CN1803787A - 贯叶金丝桃总黄酮提取物、其制备及应用 - Google Patents
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Abstract
贯叶金丝桃总黄酮提取物、其制备及应用，所述提取物总黄酮含量为80－95％；其所含黄酮成分为：芦丁5.0－50.0％、金丝桃苷6.0－70.0％、异槲皮苷3.0－10.0％、扁蓄苷0.5－5.0％、槲皮苷0.5－5.0％、槲皮素0.1－1.0％，其他黄酮类成分余量。本发明公开了贯叶金丝桃总黄酮提取物在制备保肝、治疗乙肝和治疗心脑缺血药物中的应用。
Description
技术领域：
本发明涉及贯叶金丝桃总黄酮提取物、该提取物的制备方法、中药制剂，及其在保肝、治疗乙肝和治疗心脑缺血药物中的应用。
背景技术：
贯叶金丝桃(贯叶连翘)为藤黄科金丝桃属植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分，收载于2005年版药典一部159页。功能与主治为：舒肝解郁，清热利湿，消肿止痛。用于情志不畅，气滞郁闷，关节肿痛，小便不利。
目前研究贯叶金丝桃提取物方法有申请号为02115540.2的发明专利申请“贯叶连翘提取物的制备方法”、申请号为02134380.2的发明专利申请“一种贯叶连翘提取物的制备方法”、申请号为200410017163.7的发明专利申请“一种从贯叶连翘中制备总黄酮的工艺”、申请号为200410017828.4的发明专利申请“一种贯叶连翘提取物及制备方法”等4份专利。
第一项专利申请对于贯叶连翘提取物的制备方法为：贯叶连翘提取液经处理后通过大孔吸附树脂、离子交换树脂或聚酰胺填充的吸附柱，首先用10～15倍量(吸附柱填充的吸附材料体积的倍数，下同)的水淋洗到无色，再用2倍量的容量10-30％的甲醇、乙醇洗脱，洗脱完后再用4倍量的容量30-70％的甲醇、乙醇或丙酮洗脱，回收洗脱液，得流浸膏200ml，再用乙酸乙酯与乙醇混合溶剂萃取，回收溶剂，得稠膏，干燥，得干浸膏，收率为2.2-2.9％。干燥提取物经紫外分光光度法分析测得如下：金丝桃素含量为0.6-1.2％，总黄酮含量为52-70％。该专利的缺点为：未提供该有效部位由哪些黄酮成分组成，虽提供有效部位总黄酮含量为52-70％，但还未达到静脉注射用二类原料药的标准(80％以上)。
第二项专利申请对于贯叶连翘提取物的制备方法为：取贯叶连翘药材粉末1100g，用丙酮在室温并不断搅拌下浸提3次，溶剂用量依次为4000ml、3000ml、2500ml。过滤，合并提取液，得提取液7800ml。提取液加蒸馏水2300ml后，每次用石油醚5000ml萃取，共萃取2次，合并萃取液。取丙酮水层50’C减压回收丙酮，水相10％盐酸酸化至pH＝2，4’C静置48小时，离心，沉淀水洗至中性后冷冻干燥，得褐色沉淀8.68g。浓缩石油醚相至2200ml，用3000ml 50％乙醇萃取，弃去醇水相。用含3％NaOH的50％乙醇溶液萃取石油醚相，10％盐酸酸化至pH＝2，用3000ml石油醚萃取酸醇相，共萃取2次，合并石油醚相，45℃以下回收石油醚，得黑色粘稠浸膏12.3g。将褐色沉淀与黑色浸膏混合，丙酮溶解，加入复合稳定剂(Vc VE柠檬酸20∶100∶1)0.5g，在低于45℃下减压回收溶剂并真空干燥，得贯叶连翘提取物。其中含贯叶金丝桃素28.4％，金丝桃素类2.1％，黄酮类32。8％，三者含量总和63.3％。该专利的缺点为：未提供该有效部位由哪些黄酮成分组成，虽提供有效部位三者含量总和为63.3％，但还未达到静脉注射用二类原料药的标准(80％以上)。
第三项专利申请对于从贯叶连翘中制备总黄酮的提取分离方法为：称取30g贯叶连翘浸提物，加入1000mL水，超声处理30分钟，使贯叶连翘浸提物悬浮于水中。离心过滤，滤液经络合比色法测定，其黄酮含量为9.1mg/mL，滤液待用。取140mL滤液，用水稀释至400ml，即可上柱分离。取一定量预处理好的弱极性AB-8树脂或中极性DM-301树脂，装入内径为1cm的玻璃柱中，使其床体积为20mL，以2BV/h的流速使400mL贯叶连翘溶液缓慢流过树脂床。然后用120mL水洗去柱中残留的溶液，再用浓度为50％的乙醇溶液以4BV/h的流速流过树脂柱，收集0.25～3BV间的洗脱液，减压浓缩至干，即得浅棕色粉末状提取物，其总黄酮含量为86.6％。该专利的缺点为：未提供该总黄酮由哪些黄酮成分组成，虽提供该总黄酮中总黄酮含量为86％，但未标明总黄酮中主要活性成分金丝桃苷的含量。
