WO2006106763A1 - リンパ球増殖抑制因子の除去方法 - Google Patents

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WO2006106763A1
WO2006106763A1 PCT/JP2006/306526 JP2006306526W WO2006106763A1 WO 2006106763 A1 WO2006106763 A1 WO 2006106763A1 JP 2006306526 W JP2006306526 W JP 2006306526W WO 2006106763 A1 WO2006106763 A1 WO 2006106763A1
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body fluid
adsorbent
blood
extracorporeal circulation
lymphocyte proliferation
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Akira Kobayashi
Shinya Yoshida
Hideo Niwa
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Kaneka Corporation
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    • A61M1/3621—Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3623—Means for actively controlling temperature of blood

Definitions

  • the present invention relates to the suppression of lymphocyte proliferation in blood through extracorporeal circulation in cancer, infectious diseases, immune diseases, etc., in which immunocompetent cells (particularly lymphocytes) in the blood are poorly proliferated or in a growth-suppressed state.
  • the present invention relates to an extracorporeal circulation system and a body fluid treatment method for releasing a state in which lymphocyte proliferation is suppressed by adsorbing and removing factors.
  • lymphocyte fraction is collected by density gradient centrifugation, and autologous plasma is added to a dedicated culture medium for culturing.
  • the ability to grow about 100 times the number of initial cultured lymphocytes in a week usually shows that lymphocytes hardly grow in autologous plasma, and there are cancer patients that can grow in other people's plasma (donation). It is getting stronger. This suggests the presence of a factor that suppresses the proliferation of lymphocytes in its own plasma.
  • Cancer cells are transforming, growth, factor, beta (hereinafter abbreviated as TGF- ⁇ ), interleukin 4 (hereinafter abbreviated as IL4), interleukin 6 (hereinafter abbreviated as IL6), and interleukin 10 (hereinafter abbreviated as IL10).
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇
  • IL4 interleukin 4
  • IL6 interleukin 6
  • IL10 interleukin 10
  • PGE2 prostaglandin ⁇ 2
  • the factor commercially available as a reagent Sites that strongly inhibit lymphocyte proliferation other than the above factors, such as the ability to dissolve babies in plasma at a high concentration and study the effect on lymphocyte proliferation, with little inhibition. The presence of some lymphocyte growth inhibitory factor other than force-in is suggested.
  • adsorbents that adsorb and remove immunosuppressive acidic proteins (Patent Document 1)
  • adsorbents that adsorb and remove interleukins in body fluids Patent Document 2
  • TGF- ⁇ immunosuppressive acidic proteins
  • Patent Document 3 adsorbents to be adsorbed
  • all are limited to adsorption removal of cytodynamic ins, and there are no reports of adsorbents that improve lymphocyte proliferation.
  • the number of patients receiving the treatment is increasing year by year, but the number of patients who depend on blood donation due to poor lymphocyte proliferation is increasing.
  • an adsorbent in which a material that adsorbs an immunosuppressive protein such as cytodynamic ins is bound to a water-insoluble carrier (Patent Documents 4, 5, and 6).
  • the adsorbent is based on the affinity of immunosuppressive proteins such as amine residues and cytodynamic ins. Therefore, the adsorbent requires the presence of an amine residue.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 56-092824
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 08-257398
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-218840
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-310751
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-339854
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-73618
  • lymphocytes in cancer, infectious diseases, immune diseases, etc. where the immunocompetent cells (especially lymphocytes) in the blood are poorly proliferating or in a growth-inhibited state (hereinafter referred to as “lymphocytes”) Prohibition of growth inhibition "t, u) Processing is awaited!
  • an object of the present invention is to release a lymphocyte proliferation-suppressed state, improve the proliferation of lymphocytes, and pass body fluids without losing useful substances in body fluids. It is to provide a processing method and a system for extracorporeal circulation.
  • an adsorbent containing a polymer compound having a water contact angle force of 0 ° in the range of 98 ° is also present in the presence of a divalent cation chelating agent.
  • adsorbent containing activated carbon with bodily fluids to release the lymphocyte proliferation inhibitory state, improve lymphocyte proliferation, and red blood cells, leukocytes, and platelets in bodily fluids
  • the present inventors have found that it is possible to pass blood well with almost no loss of blood cells such as the above, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to an adsorbent containing a polymer compound having a water contact angle of 40 ° force and 98 ° in the presence of a divalent cation chelating agent by means of an extracorporeal circulation method.
  • a body fluid treatment method for releasing a lymphocyte proliferation-suppressed state comprising contacting with
  • a body fluid treatment method for releasing a lymphocyte proliferation-suppressed state comprising contacting an adsorbent containing activated carbon with a mammalian body fluid by an extracorporeal circulation method;
  • An extracorporeal circulation system comprising a bodily fluid transfer pump, an anticoagulant injection pump, and a device comprising an adsorbent containing a polymer compound in a container with a water contact angle force of 0 ° within a range of 98 °; as well as,
  • the present invention relates to a system for extracorporeal circulation comprising a body fluid transfer pump and a device comprising an adsorbent containing activated carbon in a container.
  • the adsorbent in the present invention comprises a polymer compound having a water contact angle within a range of 40 ° force and 98 °.
  • the adsorbent in the present invention is used for extracorporeal circulation of body fluids. Can be used.
  • the contact angle of water in the present invention is that a smooth film made of a polymer compound as a main constituent is produced, and droplets are formed on it in a horizontal state using a microinjector. Can be determined by measuring at room temperature. If the polymer compound can be dissolved in an organic solvent, the contact angle can also be measured by preparing a cast film on a flat plate using the solution after dissolving the polymer compound. For details of the measurement method, for example, “New Experimental Chemistry Course 18 Interfaces and Colloids” (Maruzen Co., Ltd., issued October 20, 1977, first edition) can be referred to.
  • a flat specimen having a mirror-finished smoothness is placed horizontally so as to be filled with the saturated vapor of the liquid to be measured, and droplets are formed thereon using a microinjector.
  • the droplet size should be such that the contact diameter is about 3 mm or less.
  • the contact angle is a measurement of the angle formed when the droplet is advanced relative to the solid surface (when the liquid spreads on the sample and the liquid spreads and then settles to a certain size). It can be measured with a reading microscope with a square tool (magnification about 20 times). If the lens barrel is tilted 12 degrees below horizontal, the image will be very sharp.
  • the drop is illuminated with light through the front force milky glass or parallel light through the heat-absorbing glass.
  • the contact angle was measured by the method described in Examples described later.
  • Typical polymer compounds having a water contact angle within a range of 40 ° force and 98 ° include, for example, nylon 6, nylon 6, 6, nylon 11, polyethylene, poly (vinylidene chloride) , Poly (Butyl chloride), Poly (Butylacetate acetate), Polystyrene, Styrene-dibulene benzene copolymer, Poly (trifluoroethylene), Poly (Black-end trifluoroethylene), Poly (ethylene terephthalate), Polypropylene , Polyacrylic acid esters (poly (methyl acrylate), etc.), polymethacrylic acid esters (poly (methyl methacrylate), etc.), cross-linked polyacrylates, cross-linked polyamides and other synthetic polymer compounds, cellulose and other water-insoluble materials Powers that include things are not limited to these.
  • aromatic monomers eg, styrene; methyl styrene, ethyl styrene, etc., optionally substituted alkyl styrene; dibutyl benzene; dibinaphthalene, dibianthracene, etc.
  • a polymer or copolymer obtained by polymerizing a monomer selected from a benzo-condensed ring force is preferred.
  • polystyrene and a styrene-dibutylbenzene copolymer are preferable.
  • polystyrene any polystyrene can be used.
  • Polystyrene is a homopolymer of styrenes (styrene; alkyl styrene which may be substituted, such as methyl styrene and ethyl styrene), and a copolymer containing styrenes as a main component.
  • the styrene-dibutylbenzene copolymer can be obtained by crosslinking the above styrenes with m-, o-, or p-dibutylbenzene, which may be optionally substituted.
  • the above polymer compounds are halogen, alkyl, alkyl, alkynyl, aralkyl, aryl, heteroaryl, arylylcarbonyl, heteroarylcarbonyl, alkylenoreboninore, anorecoxicanoleponore, It may be optionally substituted with linoles nore honorole, hetero linole les nole phonol, alkyl sulphonyl, alkylamino sulphonyl and the like.
  • the substituent can be further substituted with an amine group, and the substituent of the substituent is preferably an amide group, a urea group, an ester group, or an ether group.
  • the polymer compound is not bonded with an amine group.
  • the amine group include those in which ammonia, primary to tertiary amines, and the like are chemically bonded to a polymer compound.
  • the polymer compound is preferably one in which no other compound is immobilized.
  • Other compounds are not particularly limited as long as they are other than the above polymer compounds, and examples thereof include amines, alcohols, glycidyl ethers, carboxylic acids and derivatives thereof, acid halides, halides, halogenated silanes, Examples include thiols, aldehydes, and antibodies.
  • the water contact angle is preferably about 60 ° force 96 °, more preferably about 70 ° force 94 °, more preferably About 75 ° force is 91 °.
  • the contact angle force of water is less than 0 °, the adsorbent is highly hydrophilic, so the amount of adsorption of proteins involved in lymphocyte proliferation inhibition is reduced, and it is estimated that the lymphocyte proliferation inhibition state is hardly released.
  • the contact angle of water exceeds 98 °, the hydrophobicity of the adsorbent becomes higher and the adsorption performance of proteins and the like tends to decrease. As a result, it is presumed that the amount of adsorption of proteins involved in the inhibition of lymphocyte proliferation also decreases, making it difficult to release the lymphocyte proliferation inhibition state.
  • the adsorbent is preferably water-insoluble.
  • the adsorbent of the present invention contains about 50% by weight or more of the polymer compound, preferably about 60% by weight or more, more preferably about 70% by weight or more, and further preferably about 80% by weight or more. .
  • Examples of components other than the above polymer compound that can be contained in the adsorbent and have a water contact angle of 40 ° and a force of 98 ° include polyvinyl alcohol (contact angle 36 °), poly (hydroxy methacrylate), and the like. Ethyl) (13 °) and paraffin (105-106 °).
  • two or more of the above polymer compounds having a water contact angle of 40 ° and a force of 98 ° are used in combination, or the above polymer compound having a water contact angle of 40 ° and a force of 98 ° is used as a main raw material.
  • the water contact angle of the resulting polymer compound can be adjusted by, for example, blending components other than the high molecular compound as an auxiliary material.
