ES2937963T3 - Vacunas de enfermedad infecciosa - Google Patents

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Eric Yi-Chun Huang
Kapil Bahl
Tal Zaks
Sunny Himansu
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Abstract

Los aspectos de la divulgación se relacionan con vacunas de ácido nucleico. Las vacunas incluyen uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica uno o más antígenos de Chikungunya, uno o más antígenos del virus Zika y uno o más antígenos del dengue. También se describen métodos para preparar y usar dichas vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas de enfermedad infecciosa
Antecedentes de la invención
El virus Zika (ZIKV) es un miembro de la familia de virus Flaviviridae y del género flavivirus. En humanos, causa una enfermedad conocida como fiebre Zika. Está relacionado con el dengue, la fiebre amarilla, el Nilo Occidental y la encefalitis japonesa, virus que también son miembros de la familia de virus Flaviviridae. El ZIKV se transmite a las personas a través de las picaduras de mosquitos. Los síntomas más comunes de la enfermedad ZIKV (Zika) son fiebre, sarpullido, dolor en las articulaciones y ojos rojos. La enfermedad suele ser leve, con síntomas que duran desde varios días hasta una semana. No existe una vacuna para prevenir ni un medicamento para tratar el virus del Zika.
La vacuna de ácido desoxirribonucleico (ADN) es una técnica utilizada para estimular las respuestas inmunitarias celulares a antígenos externos, tales como antígenos de ZIKV. La inyección directa de ADN modificado genéticamente (por ejemplo, ADN de plásmido desnudo) en un hospedador vivo causa que una pequeña cantidad de sus células produzcan directamente un antígeno, lo que resulta en una respuesta inmunológica protectora. Sin embargo, esta técnica acarrea posibles problemas que incluyen la posibilidad de mutagénesis insercional, lo que podría llevar a la activación de oncogenes o la inhibición de genes de supresión tumoral.
US 2007/0292453 se refiere a vacunas y métodos de virus de ARN.
Sumario de la invención
La divulgación proporciona una vacuna de ácido ribonucleico (ARN) (por ejemplo, ARN mensajero (ARNm)) que puede dirigir de manera segura la maquinaria celular del cuerpo para producir casi cualquier proteína de interés, desde proteínas nativas hasta anticuerpos y otros constructos de proteínas completamente nuevas que pueden tener actividad terapéutica dentro y fuera de las células. Las vacunas de ARN de la presente divulgación se pueden usar para inducir una respuesta inmunitaria equilibrada contra un solo virus o múltiples virus, incluyendo el virus Chikungunya (CHIKV), el virus Zika (ZIKV) y el virus del dengue (DENV), que comprende tanto inmunidad celular como humoral, sin las preocupaciones de seguridad asociadas, por ejemplo, arriesgando la posibilidad de mutagénesis por inserción.
Algunos casos de la presente divulgación proporcionan vacunas y/o vacunas combinadas que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN, por ejemplo, ARNm. En algunos casos, los polinucleótidos de ARN codifican un antígeno CHIKV, un antígeno ZIKV, un antígeno DENV o cualquier combinación de dos o tres de los anteriores (por ejemplo, antígeno CHIKV/ antígeno ZIKV, antígeno CHIKV/antígeno DENV, antígeno ZIKV/antígeno DENV, o CHIKV/DENV/ZIKV) en el mismo polinucleótido o en diferentes polinucleótidos. En algunos casos, los polinucleótidos de ARN codifican un antígeno ZIKV y un antígeno DENV, ya sea en el mismo polinucleótido o en diferentes polinucleótidos.
Así, debe entenderse la frase "un CHIKV, DENV y/o ZIKV" pretende abarcar cada virus individual en la alternativa (CHIKV o DENV o ZIKV) así como las combinaciones individuales de CHIKV y DENV (CHIKV/DENV), CHIKV y ZIKV (CHIKV/ZIKV), ZIKV y DENV (ZIKV/DENV), y CHIKV, DENV y ZIKV (CHIKV/DENV/ZIKV).
Con base en la divulgación que está contenida en el presente documento, la presente invención proporciona una vacuna contra el virus del Zika (ZIKV), que comprende: un polinucleótido de ácido ribonucleico (ARN) que tiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico del ZIKV formulado en una nanopartícula lipídica, en la que el polinucleótido de ARN es el ARN mensajero (ARNm).
En otro aspecto, la presente invención proporciona la vacuna ZIKV de la invención para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, en el que dicho método comprende administrar dicha vacuna en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria específica de antígeno, en el que opcionalmente : (i) la respuesta inmunitaria específica de antígeno comprende una respuesta de células T o una respuesta de células B; (ii) dicho método comprende administrar una dosis única de la vacuna ZIKV o una dosis de refuerzo de la vacuna ZIKV; y/o (iii) la vacuna se administra mediante inyección intradérmica o inyección intramuscular.
La presente invención algunas realizaciones preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una poliproteína de ZIKV. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una poliproteína estructural ZIKV. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una proteína no estructural de ZIKV.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una proteína de la cápside del ZIKV, una proteína de premembrana/membrana del ZIKV, una proteína de la cubierta del ZIKV, una proteína 1 no estructural del ZIKV, una proteína 2A no estructural del ZIKV, una proteína 2B no estructural del ZIKV, una proteína 3 no estructural de ZIKV, una proteína 4A no estructural de ZIKV, una proteína 4B no estructural de ZIKV o una proteína 5 no estructural de ZIKV.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una proteína de la cápside del ZIKV, una proteína de premembrana/membrana del ZIKV, una proteína de la cubierta del ZIKV, una proteína 1 no estructural del ZIKV, una proteína 2A no estructural del ZIKV, una proteína 2B no estructural del ZIKV, una proteína no estructural 3 de ZIKV, una proteína 4A no estructural de ZIKV, una proteína 4B no estructural de ZIKV o una proteína 5 no estructural de ZIKV.
En algunas realizaciones, la vacuna comprende un polinucleótido de ARN con un marco de lectura abierto que codifica una proteína de cápside ZIKV, un polinucleótido de ARN con un marco de lectura abierto que codifica una proteína de premembrana/membrana ZIKV y un polinucleótido de ARN con un marco de lectura abierto que codifica una proteína de envoltura ZIKV.
En algunas realizaciones, la vacuna comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cápside de ZIKV y un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de premembrana/membrana de ZIKV.
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN de ZIKV comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cápside del ZIKV y un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cubierta del ZIKV.
En algunas realizaciones, la vacuna comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de membrana/premembrana de ZIKV y un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de cubierta de ZIKV.
En algunas realizaciones, la vacuna comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cápside del ZIKV y al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una cualquiera o más proteínas no estructurales del ZIKV 1,2A, 2B, 3, 4A, 4B o 5. En algunas realizaciones, la vacuna comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una premembrana/proteína de membrana del ZIKV y al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una o más proteínas no estructurales del ZIKV 1 ,2A, 2B, 3, 4a, 4B o 5.
En algunas realizaciones, la vacuna comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de envoltura del ZIKV y al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una cualquiera o más proteínas no estructurales del ZIKV 1,2A, 2B, 3, 4A, 4B o 5. En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico comprende una combinación de dos o más de una proteína de la cápside de ZIKV, una premembrana/proteína de membrana de ZIKV, una proteína de envoltura ZIKV, una proteína no estructural ZIKV 1, una proteína no estructural ZIKV 2A, una proteína no estructural ZIKV 2B, una proteína no estructural ZIKV 3, una proteína no estructural ZIKV 4A, una proteína no estructural ZIKV -proteína estructural 4B, o una proteína no estructural 5 de ZIKV.
En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico ZIKV se fusiona con el péptido señal que tiene una secuencia establecida como SEQ ID NO: 125, 126, 128 o 131. En algunas realizaciones, el péptido señal se fusiona con el extremo N del al menos un polipéptido antigénico ZIKV.
En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico ZIKV tiene más del 90 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-134 y tiene actividad de fusión de membrana.
En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico ZIKV tiene más del 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-134 y tiene actividad de fusión de membrana.
En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico ZIKV tiene más del 96 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-134 y tiene actividad de fusión de membrana.
En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico ZIKV tiene más del 97 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-134 y tiene actividad de fusión de membrana.
- En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico ZIKV tiene más del 98 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-134 y tiene actividad de fusión de membrana.
- En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico ZIKV tiene más del 99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-134 y tiene actividad de fusión de membrana.
En algunas realizaciones, el al menos un polipéptido antigénico ZIKV tiene más del 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-134 y tiene actividad de fusión de membrana.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN, por ejemplo, ARNm, de una vacuna está codificado por al menos un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de ZIKV de SEQ ID NO: 67­ 134.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una proteína de envoltura ZIKV.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una poliproteína del virus Spondweni.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una poliproteína obtenida de la cepa ZIKV MR 766, ACD75819 o SPH2015.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla 32.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico tiene al menos 95 % de identidad con un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla 32.
En algunas realizaciones, el al menos un polinucleótido de ARN codifica al menos un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de las enumeradas en la Tabla 31.
En algunas realizaciones, el al menos un polinucleótido de ARN codifica al menos una variante de proteína que tiene al menos 95 % de identidad con un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de las enumeradas en la Tabla 31.
Las tablas en el presente documento proporcionan números de acceso de interés del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Debe entenderse que la frase "una secuencia de aminoácidos de la Tabla X" (por ejemplo, Tabla 33 o Tabla 35) se refiere a una secuencia de aminoácidos identificada por uno o más números de acceso NCBI enumerados en la Tabla X. Cada una de las secuencias de aminoácidos y las variantes que tienen una identidad superior al 95 % con cada una de las secuencias de aminoácidos incluidas en los números de acceso de la Tabla X (por ejemplo, Tabla 33 o Tabla 35) se incluyen dentro de los constructos de la presente divulgación.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y que tiene actividad de fusión de membrana. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene al menos 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y que tiene actividad de fusión de membrana. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene al menos 96 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y que tiene actividad de fusión de membrana. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene al menos 97 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y que tiene actividad de fusión de membrana. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene al menos 98 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y que tiene actividad de fusión de membrana. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene al menos 99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y que tiene actividad de fusión de membrana. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y que tiene actividad de fusión de membrana.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y es ARNm de codones optimizados.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y tiene menos de 80 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y tiene menos de 75 %, 85 % o 95 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y tiene 50-80 %, 60-80 %, 40-80 %, 30-80 %, 70-80 %, 75-80 % o 78-80 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y tiene 40-85 %, 50-85 %, 60-85 %, 30-85 %, 70-85 %, 75-85 %, o 80-85 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y tiene 40-90 %, 50- 90 %, 60-90 %, 30-90 %, 70-90 %, 75-90 %, 80-90 %, o 85-90 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN está codificado por un ácido nucleico que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de la Tabla 31. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN está codificado por un ácido nucleico que tiene al menos 95 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de la Tabla 31. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN está codificado por un ácido nucleico que tiene al menos 96 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de la Tabla 31. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN está codificado por un ácido nucleico que tiene al menos 97 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de la Tabla 31. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN está codificado por un ácido nucleico que tiene al menos 98 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de la Tabla 31. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN está codificado por un ácido nucleico que tiene al menos 99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de la Tabla 31. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN está codificado por un ácido nucleico que tiene 95-99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de la Tabla 31.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARNm está codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de la Tabla 31 y tiene menos de 80 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARNm está codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de la Tabla 31 y tiene menos de 75 %, 85 % o 95 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARNm está codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de la Tabla 31 y tiene menos de 50-80 %, 60-80 %, 40-80 %, 30-80 %, 70­ 80 %, 75-80 % o 78-80 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARNm está codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de la Tabla 31 y tiene menos de 40-85 %, 50-85 %, 60-85 %, 30-85 %, 70-85 %, 75-85 % o 80-85 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre. En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARNm está codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de la Tabla 31 y tiene menos de 40-90 %, 50-90 %, 60-90 %, 30-90 %, 70-90 %, 75-90 %, 80-90 % o 85-90 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 32 o 33 y tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre, pero no incluye la secuencia de ARNm de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que se une a los receptores celulares.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que provoca la fusión de las membranas virales y celulares.
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico que es responsable de la unión del ZIKV a una célula infectada.
Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una vacuna ZIKV que incluye al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico ZIKV, en el que el polinucleótido de ARN de la vacuna ZIKV incluye una tapa terminal 5'.
En algunas realizaciones, la tapa terminal 5' es 7mG(5')ppp(5')NlmpNp.
Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una vacuna que incluye al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico de ZIKV en el que el polinucleótido de ARN de la vacuna de ARN de ZIKV incluye al menos una modificación química.
En algunas realizaciones, la modificación química se selecciona de pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil -pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tiopseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina, 5-metiluridina y 2'-O-metiluridina.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN, es decir, el ARNm que incluye al menos una modificación química incluye además una tapa terminal 5'. En algunas realizaciones, la tapa terminal 5' es 7mG(5')ppp(5')NlmpNp.
Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una vacuna que incluye al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico ZIKV, en la que al menos 80 % del uracilo en el marco de lectura abierto tiene una modificación química.
En algunas realizaciones, 100 % del uracilo en el marco de lectura abierto tiene una modificación química. En algunas realizaciones, la modificación química se encuentra en la posición 5 del uracilo. En algunas realizaciones, la modificación química es una N1-metilpseudouridina.
En algunas realizaciones de cualquiera de las vacunas combinadas de ARN descritas en el presente documento, el polinucleótido de ARN de la vacuna de ARN se formula en un vehículo de nanopartículas lipídicas (LNP). En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, un lípido modificado por PEG, un esterol y un lípido no catiónico. En algunas realizaciones, el vehículo de nanopartículas lipídicas comprende una relación molar de aproximadamente 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido no catiónico: 25-55 % de esterol; y 0,5-15 % de lípido modificado con PEG. En algunas realizaciones, el lípido catiónico es un lípido catiónico ionizable. En algunas realizaciones, el lípido no catiónico es un lípido neutro. En algunas realizaciones, el esterol es un colesterol. En algunas realizaciones, el lípido catiónico se selecciona de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-no-2-en-1-ilo) (L319). En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica tiene un valor de polidispersidad de menos de 0.4. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica tiene una carga neutra neta a un pH neutro. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica tiene un diámetro medio de 50-200 nm.
Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una vacuna que incluye al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico ZIKV, al menos una tapa terminal 5' y al menos una modificación química, formulada dentro de una nanopartícula lipídica.
Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una vacuna que incluye al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico ZIKV, en el que el marco de lectura abierto del polinucleótido de ARN tiene codones optimizados.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos no están destinados a ser dibujados a escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en diversas figuras está representado por un número similar. Para mayor claridad, no todos los componentes pueden estar etiquetados en todos los dibujos. En los dibujos:
La Fig. 1A muestra una representación esquemática del proceso postraduccional de las proteínas estructurales de CHIKV. La Fig. 1B muestra una representación esquemática del E1/E2 heterodímero que se asocia como un pico trimérico en la superficie viral CHIKV.
La Fig. 2 muestra un árbol filogenético de cepas del virus chikungunya derivadas de marcos de lectura abiertos concatenados completos para las poliproteínas estructurales y no estructurales. Las sustituciones de aminoácidos E1 que facilitaron (linaje del Océano Índico) o impidieron (linaje asiático) la adaptación a Aedes albopictus se muestran a la derecha. RCA: República Centroafricana; ECSA: Este/Centro/Sudáfrica.
La Fig. 3 muestra la detección de la proteína de la cubierta de CHIKV del lisado en células HeLa 16 horas después de la transfección.
La Fig. 4A es una gráfica que muestra las tasas de supervivencia de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 pg o dos dosis de 2 pg de antígeno Chikungunya E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 4B es una gráfica que muestra el porcentaje de pérdida de peso de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 |jg o dos dosis de 2 |jg de antígeno Chikungunya E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 4C es una gráfica que muestra la puntuación de salud de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 jg o dos dosis de 2 jg de antígeno Chikungunya E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica.
La Fig. 5A es una gráfica que muestra las tasas de supervivencia de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 jg o dos dosis de 2 jg de antígeno Chikungunya E2 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 5B es una gráfica que muestra el porcentaje de pérdida de peso de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 jg o dos dosis de 2 jg de antígeno Chikungunya E2 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 5C es una gráfica que muestra la puntuación de salud de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 jg o dos dosis de 2 jg de antígeno Chikungunya E2 administrada por vía intramuscular o intradérmica.
La Fig. 6A es una gráfica que muestra las tasas de supervivencia de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 jg o dos dosis de 2 jg de antígeno Chikungunya C-E3-E2-6K-E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 6B es una gráfica que muestra el porcentaje de pérdida de peso de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 jg o dos dosis de 2 jg de antígeno Chikungunya C-E3-E2-6K-E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 6C es una gráfica que muestra la puntuación de salud de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 2 jg o dos dosis de 2 jg de antígeno Chikungunya C-E3-E2-6K-E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica.
La Fig. 7 muestra el diseño del estudio, el programa de inyección/sangrado, lectura y datos de supervivencia para el estudio de dosis de 2 jg de las vacunas CHIKV E1, CHIKV E2 y CHIKV E1/E2/E3/6K/C.
La Fig. 8A es una gráfica que muestra las tasas de supervivencia de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 8B es una gráfica que muestra el porcentaje de pérdida de peso de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 8C es una gráfica que muestra la puntuación de salud de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica.
La Fig. 9A es una gráfica que muestra las tasas de supervivencia de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya E2 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 9B es una gráfica que muestra el porcentaje de pérdida de peso de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya E2 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 9C es una gráfica que muestra la puntuación de salud de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya E2 administrada por vía intramuscular o intradérmica.
La Fig. 10A es una gráfica que muestra las tasas de supervivencia de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya C-E3-E2-6K-E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 10B es una gráfica que muestra el porcentaje de pérdida de peso de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya C-E3-E2-6K-E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica. La Fig. 10C es una gráfica que muestra la puntuación de salud de ratones AG129 vacunados con una dosis única de 10 jg o dos dosis de 10 jg de antígeno Chikungunya C-E3-E2-6K-E1 administrada por vía intramuscular o intradérmica.
La Fig. 11 muestra el diseño del estudio, el programa de inyección/sangrado, lectura y datos de supervivencia para el estudio de dosis de 10 jg de las vacunas CHIKV E1, CHIKV E2, y CHIKV C-E3-E2-6K-E1.
La Fig. 12 muestra los resultados de una transfección in vitro de proteínas estructurales de CHIKV codificadas por ARNm. Se detecta detección de proteína en lisado de células HeLa 16 h después de la transfección.
Las Figs. 13A y 13B son esquemas de un epítopo peptídico de DENV ejemplar. El polipéptido de la Fig. 13A incluye dos o más epítopos. Los epítopos pueden ser de la misma secuencia o de una secuencia diferente y pueden ser todos epítopos de células T, todos epítopos de células B o una combinación de ambos. El esquema de la Fig. 13B muestra el epítopo del péptido con diversas unidades terminales para potenciar el procesamiento de los péptidos por parte del MHC.
La Fig. 14 es un esquema de un genoma viral del dengue que incluye componentes estructurales y no estructurales.
La Fig. 15 muestra epítopos peptídicos del dengue ejemplares identificados usando una pantalla de base de datos.
Las Figs. 16A-16C muestran epítopos de células IT del MHC del virus del dengue.
Las Figs. 17A-17C muestran epítopos de células T MHC II del virus del dengue.
La Fig. 18 es un gráfico que representa los resultados de un ensayo ELISPOT de péptidos específicos del dengue.
La Fig. 19 es un gráfico que representa los resultados de un ensayo ELISPOT de péptidos específicos del dengue.
La Fig. 20 es un esquema de un ratón de médula ósea/hígado/timo (BLT) y datos sobre células T CD8 humanas estimuladas con el epítopo peptídico del dengue.
La Fig.21 muestra DENV MHC-1_V5 transfección de concatémeros en células HeLa. Se realizó inmunofluorescencia triple utilizando Mitotracker Red (mitocondrias), anticuerpos anti-V5 y anti-MHC-1 más DAPI. Las flechas indican la colocalización de V5-MHC1 (abajo a la derecha).
La Fig.22 muestra DENV MHC-1_V5 transfección de concatémeros en células HeLa. Se realizó inmunofluorescencia triple utilizando Mitotracker Red (mitocondrias), anticuerpos anti-V5 y anti-MHC-1 más DAPI. Las flechas indican regiones donde V5 colocaliza preferentemente con MHC 1 y no con Mitotracker.
La Fig.23 muestra DENV MHC-1_V5 transfección de concatémeros en células HeLa. Se realizó inmunofluorescencia triple utilizando Mitotracker Red (mitocondrias), anticuerpos anti-V5 y anti-MHC-1 más DAPI. V5 tiene una distribución citoplasmática homogénea que colocaliza preferentemente con MHC1 y no con Mitotracker.
Las Figs. 24A y 24B muestran los resultados de un ensayo de tinción de citoquinas intracelulares realizado en células PBMC.
La Fig. 25 muestra un esquema de una poliproteína genómica obtenida del virus Zika, Flaviridiaie. El genoma del ZIKV codifica una poliproteína con tres proteínas estructurales (cápside (C), premembrana/membrana (prM) y envoltura (E, un motivo de glicosilación previamente asociado con la virulencia)), y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5). La poliproteína puede ser escindida por varias peptidasas o proteasas del huésped para generar proteínas estructurales o funcionales para el virus. Los sitios de escisión respectivos de las peptidasas o proteasas se indican mediante flechas.
La Fig. 26A muestra un esquema de una vacuna ZIKV que comprende un polinucleótido de ARN que codifica un péptido señal fusionado con la proteína prM del Zika fusionada con la proteína E del Zika. La Fig. 26B muestra un esquema de una vacuna ZIKV que comprende un polinucleótido de ARN que codifica un péptido señal fusionado con la proteína E Zika. La unión de división se encuentra entre el péptido señal y la proteína prM de Zika y se conserva entre Dengue y Zika.
La Fig. 27 muestra un alineamiento de secuencias de las cepas del virus del Zika que circulan actualmente.
La Fig. 28 muestra la tinción fluorescente de lisados de células de mamíferos no reducidos. El tubo 1 contiene un precipitado de células lisadas obtenido a partir de células 293T transfectadas con ARNm de prME de ZIKV y teñidas solo con anticuerpo secundario (control negativo). El tubo 2 contiene un precipitado de células lisadas obtenido de células 293T no transfectadas y teñido con suero humano anti-ZIKV (1:20) y cabra anti-humano Alexa Fluor 647 (control negativo). El tubo 3 contiene un precipitado de células lisadas obtenido de células 293T transfectadas con ARNm de prME de ZIKV y teñidas con suero humano anti-ZIKV (1:20) y cabra antihumana Alexa Fluor 647. El tubo 4 contiene un precipitado de células lisadas obtenido de células 293T transfectadas con ARNm de prME de ZIKV y teñidas con suero humano anti-ZIKV (1:200) y cabra antihumana Alexa Fluor 647. Los anticuerpos en suero humano anti-ZIKV pueden detectar proteínas no reducidas expresadas por constructos de ARNm de prME.
La Fig. 29 muestra un histograma que indica la detección intracelular de la proteína prME de ZIKA usando suero anti-ZIKV humano.
Las Figs. 30A-30B muestran los resultados de la detección de la expresión de la proteína prME en células de mamífero con clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando un citómetro de flujo. Las células que expresaban prME mostraron una mayor intensidad de fluorescencia cuando se tiñeron con suero humano anti-ZIKV.
La Fig. 31 muestra un gráfico de títulos neutralizantes de Balb/c ratones inmunizados con vacuna de ARNm de ZIKV que codifica prME.
La Fig. 32 muestra imágenes de tinción negativa para muestras de Hela.
La Fig. 33A muestra un gel SDS-PAGE reductor de Zika VLP. La Fig. 33B muestra un gráfico de títulos de neutralización obtenidos de Balb/c ratones inmunizados con una vacuna de ARNm de ZIKV.
La Fig. 34A muestra análisis FACS de células que expresan prME de DENV2 utilizando diferentes anticuerpos contra la proteína de la envoltura del dengue. Los números en la esquina superior derecha de cada gráfico indican la intensidad fluorescente media. La Fig. 34B muestra una repetición de la tinción por triplicado y en dos líneas celulares diferentes (HeLa y 293T).
La Fig. 35 muestra un ensayo de presentación de antígenos in vitro usando multitopos de OVA (epítopo peptídico de ovoalbúmina) para probar diferentes configuraciones de constructos de vacunas de ARNm de DENV.
La Fig. 36 es un gráfico que muestra la cinética de presentación del péptido OVA en células Jawsii. Todos los ARNm probados están formulados en nanopartículas de lípidos MC3.
La Fig. 37 es un gráfico que muestra la Intensidad Fluorescente Media (MFI) del anticuerpo que se une a los epítopos prME de DENV-1, 2, 3 y 4 presentados en la superficie celular.
Las Figs. 38A-38D son gráficos que muestran el diseño y los resultados de un estudio de exposición en ratones AG129. La Fig. 38A muestra los calendarios de inmunización, exposición y recogida de suero. La Fig. 38B muestra la supervivencia de los ratones AG129 expuestos con el virus Dengue D2Y98P después de ser inmunizados con las vacunas de ARNm de DENV indicadas. Todos los ratones inmunizados sobrevivieron 11 días después de la infección, mientras que los ratones no inmunizados (control) murieron. Las Figs. 38C y 38D muestran la pérdida de peso de los ratones AG129 después de la infección. Las vacunas 1, 7, 8 o 9 corresponden al constructo de vacuna DENV 22, 21, 23 o 24 de la presente divulgación, respectivamente.
La Fig. 39 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de neutralización in vitro usando suero de ratones inmunizados con las vacunas de ARNm de DENV en las Figs. 39A-39D.
Las Figs. 40A-40I son gráficos que muestran los resultados de un estudio de provocación en ratones AG129. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 40. Las Figs. 40A-40F muestran la supervivencia, la pérdida de peso y la puntuación de salud de los ratones AG129 expuestos con el virus D2Y98P después de ser inmunizados con los grupos de vacuna de ARNm de DENV 1-12 en la Tabla 40. Las Figs. 40G-40I muestran la supervivencia, la pérdida de peso y la puntuación de salud de los ratones AG129 expuestos con el virus D2Y98P después de ser inmunizados con los grupos de vacuna de ARNm de DENV 13-19 en la Tabla 40.
La Fig. 41 es una imagen de microscopía electrónica con tinción negativa de las partículas similares a virus (VLP) ensambladas a partir de los antígenos (prME) codificados por las vacunas de ARNm de DENV. Se ensayaron los constructos de vacuna de ARNm de DENV 21-24 en la Tabla 38. El constructo 23 es el constructo de vacuna utilizado por Sanofi en sus vacunas contra el DENV. Los constructos 21, 22 y 24 produjeron VLP más uniformes, lo que sugiere que estas VLP pueden ser más superiores en su inmunogenicidad que las VLP producidas a partir del constructo 23.
Las Figs. 42A-42B son gráficos que muestran las curvas de supervivencia de un estudio de exposición a CHIKV en ratones AG129 inmunizados con vacunas de ARNm de CHIKV en dosis de 10 pg, 2 pg o 0,04 pg. Los ratones se dividieron en 14 grupos (1-4 y 7-16, n=5). La Fig. 42A muestra la curva de supervivencia de los grupos de ratones 1-4 y 7-9 expuestos el día 56 después de la inmunización. La Fig. 42B muestra la curva de supervivencia de los grupos de ratones 10-16 expuestos el día 112 después de la inmunización. Las curvas de supervivencia se trazaron como "porcentaje de supervivencia" frente a "días después de la infección". Ver también la Tabla 45 para el porcentaje de supervivencia.
Las Figs. 43A-43B son gráficos que muestran los cambios de peso posteriores a la exposición en ratones AG129 inmunizados con vacunas de ARNm de CHIKV. La Fig. 43A muestra el cambio de peso de los grupos de ratones 1-4 y 7-9 expuestos el día 56 después de la inmunización. La Fig. 43B muestra los cambios de peso de los grupos de ratones 10-16 expuestos el día 112 después de la inmunización. Los pesos iniciales se evaluaron en ratones individuales en el día 0 del estudio y diariamente a partir de entonces. Los pesos porcentuales medios para cada grupo en comparación con su peso porcentual en el día 0 (línea de base) se representaron frente a los "días posteriores a la infección". Las barras de error representan la desviación estándar (DE).
Las Figs. 44A-44B son gráficos que muestran las puntuaciones de salud posteriores a la exposición de ratones AG129 inmunizados con vacunas de ARNm de CHIKV. La Fig. 44A muestra las puntuaciones de salud de los grupos de ratones 1 -4 y 7-9 expuestos el día 56 después de la inmunización. La Fig. 44B muestra la puntuación de salud de los grupos de ratones 10-16 expuestos el día 112 después de la inmunización. Las puntuaciones medias de salud de cada grupo se representaron frente a los "días posteriores a la infección" y las barras de error representan la DE. Las puntuaciones medias de salud se calcularon con base en las observaciones descritas en la Tabla 5.
Las Figs. 45A-45C son gráficos que muestran los títulos de anticuerpos medidos mediante ensayos ELISA en el suero de ratones AG129 (grupos 1-4 y 7-9) 28 días después de la inmunización con vacunas de ARNm de CHIKV. La Fig. 45A muestra los títulos de anticuerpos en suero contra la proteína CHIKV E1. La Fig. 45B muestra los títulos de anticuerpos en suero contra la proteína CHIKV E2. La Fig. 45C muestra los títulos de anticuerpos en suero contra el lisado de CHIKV.
Las Figs. 46A-46C son gráficos que muestran los títulos de anticuerpos medidos mediante ensayos ELISA en el suero de ratones AG129 (grupos 10-16) 28 días después de la inmunización con vacuna de ARNm de CHIKV. La Fig. 45A muestra los títulos de anticuerpos en suero contra la proteína CHIKV E1. La Fig. 46B muestra los títulos de anticuerpos en suero contra la proteína CHIKV E2. La Fig. 46C muestra los títulos de anticuerpos en suero contra el lisado de CHIKV.
Las Figs. 47A-47C son gráficos que muestran los títulos de anticuerpos medidos mediante ensayos ELISA en el suero de ratones AG129 (grupos 10-16) 56 días después de la inmunización con vacuna de ARNm de CHIKV. La Fig. 47A muestra los títulos de anticuerpos en suero contra la proteína CHIKV E1. La Fig. 47B muestra los títulos de anticuerpos en suero contra la proteína CHIKV E2. La Fig. 47C muestra los títulos de anticuerpos en suero contra el lisado de CHIKV.
Las Figs. 48A-48C son gráficos que muestran los títulos de anticuerpos medidos mediante ensayos ELISA en el suero de ratones AG129 (grupos 10-16) 112 días después de la inmunización con vacuna de ARNm de CHIKV. La Fig. 48A muestra los títulos de anticuerpos en suero contra la proteína CHIKV E1. La Fig. 48B muestra los títulos de anticuerpos en suero contra la proteína CHIKV E2. La Fig. 48C muestra los títulos de anticuerpos en suero contra el lisado de CHIKV.
La Fig. 49 muestra diferentes antígenos con base en la proteína estructural de Chikungunya de tres genotipos diferentes.
La Fig. 50 muestra un conjunto de gráficos que representan los resultados de un ensayo ELISA para identificar la cantidad de anticuerpos producidos en ratones AG129 en respuesta a la vacunación con ARNm que codifica la proteína estructural E1 de CHIKV secretada, la proteína estructural E2 de CHIKV secretada o la poliproteína estructural completa C-E3-E2-6k-E1 de CHIKV a una dosis de 10 pg o 2 pg a los 28 días posteriores a la inmunización.
La Fig. 51 muestra un conjunto de gráficos que representan los resultados de un ensayo ELISA para identificar la cantidad de anticuerpos producidos en ratones AG129 en respuesta a la vacunación con ARNm que codifica la proteína estructural E1 de CHIKV secretada, la proteína estructural E2 de CHIKV secretada o la poliproteína estructural completa C-E3-E2-6k-E1 de CHIKV a una dosis de 10 pg o 2 pg a los 28 días posteriores a la inmunización. Los dos paneles representan diferentes estudios.
La Fig. 52 es un gráfico que representa la comparación de los títulos de ELISA de los datos de la Fig. 50 con la supervivencia en los datos del panel izquierdo de la Fig. 51.
La Fig. 53 muestra un conjunto de gráficos que representan los resultados de eficacia en ratones en respuesta a la vacunación con ARNm que codifica la poliproteína estructural completa C-E3-E2-6k-E1 de CHIKV a una dosis de 10 pg (paneles de la izquierda), 2 pg (paneles del medio) o 0,4 pg (paneles de la derecha) a los 56 días (paneles superiores) o 112 días (paneles inferiores) después de la inmunización.
La Fig. 54 muestra un conjunto de gráficos que representan la cantidad de anticuerpo neutralizante producido en ratones en respuesta a la vacunación con ARNm que codifica la poliproteína estructural completa C-E3-E2-6k-E1 de CHIKV a una dosis de 10 pg, 2 pg o 0,4 pg a 56 días post inmunización.
La Fig. 55 muestra un conjunto de gráficos que representan el anticuerpo de unión producido en ratones en respuesta a la vacunación con ARNm que codifica la poliproteína estructural completa C-E3-E2-6k-E1 de CHIKV a una dosis de 10 pg, 2 pg o 0,4 pg a los 56 días después de la inmunización (paneles superiores) y la correlación correspondiente entre los anticuerpos de unión y neutralización (paneles inferiores).
La Fig. 56 muestra un conjunto de gráficos que representan la cantidad de anticuerpo neutralizante producido en ratones A129 en respuesta a la vacunación con ARNm que codifica la poliproteína estructural completa C-E3-E2-6k-E1 de CHIKV a una dosis de 10 pg, 2 pg o 0,4 pg en 56 días después de la inmunización contra tres cepas diferentes de CHIKV, África-Senegal (panel izquierdo), La Reunión (panel central) y CDC CAR (panel derecho).
La Fig. 57 muestra un gráfico que representa los anticuerpos neutralizantes contra la cepa CHIKV S27.
La Fig. 58 es un gráfico que representa el título de anticuerpos contra el lisado de CHIKV después de la 3a vacunación 10 con la vacuna de ARNm en ratas Sprague Dawley.