第四项专利申请对于贯叶连翘提取物的制备方法为：取贯叶连翘药材，加入10倍量55-70％乙醇回流提取二次，每次1小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至相对密度1.02-1.03(55℃-65‘C)，离心，上清液过LSA-20、D101、AB-8大孔吸附树脂柱，树脂吸附饱和后停止上样，20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再以75-95％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩、干燥，粉碎，过100目筛，即得贯叶连翘提取物。其中所含的苯并二蒽酮类含量为1.3-2.1％，总黄酮含量为50-61％。该专利的缺点为：虽提供提取物的指纹图谱及提取物含量总和为63.1％，但还未达到静脉注射用二类原料药的标准(80％以上)。
据文献报道，贯叶金丝桃(Hypericumper～orarum L.)主要成分有苯并二蒽酮类、黄酮类、挥发油类和间苯三酚类。贯叶金丝桃的应用还局限于其甲醇提取物制剂用于治疗抑郁症，以含量极低的金丝桃素作为质量标准，其富含的黄酮类成分却未被开发利用。药理研究表明黄酮类成分是其中的主要活性成分类别之一，化学研究表明贯叶金丝桃黄酮类成分以芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、扁蓄苷、槲皮苷和槲皮素等6种成分含量较高。不同的提取方法得到的提取物由于包含不同的黄酮类化合物、不同的含量，其药理、药性存在很大差异。因此在保证药效的前提下，尽可能提高提取物总黄酮的含量，特别是主要保肝、治疗乙肝活性成分金丝桃苷的含量和明确提取物中黄酮组成成分是技术难点。
中药贯叶金丝桃及其制剂临床用于治疗轻度及中度抑郁症，尚未见到用于保肝、治疗乙肝和治疗心脑缺血性疾病的报道，。
发明内容：
本发明是为避免上述现有技术所存在的问题，提供一种贯叶金丝桃总黄酮提取物，药理和化学研究表明该提取物活性成分明确，质量可控。
本发明另一目的是提供该贯叶金丝桃总黄酮提取物的制备方法及其制剂。
本发明目的还在于提供该贯叶金丝桃总黄酮提取物在保肝、治疗乙肝和治疗心脑缺血疾病中的应用。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物，其特点是所述提取物总黄酮含量为80-95％；其所含黄酮成分为：芦丁5.0-50.0％、金丝桃苷6.0-70.0％、异槲皮苷3.0-10.0％、扁蓄苷0.5-5.0％、槲皮苷0.5-5.0％、槲皮素0.1-1.0％，其他黄酮类成分余量。
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物制备方法的特点是按如下步骤操作：
a、将干燥的贯叶金丝桃粉碎成粗粉，用8-10倍量的30-95％乙醇水溶液加热回流提取；
b、将步骤a所得提取液在50℃-60℃的条件下减压浓缩至60℃时比重为1.13-1.16的浸膏，加入原生药量4-6倍量沸水，分次溶解，静置24小时过滤；
c、将步骤b所得滤液通过聚酰胺和大孔吸附树脂混合柱层析，或通过聚酰胺柱层析，首先用水冲洗，再用不同浓度醇水溶液分段洗脱、收集、浓缩，所述分段洗脱、收集、浓缩的操作过程为：
用10-20％乙醇水溶液或10-20％甲醇水溶液洗脱1-3个柱体积、去除洗脱液；
用40-50％乙醇水溶液或40-50％甲醇水溶液洗脱，按照洗脱时间的先后顺序，分段收集，分别获得前段洗脱液、中段洗脱液和后段洗脱液，去除前段和后段洗脱液；
将所述中段洗脱液在50℃-60℃条件下减压浓缩，真空干燥得贯叶金丝桃总黄酮提取物；
d、将步骤c中所得贯叶金丝桃总黄酮提取物用甲醇或乙醇重结晶，得结晶物和结晶母液；所述结晶物通过真空干燥即获得总黄酮含量达到80％-95％、金丝桃苷含量达50％的贯叶金丝桃总黄酮提取物A；所述结晶母液在50℃-60℃条件下减压浓缩，并经真空干燥获得总黄酮含量达到80％-95％、芦丁含量达40％的贯叶金丝桃总黄酮提取物B。