  • the adsorbent of the present invention is preferably a porous body that is solid at normal temperature and pressure and has pores of an appropriate size, that is, a porous structure.
  • the size of pores in the porous body is preferably 1.5 ⁇ 10 5 or less. More preferably, 1.4 ⁇ 10 5 or less is used.
  • the exclusion limit molecular weight is larger than 1.5 ⁇ 10 5 , non-specific adsorption tends to increase, loss of useful proteins in body fluids, and lymphocyte proliferation tend to decrease.
  • the exclusion limit molecular weight is more preferably 1.3 ⁇ 10 5 or less. Particularly preferred is 1.2 ⁇ 10 5 or less, and most preferred is 1.0 ⁇ 10 5 or less.
  • Adjustment of the exclusion limit molecular weight can be easily controlled, for example, by adjusting the content of the main polymer compound constituting the porous body at the time of producing the porous body. That is, as the polymer compound content increases, the limit exclusion molecular weight decreases, and as the polymer compound content decreases, the exclusion limit molecular weight increases.
  • the exclusion limit molecular weight can be measured as follows. Polystyrene beads with different particle sizes are passed through a column packed with adsorbent, and the pore size is determined from the outflow curve of the polystyrene beads that have flowed out. Next, the globular protein conversion is performed by extrapolating the size of the pores to a globular protein (such as dextran) having both a diameter and a molecular weight. Obtain the calculated molecular weight and use it as the exclusion limit molecular weight.
  • a globular protein such as dextran
  • any shape such as granular, aggregate of particles, fiber, film or hollow fiber can be selected.
  • the average particle size is about 5 ⁇ m to 2000 ⁇ 111 particles, more preferably about 20 to: LOOO ⁇ m, more preferably. Is about 30-800 / ⁇ ⁇ .
  • the average particle size is preferably 80 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less, more preferably 100 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less from the viewpoint of stable direct blood perfusion and adsorption performance. Particularly preferably, it is 120 ⁇ m or more and 800 ⁇ m or less.
  • the average particle size distribution of the particles it is also desirable to limit the average particle size distribution of the particles from the viewpoint that stable direct blood perfusion is performed and blood cells are not activated more than necessary. If the average particle size distribution is too wide, adhesion and activation of blood cells are induced, and if the distribution is narrow, attachment and activation due to physical factors such as turbulence tend to be suppressed. Therefore, in the present invention, it is preferable that the particle size of particles of 80% by volume or more is distributed within ⁇ 75% of the average particle size. Further, activation of blood cells by the adsorber itself and adhesion based thereon are suppressed. In order to perform stable direct blood perfusion, it is more preferable that the distribution is within ⁇ 50%. Particularly preferably, it is distributed within ⁇ 30%.
  • the average particle diameter referred to here is a particle-like carrier imaged by increasing the magnification using an optical microscope or the like, measuring the diameter of the particles in the captured image, and measuring the sum of the diameters. The value obtained by dividing by the total number of particles.
  • the average particle size distribution was calculated by calculating the standard deviation of the diameter of the measured particle, and expressed as the average average standard deviation.
  • the adsorbent of the present invention can be produced, for example, as follows. One or more raw material monomer compounds are dispersed and suspended in a suitable viscous solvent (for example, water). While stirring the suspension, suspension polymerization is performed by a known method to obtain the target adsorbent.
  • a suitable viscous solvent for example, water
  • the adsorbent of the present invention may have activated carbon power.
  • the activated carbon examples include fibrous activated carbon such as phenol fibrous activated carbon; granular activated carbon such as coconut shell activated carbon, petroleum pitch activated carbon, peat activated carbon, and charcoal activated carbon.
  • the average particle size of the activated carbon is not particularly limited, but is preferably about 5 ⁇ to 2000 / ⁇ m, more preferably about 20 to: LOOO m, and more preferably about 30 to 800 m.
  • the average particle size can be measured by the method described above.
  • adsorbent components composed of the above-mentioned polymer compound or activated carbon
  • polystyrene, styrene-dibutylbenzene copolymer, and activated carbon are particularly preferred from the viewpoint of lymphocyte proliferation rate. Coalescence is preferred.
  • the body fluid treatment method of the present invention sucks an adsorbent containing a high molecular compound within the above-mentioned range of water contact angular force 0 ° force 98 ° by an extracorporeal circulation method in the presence of a divalent cation chelating agent.
  • This is a method for releasing a lymphocyte proliferation-suppressed state by contacting with an animal body fluid or contacting an adsorbent containing the above-mentioned activated carbon with a mammalian body fluid by an extracorporeal circulation method.
  • the adsorbent is preferably contained in a container.
  • the container will be described later.
  • the body fluid treatment method for releasing the lymphocyte proliferation-suppressed state of the present invention is not limited to the power that can include the following procedures.
  • the extracorporeal circulation method (1) there is a method in which a bodily fluid is circulated outside the body by a bodily fluid transfer pump or the like and is brought into contact with the adsorbent for a certain period of time.
  • the extracorporeal circulation method includes a plasma separation method in which blood cells and plasma are separated using a plasma separation membrane and the like, and then the plasma is processed by the adsorption device and returned together with the blood cell components.
  • the contact time is preferably 15 minutes or longer, but the surface performance of the adsorption performance is more preferably about 30 minutes to 6 hours. From the standpoint of sufficient adsorption performance and cell treatment efficiency, it is more preferable that the contact is performed for about 45 minutes for 4.5 hours, more preferably about 60 minutes to 3 hours.
  • the bodily fluid treatment method of the present invention when an adsorbent containing a polymer compound within the range of water contact angular force 0 ° force 98 ° is used as the adsorbent, a bivalent anticoagulant for the body fluid is used.
  • a cationic chelating agent or an anticoagulant having antithrombin activity can be used. These anticoagulants can be used in combination.
  • the extracorporeal circulation method (1) is such that when the patient's body fluid enters the extracorporeal circuit, the divalent cation chelating agent is added to the body fluid at a preferred blood concentration. As such, it can be carried out by continuous infusion with adjustment as needed.
  • a method in which blood is directly passed through the adsorption device online, or plasma and blood cells are separated by a commercially available plasma separation membrane, and then the plasma is treated with the adsorption device is preferable.
  • a divalent cation chelating agent may be used alone as an anticoagulant, but it suppresses the generation of bradykin associated with blood coagulation system activity.
  • the contact between the body fluid and the adsorbent is preferably performed in the presence of an anticoagulant having antithrombin activity from the viewpoint of liquid permeability.
  • an anticoagulant having antithrombin activity from the viewpoint of liquid permeability.
  • a divalent cation chelator and an anticoagulant having antithrombin activity are used in combination.
  • the divalent cation chelating agent can be used alone.
  • the injection position of the divalent cation chelating agent and the anticoagulant having antithrombin activity is preferably upstream of the adsorption device.
  • the divalent cation chelating agent used in the present invention is not particularly limited.
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • EDTA-2 potassium EDTA-3 strength rhodium
  • ammonium oxalate EDTA-2 potassium
  • EDTA-3 strength rhodium ammonium oxalate
  • Potassium oxalate citrate, monosodium citrate, disodium citrate, trisodium citrate and the like.
  • the citrate is preferable, and a citrate solution is more preferably used.
  • citrate solution as used herein means a solution containing at least one kind of taenic acid, monosodium citrate, disodium citrate, trisodium citrate and the like.
  • a divalent cation chelating agent solution containing at least one of the above-mentioned components is preferred, and a commercially available divalent thiol chelating agent solution is a CPD solution, ACD-A solution, ACD-B solution. MAP solution.
  • the anticoagulant having antithrombin activity used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include nafamostat mesylate, argatroban, heparin, and low molecular weight heparin. Heparin and low molecular weight heparin are preferred.
  • the amount of the divalent cation chelating agent used is the divalent cation chelating agent solution.
  • the ratio (volume ratio) of (for example, citrate solution such as ACD-A solution and ACD-B solution) to body fluid is preferably 1:10 or more and 1:80 or less. It is preferably 1:15 to 1:70, more preferably 1:20 to 1:60.
  • a divalent cation chelating agent may cause tetanic symptoms such as numbness of the lips and limbs and nausea due to chelation of a large amount of ionized calcium in the blood if the amount of added cation is large. On the other hand, if the amount added is too small, platelet adhesion to the adsorbent will increase, which may impede blood flow.
  • the concentration of the anticoagulant having antithrombin action (for example, heparin, low molecular weight heparin, etc.) in the body fluid is from 0. OllUZml to 1. It is preferably used in an amount of 5 IUZml. More preferably from 0.05 IUZml to 1. OlUZml, still more preferably from 0.1 IUZml to l. OlUZml, and particularly preferably from 0.2 IUZml to l. OlUZml. Anticoagulant with antithrombin action makes it difficult to stop hemostasis if the amount added is too large, and blood coagulation tends to occur if the amount added is too small
  • the anticoagulant having an antithrombin action has a low blood concentration, it may be continuously infused or V, but it may be one shot at a predetermined concentration at a time!
  • the divalent cation chelating agent is preferably infused continuously so that the volume ratio is in the above range, since it may cause a shock symptom if the blood concentration is infused at a predetermined concentration at a time.
  • the adsorbing device is used.
  • extracorporeal circulation is performed to cancel the lymphocyte proliferation suppression state.
  • the time required for extracorporeal circulation with the adsorption device after stimulation of lymphocyte activity is preferably within 1 week, more preferably within 3 days, and even more preferably within 1 day.
  • the body fluid treatment method of the present invention is not limited to these, but the above methods (1) and (2) are preferred as methods for releasing the lymphocyte proliferation-suppressed state in the extracorporeal circulation. (2) This method has the highest therapeutic effect and is the most preferred method for treating diseases.
  • the body fluid treatment method of the present invention can function as a method for adsorbing and removing lymphocyte proliferation inhibitory factors.
  • An extracorporeal circulation system includes a body fluid transfer pump, an anticoagulant injection pump, and an adsorbent containing a polymer compound having a contact angle of water in the range of 40 ° and 98 ° in the container. Or a body fluid transfer pump, and a device comprising an adsorbent containing activated carbon as described above in a container.
  • This system can be used to cancel the lymphocyte proliferation-suppressed state of mammalian body fluids in extracorporeal circulation. Specifically, the system is used to carry out the body fluid treatment method of the present invention described above. ! /
  • the shape, size, and material of the container used for the adsorption device are not particularly limited.
  • the form may be any form such as a sphere, container, bag, tube, column, and the like.
