发明内容
本发明的技术方案是提供了一种治疗颈椎病的药物组合物,它是由川芎、葛根为原料制备而成药剂。本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法和用途。
本发明提供了一种治疗颈椎病的药物组合物,它是由下述重量配比的原料制备而成的药剂:
川芎1-20份、葛根0.5-10份。
进一步地,它是由下述重量配比的原料制备而成的药剂:
川芎20份、葛根1份。
所述的药物是由川芎总生物碱、葛根总黄酮为活性成分,加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
进一步地,所述的川芎总生物碱以盐酸川芎嗪计为:不低于50%(g/g);葛根总黄酮以葛根素计为:不低于70%(g/g)。
它是由下述重量配比的原料制备而成的药剂:川芎总生物碱1-20份、葛根总黄酮0.5-10份。
进一步地,它是由下述重量配比的原料制备而成药剂:
川芎总生物碱1份、葛根总黄酮1份。
其中,所述的药剂是:片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、缓释制剂。
所述的缓释制剂是由下述重量配比的原料及辅料制备而成的:
川芎总生物碱0.5-5份、葛根总黄酮0.5-5份、缓释制剂用辅料:1~10份。
其中,所述的缓释制剂用辅料为:乙基纤维素类EC20cp、EC45cp、EC N-10、EC200cp、羟丙甲纤维素类HPMC15cp、脂质类。
进一步地,它是由下述重量配比的原料及辅料制备而成:
川芎总生物碱0.5-5份、葛根总黄酮0.5-5份、EC N-10 1~9份、HPMC 0.2~1.0份。
更进一步,它是由下述重量配比的原料及辅料制备而成:
川芎总生物碱0.5份、葛根总黄酮0.5份、EC N-10 3份、HPMC 0.5份。
本发明还提供了该药物组合物的制备方法,包括如下步骤:
a、取川芎药材粗粉,以pH值2~3酸水浸泡、渗漉,渗漉速度4~5ml/min(以每Kg药材计),收集渗漉液,通过大孔吸附树脂,洗脱液再通过强酸性阳离子交换树脂,用一定浓度盐酸洗脱,收集洗脱液,浓缩,浓缩液通过大孔吸附树脂,收集过柱液,干燥,即得川芎总生物碱;
b、取葛根,用50~90%乙醇回流提取,乙醇提取液减压回收乙醇,滤过,通过吸附树脂柱,以30%~90%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,干燥,即得葛根总黄酮;
c、将b、c步骤制备的川芎生物碱、葛根总黄酮按下述重量配比,加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的剂型:
川芎总生物碱0.5-5份、葛根总黄酮0.5-5份。
其中,b步骤所述的回流提取乙醇浓度为50%乙醇;乙醇洗脱的浓度为70%乙醇。
川芎性辛温,入肝、胆、心包经。具有行气活血,祛风止痛之功效。川芎辛温香走窜,走而不守,能上行头巅,下达血海,外彻皮毛,旁通四肢,为血中之气药。为活血化瘀常用中药,治疗椎动脉型颈椎病引起的眩晕有较好的疗效。《本草纲目·主治第四卷·百病主治药·眩晕》引刘河间《宣明论》云:“首风旋运及偏正头痛,多汗恶风,胸膈痰饮,川芎一斤,天麻四两,为末,炼蜜为丸,如弹子大,每嚼一丸,清茶下”。葛根味甘、辛,性凉。归脾、胃经。功能发表解肌,升阳透疹,解热生津。葛根气味俱薄,轻而上行,《证类本草·卷八·葛根》指出其“生者,破血”,故葛根能升阳化瘀。与川芎配伍,可以助川芎行气活血,舒筋通络,共奏活血化瘀。
通过药效学试验说明,本发明药物原料川芎、葛根配伍,能有效的治疗颈椎病,达到协同增效的作用,其中进一步将川芎中的活性成分川芎生物碱及葛根活性成分葛根总黄酮配比使用,同样发挥协同增效的作用,且由于有效部位确定,减少服用剂量,便于制剂及制备成中药缓释剂型,使缓释功效充分适于本发明的适应症,达到长效目的。综上,本发明药物原料川芎、葛根或川芎生物碱、葛根总黄酮配伍使用,达到协同增效的作用,药效明确,质量稳定,可控性强,为临床提供了一种新的选择。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以作出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明药物原料的提取
