l-desoxynojirimycin
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Rf-Wert : 0, 7 (Platten und Fliessmittel wie bei vorstehender Verbindung angegeben).

Zur Reinigung wurde die Verbindung über basischen Ionenaustauscher chromatographiert,
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: N-p-Carboxybenzyl-l-desoxynojirimycinRf-Wert : 0, 7 (Platten und Fliessmittel wie oben angeben). Auch hier wurde die Verbindung mit l% iger Essigsäure vom basischen Austauscher eluiert.

Fp. : 280 bis 281 C (Methanol)
Beispiel 24: N-ss-Phenyläthyl-1-desoxynojirimycin
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Fp. : 179 bis 181 C Beispiel 25 : N-n-Pentyl-1-desoxynojirimycin
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Fp. : 97 C (aus Aceton)

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Beispiel 31: N-n-Dodecyl-1-desoxynojirimycin
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Fp. : 1640C (sintert bei 97 C, aus Äthanol/Aceton) Beispiel 32: N-n-Tetradecyl-1-desoxynojirimycin
EMI14.2
Fp. : 105 bis 1070C (aus Methanol) Beispiel 33 : N-n- (5'-Hydroxypentyl)-l-desoxynojirimycin
EMI14.3
Fp. : 86 bis 87 C (aus Butanol) Beispiel 34 :

N-Cyclohexylmethyl-1-desoxynojirimycin
EMI14.4
Fp. : 138 bis 140 C (aus Aceton) Beispiel 35 : N-(3'-Cyclohexenylmethyl)-1desoxynojirimycin
EMI14.5
Fp. : 142 bis 1440C (aus Aceton)

Beispiel 36: N-(2'-Norbornen-5'-yl-methyl)-1-desoxynojirimycin
EMI15.1
Fp. : 160 bis 162 C (aus Äthanol)
EMI15.2

EMI15.3
: N-p-Chlorbenzyl-1-desoxynojirimycinFp. : 153 bis 1550C (aus Aceton) Beispiel 38: N-m-Methylbenzyl-1-desoxynojirimycin
EMI15.4
Fp. : 134 bis 136 C (aus Methanol) Beispiel 39 : N- (p-Biphenylmethyl)-l-desoxynojirimycin
EMI15.5
Fp. : 240 bis 2450C (aus Wasser/Äthanol) Beispiel 40 :

N- (n-3'-Phenylpropyl)-l-desoxynojirimycin
EMI15.6
Fp. : 125 bis 1270C (aus Äthanol)

Beispiel 41 : N-5, 5-7, 7-Tetramethyl-octen-2-yl-l-desoxynojirimycin
EMI16.1
Fp. : 112 bis 118 C Beispiel 42 : N-Cinnamyl-l-desoxynojirimycin
EMI16.2
Fop. : 163C
EMI16.3

EMI16.4
: N-Undecen-10-yl-l-desoxynojirimycinFp. : 144 bis 146 C Beispiel 44: N-(ss-Methoxyäthyl)-1-desoxynojirimycin
EMI16.5

Rf-Wert : 0, 57 (dünnschichtchromatographisch auf gebrauchsfertigen Silicagel 60-Platten der Fa.

Merck, Laufmittel: Äthylacetat/Methanol/H2O/25% Ammoniak 100 : 60 : 40 : 2).
EMI16.6

EMI16.7

EMI16.8

EMI17.1

EMI17.2

EMI17.3
m/e = 176 (base peak).

Beispiel 47 : N- [ss- (8'-Methoxy)-äthoxyäthyl]-1-desoxynojirimycin
EMI17.4

Massenspektrum : Die wichtigsten Peaks im oberen Massenbereich liegen bei m/e = 234 und m/e = 176. Weitere Peaks findet man bei m/e = 218, m/e = 204, m/e = 158, m/e = 146 und m/e = 132.

Beispiel 48 : N-(4-Methoxycarbonylbenzyl)-1-desoxynojirimycin vom Fp. : 197 C.
EMI17.5

Beispiel 49: N-(1-Desoxynojirimycin-yl)-essigsäure-6-lacton
EMI17.6

5 g N-(1-Desoxynojirimycin-yl)-essigsäure wurden in 50 ml Dimethylformamid 1/2 h unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum am Rotationsverdampfer entfernt und das zurückbleibende Öl aus 25 ml Äthanol kristallisiert. Ausbeute an N- (l-Desoxynojirimycin-yl)- - essigsäure-6-lacton : 3, 5 g vom Schmp. : 157 bis 159 C.

Beispiel 50 : N-(1Desoxynojirimycin-yl)-essigsäurebenzylamid
EMI17.7

500 mg N-(1-Desoxynojirimycin-yl)-essigsäure-6-lacton wurden mit 1 ml Benzylamin in 20 ml DMF 6 h unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt und der Rückstand aus Äthanol/Aeeton l : 2 umkristallisiert.