  • Preferable specific examples include a transparent or translucent cylindrical container having a volume of about 0.1 to 400 ml and a diameter of about 0.1 to about LOcm.
  • the container can be made using any structural material.
  • the structural material include non-reactive polymers, biocompatible metals, alloys, and glass.
  • Non-reactive polymers include acrylonitrile butadiene styrene terpolymers and other acrylonitrile polymers; polytetrafluoroethylene, polychloroethylene, tetrafluoroethylene and hexafluoropropylene copolymers, polychlorinated butyl, etc.
  • Halogenated polymers Polyamide, polysulfone, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride acrylic copolymer, polycarbonate acrylonitrile butadiene styrene, polystyrene, polymethylpentene and the like.
  • Metal materials useful as container materials are stainless steel, titanium, platinum, tantalum, gold, and alloys thereof, as well as gold-plated alloy iron, platinum-plated alloy iron, cobalt chromium alloy, titanium nitride-coated stainless steel, etc. Is mentioned.
  • the container has an inlet and an outlet for body fluid, and the outlet is preferably equipped with a filter that allows passage of the body fluid and components contained in the body fluid but not the adsorbent. Yes.
  • the adsorbent is filled in the container.
  • the extracorporeal circulation system of the present invention when using an adsorbent containing a polymer compound with a water contact angle within the range of 40 ° and 98 ° as the adsorbent is an adsorbent.
  • Body fluid transfer pump for transferring body fluid to the adsorption device, and anticoagulant injection pump for injecting a divalent cation chelating agent and, if necessary, an anticoagulant having antithrombin activity into the body fluid With.
  • the extracorporeal circulation system of the present invention in the case of using an adsorbent containing activated carbon as the adsorbent includes a bodily fluid transfer pump for transferring the patient's bodily fluid to the adsorbent device in addition to the adsorbent device. Furthermore, it is preferable to provide an anticoagulant injection pump for injecting a divalent cation chelating agent and an anticoagulant having Z or antithrombin activity into the body fluid.
  • the anticoagulant injection pump is connected upstream of the adsorption device. Preferably it is provided.
  • the anticoagulant injection position is closer to the blood removal port of the blood removal line to suppress blood coagulation!
  • an anticoagulant injection pump for injecting the divalent cation chelator and antithrombin activity is preferably in a close position, but either may be upstream.
  • the extracorporeal circulation system of the present invention is intended for use in a plasma separation system, it is preferable to further include a plasma separation membrane.
  • a plasma separation membrane In the plasma separation method, it is preferable to separate the plasma and blood cells from blood and then pass the plasma through the adsorption device. Therefore, the plasma separation membrane may be connected to the upstream of the adsorption device.
  • the extracorporeal circulation system of the present invention direct blood perfusion is performed online, Since plasma and blood cells are separated by a commercially available plasma separation membrane, etc., the plasma is processed with the body fluid treatment device, and if the adsorbent becomes consolidated, a sufficient fluid flow rate cannot be obtained and treatment is performed. It is preferred that the adsorbent should have sufficient mechanical strength (hard) to prevent consolidation, since prolonged treatment may make it impossible to continue treatment.
  • hard refers to a carrier that is less swelled by a solvent and hardly deformed by pressure compared to a soft carrier such as dextran, agarose, and acrylamide.
  • a hard carrier and a soft carrier can be distinguished by the following method. That is, the relationship between pressure loss and flow rate when a carrier is uniformly filled in a cylindrical force ram and an aqueous liquid is flowed is almost a straight line for a hard carrier, but exceeds the point at which a soft carrier has pressure. The carrier is deformed and consolidated, and the flow rate does not increase.
  • a material having the above linear relationship up to at least 0.3 kgZcm 2 is referred to as hard.
  • mammals include mammals other than humans, such as human power, domestic animals such as horses, horses, hedges, and pigs.
  • the body fluid includes blood and plasma.
  • the body fluid includes other body fluids such as ascites, lymph fluid, intra-articular fluid and fraction components obtained therefrom, and other biological fluid components.
  • lymphocytes refer to T cells, B cells, and the like present in mammalian peripheral blood, lymphatic vessels, and bone marrow.
  • the lymphocytes include neither T cells nor B cells, such as natural killer cells.
  • T cells include, but are not limited to, helper T cells, cytotoxic T cells, and killer T cells.
  • the poor lymphocyte proliferation referred to in the present invention is a case where the lymphocyte proliferation rate when a patient body fluid is added to a lymphocyte culture system is equal to or less than the lymphocyte proliferation rate obtained using a healthy human body fluid. Point to.
  • the lymphocyte proliferation rate is defined as 0.1% (V / V) to 20% (V / V) of the body fluid of a patient treated with an adsorbent or the body fluid of an untreated adsorbent.
  • the proliferation rate when the lymphocytes are cultured at 37 ° C for 1 week using the prepared culture solution (number of cells after 7 days Z number of seeded cells).
  • lymphocytes are activated outside the body and then returned to the body, thereby producing a therapeutic effect.
  • Inhibiting lymphocyte proliferation without adsorbing factors necessary for lymphocyte proliferation from the body fluid of subjects suffering from certain diseases (eg, cancer, infectious diseases, immune diseases, etc.), such as those with poor lymphocyte proliferation By adsorbing and removing the factor by extracorporeal circulation, it became possible to release the lymphocyte proliferation inhibitory state and significantly increase the proliferation rate of lymphocytes.
  • the body fluid treatment method is a plasma separation method or a direct blood reflux method, and stable extracorporeal circulation treatment can be performed with minimal loss of blood cells.
  • the contact angle of water, the exclusion limit molecular weight, and the average particle diameter were measured as follows.
  • a sample of the polymer compound was compressed under high pressure to produce a smooth film.
  • the obtained flat plate specimen was placed horizontally, and water droplets were formed thereon using a microinjector.
  • the size of the water droplet was set so that the contact diameter was about 1 to 2 mm.
  • the angle formed when the water droplet was advanced with respect to the solid surface was measured at room temperature (20 ° C) using a reading microscope (approximately 20 times magnification) with a goniometer.
  • the polystyrene beads having different particle diameters were allowed to flow through a column packed with an adsorbent, and the pore size was determined from the outflow curve of the polystyrene beads that had flowed out.
  • the molecular weight in terms of dextran was determined by extrapolating the size of the pores to dextran, which is a globular protein having a diameter and molecular weight, and used as the exclusion limit molecular weight.
  • the adsorbent was spread on a petri dish, and several tens of Z-fields were photographed with a CCD camera and measured so that the total number of particles was 100 or more.
  • the average particle size of the captured image was calculated using a particle size measurement software (Image-Pro plus, Medical Cybernetics, Inc.).
  • lymphocyte separation tube Pactina tube (Betaton Dickinson)
  • the knocker tube was immediately centrifuged at 3000 rpm for 20 min at room temperature.
  • the lymphocyte layer was collected, 40 ml of physiological saline was added, and centrifuged at 1500 rpm, 5 min, 4 ° C.
  • KBM400 medium manufactured by Kojin Bio
  • ⁇ 3 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was prepared to a concentration of 5 ⁇ g / ml with physiological saline, and 500 ⁇ l was injected into a 24-well polystyrene microplate (Sumitomo Bakelite). After standing at room temperature for about 2 hours, the ⁇ 3 solution was removed and washed twice with an equal amount of physiological saline to prepare a ⁇ 3 solid-phase plate.
  • a monomer mixture consisting of 100 parts by weight of industrial dibutene benzene (dibulene content 57%), 100 parts by weight of toluene, 60 parts by weight of isoamyl alcohol, and 1 part by weight of benzoyl peroxide (content 75%) Add 572 parts by weight, sodium chloride 23 parts by weight, polyvinyl alcohol 1 part by weight, sodium nitrite 0.03 part by weight, and stir so that the droplets of the monomer mixture are dispersed and suspended.
  • polymerization was carried out at 80 ° C for 5 hours in a nitrogen atmosphere. The produced polymer particles are filtered and washed with water, and then residues such as solvents, monomers, initiators, etc.
  • a granular porous material having the strength of a non-dibutylbenzene copolymer was obtained (exclusion limit molecular weight of about 8 ⁇ 10 4 , water contact angle of about 85 °).
  • porous body was thoroughly washed with physiological saline and then weighed 0.17 ml in a cryotube. Thoroughly remove the physiological saline from the porous material, add lml of ACD-A liquid: plasma patient plasma prepared at a volume ratio of 1:20, and mix at 37 ° C for 2 hours. Incubated with stirring (40 rpm) on top.
  • Multiplication rate number of lymphocytes after 7 days of culture Z number of lymphocytes at seeding 1)
  • the number of lymphocytes when cancer patient plasma was treated with the adsorbent increased to 16.7 times the proliferation number.
  • the obtained porous material was washed with henolin (henolin sodium injection solution, Yoshitomi Pharmaceutical Co., Ltd.) and physiological saline (prepared so that the final concentration of heparin was 1 UZml), Equilibration was performed.
  • henolin henolin sodium injection solution, Yoshitomi Pharmaceutical Co., Ltd.
  • physiological saline prepared so that the final concentration of heparin was 1 UZml
  • Equilibration was performed.
  • 2.5 ml of a sedimentation volume was packed in a minicolumn (made of polypropylene, inner diameter 13 mm, height 19 mm, made of Thermonet). Attach a polyvinyl chloride tube (inner diameter 1 mm, outer diameter 3 mm, length 70 cm) to the column inlet side, and a similar polyvinyl chloride tube (length 30 cm) to the column outlet side.
  • Teflon registered trademark
  • the blood transfusion experiment was started at a flow rate of 2.9 mlZmin (linear velocity 2.6 cmZmin). Column outlet side force Starting from the time when blood came out, the tip of the outlet side tube was returned to the blood pool, and a perfusion experiment was performed for 120 minutes. Sampling to measure blood counts was performed 30 minutes, 60 minutes and 120 minutes after the start.
  • Passing rate (%) Number of blood cells at the column outlet Z Number of blood cells at the column inlet X 100 ⁇ ⁇ ⁇ 2)
  • the passing rate of red blood cells and white blood cells was about 100%.
  • the platelet passage rate was about 90%.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, except that petroleum pitch-based activated carbon (DHP-1 (trade name), manufactured by Kuraray Co., Ltd.) having an average particle size of about 500 ⁇ m was used as the adsorbent, the lymphocyte proliferation fold was determined. Asked. As a result, the number of lymphocytes increased to 10.6 times the proliferation number.