a、川芎生物碱的制备:取川芎药材粗粉,以pH值2~3酸水浸泡、渗漉,以每Kg药材计,渗漉速度为4~5ml/min,收集渗漉液,通过大孔吸附树脂,洗脱液再通过强酸性阳离子交换树脂,用一定浓度盐酸洗脱,收集洗脱液,浓缩,浓缩液通过大孔吸附树脂,收集过柱液,干燥,即得川芎总生物碱;
b、葛根总黄酮的制备:取葛根,用50%乙醇回流提取,乙醇提取液减压回收乙醇,滤过,通过吸附树脂柱,以70%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,干燥,即得葛根总黄酮。
实施例2本发明药物原料的提取
a、川芎生物碱:取川芎药材粗粉,以pH值3酸水浸泡、渗漉,以每Kg药材计,渗漉速度为5ml/min,收集渗漉液,通过大孔吸附树脂,洗脱液再通过强酸性阳离子交换树脂,用一定浓度盐酸洗脱,收集洗脱液,浓缩,浓缩液通过大孔吸附树脂,收集过柱液,干燥,即得川芎总生物碱;
b、葛根总黄酮:取葛根,用50%乙醇回流提取,乙醇提取液减压回收乙醇,滤过,通过吸附树脂柱,以30%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,干燥,即得葛根总黄酮。
实施例3 本发明药物原料的提取
a、川芎生物碱:取川芎药材粗粉,以pH值2酸水浸泡、渗漉,以每Kg药材计,渗漉速度为4ml/min,收集渗漉液,通过大孔吸附树脂,洗脱液再通过强酸性阳离子交换树脂,用盐酸洗脱,收集洗脱液,浓缩,浓缩液通过大孔吸附树脂,收集过柱液,干燥,即得川芎总生物碱;
b、葛根总黄酮:取葛根,用90%乙醇回流提取,乙醇提取液减压回收乙醇,滤过,通过吸附树脂柱,以90%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,干燥,即得葛根总黄酮。
实施例4本发明药物胶囊制备
按重量比称取实施例1制备的1份川芎总生物碱和1份葛根总黄酮,混匀,加2份乳糖,用适量95%乙醇润湿,湿法制粒,过14~16目筛整粒,60℃干燥,取出,再过14~16目筛整粒,装胶囊即得。
实施例5本发明药物缓释胶囊制备
按重量比称取3份乙基纤维素(EC N-10),0.5份羟丙甲纤维素(HPMC15cp),无水乙醇溶解,备用。另取实施例1制备的0.5份川芎总生物碱和0.5份葛根总黄酮,用适量无水乙醇溶解,加入到已经溶解的乙基纤维素和羟丙甲纤维素中,搅拌均匀,旋转蒸发仪减压回收乙醇,待乙醇挥尽后,取出,60℃干燥,粉碎,过14~16目筛整粒,装胶囊即得。
实施例6本发明药物片剂的制备
按重量比称取实施例1制备的1份川芎总生物碱和1份葛根总黄酮,混匀,加2份乳糖,用适量95%乙醇润湿,湿法制粒,过14~16目筛整粒,60℃干燥,取出,再过14~16目筛整粒,再加适量微晶纤维素和滑石粉,混匀,压片,即得。
实施例7本发明药物缓释片制备:
按重量比称的3份乙基纤维素(EC N-10),0.5份羟丙甲纤维素(HPMC15cp),无水乙醇溶解,备用。另取取实施例1制备0.5份川芎总生物碱和0.5份葛根总黄酮,用适量无水乙醇溶解,加入到已经溶解的乙基纤维素和羟丙甲纤维素中,搅拌均匀,旋转蒸发仪减压回收乙醇,待乙醇挥尽后,取出,60℃干燥,粉碎,加1份乳糖,用适量95%乙醇润湿,湿法制粒,过14~16目筛整粒,60℃干燥,取出,再过14~16目筛整粒,再加适量微晶纤维素和滑石粉,混匀,压片,即得。
实施例8本发明药物颗粒制备
按重量比称取实施例1制备的1份川芎总生物碱和1份葛根总黄酮,混匀,加2份乳糖,用适量95%乙醇润湿,湿法制粒,过14~16目筛整粒,60℃干燥,取出,再过14~16目筛整粒,即得。
实施例9本发明药物胶囊制备
按重量比称取20Kg川芎和1Kg葛根,按实施例的方法提取得到提取物,混匀,加乳糖,用适量95%乙醇润湿,湿法制粒,过16目筛整粒,60℃干燥,取出,再过16目筛整粒,装胶囊即得。
实施例10本发明药物片剂的制备
按重量比称取2Kg川芎和10Kg葛根,按实施例1的方法提取得到提取物,混匀,加乳糖,用适量95%乙醇润湿,湿法制粒,过15目筛整粒,60℃干燥,取出,再过15目筛整粒,再加适量微晶纤维素和滑石粉,混匀,压片,即得。
实施例11本发明缓释制剂辅料选择的筛选试验
目前常用的缓释固体分散体载体材料有乙基纤维素(EC)、Eudragit E、RL、RS及脂质类等。EC不溶于水,但能溶于有机溶剂中,为白色至微黄色流动性粉末,无臭、无味,化学性质稳定,耐碱、耐盐溶液;EC有较大的粘性,载药量高,稳定性好,不易老化,是理想的缓释固体分散物载体材料。溶剂法制备缓释固体分散体,其成型原理是:EC在乙醇溶液中溶解,呈网状结构,将溶剂蒸发除去后,药物以分子或微晶状态包埋在EC的网状骨架中,处于高度分散状态。