La Fig. 59 muestra un conjunto de gráficos que representan títulos de anticuerpos después de la vacunación de ratones con poliproteína de CHIKV codificada por ARNm (C-E3-E2-6K-E1).
La Fig. 60 muestra un conjunto de gráficos que representan la secreción de citoquinas y la activación de células T después de la vacunación de ratones con poliproteína de CHIKV codificada por ARNm (C-E3-E2-6K-E1) (SEQ ID NO: 13).
Las Figs. 61A-61B muestran un conjunto de gráficos que representan la activación de células T CD8+ después de la vacunación de ratones con poliproteína de CHiKv codificada por ARNm (C-E3-E2-6K-E1) (SEQ ID NO: 13).
Descripción detallada
Los casos de la presente divulgación proporcionan vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) que son útiles para vacunar contra uno o múltiples virus. Las vacunas, incluyendo las vacunas combinadas, de la divulgación codifican antígenos del virus chikungunya (CHIKV), virus Zika (ZIKV), virus del dengue (DENV) o cualquier combinación de dos o tres de los virus anteriores. Se puede generar una respuesta inmunitaria equilibrada, que comprende tanto inmunidad celular como humoral, contra CHIKV, contra DENV, contra ZIKV, contra CHIKV y DENV, contra CHIKV y ZIKV, contra DENV y ZIKV, o contra CHIKV, DENV y ZIKV, utilizando los constructos de la divulgación sin muchos de los riesgos asociados con las vacunas de ADN y las vacunas vivas atenuadas. Las diversas vacunas de ARN divulgadas en el presente documento produjeron una eficacia sorprendente en modelos animales de infección por Chikungunya e infección por Dengue, cuyos resultados se analizan en detalle en la sección de Ejemplos. Específicamente, las vacunas de polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica para una variedad de antígenos de Chikungunya produjeron una inmunidad significativa, mientras que las vacunas de Chikungunya tradicionales no la produjeron (por ejemplo, virus chikungunya atenuados). Las vacunas de polinucleótidos de ARN de CHIKV divulgadas en el presente documento que codifican CHIKV-E1, CHIKV-E2 o CHIKV-C-E3-E2-6K-E1 demostraron una tasa de supervivencia de 60 %-100 % después de dos administraciones. Específicamente, dos inyecciones de la vacuna de ARNm de CHIKV E1 proporcionaron una protección casi total contra la infección cuando se administraron por vía intramuscular (IM) (60 % de supervivencia) o intradérmica (ID) (80 % de supervivencia). Dos inyecciones de la vacuna CHIKV E2 ARNm o CHIKV C-E3-E2-6K-E1 proporcionaron protección total (100 % de supervivencia) contra la infección cuando se administraron por vía IM o ID. Es importante destacar que una sola inyección (sin dosis de refuerzo) de la vacuna CHIKV C-E3-E2-6K-E1 proporcionó protección total (100 % de supervivencia) contra la infección cuando se administró por vía IM o ID.
Las vacunas de ARN contra el DENV y las vacunas contra el ZIKV también se divulgan en el presente documento, así como las vacunas combinadas contra el DENV y el CHIKV, el CHIKV y el ZIKV y las vacunas contra el DENV y el ZIKV. Las vacunas combinadas de CHIKV, DENV y ZIKV, DENV y ZIKV, CHIKV y ZIKV, o CHIKV y DENV pueden proporcionar un medio para proteger contra dos o más infecciones virales en una sola vacuna.
El virus Chikungunya es un virus de ARN de cadena positiva, pequeño (de aproximadamente 60-70 nm de diámetro), esférico, envuelto, que tiene una cápside con simetría icosaédrica. El virión consta de una envoltura y una nucleocápside. El ARN del virión es infeccioso y sirve tanto como ARN mensajero genómico como viral. El genoma es lineal, ARNss (+) genoma de 11,805 nucleótidos que codifica dos poliproteínas que son procesadas por las proteasas virales y del hospedador en proteínas no estructurales (nsP1, nsP2, nsP3 y RdRpnsP4) necesarias para la síntesis de ARN (replicación y transcripción) y proteínas estructurales (cápside y proteínas de la cubierta C, E3, E2, 6K y E1) que se unen a los receptores del huésped y median la endocitosis del virus en la célula huésped. (Fig. 1). Las glicoproteínas E1 y E2 forman heterodímeros que se asocian como 80 picos triméricos en la superficie viral cubriendo la superficie uniformemente. Las glicoproteínas de la envoltura desempeñan un papel en la unión a las células. La proteína de la cápside posee una actividad de proteasa que da como resultado su autoescisión de la proteína estructural naciente. Después de su escisión, la proteína de la cápside se une al ARN viral y se ensambla rápidamente en partículas centrales icosaédricas. La nucleocápside resultante finalmente se asocia con el dominio citoplasmático de E2 en la membrana celular, lo que lleva a la gemación y formación de viriones maduros.
E2 es una glicoproteína de la cubierta responsable de la unión viral a la célula huésped objetivo, al unirse al receptor celular. E2 se sintetiza como un precursor de p62 que se procesa en la membrana celular antes de la gemación del virión, dando lugar a un heterodímero E2-E1. El extremo C de E2 participa en la gemación al interactuar con las proteínas de la cápside.
E1 es una glicoproteína de la cubierta con actividad de fusión, cuya actividad de fusión es inactiva mientras E1 se une a E2 en el virión maduro. Después de la unión del virus a la célula objetivo y la endocitosis, la acidificación de la endosoma induce la disociación del E1/E2 heterodímero y trimerización concomitante de las subunidades E1. El trímero E1 es activo para la fusión y promueve la liberación de la nucleocápside viral en el citoplasma después de la fusión de la endosoma y la membrana viral.
E3 es una proteína accesoria que funciona como una señal de translocación/transporte de membrana para E1 y E2.
6K es otra proteína accesoria involucrada en el procesamiento de glicoproteínas virales, la permeabilización celular y la germinación de partículas virales. Al igual que E3, funciona como una señal de transporte de membrana para E1 y E2.
Se ha demostrado que las proteínas estructurales de CHIKV son antigénicas, cuyas proteínas, fragmentos y epítopos de las mismas se incluyen en la divulgación. Un árbol filogenético de las cepas del virus Chikungunya derivadas de marcos de lectura abiertos concatenados completos para las poliproteínas estructurales y no estructurales muestra sustituciones de aminoácidos clave de la glicoproteína E1 de la envoltura que facilitaron (linaje del Océano Índico) o impidieron (linaje asiático) la adaptación a Aedes albopictus. Hay formas unidas a la membrana y secretadas de E1 y E2, así como el antígeno poliproteico completo (C-E3-E2-6K-E1), que retiene la conformación nativa de la proteína. Además, los diferentes genotipos, cepas y aislados de Chikungunya también pueden producir diferentes antígenos, que son funcionales en los constructos de la divulgación. Por ejemplo, hay varios genotipos diferentes de Chikungunya: Aislados del Océano Índico, Este/Centro/Sudáfrica (ECSA), Asia, África Occidental y Brasil (ECSA/Asia). Hay tres genotipos principales de Chikungunya. Estos son ESCA (África Este-Sur-Central); Asia; y África Occidental. Si bien a veces los nombres difieren en las publicaciones, todos pertenecen a estas tres cepas geográficas.
El virus del dengue es transmitido por mosquitos (Aedes aegypti/Aedes albopictus) miembro de la familia Flaviviridae (virus de ARN monocatenario de sentido positivo). El genoma del virus del dengue codifica diez genes y se traduce como un solo polipéptido que se divide en diez proteínas: la cápside, la envoltura, la membrana y las proteínas no estructurales (proteínas NS1, NS2A, Ns 2B, NS3, SN4A, NS4B y NS5). El antígeno principal del virus es DENe, que es un componente de la superficie viral y se cree que facilita la unión del virus a los receptores celulares (Heinz et al., Virology. 1983, 126:525). Hay cuatro serotipos similares pero distintos del virus del dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4), que provocan anualmente entre 50-100 millones de casos de dengue y 500,000 casos de dengue hemorrágico más grave/síndrome de choque por dengue (DHF/DSS) (Gubler et al., Adv Virus Res. 1999, 53:35-70). Los cuatro serotipos muestran reactividad cruzada inmunológica, pero son distinguibles en las pruebas de neutralización por reducción de placa y por sus respectivos anticuerpos monoclonales. La proteína E del virus del dengue incluye un determinante antigénico específico de serotipo y determinantes necesarios para la neutralización del virus (Mason et al., J Gen Virol. 1990, 71:2107-2114).
Después de la inoculación, las células dendríticas se infectan y viajan a los ganglios linfáticos. Los monocitos y los macrófagos también son el objetivo poco después. Generalmente, el individuo infectado estará protegido contra la reinfección homotípica de por vida; sin embargo, el individuo solo estará protegido contra otros serotipos durante algunas semanas o meses (Sabin, Am J Trop Med Hyg. 1952, 1:30-50). En realidad, DHF/DSS se encuentra generalmente en niños y adultos infectados con un serotipo del virus del dengue que difiere de su infección primaria respectiva. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna que proporcione inmunidad a los cuatro serotipos.
Junto con otros virus de la familia Flaviviridae, el virus del Zika tiene envoltura y es icosaédrico con un genoma de ARN de sentido positivo, monocatenario y no segmentado. Está más estrechamente relacionado con el virus Spondweni y es uno de los dos virus del clado del virus Spondweni. El virus se aisló por primera vez en 1947 de un mono rhesus en el bosque Zika de Uganda, África y se aisló por primera vez de humanos en 1968 en Nigeria. Desde 1951 hasta 1981, se informaron pruebas de infección humana en otros países africanos, como Uganda, Tanzania, Egipto, República Centroafricana, Sierra Leona y Gabón, así como en partes de Asia, como India, Malasia, Filipinas, Tailandia, Vietnam e Indonesia. Se transmite por mosquitos y se ha aislado de varias especies del género Aedes - Aedes aegypti, Aedes africanus, Aedes apicoargenteus, Aedes furcifer, Aedes luteocephalus y Aedes vitattus. Los estudios muestran que el período de incubación extrínseco en los mosquitos es de unos 10 días. Los huéspedes vertebrados del virus incluyen monos y humanos.
A principios de 2016, el brote más generalizado de fiebre Zika, causado por el virus Zika, está en curso principalmente en las Américas. El brote comenzó en abril de 2015 en Brasil y posteriormente se extendió a otros países de América del Sur, América Central y el Caribe.
El virus del Zika se vinculó por primera vez con la microcefalia del recién nacido durante el brote del virus del Zika en Brasil. En 2015 hubo 2,782 casos de microcefalia en comparación con 147 en 2014 y 167 en 2013. El Ministerio de Salud de Brasil ha informado 4783 casos de sospecha de microcefalia al 30 de enero, un aumento de más de 1000 casos respecto a la semana anterior. La confirmación de muchos de los casos recientes está pendiente, y es difícil estimar cuántos casos no se informaron antes de la reciente toma de conciencia del riesgo de infecciones por virus.
Lo importante no es solo el número de casos sino también la manifestación clínica de los casos. Brasil está viendo casos graves de microcefalia, que es más probable que se acompañen de mayores retrasos en el desarrollo. La mayor parte de lo que se informa fuera de Brasil es microcefalia con otras anomalías asociadas. La consecuencia potencial de esto es el hecho de que es probable que haya casos subclínicos en los que las secuelas neurológicas solo se harán evidentes a medida que los niños crezcan.
El virus del Zika también se ha asociado con un aumento de una condición rara conocida como Guillain-Barré, en la que la persona infectada queda prácticamente paralizada. Durante el brote del virus Zika en la Polinesia Francesa, 74 pacientes que habían tenido síntomas de Zika, de ellos, 42 fueron diagnosticados con síndrome de Guillain-Barré. En Brasil, se informaron 121 casos de manifestaciones neurológicas y síndrome de Guillain-Barré (SGB), todos los casos con antecedentes de síntomas similares al Zika.
En algunas realizaciones, las vacunas contra el ZIKV comprenden ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico del ZIKV que tiene al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con la poliproteína del ZIKV y que tiene actividad poliproteica, respectivamente. La poliproteína ZIKV se escinde en cápside, membrana precursora, envoltura y proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).
Se considera que una proteína tiene actividad de poliproteína ZIKV si, por ejemplo, facilita la unión de la envoltura viral a los receptores del huésped, media la internalización en la célula huésped y ayuda en la fusión de la membrana del virus con la membrana endosomal del huésped.
Es posible utilizar las vacunas de ARN en diversos casos de acuerdo con la prevalencia de la infección o el grado o nivel de la necesidad médica no satisfecha. Las vacunas de ARN se pueden utilizar para tratar y/o prevenir una infección por CHIKV, DENV y/o ZIKV de varios genotipos, cepas y aislados. Las vacunas de ARN tienen propiedades superiores debido a que producen títulos de anticuerpo mucho mayores y producen respuestas antes que los tratamientos terapéuticos antivirales comercialmente disponibles. Sin limitarse a la teoría, se cree que el diseño de las vacunas de ARN, como polinucleótidos de ARNm, están mejor diseñadas para producir la conformación proteica adecuada tras la traducción, ya que las vacunas de ARN cooptan la maquinaria celular natural. A diferencia de las vacunas tradicionales que se producen ex vivo y que pueden desencadenar respuestas celulares no deseadas, las vacunas de ARN se presentan al sistema celular en una forma más natural.
Ácidos nucleicos/Polinucleótidos
Las vacunas, incluyendo las vacunas combinadas, como se describe en el presente documento, comprenden al menos uno (uno o más) polinucleótidos de ácido ribonucleico (ARN) que tienen un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico CHIKV, al menos un polipéptido antigénico ZIKV, al menos un polipéptido antigénico de dEnV, al menos un polipéptido antigénico de CHIKV y al menos un polipéptido antigénico de DENV, al menos un polipéptido antigénico de CHIKV y al menos un polipéptido antigénico de ZIKV, al menos un polipéptido antigénico de ZIKV y al menos un polipéptido antigénico de DENV, o al menos uno polipéptido antigénico CHIKV, al menos un polipéptido antigénico DENV y al menos un polipéptido antigénico ZIKV. En algunos casos, la vacuna, incluyendo las vacunas combinadas, comprende al menos un polinucleótido de ARN, por ejemplo, ARNm, que tiene un marco de lectura abierto que codifica dos o más polipéptidos antigénicos de CHIKV diferentes, polipéptidos antigénicos de ZIKV, y/o polipéptidos antigénicos de DENV (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más polipéptidos antigénicos diferentes). En algunos casos, la vacuna combinada comprende al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido o epítopo antigénico de CHIKV, un polipéptido o epítopo antigénico de ZIKV, un polipéptido o epítopo antigénico de DENV, o una combinación de cualquiera de dos o tres de los siguientes. renunciando La expresión “ácido nucleico”, en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprenda un polímero de nucleótidos. Estos polímeros se denominan polinucleótidos. Como se usa en el presente documento, el término polipéptido se refiere a proteínas de longitud completa, fragmentos de proteínas, variantes y epítopos.
En algunos casos, un polinucleótido de ARN, por ejemplo, ARNm, de una vacuna combinada codifica al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polipéptidos antigénicos. En algunos casos, un polinucleótido de ARN comprende de 30 a 12000 más nucleótidos. Por ejemplo, un polinucleótido puede incluir 30 a 100, 101 a 200, 200 a 500, 200 a 1000, 200 a 1500, 200 a 2000, 200 a 3000, 500 a 1000, 500 a 1500, 500 a 2000, 500 a 3000, 1000 a 1500, 1000 a 2000, 1000 a 3000, 1500 a 3000, 1500 a 4000, 1500 a 5000, 2000 a 3000, 2000 a 4000, 2000 a 5000, 5000 a 7500, 7500 a 10,000, o 10,000 a 12,000 nucleótidos.
Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan vacunas ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas, que incluyen al menos un polinucleótido de ácido ribonucleico (ARN) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico ZIKV o un fragmento inmunogénico o epítopo del mismo. Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan vacunas combinadas contra ZIKv que incluyen al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica dos o más polipéptidos antigénicos contra ZIKV o un fragmento inmunogénico o un epítopo del mismo. Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan vacunas ZIKV que incluyen dos o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifican dos o más polipéptidos antigénicos ZIKV o fragmentos inmunogénicos o epítopos de los mismos. El uno o más polipéptidos antigénicos de ZIKV pueden codificarse en un solo polinucleótido de ARN o pueden codificarse individualmente en múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos de ARN.
En algunas realizaciones, el al menos un polinucleótido de ARN puede codificar al menos un polipéptido antigénico ZIKV. En algunos casos, el polipéptido antigénico de ZIKV es un péptido de ZIKV intacto u otro antígeno grande (es decir, de más de 25 aminoácidos de longitud). En cualquiera de estas realizaciones, el al menos un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido de ZIKV de un serotipo de ZIKV seleccionado entre MR 766, SPH2015 o ACD75819. Por ejemplo, el polipéptido ZIKV puede ser uno o más polipéptidos codificados por SEQ ID NO: 67-134 o un fragmento inmunogénico o epítopo del mismo.
Las vacunas contra el virus del Zika (ZIKV), incluyendo las vacunas combinadas, como se proporciona en el presente documento, comprenden al menos uno (uno o más) polinucleótidos de ácido ribonucleico (ARN) que tienen un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico del ZIKV. En algunas realizaciones, un polipéptido antigénico de ZIKV tiene una longitud de más de 25 aminoácidos y de menos de 50 aminoácidos. Por lo tanto, los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos de origen natural, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los que anteceden. Un polipéptido puede ser una sola molécula o puede ser un complejo multimolecular tal como un dímero, trímero o tetrámero. Los polipéptidos también pueden comprender polipéptidos de cadena simple o de cadena múltiple, tales como anticuerpos o insulina, y pueden estar asociados o unidos. Los enlaces disulfuro más comunes se encuentran en los polipéptidos de cadena múltiple. El término "polipéptido" también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos en los que al menos un residuo de aminoácido es un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente.
La generación de antígenos que provocan una respuesta inmunitaria deseada (por ejemplo, respuestas de células B y/o T) contra secuencias polipeptídicas específicas en el desarrollo de vacunas sigue siendo una tarea desafiante. La divulgación involucra tecnología que supera los obstáculos asociados con el desarrollo de vacunas. Mediante el uso de la tecnología de la divulgación, es posible adaptar la respuesta inmunitaria deseada seleccionando epítopos de células T o B apropiados que, en virtud del hecho de que se procesan intracelularmente, pueden presentarse de forma más eficaz en Moléculas MHC-1 o MHC-2 (dependiendo de si son epítopos de células T o B, respectivamente). En particular, la divulgación implica la generación de concatémeros de DENV de epítopos (particularmente epítopos de células T) preferiblemente intercalados con sitios de escisión por proteasas que abundan en las células presentadoras de antígenos (APC). Estos métodos imitan el procesamiento de antígenos y pueden conducir a una presentación de antígenos más eficaz que la que se puede lograr con antígenos peptídicos.
El hecho de que los epítopos peptídicos de la divulgación se expresen a partir de ARN como péptidos intracelulares proporciona ventajas sobre los péptidos de la técnica anterior que se administran como péptidos exógenos o como ADN. El ARN se administra intracelularmente y expresa los epítopos en la proximidad de la maquinaria celular apropiada para procesar los epítopos de manera que sean reconocidos por las células inmunitarias apropiadas. Además, una secuencia dirigida permitirá una mayor especificidad en la administración de los epítopos peptídicos.
Un péptido concatemérico como se usa en el presente documento es una serie de al menos dos epítopos peptídicos unidos para formar el propéptido. En algunas realizaciones, un péptido concatemérico está compuesto por 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más epítopos peptídicos. En otras realizaciones, el péptido concatemérico está compuesto por 1000 o menos, 900 o menos, 500 o menos, 100 o menos, 75 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos o 100 o menos epítopos peptídicos. En otras realizaciones más, un péptido concatemérico tiene 3-100, 5-100, 10-100, 15-100, 20-100, 25-100, 30­ 100, 35-100, 40-100, 45-100, 50-100, 55-100, 60-100, 65-100, 70-100, 75-100, 80-100, 90-100, 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50, 100-150, 100-200, 100-300, 100-400, 100-500, 50-500, 50­ 800, 50-1,000 o 100 -1,000 epítopos peptídicos.
Un epítopo, también conocido como determinante antigénico, como se usa en el presente documento, es una porción de un antígeno que es reconocido por el sistema inmunitario en el contexto apropiado, específicamente por anticuerpos, células B o células T. Los epítopos incluyen epítopos de células B y epítopos de células T. Los epítopos de células B son secuencias peptídicas que se requieren para el reconocimiento por parte de células B productoras de anticuerpos específicos. Los epítopos de células B se refieren a una región específica del antígeno que es reconocida por un anticuerpo. La porción de un anticuerpo que se une al epítopo se llama paratopo. Un epítopo puede ser un epítopo conformacional o un epítopo lineal, según la estructura y la interacción con el paratopo. Un epítopo lineal o continuo se define por la secuencia primaria de aminoácidos de una región particular de una proteína. Las secuencias que interactúan con el anticuerpo están situadas una al lado de la otra de manera secuencial en la proteína y, por lo general, el epítopo puede imitarse mediante un único péptido. Los epítopos conformacionales son epítopos que están definidos por la estructura conformacional de la proteína nativa. Estos epítopos pueden ser continuos o discontinuos, es decir, los componentes del epítopo pueden estar situados en partes dispares de la proteína, que se acercan entre sí en la estructura de la proteína nativa plegada.
Los epítopos de células T son secuencias peptídicas que, en asociación con proteínas en APC, son necesarias para el reconocimiento por parte de células T específicas. Los epítopos de células T se procesan intracelularmente y se presentan en la superficie de las APC, donde se unen a moléculas MHC, incluyendo MHC de clase II y MHC de clase I.
La presente divulgación, en algunos aspectos, se refiere a un proceso de desarrollo de epítopos concateméricos de células T o B o epítopos concateméricos compuestos por epítopos de células B y T. Existen varias herramientas para identificar diversos epítopos peptídicos. Por ejemplo, los epítopos se pueden identificar utilizando una base de datos comercial o gratuita (Lonza Epibase, antitope, por ejemplo). Tales herramientas son útiles para predecir los epítopos más inmunogénicos dentro de una proteína antigénica objetivo. A continuación, los péptidos seleccionados pueden sintetizarse y examinarse en paneles de HLA humanos, y las secuencias más inmunogénicas se utilizan para construir los polinucleótidos de ARNm que codifican los antígenos concateméricos. Una estrategia para el mapeo de epítopos de células T citotóxicas basada en la generación de mezclas equimolares de los cuatro péptidos C-terminales para cada 11-mer nominal en su proteína an. Esta estrategia produciría un antígeno de biblioteca que contiene todos los posibles epítopos CTL activos.
El epítopo peptídico puede tener cualquier longitud que sea razonable para un epítopo. En algunas realizaciones, el epítopo peptídico tiene 9-30 aminoácidos. En otras realizaciones la longitud es 9-22, 9-29, 9­ 28, 9-27, 9-26, 9-25, 9-24, 9-23, 9-21, 9-20, 9-19, 9-18, 10-22, 10-21, 10-20, 11-22, 22-21, 11-20, 12-22, 12­ 21, 12-20, 13-22, 13-21, 13-20, 14-19, 15-18 o 16-17 aminoácidos. En algunas realizaciones, la longitud óptima de un epítopo peptídico se puede obtener a través del siguiente procedimiento: sintetizar un sitio de proteasa de prueba de concatámero de etiqueta V5, introducirlo en células DC (por ejemplo, usando un procedimiento RNA Squeeze, generar lisis en las células y luego ejecutando un Western blot anti-V5 para evaluar la escisión en los sitios de proteasa.
Los ácidos nucleicos (a los que también se hace referencia como polinucleótidos) pueden ser o pueden incluir, por ejemplo, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de treosa (TNA), ácidos nucleicos glicólicos (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA, inclusive LNA con una configuración p-D-ribo, a-LNA con una configuración a-L-ribo (un diasterómero de LNA), 2'-amino-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino, y 2'-amino-a-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino), ácidos nucleicos de etileno (ENA), ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA) o quimeras o combinaciones de los mismos.
Los polinucleótidos de la presente divulgación son o funcionan como un ARN mensajero (ARNm). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ARN mensajero" (ARNm) se refiere a cualquier polinucleótido que codifica un (al menos un) polipéptido (un polímero de aminoácidos natural, no natural o modificado) y puede traducirse para producir el polipéptido codificado in vitro, in vivo, in situ o ex vivo.
Tradicionalmente, los componentes básicos de una molécula de ARNm incluyen al menos una región codificante, una región no traducida (UTR) en 5' y una UTR en 3'. En algunas realizaciones, las moléculas de ARNm incluyen además una tapa de 5'. En algunas realizaciones, el ARNm incluye además una cola poliA. Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden funcionar como ARNm, pero se distinguen del ARNm de tipo silvestre en sus características de diseño funcional y/o estructural que sirven para superar los problemas existentes de producción eficaz de polipéptidos utilizando agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos. Los polipéptidos antigénicos (antígenos) de la presente divulgación pueden estar codificados por polinucleótidos traducidos in vitro, denominados polinucleótidos "traducidos in vitro" (IVT).
Los polinucleótidos de ARN de la presente divulgación pueden ser o comprender una secuencia variante o mutante. El término "variante de polinucleótido" se refiere a una molécula de nucleótido que difiere en su secuencia de nucleótidos de una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia. Las variantes de la secuencia de nucleótidos pueden poseer sustituciones, deleciones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de nucleótidos, en comparación con la correspondiente secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia. En algunas realizaciones, las variantes de nucleótidos poseen al menos 80 % de identidad (homología) con una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia, por ejemplo, al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad (homología) con una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación, por ejemplo, variantes de polinucleótidos, tienen menos 80 % de identidad (homología) con una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia, por ejemplo, menos de 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 69 %, 68 %, 67 %, 66 %, 65 %, 64 %, 63 %, 62 %, 61 %, 60 % o menos de identidad (homología) con una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia. En algunas realizaciones, el polinucleótido de la invención, por ejemplo, las variantes de polinucleótidos tienen aproximadamente 65 % a aproximadamente 85 % de identidad con una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia, por ejemplo, 65 % - 82 %, 67 % - 81 %, o 66 %-80 % de identidad con una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia.
Los polinucleótidos de la presente divulgación, en algunas realizaciones, tienen codones optimizados. Los métodos de optimización de codones son conocidos en la técnica y pueden usarse como se proporciona en el presente documento. En algunas realizaciones, es posible emplear métodos de optimización por codón para la igualación de frecuencias de codones en organismos objetivo y hospedadores para garantizar el plegamiento adecuado, para alterar el contenido de GC para aumentar la estabilidad de ARNm o reducir estructuras secundarias, para minimizar los codones de repetición en tándem o corridas de base que pueden impedir la expresión o construcción génica, para modificar las regiones de control de transcripción y traducción, para insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas, para eliminar o agregar sitios de modificación postraduccional en proteínas codificadas (por ejemplo, sitios de glicosilación), para agregar, eliminar o mezclar dominios proteicos, para insertar o eliminar sitios de restricción, para modificar sitios de unión a ribosomas y sitios de degradación de ARNm, para ajustar las tasas de traducción con el fin de permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen en forma adecuada, o para reducir o eliminar estructuras secundarias problemáticas en el polinucleótido. Las herramientas, algoritmos y servicios de optimización de codones son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitativos incluyen servicios de GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) y/o métodos patentados. En algunas realizaciones, la secuencia del marco de lectura abierto (ORF) se optimiza utilizando algoritmos de optimización.
En algunas realizaciones, una secuencia optimizada por codones comparte menos de 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de origen natural o de tipo salvaje (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido o proteína antigénicos). En algunas realizaciones, una secuencia optimizada por codones comparte menos de 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de origen natural o de tipo salvaje (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido o proteína antigénicos)). En algunas realizaciones, una secuencia optimizada por codones comparte menos de 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de origen natural o de tipo salvaje (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido o proteína antigénicos). En algunas realizaciones, una secuencia optimizada por codones comparte menos de 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de origen natural o de tipo salvaje (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido o proteína antigénicos). En algunas realizaciones, una secuencia optimizada por codones comparte menos de 75 % de identidad de secuencia con una secuencia de origen natural o de tipo salvaje (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido o proteína antigénicos).
En algunas realizaciones, una secuencia optimizada por codón comparte entre 65 % y 85 % (por ejemplo, entre aproximadamente 67 % y aproximadamente 85 % o entre aproximadamente 67 % y aproximadamente 80 %) de identidad de secuencia con una secuencia de origen natural o de tipo salvaje (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido o proteína antigénicos). En algunas realizaciones, una secuencia optimizada por codones comparte entre 65 % y 75 % o aproximadamente 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de origen natural o de tipo salvaje (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido o proteína antigénicos).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos de ARN de la presente descripción pueden comprender además una secuencia que comprende o que codifica una secuencia adicional, por ejemplo, uno o más dominios funcionales, una o más secuencias reguladoras adicionales, un casquete 5' diseñado.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, las vacunas de ARN comprenden un elemento de UTR 5', un marco abierto de lectura opcionalmente optimizado por codón y un elemento de UTR 3', una secuencia poli(A) y/o una señal de polieadenilación en la que no se modifica químicamente el ARN.
Transcripción in vitro de ARN (por ejemplo, ARNm)
La combinación de vacunas de la presente divulgación comprende al menos un polinucleótido de ARN, tal como un ARNm (por ejemplo, ARNm modificado). Por ejemplo, se transcribe ARNm in vitro a partir del ADN plantilla, al que se hace referencia como una "plantilla de transcripción in vitro". En algunas realizaciones, una plantilla de transcripción in vitro codifica una región no traducida (UTR) 5', contiene un marco abierto de lectura y codifica un una UTR 3' y una cola poliA. La composición particular de la secuencia de nucleótido y la longitud de una plantilla de transcripción in vitro dependerán del ARNm codificado por la plantilla.
Una "región no traducida 5" (UTR) hace referencia a una región de un ARNm que se encuentra directamente aguas arriba (es decir, 5') respecto al codón de inicio (es decir, el primer codón de un transcrito de ARNm traducido por un ribosoma) que no codifica una proteína o un péptido.
Una "región no traducida 3" (UTR) hace referencia a una región de un ARNm que se encuentra directamente aguas abajo (es decir, 3') respecto al codón de terminación (es decir, el codón de un transcrito de ARNm que indica la terminación de la traducción) que no codifica una proteína o un péptido.
Un "marco de lectura abierto" es un tramo continuo de codones que comienza con un codón de inicio (por ejemplo, metionina (ATG)) y termina con un codón de parada (por ejemplo, TAA, TAG o TGA) que codifica un polipéptido.
Una "cola poliA" es una región del ARNm que se encuentra aguas abajo, por ejemplo, directamente aguas abajo (es decir, 3'), respecto a la UTR 3' que contiene monofosfatos de adenosina consecutivos múltiples. Una cola poliA puede contener de 10 a 300 monofosfatos de adenosina. Por ejemplo, una cola poliA puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 monofosfatos de adenosina. En algunas realizaciones, una cola de poliA contiene de 50 a 250 monofosfatos de adenosina. En un entorno biológico relevante (por ejemplo, en células, in vivo) la cola de poliA protege al ARNm de la degradación enzimática, por ejemplo, en el citoplasma y ayuda con la finalización de la transcripción, la exportación del ARNm del núcleo y la traducción.
En algunas realizaciones, un ARN con codones optimizados puede, por ejemplo, ser uno en el que se mejoren los niveles de G/C. El contenido de G/C de las moléculas de ácido nucleico puede influir en la estabilidad del ARN. El ARN con una cantidad mayor de residuos guanina (G) y/o citosina (C) puede ser funcionalmente más estable que los ARN que contienen una gran cantidad de nucleótidos de adenina (A) y timina (T) o uracilo (U). El documento WO02/098443 divulga una composición farmacéutica que contiene un ARNm estabilizado mediante modificaciones de secuencia en la región traducida. Debido a la degeneración del código genético, las modificaciones funcionan sustituyendo los codones existentes por aquellos que promueven una mayor estabilidad del ARN sin cambiar el aminoácido resultante. La estrategia se limita a las regiones codificantes del ARN.
Antígenos/Polipéptidos antigénicos
Los antígenos polipeptídicos de la presente divulgación pueden ser uno o más antígenos proteicos de ZIKV de longitud completa, uno o más fragmentos de antígenos, uno o más antígenos epítopos o cualquier combinación de sus secuencias. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 10 - 25 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 26 - 50 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 51 - 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 101 - 200 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 201 - 400 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 401 - 500 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 501 - 750 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 751 - 1000 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 1001 - 1500 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 1501 -2000 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico ZIKV comprende de 2001 - 4000 aminoácidos.
Los polipéptidos antigénicos incluyen productos génicos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos o manipulados, polipéptidos mutantes, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser una sola molécula o puede ser un complejo multimolecular tal como un dímero, trímero o tetrámero. Los polipéptidos también pueden comprender polipéptidos de cadena simple o de cadena múltiple, tales como anticuerpos o insulina, y pueden estar asociados o unidos. Los enlaces disulfuro más comunes se encuentran en los polipéptidos de cadena múltiple. El término "polipéptido" también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos en los que al menos un residuo de aminoácido es un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente.
El término "variante de polipéptido" se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, deleciones e/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia. Normalmente, las variantes poseen al menos 50 % de identidad (homología) con una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia. En algunas realizaciones, las variantes poseen al menos un 80 % o al menos un 90 % idénticas (homologas) a una secuencia nativa, de tipo silvestre o de referencia.