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物制备方法的特点也在于在所述步骤c中的分段洗脱、收集、浓缩的操作过程为：
用40-50％乙醇水溶液或40-50％甲醇水溶液洗脱4个柱体积、以每1个柱体积的洗脱液为1份，按照洗脱时间的先后顺序，分段收集，分别获得第一段至第四段共4份洗脱液，去除第一段和第四段洗脱液，并合其中第2至第3段洗脱液得中段洗脱液。
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物制备方法的特点还在于在所述步骤d中的重结晶操作过程为：
将步骤c所得贯叶金丝桃总黄酮提取物，加10倍量的甲醇或乙醇，置80℃-90℃水浴中加热回流提取2小时，乘热抽滤，滤液在50℃-60℃条件下减压浓缩至1/4体积，在4℃的环境中放置2-5天，经过滤得结晶物和结晶母液，结晶物用甲醇或乙醇抽洗两次，抽干，洗液备用，结晶物在50℃-60℃条件下真空干燥，得总黄酮含量达到80％-95％、金丝桃苷含量达50％的贯叶金丝桃总黄酮提取物A；
洗液与结晶母液合并在50℃-60℃条件下减压浓缩，真空干燥得贯叶金丝桃总黄酮含量达到80％-95％、芦丁含量达40％的贯叶金丝桃总黄酮提取物B。
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物制备方法的特点还在于所述步骤a中用于回流提取的乙醇为60-80％乙醇水溶液。
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物的中药制剂是以所述贯叶金丝桃总黄酮提取物为药物有效成份，加入药用辅料后制成的滴丸、片剂、胶囊剂、软胶囊、颗粒剂、混悬剂、口服液、粉针剂、注射剂、输液。
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物A用于保肝、治疗乙肝性疾病。
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物B用于治疗心脑缺血性疾病。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明贯叶金丝桃提取物是以总黄酮含量、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、扁蓄苷、槲皮苷、槲皮素的含量对其进行确切的表征。目前，以上述表征方式进行表征的黄酮类物质以及贯叶金丝桃总黄酮提取物具有显著的保肝、抗乙肝和抗脑缺血作用，均未见相关文献的报道。
2、采用高效液相色谱法，可以对本发明提取物中对芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、扁蓄苷、槲皮素的黄酮成分进行明确定性和定量。
3、本发明贯叶金丝桃提取物对于保肝、治疗乙肝和治疗心脑缺血性疾病有可靠的疗效。
4、本发明根据贯叶金丝桃中黄酮等酚性成分的酚羟基与聚酰胺的酰胺基形成氢键而被聚酰胺吸附的原理，设计了贯叶金丝桃乙醇提取物用水溶解，通过聚酰胺和大孔吸附树脂混合柱层析，或通过聚酰胺柱吸附，先用水洗去不被吸附的杂质，并用10-20％乙醇水溶液洗去低酚性为成分如氯原酸等酚酸性成分，再用40％-50％乙醇水溶液洗脱黄酮成分，而多酚性成分鞣质保留在柱上，从而达到富集黄酮成分；在40％-50％乙醇水溶液洗脱黄酮成分时，根据洗脱曲线，分段收集浓缩，从而得到总黄酮含量为80％-95％提取物，为了提高提取物中保肝、抗乙肝作用较强金丝桃苷含量，设计了用甲醇或乙醇对提取物进行重结晶，从而得到金丝桃苷含量较高的结晶物和其他黄酮成分含量较高的结晶母液，分别干燥后得原料药A和B，分别作为保肝、抗乙肝静脉注射制剂的原料和治疗心脑缺血静脉注射制剂的原料。
5、本发明可以满足个广大心脑缺血患者对不同剂型的要求。
本发明贯叶金丝桃总黄酮提取物，其提取分离工艺不仅限于上述工艺，亦可采用其他提取分离手段得到。
利用上述工艺得到的贯叶金丝桃总黄酮提取物中总黄酮含量及各组成成分含量测定方法为：
1、贯叶金丝桃总黄酮提取物干燥后，总黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO2)3-NaOH络合比色法进行测定，本品含总黄酮(以金丝桃苷计)为80-95％。