  • the blood cell permeability was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the anticoagulant was changed to heparin (final concentration of 5 IUZml) in the ACD-A fluid power. As a result, the passage rate of red blood cells was about 100%, about 80% for white blood cells, and about 60% for platelets.
  • a granular porous material composed of a styrene-dibutylbenzene copolymer having an exclusion limit molecular weight of 1 X 10 4 or less and an average particle diameter of about 400 ⁇ m (water contact angle of about 85 °; use of industrial dibenzene Except for changing the amount to 115 parts by weight, the lymphocyte proliferation fold and blood cell passage rate were determined in the same manner as in Example 1 except that the same method as in Example 1 was used. As a result, the number of lymphocytes increased to 11.5 times the proliferation number. Regarding the blood cell passage rate, red blood cells and white blood cells were about 100%, and platelets were 80% to 85%.
  • a cellulose solution having a viscosity of about 10OOcP was jetted into the gas phase as uniform droplets while directly oscillating a vibration of about 20000 Hz. After flying over the flight distance where the droplets were spherical, they were captured in a coagulation bath, desolvated, and washed to obtain a cellulose porous material with an average particle size of about 400 m (exclusion limit molecular weight 3 X 10 4 or less, water contact angle of about 50 °) 0
  • the lymphocyte proliferation rate and blood cell passage rate were determined in the same manner as in Example 1 except that the porous material was used as an adsorbent. As a result, the number of lymphocytes increased to 6.9 times the number of cells at the time of seeding (multiplication rate).
  • red blood cells are about 100% and white blood cells are About 80%, platelet strength was 3 ⁇ 40% -90%.
  • a porous cellulose body having an exclusion limit molecular weight of 6 ⁇ 10 4 or less and an average particle diameter of about 400 ⁇ m (contact angle of water: about 40 °; cellulose solution is described in JP-A-63-117039)
  • the lymphocyte proliferation fold and blood cell passage rate were determined in the same manner as in Example 1 except that the droplets were made by the method (vibration method) and made by coagulation by trapping in a coagulation bath. It was. As a result, the number of lymphocytes increased to 5.7 times the proliferation number.
  • red blood cells were about 100%, white blood cells were 70% to 80%, and platelets were 85% to 95%.
  • the lymphocyte proliferation factor was determined in the same manner as in Example 1 except that patient plasma not in contact with the adsorbent was used.
  • the blood cell passage rate was determined in the same manner as in Example 1 except that an empty column without adsorbent was used. As a result, the number of lymphocytes was 3.9 times the number of cells at the time of seeding (multiplication rate). Regarding the blood cell passage rate, red blood cells and white blood cells were about 100%, and platelets were 95% to 100%.
  • Example 1 Except that dextran sulfate was bonded to the porous material used in Example 4 with epichlorohydrin (exclusion limit molecular weight 3 ⁇ 10 4 or less, water contact angle about 35 °), it was the same as Example 1.
  • the lymphocyte proliferation fold and blood cell passage rate were determined by the method. As a result, the lymphocyte count was 3.6 times the proliferation (multiplication rate).
  • red blood cells were about 100%, white blood cells were 80% to 95%, and platelets were 80% to 90%.
  • Example 1 Except that dextran sulfate was bonded to the porous material used in Example 5 with epichlorohydrin (exclusion limit molecular weight 3 ⁇ 10 4 or less, water contact angle about 30 °), it was the same as Example 1.
  • the lymphocyte proliferation fold and blood cell passage rate were determined by the method. As a result, the number of lymphocytes was 3.2 times the proliferation number.
  • red blood cells were about 100%, white blood cells were 80% to 90%, and platelets were 80% to 85%.
  • Table 1 shows the results of evaluating the lymphocyte proliferation folds of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 3.
  • the results of evaluating the blood cell passage rate are shown in Table 2. From this result, it is possible to greatly increase the proliferation rate of lymphocytes by bringing a body fluid into contact with the specific adsorbent of the present invention, and even if direct blood circulation is performed, the loss of blood cells such as red blood cells, white blood cells, and platelets is reduced. It can be seen that it has almost the highest blood permeability.
  • a factor necessary for lymphocyte proliferation from a body fluid of a subject suffering from a disease that has a therapeutic effect by activating lymphocytes outside the body and then returning them to the body, such as a subject with poor lymphocyte proliferation is obtained.
  • lymphocyte proliferation-inhibiting factor it was possible to adsorb lymphocyte proliferation-inhibiting factor, release the suppression of lymphocyte proliferation in lymphocyte culture, and greatly increase the proliferation rate of lymphocytes.
  • immunocompetent cells (especially lymphocytes) in the blood are removed from the body and cultured, and those that have been stimulated and activated to return to the body can be used to treat or progress the disease.
  • active autologous lymphocyte therapy it is useful as an adsorbent for releasing the suppression of lymphocyte proliferation in lymphocyte culture for the target body fluid, and as a lymphocyte proliferation method using this adsorbent It is.