Los ejemplos de variantes naturales que están abarcadas por la presente divulgación incluyen polipéptidos estructurales CHIKV, DENV y ZIKV de diferentes genotipos, linajes, cepas y aislados de CHIKV. Un árbol filogenético de las cepas del virus Chikungunya derivadas de marcos de lectura abiertos concatenados completos para las poliproteínas estructurales y no estructurales muestra sustituciones de aminoácidos clave de la glicoproteína E1 de la envoltura que facilitaron (linaje del Océano Índico) o impidieron (linaje asiático) la adaptación a Aedes albopictus. Hay formas unidas a la membrana y secretadas de E1 y E2, así como el antígeno poliproteico completo, que retiene la conformación nativa de la proteína. Además, los diferentes genotipos de Chikungunya también pueden producir diferentes antígenos, que son funcionales en los constructos de la divulgación. Hay varios genotipos de Chikungunya: Aislados del Océano Índico, Este/Centro/Sudáfrica (ECSA), Asia, África Occidental y Brasil (ECSA/Asia). Por lo tanto, por ejemplo, las variantes naturales que están abarcadas por la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos estructurales CHIKV de las siguientes cepas y aislados: TA53, SA76, UG82, 37997, IND-06, Ross, s 27, M-713424, E1-A226V, E1-T98, IND-63-WB1, Gibbs 63-263, TH35, 1-634029, AF15561, IND-73-MH5, 653496, CO392-95, PO731460, MY0211MR/06/BP, SV0444-95, K0146-95, TSI-GSD-218-VR1, TSI-GSD-218, M127, M125, 6441-88, MY003IMR/06/BP, MY002IMR/06/BP, TR206/H804187, MY/06/37348, MY/06/37350, NC/2011-568, 1455-75, RSU1, 0706aTw, InDRE51CHIK, PR-S4, AMA2798/H804298, Hu/85/NR/001, PhH15483, 0706aTw, 0802aTw, MY019IMR/06/BP, PR-S6, PER160/H803609, 99659, JKT23574, 0811aTw, CHIK/SBY6/10, 2001908323-BDG E1, 2001907981-BDG E1, 2004904899-BDG E1, 2004904879-BDG E1, 2003902452-BDG E1, DH130003, 0804aTw, 2002918310-BDG E1, JC2012, chik-sy, 3807, 3462, Yap 13­ 2148, PR-S5, 0802aTw, MY019IMR/06/Bp, 0706aTw, PhH15483, Hu/85/NR/001, CHIKV-13-112A, InDRE 4CHIK, 0806aTw, 0712aTw, 3412-78, Yap 13-2039, LEIV-CHIKV/Moscow/1, DH130003, y 20039.
En algunas realizaciones, se proporcionan “miméticos variantes”. Tal como se usa en esta invención, la expresión "mimético de variante" es uno que contiene al menos un aminoácido que imitarían una secuencia activada. Por ejemplo, el glutamato puede servir como un imitador de fosforo-treonina y/o fosforo-serina. De manera alternativa, los miméticos o imitadores de variantes pueden producir la desactivación o un producto inactivado que contiene el imitador, por ejemplo, la fenilalanina puede actuar como una sustitución inactivante de la tirosina, o la alanina puede actuar como una sustitución inactivante para serina.
"Homología", tal como se aplica a las secuencias de aminoácidos, se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos candidata que sean idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos de una segunda secuencia a continuación de alinear las secuencias e introducir huecos, de ser necesario, para lograr el mayor porcentaje de homología. Procedimientos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica. Se entiende que la homología depende de un cálculo del porcentaje de identidad, pero puede diferir en valor debido a los huecos y las penalizaciones introducidas en el cálculo. Por "homólogos", tal como se aplica a secuencias de polipéptidos, se entiende la secuencia correspondiente de otra especie que tiene una identidad sustancial con una segunda secuencia de una segunda especie.
Se pretende que "análogos" incluya variantes polipeptídicas que difieran en una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o eliminaciones de residuos aminoácidos que aún conservan una o más de las propiedades del polipéptido original o inicial.
La presente divulgación proporciona varios tipos de composiciones basadas en polipéptidos, incluyendo variantes y derivados. Estos incluyen, por ejemplo, variantes y derivados de sustitución, inserción, deleción y covalentes. El término "derivado" se usa como sinónimo del término "variante", pero generalmente se refiere a una molécula que ha sido modificada y/o cambiada de cualquier manera en comparación con una molécula de referencia o molécula inicial.
Como tales, los polinucleótidos que codifican péptidos o polipéptidos que contienen sustituciones, inserciones y/o adiciones, deleciones y modificaciones covalentes con respecto a las secuencias de referencia, en particular las secuencias polipeptídicas descritas en esta invención se incluyen dentro del alcance de esta divulgación. Las "variantes de sustitución", cuando se refieren a polipéptido, son las que tienen eliminado al menos un residuo de aminoácidos en una secuencia natural o inicial y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser simples, donde solamente se sustituye una molécula de aminoácido, o pueden ser múltiples, donde se sustituyen dos o más aminoácidos en la misma molécula.
Tal como se usa en esta invención, la expresión “sustitución de aminoácido conservadora” se refiere a la sustitución de un aminoácido que está presente normalmente en la secuencia con un aminoácido diferente de tamaño, carga o polaridad similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina y leucina, por otro residuo no polar. De manera similar, ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. De manera adicional, la sustitución de un residuo básico, tal como lisina, arginina o histidina, por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido, son ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras. Ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina, por un residuo polar (hidrofílico), tal como, cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina, y/o un residuo polar por un residuo no polar.
"Características" cuando se refiere a polipéptido o polinucleótido se definen como componentes distintos basados en secuencias de aminoácidos o basados en nucleótidos de una molécula, respectivamente. Las características de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos incluyen manifestaciones superficiales, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "dominio" se refiere a un motivo de un polipéptido que tenga una o más características o propiedades funcionales o estructurales identificables (por ejemplo, capacidad de unión, servir como sitio para interacciones entre proteínas).
Tal como se usa en esta invención en referencia a polipéptidos, el término “sitio”, en lo referente a realizaciones basadas en aminoácidos, se usa como sinónimo de “residuo de aminoácidos” y “cadena lateral de aminoácidos”. Tal como se usa en esta invención en referencia a polinucleótidos, el término “sitio”, en lo que respecta a realizaciones a base de nucleótidos, se utiliza como sinónimo de “nucleótido”. Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido o polinucleótido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivatizarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptidos o polinucleótidos.
Tal como se usa en esta invención los términos "extremos" o "extremo", en referencia a polipéptidos, se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido, respectivamente. Dicha extremidad no se limita únicamente al sitio inicial o final del polipéptido o polinucleótido, sino que puede incluir aminoácidos o polinucleótidos adicionales en las regiones de los extremos. Las moléculas basadas en polipéptidos se pueden caracterizar por tener un extremo N (terminado por un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) y un extremo C (terminado por un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). En algunos casos, las proteínas están formadas por múltiples cadenas polipeptídicas unidas por enlaces disulfuro o por fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estas proteínas tienen múltiples extremos N y C. De manera alternativa, los extremos de los polipéptidos pueden modificarse de manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos, tal como un conjugado orgánico.
Como reconocerán los expertos en la técnica, los fragmentos de proteína, dominios de proteína funcional y proteínas homólogas, también se consideran dentro del alcance de los polipéptidos de interés. Por ejemplo, se proporciona en esta invención cualquier fragmento de proteína (que significa una secuencia de polipéptidos que en su longitud tiene un residuo de aminoácidos menos que una secuencia de polipéptidos de referencia, pero idéntica en los demás aspectos) de una proteína de referencia con una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mayor que 100 aminoácidos. En otro ejemplo, se puede utilizar de acuerdo con la descripción cualquier proteína que incluya una extensión de 20, 30, 40, 50 o 100 aminoácidos que sea 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o de aproximadamente 100 % idéntica a las secuencias descritas en la presente. En algunas realizaciones, un polipéptido incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones, según se muestra en cualquiera de las secuencias que se proporcionan o a las que se hace referencia en la presente.
Las moléculas de referencia (polipéptidos o polinucleótidos) pueden compartir una cierta identidad con las moléculas diseñadas (polipéptidos o polinucleótidos). Tal como se conoce en la técnica, el término "identidad" hace referencia a una relación entre las secuencias de dos o más péptidos, polipéptidos o polinucleótidos determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, la identidad también hace referencia al grado de relación entre secuencias según se determina por la cantidad de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos o nucleósidos. La identidad mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de espacios (si los hubiera) conforme a un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de los péptidos relacionados se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos. En general, las variantes de un polinucleótido o polipéptido particular tienen al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, pero menos de 100 % de identidad de secuencia con dicho polinucleótido o polipéptido de referencia particular, según se determina mediante parámetros y programas de alineación de secuencia descritos en esta invención y conocidos por los expertos en la técnica. Dichas herramientas para la alineación incluyen las de la suite BLAST (Stephen F. Altschul, y col. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402" Una técnica general de alineación global basada en la programación dinámica es el algoritmo de Needleman-Wunsch. Más recientemente, se ha desarrollado un algoritmo de alineación de secuencia global óptima rápida (FOGSAA) que supuestamente produce una alineación global de secuencias de nucleótidos y proteínas más rápidamente que con otros métodos de alineación global óptima, lo que incluye el algoritmo de Needleman-Wunsch. Otras herramientas se describen en esta invención, específicamente en la definición de "identidad" a continuación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “homología” se refiere al vínculo general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran «homólogas» entre sí si sus secuencias son al menos 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % idénticas o similares. El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos). Se considera que dos secuencias de polinucleótidos son homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos de aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso 99 % para al menos un tramo de al menos unos 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. Para secuencias de polinucleótidos de menos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. Dos secuencias de proteínas se consideran homólogas si las proteínas son idénticas al menos en un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en al menos un tramo de al menos 20 aminoácidos.
El término “ identidad” hace referencia a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótidos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias a efectos de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico para una alineación óptima, y se pueden ignorar las secuencias no idénticas a efectos de comparación). En determinadas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con fines comparativos es de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en dicha posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede obtener usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando procedimientos tales como los que se describen en el documento Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Ed., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Ed., M Stockton Press, Nueva York, 1991.
Por ejemplo, es posible determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, de manera alternativa, usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los procedimientos comúnmente empleados para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, entre otros, aquellos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Las técnicas para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles al público. El software informático ejemplar para determinar la homología entre dos secuencias incluye, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG, Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research, 12(1), 387(1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).
En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden además secuencias adicionales o dominios funcionales. Por ejemplo, los polipéptidos CHIKV de la presente divulgación pueden comprender una o más secuencias conectoras. En algunos casos, el CHIKV de la presente divulgación puede comprender una etiqueta polipeptídica, tal como una etiqueta de afinidad (proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta SBP, etiqueta Strep, AviTag, etiqueta Calmodulina); etiqueta de solubilización; etiqueta de cromatografía (etiqueta de aminoácido polianiónico, tal como etiqueta FLAG); etiqueta de epítopo (secuencias peptídicas cortas que se unen a anticuerpos de alta afinidad, tales como etiqueta V5, etiqueta Myc, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, etiqueta E, etiqueta S y etiqueta HA); etiqueta de fluorescencia (por ejemplo, GFP). En algunos casos, el CHIKV de la presente divulgación puede comprender una etiqueta de aminoácido, tal como una o más lisinas, histidinas o glutamatos, que se pueden agregar a las secuencias polipeptídicas (por ejemplo, en los extremos N-terminal o C-terminal). Pueden usarse lisinas para aumentar la solubilidad de péptidos o para permitir la biotinilación. Las etiquetas de proteínas y aminoácidos son secuencias peptídicas injertadas genéticamente en una proteína recombinante. Las etiquetas de secuencia se unen a proteínas para diversos fines, tales como la purificación, identificación o localización de péptidos, para su uso en diversas aplicaciones que incluyen, por ejemplo, purificación por afinidad, matriz de proteínas, transferencia Western, inmunofluorescencia e inmunoprecipitación. Dichas etiquetas se eliminan posteriormente mediante agentes químicos o por medios enzimáticos, como por ejemplo mediante proteólisis específica o empalme de inteínas.
De manera alternativa, los residuos de aminoácidos ubicados en las regiones de los extremos amino y carboxi de la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína pueden eliminarse de manera opcional para proporcionar secuencias truncadas. Determinados aminoácidos (por ejemplo, residuos del extremo C o extremo N) pueden eliminarse de manera alternativa, dependiendo del uso de la secuencia, como, por ejemplo, expresión de la secuencia como parte de una secuencia mayor que sea soluble, o que esté unida a un soporte sólido.
Vacunas Multiproteicas y Multicomponentes
La presente divulgación abarca vacunas CHIKV, vacunas DENV, vacunas ZIKV, vacunas CHIKV/DENV, vacunas CHIKV/ZIKV, vacunas ZIKV/DENV y vacunas CHIKV/DENV/ZIKV que comprenden uno o múltiples polinucleótidos de ARN (por ejemplo, ARNm), cada uno de los cuales codifica un polipéptido antigénico único, así como vacunas que comprenden un polinucleótido de ARN único que codifica más de un polipéptido antigénico (por ejemplo, como un polipéptido de fusión). Por lo tanto, se debe entender que una composición de vacuna que comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico de RSV y un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica un segundo polipéptido antigénico comprende (a) vacunas que comprenden un primer polinucleótido de ARN que codifica un primer polipéptido antigénico y un segundo polinucleótido de ARN que codifica un segundo polipéptido antigénico y (b) vacunas que comprenden un único polinucleótido de ARN que codifica un primer y un segundo polipéptido antigénico (por ejemplo, como un polipéptido de fusión). Las vacunas de ARN de la presente divulgación, en algunas realizaciones, comprenden de 2-10 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10), o más, polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto, cada uno de los cuales codifica un polipéptido antigénico diferente (o un único polinucleótido de ARN que codifica de 2-10, o más, polipéptidos antigénicos diferentes). En algunas realizaciones, una vacuna de a Rn comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cápside, un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de premembrana/membrana y un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cubierta. En algunas realizaciones, una vacuna de ARN comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cápside y un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de premembrana/membrana. En algunas realizaciones, una vacuna de ARN comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cápside y un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cubierta. En algunas realizaciones, una vacuna de ARN comprende un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de premembrana/membrana y un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la cubierta.
Péptidos señal
En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN codifica un polipéptido antigénico fusionado con un péptido señal (por ejemplo, SEQ ID NO: 125, 126, 128 o 131). El péptido señal puede fusionarse en el extremo N o el extremo C del polipéptido antigénico. En algunos casos, los polipéptidos antigénicos codificados por los ácidos nucleicos de CHIKv , DENV y/o ZIKV comprenden un péptido señal. Los péptidos señal que comprenden los 15-60 aminoácidos de extremo N de proteínas suelen ser necesarios para la translocación a través de la membrana en la vía de secreción y, por lo tanto, para controlar universalmente la entrada de la mayoría de las proteínas tanto en eucariotas y procariotas a la vía de secreción. En general, los péptidos señal incluyen tres regiones: una región de extremo N de longitud diferente que usualmente comprende aminoácidos con carga positiva, una región hidrofóbica y una región peptídica de extremo carboxi corta. En eucariotas, el péptido señal de una proteína precursora naciente (preproteína) dirige el ribosoma a la membrana del retículo endoplásmico rugoso (RE) e inicia el transporte de la cadena peptídica en crecimiento a través de ella. Sin embargo, el péptido señal no es responsable del destino final de la proteína madura. Las proteínas secretoras desprovistas de más etiquetas de dirección en su secuencia se secretan por defecto al entorno externo. Los péptidos señal se escinden de las proteínas precursoras mediante una peptidasa señal residente en el retículo endoplásmico (RE) o permanecen sin escindir y funcionan como un ancla de membrana. Durante los últimos años, ha evolucionado una visión más avanzada de los péptidos señal, lo que demuestra que las funciones y la inmunodominancia de ciertos péptidos señal son mucho más versátiles de lo previsto anteriormente.
Proteínas codificadas por el genoma ZIKV, por ejemplo, la proteína envoltura de ZIKV, contiene un péptido señal en el extremo N para facilitar el direccionamiento de la proteína al RE para su procesamiento. El procesamiento del RE produce una proteína de envoltura madura, donde se escinde el péptido señal, usualmente mediante una peptidasa señal de la célula hospedadora. Además, un péptido señal puede facilitar la selección de la proteína como diana para la membrana celular.
Las vacunas CHIKV, vacunas DENV, vacunas ZIKV, vacunas CHIKV/DENV, vacunas CHIKV/ZIKV, vacunas ZIKV/DENV y vacunas CHIKV/DENV/ZIKV de la presente divulgación pueden comprender, por ejemplo, polinucleótidos de ARN que codifican un péptido señal artificial, en el que la secuencia codificante del péptido señal está unida operativamente y está en fase con la secuencia codificante del polipéptido antigénico CHIKV, DENV y/o ZIKV. Así, las vacunas CHIKV, vacunas DENV, vacunas ZIKV, vacunas CHIKV/DENV, vacunas CHIKV/ZIKV, vacunas ZIKV/DENV, y vacunas CHIKV/DENV/ZIKV de la presente divulgación, en algunos casos, producen un polipéptido antigénico que comprende un polipéptido antigénico CHIKV, DENV y/o ZIKV fusionado con un péptido señal. En algunos casos, un péptido señal se fusiona con el extremo N del polipéptido antigénico CHIKV, DENV y/o ZIKV. En algunos casos, un péptido señal se fusiona con el extremo C del polipéptido antigénico CHiKv , DENV y/o ZIKV.
En algunas realizaciones, el péptido señal fusionado a un polipéptido antigénico es un péptido señal artificial. En algunas realizaciones, se obtiene un péptido señal artificial fusionado con un polipéptido antigénico codificado por una vacuna de ARN a partir de una proteína de inmunoglobulina, por ejemplo, un péptido señal de IgE o un péptido señal de IgG. En algunas realizaciones, un péptido señal fusionado con un polipéptido antigénico codificado por una vacuna de ARN es un péptido señal epsilon-1 de cadena pesada de Ig (IgE HC SP) que tiene la secuencia de: MDWTWILFLVAAATr Vh S (SEQ iD NO: 126). En algunas realizaciones, un péptido señal fusionado con un polipéptido antigénico ZIKV codificado por la vacuna de ARN ZIKV es un péptido señal IgGk cadena V-III región Ha H (IgGk SP) que tiene la secuencia de METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 125). En algunas realizaciones, un péptido señal fusionado con un polipéptido antigénico codificado por una vacuna de ARN tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 125, 126, 128 o 131. Los ejemplos divulgados en esta invención no pretenden ser limitantes y cualquier péptido señal que sea conocido en la técnica para facilitar la orientación de una proteína al ER para el procesamiento y/o la orientación de una proteína a la membrana celular puede usarse de acuerdo con la presente divulgación.
Un péptido señal puede tener una longitud de 15-60 aminoácidos. Por ejemplo, un péptido señal puede tener una longitud de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 aminoácidos. En algunas realizaciones, un péptido señal puede tener una extensión de 20-60, 25-60, 30-60, 35- 60, 40-60, 45- 60, 50­ 60, 55-60, 15-55, 20-55, 25-55, 30-55, 35-55, 40-55, 45-55, 50-55, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50, 15-45, 20-45, 25-45, 30-45, 35-45, 40-45, 15-40, 20-40, 25-40, 30-40, 35-40, 15-35, 20-35, 25-35, 30­ 35, 15-30, 20-30, 25-30, 15-25, 20-25 o 15-20 aminoácidos.
En la Tabla 31, SEQ ID NO: 48-59, se pueden encontrar ejemplos no limitativos de polipéptidos antigénicos fusionados con péptidos señal, que están codificados por una vacuna de ARN ZIKV de la presente divulgación.
Normalmente, un péptido señal se escinde del polipéptido naciente en la unión de escisión durante el procesamiento del e R, como se ilustra en la Fig. 26. El polipéptido antigénico de ZIKV maduro producido por una vacuna de ARN de ZIKV, por ejemplo, normalmente no comprende un péptido señal.
Modificaciones químicas
En algunos casos, las vacunas de ARN de la presente divulgación comprenden al menos un polinucleótido de ácido ribonucleico (ARN) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico CHIKV, DENV y/o ZIKV que comprende al menos una modificación química.
Los términos "modificación química" y "químicamente modificado" hacen referencia a la modificación respecto a ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos de adenosina (A), guanosina (G), uridina (U), timidina (T) o citidina (C) en al menos uno de su posición, patrón, porcentaje o población. En general, estos términos no se refieren a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de caperuza de ARNm extremo 5' de origen natural. Respecto a un polipéptido, el término "modificación" hace referencia a una modificación respecto al conjunto canónico de 20 aminoácidos. Los polinucleótidos de ARN, como se proporciona en el presente documento, también se consideran "modificados" si contienen sustituciones, inserciones o una combinación de sustituciones e inserciones de aminoácidos.
Los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARNm), en algunas realizaciones, comprenden diversas (más de una) modificaciones diferentes. En algunas realizaciones, una región particular de un polinucleótido contiene una, dos o más modificaciones (opcionalmente diferentes) de nucleósidos o nucleótidos. En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN modificado (es decir, un polinucleótido de ARNm modificado), introducido en una célula u organismo, muestra una degradación reducida en la célula u organismo, respectivamente, en relación con un polinucleótido no modificado. En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN modificado (es decir, un polinucleótido de ARNm modificado), introducido en una célula u organismo, puede exhibir inmunogenicidad reducida en la célula u organismo, respectivamente (por ejemplo, una respuesta innata reducida).
Las modificaciones de los polinucleótidos incluyen, sin limitación, las descritas en el presente documento. Los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARNm) pueden comprender modificaciones que ocurren de forma natural, que no ocurren de forma natural o el polinucleótido puede comprender una combinación de modificaciones que ocurren de forma natural y que no ocurren de forma natural. Los polinucleótidos pueden incluir cualquier modificación útil, por ejemplo, de un enlace internucleósido, un azúcar o una nucleobase (por ejemplo, a un fosfato enlazador, a un enlace fosfodiéster o a la estructura principal de fosfodiéster).
Los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARNm), en algunas realizaciones, comprenden nucleótidos modificados no naturales que se introducen durante la síntesis o possíntesis de los polinucleótidos para lograr las funciones o propiedades deseadas. Las modificaciones pueden estar en un enlace internucleótido, bases de purina o pirimidina o azúcares. La modificación se puede introducir con síntesis química o con una enzima polimerasa en el extremo de una cadena o en cualquier otro lugar de la cadena. Cualquiera de las regiones de un polinucleótido puede modificarse químicamente.
La presente divulgación proporciona nucleósidos y nucleótidos modificados de un polinucleótido (es decir, polinucleótidos de ARNm). Un "nucleósido" se refiere a un compuesto que contiene una molécula de azúcar (por ejemplo, una pentosa o una ribosa) o un derivado del mismo en combinación con una base orgánica (por ejemplo, una purina o pirimidina) o un derivado del mismo (también denominado en esta invención "nucleobase"). Un “nudeótido” hace referencia a un nucleósido, inclusive un grupo fosfato. Los nucleótidos modificados pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento útil, como, por ejemplo, química, enzimática o recombinantemente, para incluir uno o más nucleósidos modificados o no naturales. Los polinucleótidos pueden comprender una región o regiones de nucleósidos enlazados. Dichas regiones pueden tener enlaces de estructura principal variable. Los enlaces pueden ser enlaces fosfodiéster estándares, en cuyo caso los polinucleótidos comprenderían regiones de nucleótidos.
El emparejamiento de bases de nucleótidos modificados engloba no solo los pares de bases estándar de adenosina-timina, adenosina-uracilo o guanosina-citosina, sino también pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos modificados que comprenden bases no estándar o modificadas, en donde la disposición de los donantes de enlace de hidrógeno y aceptores de enlaces de hidrógeno permiten la formación de enlaces de hidrógeno entre una base no estándar y una base estándar o entre dos estructuras de base no estándar complementarias. Un ejemplo de dicho apareamiento de bases no estándar es el apareamiento de bases entre el nucleótido modificado inosina y adenina, citosina o uracilo. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador puede incorporarse a los polinucleótidos de la presente descripción.
El experto en la técnica apreciará que, salvo que se indique otra cosa, las secuencias de polinucleótidos mostradas en la presente solicitud indicarán "T" en una secuencia de ADN representativa, pero cuando la secuencia representa ARN, se debería sustituir las "T" con "U".
Las modificaciones de polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARNm) que son útiles en las vacunas de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina; 2-metiltio-N6-metiladenosina; 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina; N6-glicinilcarbamoiladenosina; N6-isopenteniladenosina; N6-metiladenosina; N6-treonilcarbamoiladenosina: 1,2'-O-dimetiladenosina; 1-metiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6 isopenteniladenosina; 2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); isopenteniladenosina; N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,2'O-dimetiladenosina; N6,N6,2'-O-trimetiladenosina; N6,N6-dimetiladenosina; N6-acetiladenosina; N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina; N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina; 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; 7-desaza-adenosina; N1-metil-adenosina; N6, N6(dimetil)adenina; N6-cis-hidroxi-isopentenil-adenosina; a-tio-adenosina; 2(amino)adenina; 2 (aminopropil) adenina; 2(metiltio) N6 (isopentenil)adenina; 2-(alquil)adenina; 2-(aminoalquil)adenina; 2-(aminopropil)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(propil)adenina; 2'-amino-2'-desoxi-ATP; 2'-azido-2'-desoxi-ATP; 2'-desoxi-2'-a-a minoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-a-azidoadenosina TP; 6 (alquil) adenina; 6 (metil) adenina; 6-(alquil)adenina; 6-(metil)adenina; 7(deaza)adenina; 8 (alquenil) adenina; 8(alquinil)adenina; 8(amino)adenina; 8(tioalquil)adenina; 8-(alquenil)adenina; 8-(alquil)adenina; 8-(alquinil)adenina; 8-(amino)adenina; 8-(halo)adenina; 8-(hidroxil)adenina; 8-(tioalquil)adenina; 8-(tiol)adenina; 8-azido-adenosina; aza adenina; deaza adenina; N6(metil)adenina; N6-(isopentil)adenina; 7-desaza-8-aza-adenosina; 7-metiladenina; 1-desazaadenosina TP; 2'Fluoro-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2'-OMe-2-Amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2'-a-etiniadenosina TP; 2-aminoadenina; 2-aminoadenosina TP; 2-Amino-ATP; 2'-a-trifluorometiladenosina TP; 2-azidoadenosina TP; 2'-b-etiniladenosina TP; 2-bromoadenosina TP; 2'-btrifluorometiladenosina TP; 2-cloroadenosina TP; 2'-desoxi-2',2'-difluoroadenosina TP; 2'-desoxi-2'-amercaptoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-a-tiometoxiadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-aminoa denosina TP; 2'-desoxi-2'-b-azidoadenoseno TP; 2'-desoxi-2'-b-bromoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-cloroadenosina TP; 2'-desoxi-2'-bfluoroadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-yodoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-mercaptoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-btiometoxiadenosina TP; 2-fluoroadenosina TP; 2-yodoadenosina TP; 2-mercaptoadenosina TP; 2-metoxiadenina; 2-metiltio-adenina; 2-trifluorometiladenosina TP; 3-Deaza-3-bromoadenosina TP; 3-Desaza-3-cloroadenosina TP; 3-Desaza-3-fluoroadenosina TP; 3-Desaza-3-yodoadenosina TP; 3-desazaadenosina TP; 4'azidoadenosina TP; TP de adenosina 4'-carbocíclica; 4'-etiniladenosina TP; 5'Homo-adenosina TP; 8-AzaATP; 8-bromo-adenosina TP; 8-trifluorometiladenosina TP; 9-desazaadenosina TP; 2-aminopurina; 7-desaza-2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-2-aminopurina; 2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina; 2-tiocitidina; 3-metilcitidina; 5-formilcitidina; 5-hidroximetilcitidina; 5-metilcitidina; N4-acetilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 5,2'-O-dimetilcitidina; 5-formil-2'-O-metilcitidina; lisidina; N4,2'-O-dimetilcitidina; N4-acetil-2'-O-metilcitidina; N4-metilcitidina; N4,N4-dimetil-2'-OMe-citidina TP; 4-metilcitidina; 5-aza-citidina; pseudo-iso-citidina; pirrolo-citidina; a-tio-citidina; 2-(tio)citosina; 2'-amino-2'-desoxi-CTP; 2'-azido-2'-desoxi-CTP; 2'-desoxi-2'-a-aminocitidina TP; 2'-desoxi-2'-aazidocitidina TP; 3 (deaza) 5 (aza)citosina; 3(metil)citosina; 3-(alquil)citosina; 3-(deaza) 5 (aza)citosina; 3-(metil)citidina; 4,2'-O-dimetilcitidina; 5(halo)citosina; 5(metil)citosina; 5(propinil)citosina; 5 (trifluorometil) citosina; 5-(alquil)citosina; 5-(alquinil)citosina; 5-(halo)citosina; 5-(propinil)citosina; 5-(trifluorometil)citosina; 5-bromo-citidina; 5-yodo-citidina; 5-propinil citosina; 6-(azo)citosina; 6-aza-citidina; aza citosina; deaza citosina; N4 (acetil)citosina; 1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina; 1-metil-pseudoisocitidina; 2-metoxi-5-metil-citidina; 2-metoxi-citidina; 2-tio-5-metil-citidina; 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina; 4-metoxi-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina; 4-tio-pseudoisocitidina; 5-aza-zebularina; 5-metil-zebularina; pirrolo-pseudoisocitidina; cebularina; (E)-5-(2-Bromo-vinil)citidina TP; hidrocloruro de 2,2'-anhidro-citidina TP; 2'Fluor-N4-Bz-citidina TP; 2'Fluoro-N4-Acetil-citidina TP; 2'-O-Metil-N4-Acetil-citidina TP; 2'O-metil-N4-Bz-citidina TP; 2'-a-Etinilcitidina TP; 2'-a-trifluorometilcitidina TP; 2'-b-etinilcitidina TP; 2'-btrifluorometilcitidina TP; 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina TP; 2'-desoxi-2'-a-mercaptocitidina TP; 2'-desoxi-2'-atiometoxicitidina TP; TP de 2'-desoxi-2'-b-aminocitidina; 2'-desoxi-2'-b-azidocitidina TP; 2'-desoxi-2'-bbromocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-clorocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-fluorocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-yodocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-mercaptocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-tiometoxicitidina TP; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)citidina TP; 3'-Etinilcitidina TP; 4'-azidocitidina TP; citidina 4'-carbocíclica TP; 4'-Etinilcitidina TP; 5-(1-Propinil)ara-citidina TP; 5-(2-cloro-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-(4-aminofenil)-2-tiocitidina TP; 5-aminoalil-CTP; 5-cianocitidina TP; 5-etinilara-citidina TP; 5-Etinilcitidina TP; TP de 5'-homocitidina; 5-metoxicitidina TP; 5-trifluorometil-citidina TP; N4-Amino-citidina TP; N4-benzoil-citidina TP; pseudoisocitidina; 7-metilguanosina; N2,2'-O-dimetilguanosina; N2-metilguanosina; Wyosine; 1,2-O-dimetilguanosina; 1-metilguanosina; 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 2'-O-metilguanosina; 2'O-ribosilguanosina (fosfato); 7-aminometil-7-desazaguanosina; 7-ciano-7-desazaguanosina; arqueosina; metilwyosina; N2,7-dimetilguanosina; N2,N2,2'-O-trimetilguanosina; N2,N2,7-trimetilguanosina; N2,N2-dimetilguanosina; N2,7,2'-O-trimetilguanosina; 6-tioguanosina; 7-deaza-guanosina; 8-oxo-guanosina; N1-metil-guanosina; a-tio-guanosina; 2(propil)guanina; 2-(alquil)guanina; 2'-amino-2'-desoxi-GTP; 2'-azido-2'-desoxi-GTP; 2'-desoxi-2'-a-aminoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-a-azidoguanosina TP; 6(metil)guanina; 6-(alquil)guanina; 6-(metil)guanina; 6-metil-guanosina; 7(alquil)guanina; 7 (deaza)guanina; 7(metil)guanina; 7-(alquil)guanina; 7-(deaza)guanina; 7-(metil)guanina; 8 (alquil)guanina; 8(alquinil)guanina; 8 (halo)guanina; 8(tioalquil)guanina; 8-(alquenil)guanina; 8-(alquil)guanina; 8-(alquinil)guanina; 8-(amino)guanina; 8-(halo)guanina; 8-(hidroxil)guanina; 8-(tioalquil)guanina; 8-(tiol)guanina; aza guanina; deaza guanina; N (metil) guanina; N-(metil)guanina; 1-metil-6-tio-guanosina; 6-metoxi-guanosina; 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina; 6-tio-7-deaza-guanosina; 6-tio-7-metil-guanosina; 7-deaza-8-aza-guanosina; 7-metil-8-oxo-guanosina; N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina; N2-metil-6-tio-guanosina; 1-Me-GTP; 2'Fluoro-N2-isobutil-guanosina TP; 2'O-metil-N2-isobutil-guanosina; TP; 2'-a-Etinilguanosina TP; 2'-a-Tnfluorometilguanosina TP; 2'-b-Etinilguanosina TP; 2'-b-trifluorometilguanosina TP; 2'-desoxi-2',2'-difluoroguanosina TP; 2'-desoxi-2'-a-mercaptoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-a-tiometoxiguanosina TP; 2'-desoxi-2'-b-aminoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-b-azidoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-b-bromoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-bcloroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluoroguano seno TP; 2'-desoxi-2'-b-yodoguano seno TP; 2'-desoxi-2'-bmercaptoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-b-tiometoxiguanosina TP; 4'-azidoguanosina TP; guanosina 4'-carbocíclica TP; 4'-Etinilguanosina TP; 5'-Homo-guanosina TP; 8-bromo-guanosina TP; 9-desazaguanosina TP; N2-isobutil-guanosina TP; 1-metilinosina; inosina; 1,2'-O-dimetilinosina; 2'-O-metilinosina; 7-metilinosina; 2'-O-metilinosina; epoxiqueuosina; galactosil-queuosina; manosilqueuosina; queuosina; alilamino-timidina; aza timidina; deaza timidina; desoxitimidina; 2'-O-metiluridina; 2-tiouridina; 3-metiluridina; 5-catoximetiluridina; 5-hidroxiuridina; 5-metiluridina; 5-taufinometil-2-tiouridina; 5-taurinometiluridina; dihidrouridina; pseudouridina; (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 1-metil-3-(3-amino-5-carboxipropil)pseudouridina; 1-metilpsduouridina; 1-metil-pseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2'-O-metilpseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2-tio-2'-O-metiluridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 3,2'-O-dimetiluridina; 3-metil-pseudo-uridina TP; 4-tiouridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina; éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)uridina; 5,2'-O-dimetiluridina; 5,6-dihidrouridina; 5-aminometil-2-tiouridina; 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina; 5-carbamoilmetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina; éster metílico de 5-carboxihidroximetiluridina; 5-carboximetilaminometil-2'-O-metiluridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carbamoilmetiluridina TP; 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metoxiuridina; 5-metiluridina;5-metil-2-tiouridina; 5-metilaminometil-2-selenouridina; 5-metilaminometil-2-tiouridina; 5-metilaminometiluridina; 5-metildihidrouridina; ácido 5-oxiacético-uridina TP; Ácido 5-oxiacéticoéster metílico-uridina TP; N1-metil-pseudouridina; ácido uridina 5-oxiacético; éster metílico del ácido 5-oxiacético de uridina; 3-(3-Amio-3-carboxipropil)-Uridina TP; 5-(iso-pentenilaminometil)-2-tiouridina