2、贯叶金丝桃总黄酮提取物干燥后，组成成分：芦丁(Rutin)、金丝桃苷(Hyperin)、异槲皮苷(Isoquercetin)、扁蓄苷(avicularin)、槲皮苷(quercitrin)、和槲皮素(Quercetin)的含量测定均采用HPLC法，各成分含量见实施例1-3。
下面用药理实验结果阐明其药效作用
一、贯叶金丝桃总黄酮提取物A(HPTF A)保肝降酶效果见表1
表1 HPTFA对CCl4中毒小鼠的降酶效果
| 组 别 | ALT(x±s.U/L) | 显著性(P值) |
| (1)正常小鼠组(2)CCl4中毒组(3)水飞蓟宾组(100mg/kg)(4)HPTFA组(60mg/kg)(5)HPTFA组(120mg/kg) | 15.90±7.04302.06±20.00251.51±57.02253.00±57.00211.40±53.42 | ＜0.05＜0.05＜0.01 |
注：治疗组与CCl4中毒组比较
二、贯叶金丝桃总黄酮提取物A(HPTFA)对2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的抑制作用
1、HPTFA对2.2.15细胞HBeAg的抑制作用见表2
表2 HPTFA对2.2.15细胞HBeAg的抑制作用
| 4天 | 8天 | ||||||
| 药物 | 浓度(mg/ml) | cpm(x±s) | 抑制率(％) | IC50 | cpm(x±s) | 抑制率(％) | IC50 |
| HPTFA细胞对照 | 210.5 | 3141±180**3569±208**3966±382**5676±194 | 44.6037.0030.10 | 1.29 | 2890±130**3759±214**3964±196**6630±341 | 56.3543.2540.20 | 1.43 |
注：1)HPTFA对2.2.15细胞最大无毒浓度(TC0)为：2mg/ml；
2)与细胞对照相化较，**p＜0.01 *p＜0.05
2、HPTFA对2.2.15细胞HBsAg的抑制作用见表3
表3 HPTFA对2.2.15细胞HBsAg的抑制作用
| 4天 | 8天 | ||||||
| 药物 | 浓度(mg/ml) | cpm(x±s) | 抑制率(％) | IC50 | cpm(x±s) | 抑制率(％) | IC50 |
| HPTFA细胞对照 | 210.5 | 3433±105**4272±210**4543±602**5691±738 | 39.6024.9020.13 | 1.63 | 3657±241**4374±223**5601±149**7248±815 | 49.5039.6022.72 | 1.30 |
注：与细胞对照相化较，**p＜0.01 *p＜0.05
三、贯叶金丝桃总黄酮提取物B(HPTFB)对脑缺血损伤的影响
1、HPTFB对小鼠断头后张口喘气时间的影响
结果如表4所示，20、40、80mg.kg-1HPTFB可明显延长小鼠断头后张口喘气时间，并呈一定的量效关系。
表4 HPTFB对小鼠断头后张口喘气时间的影响(x±s)
| 组别 | 剂量(mg.kg-1) | n | 张口喘气时间(sec) | 延长百分率(％) |
| 对照EGBHPTFB | --60204080 | 1088108 | 18.0±2..219.4±1.619.8±1.621.2±1.8**23.0±2.0** | -8.38.617.027.8 |
注：与对照比较，*P＜0.05。
2、HPTFB对脑梗塞组织重量的的影响
结果如表5所示，大鼠MCAO后有明显的脑梗塞发生，HPTFB可显著降低脑梗塞组织重量百分比，在20-80mg.kg-1范围内呈一定的量效关系。
表5 HPTFB对WCAO致大鼠脑梗塞组织重量的影响(x±s)
| 组别 | 剂量(mg.kg-1) | n | 梗塞脑组织重量百分比(％) | 抑制率(％) |
| Sham对照EGBHPTFB | --80204080 | 888888 | 1.5±0.38**18.2±1.613.4±2.0**14.0±3.1*14.0±3.2**13.3±3.0** | --25.920.021.125.9 |
注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
四、贯叶金丝桃总黄酮提取物B(HPTFB)对心肌缺血缺氧损伤的影响