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Abstract

水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることからなるか、又は、活性炭を含む吸着材を、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることからなる、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法；及び、体液移送ポンプと、抗凝固剤注入用ポンプと、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備えるか、又は、体液移送ポンプと、活性炭を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備える体外循環用システムに関する。

Description

リンパ球増殖抑制因子の除去方法
技術分野
[0001] 本発明は、血液中の免疫担当細胞 (特にリンパ球)が増殖不良又は増殖抑制状態に ある、癌、感染症、免疫疾患などにおいて、体外循環にて血液中のリンパ球増殖抑 制因子を吸着除去することにより、リンパ球増殖が抑制された状態を解除するための 体外循環用システムおよび体液処理方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、血液中の免疫担当細胞 (特にリンパ球)を体外に取り出して培養し、これを刺 激 '活性ィ匕して増殖したものを、再び体内にもどすことにより、癌の進行を抑制する活 性ィ匕自己リンパ球療法が注目を集めている。本方法は、副作用をほとんど伴わず、 治療中においても高い QOL (quality of life)を維持出来ることから、特に癌治療 分野において、主要な 3大癌治療方法である外科的療法、放射線療法、化学療法に 次ぐ第 4の癌治療の選択肢として広く浸透しつつある。既に、テーラーメード型の高 度先進医療の一つとして、大学病院、癌センター、専門のクリニックにて積極的に治 療が行われており、さらなる拡大が期待されている。本方法は、通常、患者血液を採 取した後に、リンパ球画分を密度勾配遠心法にて分取し、専用の培養液に自己血漿 を添加して培養を行う。通常は一週間で初期培養リンパ球数の約 100倍前後増殖す る力 なかには自己血漿ではリンパ球はほとんど増殖せず、他人の血漿 (供血)で増 殖可能な癌患者が存在することがわ力つてきている。このことは、自己の血漿中にリ ンパ球の増殖を抑制する因子の存在を示唆するものである。癌細胞はトランスフォー ミング .グロウス .ファクター ·ベータ（以下 TGF - βと略す）、インターロイキン 4 (以下 I L4と略す）、インターロイキン 6 (以下 IL6と略す）、インターロイキン 10 (以下 IL10と 略す)等のサイト力インや、プロスタグランジン Ε2 (以下 PGE2と略す)等、細胞性免 疫を抑制する因子を産生している。そこで該因子カ^ンパ球の増殖を抑制している可 能性が考えられるが、これら因子は癌病巣局所での濃度は高いものの、癌患者の血 液中の濃度は健常人と変わらない程度である。また、試薬として市販されている該因 子を高濃度で血漿中に溶解させ、リンパ球の増殖性への影響を検討しても、ほとんど 抑制が力からないこと等から、該因子以外でリンパ球の増殖を強く抑制しているサイト 力イン類以外による、何らかのリンパ球増殖抑制因子の存在が示唆される。
実際、これまでに免疫抑制性酸性蛋白質 (IAP)を吸着除去する吸着体 (特許文献 1 )、体液中のインターロイキン類を吸着除去する吸着体 (特許文献 2)、体液中の TGF - βを吸着する吸着体 (特許文献 3)等が開示されているが、いずれもサイト力イン類 の吸着除去に限定されており、リンパ球の増殖性を向上させる吸着材の報告はない 。また、近年、活性化リンパ球療法の著しい発展により、該治療を受ける患者数は年 々増加の一途をたどってはいるものの、リンパ球増殖不良で供血に頼る患者数も増 カロしている。供血の場合、患者の治療サイクルに合わせて、非自己血漿を確保する 必要がある。また、感染の問題等、安全上考慮すべき課題も多ぐ他の有用な物質を 損失することなぐ簡便な操作でリンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるの を解除する方法の開発が望まれている。さらに、自己体液で増殖可能な癌患者にお いても、リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除することにより、さら なる増殖率、サイト力イン産生能等の活性の向上が期待されている力 このような吸 着材、多孔質体、デバイスおよび処理方法は存在しない。また、サイト力イン類等の 免疫抑制性蛋白質を吸着する材料を、水不溶性担体に結合させた吸着材が開示さ れている（特許文献 4、 5、 6)。しかし、該吸着材は、ァミン残基とサイト力イン類等の 免疫抑制性蛋白質のァフィ二ティに基づく。したがって、該吸着材は、ァミン残基の 存在を要する。
特許文献 1：特開昭 56— 092824号公報
特許文献 2：特開平 08 - 257398号公報
特許文献 3：特開 2001— 218840号公報
特許文献 4:特開 2003— 310751号公報
特許文献 5：特開 2003 - 339854号公報
特許文献 6：特開 2004 - 73618号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0004] 血液中の免疫担当細胞 (特にリンパ球）が増殖不良又は増殖抑制状態にある、癌、 感染症、免疫疾患などにおいて、増殖不良のリンパ球の増殖性を向上させる（以下「 リンパ球増殖抑制解除」 t 、う）処理が待望されて!、る。
そこで、本発明の目的は、リンパ球増殖抑制状態を解除し、リンパ球の増殖性を向上 させること、及び、体液中の有用物質を損失することなく体液を通液することが可能な 、体液処理方法及び体外循環用システムを提供することである。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、鋭意研究を行ったところ、水の接触角力 0° 力も 98° の範囲内にあ る高分子化合物を含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体液と接触 させること、又は、活性炭を含む吸着材を、体液と接触させることにより、リンパ球増殖 抑制状態を解除し、リンパ球の増殖性を向上させ、かつ、体液中の赤血球、白血球、 血小板等の血球をほとんど損失せずに良好に通血することが可能であることを見出 し、本発明の完成に至った。
[0006] すなわち、本発明は、水の接触角が 40° 力も 98° の範囲内にある高分子化合物を 含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環法によって哺乳動物 体液と接触させることからなる、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方 法；
活性炭を含む吸着材を、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることからな る、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法；
体液移送ポンプと、抗凝固剤注入用ポンプと、水の接触角力 0° 力も 98° の範囲 内にある高分子化合物を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備える体外 循環用システム;及び、
体液移送ポンプと、活性炭を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備える 体外循環用システムに関する。
以下に本発明を詳細に説明する。
[0007] まず、本発明における吸着材について説明する。
本発明における吸着材は、水の接触角が 40° 力も 98° の範囲内にある高分子化合 物を含んでなるものである。本発明における吸着材は、体液の体外循環において使 用することができる。
[0008] 本発明における水の接触角は、主たる構成成分である高分子化合物よりなる平滑な フィルムを作製し、水平な状態でその上に微量注射器を用いて液滴を形成し、その 接触角を室温で測定することにより求めることができる。また、高分子化合物が有機 溶媒に溶解可能な場合は、高分子化合物を溶解後、溶解液を用いて平板上にキヤ ストフィルムを作製して、接触角を測定することもできる。測定方法の詳細は、例えば 「新実験化学講座 18 界面とコロイド」（丸善株式会社、昭和 52年 10月 20日発行、 初版)等を参照することができる。
[0009] すなわち、鏡面仕上げの平滑度をもつ平板試片を、測定する液体の飽和蒸気で満 たされるように水平に置き、その上へ微量注射器を用いて液滴を作る。液滴の大きさ は、接触径が約 3mm以下になるようにする。接触角は、液滴を、固体表面に対して 前進させるとき (液体を試料上に展開し、液体が広がった後に、液滴がある大きさに 落ち着いたとき）に形成される角度を、測角器のついた読みとり顕微鏡 (倍率 20倍程 度)で測定することができる。鏡筒を 1 2度水平より下方に傾けておくと、像の鮮明 度が極めてよくなる。滴は、前方力 乳白ガラスを通した光あるいは熱線吸収ガラスを 通した平行光で照明する。
なお、本発明においては、後述の実施例で記載の方法により、接触角を測定した。
[0010] 水の接触角が 40° 力 98° の範囲内にある代表的な高分子化合物としては、例え ば、ナイロン 6、ナイロン 6, 6、ナイロン 11、ポリエチレン、ポリ（塩化ビ-リデン）、ポリ（ 塩化ビュル）、ポリ（酢酸ビュル）、ポリスチレン、スチレンージビュルベンゼン共重合 体、ポリ（トリフルォロエチレン）、ポリ（クロ口トリフルォロエチレン）、ポリ（テレフタル酸 エチレン）、ポリプロピレン、ポリアクリル酸エステル (ポリ（アクリル酸メチル)等）、ポリメ タクリル酸エステル (ポリ (メタクリル酸メチル)等）、架橋ポリアタリレート、架橋ポリアミ ド等の合成高分子化合物、セルロース等の水不溶性のものが挙げられる力 これら に限定されない。このうち、リンパ球増殖率の点から、芳香族系モノマー（例えば、ス チレン；メチルスチレン、ェチルスチレン等の、置換されても良いアルキルスチレン；ジ ビュルベンゼン；ジビ-ルナフタレン、ジビ-ルアントラセン等の置換されても良 、ベ ンゾ縮合環力 選ばれるモノマー）を重合させた重合体または共重合体が好まし 、。 特に、ポリスチレン、スチレン一ジビュルベンゼン共重合体が好ましい。
[0011] ポリスチレンとしては、任意のポリスチレンを使用できる。ポリスチレンは、スチレン類（ スチレン；メチルスチレン、ェチルスチレン等の、置換されても良いアルキルスチレン） の単独重合体、および、上記スチレン類を主成分とする共重合体である。
スチレンージビュルベンゼン共重合体は、上記スチレン類を、所望により置換されて もよい m—、 o—または p—ジビュルベンゼンで架橋させて得ることができる。
[0012] 上記高分子化合物は、ハロゲン、アルキル、ァルケ-ル、アルキニル、アルアルキル 、ァリール、ヘテロァリール、ァリールカルボニル、ヘテロァリールカルボニル、アルキ ノレカノレボニノレ、ァノレコキシカノレポ-ノレ、ァリーノレスノレホニノレ、ヘテロァリーノレスノレホニ ル、アルキルスルホ -ル、アルキルアミノスルホ -ル等で所望により置換されてもよい 。上記置換基は、アミン基以外でさらに置換されることができ、上記置換基の置換基 としては、アミド基、尿素基、エステル基、エーテル基以外が好ましい。
上記高分子化合物は、アミン基を結合していないものであることが好ましい。アミン基 としては、例えば、アンモニア、第 1〜3級ァミン等が高分子化合物に化学的に結合 した状態のもの等が挙げられる。
また、上記高分子化合物は、他の化合物が固定されていないものであることが好まし い。他の化合物としては、上記高分子化合物以外であれば特に限定されず、例えば 、アミン類、アルコール類、グリシジルエーテル類、カルボン酸類とその誘導体、酸ハ ロゲン化物、ハロゲン化物、ハロゲン化シラン類、チオール類、アルデヒド類、抗体等 が挙げられる。
[0013] 本発明の目的のために、つまりリンパ球増殖の促進の点から、上記水の接触角は、 好ましくは約 60° 力 96° 、より好ましくは約 70° 力 94° 、さらに好ましくは約 75 ° 力も 91° である。水の接触角力 0° 未満の場合、吸着材の親水性が高いために 、リンパ球増殖抑制に関与するタンパク質などの吸着量が低下し、リンパ球増殖抑制 状態が解除され難くなるものと推測される。一方、水の接触角が 98° を超えると吸着 材の疎水性がさらに高くなり、タンパク質などの吸着性能が低下傾向を示す。結果と して、リンパ球増殖抑制に関与するタンパク質などの吸着量も低下し、リンパ球増殖 抑制状態が解除され難くなるものと推測される。 本発明にお 、て、吸着材は水不溶性であることが好ま 、。