TP; 5-(isopentenilaminometil)-2'O-metiluridina TP; 5-(iso-pentenilaminometil)uridina TP; 5-propinil uracilo; a-tio-uridina; 1 (aminoalquilamino-carboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-4 (tio) pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-4 (tio) pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 12(tio)-pseudouracilo sustituido; 12,4-(ditio)pseudouracilo sustituido; 1 4-(tio)pseudouracilo sustituido; 1 pseudouracilo sustituido; 1-(aminoalquilamino-carboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracilo; 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina TP; 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-metil-pseudo-UTP; 2 (tio) pseudouracilo; 2' desoxiuridina; 2' fluorouridina; 2-(tio(uracilo; 2,4-(dtio)pseudouracilo; 2'metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluoro-guanosina; 2'-Amino-2'-desoxi-UTP; 2'-Azido -2'-desoxi-UTP; 2'-azido-desoxiuridina TP; 2'-O-metilpseudouridina; 2'desoxiuridina; 2'fluorouridina; 2'-desoxi-2'-a-amifiouridina TP; 2'-desoxi- 2'-a-azidouridina TP; 2-metilpseudouridina; 3(3amino-3 carboxipropil)uracilo; 4(tio)pseudouracilo; 4-(tio)pseudouracilo; 4-(tio)uracilo; 4-tiouracilo; 5 (1,3 -diazol-1-alquil)uracilo, 5(2-aminopropil)uracilo, 5(aminoalquil)uracilo, 5(dimetilaminoalquil)uracilo; 5 (guanidinioalquil)uracilo; 5(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5 (metoxicarbonil-metil)uracilo; 5 (metil) 2 (tio) uracilo; 5 (metil) 2,4 (ditio) uracilo; 5 (metil) 4 (tio) uracilo; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio(uracilo; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracilo; 5 (propinil)uracilo; 5 (trifluorometil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5-(alquilo) -2-(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(alquil)-4(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)pseudouracilo; 5-(alquil)uracilo; 5- (alquinil)uracilo; 5-(alilamino)uracilo; 5-(cianoalquil)uracilo; 5-(dialquilaminoalquil)uracilo; 5-(dimetilaminoalquil)uracilo; 5-(guanidinioalquil)uracilo; 5-(halo)uracilo; 5-(1,3-diazol-1-alquil)uracilo, 5-(metoxi)uracilo, 5-(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonil-metil)uracilo; 5-(metil) 2(tio)uracilo; 5-(metil) 2,4(ditio)uracilo; 5-(metil) 4(tio)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(metil)-4(tio)pseudouracilo; 5-(metil)pseudouracilo; 5-(metilaminometil)-2(tio)uracilo; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracilo; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracilo; 5-(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-aminoalil-uridina; 5-bromo-uridina; 5-yodo-uridina; 5-uracilo; 6(azo)uracilo; 6-(azo)uracilo; 6-aza-uridina; alilamino-uracilo; aza uracilo; deaza uracilo; N3 (metil)uracilo; ácido pseudo-UTP-1-2-etanoico; pseudouracilo; 4-tio-pseudo-UTP; 1-carboximetil-pseudouridina; 1-metil-1-desazapseudouridina; 1-propinil-uridina; 1-taurinometil-1-metil-uridina; 1-taurinometil-4-tio-uridina; 1-taurinometilpseudouridina; 2-metoxi-4-tio-pseudouridina; 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina; 2-tio-1-metilpseudouridina; 2-tio-5-aza-uridina; 2-tio-dihidropseudouridina; 2-tio-dihidrouridina; 2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-pseudouridina; 4-tio-1-metil-pseudouridina; 4-tio-pseudouridina; 5-azauridina; dihidropseudouridina; (±)1-(2-hidroxipropil)pseudouridina TP; (2R)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2S)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; 1-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)pseudouridina TP; 1-(2,2-Dietoxietil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-trimetilbencil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-trimetil-bencil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-trimetil-fenil)pseudo-UTP; 1-(2-Amino-2-carboxietil)pseudo-UTP; 1-(2-aminoetil)pseudo-UTP; 1-(2-hidroxietil)pseudouridina TP; 1-(2-Metoxietil)pseudouridina TP; 1-(3,4-bis-trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Dimetoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3-Amino-3-carboxipropil)pseudo-UT P; 1-(3-Amino-propil)pseudo-UTP; 1-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)pseuduridina TP; 1-(4-amino-4-carboxibutil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-butil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-azidobencil)pseudouridina TP; 1-(4-bromobencil)pseudouridina TP; 1-(4-clorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-fluorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-yodobencil)pseudouridina TP; 1-(4-metanosulfonilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-metoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-metoxi-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-metoxi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-metilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metil-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-nitrobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Nitro-bencil)pseudo-UTP; 1 (4-nitrofenil)pseudo-UTP; 1-(4-tiometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-trifluorometilbencil)pseudouridina TP; 1-(5-Amino-pentil)pseudo-UTP; 1-(6-Amino-hexil)pseudo-UTP; 1,6-Dimetil-pseudo-UTP; 1-[3-(2-2-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionil]pseudouridina TP; 1-{3-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-propionil}pseudouridina TP; 1-acetilpseudouridina TP; 1-alquil-6-(1-propinil)-pseudo-UTP; 1-alquil-6-(2-propinil)-pseudo-UTP; 1-alquilo-6-alilo-pseudo-UTP; 1 -alquil-6-etinil-pseudo-UTP; 1 -alquil-6-homoalil-pseudo-UTP; 1-alquil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-alilpseudouridina TP; 1-aminometil-pseudo-UTP; 1-benzoilpseudouridina TP; 1-benciloximetilpseudouridina TP; 1-bencil-pseudo-UTP; 1-biotinil-PEG2-pseudouridina TP; 1-biotinilpseudouridina TP; 1-butil-pseudo-UTP; 1-cianometilpseudouridina TP; 1-ciclobutilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclobutil-pseudo-UTP; 1-cicloheptilmetil-pseudo-UTP; 1-cicloheptil-pseudo-UTP; 1-ciclohexilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclohexil-pseudo-UTP; 1-ciclooctilmetil-pseudo-UTP; 1 -ciclooctilopseudo-UTP; 1-ciclopentilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclopentil-pseudo-UTP; 1-ciclopropilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclopropil-pseudo-UTP; 1-etil-pseudo-UTP; 1-hexil-pseudo-UTP; 1-Homoalilpseudouridina TP; 1-hidroximetilpseudouridina TP; 1-iso-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4-tio-pseudo-UTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-UTP; 1-metanosulfonilmetilpseudouridina TP; 1-metoximetilpseudouridina TP; 1-metil-6-(2,2,2-trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(fenil sustituido)pseudo-UTP; 1-metil-6-amino-pseudo-UTP; 1-metil-6-azido-pseudo-UTP; 1-metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-cloro-pseudo-UTP; 1-metil-6-ciano-pseudo-UTP; 1-metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-etoxi-pseudo-UTP; pseudo-UTP de 1-metil-6-etilcarboxilato; 1-metil-6-etil-pseudo-UTP; 1-metil-6-fluoro-pseudo-UTP; 1-metil-6-formil-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroxiaminopseudo-UTP; 1-metil-6-hidroxi-pseudo-UTP; 1-metil-6-yodo-pseudo-UTP; 1-metil-6-iso-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-metoxi-pseudo-UTP; 1-metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-fenil-pseudo-UTP; 1 -metil-6-propilpseudo-UTP; 1-metil-6-teft-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-tritluorometoxi-pseudo-UTP; 1 -metil-6-trifluorometilpseudo-UTP; 1-morfolinometilpseudouridina TP; 1-Pentil-pseudo-UTP; 1-fenil-pseudo-UTP; 1-pivaloilpseudouridina TP; 1-propargilpseudouridina TP; 1-propil-pseudo-UTP; 1-propinil-pseudouridina; 1-ptolil-pseudo-UTP; 1-terc-butil-pseudo-UTP; 1-tiometoximetilpseudouridina TP; 1tiomorfolinometiipseudouridina TP; 1-trifluoroacetilpseudouridina TP; 1-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-vinilpseudouridina TP; 2,2'-anhidro-uridina TP; 2'-bromo-desoxiuridina TP; 2'-F-5-Metil-2'-desoxi-UTP; 2'-OMe-5-Me-UTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-Etiniluridina TP; 2'a-triluorometiluridina TP; 2'b-Etiniluridina TP; 2'btriluorometiluridina TP; 2'-desoxi-2',2'-difluorouridina TP; 2'-desoxi-2'-a-mercaptouridina TP; 2'-desoxi-2'-atiometoxiuridina TP; 2'-desoxi-2'-b-aminouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-azidouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-bromouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-clorouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-fluorouridinaTP; 2'-desoxi-2'-b-yodoruridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-tiometoxiuridina TP; 2-metoxi-4-tio-uridina; 2-metoxiuridina; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)uridina TP; 3-alquilo-pseudo-UTP; 4'Azidouridina TP; TP de uridina 4'-catocíclica; 4'Etiniluridina TP; 5- (1-Propinil)ara-uridina TP; 5-(2-furanil)uridina TP; 5-cianouridina TP; 5-dimetilaminouridina TP; 5'-Homouridina TP; 5-yodo-2'-fluoro-desoxiuridina TP; 5-feniletiniluridina TP; 5-trideuterometil-6-deuterouridina TP; 5-trifluorometil-uridina TP; 5-vinilarauridina TP; 6-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 6- (4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 6-(fenilo sustituido)-pseudo-UTP; 6-amino-pseu do-UTP; 6-azido-pseudo-UTP; 6-bromo-pseudo-UTP; 6-butil-pseudo-UTP; 6-cloro-pseudo-UTP; 6-ciano-pseudo-UTP; 6-dimetilaminopseudo-UTP; 6-etoxi-pseudo-UTP; 6-etilcarboxilato-pseudo-UTP; 6-etil-pseudo-UTP; 6-fluoro-pseudo-UTP; 6-formil-pseudo-UTP; 6-hidroxiamino-pseudo-UTP; 6-Hidroxi-pseudo-UTP; 6-lodo-pseudo-UT P; 6-iso-propilpseudo-UTP; 6-metoxi-pseudo-UTP; 6-metilamino-pseudo-UTP; 6-metil-pseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-propil-pseudo-UTP; 6-terc-butil-pseudo-UTP; 6-trifluorometoxi-pseudo-UTP; 6-trifluorometil-pseudo-UTP; alfa-tio-pseudo-UTP; Pseudouridina 1-(ácido 4-metilbencenosulfónico) TP; pseudouridina 1-(ácido 4-metilbenzoico) TP; pseudouridina TP 1-[3-(2-etoxi)]ácido propiónico; pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etoxi)-etoxi}]ácido propiónico; pseudouridina Tp 1-[3-[2-(2-[2-[2(2-etoxi)-etoxi}-etoxi]-etoxi)-etoxi}]ácido propiónico; pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-[2-etoxi]-etoxi)-etoxi}]ácido propiónico; pseudouridina Tp 1-[3-{2-(2-etoxi)-etoxi}] ácido propiónico; ácido pseudouridina TP 1-metilfosfónico; éster dietílico del ácido 1-metilfosfónico de pseudouridina TP; ácido pseudo-UTP-N1-3-propiónico; ácido pseudo-UTP-N1-4-butanoico; ácido pseudo-UTP-N1-5-pentanoico; ácido pseudo-UTP-N1-6-hexanoico; ácido pseudo-UTP-N1-7-heptanoico; ácido pseudo-UTP-N1-metil-p-benzoico; ácido pseudo-UTP-N1-p-benzoico; Wybutosina; hidroxiwybutosina; isoyosina; peroxiwybutosina; hidroxiwybutosina submodificada; 4-desmetilwyosina; 2,6(diamino)purina;1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-il: 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazina-1-il;1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-il;1,3,5-(triaza)-2,6-(dioxa)-naftaleno;2 (amino)purina; 2,4,5-(trimetil)fenilo; 2'metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluorocitidina;2' metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluoroadenina;2'metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluorouridina;2'-amino-2'-desoxirribosa; 2-amino-6-cloro-purina; 2-aza-inosinilo; 2'-azido-2'-desoxirribosa; 2'fluoro-2'-desoxirribosa; bases modificadas con 2'-fluoro; 2'-O-metil-ribosa; 2-oxo-7-aminopiridopirimidin-3-ilo; 2-oxo-piridopirimidin-3-ilo; 2-piridinona; 3 nitropirrol; 3-(metil)-7-(propinil)isocarboestirililo; 3-(metil)isocarboestirililo; 4-(fluoro)-6-(metil)bencimidazol; 4-(metil)bencimidazol; 4-(metil)indolilo; 4,6-(dimetil)indolilo; 5 nitroindol; 5 pirimidinas sustituidas; 5-(metil)isocarboestirililo; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidina; 6- (azo)timina; 6-(metil)-7-(aza)indolilo; 6-cloro-purina; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aza)indolilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazinl-ilo; 7-(guanidinioaikyihidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquil-hidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(propinil)isocarboestirililo; 7-(propinil)isocarboestirilo, propinil-7-(aza)indolilo; 7- desaza-inosinilo; 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo 7-sustituido; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 9-(metil)-imidizopiridinilo; aminoindolilo; antracenilo; bis-orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo bis-orto-sustituido; difluorotolilo; hipoxantina; imidizopiridinilo; inosinilo; isocarboestirilo; isoguanisina; purinas sustituidas en N2; N6-metil-2-amino-purina; purinas sustituidas en N6; derivado N-alquilado; naftalenilo; nitrobencimidazolilo; nitroimidazolilo; nitroindazolilo; nitropirazolilo; nubularina; purinas sustituidas en O6; derivado O-alquilado; orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2- on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo orto-sustituido; Oxoformicina TP; para-(aminoalquilhidroxi)-6-fenilpirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo para-sustituido; pentacenilo; fenantracenilo; Fenilo; propinil-7-(aza)indolilo; pirenilo; piridopirimidin-3-ilo; piridopirimidin-3-ilo, 2-oxo-7-amino-piridopirimidin-3- ilo; pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; pirrolopirimidinilo; pirrolopirizinilo; estilbencilo; 1,2,4-triazoles sustituidos; tetracenilo; tubercidina; xantina; xantosina-5'-TP; 2-tio-zebularina; 5-aza-2-tio-zebularina; 7-deaza-2-aminopurina; ribonucleósido de piridin-4-ona; 2-Amino-ribosido-TP; formicina A TP; Formicina B TP; pirrolosina TP; 2'OH-ara-adenosina TP; 2'-OH-afa-citidifie TP; 2'OH-ara-uridina TP; 2'OH-ara-guanosina TP; 5-(2-carbometoxivinil)uridina TP; y N6-(19-Amino-pentaoxanonadecil)adenosina TP.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, las bases nitrogenadas modificadas en el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) se seleccionan del grupo que consiste en pseudouridina (y), Nl-metilpseudouridina (m1 y), 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4 -metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metilpseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina, 5-metiluridina y 2'-O-metil uridina. En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, las bases nitrogenadas modificadas en el polinucleótido de ARNm se seleccionan del grupo que consiste en 1-metil-pseudouridina (m lY), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (y ), a -tio-guanosina y a-tio-adenosina. En algunas realizaciones, el polinucleotido incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (por ejemplo, polinucleótido de ARNm) comprende pseudouridina (Y) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) comprende 1-metil-pseudouridina (m lY). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) comprende 1-metil-pseudouridina (m lY) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) comprende 2-tiouridina (s2U). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) comprende 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) comprende metoxiuridina (mo5U). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) comprende 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden 2'-O-metiluridina. En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) comprende 2'-O-metiluridina y 5-metilcitidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) comprende N6-metil-adenosina (m6A). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende N6-metiladenosina (m6A) y 5-metil-citidina (m5C).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, el polinucleótido de ARNm) se modifica uniformemente (por ejemplo, se modifica completamente, se modifica en toda la secuencia) para una modificación particular. Por ejemplo, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido con 5-metil-citidina (m5C), lo que significa que se reemplazan todos los residuos citosina en la secuencia de ARNm con 5-metil-citidina (m5C). De manera similar, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido para cualquier tipo de residuo nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un residuo modificado tal como cualquiera de los establecidos anteriormente.
En algunas realizaciones, la nucleobase es una citosina modificada. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (ac4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (por ejemplo, 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2-tiocitidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una uridina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una uridina modificada incluyen 5-ciano uridina o 4'-tio uridina.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una adenina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una adenina modificada incluyen 7-deaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A) y 2,6-Diaminopurina.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metilinosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-deaza-guanosina, 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQ0), 7-aminometil-7-deazaguanosina (preQ1), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, o 7-metil-8-oxoguanosina.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es un uracilo modificado. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen un uracilo modificado incluyen pseudouridina (y ), ribonucleósido de piridin-4-ona, 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (s2U), 4-tio-uridina (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tiopseudouridina, 5-hidroxiuridina (ho5U), 5-aminoallil-uridina, 5-halo-uridina (p.ej., 5-yodo-uridina o 5-bromouridina), 3-metiluridina (m3U), 5-metoxi-uridina (mo5U), uridina ácido 5-oxiacético (cmo5U), uridina ácido 5-oxiacético metil éster (mcmo5U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), 5-carboxihidroximetil-uridina metil éster (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetiluridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tio-uridina (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-selenouridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 5-metil-uridina (m5U, i.e., teniendo la nucleobase deoxitimina), 1-metil-pseudouridina (m1Y), 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4Y), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metilpseudouridina (m3Y), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tiodihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3^ ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uridina (inm5s2U), a-tio-uridina, 2'-O-metil-uridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (^m), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um), y 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1-tiouridina, deoxitimidina, 2'-F-ara-uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil) uridina, y 5-[3-(1-E-propenilamino)]uridina.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una citosina modificada incluyen 5-aza-citidina, 6-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metilcitidina (m3C), N4-acetil-citidina (ac4C), 5-formil-citidina (f®C), N4-metil-citidina (m4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p.ej., 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1 -metilpseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metilcitidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina, lisidina (k2C), a-tio-citidina, 2'-O-metilcitidina (Cm), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidina (f®Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1 -tio-citidina, 2'-F-ara-citidina, 2'-F-citidina, y 2'-OH-ara-citidina.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una adenina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una adenina modificada incluyen 2-amino-purina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-halopurina (por ejemplo, 2-amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (por ejemplo, 6-cloro-purina), 2-amino-6-metilpurina, 8-azido-adenosina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-amino-purina, 7-deaza-8-aza-2-amino-purina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenosina (ms2m6A), N6-isopenteniladenosina (i6A), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenosina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (io6A), 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoil-adenosina (g6A), N6-treonilcarbamoil-adenosina (t6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenosina (m6t6A), 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenosina (ms2g6A), N6,N6-dimetil-adenosina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (ms2hn6A), N6-acetil-adenosina (ac6A), 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, a-tio-adenosina, 2'-O-metil-adenosma (Am), N6,2'-O-dimetiladenosina (m6Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2'-O-dimetil-adenosina (m1Am), 2'-O-ribosiladenosina (fosfato) (Ar(p)), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenosina, 8-azido-adenosina, 2'-F-araadenosina, 2'-F-adenosina, 2'-Oh-ara-adenosina y N6-(19-amino-pentaoxanonadecil)-adenosina.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una guanina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1l), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4-demetil-wiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (o2yW), hidroxiwibutosina (OHyW), hidroxiwibutosina submodificada (OHyW*), 7-deaza-guanosina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosil-queuosina (galQ), mannosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-deazaguanosina (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanosina (preQ1), arcaeosina (G+), 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deaza-guanosina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina, 7-metilguanosina (m7G), 6-tio-7-metilguanosina, 7-metil-inosine, 6-metoxi-guanosina, 1-metilguanosina (m1G), N2-metil-guanosina (m2G), N2,N2-dimetil-guanosina (m22G), N2,7-dimetil-guanosina (m27G), N2, N2,7-dimetil-guanosina (m2,2,7G), 8-oxoguanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tioguanosina, a-tio-guanosina, 2'-O-metil-guanosina (Gm), N2-metil-2'-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m22Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m2,7Gm), 2'-O-metil-inosina (lm), 1,2'-O-dimetil-inosina (m1lm), 2'-O-ribosilguanosina (fosfato) (Gr(p)), 1-tioguanosina, O6-metil-guanosina, 2'-F-ara-guanosina, y 2'-F-guanosina.
Métodos de tratamiento
La divulgación proporciona composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), métodos, kits y reactivos para la prevención y/o tratamiento de CHiKv, DeNV, ZIKV, CHIKV/DENV (la combinación de CHIkV y DENV, CHIKV/ZIKV (la combinación de CHIKV y ZIKV), ZIKV y DENV (la combinación de ZIKV y DENV), y CHIKV/DENV/ZIKV (la combinación de CHIKV, DENV y ZIKV) en humanos y otros mamíferos. Vacunas de ARN de CHIKV (por ejemplo, ARNm), vacunas de ARN de DENV (por ejemplo, ARNm), vacunas de ARN de ZIKV (por ejemplo, ARNm), vacunas de ARN de CHIKV/DENV (por ejemplo, ARNm), vacunas de ARN de CHIKV/ZIKV (por ejemplo, ARNm), vacunas de ARN de ZIKV/DENV (por ejemplo, ARNm), y vacunas de ARN de CHIKV/DENV/ZIKV (por ejemplo, ARNm) se pueden utilizar como agentes terapéuticos o profilácticos. Pueden usarse en medicina para prevenir y/o tratar enfermedades infecciosas. En aspectos ejemplares, las vacunas de la presente divulgación se usan para proporcionar protección profiláctica contra CHiKv, DENV, ZIKV o cualquier combinación de dos o tres de los virus anteriores. La protección profiláctica contra CHIKV, DENV y/o ZIKV se puede lograr después de la administración de una vacuna contra CHIKV, DENV y/o ZIKV o una vacuna combinada, de la presente divulgación. Las vacunas (incluyendo las vacunas combinadas) se pueden administrar una, dos, tres, cuatro o más veces, pero es probable que sea suficiente administrar la vacuna una vez (opcionalmente seguida de un solo refuerzo). Es posible, aunque menos deseable, administrar la vacuna a un individuo infectado para lograr una respuesta terapéutica. Es posible que sea necesario ajustar la dosificación en consecuencia.
Vacunas de amplio espectro
Se prevé que puede haber situaciones en las que las personas estén en riesgo de infección con más de una cepa de CHIKV, DENV y/o ZIKV (por ejemplo, más de una cepa de CHIKV, más de una cepa de DENV, y/o más de una cepa de ZIKV). Las vacunas terapéuticas de ARN (por ejemplo, ARNm) son particularmente adecuadas para enfoques de vacunación en conjunto debido a una cantidad de factores que incluyen, de modo no taxativo, velocidad de producción, capacidad para modificar rápidamente las vacunas para que se adapten a amenazas geográficas percibidas. Asimismo, debido a que las vacunas utilizan el cuerpo humano para producir la proteína antigénica, son responsables por la producción de proteínas antigénicas más complejas y más largas, lo que hace posible el pliegue adecuado, expresión superficial, presentación de antígenos, etc., en el sujeto humano. Para proteger contra más de una cepa de CHIKV, DENV y/o ZIKV, se puede administrar una vacuna (incluyendo una vacuna combinada) que incluya ARN que codifique al menos una proteína polipeptídica antigénica (o una porción antigénica de la misma) de un primer CHIKV, DENV y /o ZIKV e incluye además ARN que codifica al menos una proteína polipeptídica antigénica (o una porción antigénica de la misma) de un segundo CHIKV, DENV y/o ZIKV. Por ejemplo, se pueden formular ARN en conjunto en una única nanopartícula lipídica (LNP, por sus siglas en inglés) o en LNP separadas destinadas a coadministración.
En aspectos de la divulgación se proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra CHIKV, DENV y/o ZIKV. El método consiste en administrar al sujeto una vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV que comprende al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico de CHIKV, DENV y/o ZIKV o un fragmento inmunogénico del mismo, induciendo así en el sujeto una respuesta inmune específica al polipéptido antigénico CHIKV, DENV y/o ZIKV o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en el sujeto aumenta después de la vacunación en relación con el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con un dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o ZIKV. Un "anticuerpo de polipéptido anti-antigénico" es un anticuerpo en suero que se une específicamente al polipéptido antigénico.
Una dosis profilácticamente efectiva es una dosis terapéuticamente efectiva que impide la infección por el virus a un nivel clínicamente aceptable. En algunos casos, la dosis terapéuticamente eficaz es una dosis que figura en el prospecto de la vacuna. Una vacuna tradicional, como se usa en el presente documento, se refiere a una vacuna distinta de las vacunas de ARNm de la divulgación. Por ejemplo, una vacuna tradicional incluye, de modo no taxativo, vacunas de microorganismos vivos, vacunas de microorganismos muertos, vacunas de subunidades, vacunas de antígenos proteicos, vacunas de ADN, etc.
En algunos casos, el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en el sujeto aumenta de 1 log a 10 log después de la vacunación en relación con el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o o ZIKV.
En algunos casos, el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en el sujeto aumenta 1 log después de la vacunación en relación con el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en el sujeto aumenta 2 log después de la vacunación en relación con el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en el sujeto aumenta 3 log después de la vacunación en relación con el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en el sujeto aumenta 5 log después de la vacunación en relación con el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en el sujeto aumenta 10 log después de la vacunación en relación con el título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o ZIKv .
En otros aspectos de la divulgación se proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra CHIKV, DENV y/o ZIKV. El método consiste en administrar al sujeto una vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV que comprende al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico de CHIKV, DENV y/o ZIKV o un fragmento inmunogénico del mismo, induciendo así en al sujeto una respuesta inmune específica al polipéptido antigénico CHIKV, DENV y/o ZIKV o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde la respuesta inmune en el sujeto es equivalente a una respuesta inmune en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o o ZIKV a 2 veces a 100 veces el nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional al doble del nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 3 veces el nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 4 veces el nivel de dosificación en relación con la vacuna CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 5 veces el nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 10 veces el nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 50 veces el nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 100 veces del nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 10 veces a 1000 veces el nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 100 veces a 1000 veces el nivel de dosificación en relación con la vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En otros aspectos, se evalúa la respuesta inmunitaria mediante la determinación del título de anticuerpo [proteína] en el sujeto.
En otros aspectos, la presente divulgación es un método para provocar una respuesta inmune en un sujeto contra CHIKV, DENV y/o ZIKV mediante la administración al sujeto de una vacuna de ARN de CHIKV, d En V y/o ZIKV que comprende al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura que codifica al menos un polipéptido antigénico CHIKV, DENV y/o ZIKV o un fragmento inmunogénico del mismo, induciendo así en el sujeto una respuesta inmune específica para el polipéptido antigénico CHIKV, DENV y/o ZIKV o un fragmento inmunogénico del mismo, en el que la respuesta inmune en el sujeto se induce de 2 días a 10 semanas antes con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra CHIKV, DENV y/o ZIKV. En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional a una dosis que es de 2 veces a 100 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.
En algunos casos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 2 días antes, con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional.
En algunos casos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 3 días antes en comparación con una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional.
En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 1 semana antes, con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional.
En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 2 semanas antes con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional.
En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 3 semanas antes con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional.
En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 5 semanas antes con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional.
En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 10 semanas antes con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional.
También se divulgan en el presente documento métodos para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra CHIKV, DENV y/o ZIKV mediante la administración al sujeto de una vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV que tiene un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico, en el que el polinucleótido de ARN no incluye un elemento de estabilización, y en el que no se coformula ni coadministra un adyuvante con la vacuna.
Composiciones terapéuticas y profilácticas
La divulgación proporciona composiciones, métodos, kits y reactivos para la prevención, tratamiento o diagnóstico del virus Chikungunya en humanos y otros mamíferos, por ejemplo. Los agentes terapéuticos activos de la presente divulgación incluyen ARN de CHIKV, DENV y/o vacunas ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN), células que contienen CHIKV, DENV y/o vacunas de ARN de ZIKv , incluyendo las vacunas de ARN combinadas), y polipéptidos antigénicos traducidos de los polinucleótidos que comprenden las vacunas de ARN. Las vacunas de a Rn de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN) se pueden usar como agentes terapéuticos o profilácticos. Pueden usarse en medicina y/o para la preparación de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, para activar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) ex vivo, que luego se infunden (reinfunden) en un sujeto.
En algunos casos, una vacuna, incluyendo una vacuna combinada, que contiene polinucleótidos de ARN, por ejemplo, ARNm, como se describe en el presente documento, puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano), y los polinucleótidos de ARN se traducen en vivo para producir un polipéptido antigénico.
Las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden inducirse para la traducción de un polipéptido (por ejemplo, antígeno o inmunógeno) en una célula, tejido u organismo. Dicha traducción puede ser in vivo, ex vivo, en cultivo, o in vitro. La célula, tejido u organismo se pone en contacto con una cantidad eficaz de una composición que contiene vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, que contiene un polinucleótido que tiene al menos una región traducible que codifica un polipéptido antigénico.
Se proporciona una "cantidad eficaz" de las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, con base, al menos en parte, del tejido objetivo, el tipo de célula objetivo, los medios de administración, las características físicas del polinucleótido (por ejemplo, el tamaño y la extensión de los nucleósidos modificados) y otros componentes de las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN y otros determinantes. En general, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, proporcionan una respuesta inmunitaria inducida o potenciada en función de la producción de antígeno en la célula, preferiblemente más eficiente que una composición que contiene un polinucleótido no modificado correspondiente que codifica el mismo antígeno. o un antígeno peptídico. El aumento de la producción de antígenos puede demostrarse mediante el aumento de la transfección celular (el porcentaje de células transfectadas con la vacuna de ARN), el aumento de la traducción de proteínas del polinucleótido, la disminución de la degradación del ácido nucleico (como se demuestra, por ejemplo, mediante el aumento de la duración de la traducción de proteínas de un polinucleótido modificado), o respuesta inmunitaria específica de antígeno alterada de la célula huésped.
En algunos casos, las vacunas de ARN (incluyendo los polinucleótidos y sus polipéptidos codificados) y las células que comprenden las vacunas de ARN de acuerdo con la presente divulgación pueden usarse para el tratamiento del virus Chikungunya, virus del dengue, virus Zika o cualquier combinación de dos o tres de los virus anteriores.
Las vacunas ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse de manera profiláctica o terapéutica como parte de un esquema de inmunización activa a individuos sanos o al inicio de la infección durante la fase de incubación o durante la infección activa después del inicio de los síntomas. En algunos casos, la cantidad de vacuna de ARN de la presente descripción proporcionada a una célula, un tejido o un sujeto puede ser una cantidad eficaz para la profilaxis inmunitaria.
Las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse con otros compuestos profilácticos o terapéuticos. Como ejemplo no limitante, el compuesto profiláctico o terapéutico puede ser un adyuvante o un refuerzo. Tal como se usa en esta invención, cuando se hace referencia a una composición profiláctica, tal como una vacuna, el término “refuerzo” se refiere a una administración extra de la composición profiláctica (vacuna). Puede administrarse un refuerzo (o vacuna de refuerzo) después de una administración anterior de la composición profiláctica. El plazo de administración entre la administración inicial de la composición profiláctica y el refuerzo puede ser, de modo no taxativo, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 35 minutos, 40 minutos, 45 minutos, 50 minutos, 55 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 día, 36 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 10 días, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 15 meses, 18 meses, 21 meses, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años, 11 años, 12 años, 13 años, 14 años, 15 años, 16 años, 17 años, 18 años, 19 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años, 40 años, 45 años, 50 años, 55 años, 60 años, 65 años, 70 años, 75 años, 80 años, 85 años, 90 años, 95 años o más de 99 años, y cualquier período de tiempo intermedio.
En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse por vía intramuscular o intradérmica, de manera similar a la administración de vacunas inactivadas conocidas en la técnica.
Las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, se pueden utilizar en diversos entornos según la prevalencia de la infección o el grado o nivel de necesidad médica no satisfecha. Como ejemplo no limitativo, las vacunas de ARN pueden utilizarse para tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas causadas por el virus Chikungunya. Las vacunas de ARN tienen propiedades superiores, debido a que producen títulos de anticuerpo mucho mayores y producen respuestas en forma más temprana que los antivirales comercialmente disponibles.
En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, que incluyen vacunas combinadas de ARN y composiciones y/o complejos de vacunas de ARN opcionalmente en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden formularse o administrarse solas o junto con uno o más componentes. Por ejemplo, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN (composiciones de vacunas) pueden comprender otros componentes que incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes. En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, no incluyen un adyuvante (no tienen adyuvante).
Las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden formularse o administrarse en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunos casos, las composiciones de vacuna comprenden al menos una sustancia activa adicional, tal como, por ejemplo, una sustancia terapéuticamente activa, una sustancia profilácticamente activa o una combinación de ambas. Las composiciones de vacuna pueden ser estériles, libres de pirógenos o estériles y libres de pirógenos. Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, se administran a seres humanos, pacientes o sujetos humanos. Para los fines de la presente divulgación, la frase "ingrediente activo" generalmente se refiere a las vacunas de ARN o los polinucleótidos contenidos en ellas, por ejemplo, polinucleótidos de ARN (por ejemplo, polinucleótidos de ARNm) que codifican polipéptidos antigénicos CHIKV, DENV y/o ZIKV.