1、HPTFB对挟闭气管小白鼠心脏缺氧损伤的影响
结果如表6所示，与对照组NS比较，HPTFB可显著延长小白鼠挟闭气管后心电时间，在20-80mg.kg-1范围内呈一定的量效关系。
表6HPTFB对挟闭气管小白鼠心脏缺氧损伤的影响
| 组别 | 剂量(mg.kg-1) | n | 心电时间(min) |
| NSHPTFB | 204080 | 8888 | 7.1±1.058.5±1.20**9.2±1.30**9.8±1.20** |
注：与对照组NS比较，**P＜0.01。
2、HPTFB对冠状动脉结扎引起的大鼠急性心肌梗塞的影响
表7HPTFB对冠状动脉结扎引起的大鼠急性心肌梗塞的影响
| 组别 | 剂量(mg.kg1.d-1) | n | 梗塞心肌组织重量百分比(％) |
| 对照EGBHPTFB | 80×320×340×380×3 | 66666 | 32.15±14.8516.80±7.30*28.82±12.2018.05±5.65*16.52±7.28* |
注：与对照组比较，*P＜0.05。
五、结论：贯叶金丝桃总黄酮提取物A有保肝降酶、抗乙肝作用，贯叶金丝桃总黄酮提取物B有治疗心脑缺血作用，具体体现为：
1、贯叶金丝桃总黄酮提取物A 60mg/kg和120mg/kg对CCl4中毒小鼠血清ALT有非常明显的降低效果P＜0.05和P＜0.01。
2、贯叶金丝桃总黄酮提取物A在乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系2.2.15细胞培养4天、8天，无毒浓度对HBsAg和HBeAg的分泌有明显抑制作用。
3、小鼠断头后张口喘气模型是一筛选研究抗脑缺血、缺氧药物较好的实验方法，其特点为重复性好、快速简便。在该模型上，本研究发现20、40、80mg.kg-1贯叶金丝桃总黄酮提取物B可明显延长小鼠断头后张口喘气时间；大鼠MCAO是一常用的研究脑缺血损伤的动物模型，与人脑梗塞损伤较为接近。本研究在该模型上发现，在20-80mg.kg-1范围内，贯叶金丝桃总黄酮提取物B能显著减轻脑组织梗塞重量，并呈一定的量效关系。这些结果表明贯叶金丝桃总黄酮提取物B对脑缺血、缺氧性损伤有保护作用。
4、贯叶金丝桃总黄酮提取物B在20-80mg.kg-1范围，可显著延长小白鼠挟闭气管后心电时间；在冠状动脉结扎模型上，在20-80mg.kg-1范围内，贯叶金丝桃总黄酮提取物B能减轻心肌组织梗塞重量。这些结果表明贯叶金丝桃总黄酮提取物B对心肌缺血、缺氧性损伤有保护作用。
附图说明：
图1为贯叶金丝桃总黄酮提取物A的HPLC图谱。
该图谱对贯叶金丝桃.总黄酮提取物A组成成分：芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、扁蓄苷、槲皮苷、槲皮素的黄酮成分进行了明确定性和定量。
图2为贯叶金丝桃总黄酮提取物B的HPLC图谱。
该图谱对贯叶金丝桃.总黄酮提取物B组成成分：芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、扁蓄苷、槲皮苷、槲皮素的黄酮成分进行了明确定性和定量。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对贯叶金丝桃总黄酮提取物提取方法及其制剂的制备方法作进一步详述。
实施例1：
取贯叶金丝桃生药粗粉1kg，加10倍量70％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩成60℃时的相对密度为1.13的浸膏；加入相当于生药6倍量的沸水搅拌使溶解，过滤，滤液加于聚酰胺和大孔吸附树脂混合柱上，用水冲洗10个柱体积后，用20％乙醇水溶液洗脱2个柱体积，用50％乙醇水溶液洗脱4个柱体积，分段收集50％乙醇水溶液，每1个柱体积的洗脱液为1份，收集第2和第3份洗脱液，在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥，得提取物，取该提取物加10倍量的甲醇，置水浴中加热回流提取2小时，乘热抽滤，滤液在低于60℃条件下减压浓缩至1/4体积，置冰箱中放置3天，过滤，得结晶物和结晶母液，结晶物用甲醇抽洗两次，抽干，洗液备用，结晶物在低于60℃条件下真空干燥，得贯叶金丝桃总黄酮提取物A，收得率为0.70％，其总黄酮含量为83.15％，芦丁5.45％、金丝桃苷59.23％、异槲皮苷5.64％、扁蓄苷1.79％、槲皮苷1.03％、槲皮素0.2％，以及其他数种黄酮类成分。