[0014] また、本発明の吸着材は、上記高分子化合物を約 50重量％以上、好ましくは約 60 重量％以上、より好ましくは約 70重量％以上、さらに好ましくは約 80重量％以上含 むものである。
吸着材に含有させることのできる、水の接触角が 40° 力も 98° である上記高分子化 合物以外の成分としては、例えば、ポリビニルアルコール (接触角 36° )、ポリ（メタク リル酸ヒドロキシェチル）（同 13° )、パラフィン（同 105— 106° )等が挙げられる。 なお、水の接触角が 40° 力 98° である上記高分子化合物を 2種以上併用するこ とや、水の接触角が 40° 力も 98° である上記高分子化合物を主原料とし、上記高 分子化合物以外の成分を副原料として配合すること等により、得られる高分子化合 物の水の接触角を調節することができる。
[0015] 本発明の吸着材は、常温常圧で固体であり、かつ適当な大きさの細孔を有する、す なわち多孔構造を有する多孔質体であることが好ましい。
多孔質体中の細孔の大きさ、すなわちポリスチレンビーズを用いて測定した多孔質 体の排除限界分子量は、好ましくは 1. 5 X 105以下である。より好ましくは 1. 4 X 105 以下のものが用いられる。排除限界分子量が 1. 5 X 105より大きくなると非特異吸着 が大きくなつたり、体液中の有用蛋白質の損失が起こったり、リンパ球の増殖性が低 くなり易い傾向がある。リンパ球の高い増殖率を維持しつつ、非特異吸着の影響をよ り少なくするためには、排除限界分子量は 1. 3 X 105以下であることがさらに好ましい 。特に好ましくは 1. 2 X 105以下、最も好ましくは 1. 0 X 105以下である。
排除限界分子量の調節は、例えば、多孔質体作製時に、多孔質体を構成する主た る上記高分子化合物の含量を調節することにより、容易に制御可能である。すなわち 、上記高分子化合物含量が多くなれば、限界排除分子量は小さくなり、上記高分子 化合物含量が少なくなれば、排除限界分子量は大きくなる。
[0016] 排除限界分子量の測定は、以下のようにして行うことができる。粒子径の異なるポリス チレンビーズを、吸着材が充填されたカラムに流し、流出してきたポリスチレンビーズ の流出曲線により、孔のサイズを求める。次に、直径と分子量がわ力つている球状蛋 白質 (デキストラン等)へ、上記孔のサイズを外挿することにより、当該球状蛋白質換 算の分子量を求め、排除限界分子量とする。
[0017] 吸着材の形状としては、粒状、粒子の集合体、繊維状、膜状またはホロ一ファイバー 状など任意の形状を選ぶことができる。
粒子状の担体を用いる場合において、血漿分離方式で使用する場合、その平均粒 径は、約 5 μ m〜2000 μ 111カ 子ましく、より好ましくは約 20〜： LOOO μ m、さらに好ま しくは約 30〜800 /ζ πιである。また直接血液還流方式で使用する場合は、下限平均 粒径が 80 m未満では直接血液灌流が困難になる場合が生じる。そこでその平均 粒径は 80 μ m以上 2000 μ m以下が好ましぐ安定した直接血液灌流の実施および 吸着性能面から 100 μ m以上 1000 μ m以下がより好ましい。特に好ましくは 120 μ m以上 800 μ m以下である。
[0018] 直接血液灌流を安定的に行い、かつ必要以上に血球を活性ィ匕させないという意味 からも、粒子の平均粒径分布を限定することが望ましい。平均粒径分布は広すぎると 血球の付着や活性化などを誘発し、分布が狭いと乱流などの物理的な要因による付 着や活性化は抑制される傾向を示す。そこで本発明では 80容量％以上の粒子の粒 径が平均粒径の ± 75%以内に分布していることが好ましぐさらに該吸着器自体に よる血球の活性化やそれに基づく付着を抑制し、安定した直接血液灌流を実施する ためには、 ± 50%以内に分布していることがより好ましい。特に好ましくは ± 30%以 内に分布して ヽることである。
[0019] ここで言う平均粒径とは、粒子状の担体を光学顕微鏡などを用いて倍率を上げて撮 影し、撮影画像中の粒子の直径を測定し、その直径の総和を、測定した粒子の全個 数で割ることにより求めた値をいう。
また平均粒径分布は、測定した粒子の直径の標準偏差を計算し、平均士標準偏差 で示した。
[0020] 撮影画像中の粒子の粒径を計測する手段としては、同様の倍率で撮影したスケール を用いて計測する方法、撮影画像中の粒子の直径をノギスなどにより計測した後に 倍率で補正する方法、撮影画像を画像解析ソフト (Image— Pro plus、 Medical C ybernetics, Inc.製)などを用いて計測する方法などを用いることが出来る。また測 定する粒子の個数は最低 100個以上が好ま 、。 [0021] 本発明の吸着材は、例えば以下のようにして製造することができる。 1種または 2種以 上の原料モノマー化合物を、適当な粘性の溶媒 (例えば水）中に分散、懸濁させる。 懸濁液を攪拌しつつ、公知方法によって懸濁重合させ、目的の吸着材を得る。
[0022] さらに、本発明の吸着材は、活性炭力もなるものであってもよい。
活性炭としては、例えば、フエノール系繊維状活性炭等の繊維状活性炭;ヤシ殻系 活性炭、石油ピッチ系活性炭、ピート系活性炭、木炭系活性炭等の粒状活性炭等を 使用することが出来る。
また、活性炭の平均粒径は特に限定されないが、約 5 πι〜2000 /ζ mが好ましぐ より好ましくは約 20〜： LOOO m、さら〖こ好ましくは約 30〜800 mである。平均粒径 は上述の方法で測定することができる。
[0023] 上記高分子化合物または活性炭からなる吸着材の成分のうち、リンパ球増殖率の点 から、ポリスチレン、スチレンージビュルベンゼン共重合体、活性炭が好ましぐ特に スチレンージビュルベンゼン共重合体が好ましい。
[0024] 次に、本発明の体液処理方法について説明する。
本発明の体液処理方法は、上述した水の接触角力 0° 力 98° の範囲内にある高 分子化合物を含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環法によ つて哺乳動物体液と接触させること、又は、上述した活性炭を含む吸着材を、体外循 環法によって哺乳動物体液と接触させることにより、リンパ球増殖抑制状態を解除す るための方法である。
本発明において体外循環方式を実施するにあたって、上記吸着材は、容器内に含 まれて 、ることが好ま 、。上記容器にっ ヽては後述する。
[0025] 本発明のリンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法としては、具体的に は、以下のような手順を挙げることができる力 これらに限定されるものではない。
(1)体液の流入口及び流出口を有し、体液は通過するが吸着材は通過しないフィル ターを上記流出口に装着した容器に吸着材を充填し、この吸着デバイスを用いて、 必要に応じて二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環方式にて体液処理を実 施した後、処理された体液を患者に戻す方法。
(2)上記（1)の方法にて体液処理を実施し、処理された体液を患者に戻した後に、 予め活性化させてお!、た自己リンパ球を患者体内に戻す方法。
(3)予め活性ィ匕させておいた自己リンパ球を患者体内に戻した後に、上記（1)の方 法にて体液処理を実施し、処理された体液を患者に戻す方法。
[0026] (1)の体外循環方法につ!ヽては、体液を体液移送ポンプ等により体外で循環させ一 定時間吸着材と接触させる方法等がある。体外循環方法には、血球と血漿を、血漿 分離膜などを使用して分離した後に、血漿を上記吸着デバイスにて処理し、これを血 球成分と合わせて返血する血漿分離方式と、血漿と血球の分離を行わずに直接血 液を還流する直接血液還流方式がある力 V、ずれの方式でも良!、。
接触時間は、 15分間以上接触させることが好ましいが、吸着性能の面力も約 30分か ら 6時間の接触がより好ましい。十分な吸着性能と細胞処理効率の面から、より好まし くは約 45分間力ら 4. 5時間、さらに好ましくは約 60分間から 3時間、接触させること が好ましい。
[0027] 本発明の体液処理方法において、吸着材として、水の接触角力 0° 力 98° の範 囲内にある高分子化合物を含む吸着材を用いる場合には、体液の抗凝固剤として 二価カチオンキレート剤、又は、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を使用することが できる。また、これらの抗凝固剤を併用することもできる。二価カチオンキレート剤を使 用する場合、（1)の体外循環方式は、患者の体液が体外循環回路に入ってきた時に 、当該体液に、二価カチオンキレート剤を、好ましい血中濃度になるように必要に応 じて調整しながら持続的に注入することによって実施することができる。この後、オン ラインで直接血液を吸着デバイス内に通血する、又は、血漿と血球を市販の血漿分 離膜などにより分離した後に、血漿を吸着デバイスにて処理する方法が好ましい。 前記オンラインで直接血液を吸着デバイス内に通血する場合、抗凝固剤として二価 カチオンキレート剤を単独で使用してもよいが、血液凝固系の活性ィ匕に伴うブラジキ ンの発生などを抑制するためには、二価カチオンキレート剤と抗トロンビン活性を有 する抗凝固剤を併用することがより好ましい。
[0028] 吸着材として、活性炭を含む吸着材を用いる場合には、体液と吸着材の接触は、抗ト ロンビン活性を有する抗凝固剤の存在下で行うことが、通液性の観点から好ま 、。 またこの場合、 2価カチオンキレート剤と抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を併用し てもよいし、 2価カチオンキレート剤を単独で使用することもできる。
抗トロンビン活性を有する抗凝固剤の体液への注入方法としては、体外循環方式に おいて、患者の体液が体外循環回路に入ってきた時に、体液の先端部に上記抗凝 固剤をワンショットする方法や、体液処理の前に予め、患者に上記抗凝固剤を注入し ておき、当該患者から上記抗凝固剤を含む体液を採取し、これを用いて上記の体液 処理を行う方法等が挙げられる。
なお、二価カチオンキレート剤及び抗トロンビン活性を有する抗凝固剤の注入位置 は、吸着デバイスの上流が好ましい。
[0029] 本発明で使用する二価カチオンキレート剤としては特に限定されないが、例えば、 E DTA (エチレンジァミン四酢酸） 2ナトリウム、 EDTA— 2カリウム、 EDTA— 3力リウ ム、シユウ酸アンモ-ゥム、シユウ酸カリウム、クェン酸、クェン酸一ナトリウム、クェン 酸ニナトリウム、クェン酸三ナトリウムなどが挙げられる。好ましくはクェン酸塩であり、 クェン酸塩溶液を用いるのがより好ましい。ここで言うところのクェン酸塩溶液は、タエ ン酸、クェン酸一ナトリウム、クェン酸ニナトリウム、クェン酸三ナトリウムなどを少なくと も 1種類以上含有する溶液を意味する。また、上記成分を少なくとも 1種類以上含有 する二価カチオンキレート剤溶液が好ましぐより好ましくは、市販されている二価力 チオンキレート剤溶液である CPD液、 ACD—A液、 ACD— B液、 MAP液などであ る。
[0030] 本発明で使用する抗トロンビン活性を有する抗凝固剤としては特に限定されないが、 例えば、メシル酸ナファモスタツト、アルガトロバン、へパリン、低分子量へパリンなど が挙げられる。好ましくはへパリン、低分子量へパリンである。
[0031] 本発明において、二価カチオンキレート剤の使用量は、二価カチオンキレート剤溶液
(例えば、 ACD— A液、 ACD— B液などのクェン酸溶液）と体液の比率 (体積比）とし て、 1 : 10以上 1 : 80以下が好ましい。ょり好ましくは1 : 15〜1 : 70で、さらに好ましく は1 : 20〜1 : 60でぁる。二価カチオンキレート剤は、添カ卩量が多いと血中のイオン化 カルシウムを大量にキレートしてしまうことによる、唇や手足のしびれ、吐気などのテタ ニー症状を引き起こす恐れがある。一方で添加量が少な過ぎると吸着体への血小板 の粘着などが多くなり、通血に支障をきたす可能性がある。 [0032] 本発明において、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を使用する場合、抗トロンビン 作用を有する抗凝固剤 (例えばへパリン、低分子量へパリンなど)の体液中濃度が 0 . OllUZmlから 1. 5IUZmlとなる量で使用するのが好ましい。より好ましくは 0. 05 IUZmlから 1. OlUZmlであり、さらに好ましくは 0. lIUZml〜l. OlUZmlであり、 特に好ましくは 0. 2IUZml〜l. OlUZmlである。抗トロンビン作用を有する抗凝固 剤は、添加量が多すぎると止血し難くなり、添加量が少な過ぎると血液凝固し易くなる