Las formulaciones de las composiciones de vacunas de virus respiratorios descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos de preparación incluyen la etapa de asociación del ingrediente activo (por ejemplo, polinucleótido de ARNm) con un excipiente y/o uno o más ingredientes accesorios y luego, si fuera necesario y/o deseable, la división, formación y/o empaque del producto en una unidad de dosis única o de dosis múltiples deseada.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la divulgación variarán dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la afección del sujeto tratado y adicionalmente dependiendo de la vía mediante la que se administra la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0.1 % y 100 %, por ejemplo, entre 0.5 y 50 %, entre 1-30 %, entre 5-80 % o al menos 80 % (p/p) de ingrediente activo.
Las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyend las vacunas combinadas de ARN, se pueden formular usando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la transfección celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (por ejemplo, a partir de una formulación de depósito); (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, dirigirse a tejidos o tipos de células específicos); (5) aumentar la traducción de la proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de la proteína codificada (antígeno) in vivo. Además de los excipientes tradicionales, tales como cualquier solvente, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, los excipientes pueden incluir, de modo no taxativo, lipidoides, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas de cápside, péptidos, proteínas, células transfectadas con vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV(por ejemplo, para su trasplante a un sujeto), hialuronidasa, miméticos de nanopartículas y combinaciones de estos.
Elementos estabilizadores
Se ha encontrado que las moléculas de ARNm eucariotas de origen natural contienen elementos estabilizadores, que incluyen, entre otros, regiones no traducidas (UTR) en su extremo 5' (5'UTR) y/o en su extremo 3' (3'UTR), además de otras características estructurales, como una estructura 5'-cap o una cola 3'-poli(A). Normalmente se transcriben tanto la 5'UTR como la 3'UTR del ADN genómico y son elementos del ARNm prematuro. Se suelen agregar las características estructurales que caracterizan el ARNm maduro, tales como casquete 5' y la cola 3'-poli(A), al ARNm (prematuro) transcrito durante el procesamiento de ARNm. La cola 3'-poli(A) usualmente es una extensión de nucleótidos de adenina que se agrega al extremo 3' del ARNm transcripto. Puede comprender hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenina. En algunas realizaciones, la extensión de la cola 3'-poli(A) puede ser un elemento esencial respecto a la estabilidad del ARNm individual.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN puede incluir uno o más elementos estabilizantes. Los elementos estabilizadores pueden incluir, por ejemplo, una horquilla de histona. Se ha identificado una proteína de unión a horquilla (SLBP - Stem-Loop Binding Protein) de 32 kDa. Se asocia a la horquilla de histona en el extremo 3' de los mensajes de histona tanto en el núcleo como en el citoplasma. El ciclo celular regula su nivel de expresión; alcanza su punto máximo durante la fase S, cuando los niveles de ARNm de histona también se encuentran elevados. Se ha demostrado que la proteína es esencial para el procesamiento eficiente del extremo 3' del pre-ARNm de histona por parte de U7 snRNP. Aún se asocia la SLBP con la horquilla luego del procesamiento y luego se estimula la traducción de ARNm de histona maduro en proteínas de histona en el citoplasma. El dominio de unión de ARN de SLBP se conserva mediante metazoarios y protozoarios, y su unión a la horquilla de histona depende de la estructura del bucle. El sitio de unión mínimo incluye al menos tres nucleótidos 5' y dos nucleótidos 3' respecto a la horquilla.
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN incluyen una región codificante, al menos una horquilla de histona y, opcionalmente, una secuencia poli(A) o señal de poliadenilación. La secuencia poli(A) o la señal de poliadenilación generalmente debería mejorar el nivel de expresión de la proteína codificada. En algunas realizaciones, la proteína codificada no es una proteína de histona, una proteína informante (por ejemplo, luciferasa, GFP, EGFP, p-galactosidasa, EGFP) o una proteína marcadora o de selección (por ejemplo, alfaglobina, galactocinasa y xantina: guanina fosforribosil transferasa (GPT)).
En algunas realizaciones, la combinación de una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación y al menos una horquilla de histona, aunque ambas representan mecanismos alternativos en la naturaleza, actúan en forma sinérgica para aumentar la expresión proteica más allá del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. Se ha observado que el efecto sinérgico de la combinación de poli(A) y al menos una horquilla de histona no depende del orden de los elementos o de la extensión de la secuencia de poli(A).
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN no comprende un elemento posterior de histona (HDE). El "elemento aguas abajo de histona" (HDE, por sus siglas en inglés) incluye una extensión de polinucleótidos rica en purina aproximadamente 15 a 20 nucleótidos en dirección 3' respecto a una horquilla de origen natural, lo que representa el sitio de unión para el ARNpn U7 involucrado en el procesamiento de pre-ARNm de histona en ARNm de histona maduro. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la invención no incluye un intrón.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN puede o no contener una secuencia potenciadora y/o promotora que se puede encontrar modificada o no modificada o que puede estar activada o inactivada. En algunas realizaciones, el tallo-bucle de histona deriva en general de genes de histona e incluye un apareamiento de bases intramolecular de dos secuencias complementarias parcial o totalmente inversas separadas por un espaciador, el que consiste en una secuencia breve, que forma el bucle de la estructura. Usualmente, la región de bucle no apareada no es capaz de aparear bases con ninguno de los elementos de tallo-bucle. Se produce con mayor frecuencia en el ARN, ya que es un componente clave de muchas estructuras secundarias del ARN, pero también puede estar presente en el ADN de cadena simple. En general, la estabilidad de la estructura de horquilla depende de la extensión, cantidad de apareamientos incorrectos o protuberancias, y la composición de bases de la región apareada. En algunas realizaciones, puede producirse un apareamiento de bases que oscila (apareamiento de bases que no responde a Watson y Crick). En algunas realizaciones, la al menos una secuencia de horquilla de histona comprende una extensión de 15 a 45 nucleótidos.
En otras realizaciones, es posible eliminar una o más secuencias ricas en AU de la vacuna de ARN. Estas secuencias, a veces denominadas AURES, son secuencias desestabilizadoras que se encuentran en la 3'UTR. Las AURES pueden eliminarse de las vacunas de ARN. De manera alternativa, las AURES pueden permanecer en la vacuna de ARN.
Formulación de Nanopartículas
En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, se formulan en una nanopartícula. En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, se formulan en una nanopartícula de lípido. En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, se formulan en un complejo de policatión de lípidos, denominado nanopartícula lipídica catiónica. La formación de la nanopartícula lipídica se puede lograr mediante métodos conocidos en la técnica y/o como se describe en la Pub. de EE. UU. No. 20120178702. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula lipídica catiónica puede incluir un péptido catiónico o un polipéptido tal como, pero no se limita a, polilisina, poliornitina y/o poliarginina y los péptidos catiónicos descritos en la Pub. internacional No. WO2012013326 o la Pub. de Patente de EE. UU. No. US20130142818. En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, se formulan en una nanopartícula lipídica que incluye un lípido no catiónico tal como, pero sin limitarse a, colesterol o dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE).
Una formulación de nanopartículas lipídicas puede verse afectada, de modo no taxativo, por la selección del componente lipídico catiónico, el grado de saturación lipídica catiónica, la naturaleza de la PEGilación, la relación de todos los componentes y parámetros biofísicos tales como el tamaño. Por ejemplo, la formulación de nanopartículas lipídicas puede estar compuesta por 57.1 % de lípido catiónico, 7.1 % de dipalmitoilfosfatidilcolina, 34.3 % de colesterol y 1.4 % de PEG-c-DMA. (Semple y col., Nature Biotech. 2010 28:172-176). La alteración de la composición del lípido catiónico puede suministrar ARN de forma más eficaz a diversas células presentadoras de antígenos (Basha et al. Mol Ther. 2011 19:2186-2200).
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden comprender 35 a 45 % de lípido catiónico, 40 % a 50 % de lípido catiónico, 50 % a 60 % de lípido catiónico y/o 55 % a 65 % de lípido catiónico. En algunas realizaciones, la relación de lípidos a ARN (por ejemplo, ARNm) en nanopartículas lipídicas puede ser 5:1 a 20:1, 10:1 a 25:1, 15:1 a 30:1 y/o al menos 30:1.
En algunas realizaciones, la relación de PEG en las formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) se puede aumentar o disminuir y/o la longitud de la cadena de carbono del lípido PEG se puede modificar de C14 a C18 para alterar la farmacocinética y/o la biodistribución de las formulaciones de nanopartículas lipídicas. Como ejemplo no taxativo, las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden contener 0.5 % a 3.0 %, 1.0 % a 3.5 %, 1.5 % a 4.0 %, 2.0 % a 4.5 %, 2.5 % a 5.0 % y/o 3.0 % a 6.0 % de la relación molar lipídica de PEG-c-DOMG (R-3-[(w-metoxi-poli(etilenglicol)2000)carbamoil)]-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina) (a la que también se hace referencia como PEG-DOMG) en comparación con el lípido catiónico, DSPC y colesterol. En algunas realizaciones, es posible reemplazar PEG-c-DOMG con un lípido con PEG tal como, de modo no taxativo, PEG-DSG (1,2-distearoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol), PEG-DMG (1,2-dimiristoil-sn-glicerol) y/o PEG-DPG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol). El lípido catiónico se puede seleccionar de entre cualquier lípido conocido en la técnica tal como, de modo no taxativo, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 y DLin-KC2-DMA.
En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo la formulación de vacuna de ARN combinada, es una nanopartícula que comprende al menos un lípido. El lípido se puede seleccionar, de modo no taxativo, de entre DLin-DMA, Dlin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, lípidos pegilados y lípidos de aminoalcoholes. En algunas realizaciones, el lípido puede ser un lípido catiónico tal como, de modo no taxativo, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA y lípidos de aminoalcoholes. El lípido catiónico de aminoalcohol puede ser los lípidos descritos y/o producidos mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130150625. Como ejemplo no limitativo, el lípido catiónico puede ser 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-1-{[(9Z,2Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 1 en el documento US20130150625); 2-amino-3-[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]-2-{[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 2 en el documento US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-[(octiloxi)metil]propan-1-ol (Compuesto 3 en el documento US20130150625); y 2-(dimetilamino)-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-2-{[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]metil]propan-1 -ol (Compuesto 4 en el documento US20130150625); o cualquier sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo.
Típicamente, las formulaciones de nanopartículas lipídicas comprenden un lípido, en particular, un lípido catiónico ionizable, por ejemplo, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleilmetil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) o 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), y comprenden además un lípido neutro, un esterol y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo, un lípido PEG o modificado con PEG.
En algunas realizaciones, la formulación de nanopartículas lipídicas consiste esencialmente en (i) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil -4-dimetilaminobutirato de metilo (DLin-MC3-DMA), y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319); (ii) un lípido neutro seleccionado de entre DSPC, DPPC, POPC, DOPE y s M; (iii) un esterol, por ejemplo, colesterol; y (iv) un PEG-lípido, por ejemplo, PEG-DMG o PEG-cDMA, en una relación molar de 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de esterol; 0.5-15 % PEG-lípido.
En algunas realizaciones, una formulación de nanopartículas lipídicas incluye 25 % a 75 % en una base molar de lípido catiónico seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleilmetil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), por ejemplo, 35 a 65 %, 45 a 65 %, 60 %, 57.5 %, 50 % o 40 % en una base molar.
En algunas realizaciones, una formulación de nanopartículas lipídicas incluye 0,5 % a 15 % en una base molar del lípido neutro, por ejemplo, 3 a 12 %, 5 a 10 %, 10 % o 7,5 % en una base molar. Los ejemplos de lípidos neutros incluyen, sin limitación, DSPC, POPC, DPPC, DOPE y SM. En algunas realizaciones, la formulación incluye 5 % a 50 % en una base molar del esterol (por ejemplo, 15 a 45 %, 20 a 40 %, 40 %, 38,5 %, 35 % o 31 % en una base molar. Un ejemplo no limitante de un esterol es el colesterol. En algunas realizaciones, una formulación de nanopartículas lipídicas incluye 0.5 % a 20 % en una base molar del lípido PEG o modificado por PEG (por ejemplo, 0.5 a 10 %, 0.5 a 5 %, 1.5 %, 0.5 %, 1.5 %, 3.5 % o 5 % en una base molar). En algunas realizaciones, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio de 2,000 Da. En otras realizaciones, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio menor que 2,000 Da, por ejemplo, aproximadamente 1,500 Da, aproximadamente 1,000 Da o aproximadamente 500 Da. Los ejemplos no taxativos de lípidos modificados por PEG incluyen PEG-diestearoil glicerol (PEG-DMG) (al que también se hace referencia como PEG-C14 o C14-PEG), Pe G-cDMA (adicionalmente discutido en Reyes y col. J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005)).
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 25-75 % de un lípido catiónico seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 0.5-15 % del lípido neutro, 5-50 % del esterol y 0.5-20 % del lípido PEG o modificado por PEG en una base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 35-65 % de un lípido catiónico seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 3-12 % del lípido neutro, 15-45 % del esterol y 0.5-10 % del lípido PEG o modificado por PEG en una base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 45-65 % de un lípido catiónico seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 5-10 % del lípido neutro, 25-40 % del esterol y 0.5-10 % del lípido PEG o modificado por PEG en una base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 60 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,31-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 7.5 % del lípido neutro, 31 % del esterol y 1.5 % del PEG o lípido modificado con PEG en base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 50 % de un lípido catiónico seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilamino etil-[1,31-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 10 % del lípido neutro, 38.5 % del esterol y 1.5 % del PEG o lípido modificado con PEG en base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 50 % de un lípido catiónico seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,31-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 10 % del lípido neutro, 35 % del esterol, 4.5 % o 5 % del lípido PEG o modificado por PEG, y 0.5 % del lípido de selección orientado en una base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 40 % de un lípido catiónico seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilamino etil-[1,31-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 15 % del lípido neutro, 40 % del esterol y 5 % del PEG o lípido modificado con PEG en base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 57.2 % de un lípido catiónico seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin -MC3-D M A), y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 7.1 % del lípido neutro, 34.3 % del esterol y 1.4 % del lípido PEG o modificado con PEG sobre una base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen 57.5 % de un lípido catiónico seleccionado del lípido PEG que es PEG-cDMA (PEG-cDMA se analiza con más detalle en Reyes et al. (J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005)), 7.5 % del lípido neutro, aproximadamente 31.5 % del esterol, y 3.5 % del PEG o lípido modificado con PEG sobre una base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas de lípidos consisten esencialmente en una mezcla de lípidos en proporciones molares de 20-70 % de lípido catiónico: 5-45 % de lípido neutro: 20-55 % de colesterol: 0.5-15 % de lípido modificado con PEG. En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas de lípidos consisten esencialmente en una mezcla de lípidos en proporciones molares de 20­ 60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de colesterol: 0.5-15 % de lípido modificado con PEG.
En algunas realizaciones, la relación lipídica molar es 50/10/38.5/1.5 (% molar lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado por PEG, por ejemplo, Pe G-DMG, PEG-DSG o PEG-DPG), 57.2/7.1134.3/1.4 (% molar lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DPPC/Col/ lípido modificado por PEG, por ejemplo, PEG-cDMA), 40/15/40/5 (% molar lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado por PEG, por ejemplo, PEG-DMG), 50/10/35/4.5/0.5 (% molar lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado por Pe G, por ejemplo, PEG-DSG), 50/10/35/5 (lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado por Pe G, por ejemplo, PEG-DMG), 40/10/40/10 (% molar lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado por PEG, por ejemplo, PEG-DMG o PEG-cDMA), 35/15/40/10 (% molar lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado por PEG, por ejemplo, PEG-DMG o PEG-cDMA) o 52/13/30/5 (% molar lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado por PEG, por ejemplo, PEG-DMG o PEG-cDMA).
Se describen ejemplos no limitativos de composiciones de nanopartículas lipídicas y procedimientos para fabricarlas, por ejemplo, en Semple y col. (2010) Nat Biotechnol 28:172-176; Jayarama y col. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51: 8529-8533; y Maier y col. (2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden comprender un lípido catiónico, un lípido de PEG y un lípido estructural, y opcionalmente comprenden un lípido no catiónico. A modo de ejemplo no taxativo, una nanopartícula lipídica puede comprender 40-60 % de lípido catiónico, 5-15 % de un lípido no catiónico, 1-2 % de un lípido con PEG y 30-50 % de un lípido estructural. A modo de otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica puede comprender 50 % de lípido catiónico, 10 % de un lípido no catiónico, 1.5 % de un lípido con PEG y 38.5 % de un lípido estructural. A modo de otro ejemplo no taxativo adicional, una nanopartícula lipídica puede comprender 55 % de lípido catiónico, 10 % de un lípido no catiónico, 2.5 % de un lípido con PEG y 32.5 % de un lípido estructural. En una realización, el lípido catiónico puede ser cualquier lípido catiónico descrito en esta invención, tal como, pero sin limitación a, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA y L319.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento pueden ser nanopartículas lipídicas de 4 componentes. La nanopartícula lipídica puede comprender un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido con PEG y un lípido estructural. A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica puede comprender 40-60 % de lípido catiónico, 5-15 % de un lípido no catiónico, 1-2 % de un lípido con PEG y 30-50 % de un lípido estructural. A modo de otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica puede comprender 50 % de lípido catiónico, 10 % de un lípido no catiónico, 1.5 % de un lípido con PEG y 38.5 % de un lípido estructural. A modo de otro ejemplo no taxativo adicional, la nanopartícula lipídica puede comprender 55 % de lípido catiónico, 10 % de un lípido no catiónico, 2.5 % de un lípido con PEG y 32.5 % de un lípido estructural. En una realización, el lípido catiónico puede ser cualquier lípido catiónico descrito en esta invención, tal como, pero sin limitación a, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA y L319.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en la presente pueden comprender un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido con PEG y un lípido estructural. Como un ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende 50 % del lípido catiónico DLin-KC2-DMA, 10 % del lípido no catiónico DSPC, 1.5 % del lípido con PEG PEG-DOMG y 38.5 % del lípido estructural colesterol. Como un ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende 50 % del lípido catiónico DLin-MC3-DMA, 10 % del lípido no catiónico DSPC, 1.5 % del lípido con Pe G PEG-DOMG y 38.5 % del lípido estructural colesterol. A modo de ejemplo no limitativo, las nanopartículas lipídicas comprenden el 50 % del lípido catiónico DLin-MC3-DMA, 10 % del lípido no catiónico DSPC, 1.5 % del lípido PEG PEG-DMG y 38.5 % del colesterol lipídico estructural. A modo de incluso otro ejemplo no limitativo, la nanopartícula lipídica comprende 55 % del lípido catiónico L319, 10 % del lípido no catiónico DSPC, 2.5 % del lípido con PEG PEG-d Mg y 32.5 % del lípido estructural colesterol.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición de vacuna pueden variar, dependiendo de la identidad, tamaño y/o condición del sujeto que se está tratando y dependiendo además de la vía por la cual el se va a administrar la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre 0.1 % y 99 % (p/p) del ingrediente activo. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 y 100 %, por ejemplo, entre 0.5 y 50 %, entre el 1-30 %, entre 5 - 80 %, al menos el 80 % (p/p) del ingrediente activo.
En algunas realizaciones, la composición de vacuna de ARN puede comprender el polinucleótido descrito en el presente documento y formulado en una nanopartícula lipídica que comprende MC3, colesterol, DSPC y PEG2000-DMG, el amortiguador citrato trisódico, sacarosa y agua para inyección. Como ejemplo no limitativo, la composición comprende: 2,0 mg/mL de la sustancia fármaco, 21.8 mg/mL de MC3, 10,1 mg/mL de colesterol, 5.4 mg/mL de DSp C, 2.7 mg/mL de PEG2000-DMG, 5.16 mg/mL de citrato trisódico, 71 mg/mL de sacarosa y 1.0 mL de agua para inyección.
En algunas realizaciones, una nanopartícula (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) tiene un diámetro promedio de 10-500 nm, 20-400 nm, 30-300 nm, 40-200 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) tiene un diámetro promedio de 50-150 nm, 50-200 nm, 80-100 nm u 80­ 200 nm.
En una realización, las vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) de la invención pueden formularse en nanopartículas lipídicas con un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm tal como, pero no limitado a, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas pueden tener un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm.
En una realización, la nanopartícula lipídica puede tener un diámetro mayor que 100 nm, mayor que 150 nm, mayor que 200 nm, mayor que 250 nm, mayor que 300 nm, mayor que 350 nm, mayor que 400 nm, mayor que 450 nm, mayor que 500 nm, mayor que 550 nm, mayor que 600 nm, mayor que 650 nm, mayor que 700 nm, mayor que 750 nm, mayor que 800 nm, mayor que 850 nm, mayor que 900 nm, mayor que 950 nm o mayor que 1000 nm.
Modos de Administración de la Vacuna
Las vacunas de ARN CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse por cualquier vía que produzca un resultado terapéuticamente eficaz. Esto incluye, pero no está limitado a, la administración intradérmica, intranasal, intramuscular y/o subcutánea. La presente divulgación provee métodos que comprenden la administración de vacunas de ARN a un sujeto que necesita las mismas. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad, y similares. Las composiciones de vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV se formulan normalmente en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de las vacunas CHIKV, DENV y/o ZIKV RNA, incluyendo las vacunas combinadas de a Rn , puede ser decidido por el médico tratante dentro del alcance de un buen juicio médico. El nivel de dosis de formación de imágenes específico terapéuticamente efectivo, profilácticamente efectivo o apropiado para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y como factores bien conocidos en las artes médicas.
En ciertos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse en niveles de dosis suficientes para administrar 0.0001 mg/kg a 100 mg/kg, 0.001 mg/kg a 0.05 mg/kg, 0.005 mg/kg a 0.05 mg/kg, 0.001 mg/kg a 0.005 mg/kg, 0.05 mg/kg a 0.5 mg/kg, 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, 0.1 mg/kg a 40 mg/kg, 0.5 mg/kg a 30 mg/kg, 0.01 mg/kg a 10 mg/kg, 0.1 mg/kg a 10 mg/kg, o 1 mg/kg a 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado (véase por ejemplo, el intervalo de dosis unitarias descrito en la Publicación Internacional No WO2013078199). La dosis deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En ciertos aspectos, la dosificación deseada puede administrarse utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones). Cuando se emplean múltiples administraciones, se pueden utilizar pautas de dosificación dividida, tales como las descritas en esta invención.
En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse en niveles de dosificaciones suficientes para administrar 0.0001 mg/kg a 100 mg/kg, 0.001 mg/kg a 0.05 mg/kg, 0.005 mg/kg a 0.05 mg/kg, 0.001 mg/kg a 0.005 mg/kg, 0,05 mg/kg a 0,5 mg/kg, 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, 0.1 mg/kg a 40 mg/kg, 0.5 mg/kg a 30 mg/kg, 0.01 mg/kg a 10 mg/kg, 0.1 mg/kg a 10 mg/kg, o 1 mg/kg a 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, por semana, por mes, etc. para obtener el efecto terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado (véase por ejemplo, el intervalo de dosis unitarias descrito en la Publicación Internacional No WO201307819). Es posible administrar la dosificación deseada tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, día por medio, cada tres días, una vez a la semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada 6 meses, etc. En ciertos aspectos, la dosificación deseada puede administrarse utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones). Cuando se emplean múltiples administraciones, se pueden utilizar pautas de dosificación dividida, tales como las descritas en esta invención. En realizaciones de ejemplo, las vacunas ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas de ARN combinadas, pueden administrarse en niveles de dosificaciones suficientes para administrar 0.0005 mg/kg a 0.01 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0.0005 mg/kg a aproximadamente 0.0075 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0.0005 mg/kg, de aproximadamente 0.001 mg/kg, de aproximadamente 0.002 mg/kg, de aproximadamente 0.003 mg/kg, de aproximadamente 0.004 mg/kg o de aproximadamente 0.005 mg/kg.
En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, se pueden administrar una o dos veces (o más) en dosis suficientes para administrar 0.025 mg/kg a 0.250 mg/kg, 0.025 mg/kg a 0.500 mg/kg, 0.025 mg/kg a 0.750 mg/kg o 0.025 mg/kg a 1.0 mg/kg.
En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse dos veces (por ejemplo, Día 0 y Día 7, Día 0 y Día 14, Día 0 y Día 21, Día 0 y Día 28, Día 0 y Día 60, Día 0 y Día 90, Día 0 y Día 120, Día 0 y Día 150, Día 0 y Día 180, Día 0 y 3 meses después, Día 0 y 6 meses después, Día 0 y 9 meses después, Día 0 y 12 meses después, Día 0 y 18 meses después, Día 0 y 2 años después, Día 0 y 5 años después o Día 0 y 10 años después) en una dosis total o niveles de dosis suficientes para administrar una dosis total de 0.0100 mg, 0.025 mg, 0.050 mg, 0.075 mg, 0.100 mg, 0.125 mg, 0.150 mg, 0.175 mg, 0.200 mg, 0.225 mg, 0.250 mg, 0.275 mg, 0.300 mg, 0.325 mg, 0.350 mg, 0.375 mg, 0.400 mg, 0.425 mg, 0.450 mg, 0.475 mg, 0.500 mg, 0.525 mg, 0.550 mg, 0.575 mg, 0.600 mg, 0.625 mg, 0.650 mg, 0.675 mg, 0.700 mg, 0.725 mg, 0.750 mg, 0.775 mg, 0.800 mg, 0.825 mg, 0.850 mg, 0.875 mg, 0.900 mg, 0.925 mg, 0.950 mg, 0.975 mg, o 1.0 mg. La presente descripción abarca dosis y frecuencias de administración mayores y menores. Por ejemplo, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluidas las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse tres o cuatro veces.
En algunos casos, las vacunas de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV, incluyendo las vacunas combinadas de ARN, pueden administrarse dos veces (por ejemplo, Día 0 y Día 7, Día 0 y Día 14, Día 0 y Día 21, Día 0 y Día 28, Día 0 y Día 60, Día 0 y Día 90, Día 0 y Día 120, Día 0 y Día 150, Día 0 y Día 180, Día 0 y 3 meses después, Día 0 y 6 meses después, Día 0 y 9 meses después, Día 0 y 12 meses después, Día 0 y 18 meses después, Día 0 y 2 años después, Día 0 y 5 años después o Día 0 y 10 años después) en una dosis total o niveles de dosis suficientes para administrar una dosis total de 0.010 mg, 0.025 mg, 0.100 mg o 0.400 mg.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN para ser utilizada en un método de vacunación de un sujeto se administra al sujeto en una única dosis de entre 10 pg/kg y 400 pg/kg de la vacuna de ácido nucleico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto. En algunas realizaciones, la vacuna de ARN para ser utilizada en un método de vacunación de un sujeto se administra al sujeto en una única dosificación de entre 10 pg y 400 pg de la vacuna de ácido nucleico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto.
Es posible formular una composición farmacéutica de vacuna de ARN descrita en el presente documento en una forma de dosificación descrita en la presente, tal como una forma intranasal, intratraqueal o inyectable (por ejemplo, una forma intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intradérmica, intracardíaca, intraperitoneal y subcutánea).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) para usar en un método de vacunación de un sujeto se administra al sujeto en una dosificación única de 10 pg de la vacuna de ácido nucleico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto. En algunas realizaciones, una vacuna de ARN para usar en un método de vacunación de un sujeto se administra al sujeto en una dosificación única de 2 pg de la vacuna de ácido nucleico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto. En algunas realizaciones, una vacuna para usar en un método de vacunación de un sujeto se administra al sujeto en dos dosificaciones de 10 pg de la vacuna de ácido nucleico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto. En algunas realizaciones, una vacuna de ARN para usar en un método de vacunación de un sujeto se administra al sujeto en dos dosificaciones de 2 pg de la vacuna de ácido nucleico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto.
Es posible formular una composición farmacéutica de vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm descrita en el presente documento en una forma de dosificación descrita en la presente, tal como una forma intranasal, intratraqueal o inyectable (por ejemplo, una forma intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intradérmica, intracardíaca, intraperitoneal y subcutánea).
Formulaciones de vacunas de ARN y métodos de uso
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan formulaciones de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm), en las que la vacuna de ARN se formula en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un sujeto (por ejemplo, producción de anticuerpos específicos para CHIKV, DENV y/o polipéptido antigénico ZIKV). Una “cantidad efectiva” es una dosis de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) efectiva para producir una respuesta inmunitaria específica para un antígeno. También se proporcionan en la presente métodos para inducir una respuesta inmunitaria específica para un antígeno en un sujeto.
En algunos casos, la respuesta inmunitaria específica de antígeno se caracteriza midiendo un título de anticuerpos polipeptídicos anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producidos en un sujeto al que se le administró una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) como se proporciona en el presente documento. Un título de anticuerpos es una medida de la cantidad de anticuerpos dentro de un sujeto, por ejemplo, anticuerpos que son específicos para un antígeno o epítopo particular de un antígeno. El título de anticuerpos generalmente se expresa como el inverso de la mayor dilución que proporciona un resultado positivo. Por ejemplo, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es un ensayo común para determinar títulos de anticuerpo.
En algunos caso, se usa un título de anticuerpos para evaluar si un sujeto ha tenido una infección o para determinar si se requieren inmunizaciones. En algunos casos, se utiliza un título de anticuerpo para determinar la potencia de una respuesta autoinmunitaria, para determinar si es necesario un refuerzo de inmunización, para determinar si una vacuna previa fue eficaz y para identificar cualesquiera infecciones recientes o previas. De acuerdo con la presente divulgación, es posible utilizar un título de anticuerpo para determinar la potencia de una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto por la vacuna de ARN.
En algunos casos, el título de un anticuerpo polipeptídico antigénico anti-ZIKV producido en un sujeto aumenta al menos 1 log en relación con un control. Por ejemplo, el título de anticuerpo producido en un sujeto puede aumentar al menos 1.5, al menos 2, al menos 2.5 o al menos 3 log con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo producido en el sujeto aumenta 1, 1.5, 2, 2.5 o 3 log con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo producido en el sujeto aumenta 1-3 log con respecto a un control. Por ejemplo, el título de anticuerpo producido en un sujeto puede aumentar 1-1.5, 1-2, 1-2.5, 1-3, 1.5-2, 1.5­ 2.5, 1.5-3, 2-2.5, 2-3, o 2.5-3 log con respecto a un control.
En algunos caso, el título de anticuerpo producido en un sujeto aumenta al menos 2 veces con respecto a un control. Por ejemplo, el título de anticuerpo producido en un sujeto puede aumentar al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces con respecto a un control. En algunos casos, el título de anticuerpo producido en el sujeto aumenta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces con respecto a un control. En algunos casos, el título de anticuerpo producido en un sujeto aumenta 2-10 veces con respecto a un control. Por ejemplo, el título de anticuerpo producido en un sujeto puede aumentar 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-10, 7-9, 7-8, 8-10, 8-9 o 9-10 veces con respecto a un control.
Un control, en algunos casos, es un título de anticuerpos polipeptídicos anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto al que no se le ha administrado una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm). En algunos casos, un control es un título de anticuerpos anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto al que se le ha administrado una vacuna viva atenuada contra CHIKV, d En V y/o ZIKV. Una vacuna atenuada es una vacuna producida mediante la reducción de la virulencia de una vacuna viable (viva). Se altera un virus atenuado en una forma que lo torna inofensivo o menos virulento en comparación con el virus vivo no modificado. En algunos casos, un control es un título de anticuerpo polipeptídico antigénico anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto al que se le administró una vacuna inactivada contra CHIKV, DENV y/o ZIKV. En algunos casos, un control es un título de anticuerpo polipeptídico anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto al que se le administró una vacuna de proteína CHIKV, DENV y/o ZIKV recombinante o purificada. Las vacunas de proteínas recombinantes suelen incluir antígenos proteicos que fueron producidos en un sistema de expresión heterólogo (por ejemplo, bacteria o levadura) o que se purificaron a partir de grandes cantidades del organismo patogénico.
En algunos casos, una cantidad eficaz de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) es una dosis que se reduce en comparación con la dosis estándar de atención de una vacuna de proteína recombinante CHIKV, DENV y/o ZIKV. Tal como se proporciona en la presente, un “estándar de cuidado” hace referencia a lineamientos para tratamiento médico o psicológico y puede ser general o específico. El “estándar de cuidado” especifica el tratamiento adecuado con base en evidencia científica y la colaboración entre profesionales médicos involucrados en el tratamiento de una afección dada. Es el proceso de diagnóstico y tratamiento que debe seguir un médico/doctor ante un determinado tipo de paciente, enfermedad o circunstancia clínica. Una "dosis de atención estándar", como se proporciona en el presente documento, se refiere a la dosis de una vacuna de proteína CHIKV, DENV y/o ZIKv recombinante o purificada, o una vacuna viva atenuada o inactivada contra CHIKV, DENV y/o ZIKV, que un médico/doctor u otro profesional médico administraría a un sujeto para tratar o prevenir CHIKV, DENV y/o ZIKV o una afección relacionada, siguiendo las pautas de atención estándar para tratar o prevenir CHIKV, DENV y/o ZIKV, o una afección relacionada.