(1)固体分散体制备
固体分散体的常用制备方法有熔融法、溶剂法、溶剂—熔融法以及喷雾干燥法、冷冻干燥法等。
取适量EC20cp、EC45cp、ECN-10、EC200cp四种不同粘度的乙基纤维素(EC),无水乙醇溶解,备用。取辅料量一半的处方药物粉末,用适量无水乙醇溶解,加入到已经溶解的EC中,置水浴中加热蒸发,边加热边搅拌,待乙醇挥尽后,60℃干燥,取出,粉碎,过14~16目筛整粒,装一号胶囊即得。
(2)溶出度测定方法学考察
①溶出条件 转速:100转/分钟;温度:37±0.5℃
②释放介质的选择
本发明药物中的药物葛根提取物在水中不能很好地溶解,以水作介质虽然能达到药物释放的“漏槽条件”(即投入药量不得超过溶解度的10~20%),但仍有可能药物不能释放完全,因此释放介质可选用经脱气处理的0.1M的盐酸或在其中加入表面活性剂。结果见表1。
表1 释放介质的筛选
释放介质 |
葛根总黄酮累积溶出百分率(%) |
1h |
3h |
6h |
8h |
10h |
12h |
0.1M盐酸含0.3%SLS的0.1M盐酸 |
11.5439.56 |
30.4667.97 |
40.8786.07 |
56.7591.12 |
66.6193.65 |
68.7197.44 |
结果表明,加入十二烷基硫酸钠质能使葛根总黄酮更完全地溶解其中,因此选择加入0.3%十二烷基硫酸钠的0.1M盐酸溶液为释放介质。
③测定方法
取胶囊1粒,照《中华人民共和国药典》二部溶出度测定法第一法(转篮法)操作,于1、2、4、6、8、10、12小时取样5ml,经0.8μm微孔滤膜滤过,加空白溶剂(含0.3%十二烷基硫酸钠的0.1M盐酸)定容至10ml,摇匀,分取5ml样品溶液,分别在250nm和298nm处测定吸收度值,根据双波长法所得标准曲线,计算葛根素的累积溶出百分率。另取剩余5ml溶液,加2%新鲜配制的雷氏铵盐溶液3ml,按川芎生物碱含量测定方法进行操作,525nm测定吸光度,并计算川芎总生物碱的累积溶出百分率。
(3)样品溶出度测定
取前述不同粘度EC制备的固体分散体胶囊一粒,照《中华人民共和国药典》二部溶出度测定法第一法(转篮法)操作,于1、2、4、6、8、10、12小时取样5ml,经0.8μm微孔滤膜滤过,加空白溶剂(含0.3%十二烷基硫酸钠的0.1M盐酸)定容至10ml,摇匀,分取5ml样品溶液,分别在250nm和298nm处测定吸收度值,根据双波长法所得标准曲线,计算葛根素的累积溶出百分率。另取剩余5ml溶液,加2%新鲜配制的雷氏铵盐溶液3ml,按川芎生物碱含量测定方法进行操作,525nm测定吸光度,并计算川芎总生物碱的累积溶出百分率。结果见表2,表3。
表2 不同种类辅料葛根总黄酮累积溶出百分率比较
时间 |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
EC20cpEC45cpECN-10EC200cp |
21.1245.2749.4510.23 |
47.1361.5965.4515.65 |
69.8569.2776.5926.45 |
78.4476.1180.7332.69 |
82.1478.3884.3344.51 |
82.8179.5285.0449.86 |
83.0181.3290.1156.78 |
表3 不同种类辅料川芎总生物碱累积溶出百分率比较
时间 |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
EC20cpEC45cpECN-10EC200cp |
41.3247.6544.6217.83 |
55.8764.1365.4525.65 |
71.2173.4572.3834.23 |
78.4476.1180.7341.54 |
83.1480.3185.6751.51 |
85.8183.2188.1359.78 |
87.0185.4197.4266.83 |
从表2,表3葛根总黄酮和川芎总生物碱释放效果来看,EC20cp、EC45cp、ECN-10三种规格的辅料制备的缓释固体分散体均能达到缓释的效果,以ECN-10释放较完全,而EC200cp由于粘度过大的原因,在12小时内仅释放不到60%。同时,在试验过程中发现,不同规格的EC在无水乙醇中的溶解性略有区别,EC N-10粉末较细,溶解性较好。因此,初步选定以EC N-10为基本辅料进行成型工艺筛选。