[0033] 抗トロンビン作用を有する抗凝剤剤は、血中濃度が低いために、持続注入しても良 V、が、一度に所定濃度になるようにワンショットしても良!、。
二価カチオンキレート剤は、一度に血中濃度が所定濃度になるように注入すると、シ ョック症状を引き起こす恐れがあるため、体積比率が上記範囲になるように持続的に 注入するのが好ましい。
[0034] (2)上記（1)の体液処理に引き続き、予め活性ィ匕させておいた自己リンパ球を患者 体内へ戻す場合、体外循環終了後 1週間以内に、活性化リンパ球を戻すことが好ま しい。リンパ球増殖抑制物質の血中濃度が上昇する前に行うことが望ましいことから、 より好ましくは 3日以内、さらに好ましくは 1日以内に実施することが好ましい。なおリ ンパ球を活性ィ匕させるためには、汎用的に用いられている抗体等、例えば抗 CD3抗 体（OKT3)、 CD28等を用いることができる。
[0035] (3)は、予め薬剤などでリンパ球に活性ィ匕刺激を与える、または生体外で活性化、増 殖させておいた自己リンパ球を患者体内へ戻した後に、上記吸着デバイスをもちい て体外循環を行い、リンパ球増殖抑制状態を解除する方法である。リンパ球活性ィ匕 刺激後、上記吸着デバイスにて体外循環を行うまでの時間は、 1週間以内が好ましく 、より好ましくは 3日以内であり、さらに好ましくは 1日以内である。
[0036] 本発明の体液処理方法はこれらに限定されるものではないが、上記（1)、 （2)の方法 が体外循環におけるリンパ球増殖抑制状態を解除する方法として好ましぐ (2)の方 法が治療効果が高 、疾患の処置方法として最も好まし 、。
[0037] なお、前述したように、リンパ球増殖が抑制されるためには未知のメカニズムがあり得 る。また、該メカニズムには、未知の「リンパ球増殖抑制性因子」の関与があり得る。し たがって、本発明の体液処理方法は、リンパ球増殖抑制性因子の吸着除去方法とし て機能し得る。
[0038] 次に、本発明の体外循環用システムについて説明する。
本発明の体外循環用システムは、体液移送ポンプと、抗凝固剤注入用ポンプと、上 述した水の接触角が 40° 力 98° の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を 容器内に含んでなるデバイスとを備えるものであるカゝ、又は、体液移送ポンプと、上 述した活性炭を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備えるものである。本 システムは、体外循環にお 1、て哺乳動物体液のリンパ球増殖抑制状態を解除するた めに用いることができ、具体的には、上記の本発明の体液処理方法を実施するのに 用!/、ることができる。
[0039] 吸着デバイスに用いる容器の形態、大きさ、材質には特に限定はない。
形態は、球、コンテナ、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態であってよい。好まし い具体例としては、例えば、容量約 0. l〜400ml程度、直径約 0. 1〜： LOcm程度の 透明または半透明の筒状容器等が挙げられる。
[0040] 容器は、任意の構造材料を使用して作成することができる。構造材料としては、具体 的には、非反応性ポリマー、生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。
非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアタリ ロニトリルポリマー；ポリテトラフルォロエチレン、ポリクロ口トリフルォロエチレン、テトラ フルォロエチレンとへキサフルォロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビュル等のハロ ゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピ レン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジェ ンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
容器の材料として有用な金属材料は、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、お よびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミゥム合 金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。
特に好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的には、シリコンコートされたガ ラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペン テン等が挙げられる。 [0041] 上記容器は、体液の流入口及び流出口を有しており、当該流出口に、体液及び体 液に含まれる成分は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着したものが好 ましい。吸着材は、上記容器に充填される。
吸着材として、水の接触角が 40° 力 98° の範囲内にある高分子化合物を含む吸 着材を用いる場合の本発明の体外循環システムは、このような吸着デバイスのほか に、患者の体液を当該吸着デバイスに移送するための体液移送ポンプと、二価カチ オンキレート剤及び必要に応じて、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を体液中に注 入するための抗凝固剤注入用ポンプとを備える。
吸着材として、活性炭を含む吸着材を用いる場合の本発明の体外循環システムは、 上記吸着デバイスのほかに、患者の体液を当該吸着デバイスに移送するための体液 移送ポンプを備える。さらに、二価カチオンキレート剤及び Z又は抗トロンビン活性を 有する抗凝固剤を体液中に注入するための抗凝固剤注入用ポンプを備えることが好 ましい。
[0042] 二価カチオンキレート剤及び抗トロンビン活性を有する抗凝固剤の注入位置は吸着 デバイスの上流にあることが望ましいことから、抗凝固剤注入用ポンプは、吸着デバ イスの上流に連結して備わっていることが好ましい。抗凝固剤注入位置は、血液の凝 固を抑制するために脱血ラインの脱血口により近!、位置が好ま 、。
また二価カチオンキレート剤と、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤 (例えば、へパリ ン）を併用する場合は、二価カチオンキレート剤を注入するための抗凝固剤注入用 ポンプと、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を注入するための抗凝固剤注入用ボン プは、近い位置にあることが好ましいが、どちらかが上流にあってもよい。
また、血液を患者に返血する際には、体温の低下を防止するために、血液を加温す る加温装置を通過させた後に返血してもよ!、。
[0043] 本発明の体外循環システムが血漿分離方式への使用を目的とした場合には、さらに 、血漿分離膜を備えることが好ましい。血漿分離方式においては、血液から血漿と血 球を分離した後、血漿を吸着デバイスに通液することが好ましいので、上記血漿分離 膜は、吸着デバイスの上流に連結して備わって 、ることが好ま 、。
[0044] 本発明の体外循環システムにおいては、オンラインで直接血液灌流を実施する、又 は、血漿と血球を市販の血漿分離膜などにより分離した後に、血漿を該体液処理デ バイスにて処理するため、吸着材の圧密化が生じると、充分な体液流量が得られなく なり、治療時間の延長さらに治療続行不可能となりうるので、吸着材は、圧密化を防 ぐために、充分な機械的強度を有するもの (硬質)であることが好ま U、。
ここでいう硬質とは、デキストラン、ァガロース、アクリルアミド等の軟質な担体に比較 し、溶媒による膨潤が少なぐまた圧力により変形し難い担体のことをいう。硬質な担 体と軟質な担体とは次の方法により区別することができる。すなわち担体を円筒状力 ラムに均一に充填し、水性液体を流した際の圧力損失と流量の関係が、硬質担体で はほぼ直線となるのに対し、軟質な担体では圧力がある点を越えると担体が変形し 圧密化して流量が増加しなくなる。本発明では、少なくとも 0. 3KgZcm2まで上記直 線関係にあるものを硬質と称する。
[0045] 本明細書において、哺乳動物としては、ヒトのほ力、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ブタなどの家 畜等、ヒト以外の哺乳動物も含まれる。
本明細書において、体液としては、血液、血漿を含む。カロえて、体液は、その他の体 液、例えば腹水、リンパ液、関節内液およびこれらから得られた画分成分、ならびに その他の生体由来の液性成分も含むものである。
[0046] 本明細書において、リンパ球は、哺乳類末梢血中、リンパ管中、骨髄中に存在する T 細胞、 B細胞等をいう。また、当該リンパ球は、 T細胞でも B細胞でもない、例えばナ チュラルキラー細胞等も含む。 T細胞は、特に限定されないが、ヘルパー T細胞、細 胞障害性 T細胞、キラー T細胞を含む。
[0047] 本発明でいうリンパ球増殖不良とは、患者体液をリンパ球培養系に添加した時のリン パ球増殖率が、健常人体液を使用して求めたリンパ球増殖率以下である場合を指す 。また、リンパ球増殖率とは、吸着材で処理した患者体液、あるいは吸着材未処理の 健常人体液を、培養液中に 0. 1% (V/V)〜20% (V/V)添加した培養液を用い て、リンパ球を 37°Cで 1週間培養した時の増殖率（7日後の細胞数 Z播種細胞数)を いう。
発明の効果
[0048] 本発明により、リンパ球を体外で活性化させた後に体内にもどすことにより治療効果 がある疾患 (例えば、癌、感染症、免疫疾患など）に罹患する対象、例えばリンパ球 増殖不良癌対象の、体液中からリンパ球の増殖に必要な因子を吸着せずに、リンパ 球増殖抑制因子を体外循環にて吸着除去することにより、リンパ球増殖抑制状態を 解除し、リンパ球の増殖率を大幅に上昇させることが可能となった。また該体液処理 方法は血漿分離方式、あるいは直接血液還流方式などで、血球のロスを最低限にお さえ、安定した体外循環処理の実施が可能となった。
発明を実施するための最良の形態
[0049] 以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に 限定されるものではない。
[0050] なお、下記実施例等において、水の接触角、排除限界分子量、平均粒径は以下の ようにして測定した。
(1)水の接触角
高分子化合物の試料を、高圧で圧縮して平滑なフィルムを作製した。得られた平滑 な平板試片を、水平に置き、その上へ微量注射器を用いて水滴を作った。水滴の大 きさは、接触径が約 l〜2mmになるようにした。水滴を、固体表面に対して前進させ るときに形成される角度を、測角器のついた読みとり顕微鏡 (倍率 20倍程度)を用い て、室温（20°C)で測定した。
[0051] (2)排除限界分子量
粒子径の異なるポリスチレンビーズを、吸着材が充填されたカラムに流し、流出してき たポリスチレンビーズの流出曲線により、孔のサイズを求めた。次に、直径と分子量が わ力つている球状蛋白質のデキストランへ、上記孔のサイズを外挿することにより、デ キストラン換算の分子量を求め、排除限界分子量とした。
[0052] (3)平均粒径
湿潤状態で、吸着材をシャーレに展開し、 CCDカメラにて数十粒 Z—視野を撮影し 、粒子数の合計が 100個以上になるように計測して求めた。次に、取り込んだ画像を 、粒径測定ソフト（Image— Pro plus, Medical Cybernetics, Inc.製）を用いて 、平均粒径を算出した。
[0053] (実施例 1) (1)リンパ球の調製
翼付静注針を健常人上腕部に穿刺した後、リンパ球分離用チューブ (パクティナ一 チューブ (ベタトンディッキンソン製)）に血液を約 7. 5ml採取した。採血後、ノ クティ ナーチューブを速やかに 3000rpm、 20min、室温にて遠心分離した。リンパ球層を 回収し、生理食塩液を 40mlカ卩え、 1500rpm、 5min、 4°Cで遠心分離した。本操作 を数回繰り返すことにより、リンパ球の洗浄を行い、 KBM400培地（コージンバイオ 製）に再懸濁し、所定濃度のリンパ球懸濁液を調製した。
[0054] (2) OKT3固相化プレートの調製
ΟΚΤ3 (大日本製薬製)を生理食塩液にて 5 μ g/mlの濃度に調製し、 24穴ポリスチ レンマイクロプレート（住友ベークライト製）に 500 μ 1ずつ注入した。室温で約 2時間 静置した後に、 ΟΚΤ3溶液を除去し、等量の生理食塩液で 2回洗浄を行うことにより 、 ΟΚΤ3固相化プレートを調製した。
[0055] (3)吸着材の調製