En algunos casos, el título de anticuerpos polipeptídicos anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producidos en un sujeto al que se le administró una cantidad eficaz de una vacuna de ARN del ZIKv es equivalente a un título de anticuerpo polipeptídico anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto de control al que se le administró una dosis estándar de cuidado de una vacuna de proteína recombinante o purificada contra CHIKV, DENV y/o ZIKV o una vacuna viva atenuada o vacuna inactivada CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, una cantidad eficaz de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) es una dosis equivalente a una reducción de al menos dos veces en una dosis estándar de atención de una vacuna de proteína CHIKV, DENV y/o ZIKV recombinante o purificada. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV puede ser una dosis equivalente a una dosis de al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos Reducción de 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces en una dosis de cuidado estándar de una vacuna de proteína CHIKV, DENV y/o ZIKV recombinante o purificada. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de una vacuna de ARN de RSV es una dosis equivalente a una reducción de al menos 100 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces en una dosis de estándar de cuidado de una vacuna de proteína de RSV recombinante o purificada. En algunos casos, una cantidad eficaz de una vacuna contra CHIKv , DENV y/o ZIKV RNA es una dosis equivalente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, reducción de 20, 50, 100, 250, 500 o 1000 veces en una dosis de cuidado estándar de una vacuna de proteína CHIKV, DENV y/o ZIKV recombinante o purificada. En algunos casos, el título de anticuerpos polipeptídicos anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto al que se le administró una cantidad eficaz de una vacuna de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV es equivalente a un título de anticuerpos polipeptídicos anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto de control al que se le administró la dosis estándar de atención de una vacuna recombinante o proteica contra CHIKV, DENV y/o ZIKV o una vacuna viva atenuada o vacuna inactivada CHIKV, DENV y/o ZIKV. En algunos casos, una cantidad eficaz de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) es una dosis equivalente a una reducción de 2 a 1000 veces (por ejemplo, de 2 a 100 veces, de 10 a 1000 veces) en la dosis estándar de atención de una vacuna de proteína CHIKV, DENV y/o ZIKV recombinante o purificada, en la que el título de anticuerpo anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpos polipeptídicos anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto de control al que se le administró la dosis estándar de cuidado de una vacuna recombinante o purificada de proteína CHIKV, DENV y/o ZIKV o una vacuna viva atenuada o vacuna inactivada CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) es una dosis equivalente a una reducción de 2 a 1000, 2 a 900, 2 a 800, 2 a 700, 2 a 600, 2 a 500, 2 a 400, 2 a 300, 2 a 200, 2 a 100, 2 a 90, 2 a 80, 2 a 70, 2 a 60, 2 a 50, 2 a 40, 2 a 30, 2 a 20, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 1000, 3 a 900, 3 a 800, 3 a 700, 3 a 600, 3 a 500, 3 a 400, 3 a 3 a 00, 3 a 200, 3 a 100, 3 a 90, 3 a 80, 3 a 70, 3 a 60, 3 a 50, 3 a 40, 3 a 30, 3 a 20, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 1000, 4 a 900, 4 a 800, 4 a 700, 4 a 600, 4 a 500, 4 a 400, 4 a 4 a 00, 4 a 200, 4 a 100, 4 a 90, 4 a 80, 4 a 70, 4 a 60, 4 a 50, 4 a 40, 4 a 30, 4 a 20, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 4 a 4, 5 a 1000, 5 a 900, 5 a 800, 5 a 700, 5 a 600, 5 a 500, 5 a 400, 5 a 300, 5 a 200, 5 a 100, 5 a 90, 5 a 80, 5 a 70, 5 a 60, 5 a 50, 5 a 40, 5 a 30, 5 a 20, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 1000, 6 a 900, 6 a 800, 6 a 700, 6 a 600, 6 a 500, 6 a 400, 6 a 300, 6 a 200, 6 a 100, 6 a 90, 6 a 80, 6 a 70, 6 a 60, 6 a 50, 6 a 40, 6 a 30, 6 a 20, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 1000, 7 a 900, 7 a 800, 7 a 700, 7 a 600, 7 a 500, 7 a 400, 7 a 300, 7 a 200, 7 a 100, 7 a 90, 7 a 80, 7 a 70, 7 a 60, 7 a 50, 7 a 40, 7 a 30, 7 a 20, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 1000, 8 a 900, 8 a 800, 8 a 700, 8 a 600, 8 a 500, 8 a 400, 8 a 300, 8 a 200, 8 a 100, 8 a 90, 8 a 80, 8 a 70, 8 a 60, 8 a 50, 8 a 40, 8 a 30, 8 a 20, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 1000, 9 a 900, 9 a 800, 9 a 700, 9 a 600, 9 a 500, 9 a 400, 9 a 300, 9 a 200, 9 a 100, 9 a 90, 9 a 80, 9 a 70, 9 a 60, 9 a 50, 9 a 40, 9 a 30, 9 a 20, 9 a 10, 10 a 1000, 10 a 900, 10 a 800, 10 a 700, 10 a 600, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 10 a 90, 10 a 80, 10 a 70, 10 a 60, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 20, 20 a 1000, 20 a 900, 20 a 800, 20 a 700, 20 a 600, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 100, 20 a 90, 20 a 80, 20 a 70, 20 a 60, 20 a 50, 20 a 40, 20 a 30, 30 a 1000, 30 a 900, 30 a 800, 30 a 700, 30 a 600, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 100, 30 a 90, 30 a 80, 30 a 70, 30 a 60, 30 a 50, 30 a 40, 40 a 1000, 40 a 900, 40 a 800, 40 a 700, 40 a 600, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 100, 40 a 90, 40 a 80, 40 a 70, 40 a 60, 40 a 50, 50 a 1000, 50 a 900, 50 a 800, 50 a 700, 50 a 600, 50 a 500, 50 a 400, 50 a 300, 50 a 200, 50 a 100, 50 a 90, 50 a 80, 50 a 70, 50 a 60, 60 a 1000, 60 a 900, 60 a 800, 60 a 700, 60 a 600, 60 a 500, 60 a 400, 60 a 300, 60 a 200, 60 a 100, 60 a 90, 60 a 80, 60 a 70, 70 a 1000, 70 a 900, 70 a 800, 70 a 700, 70 a 600, 70 a 500, 70 a 400, 70 a 300, 70 a 200, 70 a 100, 70 a 90, 70 a 80, 80 a 1000, 80 a 900, 80 a 800, 80 a 700, 80 a 600, 80 a 500, 80 a 400, 80 a 300, 80 a 200, 80 a 100, 80 a 90, 90 a 1000, 90 a 900, 90 a 800, 90 a 700, 90 a 600, 90 a 500, 90 a 400, 90 a 300, 90 a 200, 90 a 100, 100 a 1000, 100 a 900, 100 a 800, 100 a 700, 100 a 600, 100 a 500, 100 a 400, 100 a 300, 100 a 200, 200 a 1000, 200 a 900, 200 a 800, 200 a 700, 200 a 600, 200 a 500, 200 a 400, 200 a 300, 300 a 1000, 300 a 900, 300 a 800, 300 a 700, 300 a 600, 300 a 500, 300 a 400, 400 a 1000, 400 a 900, 400 a 800, 400 a 700, 400 a 600, 400 a 500, 500 a 1000, 500 a 900, 500 a 800, 500 a 700, 500 a 600, 600 a 1000, 600 a 900, 600 a 800, 600 a 700, 700 a 1000, 700 a 900, 700 a 800, 800 a 1000, 800 a 900 o 900 a 1000 veces en la dosis de atención estándar de una vacuna de proteína recombinante CHIKV, DENV y/o ZIKV. En algunos casos, tal como los anteriores, el título de anticuerpos de polipéptido antigénico anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpos de polipéptido antigénico anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto de control al que se le administró el dosis estándar de atención de una vacuna de proteína CHIKV, DENV y/o ZIKV recombinante o purificada o una vacuna viva atenuada o inactivada contra CHIKV, DENV y/o ZIKV. En algunos aspectos, la cantidad efectiva es una dosis equivalente (o equivalente a al menos) a una reducción de 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 1280, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 4360, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 5760, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 veces en la dosis estándar de atención de una vacuna de proteína recombinante CHIKV, DENV y/o ZIKV. En algunos casos, tal como los anteriores, un título de anticuerpo de polipéptido antigénico anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpo de polipéptido antigénico anti-CHIKV, anti-DENV y/o anti-ZIKV producido en un sujeto de control al que se le administró la dosis estándar de atención de una vacuna recombinante o purificada de proteína de CHIKV, DENV y/o ZIKV o una vacuna viva atenuada o vacuna inactivada de CHIKV, DENV y/o ZIKV.
En algunos casos, la cantidad eficaz de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) es una dosis total de 50­ 1000 pg. En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una vacuna de a Rn (por ejemplo, ARNm) es una dosis total de 50-1000, 50- 900, 50-800, 50-700, 50-600, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-100, 50-90, 50-80, 5070, 50-60, 60-1000, 60- 900, 60-800, 60-700, 60-600, 60-500, 60-400, 60-300, 60-200, 60-100, 60-90, 60-80, 60-70, 70-1000, 70- 900, 70-800, 70-700, 70-600, 70-500, 70-400, 70-300, 70-200, 70-100, 70-90, 70-80, 80­ 1000, 80- 900, 80-800, 80-700, 80-600, 80-500, 80-400, 80-300, 80-200, 80-100, 80-90, 90-1000, 90- 900, 90­ 800, 90-700, 90-600, 90-500, 90-400, 90-300, 90-200, 90-100, 100-1000, 100- 900, 100-800, 100-700, 100­ 600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 200-1000, 200-900, 200-800, 200-700, 200-600, 200-500, 200-400, 200-300, 300-1000, 300-900, 300-800, 300-700, 300-600, 300-500, 300-400, 400-1000, 400-900, 400-800, 400-700, 400-600, 400-500, 500-1000, 500-900, 500-800, 500-700, 500-600, 600-1000, 600-900, 600-900, 600-700, 700-1000, 700-900, 700-800, 800-1000, 800-900, o 900-1000 |jg. En algunos casos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) es una dosis total de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 |jg. En algunos aspectos, la cantidad efectiva es una dosis de 25-500 jg administrada al sujeto un total de dos veces. En algunos casos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) es una dosis de 25-500, 25-400, 25-300, 25-200, 25-100, 25-50, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-100, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 150-500, 150-400, 150-300, 150-200, 200-500, 200-400, 200-300, 250-500, 250-400, 250-300, 300-500, 300-400, 350-500, 350-400, 400­ 500 o 450-500 jg administrada al sujeto un total de dos veces. En algunos casos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) es una dosis total de 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 jg administrada al sujeto un total de dos veces.
Ejemplos
Ejemplo 1. Fabricación de polinucleótidos
De acuerdo con la presente divulgación, la fabricación de polinucleótidos y/o partes o regiones de los mismos se puede lograr utilizando los métodos enseñados en la solicitud internacional WO2014/152027 titulada "Manufacturing Methods for Production of RNA Transcripts".
Los métodos de purificación pueden incluir los que se enseñan en la Solicitud Internacional WO2014/152030 y WO2014/152031.
Los métodos de detección y caracterización de los polinucleótidos se pueden realizar como se enseña en el documento WO2014/144039.
La caracterización de los polinucleótidos de la divulgación se puede lograr usando un procedimiento seleccionado de entre el grupo que consiste en mapeo de polinucleótidos, secuenciación de transcriptasa inversa, análisis de distribución de carga y detección de impurezas de ARN, en donde la caracterización comprende determinar la secuencia de transcripción de ARN, determinando la pureza de la Transcripción de ARN, o determinación de la heterogeneidad de carga de la transcripción de ARN. Tales métodos se enseñan, por ejemplo, en los documentos WO2014/144711 and WO2014/144767.
Ejemplo 2. Síntesis de polinucleótidos quiméricos
Introducción
De acuerdo con la presente divulgación, dos regiones o partes de un polinucleótido quimérico pueden unirse o ligarse usando química de trifosfato.
De acuerdo con este procedimiento, una primera región o parte de 100 nucleótidos o menos se sintetiza químicamente con un monofosfato 5' y 3' de OH extremo u OH bloqueado. Si la región tiene más de 80 nucleótidos, se puede sintetizar como dos cadenas para la ligación.
Si la primera región o parte se sintetiza como una región o parte modificada en forma no posicional mediante transcripción in vitro (IVT), puede seguir la conversión de monofosfato en 5' con posterior protección del extremo 3'.
Los grupos protectores de monofosfato se pueden seleccionar de entre cualesquiera de los conocidos en la técnica.
La segunda región o parte del polinucleótido quimérico puede sintetizarse utilizando procedimientos de síntesis química o IVT. Los métodos IVT pueden incluir una ARN polimerasa que puede utilizar un cebador con una capa modificada. Alternativamente, una capa de hasta 130 nucleótidos puede sintetizarse químicamente y acoplarse a la región o parte de IVT.
Para los procedimientos de ligación, la ligación con ADN ligasa T4 seguida del tratamiento con DNasa debería evitar la concatenación fácilmente.
No es necesario fabricar el polinucleótido quimérico completo con una estructura principal de fosfato-azúcar.
Si una de las regiones o partes codifica un polipéptido, a continuación, es preferible que dicha región o parte comprenda una estructura principal de fosfato-azúcar.
A continuación, se realiza la ligadura usando cualquier química de clic conocida, química de ortoclic, solulink u otras químicas de bioconjugado conocidas por los expertos en la técnica.
Ruta sintética
El polinucleótido quimérico puede elaborarse mediante una serie de segmentos de partida. Dichos segmentos incluyen:
(a) un segmento en 5' protegido y con capa que comprende un OH en 3' normal (SEG. 1)
(b) un segmento de trifosfato en 5' que puede incluir la región codificante de un polipéptido y comprender un o H en 3' normal (SEG. 2)
(c) el segmento de monofosfato en 5' para el extremo 3' del polinucleótido quimérico (por ejemplo, la cola) que comprende cordicepina o carece de OH en 3' (SEG. 3)
Después de la síntesis (química o IVT), el segmento 3 (SEG. 3) se trata con cordicepina y a continuación con pirofosfatasa para crear el 5'monofosfato.
El segmento 2 (SEG. 2) se liga a continuación a SEG. 3 usando ARN ligasa. A continuación, el polinucleótido ligado se purifica y se trata con pirofosfatasa para escindir el difosfato. EL constructo SEG.2-SEG. 3 tratada es a continuación purificada y SEG. 1 es ligado al extremo 5'. Puede realizarse un paso de purificación adicional del polinucleótido quimérico.
Cuando el polinucleótido quimérico codifica un polipéptido, los segmentos ligados o unidos pueden representarse como: 5'UTR (SEG. 1), marco de lectura abierto u ORF (SEG. 2) y 3'UTR+PoliA (SEG. 3). Los rendimientos de cada paso pueden ser tanto como 90-95 %.
Ejemplo 3. PCR para la producción de ADNc
Los procedimientos de PCR para la preparación de ADNc se realizan usando 2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix por Kapa Biosystems (Woburn, MA). Este sistema incluye 12.5 pl de 2x KAPA ReadyMix; 0.75 pl de cebador directo (10 pM); 0.75 pl de cebador indirecto (10 pM); -100 ng de ADNc plantilla y dH20 diluido hasta 25.0 pl. Las condiciones de reacción son a 95 °C durante 5 min. y 25 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, a continuación 58 °C durante 15 segundos, a continuación 72 °C durante 45 segundos, a continuación 72 °C durante 5 min. a continuación 4 °C hasta la terminación.
La reacción se limpia con el micro kit PURELINK™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante (hasta 5 pg). Las reacciones más grandes requerirán una limpieza con un producto de mayor capacidad. Luego de la limpieza, se cuantifica el ADNc con el NANODROPTM y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ADNc es del tamaño esperado. Luego, se presenta el ADNc para el análisis de secuenciación antes de proceder a la reacción de transcripción in vitro.
Ejemplo 4. Transcripción In vitro (IVT)
La reacción de transcripción in vitro genera polinucleótidos que contienen polinucleótidos uniformemente modificados. Dichos polinucleótidos uniformemente modificados pueden comprender una región o parte de los polinucleótidos de la divulgación. La mezcla de trifosfato de nucleótidos de entrada (NTP) se fabrica internamente utilizando NTP naturales y no naturales.
Una reacción de transcripción in vitro típica incluye lo siguiente:
1 ADNc plantilla 10 pg
2 Tampón de transcripción 10x (Tris-HCl 400 mM pH 8,0, MgCl2190 2.0 pl
mM, DTT 50 mM, espermidina 10 mM)
3 NTP personalizados (25 mM cada uno) 7.2 pl
4 Inhibidor de RNasa 20 U
5 T7 ARN polimerasa 3000 U
6 dH20 Hasta 20.0 pl. y
7 Incubación a 37 °C durante 3 h-5 h. h
La mezcla cruda de IVT se puede almacenar a 4 ° C durante la noche para su limpieza al día siguiente. A continuación, se usa 1 U de DNasa libre de RNasa para digerir la plantilla original. Después de 15 minutos de incubación a 37 °C, el ARNm se purifica usando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit puede purificar hasta 500 pg de ARN. Después de la limpieza, el ARN se cuantifica utilizando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido degradación del ARN.
Ejemplo 5: Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polinucleótidos de ARN de CHIKV E1 para su uso en una vacuna de ARN (ejemplo de referencia)
Las siguientes secuencias son ejemplos de secuencias que se pueden usar para codificar polinucleótidos de ARN de CHIKV E1 para usar en la vacuna de ARN de CHIKV:
Tabla 1. Polinucleótidos de ARN de CHIKV E1
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Ejemplo 6: Ácidos nucleicos ejemplares que codifican polinucleótidos de ARN de CHIKV E2 para uso en una vacuna de ARN (Ejemplo de referencia)
Las siguientes secuencias son ejemplos de secuencias que se pueden usar para codificar polinucleótidos de ARN de CHIKV E2 para usar en una vacuna de ARN:
Tabla 2. Polinucleótidos de ARN de CHIKV E2
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Ejemplo 7: Ácidos nucleicos ejemplares que codifican polinucleótidos de ARN de CHIKV E1-E2 para uso en una vacuna de ARN (Ejemplo de referencia)
Las siguientes secuencias son ejemplos de secuencias que se pueden usar para codificar polinucleótidos de ARN de CHIKV E1-E2 para usar en una vacuna de ARN:
Tabla 3. Polinucleótidos de ARN de CHIKV E1-E2
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Ejemplo 8: Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polinucleótidos de ARN de CHIKV C-E3-E2-6K-E1 para usar en una vacuna de ARN (ejemplo de referencia)
La siguiente secuencia es una secuencia de ejemplo que se puede usar para codificar un polinucleótido de ARN de CHIKV, DENV y/o ZIKV C-E3-E2-6K-E1 para usar en una vacuna de ARN:
Tabla 4. Polinucleótido de ARN de CHIKV C-E3-E2-6K-E1
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La Fig.2 muestra un árbol filogenético de cepas del virus chikungunya derivadas de marcos de lectura abiertos concatenados completos para las poliproteínas estructurales y no estructurales. Las sustituciones de aminoácidos E1 que facilitaron (linaje del Océano Índico) o impidieron (linaje asiático) la adaptación a Aedes albopictus se muestran a la derecha. RCA: República Centroafricana; ECs A: Este/Centro/Sudáfrica.
Ejemplo 9: Protocolo para determinar la eficacia de los candidatos a antígeno Chikungunya codificados por ARNm contra CHIKV (ejemplo de referencia)
Chikungunya tiene un genoma policistrónico y son posibles diferentes antígenos, con base en la proteína estructural de Chikungunya. Hay formas unidas a la membrana y secretadas de E1 y E2, así como el antígeno poliproteico completo, que retiene la conformación nativa de la proteína. Además, los diferentes genotipos de CHIKV también pueden producir diferentes antígenos.
La eficacia de las vacunas candidatas Chik en ratones AG129 frente a la exposición con una dosis letal de la cepa CHIKV 181/25 fue investigada. Los ratones A129, que carecen de señalización del receptor IFN a/p, inyectados por vía intradérmica en la almohadilla plantar con 104 UFP del virus CHIKV 181/25 tienen una tasa de supervivencia del 100 % después de la inyección. Por el contrario, los ratones AG129, que carecen de señalización de los receptores IFN a/p y y, inyectados por vía intradérmica en la almohadilla plantar con 104 PFU del virus CHIKV 181/25 no sobreviven más allá del día 5 después de la inyección. Las vacunas probadas incluyeron: CHIKV-E1 codificado con ARNm formulado con MC3-LNP, CHIKV-E2 codificado con ARNm formulado con MC3-LNP y CHIKV-E1/E2/E3/C codificado con ARNm formulado con MC3-LNP. Se vacunaron quince grupos de cinco ratones AG129 mediante inyección intradérmica (ID) o intramuscular (IM) con 2 pg o 10 pg de la vacuna candidata. Las vacunas se administraron a ratones AG129 en una o dos dosis (la segunda dosis se proporcionó 28 días después de la primera). El grupo de control positivo se vacunó mediante instilación intranasal (volumen de 20 pL) con CHIKV inactivado por calor. Se utilizó solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control negativo.
El día 56, los ratones se expusieron a 1 x 104 PFU de CHIKV mediante inyección ID en un volumen de 50 pl y se controlaron durante 10 días para determinar la pérdida de peso, la morbilidad y la mortalidad. Los ratones que mostraban una enfermedad grave, definida como >30 % pérdida de peso, una puntuación de salud de 6 o más, letargo extremo, y/o parálisis fueron sacrificados. En particular, los ratones "vacunados" con CHIKV inactivado por calor (grupo de control positivo) se volvieron mórbidos y fueron sacrificados después de la segunda dosis de HI-CHIKV (no se incluyeron en la parte de exposición del estudio).
Además, se analizó la reactividad de muestras individuales en un ELISA semicuantitativo para IgG de ratón contra E1 específico de Chikungunya (grupos 1-4), E2 específico de Chikungunya (grupos 5-8) o proteínas E1 y E2 específicas de Chikungunya. (grupos 9-15).
El estado de salud se puntúa como se indica en la siguiente Tabla 5:
Tabla 5- Estado de Salud
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Ejemplo 10: Eficacia del candidato a vacuna de ARNm del antígeno E1 de Chikungunya (Ejemplo de referencia)
Ratones AG129 (n=5 por grupo) fueron vacunados con 2 pg o 10 pg de ARNm formulado con MC-3-LNP que codifica CHIKV E1. Los ratones AG129 se vacunaron el día 0 o los días 0 y 28 mediante administración IM o ID. El día 56 después de la vacunación final, todos los ratones se expusieron a una dosis letal de CHIKV. La curva de supervivencia, el porcentaje de pérdida de peso y el estado de salud de los ratones vacunados con 2 pg de ARNm de CHIKV E1 se muestran en las Figs. 4A-C. Los resultados de supervivencia se tabulan en la Tabla 6 a continuación. La curva de supervivencia, el porcentaje de pérdida de peso y el estado de salud de los ratones vacunados con 10 pg de ARNm de CHIKV E1 se muestran en las Figs. 8A-C. Los resultados de supervivencia se tabulan en la Tabla 7 a continuación.
Tabla 6. Supervivencia de ratones vacunados con ARNm del antígeno E1 de Chikungunya - dosis de 2 pg
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Tabla 7. Supervivencia de ratones vacunados con ARNm del antígeno Chikungunya E1 - dosis de 10 pg
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Como se muestra en la Tabla 6, la dosis de 2 pg de la vacuna de ARNm de CHIKV E1 no brindó protección después de la exposición a la infección por CHIKV cuando se administró por vía IM o ID con una dosis única o dos dosis. Asimismo, la dosis única de 10 pg de la vacuna CHIKV E1 proporcionó poca o ninguna protección cuando se administró por vía IM o ID. Sin embargo, como se indica en la Tabla 7, la dosis de 10 pg de la vacuna de ARNm de CHIKV E1 proporcionó una protección del 60 % después de la prueba de CHIKV cuando se administró por vía IM con dos dosis y una protección del 80 % después de la prueba de CHIKV cuando se administró por vía ID con dos dosis.
En todos los experimentos, los ratones de control negativo tenían una ~0 % tasa de supervivencia, al igual que los ratones de control positivo (CHIKV inactivado por calor), que murieron antes de la exposición a CHIKv . Algunos ratones murieron durante el período de vacunación.
Ejemplo 11: Eficacia del candidato a vacuna de ARNm del antígeno E2 de Chikungunya (Ejemplo de referencia)
Ratones AG129 (n=5 por grupo) fueron vacunados con 2 pg o 10 pg de ARNm formulado con MC-3-LNP que codifica CHIKV E2. Los ratones se vacunaron el día 0 o los días 0 y 28 mediante administración IM o ID. El día 56 después de la vacunación final, todos los ratones se expusieron a una dosis letal de CHIKV. La curva de supervivencia, el porcentaje de pérdida de peso y el estado de salud de los ratones vacunados con 2 pg de ARNm de CHIKV E2 se muestran en las Figs. 5A-C. Los resultados de supervivencia se tabulan en la Tabla 8 a continuación. La curva de supervivencia, el porcentaje de pérdida de peso y el estado de salud de los ratones vacunados con 10 pg de ARNm de CHIKV e2 se muestran en las Figs. 9A-C. Los resultados de supervivencia se tabulan en la Tabla 9 a continuación.
Tabla 8. Supervivencia de ratones vacunados con ARNm del antígeno Chikungunya E2 - dosis de 2 pg
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Tabla 9. Supervivencia de ratones vacunados con ARNm del antígeno Chikungunya E2 - dosis de 10 pg
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Como se muestra en la Tabla 8, la dosis de 2 pg de la vacuna de ARNm de CHIKV E2 no proporcionó protección después de la exposición a la infección por CHIKV cuando se administró por vía IM o ID en una sola dosis. Sin embargo, cuando se administró en dos dosis, la dosis de 2 pg de la vacuna de ARNm de CHIKV E2 proporcionó una protección del 80 % cuando se administró por vía IM y una protección del 100 % cuando se administró por vía ID después de la exposición a CHIKV. Como se indica en la Tabla 9, la dosis de 10 pg de ARNm de E2 de CHIKV en ratón no proporcionó protección después de la exposición a CHIKV cuando se administró por vía IM o ID en una sola dosis. Sin embargo, la administración de ARNm de E2 de CHIKV por vía IM o ID usando dos dosis proporcionó una protección del 100 % después de la exposición a CHIKV.
En todos los experimentos, los ratones de control negativo tenían un ~0 % tasa de supervivencia, al igual que los ratones de control positivo (CHIKV inactivado por calor), que murieron antes de la exposición a CHIKv . Algunos ratones murieron durante el período de vacunación.
Ejemplo 12: Eficacia del candidato a vacuna de ARNm del antígeno C-E3-E2-6K-E1 de Chikungunya (Ejemplo de referencia)
Ratones AG129 (n=5 por grupo) se vacunaron con 2 pg o 10 pg de ARNm formulado con MC-3-LNP que codifica ARNm de CHIKV C-E3-E2-6K-E1 (SEQ ID NO:3). Los ratones AG129 se vacunaron el día 0 o los días 0 y 28 mediante administración IM o ID. El día 56 después de la vacunación final, todos los ratones se expusieron a una dosis letal de CHIKV. La curva de supervivencia, el porcentaje de pérdida de peso y el estado de salud de los ratones vacunados con 2 pg de ARNm de CHIKV C-E3-E2-6K-E1 se muestran en las Figs. 6A-C. Los resultados de supervivencia se tabulan en la Tabla 10 a continuación. La curva de supervivencia, el porcentaje de pérdida de peso y el estado de salud de los ratones vacunados con 10 pg de ARNm de CHIKV C-E3-E2-6K-E1/E2/E3/C se muestran en las Figs. 10A-C. Los resultados de supervivencia se tabulan en la Tabla 11 a continuación.
Tabla 10: Supervivencia de ratones vacunados con ARNm del antígeno Chikungunya C-E3-E2-6K-E1 - 2 pg
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Tabla 11: Supervivencia de ratones vacunados con ARNm del antígeno Chikungunya C-E3-E2-6K-E1 - 10 pg
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Como se muestra en la Tabla 10, la dosis de 2 pg de la vacuna de ARNm de C-E3-E2-6K-E1 proporcionó una protección del 100 % después de la exposición a CHIKV cuando se administró por vía IM en una sola dosis y proporcionó una protección del 80 % después de la exposición a CHIKV cuando se administró vía ID en una sola dosis. La dosis de 2 pg de la vacuna de ARNm C-E3-E2-6K-E1 proporcionó una protección del 100 % después de la exposición al CHIKV cuando se administró por vía IM o ID en dos dosis. Como se muestra en la Tabla 11, la dosis de 10 pg de la vacuna de ARNm C-E3-E2-6K-E1 proporcionó una protección del 100 % después de la exposición a la infección por CHIKV cuando se administró por vía IM o ID en una sola dosis o en dos dosis.
En todos los experimentos, los ratones de control negativo tenían un ~0 % tasa de supervivencia, al igual que los ratones de control positivo (CHIKV inactivado por calor), que murieron antes de la exposición a CHIKv . Algunos ratones murieron durante el período de vacunación.
Ejemplo 13: Resumen de datos de supervivencia usando candidatos a vacuna de ARNm de antígeno Chikungunya CHIKV E1. CHIKV E2 y CHIKV C-E3-E2-6K-E1 (Ejemplo de referencia)
La Tabla 12 muestra los datos de supervivencia de los ratones vacunados con los antígenos de ARNm de CHIKV usados en los estudios informados en los Ejemplos 10-12.
Tabla 12: Resumen de los datos de supervivencia posteriores a la inyección del día 6
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Ejemplo 14: Transfección in vitro de la proteína de la cubierta del virus Chikungunya codificada por ARNm (Ejemplo de referencia)
La transfección in vitro de ARNm que codifica Notch y un control de PBS se realizaron en 150k células HeLa/pocillo transfectado con 1 pg de ARNm 2 pL de LF2000/pocillo en una placa de 24 pocillos. Las proteínas que contenían lisado expresadas a partir de los ARNm de la envoltura de CHIKV transfectadas en células HeLa se recolectaron 16 horas después de la transfección y luego se detectaron mediante transferencia Western con un anticuerpo V5 tag-HRP. La detección exitosa de una proteína de la cubierta de CHIKV se muestra en la Fig. 3.
Ejemplo 15: Detección de inmunidad (ratón I?G) contra proteínas específicas E1 de Chikungunya, específicas E2 de Chikungunyam o específicas E1 y E2 de Chikungunya (Ejemplo de referencia)
Muestras de suero de ratones vacunados con CHIKV E1. Las vacunas E2 o E1-E2-E3-C descritas en los Ejemplos 11-13 se analizaron usando un ELISA semicuantitativo para la detección de IgG de ratón contra proteínas E1 específicas de Chikungunya, E2 específicas de Chikungunya o E1 y E2 específicas de Chikungunya.
Se vacunaron quince grupos de cinco ratones mediante inyección intradérmica (ID) o intramuscular (IM) con 2 pg o 10 pg de la vacuna candidata. Las vacunas se administraron a ratones AG129 en una o dos dosis (la segunda dosis se proporcionó 28 días después de la primera). En el día 56, los ratones se expusieron a 1 x 104 PFU de CHIKV a través de una inyección ID en un volumen de 50 pl y se controlaron durante 10 días para determinar la pérdida de peso, la morbilidad y la mortalidad. Los ratones se sangraron el día 7 y el día 28 después de la vacunación a través del seno periorbitario (sangrado retroorbitario). Además, los ratones que sobrevivieron a la exposición a CHIKV fueron sangrados 10 días después de la exposición.
Se analizó la reactividad de las muestras individuales en un ELISA semicuantitativo para IgG de ratón contra proteínas E1 específicas de Chikungunya, E2 específicas de Chikungunya o E1 y E2 específicas de Chikungunya. Los resultados son visibles en las Figs. 50-52.
Los datos que representan los resultados del ensayo ELISA para identificar la cantidad de anticuerpos producidos en ratones AG129 en respuesta a la vacunación con ARNm que codifica la proteína estructural CHIKV E1 secretada, la proteína estructural CHIKV E2 secretada o la poliproteína estructural completa CHIKV C-E3-E2-6k-E1 a una dosis de 10 pg o 2 pg 28 días después de la inmunización se muestra en las Figs. 50­ 51. Los 10 pg de ARNm que codifica la poliproteína CHIKV produjeron niveles significativos de anticuerpos en ambos estudios. Los datos que representan una comparación de los títulos ELISA de los datos de la Fig. 50 con la supervivencia en los datos del panel izquierdo de la Fig. 51 se muestran en la Fig. 52. Como se muestra en los resultados de supervivencia, los animales vacunados con cualquier dosis (administración única o doble) de ARNm que codifica la poliproteína CHIKV tuvieron tasas de supervivencia del 100 %.
Ejemplo 16: Eficacia del candidato a vacuna de ARNm de poliproteína de Chikungunya (C-E3-E2-6K-E1) (Ejemplo de referencia)
Ratones AG129 (n=5 por grupo) se vacunaron con 10 pg, 2 pg o 0.4 pg de poliproteína CHIKV codificada por ARNm formulada con MC-3-Ln P (C-E3-E2-6K-E1) (SEQ ID NO: 13). Los ratones se vacunaron el día 0 o los días 0 y 28 mediante administración IM. En un estudio, todos los ratones fueron expuestos el día 56 con una dosis letal de CHIKV luego de la vacunación final. En otro estudio, todos los ratones fueron expuestos el día 84 con una dosis letal de CHIKV luego de la vacunación final. La curva de supervivencia, el porcentaje de pérdida de peso y el estado de salud de los ratones vacunados con 10 pg, 2 pg o 0,4 pg de ARNm se determinaron como se describe previamente en los Ejemplos 10-12. Se evaluaron las tasas de supervivencia, los anticuerpos neutralizantes y los anticuerpos de unión. También se identificaron anticuerpos neutralizantes contra tres cepas diferentes de CHIKV.
Las tasas de supervivencia de los ratones vacunados con ARNm que codifica CHIKV C-E3-E2-6k-E1 se muestran en la Fig. 53. Los datos muestran la vacunación a una dosis de 10 pg (paneles de la izquierda), 2 pg (paneles del medio) o 0.4 pg (paneles de la derecha) a los 56 días (paneles superiores) o 112 días (paneles inferiores) después de la inmunización. Estos datos demuestran que una sola dosis de 2 pg de la vacuna de ARNm proporcionó una protección del 100 % durante al menos 112 días (16 semanas). Después de 5 estudios adicionales, los datos demostraron que una sola dosis de 2 pg de la vacuna de ARNm proporcionó una protección del 100 % protección durante al menos 140 días (20 semanas).
El anticuerpo neutralizante y el anticuerpo de unión producidos en ratones tratados se muestran en las Figs.
54 y 55 respectivamente. Como puede verse en las Figs. 54 y 55, los niveles de Ab neutralizantes fueron dependientes de la dosis y el régimen con los títulos más altos evidentes con 10 pg dosificados dos veces (días 0 y 28). Se utilizaron pruebas de neutralización por reducción de placas (PRNT50 y PRNT80) para cuantificar el título de anticuerpos neutralizantes para el virus. El anticuerpo de unión a antígeno se determinó mediante ELISA. La correlación correspondiente entre el Ab de unión y los anticuerpos neutralizantes se muestra en los paneles inferiores de la Fig. 55. Después del estudio de 16 semanas, se demostró que los títulos de E1 más altos se lograron cuando se administraron dos dosis de 10 pg de vacuna de ARNm.