洗液与结晶母液合并后在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥，得贯叶金丝桃总黄酮提取物B，收得率为0.65％，其总黄酮含量为82.50％，芦丁45.61％、金丝桃苷8.18％、异槲皮苷5.88％、扁蓄苷1.41％、槲皮苷3.05％、槲皮素0.20％，以及其他数种黄酮类成分。
实施例2：
取贯叶金丝桃生药粗粉1kg，加8倍量80％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩成60℃时的相对密度为1.15的浸膏；加相当于生药4倍量的沸水搅拌使溶解，过滤，滤液加于已处理好的聚酰胺柱上，用水冲洗10个柱体积后，用20％乙醇水溶液洗脱2个柱体积，用50％乙醇水溶液洗脱4个柱体积，分段收集50％乙醇水溶液，每1个柱体积的洗脱液为1份，收集第2和第3份洗脱液，在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥，得提取物，取该提取物加10倍量的甲醇，置水浴中加热回流提取2小时，乘热抽滤，滤液在低于60℃条件下减压浓缩至1/4体积，置冰箱中放置5天，过滤，得结晶和结晶母液，结晶物用甲醇抽洗两次，抽干，洗液备用，结晶物在低于60℃条件下真空干燥，得贯叶金丝桃总黄酮提取物A，收得率为0.68％，其总黄酮含量为82.00％，芦丁5.41％、金丝桃苷58.23％、异槲皮苷5.94％、扁蓄苷1.89％、槲皮苷1.15％、槲皮素0.21％，以及其他数种黄酮类成分。
洗液与结晶母液合并在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥，得贯叶金丝桃总黄酮提取物B，收得率为0.68％，其总黄酮含量为82.50％，芦丁45.25％、金丝桃苷8.25％、异槲皮苷5.68％、扁蓄苷1.50％、槲皮苷3.40％、槲皮素0.22％，以及其他数种黄酮类成分。
实施例3：
取贯叶金丝桃生药粗粉1kg，加10倍量90％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩成60℃时的相对密度为1.16的浸膏；加相当于生药6倍量的沸水搅拌使溶解，过滤，滤液加于已处理好的聚酰胺柱上，用水冲洗10个柱体积，用15％甲醇洗脱3个柱体积，40％甲醇水溶液洗脱4个柱体积，分段收集40％甲醇水溶液，每1个柱体积的洗脱液为1份，收集第2和第3份洗脱液，在低60℃条件下减压浓缩，真空干燥，得提取物，取该提取物加10倍量的乙醇，置水浴中加热回流提取2小时，乘热抽滤，滤液在低于60℃条件下减压浓缩至1/4体积，置冰箱中放置4天，过滤，得结晶物和结晶母液，结晶物用乙醇抽洗两次，抽干，洗液备用，结晶物在低于60°C条件下真空干燥，得贯叶金丝桃总黄酮提取物A，收得率为0.72％，其总黄酮含量为82.15％，芦丁5.60％、金丝桃苷57.23％、异槲皮苷5.64％、扁蓄苷1.82％、槲皮苷1.20％、槲皮素0.18％，以及其他数种黄酮类成分。
洗液与结晶母液合后在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥，得贯叶金丝桃总黄酮提取物B，收得率为0.62％，其总黄酮含量为83.05％，芦丁44.95％、金丝桃苷8.05％、异槲皮苷5.58％、扁蓄苷1.45％、槲皮苷3.25％、槲皮素0.18％，以及其他数种黄酮类成分。
实施例4：贯叶金丝桃总黄酮片
组分 量
贯叶金丝桃总黄酮提取物 5-300g
糊精 90g
微晶纤维素 105g
低取代羟丙甲纤维素 15g
70％的乙醇溶液 15ml
硬脂酸镁 1g
将贯叶金丝桃总黄酮提取物、糊精、硬脂酸镁、低取代羟丙甲纤维素分别粉碎过80目筛；将贯叶金丝桃总黄酮与糊精、2/3量的低取代羟丙甲纤维素及70％的乙醇溶液混合研磨，使均匀，制软材；用20目筛制颗粒，干燥，整粒后加入剩余的低取代羟丙甲纤维素，混匀，再加入硬脂酸镁混匀，压1000片；检验合格后包装。
实施例5：贯叶金丝桃总黄酮滴丸
组分 量
贯叶金丝桃总黄酮提取物 1-50g
PEG4000 30g