Ausbeute : 400 mg N-(1-Desoxynojirimycin-yl)-essigsäurebenzylamid vom Schmp. : 129 C.
EMI18.1

EMI18.2

EMI18.3
m/e = 203, m/e = 176, m/e = 159 und m/e = 145.

Beispiel 52 : CH2OH --N-CH2-CHz-CO-NH HO- < > . HCl
EMI18.4
HC-COOCHs4, 7 g ss-[N-(1-Desoxynojirimycin-yl)]-propionsäure wurden mit 5, 03 g Phenylglycinester-hydrochlorid und 6, 3 g Dicylohexylcarbodiimid in einem Gemisch von 80 ml Pyridin und 80 ml Wasser 3 h bei 60 C gerührt. Es wurde abgekühlt und abgesaugt. Das Filtrat wurde eingeengt, der Rückstand in 100 ml Wasser aufgenommen, vom Unlöslichen filtriert und 2mal mit Essigester ausgeschüttelt. Die wässerige Phase wurde eingeengt, der Eindampfrückstand in wenig Wasser gelöst und auf eine Aceton/Cellulosesäule aufgetragen.

Nach Abtrennung der Nebenprodukte erhielt man das gewünschte Produkt mit 85% Aceton mit einer Ausbeute von 3, 0 g.
EMI18.5

EMI18.6

16 g 1-Desoxynojirimycin wurden in 60 ml Wasser gelöst und nacheinander mit 40 ml Methanol und 32 ml 3-Chlorphenoxy-2, 3-epoxypropan versetzt. Es wurde 72 h bei 20 bis 25 C gerührt und eingeengt. Der Eindampfrückstand wurde in Wasser aufgenommen und 2mal mit Äther ausgeschüttelt.

Die wässerige Phase wurde auf eine Kationenaustauschersäule Amberlite IR 120 aufgetragen und sorgfältig mit Methanol/Wasser im Volumenverhältnis 8 : 1 gewaschen. Anschliessend wurde mit 2% Ammoniak in Methanol/Wasser 8 : 1 chromatographiert. Die reinen Fraktionen wurden eingeengt und der Eindampfrückstand mit wenig Methanol kristallisiert. Man erhielt 10, 1 g farblose Kristalle vom Fp. 120 bis 123 C.

EMI19.1

EMI19.2

EMI19.3

EMI19.4

EMI19.5
6 h bei 500C gerührt. Nach weiterem 20 stündigem Rühren bei 20 C wurde aufgearbeitet. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand wurde mit 2-Methoxyäthanol zum Sieden erhitzt und mit Aktivkohle geklärt. Man liess das Produkt bei 200C auskristallisieren.

Es wurde abgesaugt, mit 2-Methoxyäthanol, dann mit Äthanol nachgewaschen und getrocknet. Die so erhaltenen 84, 2 g N- (ss-Hydroxyäthyl)-l-desoxynojirimycin mit einem Fp. von 144 bis 145, 5 C
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gem78, 3 g mit einem Fp. von 147 bis 149 C.

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung neuer 2-Hydroxymethyl-3, 4, 5-trihydroxypiperidinderivate der allgemeinen Formel EMI19.7 in der R, gegebenenfalls durch OH, NH2, COOH, Phenyl, Nitrophenyl, Carboxyphenyl, Sulfophenyl, Halogenphenyl, C l 6 -Alkylphenyl, Phenoxy, Halogenphenoxy, Pyridyl, Oxyranyl, N-Phthalimido, Glucopyranosylmercapto, Cycloalkyl oder Cycloalkenyl mit bis zu 6 C-Atomen, Norbornenyl, Biphenyl, Alkoxy, Alkylthio, Alkoxyalkoxy, Alkoxyalkoxysulfonyl oder Alkoxycarbonylphenyl mit jeweils bis zu 6 C-Atomen in den Alkylgruppen, substituiertes Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl mit bis zu 18 C-Atomen bedeutet, bzw.

mit der benachbarten -CH2-OH-Gruppe eine -CH2-CO-O-CH2-Gruppe bildet, sowie ihrer Salze und Stereoisomeren, dadurch gekennzeichnet, dass man 1-Desoxynojirimycin der Formel <Desc/Clms Page number 20> EMI20.1 mit reaktiven Alkylierungsmitteln der allgemeinen Formel Z-R2, (ils) in der R2 die oben für R, angegebene Bedeutung besitzt und Z eine bei Alkylierungsmitteln ge- EMI20.2 Alkyl, Aralkyl oder Aryl bedeutet, in bekannter Weise einen Laktonringschluss mit der benachbarten -CH2OH-Gruppe durchführt, die erhaltenen Verbindungen der Formel (I) gegebenenfalls in Salze umwandelt sowie gegebenenfalls in die Stereoisomeren auftrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man reaktive Alkylierungsmittel der Formel (III) einsetzt, in der R2 C, -Cs-Alkyl, Hydroxyäthyl oder Benzyl bedeutet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man reaktive Alkylierungsmittel der Formel (III) einsetzt, in der R2 Hydroxyäthyl bedeutet.