Los datos que representan anticuerpos neutralizantes contra tres cepas diferentes de CHIKV se muestran en la Fig. 56. Los anticuerpos neutralizantes se probaron contra tres cepas diferentes de CHIKV, África-Senegal (panel izquierdo), La Reunión (panel central) y CDC CAR (panel derecho). La Fig. 56 muestra que la vacuna de ARNm que codifica poliproteína provocó anticuerpos ampliamente neutralizantes contra las tres cepas ensayadas. Los sueros se probaron adicionalmente contra la cepa Chik S27 (virus Chikungunya (cepa S27-prototipo africano). Los datos que representan anticuerpos neutralizantes contra la cepa CHIKV S27 se muestran en la Fig. 57. Estos datos muestran colectivamente que la poliproteína que codifica la vacuna de ARNm provocó anticuerpos ampliamente neutralizantes contra las cuatro cepas probadas. La vacuna indujo anticuerpos neutralizantes contra múltiples cepas de Chikungunya. La preparación y el refuerzo con la dosis de 10 pg produjeron la respuesta de anticuerpos neutralizantes más sólida, seguida de la dosis única con 10 pg.
Ejemplo 17: Transfección de proteínas estructurales de CHIKV codificadas con ARNm: (Ejemplo de referencia)
La transfección in vitro de ARNm que codifica proteínas estructurales de CHIKV y el control de PBS se realizaron en células HeLa de 400 k transfectadas con 1.25 ug de ARNm lipoplexado con 5 ul de LF2000/pocillo en una placa de 6 pocillos. Se midió la detección de proteínas en el lisado de células HeLa 16 horas después de la transfección. Los lisados que contienen proteínas expresadas a partir de los ARNm de CHIKV transfectados en HeLa se recogieron 16 horas después de la transfección. Las proteínas se detectaron por WB con anticuerpos anti Flag o V5.
La Fig. 12 muestra los resultados del ensayo. Proteínas estructurales de CHIKV codificadas por ARNm. Se detectó la producción de proteínas en el lisado de células HeLa 16 horas después de la transfección.
Ejemplo 18: Secuencias ejemplares de dengue: (Ejemplo de referencia)
Las siguientes son secuencias de ácido nucleico (SEQ ID NO: 16, 18, 20 y 22) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 15, 17, 19 y 21) para cada uno de DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4.
Tabla 13. Secuencias de polinucleótidos y secuencias de aminoácidos de DENV
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Ejemplo 19: Inmunogenicidad de la vacuna de ARN del virus del dengue en ratones (Ejemplo de referencia)
Este estudio proporciona un análisis preliminar de la inmunogenicidad de una vacuna de ARNm de ácido nucleico utilizando un antígeno del serotipo 2 del virus del dengue (DENV) en ratones BALB/c. El estudio utiliza 44 grupos de 10 ratones BALB/c hembras (5) y machos (5) (440 en total, 6-8 semanas de edad al inicio del estudio, véase la Tabla 10 para el resumen del diseño). En este estudio, los números de constructo utilizados se referencian y se encuentran en la Tabla 14.
Tabla 14. Polinucleótidos del antígeno del dengue
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Las secuencias se muestran a continuación:
Tabla 15.
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Los ratones se vacunaron en las semanas 0 y 3 por vía intramuscular (IM) o intradérmica (ID). Un grupo permaneció sin vacunar y a uno se administraron 105 conjuntos formadores de placas (PFU) DENV2 D2Y98P vivas, mediante inyección intravenosa (IV) aislada como control positivo. Se recogió suero de cada ratón en las semanas 1, 3 y 5; las hemorragias en las semanas 1 y 3 fueron muestras en vida (hemorragias en la vena de la cola o submandibulares) y en la semana 5 será una hemorragia terminal (intracardíaca). Muestras de suero individuales se almacenaron a -80 °C hasta su análisis mediante ensayo de neutralización o microneutralización. Las muestras reunidas de cada grupo en los puntos temporales de la semana 5 se analizaron mediante Western blot para determinar la reactividad con el lisado viral.
Tabla 16. Diseño experimental detallado (tratamiento, lecturas)
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La señal se detectó en los grupos 5, 15, 39 y 44 (control de virus vivos) por una banda que apareció entre 50 y 60 kDa en los datos del Western blot. Los datos sugieren que una vacuna de ARNm para un solo antígeno viral del dengue puede producir anticuerpos en estudios preliminares.
Con el fin de proporcionar una vacuna contra el dengue que tenga una inmunogenicidad mejorada, se diseñaron y probaron vacunas de ARN para antígenos concateméricos de acuerdo con la divulgación. Estas vacunas, que tienen una actividad significativamente mejorada, en comparación con los antígenos proteicos únicos descritos en el presente documento, se describen a continuación.
Ejemplo 20: predicción in silico de epítopos de células T para el diseño de vacunas de ARN (Ejemplo de referencia)
Se generaron y analizaron varios epítopos peptídicos del virus del dengue para determinar su actividad antigénica. Los epítopos peptídicos están diseñados para maximizar la presentación de MHC. En general, el proceso de presentación de MHC de clase I es bastante ineficaz, y en realidad solo se presenta 1 péptido de 10,000 moléculas degradadas. Además, el cebado de células T CD8 con APC que tienen densidades de superficie insuficientes péptido/MHC los complejos de clase I dan como resultado respondedores débiles que exhiben una secreción de citoquinas alterada y una reserva de memoria disminuida. Por lo tanto, el proceso de diseño de epítopos peptídicos altamente efectivos es importante para la inmunogenicidad de la vacuna definitiva.
La predicción in silico de los epítopos peptídicos deseables se realizó utilizando la base de datos de epítopos inmunes. Utilizando esta base de datos, se predijeron varios epítopos inmunogénicos de células T del dengue que mostraban una fuerte homología en los 4 serotipos del dengue. Los ejemplos de estos epítopos se muestran en las Figs. 16A-16C y 17A-17C.
Ejemplo 21: Predicción de epítopos de células T para el diseño de vacunas de ARN (Ejemplo de referencia)
El diseño de sistemas de vacunación optimizados para prevenir o tratar afecciones que no han respondido a tratamientos más tradicionales o estrategias de vacunación temprana se basa en la identificación de los antígenos o epítopos que desempeñan un papel en estas afecciones y a los que el sistema inmunitario puede dirigirse con eficacia. Los epítopos de células T (por ejemplo, unión de péptido MHC) para los diversos alelos que se muestran en la Tabla 17 se determinaron utilizando el Sistema de descubrimiento rápido de epítopos (ProImmune REVEAL &ProVE®). Este sistema se usa para identificar aquellos epítopos candidatos que realmente causan respuestas inmunitarias relevantes de los numerosos otros candidatos potenciales identificados usando algoritmos para predecir la unión del péptido MHC. El ensayo de unión REVEAL determina la capacidad de cada péptido candidato para unirse a uno o más alelos de clase MHC I y estabilizar el complejo MHC-péptido. El ensayo identifica los péptidos inmunogénicos más probables en una secuencia de proteína comparando la unión con la de un epítopo de células T de alta afinidad y detectando la presencia o ausencia de la conformación nativa del complejo MHC-péptido. Los péptidos epitópicos se analizan adicionalmente utilizando los ensayos descritos en el presente documento para confirmar su actividad inmunogénica.
Tabla 17: Alelos probados
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Tabla 18; Datos del ensayo de unión de Prolmmune REVEAL® para A*01:01
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Tabla 19. Datos del ensayo de unión ProImmune REVEAL® para A*02:01
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Tabla 20. Datos del ensayo de unión ProImmune REVEAL® para A*03:01
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Tabla 21. Datos del ensayo de unión ProImmune REVEAL® para A*11:01
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Tabla 22. Datos del ensayo de unión ProImmune REVEAL® para A*24:02
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Tabla 23, datos del ensayo de unión ProImmune REVEAL® para B*07:02
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Tabla 24. Datos del ensayo de unión ProImmune REVEAL® para B*27:05
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Tabla 25. Datos del ensayo de unión Prolmmune REVEAL® para H-2Kb
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Ejemplo 22: Prueba de actividad para epítopos peptídicos previstos (ejemplo de referencia)
Los epítopos peptídicos ejemplares seleccionados utilizando los métodos descritos anteriormente se caracterizaron adicionalmente. Se confirmó que estos epítopos peptídicos tenían actividad utilizando ensayos de unión a HLA in vitro (ensayos de unión a linfocitos humanos). Los péptidos (péptidos de 9 aa del antígeno del dengue) se exploraron en cuanto a su capacidad para unirse a HLA. El análisis de la homología, afinidad, frecuencia y diseño de estos péptidos se muestra en las Figs. 16A-16C y 17A-17C.
Ejemplo 23: Análisis in vivo de mimectopos de vacunas de ARN de epítopos humanos predichos (Ejemplo de referencia)
Métodos
IFNy ELISpot. Los ensayos ELISpot de IFNy de ratón se realizaron utilizando placas Millipore IP Opaque recubiertas con IFNy de acuerdo con las directrices del fabricante paralFNYELISPOT de ratón. Brevemente, las placas se bloquearon utilizando RPMI completo (R10) y se incubaron durante 30 minutos antes de sembrar las células. Los péptidos (284-292, 408-419 o 540-548) se diluyeron en 5 concentraciones diferentes para la estimulación a 5, -6, -7, -8 o -9 a partir de una concentración madre original de 10 mM (-2). Los esplenocitos de ratón (200,000-250,000 células) se sembraron en pocillos apropiados con péptido, PMA Medios de ionomicina o R10 solos. Las células se estimularon en un volumen total de 125 pl por pocillo. A continuación, las placas se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 18-24 horas. Las placas se desarrollaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las placas se contaron y controlaron la calidad utilizando el lector ELISPOT automatizado CTL ImmunoSpot/FluoroSpot.
Tinción de citoquinas intracelulares (ICS). Tinción de citocinas intracelulares (ICS) Para la tinción de citoquinas intracelulares, los esplenocitos individuales se resuspendieron a una concentración de 1.5 x 106 células por ml. Los péptidos (284-292, 408-419 o 540-548) se prepararon en 5 diluciones a partir de una concentración madre de 10 mM (-2). Las concentraciones finales de cada péptido fueron -5, -6, -7, -8 o -9 en sus respectivos pocillos. Las células se estimularon en un volumen final de 200 ul en una placa de cultivo de 96 pocillos. Después de añadir el tapón de Golgi (0.2 uL por pocillo), las células se incubaron a 37 °C, 5 % CO2 durante 5 horas. Después de la estimulación, las células se tiñeron en la superficie, se fijaron, se lavaron y se pusieron a 4oC durante la noche. La tinción intracelular se realizó al día siguiente, lo que resultó en un panel completo de Live/Dead (Invitrogen), aCD3, aCD4, aCD8, aCD45, aCCR7, aCD44, aCD25, aIL-2, alFNY y aTNFa (BD Biosciences). Las células se adquirieron en una placa inferior de 96 U usando BD LSR Fortessa HTS (BD Biosciences).
Resultados
Los epítopos peptídicos ejemplares seleccionados usando los métodos descritos en el presente documento se usaron para producir ensayos mimectopos de ratón de los epítopos humanos predichos. Se analizó la actividad in vivo de estos mimectopos utilizando ensayos de reestimulación durante la fase aguda de la infección por dengue (Día 7). Los métodos se realizaron en infectados con dengue IFNap/Y-receptor-deficient ratones (AG129). Siete días después de la infección, se recolectaron los esplenocitos y se sometieron a un ensayo ELISPOT para cuantificar la secreción de citoquinas por las células T (CD8) como se describe anteriormente. Brevemente, los esplenocitos aislados se estimularon con los péptidos de prueba y se ensayaron para la activación de células T. Si el péptido es un antígeno apropiado, algunas células estarían presentes en el antígeno durante la infección y serían capaces de estimular las células T. Los métodos para analizar la activación de las células T se realizaron de la siguiente manera:
• Las células T (a una concentración conocida) se incubaron con un antígeno específico en un pocillo de cultivo celular
• Las células T activadas se transfirieron a placas ELISPOT (recubiertas previamente con anticuerpo anti-citocina)
• Las células se incubaron de manera que se pudieran secretar citoquinas
• Las células se lavaron de la placa y se añadió Ig secundaria acoplada a enzima
• Se lavaron las placas y se añadió sustrato
• Los puntos positivos se puntuaron al microscopio.
Los datos se muestran en las Figs. 18-19. Las Figs. 18 y 19 son gráficos que representan los resultados de un ensayo ELISPOT de péptidos específicos del dengue que miden IFN-y (manchas por millón de esplenocitos). Un esquema de un ensayo en un modelo de ratón BLT (Médula ósea/Hígado/Timo) se muestra en la Fig. 20. Los resultados de un análisis de histograma de células T CD8 humanas estimuladas con epítopo peptídico también se muestran en la Fig. 20.
Las siguientes dos secuencias se utilizaron como controles:
(V5)8-cathb: Kozak start GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST
Stop (SEQIDNO:35)
(v5)8-cathb MHCi: Kozak Start GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST-GFLG-GKPIPNPLLGLDST
Stop (SEQIDNO:36)
Algunos resultados se muestran en la Tabla 26:
Tabla 26: Resultados
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Ejemplo 24: exposición de ratón AG129 de mimectonas de epítopos humanos previstos de DENV2 (ejemplo de referencia)
Se realiza un estudio en ratones AG129 utilizando un cóctel de 2 epítopos peptídicos. La inmunogenicidad de los epítopos peptídicos se determina en ratones AG129 frente a la exposición con una dosis letal de la cepa D2Y98P de De NV 2 adaptada a ratón. Ratones AG129, que carecen de señalización de los receptores iFn a/p y y, inyectados por vía intradérmica en la almohadilla plantar con 104 PFU de DENV no sobreviven más allá del día 5 después de la inyección. Los ratones AG129 se vacunan mediante inyección intramuscular (IM) con 2 gg o 10 gg de un cóctel de 2 epítopos peptídicos. Las vacunas se administran a ratones AG129 con un cebado y un refuerzo (día 0 y día 28). El grupo de control positivo se vacuna con DENV 2 inactivado por calor. Se usa solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control negativo. En el día 56, los ratones se exponen a DENV 2 adaptado a ratón y se controlan durante 10 días para determinar la pérdida de peso, la morbilidad y la mortalidad. Los ratones que mostraron una enfermedad grave, definida como >30 % pérdida de peso, una puntuación de salud de 6 o más, letargo extremo, y/o parálisis fueron sacrificados.
Ejemplo 25: Estudio de inmunogenicidad en ratones de péptidos DENV "humanizados " (Ejemplo de referencia)
Se realiza un estudio que analiza la inmunogenicidad de los epítopos peptídicos en ratones humanizados. Un cóctel de dosis única (30 gg) que contiene 3 epítopos peptídicos diferentes se administra por vía IM de inmunización con cebado y refuerzo (día 0, día 28). Una caracterización de células T (ELISPOT e ICS) se puede realizar el Día 7, el Día 28 y el Día 56.
Ejemplo 26: Prueba de mimectopos de primates no humanos (NHP) de Epítopos humanos DENV previstos (Ejemplo de referencia)
También se pueden desarrollar mimectopos de primates no humanos (NHP) para los epítopos humanos y probar su actividad en ensayos de NHP. Los mimectopos NHP están diseñados con base en la secuencia del antígeno humano. Se puede analizar la actividad in vivo de estos mimectopos en un modelo de NHP utilizando, por ejemplo, ensayos de reestimulación. Una vez que los NHP han sido infectados, las células inmunitarias pueden aislarse y analizarse para detectar la sensibilidad de activación por los mimectopos particulares.
Ejemplo 27: Direccionamiento de constructos concateméricos de DENV utilizando el dominio citoplasmático de MHC I. (Ejemplos de referencia)
Se desarrollaron constructos de concatémero MHC-1_V5 y se transfectaron en células HeLa. Se realizó inmunofluorescencia triple utilizando Mitotracker Red (mitocondrias), anticuerpos anti-V5 y anti-MHC-1 más DAPI. Los datos se muestran en las Figs. 21-23. La Fig. 21 muestra la transfección del concatémero MHC-1_V5 en células HeLa. Las flechas indican la colocalización de V5-MHC1 (abajo a la derecha). La Fig. 22 muestra MHC-1_Y5 transfección de concatémeros. Las flechas indican regiones donde V5 colocaliza preferentemente con MHC 1 y no con Mitotracker. La Fig. 23 muestra la transfección del concatémero V5 en células HeLa. V5 tiene una distribución citoplasmática homogénea que colocaliza preferentemente con MHC1 y no con Mitotracker. Estos datos demuestran que el concatemero V5 con el dominio citoplasmatico del MHC clase I se colocaliza con la expresión del MHC clase I (Fig. 21), mientras que el concatemero V5 sin esta secuencia solo se encuentra en el citoplasma (Fig. 23) después de la transfección en células HeLa.
Ejemplo 28: Análisis in vivo de constructo de epítopo de ARNm concatemérico de DENV (Ejemplo de referencia)
Los concatémeros de dengue utilizados en este estudio consisten en 8 repeticiones del péptido TALGATEI (SEQ ID NO: 299), un epítopo de células T CD8 de ratón que se encuentra en la envoltura de DENV2. Las repeticiones peptídicas se unieron a través de sitios de escisión de catepsina B y se modificaron con las diversas secuencias de la siguiente manera:
(1) concatémero peptídico TALGATEI (SEQ ID NO: 299) sin modificación
(2) concatémero peptídico TALGATEI (SEQ ID NO: 299) con péptido señal IgKappa
(3) concatémero peptídico TALGATEI (SEQ ID NO: 299) con secuencia PEST
(4) concatémero peptídico TALGATEI (SEQ ID NO: 299) con péptido señal IgKappa y secuencia PEST
(5) concatémero peptídico TALGATEI (SEQ ID NO: 299) con dominio citoplásmico MHC de clase I
(6) concatémero peptídico TALGATEI (SEQ ID NO: 299) con péptido señal IgKappa y dominio citoplásmico MHC clase I
(7) DENV2 inactivado por calor (D2Y98P)
(8) Sin inmunización
La inmunogenicidad de las vacunas candidatas concateméricas peptídicas se determinó en ratones AG129 frente a la exposición con una dosis letal de la cepa D2Y98P de DENV. Ratones AG129, que carecen de señalización de los receptores IFN a/p y y, inyectados por vía intradérmica en la almohadilla plantar con 104 PFU de DENV no sobreviven más allá del día 5 después de la inyección. (En este estudio, los ratones murieron debido a un problema con la atenuación del calor). Las vacunas ensayadas incluían los constructor (1) -(8) descritos anteriormente. Se vacunaron ratones AG129 mediante inyección intramuscular (IM) con 2 pg o 10 pg de la vacuna candidata. Las vacunas se administraron a ratones AG129 como cebado y refuerzo (la segunda dosis se administró 28 días después de la primera). El grupo de control positivo se vacuna con DENV 2 inactivado por calor. Se usa solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control negativo.
En el día 56, los ratones se exponen a DENV 2 adaptado a ratón y se controlan durante 10 días para determinar la pérdida de peso, la morbilidad y la mortalidad. Los ratones que mostraban una enfermedad grave, definida como >30 % pérdida de peso, una puntuación de salud de 6 o más, letargo extremo, y/o parálisis fueron sacrificados. En particular, los ratones "vacunados" con DENV inactivado por calor (grupo de control positivo) se volvieron mórbidos y murieron (no se incluyeron en la porción de exposición del estudio).
Además, se recogieron muestras de suero individuales antes de la exposición el día 54 y se aislaron y congelaron las PBMC para las pruebas posteriores.
Las PBMC de ratones AG129 se descongelaron y estimularon con el péptido TALGATEI (SEQ ID NO: 299) durante 5 horas en un ensayo de citocina intracelular estándar. Para la tinción de citoquinas intracelulares, las PBMC se descongelaron y se suspendieron en medios. Se administró el péptido TALGATEI (SEQ ID NO: 299) para estimular las células. Después de la adición del tapón de Golgi, las células se incubaron a 37oC, CO2 al 5 % durante 5 horas. Después de la estimulación, las células se tiñeron en la superficie, se fijaron, se lavaron y se pusieron a 4oC durante la noche. La tinción intracelular se realizó al día siguiente y se analizó mediante el ensayo ELISPOT para cuantificar la secreción de citoquinas por las células T (CD8) como se describe anteriormente para determinar la activación de las células T. Si el péptido es un antígeno apropiado, algunas células estarían presentes en el antígeno durante la infección y serían capaces de estimular las células T. Los resultados se muestran en las Fig. 24A y 24B, que demuestran que cada uno de los péptidos (1) -(6) estimula la activación de las células T.
Ejemplo 29: Polipéptidos ejemplares de CHIKV (Ejemplo de referencia)
Los aminoácidos presentados en la Tabla 27 son polipéptidos antigénicos CHIKV ejemplares. En la medida en que cualquier péptido antigénico ejemplar descrito en el presente documento incluya una etiqueta indicadora o V5, o un polinucleótido codifique una etiqueta indicadora o V5, el experto en la técnica entiende que dicha etiqueta indicadora o V5 está excluida del polinucleótido antigénico en una formulación de vacuna. Por lo tanto, cualquiera de los polinucleótidos que codifican proteínas descritos en el presente documento se incluyen dentro de las composiciones de la divulgación sin la etiqueta indicadora o la secuencia V5.
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Ejemplo 30. Vacunas ZIKV
El diseño de constructos preferidos de ARNm de la vacuna contra el Zika de la invención codifica proteínas prME del virus del Zika destinadas a producir una inmunogenicidad significativa. El marco de lectura abierto comprende un péptido señal (para optimizar la expresión en el retículo endoplásmico) seguido de la secuencia de la poliproteína prME del Zika. La secuencia particular de prME utilizada es de una cepa de Micronesia (2007) que representa más fielmente un consenso de prME de cepas contemporáneas. Este constructo tiene una identidad de secuencia prME del 99 % con los aislamientos brasileños actuales.
Dentro de la familia Zika, existe un alto nivel de homología dentro de la secuencia prME (>90 %) a través de todas las cepas aisladas hasta ahora (Véase la Tabla 28 a continuación). El alto grado de homología también se conserva cuando se comparan los aislamientos originales de 1947 con las cepas más contemporáneas que circulan en Brasil en 2015, lo que sugiere que se está produciendo una "deriva" de los aislamientos originales. Además, las preparaciones de virus atenuados han proporcionado inmunización cruzada con todas las demás cepas probadas, incluyendo las de América Latina/Asia y África.
En general, estos datos sugieren que la protección cruzada de todas las cepas de Zika es posible con una vacuna con base en prME.
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Tabla 28: Homología prME del virus del Zika
De hecho, el prM/M y las proteínas E del ZIKV tienen un nivel muy alto (99 %) de conservación de secuencias entre las cepas virales asiáticas y brasileñas actualmente en circulación. El alineamiento de secuencias de prM/M y las proteínas E se muestran en la Fig. 27.
Las proteínas M y E están en la superficie de la partícula viral. Los anticuerpos neutralizantes se unen predominantemente a la proteína E, la proteína preM/M funciona como acompañante para el plegamiento adecuado de la proteína E y previene la fusión prematura de la proteína E dentro de los compartimentos ácidos a lo largo de la vía secretora celular.
En el presente documento se describen ejemplos de diseños de vacunas contra el ZIKV que comprenden ARNm que codifica tanto prM/M y proteínas E o proteína E sola (Figs. 26A y 26B). La Fig. 26a representa el ARNm que codifica un péptido señal artificial fusionado con la proteína prM fusionada con la proteína E. La Fig. 2B representa el ARNm que codifica un péptido señal artificial fusionado con la proteína E.
Las constructos de vacunas ZIKV pueden codificar las proteínas prME o E de diferentes cepas, por ejemplo, Brasil_aislado_ZikaSPH2015 o ACD75819_Micronesia, que tiene un péptido señal fusionado con los extremos N de la(s) proteína(s) antigénica(s). En este ejemplo, las vacunas ZIKV comprenden ARNm que codifican polipéptidos antigénicos que tienen secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 50-59. Los ejemplos no pretenden ser limitativos.
Ejemplo 31. Expresión de la proteína prME de ZIKV en células de mamífero utilizando una constructo de vacuna de ARNm de ZIKV
El constructo de la vacuna de ARNm de ZIKV prME se analizó en células de mamífero (células 239T) para determinar la expresión de la proteína ZIKV prME. Las células 293T se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con 2 pg de ARNm de ZIKV prME utilizando un reactivo de transfección de lipofectamina. Las células se incubaron para la expresión de las proteínas prME de ZIKV antes de lisarlas en un tampón de inmunoprecipitación que contenía cócteles de inhibidores de proteasa. No se añadió agente reductor al tampón de lisis para garantizar que las proteínas celulares no se encontraran en un estado reducido. Los lisados celulares se centrifugaron a 8,000 xg durante 20 minutos para recoger el precipitado de células lisadas. A continuación, los precipitados celulares se tiñeron con suero humano anti-ZIKV y Alexa Fluor 647 anti-humano de cabra. Se detectó fluorescencia como una indicación de la expresión de prME (Fig. 28).
La expresión de la proteína ZIKV prME también se detectó mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando un citómetro de flujo. Células 293F (2 * 106 células/ml, 30 ml) se transfectaron con 120 |jg de PEI, 1 ml de NaCl 150 mM y 60 |jg de ARNm de prME. Las células transfectadas se incubaron durante 48 horas a 37 °C en un agitador a 130 rpm y bajo 5 % CO2 A continuación, las células se lavaron con tampón PBS que contenía 2 % FBS y fijado en un tampón de fijación (tampón PBS que contiene formalina) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se permeabilizaron en un tampón de permeabilización (PBS 1 % Tritón X100 1 j l de Golgi plug/ml de células). A continuación, las células permeabilizadas se tiñeron con suero humano anti-ZIKV. (1:20 dilución) y anticuerpo secundario de cabra antihumano Alexa Fluor 647, antes de clasificarlos en un citómetro de flujo. Como se muestra en la Fig. 29, la Fig. 30A y la Fig. 30B, las células transfectadas con ARNm de prME y teñidas con suero humano anti-ZIKA cambiaron a una intensidad fluorescente más alta, lo que indica que la prME se expresó a partir de constructos de vacunas de ARNm de ZIKV en las células transfectadas.
Ejemplo 32. Expresión, purificación y caracterización de VLP de Zika
Las VLP se prepararon en células HeLa y en células HEK293t y se purificaron mediante precipitación con PEG o ultracentrifugación, respectivamente. Las células se cultivaron en medios de cultivo. Antes de la transfección, las células se pasaron dos veces en medios de cultivo de virus 10 %FBS a la adaptación mediática.
Las células se sembraron el día antes de la transfección en un matraz T-175. Se transfectaron 100 ug de ARNm codificante de prME utilizando 100 ug pf de lipofectamina según el protocolo del fabricante. 6 horas después de la transfección, las monocapas se lavaron dos veces con PBS 1X y se añadieron 20 mL de medio de cultivo de virus. El sobrenadante se recogió 24-48 horas después de la transfección mediante centrifugación a 2000xg durante 10 minutos y filtración de 0.22 jm .
Para la purificación de VLP mediante precipitación con PEG, las VLP se concentraron utilizando el kit de precipitación con PEG de Biovision según el protocolo del fabricante. En resumen, el sobrenadante con VLP se mezcló con PEG8000 y se incubó a 4 °C durante 16 horas. Después de la incubación, la mezcla se centrifugó a 3000 xg durante 30 minutos. Se recogieron sedimentos que contenían VLP concentradas y se suspendieron en PBS. Las VLP se intercambiaron adicionalmente en p Bs (1:500) usando el filtro amicon ultra 100MWCO. Las muestras purificadas se tiñeron negativamente (Fig. 32).
Se demostró que la expresión de prME a partir de los constructos de ARNm de la vacuna de la invención da como resultado la producción de partículas similares a virus (VLP) que se espera que se presenten al sistema inmunitario como idénticas a las partículas del virus del Zika. La Fig. 32 muestra micrografías electrónicas con tinción negativa de sobrenadantes de células HeLa transfectadas con ARNm que codifica Zika prME. Las partículas similares a virus (VLP), purificadas por precipitación con PEG, tienen un tamaño (-35-40 nm) y una morfología muy uniformes. La apariencia rugosa de la superficie de la VLP parece reflejar una morfología principalmente inmadura debido a la expresión de las células HeLa, que tienen una expresión muy baja de furina, una proteasa del huésped que se requiere para la maduración de la envoltura viral. Al madurar, estas VLP tendrán una estructura exterior esencialmente idéntica a las partículas virales de tipo silvestre, lo que provocará una amplia respuesta inmunitaria a la futura exposición al virus del Zika.
Para la purificación de VLP mediante ultracentrifugación, se transfectaron células 293T con ARNm de prME de Zika como se describe en el presente documento. El sobrenadante se recogió 24 horas después de cambiar los medios como se describe en este documento. (30 horas después de la transfección) las VLP se concentraron utilizando el kit de precipitación de virus Biovision PEG en un volumen de 500 jl. Las VLP se purificaron adicionalmente usando un gradiente de sacarosa al 10-50 %. La capa de muestra se vio entre 20­ 30 % de capas de sacarosa y se recogió. Las VLP fueron intercambiados en PBS por 1:1000 dilución usando un ultrafiltro amicon 100MWCO. Las VLP concentradas después de la precipitación con PEG y las VLP purificadas por ultracentrifugación se analizaron en un gel SDS-PAGE reductor para determinar la pureza (Fig. 33).
Ejemplo 33: Estudios de inmunogenicidad
Estudio A
El presente estudio fue diseñado para probar la inmunogenicidad en ratones Balb/c de vacunas candidatas contra ZIKV que comprenden un polinucleótido de ARNm que codifica ZIKV prME. Cuatro grupos de Balb/c ratones (n=5) fueron inmunizados por vía intramuscular (IM) con 10 jg (n=2) o 2 jg (n=2) de la vacuna candidata. A un grupo de ratones se le administró PBS por vía intramuscular como control. A todos los ratones se les administró una dosis inicial de vacuna (Grupos 1-4) o PBS (Grupo 5) el Día 0, y luego a los ratones de los Grupos 1 y 3 se les administró una dosis de refuerzo el Día 21, mientras que a los ratones del Grupo 5 se les administró PBS el día 21 Todos los ratones se sangraron el día 41. Véase Tabla 29. El título de IgG de neutralización anti-Zika se determinó el día -1, el día 28 y el día 41 (Fig. 33B).
Tabla 29. Estudio de inmunogenicidad de la vacuna de ARNm de ZIKV
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Los títulos de neutralización del día 42 alcanzaron EC50 de 427 para 2 pg y 690 para 10 pg. El suero de control en este experimento procedía de ratones inmunocomprometidos infectados de forma natural. (Ifnarl derivado de B/6 linaje) en el que se lograrían altas cargas virales.
Estudio B
El presente estudio está diseñado para probar la inmunogenicidad en ratones de vacunas candidatas contra el ZIKV que comprenden un polinucleótido de ARNm que codifica la poliproteína del ZIKV. Los ratones se inmunizan por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID) con vacunas candidatas. Se administra un total de cuatro inmunizaciones en intervalos de 3 semanas (es decir, a las semanas 0, 3, 6 y 9) y se recolecta el suero luego de cada inmunización hasta las semanas 33-51. Los títulos de anticuerpos séricos contra la poliproteína ZIKV se determinan mediante ELISA.
Ejemplo 34: Exposición de roedores ZIKV
Estudio A
El presente estudio se diseñó para probar la eficacia en ratones AG129 de las vacunas candidatas contra el ZIKV frente a una exposición letal utilizando una vacuna contra el ZIKV que comprende ARNm que codifica ZIKV prME. Cuatro grupos de ratones AG129 (n=8) se inmunizaron por vía intramuscular (IM) con 10 pg (n=2) o 2 pg (n=2) de la vacuna candidata. A un grupo de ratones se le administró PBS por vía intramuscular como control. A todos los ratones se les administró una dosis inicial de vacuna (Grupos 1 -4) o PBS (Grupo 5) el Día 0, y luego a los ratones de los Grupos 1 y 3 se les administró una dosis de refuerzo el Día 21, mientras que a los ratones del Grupo 5 se les administró PBS el día 21. Todos los ratones fueron expuestos con una dosis letal de ZIKV en el día 42. A continuación, se controló la supervivencia y la pérdida de peso de todos los ratones. El título de IgG de neutralización anti-Zika se determinó el día -1, el día 28 y el día 41, y la carga viral se determinó 5 días después de la exposición.
Tabla 30. Exposición a ZIKV In vivo
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Estudio B
El presente estudio está diseñado para probar la eficacia en ratones AG129 de las vacunas candidatas contra el ZIKV frente a una exposición letal utilizando una vacuna contra el ZIKV que comprende ARNm que codifica la poliproteína del ZIKV. Los animales son expuestos con una dosis letal del ZIKV. Los animales se inmunizan por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID) en la semana 0 y la semana 3 con vacunas candidatas contra ZIKV con y sin adyuvante. Luego, los animales se exponen a una dosis letal de ZIKV en la semana 7 por vía IV, IM o ID. El punto final fue el día 13 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis. Se evaluó la temperatura corporal y el peso, y se registraron todos los días.
En experimentos en los que se utiliza una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP), la formulación puede incluir un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido p Eg y un lípido estructural en proporciones de 50:10:1,5:38,5. El lípido catiónico es DLin-KC2-DMA o DLin-MC3-DMA (50 mol %), el lípido no catiónico es DSPC (10 mol %), el lípido PEG es PEG-DOMG o PEG-DMG (1,5 mol %) y el lípido estructural es colesterol (38,5 mol %), por ejemplo.