辅料用量筛选
分别取不同量EC N-10,无水乙醇溶解;另取一定量的处方药物粉末,用适量无水乙醇溶解,加入到已经溶解的EC中,辅料和药物比例分别为1∶1;2∶1;3∶1;4∶1;5∶1,6∶1,10∶1,各样品置水浴中加热蒸发,边加热边搅拌,待乙醇挥尽后,60℃干燥,取出,粉碎,过14~16目筛整粒,装一号胶囊。测定各样品的体外释放度,求出累积释放百分率,考察不同辅料用量对药物体外释放特性的影响。结果见表4,表5。
表4 不同辅料用量葛根总黄酮累积释放度
辅料药物比例 |
葛根总黄酮累积释放度(%) |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
1∶12∶13∶14∶15∶16∶110∶1 |
68.9949.4530.6428.224.4419.6913.23 |
75.5465.4554.6843.932.3223.4318.87 |
85.6576.666.2349.639.3231.4124.18 |
92.380.775.8657.946.241.728.03 |
98.6584.5383.0163.552.547.6133.8 | 85.0488.070.6959.9656.4839.32 | 93.0292.377.3269.7265.9645.65 |
表5 不同辅料用量川芎总生物碱累积释放度
辅料药物比例 |
川芎总生物碱累积释放度(%) |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
1∶12∶13∶14∶15∶16∶110∶1 |
72.3652.2332.5328.7124.4421.6914.1 |
78.5468.5657.8247.7832.3226.218.87 |
89.7678.8568.5356.7539.0133.425.18 |
98.2183.2679.6363.8247.240.732.03 | 87.6885.1474.4353.546.638.8 | 91.2489.3281.8859.9654.646.32 | 96.3293.7689.7668.7260.9654.65 |
从表4,表5可以看出,随着辅料与药物比例增大,药物的释放逐渐变慢,两者比例为1∶1时,几乎没有缓释效果,比例为2∶1时,基本有缓释效果,辅料与药物比例3∶1时,可达到理想的缓释效果,同时又不会过多的增加服用量。
释放调节剂HPMC的筛选
为考察HPMC对缓释固体分散体体外释放性能的影响,选用HPMC 15cp和HPMC50cp在已经筛选出处方的基础上进行考察。以确定是否需要释放调节以及调节剂的用量。
分别取2份ECN-10,每份3g,无水乙醇溶解;另取1g的处方药物粉末各2份,用适量无水乙醇溶解,加入到已经溶解的EC中,同法称取HPMC 15cp和HPMC 50cp各0.5g,无水乙醇溶解,加入前述溶液中,各样品置水浴中加热蒸发,边加热边搅拌,待乙醇挥尽后,60℃干燥,取出,粉碎,过14~16目筛整粒,装一号胶囊。测定各样品的体外释放度,求出累积释放百分率,考察HPMC对药物体外释放特性的影响。结果见表6,表7。
表6 HPMC对固体分散体中葛根素体外释放特性的影响
处方 |
葛根总黄酮累积释放度(%) |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
1(HPMC15cp)2(HPMC50cp) |
30.0913.23 |
55.8719.3 |
69.7834.65 |
79.4746.39 |
88.3556.55 |
93.2163.89 |
96.472.01 |
表7 HPMC对固体分散体中川芎总生物碱体外释放特性的影响
处方 |
川芎总生物碱累积释放度(%) |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
1(HPMC15cp)2(HPMC50cp) |
30.1817.35 |
58.7429.21 |
69.7642.4 |
81.3254.59 |
89.3563.43 |
94.4368.46 |
98.3173.5 |
从以上实验可看出,HPMC粘度的增大对固体分散体体外释放阻滞较大,可能由于粘度过大,在药物表面形成的凝胶层阻滞了药物的释放。因此,选用HPMC15cp为释放调节剂进行研究。
HPMC用量筛选