工業用ジビュルベンゼン（ジビュルベンゼンの含有量 57%) 100重量部、トルエン 1 00重量部、イソアミルアルコール 60重量部、過酸化ベンゾィル（含有量 75%) 1重量 部からなるモノマー混合物を、水 572重量部、塩ィ匕ナトリウム 23重量部、ポリビニルァ ルコール 1重量部、亜硝酸ナトリウム 0. 03重量部力 なる水溶液に添カ卩し、モノマー 混合液の液滴が分散懸濁するよう撹拌を行いつつ、窒素雰囲気下、 80°Cで 5時間、 重合を行った。生成した重合体粒子を濾過、水洗の後、溶媒、モノマー、開始剤等の 残存物をアセトンで抽出除去し、再度水および熱水でよく洗浄して、平均粒子径が約 400 μ mのスチレンージビュルベンゼン共重合体力 なる粒状多孔質体を得た (排 除限界分子量が約 8 X 104、水の接触角約 85° )。
[0056] (4)血漿処理
該多孔質体を生理食塩液にて十分洗浄を行った後に、クライオチューブ内に 0. 17 ml計量した。該多孔質体中から生理食塩液を十分に除去し、 ACD— A液:血漿の 体積比率が 1 : 20で調製した癌患者血漿を lml添カ卩し、 37°Cで 2時間、 MIXロータ 一上で撹拌 (40rpm)しながらインキュベートした。
[0057] (5)リンパ球の培養 上記方法にて処理を行った血漿を、リンパ球培養液 KBM400 (コージンバイオ製） に 9% (VZV)になるように添カロした。該培養液を用い、リンパ球数が 1. 0 X 105cells /mlになるように調製し、先に調製した OKT3固相化プレートに 444 lZwellづっ 播種した (n= 3穴)。培養 7日目にリンパ球を回収し、血球計算盤にて細胞数をカウ ントし、リンパ球増殖倍数を下式 1)にて求め、その結果を表 1に示した。
増殖倍数 =培養 7日後のリンパ球数 Z播種時リンパ球数' · · 1)
その結果、癌患者血漿を吸着材で処理した場合のリンパ球数は、播種時細胞数の 1 6. 7倍 (増殖倍数)まで上昇した。
[0058] (6)通血実験
得られた該多孔質体をへノリン (へノリンナトリウム注射液、吉富製薬 (株)）加生理食 塩水（へパリンの最終濃度が lUZmlになるように調製)で洗浄を行い、へパリンの平 衡化を行った。次に該多孔質体の脱泡を行った後、沈降体積で 2. 5mlをミニカラム（ ポリプロピレン製、内径 13mm、高さ 19mm、テルモネ土製）に充填した。カラム入口側 にポリ塩ィ匕ビュル製のチューブ（内径 lmm、外径 3mm、長さ 70cm)を装着し、また カラム出口側にも同様のポリ塩ィ匕ビニル製のチューブ (長さ 30cm)を装着した。血液 は健常人より 18Gの注射針を用い注意深く採血した。抗凝固剤は ACD— A液 (タエ ン酸ナ卜ジゥム；2. 20gZdl、クェン酸； 0. 80gZdl、デキス卜ロース； 2. 20gZdlの組 成の溶液）：血液 = 1： 20 (体積比）、及びへパリンを最終濃度で 0. 5IU/mlになるよ うに添加した。抗凝固剤を添加した血液は、テフロン (登録商標)製三角フラスコ内（ 内容量 50ml、サンヮ（株））に 30ml入れ、 37°Cの恒温槽内にてスターラーチップに て低速で回転させ、流速 2. 9mlZmin (線速 2. 6cmZmin)で通血実験を開始した 。カラム出口側力 血液が出てきた時点を開始時点として、出口側チューブの先端を 血液プールに戻し、灌流実験を 120分間行った。血球数を測定するためのサンプリ ングは、開始後 30分、 60分、 120分後に実施した。
[0059] (7)血球数の測定
所定時間後（30分、 60分、 120分）にカラム入口及び出口側の血液を採取し、血液 中の血球数（赤血球、白血球、血小板）を血球カウンター（Microcell Counter C C 180 シスメッタス (株)）にて測定した。次に式（2)により各種細胞の通過率を求 め、その結果を表 2に示した。
通過率（％) =カラム出口の血球数 Zカラム入口の血球数 X 100 · · · 2)
その結果、赤血球、白血球の通過率は、約 100%であった。また血小板の通過率は 、約 90%であった。
[0060] (実施例 2)
吸着材として平均粒径約 500 μ mの石油ピッチ系活性炭 (DHP- 1 (商品名）、クラ レ株式会社製)を用いた以外は、実施例 1と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求め た。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の 10. 6倍 (増殖倍数)まで上昇した。血 球の通過性に関しては、抗凝固剤を ACD— A液力もへパリン (最終濃度で 5IUZml )に変えた他は、実施例 1と同様の方法で評価した。その結果、赤血球の通過率は、 約 100%であり、白血球に関しては約 80%、血小板については約 60%であった。
[0061] (実施例 3)
吸着材として、排除限界分子量が 1 X 104以下、平均粒径約 400 μ mのスチレンージ ビュルベンゼン共重合体からなる粒状多孔質体 (水の接触角約 85° ；工業用ジビ- ルベンゼンの使用量を 115重量部に変更した以外は、実施例 1と同様の方法で調製 )を用いた以外は、実施例 1と同様の方法で、リンパ球増殖倍数、および血球の通過 率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の 11. 5倍 (増殖倍数)まで上 昇した。血球の通過率に関しては、赤血球、白血球が約 100%、血小板が 80%〜8 5%であった。
[0062] (実施例 4)
吸着材の調製：
粘度約 lOOOcPのセルロース溶液に、振動数約 20000Hzの振動を直接カ卩えながら 、均一液滴として気相中に噴出させた。液滴が球形になる飛行距離以上飛行させた 後に、凝固浴に捕捉し、脱溶剤し、洗浄することにより、平均粒径約 400 mのセル ロース多孔質体を得た (排除限界分子量 3 X 104以下、水の接触角約 50° ) 0 吸着材として該多孔質体を用いた以外は実施例 1と同様の方法で、リンパ球増殖倍 数および血球の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の 6. 9倍 (増殖倍数)まで上昇した。血球の通過率に関しては、赤血球が約 100%、白血球が 約 80%、血小板力 ¾0%〜90%であった。
[0063] (実施例 5)
吸着材として、排除限界分子量が 6 X 104以下、平均粒径約 400 μ mのセルロース 多孔質体 (水の接触角約 40° ；セルロース溶液を、特開昭 63— 117039号公報に 記載された方法 (振動法）により液滴化し、凝固浴での捕捉によって凝固させることに より作製)を用いた以外は、実施例 1と同様の方法で、リンパ球増殖倍数および血球 の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の 5. 7倍 (増殖倍数)ま で上昇した。血球の通過率に関しては、赤血球が約 100%、白血球が 70%〜80% 、血小板が 85%〜95%であった。
[0064] (比較例 1)
吸着材と接触させていない患者血漿を使用した以外は、実施例 1と同様の方法で、リ ンパ球増殖倍数を求めた。また吸着材の入っていない、空カラムを用いた以外は実 施例 1と同様の方法にて血球の通過率を求めた。その結果を、リンパ球数は、播種時 細胞数の 3. 9倍 (増殖倍数)であった。血球の通過率に関しては、赤血球、白血球と もに約 100 %、血小板が 95 %〜 100 %であつた。
[0065] (比較例 2)
実施例 4で使用した多孔質体に、デキストラン硫酸をェピクロルヒドリンにて結合した（ 排除限界分子量 3 X 104以下、水の接触角約 35° )以外は、実施例 1と同様の方法 で、リンパ球増殖倍数および血球の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種 時細胞数の 3. 6倍 (増殖倍数)であった。血球の通過率に関しては、赤血球が約 10 0%、白血球が 80%〜95%、血小板が 80%〜90%であった。
[0066] (比較例 3)
実施例 5で使用した多孔質体に、デキストラン硫酸をェピクロルヒドリンにて結合した（ 排除限界分子量 3 X 104以下、水の接触角約 30° )以外は、実施例 1と同様の方法 で、リンパ球増殖倍数および血球の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種 時細胞数の 3. 2倍 (増殖倍数)であった。血球の通過率に関しては、赤血球が約 10 0%、白血球が 80%〜90%、血小板が 80%〜85%であった。
[0067] なお、実施例 1〜5、比較例 1〜3のリンパ球増殖倍数を評価した結果を表 1に、また 血球の通過率を評価した結果を表 2に示した。この結果より、本発明の特定の吸着材 に体液を接触させることにより、リンパ球の増殖率を大幅に上昇でき、また直接血液 還流を行っても、赤血球、白血球、血小板などの血球のロスはほとんどなぐ高い通 血性能を有して 、ることがわかる。
[0068] [表 1] 患者血漿を用いたリンパ球増殖性への影響
培養 7日後のリンパ球増殖倍数（式 1 )より算出
Figure imgf000021_0001
n= 3士 S.D
[0069] [表 2]
血球通過率の経時的変化
Figure imgf000022_0001
n=3± SD 産業上の利用可能性
本発明により、リンパ球を体外で活性化させた後に体内にもどすことにより治療効果 がある疾患に罹患する対象、例えばリンパ球増殖不良癌対象の、体液中からリンパ 球の増殖に必要な因子を吸着せずに、リンパ球増殖抑制因子を吸着し、リンパ球培 養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除し、リンパ球の増殖率を大幅に上昇さ せることが可能となった。本発明は、血液中の免疫担当細胞 (特にリンパ球)を体外 に取り出して培養し、これを刺激'活性ィ匕して増殖したものを再び体内にもどすことに より、疾患の処置または進行を抑制する、例えば活性ィ匕自己リンパ球療法において、 対象体液についてリンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除するた めの吸着材、ならびにこの吸着材を利用したリンパ球増殖方法として有用である。

Claims

請求の範囲
[I] 水の接触角が 40° 力も 98° の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を、二価力 チオンキレート剤の存在下で、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることを 特徴とする、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法。
[2] 該二価カチオンキレート剤がクェン酸塩である請求項 1記載の方法。
[3] 該二価カチオンキレート剤として、クェン酸塩溶液を、該クェン酸塩溶液：該体液の 体積比率が 1 : 10以上 1 : 80以下となる量で使用し、かつ該体液が 0. OllUZmlか ら 1. 5IUZmlのへノ リンを含む、請求項 2記載の方法。
[4] 該吸着材の排除限界分子量が 1. 5 X 105以下である、請求項 1ないし 3いずれか記 載の方法。
[5] 該高分子化合物が芳香族系高分子化合物である請求項 1ないし 4いずれか記載の 方法。
[6] 該芳香族系高分子化合物がポリスチレンまたはスチレンージビュルベンゼン共重合 体である、請求項 5記載の方法。
[7] 活性炭を含む吸着材を、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることを特徴 とする、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法。
[8] 該吸着材が、容器内に含まれてなるものである、請求項 1ないし 7いずれか記載の方 法。
[9] 体外循環用システムであって、体液移送ポンプと、抗凝固剤注入用ポンプと、水の接 触角が 40° 力 98° の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を容器内に含ん でなるデバイスとを備えるシステム。
[10] 体外循環用システムであって、体液移送ポンプと、活性炭を含む吸着材を容器内に 含んでなるデバイスとを備えたシステム。
[II] 該抗凝固剤注入用ポンプを、該デバイスより上流に連結して備える、請求項 9または 10記載のシステム。
[12] 血漿分離膜をさらに備えた請求項 9ないし 11いずれか記載のシステム。
[13] 該血漿分離膜を、該デバイスより上流に連結して備える、請求項 12記載のシステム。
[14] 哺乳動物体液のリンパ球増殖抑制状態を解除するためのものである、請求項 9ない し 13いずれか記載のシステム,
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