PEG6000 44g
将聚乙二醇4000、聚乙二醇6000加热熔融；再将贯叶金丝桃总黄酮提取物加入其中，充分搅拌，使药物充分分散于基质中；将上述药液转移至滴丸机上，70℃～80℃密闭保温10～20分钟，用无水甲基硅油作冷却剂，10℃～20℃梯度冷却，用30～60滴/分速度进行滴制，即得成型丸粒。再收集滴丸，用无水石油醚洗涤2次，凉干，包装即可。
实施例6：贯叶金丝桃总黄酮输液
以制备含量为0.001-0.2％(g/ml)的贯叶金丝桃总黄酮输液制剂250ml瓶为例。
将0.05-10g贯叶金丝桃总黄酮提取物加入到1000ml新鲜注射用水加热溶解后，加入5克针用活性炭，加热煮沸20分钟后过滤，滤液冷却至40℃以下，用注射用水稀释至5000ml，再用1mol/L的碳酸氢钠调PH为7.0左右，加入45克药用氯化钠及6g药用亚硫酸氢钠搅拌溶解，使之成为11溶液中含0.4贯叶金丝桃总黄酮。测pH、含量合格后，无菌罐装到250ml输液瓶中，于115℃下热压灭菌30分钟，即得。
实施例8：贯叶金丝桃总黄酮冻干粉针
贯叶金丝桃总黄酮提取物 5-300g
吐温80 120g
活性炭 4g
甘露醇 400g
泊络沙姆 8g
称取贯叶金丝桃总黄酮提取物干粉、吐温、泊络沙姆将其熔融放入研钵中研磨使其充分分散，加入二氧化碳饱和过的新鲜注射用水到3500ml，加入甘露醇，在水浴(50-70℃)加入针用活性炭，边加入边搅拌，煮沸5-10分钟后，冷却至40℃用垂熔滤器滤过。用注射用水稀释至4000ml，测pH、含量合格后，过0.45um膜，再过0.22um膜，灌装1000个西林瓶中，预冻，冷冻即得每瓶含5-300mg贯叶金丝桃总黄酮提取物冻干粉。
实施例9：贯叶金丝桃总黄酮注射液
组分 量
贯叶金丝桃总黄酮提取物 2-200g
碳酸氢钠 12g
焦亚硫酸钠 2g
注射用水 1000ml
取注射用水1000ml，煮沸，冷却至室温，备用。按处方取配置量20％的注射用水，加入贯叶金丝桃总黄酮提取物使溶解，分次缓慢加入碳酸氢钠并不断搅拌，待液面无气泡产生时，加入焦亚硫酸钠溶解，加剩余的注射用水至全量。用PH酸度计测定药液PH值应为5.5-8.0、若不在此范围内，可用硫酸氢钠调节。药液用3号垂熔玻璃滤斗滤过至澄明，灌封500支安瓿，100℃，30分钟灭菌，即得。
实施例10：贯叶金丝桃总黄酮软胶囊
组分 量
贯叶金丝桃总黄酮提取物 5-300g
蜂蜡 10g
食用植物油 150g
明胶 10g
甘油 3g
水 13g
称取贯叶金丝桃总黄酮提取物与经过加热灭菌、澄清的食用植物油及蜂蜡熔融物混合，充分搅匀即得囊心物。取明胶加入适量水使其膨胀；另将甘油及余下的水置煮胶锅中加热至70℃～80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔化，保温1-2小时，静置，使泡沫上浮，除去上浮的泡沫，以洁净白布滤过，保温待用。将已制好的明胶液，置明胶液贮槽中控制温度在60℃左右，将贯叶金丝桃总黄酮提取物放入药液贮槽内；液状石蜡温度以10-25℃为宜，室温10-20℃，滴头温度30-60℃，开始滴丸。滴出的胶丸先均匀地摊于纱网上，在10℃以下低温吹风4小时以上，再用擦丸机擦去表面的石蜡，然后再低温(10℃以下)吹风20小时以上，于40-50℃干燥约24小时。取出干燥的胶丸，灯检，除去废丸后，用95％乙醇洗涤，再在40-50℃以下吹干，经质量检查合格后，即可包装。
实施例11：贯叶金丝桃总黄酮胶囊剂
组分 量
贯叶金丝桃总黄酮提取物 5-300g
淀粉 125g
70％乙醇 适量
将淀粉、贯叶金丝桃总黄酮提取物混匀，过80目筛，加入适量的70％乙醇，制软材，再用20目筛制颗粒，干燥，整粒，装胶囊，共制成1000粒，每粒含贯叶金丝桃总黄酮提取物5-300mg，即可。
实施例12：贯叶金丝桃总黄酮颗粒剂
组分 量
贯叶金丝桃总黄酮提取物 0.1-10g
糊精 28g
糖粉 10g
酒石酸 1g
50％乙醇(体积分数) 适量
贯叶金丝桃总黄酮提取物、糊精、糖粉分别过100目筛，按等体积递增配研法将罗布麻叶总黄酮组合物与辅料混匀，再将酒石酸溶于50％乙醇(体积分数)中，一次加入上述混合物中，混匀，制软材，过16目尼龙筛，60℃以下干燥，整粒后用塑料袋包装，每袋2g，即可。
实施例13：贯叶金丝桃总黄酮混悬剂
组分 量
贯叶金丝桃总黄酮提取物 0.2-40g