分别称取EC,HPMC,处方药物适量,按照下表所列的重量比例制备固体分散体,测定体外累积释放度,筛选出HPMC的用量,试验设计见表8,试验结果见表8,表10。
表8 HPMC用量筛选试验设计
处方号 |
EC |
HPMC |
药物 |
1234 |
3333 |
0.20.50.71.0 |
1.01.01.01.0 |
表9 HPMC用量筛选试验样品葛根总黄酮累积释放度
处方号 |
葛根总黄酮累积释放度(%) |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
1234 |
35.4930.0923.0920.3 |
55.7845.8740.1233.65 |
68.8363.7857.3455.74 |
76.5579.4770.8565.89 |
84.188.3580.3676.86 |
89.1193.2186.0380.6 |
95.496.494.0583.72 |
表10 HPMC用量筛选试验川芎总生物碱累积释放度
处方号 |
川芎总生物碱累积释放度(%) |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
1234 |
41.2325.3825.6721.74 |
57.9843.6545.4642.3 |
69.0365.6565.6456.65 |
78.8680.9778.3267.45 |
86.3487.8288.5478.2 |
89.3496.5396.1185.32 |
94.6498.3897.4588.56 |
从试验结果来看随着HPMC用量的增加,固体分散体中葛根总黄酮和川芎总生物碱释放速度变快,但当处方中HPMC比例超过15%时,释放反而变慢。因此在能达到缓释效果的前提下,应尽可能的减少HPMC的用量,以减少处方剂量。基于以上考虑,暂选处方2作为缓释固体分散体的处方。
处方验证试验
根据试验所确定的处方,制备三批处方药物缓释固体分散体,测定体外释放度,验证处方的合理性和工艺的稳定性。结果见表11。
表11 处方验证试验累积溶出度(n=6)
样品批次 |
取样时间 |
1h |
2h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
葛根总黄酮累积释放度(%) |
123 |
26.3428.8229.54 |
39.2340.9743.65 |
66.3268.2563.25 |
80.0881.7879.64 |
87.8889.3488.55 |
94.2194.0692.65 |
97.3096.7698.43 |
川芎总生物碱累积释放度(%) |
123 |
27.1825.7825.24 |
42.8743.4541.25 |
61.7662.3563.25 |
81.6277.4880.64 |
89.3588.7690.85 |
97.4396.1296.65 |
98.3198.5498.67 |
从三批制剂的累积溶出度来看,缓释固体分散体中葛根素和川芎总生物碱的累积释放均满足缓释制剂体外释放度实验在1、4、8、10小时时,累积百分释放度应分别满足10~30%、40~70%、70~90%、80~100%的要求,释放效果稳定。证明所选处方工艺基本合理,稳定。
实施例10 本发明药物的质量控制方法
川芎总生物碱含量测定方法
方法原理:利用川芎总生物碱为水溶性生物碱的性质,在酸性条件下与雷氏铵盐反应,生成不溶于水的生物碱雷氏铵盐沉淀,分离沉淀,以丙酮溶解,生物碱雷氏铵盐在525nm处有最大吸收,可以盐酸川芎嗪作为对照进行含量测定。
对照品溶液制备:精密称取盐酸川芎嗪对照品(批号:0817-200104)24.7mg,以0.1mol/L的盐酸溶解并定容至25ml,即得浓度为0.988mg/ml的对照品溶液。
标准曲线制备:精密吸取对照品溶液1.0ml,1.5ml,3.0ml,4.0ml,5.0ml,6.0ml,分别加0.1M盐酸至10ml,加2%雷氏盐溶液3ml,摇匀,置冰水浴30min。取出,用小号垂熔玻璃漏斗抽滤,沉淀用适量蒸馏水洗涤,抽干,以丙酮溶解并定容至5ml,350~700nm扫描,找出最大吸收波长,并在最大吸收波长处测吸光度,以吸光度为纵坐标,样品浓度为横坐标绘制工作曲线。
显色后对照品丙酮溶液在525nm处有最大吸收,因此可以在525nm处测定吸光度值。线性回归方程:Y=0.5298X-0.019,r=0.9996.