Tabla 31. Secuencias de ácido nucleico ZIKV
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Tabla 32. Secuencias de aminoácidos de ZIKV
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Tabla 33. Números de acceso ZIKV NCBI (secuencias de aminoácidos)
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Ejemplo 35: Antígenos prME de DENV2 expresados en superficie (Ejemplo de referencia)
Las secuencias del antígeno del polipéptido prME de DENV2 proporcionadas en la Tabla 34 se analizaron para confirmar que el antígeno de la proteína prME de DENV se traduce, se pliega correctamente y se expresa en la superficie de las células. Para las secuencias polipeptídicas, la secuencia en negrita es la secuencia señal del dengue, la secuencia subrayada es la secuencia de la membrana precursora del DENV2 y la secuencia sin marcar es la secuencia de la cubierta del DENV2. Las secuencias que codifican los polipéptidos tienen codones optimizados. Las células HeLa se transfectaron con ADN que codifica las prME de nueve aislamientos diferentes de Dengue 2. Después de 24 horas, se detectó la expresión superficial de la prME utilizando tres anticuerpos diferentes seguidos de un anticuerpo secundario AF700 antihumano de cabra y sometiendo las células a análisis FACS. Cada uno de los tres anticuerpos son anticuerpos prME ampliamente neutralizantes de DENV2 que tienen eficacia in vivo contra el virus del dengue. D88 se une a DIII de la proteína envolvente para los 4 serotipos de dengue (US20150225474). 2D22 se une a DIII de la proteína envolvente para el serotipo Dengue 2. 5J7 se une a 3 dominios de la proteína envolvente para el serotipo Dengue 3. La Fig. 34B muestra que dos de los antígenos prME de DENV2 son reconocidos por los anticuerpos D88 y 2D22. Estos resultados muestran que los dos antígenos prME de DENV2 identificados como Thailand/01 68/1979 y Peru/IQT29 13/1996 se expresan en la superficie celular en una forma conformacionalmente correcta y son excelentes candidatos a vacunas (Fig. 34A). La Fig. 34B muestra una repetición de la tinción por triplicado y en dos líneas celulares diferentes (HeLa y 293T). Estos resultados confirman la conformación adecuada de los antígenos prME de DENV2 expresados (en particular, los antígenos prME de Thailand/01 68/1979 y Peru/IQT2913/1996) y también evidencian una antigenicidad de DENV2 al menos no inferior e incluso superior en comparación con Dengvaxia (CYD-TDV), una vacuna quimérica tetravalente viva atenuada. Antígeno expresado a partir del ARNm que codifica Dengue 2 prME de Peru/IQT2913/1996 muestra la mejor unión a 2 anticuerpos DENV2 diferentes en células 293T y en células HeLa (D88 - se une a los 4 serotipos 2D22 - se une a Dengue 2). Este constructo tiene una diferencia de un solo aminoácido con respecto a la región inmunodeterminante del Dominio III del envolvente del Dengue 2 (ver negrita, subrayado en SEQ ID NO: 168, Tabla 34).
Tabla 34. Ejemplo de polipéptido PrME de DENV2
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Tabla 35. Secuencias completas de aminoácidos del dengue (cepas de Homo sapiens; Brasil, Cuba y EE. UU.)
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Ejemplo 36. Análisis cinético del ensayo de cribado in vitro multitopo de OVA (ejemplo de referencia) Como se representa en la Fig. 35, la presentación de antígenos en la superficie es un proceso ineficaz en las células presentadoras de antígenos (APC). Los péptidos generados a partir de la degradación del proteasoma de los antígenos se presentan con baja eficiencia (en realidad, solo se presenta 1 péptido de 10000 moléculas degradadas). Por lo tanto, el cebado de las células T CD8 con APC proporciona densidades insuficientes de péptido de superficie/complejos MHC I, lo que resulta en respondedores débiles que exhiben una secreción de citoquinas alterada y una reserva de memoria disminuida. Para mejorar las vacunas de ARNm de DENV que codifican antígenos de DENV concateméricos, se diseñó un ensayo in vitro para probar los conectores utilizados para conectar las repeticiones peptídicas, el número de repeticiones peptídicas y las secuencias que mejoran la presentación del antígeno.
Los constructos de ARNm que codifican uno o más epítopos de OVA se configuraron con diferentes secuencias enlazadoras, sitios de escisión de proteasa y secuencias potenciadoras de la presentación de antígenos. Sus respectivas secuencias fueron como se muestra en la Tabla 37. Para realizar el ensayo, se transfectaron 200 ng de cada constructo de ARNm formulado con MC3 en células JAWSII en una placa de 24 pocillos. Las células se aislaron a las 6 , 24 y 48 horas después de la transfección y se tiñeron con péptido anti-ratón OVA257-264 (SIINFEKL) marcado con fluorescencia unido a H-2Kb. La tinción se analizó en un citómetro de flujo LSRFortessa. Las muestras se realizaron por triplicado. La Intensidad Fluorescente Media (MFI) para cada constructo de ARNm se midió y se muestra en la Fig. 36. Los constructos 2, 3, 7, 9 y 10 mostraron una presentación de superficie mejorada del epítopo OVA, lo que indica que las configuraciones de estos constructos pueden usarse para la vacuna de ARNm de DENV. El constructo 5 comprende un solo péptido OVA y una secuencia KDEL que se sabe que evita la secreción de una proteína. El constructo 5 mostró poca presentación de antígenos de superficie porque se inhibió la secreción del péptido.
Ejemplo 37. Unión de anticuerpos a epítopos prME de DENV-1,2, 3 y 4 (ejemplo de referencia)
Se analizó la unión de vacunas de ARNm de DENV que codifican epítopos de antígenos concateméricos a anticuerpos que reconocen uno o más serotipos de DENV. Para probar la unión de anticuerpos a los epítopos, se transfectaron 200 ng de vacunas de ARNm de DENV que codifican diferentes epítopos prME de dengue en células HeLa en placas de 24 pocillos utilizando el kit de transfección de ARNm TransitIT (Mirus Bio). Los constructos de vacunas de ARNm de DENV se muestran en la Tabla 34. Las transfecciones se realizaron por triplicado. Después de 24 horas, se detectó la expresión superficial utilizando cuatro anticuerpos diferentes (10 pg/mL) seguido de un anticuerpo secundario AF700 anti-humano o anti-ratón de cabra (1/500). La señal generada a partir de la unión del anticuerpo se muestra como Intensidad Fluorescente Media (MFI) (Fig. 37). Se sabe que el anticuerpo D88 reconoce los 4 serotipos y se une a todos los epítopos de antígeno codificados por los constructos de vacunas de ARNm de DENV analizadas. Se sabe que el anticuerpo 2D22 reconoce solo DENV 2 y se une preferentemente al constructo 21, que codifica los epítopos del antígeno DENV 2. El anticuerpo 2D22 también mostró una unión débil a epítopos de otros serotipos de DENV. Se sabe que el anticuerpo 5J7 reconoce solo el DENV 3 y solo se une a los epítopos del antígeno codificados por los constructos 13, 19 y 20, que codifican los epítopos del antígeno del DENV 3. Se sabe que el anticuerpo 1-11 se une fuertemente a De Nv 1 y 2, se une débilmente a DENV 3 y se une poco a DENV 4. El anticuerpo 1 -11 se une a DENV 1,2 y 3, y se une a epítopos de antígeno DENV 3 más fuertes que la unión a DENV 1 o 2 (Fig. 37).
Tabla 37. Constructos de ARNm que codifican uno o más epítopos de OVA
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Tabla 38. Constructos de vacunas de ARNm de DENV analizadas para la unión de anticuerpos o en estudios de exposición
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Ejemplo 38. Estudio de exposición prME de DENV en modelo de mono Cynomolgus (cyno)(E¡emplo de referencia)
En la Tabla 39 se muestra el diseño del estudio de exposición prME de DENV en mono cynomolgus (cyno). La vacuna de ARNm de DENV indicada que codifica epítopos de antígeno prME, o vacunas de los mismos, se usa para inmunizar cyno. Las vacunas se formulan en nanopartículas lipídicas (por ejemplo, formulación MC3) y se administran a los monos cyno por vía intramuscular los días 0, 21 y 42. Las dosis de las vacunas son de 250 pg o 5 pg por inmunización. En los experimentos en los que se usa una combinación de diferentes vacunas de ARNm de DENV, se usan 250 pg o 5 pg de cada vacuna de ARNm. La vacuna contra la gripe H10N8 marcada con FLAG se usa como control en una dosificación de 250 pg por inmunización. También se utilizan como control monos cyno vírgenes sin inmunización. Los sueros de los monos Cyno se recogen los días 20, 41, 62 y 92 después de la inmunización inicial y se utilizan para ensayos de neutralización específicos de serotipo.
Los monos cyno inmunizados se exponen el día 63 después de la inmunización inicial con los virus DENV indicados. Los sueros de los monos Cyno se recolectan los días 62 (antes de la exposición), 63-66, 6 8 , 70, 72, 76 y 92 (final de la vida) para determinar la carga viral en suero.
Tabla 39. Diseño de estudio de exposición prME de DENV en mono Cynomolgus (cyno)
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Ejemplo 39: Estudio de exposición prME de Dengue 2 en ratones AG129 (Ejemplo de referencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la eficacia de cuatro constructos de vacunas de ARNm de DENV (constructos 21 a 24 en la Tabla 38) en ensayos de exposición en ratones AG129. El programa del estudio de exposición se muestra en la Fig. 38A. Las vacunas de ARNm de DENV se formularon en nanopartículas lipídicas (por ejemplo, formulación MC3) y se administraron a los ratones AG129 por vía intramuscular los días 0 y 21. La dosificación de las vacunas fue de 2 pg o 10 pg por inmunización. Se usó la cepa D2Y98P inactivada por calor como control negativo para vacunar a los ratones. También se utilizaron como control ratones AG129 vírgenes sin inmunización.
Los ratones AG129 inmunizados se expusieron el día 42 después de la inmunización inicial con el virus Dengue D2Y98P (s.c., 1e5 UFP por ratón). Se recogieron sueros de ratones AG129 los días 20 y 41 después de la inmunización inicial y se usaron para ensayos de neutralización específicos de serotipo. Los ratones inmunizados con cualquiera de los cuatro constructos de vacunas de ARNm de DENV sobrevivieron, mientras que los ratones de control murieron. Estos datos demuestran que, después de exposición letal, cada constructo de vacuna de ARNm proporcionó una protección del 100 %, independientemente de la dosis. Se controlaron los pesos y la salud de los ratones y los resultados se representaron en las Figs. 38C-38D.
Los sueros de ratones recolectados de ratones inmunizados con 2 pg de las vacunas de ARNm de DENV pudieron neutralizar varias cepas de DENV 2 y se observaron variaciones en la capacidad de neutralización entre las vacunas de ARNm probadas y entre diferentes cepas de DENV 2 (Fig. 39).
Ejemplo 40: Estudio de exposición a prME de DENV en modelo de ratones AG129(Ejemplo de referencia)
En la Tabla 40 se muestra el diseño de un estudio de exposición a prME de DENV en ratones AG129, inlcuyendo los constructos de ARNm analizados, el calendario de vacunación, la dosificación, las cepas de exposición y el calendario de recogida de suero.
Se usaron vacunas de ARNm de DENV indicadas que codifican epítopos de antígeno prME, o vacunas de los mismos, para inmunizar ratones AG129. Las vacunas se formularon en nanopartículas lipídicas (por ejemplo, formulación MC3) y se administraron a los ratones por vía intramuscular los días 0 y 21. La dosificación de las vacunas fue de 2 pg o 10 pg por inmunización. En los experimentos en los que se usó una combinación de diferentes vacunas de ARNm de DENV, se usaron 2 pg de cada vacuna de ARNm. Se usaron ratones AG129 vírgenes sin inmunización como control. Se recogieron sueros de ratones AG129 los días 20 y 41 después de la inmunización inicial y se usaron para ensayos de neutralización específicos de serotipo.
Los ratones AG129 inmunizados se expusieron el día 42 después de la inmunización inicial con el virus Dengue D2Y98P (s.c., 1e5 UFP por ratón). Los pesos y la salud de los ratones se controlaron durante 14 días después de la infección y los resultados se representaron en las Figs. 40A-40I.
Tabla 40. Diseño de estudio de exposición a prME de DENV en ratones AG129
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Ejemplo 41: Partículas similares a virus (ejemplo de referencia)
Los antígenos producidos a partir de las vacunas de ARNm de prME de DENV de la presente divulgación, cuando se expresan, pueden ensamblarse en partículas similares a virus (VLP). El presente estudio se diseñó para evaluar la inmunogenicidad de las VLP mediante imágenes de microscopio electrónico de tinción negativa. Como se muestra en la Fig. 41, se expresaron los constructos de vacunas de ARNm de DENV 21-24 y se ensamblaron y aislaron las VLP. Las VLP se visualizaron bajo microscopía electrónica de tinción negativa. El constructo 23 es el constructo de vacuna utilizado por Sanofi en sus vacunas contra el DENV. Los constructos 21, 22 y 24 produjeron VLP más uniformes, lo que sugiere que estas VLP pueden ser más superiores en su inmunogenicidad que las VLP producidas a partir del constructo 23.
Ejemplo 42: Eficacia de la vacuna X de ARNm de CHIKV contra CHIKV en ratones AG129 (Ejemplo de referencia)
Diseño del estudio
Virus Chikungunya (CHIKV) 181/25 es una cepa de vacuna atenuada que fue desarrollada por el ejército de los EE. UU. a través de múltiples pases de placa a placa del aislado humano 15561 del sudeste asiático (Levitt et al.). Es bien tolerado en humanos y es altamente inmunogénico. Produce placas pequeñas y tiene una virulencia disminuida en ratones lactantes y primates no humanos. Cuando se administra el virus atenuado a ratones inmunodeficientes AG129 (que carecen de la IFN-a/p y receptores y), los ratones sucumben a una enfermedad letal en 3-4 días con pelaje ondulado y pérdida de peso (Partidos, et al. 2011 Vaccine).
Este estudio instantáneo fue diseñado para evaluar la eficacia de las vacunas candidatas CHIKV como se describe en el presente documento en ratones AG129 (Tabla 41). El estudio consistió en 14 grupos de ratones hembra AG129 de 6 - 8 semanas de edad (Tabla 41). Los grupos 1-4, 7-8 y 10-15 fueron vacunados con la vacuna CHIKV X por vía intramuscular (IM; 0.05 ml) el día 0 y los grupos seleccionados recibieron un refuerzo adicional el día 28. Los grupos de control 9 y 16 recibieron vehículo (PBS) solo los días 0 y 28 por vía IM (0.05 ml). Independientemente del programa de vacunación, los grupos 1 -4 y 7-9 fueron expuestos el día 56, mientras que los grupos 10-16 fueron expuestos el día 112 usando la cepa CH iKv 181/25 (título stock 3.97*107 PFU/mL, dosis de exposición 1 * 104 PFU/ratón). Para la exposición al virus, todos los ratones recibieron una dosis letal (1 x 104 PFU) de la cepa Chikungunya (CHIK) 181/25 vía intradérmica (ID) vía (0.050mL vía footpad). Todos los ratones se controlaron durante 10 días después de la infección para determinar la pérdida de peso, la morbilidad y la mortalidad. A cada ratón se le asignó una puntuación de salud con base en la Tabla 5. Los ratones que mostraban una enfermedad grave según lo determinado por >30 % pérdida de peso, una puntuación de salud superior a 5, letargo extremo, y/o parálisis fueron sacrificados con un punto final del estudio del día 10 después de la exposición con el virus. Se realizaron pruebas de sangrado a través de la recolección retroorbital (RO) en ratones de todos los grupos en los días -3, 28 y 56. Los ratones de los grupos 10-16 también fueron sangrados en los días 84 & 112. Los ratones que sobrevivieron a la exposición también recibieron una hemorragia terminal el día 10 posterior a la exposición. Las muestras de suero de ratones (días -3, 28, 56, 84, 112 y ratones supervivientes) se mantuvieron congeladas (-80 °C) y se almacenaron hasta que se analizó su reactividad en un ELISA semicuantitativo para IgG de ratón contra E1, E2 o lisado CHIKV.
Procedimiento experimental
Inyección intramuscular (IM) de ratones
1. Sujete al animal ya sea manualmente, químicamente o con un dispositivo de sujeción.
2. Inserte la aguja en el músculo. Tire ligeramente hacia atrás del émbolo de la jeringa para verificar la colocación correcta de la aguja. Si se aspira sangre, redirija la aguja y vuelva a comprobar la colocación.
3. Inyecte la dosis adecuada y retire la aguja. No exceda el volumen máximo. Si el volumen requerido excede el volumen máximo permitido, se pueden usar varios sitios y cada uno de ellos no recibirá más del volumen máximo.
4. El lugar de la inyección se puede masajear suavemente para dispersar el material inyectado.
Inyecciones intradérmicas (ID) de ratones
1. Sujete al animal ya sea manualmente, químicamente o con un dispositivo de sujeción.
2. Recorte con cuidado el pelo del sitio de inyección previsto. Este procedimiento se puede realizar a la llegada de los animales o el día antes de que se requiera cualquier procedimiento o tratamiento.
3. El área lumbar es el sitio más común para las inyecciones ID en todas las especies, pero también se pueden usar otras áreas.
4. Pellizque o estire la piel entre sus dedos (o pinzas) para aislar el lugar de la inyección.
5. Con el borde biselado hacia arriba, inserte la aguja justo debajo de la superficie entre las capas de piel. Inyecte la dosis adecuada y retire la aguja. Se formará una pequeña ampolla cuando se administre correctamente una inyección ID.
6. Si el volumen requerido excede el volumen máximo permitido, se pueden usar varios sitios y cada uno de ellos no recibirá más del volumen máximo.
Sangrado retroorbital en ratones
1. Coloque los ratones en la cámara de anestesia y abra la línea de oxígeno y ajuste la purga al 2.5 %. Inicie el flujo de anestesia en 5 % isoflurano.
2. Una vez que el animal esté sedado, cambie la anestesia a 2.5 %-3 % isoflurano y continuar exponiendo al animal a la anestesia. Supervise al animal para evitar que la respiración se vuelva lenta.
3. Retire el pequeño roedor de la cámara de anestesia y colóquelo boca arriba mientras lo sujeta con la mano izquierda y raspe la parte posterior del cuello del animal, para que sea fácil de sujetar y manipular mientras realiza el procedimiento con la mano derecha.
4. Con un pequeño movimiento, coloque el tubo capilar en la esquina del ojo del animal cerca de la fosa nasal y gire o rote la pipeta de vidrio Hematocrit hasta que la sangre comience a fluir. Recoja la cantidad adecuada de sangre necesaria en el vial etiquetado adecuado.
5. Supervise al animal después de realizar el sangrado retroorbitario durante al menos 10-15 segundos para garantizar la hemostasia.
6. Vuelva a colocar al animal en su jaula original y controle cualquier otro problema o problema causado durante la manipulación del animal debido al procedimiento.
Observación de ratones
1. Los ratones se observaron durante 10 días después de la infección (11 días en total, 0-10 días después de la infección).
2. Los ratones se pesaron diariamente en una balanza Ohause y se registraron los pesos.
3. La supervivencia y la salud de cada ratón se evaluaron una vez al día utilizando un sistema de puntuación de 1-7 descrito en la Tabla 5.
Infección
El día 56 (grupos 1-4, 7-9) o el día 112 (grupos 10-16), se infectaron grupos de 5 ratones hembra AG129 de 6 ­ 8 semanas de edad mediante inyección intradérmica con 1 x 104 PFU/ratón de la cepa 181/25 de Chikungunya diluida en PBS. El volumen total de inoculación fue de 0.05 ml administrados en la almohadilla trasera de cada animal. Los ratones fueron anestesiados ligeramente usando 2-5 % v/v de isoflurano en ~2.5 L/min de O2 (VetEquip IMPAC6 ) inmediatamente antes de la infección.
Administración de dosis
En este estudio, a los ratones se les administraron 0.04 pg, 2 pg o 10 pg de diversas formulaciones de la vacuna CHIKV X o vehículo solo (PBS) el día 0 o los días 0 y 28 por vía intramuscular (0.05mL). El material fue formulado previamente por el Cliente y diluido en PBS por IBT antes de la dosificación según las instrucciones proporcionadas por el Cliente.
Resultados
Los ratones fueron inmunizados una vez (día 0) o dos veces (días 0 & 28) con 0.04 pg, 2 pg o 10 pg de la vacuna X de Chikungunya y fueron expuestos a la cepa CHIKV 181/25 ya sea en el Día 56 (Grupos 1-4, 7-9) o en el Día 112 (Grupos 10-16). Se controló a los ratones durante un total de 10 días después de la infección en cuanto a salud y cambios de peso. Los ratones que recibieron 2 pg o 10 pg de la vacuna CHIKV X una vez (día 0 ) o dos veces (días 0 y 28) quedaron completamente protegidos ( 100 %) independientemente de si los ratones fueron expuestos 56 días o 112 días después de la vacunación inicial (Figs. 42A-42B, Tabla 44). Los ratones que recibieron 0.04 pg de la vacuna CHIKV no estaban protegidos en absoluto de la infección letal por CHIKV. Estos datos de eficacia están respaldados por las puntuaciones de salud observadas en los ratones vacunados en los que los ratones protegidos mostraron pocos o ningún efecto adverso para la salud de una infección por CHIKV (Figs. 44A-44B). La pérdida de peso no es un fuerte indicador de progresión de la enfermedad en el modelo de ratón CHIKV AG129 (Figs. 43A-43B).
Los ratones inmunizados con la vacuna CHIKV X mostraron mayores títulos de anticuerpos contra CHIKV E1, E2 y lisado de CHIKV en comparación con los grupos tratados solo con vehículo (PBS). La unión del suero contra el lisado de virus produjo los títulos de anticuerpos más altos para todos los grupos vacunados (Figs.
45A-45C, 46A-46C, 47A-47C, 48A-48C). En general, los títulos de anticuerpos fueron dependientes de la dosis con los títulos más altos observados en suero de ratones vacunados con 10 pg de vacuna CHIKV X, mientras que los títulos más bajos se observaron en suero de ratones vacunados con 0.04 pg de vacuna CHIKV X. De manera similar, se observaron títulos más altos en suero de ratones vacunados dos veces (días 0 y 28) en comparación con suero de ratones vacunados solo una vez (día 0). El suero obtenido el día 112 después de la vacunación inicial aún producía títulos de anticuerpos aumentados en ratones que recibieron 10 pg o 2 pg de vacuna CHIKV X (Figs. 47A-47C).
El suero de los grupos de ratones 10-16, 112 días después de la inmunización también se analizó en una prueba de neutralización por reducción de placa (PRNT). El suero de cada ratón se diluyó de 1/20 a 1/40960 y evaluado por su capacidad para reducir la formación de placa CHIKV. Los resultados se muestran en la Tabla 46.
Tabla 41. Diseño de Estudio de Exposición a CHIKV en ratones AG129
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Tabla 42. Equipos y Software
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Tabla 43. Reactivos ELISA
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Tabla 44. Reactivos ELISA
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Tabla 45. Porcentaje de supervivencia
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Tabla 46. CHIKV Prueba de Neutralización por Reducción de Placa (PRNT) Diluciones de suero de 1/20 a 1/40960
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Ejemplo 43: Inmunogenicidad del candidato a vacuna de ARNm de poliproteína de Chikunaunva (C-E3-E2-6K-E1) en ratas (Ejemplo de referencia)
Ratas Sprague Dawley (n=5) fueron vacunadas con 20 |jg de poliproteína de CHIKV codificada con ARNm 30 formulada con MC-3-LNP (C-E3-E2-6K-E1) (SEQ ID NO: 13). Las ratas se vacunaron el Día 0 o los Días 0 y 14 o los Días 0, 14 y 28 mediante administración IM. Los sueros se recogieron los días -3, 14, 28 y 42 para la prueba ELISA. La Fig. 58 demostró que hubo al menos un aumento de dos logaritmos en el título de anticuerpos contra el lisado de CHIKV después de la tercera vacunación con la vacuna de ARNm en ratas normales.
Ejemplo 44: Evaluación de la activación de células T del candidato a vacuna de ARNm de poliproteína P 5 de Chikungunya (C-E3-E2-6K-E1) (Ejemplo de referencia)
C57BL/6 ratones (n=6 grupo experimental; n=3 grupo de control) se vacunaron con 10 jg de poliproteína de CHIKV codificada por ARNm formulada con MC-3-LNP (C-E3-E2-6K-E1) (SEQ ID NO: 13). Los ratones se vacunaron el Día 0 o los Días 0 y 28 (refuerzo) mediante administración IM. Los sueros se recogieron los días 3, 28 y 42 para la prueba ELISA. Los animales se sacrificaron el día 42 y se recogieron los bazos para la evaluación inmunológica de las células T. Las células esplénicas se aislaron y analizaron mediante FACS. Brevemente, se extrajeron los bazos, se aislaron las células y se estimularon in vitro con péptidos inmunogénicos que se encuentran dentro de la región C, E1 o E2 de CHIKV que se sabe que son epítopos CD8 en ratones B6. La lectura de este ensayo fue la secreción de citocinas (IFN-gamma y TNF-alfa), que revela si la vacuna indujo respuestas de células T específicas de antígeno. No se detectaron respuestas de células T CD8 utilizando el péptido E2 o C (niveles iniciales de IFN-gamma y TNF-alfa), mientras que hubo una respuesta al péptido correspondiente a E1 (promedio de aproximadamente 0.4 % de IFN-gamma y 0.1 % de TNF). Los péptidos que se utilizaron para estimular las células T utilizadas en el estudio eran E1 = HSMTNAVTI (SEQ ID NO: 300), E2 = IILYYYELY (SEQ ID NO: 301), y C = ACLVGDKVM (SEQ ID NO: 302).
La Fig. 59 muestra que la vacuna de poliproteína de CHIKV que codifica la poliproteína provocó títulos elevados de anticuerpos contra las glicoproteínas de CHIKV. Las Figs. 60 y 61A-61B muestran la activación de células T por el péptido E1.
Los artículos indefinidos "un" y "una", como se usan en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse como "al menos uno".
También debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado en el presente documento que incluya más de un paso o acto, el orden de los pasos o actos del método no se limita necesariamente al orden en que los pasos o actos se recitan los actos del método.
En las reivindicaciones, así como en la especificación anterior, todas las frases de transición como "que comprende", "que incluye", "que lleva", "que tiene", "que contiene", "que involucra", "que tiene", "compuesto de, "y similares deben entenderse como abiertos, es decir, que significan que incluyen, pero no se limitan a. Solo las frases de transición "que consisten en" y "que consisten esencialmente en" serán frases de transición cerradas o semicerradas, respectivamente.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una vacuna contra el virus del Zika (ZIKV):
    que comprende:un polinucleótido de ácido ribonucleico (ARN) que tiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico del ZIKV formulado en una nanopartícula lipídica, donde el polinucleótido de ARN es ARN mensajero (ARNm).
    2. La vacuna contra el ZIKV de la reivindicación 1, en la que el polipéptido antigénico es una poliproteína del ZIKV, una proteína de la cápside del ZIKV, una proteína de premembrana/membrana del ZIKV, una proteína de la cubierta del ZIKV, una proteína 1 no estructural del ZIKv , una proteína 2A no estructural del ZIKV, una proteína no estructural 2B de ZIKV, una proteína 3 no estructural de ZIKV, una proteína 4A no estructural de ZIKV, una proteína 4B no estructural de ZIKV o una proteína 5 no estructural de ZIKV, opcionalmente en el que el polipéptido antigénico comprende además uno cualquiera de más de una proteína no estructural ZIKV 1,2a , 2B, 3, 4A, 4B o 5.
    3. La vacuna contra el ZIKV de la reivindicación 2, en la que el marco de lectura abierto codifica:
    (a) una proteína de la cápside de ZIKV, una proteína de premembrana/membrana de ZIKV y una proteína de cubierta de ZIKV;
    (b) una proteína de la cápside de ZIKV y una proteína de premembrana/membrana ZIKV;
    (c) una proteína de la cápside del ZIKV y una proteína de la cubierta del ZIKV, o
    (d) una proteína de premembrana/membrana de ZIKV y una proteína de cubierta de ZIKV.
    4. La vacuna contra el ZIKV una de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el polipéptido antigénico comprende:
    (i) una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76-134, o
    (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 %, al menos 98 %, o 95 %-99 % identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76-134,
    opcionalmente en la que:
    (a) el polinucleótido de ARN tiene menos del 80 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre, o (b) el polinucleótido de ARN tiene más del 80 % de identidad con la secuencia de ARNm de tipo silvestre, pero no incluye la secuencia de ARNm de tipo silvestre,
    opcionalmente, en el que el polipéptido antigénico tiene actividad de fusión de membranas, se une a receptores celulares, provoca la fusión de membranas virales y celulares y/o es responsable de la unión del ZIKV a una célula que se infecta.
    5. La vacuna contra el ZIKV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el polipéptido antigénico se obtiene de la cepa ZIKV MR 766, ZIKV cepa ACD75819 o ZIKV cepa SPH2015.
    6. La vacuna de ZIKV de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde al menos un polinucleótido de ARN comprende al menos una modificación química:
    (i) la modificación química se selecciona de pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 5-metiluridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio- 1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina y 2'-O-metil-uridina, por ejemplo, N1-metilpseudouridina;
    (ii) la modificación química está en la posición 5 del uracilo; y/o
    (iii) al menos 80 %, al menos 90 % o 100 % del uracilo en el marco de lectura abierto tiene una modificación química.
    7. La vacuna contra el ZIKV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el polinucleótido de ARN codifica además un casquete terminal 5', opcionalmente en el que el casquete terminal 5' es 7mG(5')ppp(5')NlmpNp.
    8. La vacuna contra el ZIKV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el polipéptido antigénico ZIKV se fusiona con un péptido señal seleccionado de: un péptido señal HuIgGk (METPAQLLFLLLLWLPDTTG; SEQ ID NO: 125); péptido señal epsilon-1 de cadena pesada de IgE (MDWTWILFLVAAATRVHS; SEQ ID NO: 126); secuencia señal PRM de encefalitis japonesa (MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS; SEQ ID NO: 128) y secuencia señal de proteína VSVg (MKCLlYlAFLFIGVNCA; SEQ ID NO: 131), opcionalmente en las que el péptido señal se fusiona con el extremo N del al menos un polipéptido antigénico ZIKV.
    9. La vacuna contra el ZIKV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el polipéptido antigénico comprende un sitio de glicosilación ligado a N mutado, opcionalmente en la que el sitio de glicosilación ligado a N mutado es la posición N154A de ZIKV prME.
    10. La vacuna contra el ZIKV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que:
    (a) la nanopartícula lipídica tiene un diámetro medio de 50-200 nm;
    (b) la nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, un lípido modificado con PEG, un esterol y un lípido no catiónico, opcionalmente donde:
    (i) la nanopartícula lipídica comprende una relación molar de aproximadamente 20-60 % de lípido catiónico, 0.5-15 % de lípido modificado con PEG, 25-55 % de esterol y 5-25 % de lípido no catiónico;
    (ii) el lípido catiónico es un lípido catiónico ionizable y el lípido no catiónico es un lípido neutro, y el esterol es un colesterol; y/o
    (iii) el lípido catiónico se selecciona de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-il) (L319);
    (c) la nanopartícula lipídica tiene un valor de polidispersidad inferior a 0.4; y/o
    (d) la nanopartícula lipídica tiene una carga neutra neta a un valor de pH neutro.
    11. La vacuna contra el ZIKV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que el marco de lectura abierto está optimizado por codones.
    12. La vacuna contra el ZIKV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, en el que dicho método comprende administrar dicha vacuna en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria específica de antígeno, en el que opcionalmente:
    (i) la respuesta inmunitaria específica de antígeno comprende una respuesta de células T o una respuesta de células B;
    (ii) dicho método comprende administrar una dosis única de la vacuna contra el ZIKV o una dosis de refuerzo de la vacuna contra el ZIKV; y/o
    (iii) la vacuna se administra mediante inyección intradérmica o inyección intramuscular.
    13. La vacuna contra el ZIKV para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la respuesta inmunitaria específica de antígeno es un título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico, en el que el título de anticuerpos anti-ZIKV polipéptido antigénico producido en el sujeto aumenta:
    (i) por al menos 1 logaritmo en relación con un control; o
    (ii) al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces con respecto a un control;
    opcionalmente en la que:
    (a) el control es un título de anticuerpo polipeptídico anti-ZIKV producido en un sujeto al que no se le ha administrado la vacuna contra el ZIKV;
    (b) el control es un título de anticuerpo polipeptídico antigénico anti-ZIKV producido en un sujeto al que se le ha administrado una vacuna contra el ZIKV viva atenuada o inactivada;
    (c) el control es un título de anticuerpo de polipéptido antigénico anti-ZIKV producido en un sujeto al que se le ha administrado una vacuna de proteína ZIKV recombinante o purificada; o
    (d) el control es un título de anticuerpo polipeptídico antigénico del virus anti-ZIKV producido en un sujeto al que se le ha administrado una vacuna de partículas similares a virus (VLP) que comprende proteínas estructurales del ZIKV.
    14. La vacuna contra el ZIKV para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en la que la cantidad eficaz es una dosis equivalente a una dosis de al menos 2 veces, al menos 4 veces, al menos 10 veces, al menos 100 veces o reducción de al menos 1000 veces en la dosis de atención estándar de una vacuna de proteína contra el ZIKV recombinante, y en la que un título de anticuerpos anti-ZIKV polipéptido antigénico producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpos anti-ZIKV polipéptido antigénico producido en un sujeto de control administrado la dosis estándar de atención de una vacuna de proteína contra el ZIKV recombinante o purificada o una vacuna contra el ZIKV viva atenuada o inactivada.
    15. La vacuna contra el ZIKV para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la que la cantidad efectiva es una dosis total de 50 pg-1000 pg, opcionalmente en la que:
    (i) la cantidad efectiva es una dosis total de 100 pg, o
    (ii) la cantidad eficaz es una dosis de 25 pg, 100 pg, 400 pg o 500 pg administrada al sujeto un total de dos veces.
    16. La vacuna contra el ZIKV para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en la que:
    (i) la eficacia de la vacuna contra ZIKV es mayor que 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % en relación con un control,
    (ii) la vacuna inmuniza al sujeto contra ZIKV por hasta 2 años o más de 2, 3, 4 o 5-10 años;
    (iii) el sujeto es mayor de 45 años o mayor de 60 años;
    (iv) el sujeto es menor de 9 años, 5 años o 1 año; y/o
    (v) el sujeto está inmunodeprimido.
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