羟甲基纤维素钠 5g
甘油 100ml
蒸馏水 适量
贯叶金丝桃总黄酮提取物于乳钵中，加甘油研磨成细腻糊状，另将羟甲基纤维素钠用200ml水制成胶浆，在搅拌下缓缓加入乳钵中研匀，移入量器中，加蒸馏水至全量，搅匀，即得。
实施例14：贯叶金丝桃总黄酮口服液
组分 量
贯叶金丝桃总黄酮提取物 0.2-40g
炼蜜 30g
山梨酸 5g
枸橼酸钠 5g
香精 1ml
水 适量
将贯叶金丝桃总黄酮提取物溶于水中，加入炼蜜、山梨酸、枸橼酸钠、香精混匀，制成200ml，封装，即得。
以上实施例仅为了对本发明作进一步说明，而本发明范围不受所举实施例的局限。
Claims (8)
1、贯叶金丝桃总黄酮提取物，其特征是所述提取物总黄酮含量为80-95％；其所含黄酮成分为：芦丁5.0-50.0％、金丝桃苷6.0-70.0％、异槲皮苷3.0-10.0％、扁蓄苷0.5-5.0％、槲皮苷0.5-5.0％、槲皮素0.1-1.0％，其他黄酮类成分余量。
2、权利要求1所述贯叶金丝桃总黄酮提取物的制备方法，其特征是按如下步骤操作：
a、将干燥的贯叶金丝桃粉碎成粗粉，用8-10倍量的30-95％乙醇水溶液加热回流提取；
b、将步骤a所得提取液在50℃-60℃的条件下减压浓缩至60℃时比重为1.13-1.16的浸膏，加入原生药量4-6倍量沸水，分次溶解，静置24小时过滤；
c、将步骤b所得滤液通过聚酰胺和大孔吸附树脂混合柱层析，或通过聚酰胺柱层析，首先用水冲洗，再用不同浓度醇水溶液分段洗脱、收集、浓缩，所述分段洗脱、收集、浓缩的操作过程为：
用10-20％乙醇水溶液或10-20％甲醇水溶液洗脱1-3个柱体积、去除洗脱液；
用40-50％乙醇水溶液或40-50％甲醇水溶液洗脱，按照洗脱时间的先后顺序，分段收集，分别获得前段洗脱液、中段洗脱液和后段洗脱液，去除前段和后段洗脱液；
将所述中段洗脱液在50℃-60℃条件下减压浓缩，真空干燥得贯叶金丝桃总黄酮提取物；
d、将步骤c中所得贯叶金丝桃总黄酮提取物用甲醇或乙醇重结晶，得结晶物和结晶母液；所述结晶物通过真空干燥即获得总黄酮含量达到80％-95％、金丝桃苷含量达50％的贯叶金丝桃总黄酮提取物A；所述结晶母液在50℃-60℃条件下减压浓缩，并经真空干燥获得总黄酮含量达到80％-95％、芦丁含量达40％的贯叶金丝桃总黄酮提取物B。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征是在所述步骤c中的分段洗脱、收集、浓缩的操作过程为：
用40-50％乙醇水溶液或40-50％甲醇水溶液洗脱4个柱体积、以每1个柱体积的洗脱液为1份，按照洗脱时间的先后顺序，分段收集，分别获得第一段至第四段共4份洗脱液，去除第一段和第四段洗脱液，并合其中第2至第3段洗脱液得中段洗脱液；
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是在所述步骤d中的重结晶操作过程为：
将步骤c所得贯叶金丝桃总黄酮提取物，加10倍量的甲醇或乙醇，置80℃-90℃水浴中加热回流提取2小时，乘热抽滤，滤液在50℃-60℃条件下减压浓缩至1/4体积，在4℃的环境中放置2-5天，经过滤得结晶物和结晶母液，结晶物用甲醇或乙醇抽洗两次，抽干，洗液备用，结晶物在低于60℃条件下真空干燥，得总黄酮含量达到80％-95％、金丝桃苷含量达50％的贯叶金丝桃总黄酮提取物A；
洗液与结晶母液合并在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得贯叶金丝桃总黄酮含量达到80％-95％、芦丁含量达40％的贯叶金丝桃总黄酮提取物B。
5、根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤a中用于回流提取的乙醇为60-80％乙醇水溶液。
6、权利要求1或2所述贯叶金丝桃总黄酮提取物的中药制剂，其特征是所述中药制剂是以所述贯叶金丝桃总黄酮提取物为药物有效成份，加入药用辅料后制成的滴丸、片剂、胶囊剂、软胶囊、颗粒剂、混悬剂、口服液、粉针剂、注射剂、输液。
7、权利要求2所述贯叶金丝桃总黄酮提取物A用于保肝、治疗乙肝性疾病。
8、权利要求2所述贯叶金丝桃总黄酮提取物B用于治疗心脑缺血性疾病。
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