在0.1976mg/ml~1.186mg/ml范围内,线性关系良好。
样品溶液制备:取样品渗漉液适量,调pH值2~3,过已经处理好的D101大孔树脂柱,收集过柱液,加2%雷氏铵盐溶液5ml,摇匀,置冰水浴30min。按照标准曲线制备项下“取出,用小号垂熔玻璃漏斗抽滤”起操作,525nm处测定吸光度。
葛根总黄酮的含量测定方法
吸收波长的选择
取葛根素对照品适量,加甲醇溶解,在200~400nm扫描,测定最大吸收波长。另取葛根药材提取液适量,挥干,加甲醇溶解,过滤,取滤液在200~400nm进行扫描。
葛根样品与葛根素对照品有相同的紫外吸收,且最大吸收波长均为250nm,故选择250nm为测定波长。
标准曲线的绘制
精密称取葛根素对照品3.51mg,加甲醇溶解成100mL,摇匀,分别精密吸取上述溶液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0mL于10mL量瓶中,加甲醇至刻度,于250nm处测定吸光度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,结果见表12。
表12 葛根素对照品标准曲线测定结果
浓度(μg/ml) |
1.75 |
3.51 |
7.02 |
8.78 |
10.53 |
吸光度 |
0.149 |
0.309 |
0.620 |
0.771 |
0.921 |
回归方程:A=0.088C-0.002 r=0.9999,表明葛根总黄酮浓度在1.75至10.53μg.mL-1之间线性关系良好。
供试品溶液的制备
精密吸取葛根药材提取后的浓缩液10mL于蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加甲醇溶解,滤过,定容至50mL,作为供试品溶液,250nm处测定吸光度,计算总黄酮含量。
以下通过药效学试验证明本发明药物的有益效果。
试验例1 本发明药物原料药效筛选试验
实验用仪器和试药
LG-R-80B型血液粘度仪(北京中勤世帝科学仪器有限公司)
盐酸肾上腺素注射液(1mg/ml)(广州明兴制药有限公司)
肝素钠(1mg/ml)(广州明兴制药有限公司)
川芎总生物碱提取物(本室提供)
葛根提取物(本室提供)
试验动物及分组
试验动物:SD大鼠90只,雌雄各半,体重280~300g,按体重随机分为9组,每组10只,分别为:
空白组,模型组,生物碱组,葛根素组,生物碱∶葛根素(1∶1)高、中、低剂量三组;生物碱∶葛根素(1∶2);生物碱∶葛根素(2∶1)。
试验方法和给药剂量
试验前大鼠先适应性饲养2天,空白组和模型组灌生理盐水,给药组大鼠分别灌胃给药,每天一次,连续灌胃7天,于末次给药当天造模。除空白组外,其余各组大鼠每只皮下注射Adr0.08ml/100g,共2次,两次间隔4h,在二次注射Adr之间(前后各间隔2h),将大鼠浸入冰水内5min,禁食至次日取血,加肝素钠100μg/ml抗凝,测定各指标,并通过仪器软件计算其他指标。
给药剂量:
为了合理设计试验用药剂量和两药比例,本研究对两味药中间体配伍后对大鼠血液流变性指标的影响做了预试,在预试中发现,川芎总生物碱和葛根总黄酮在1∶1配伍时,活血化瘀作用较明显,因此,在筛选时对两药1∶1配伍设计了高、中、低三个剂量组,处方2和处方3设计了一个剂量组,以同处方1三个剂量组比较。试验各组如下:
生物碱组:2mg/100g;葛根素组:2mg/100g;
处方1:高剂量组:生物碱∶葛根素(1∶1)4mg/100g;
中剂量组:生物碱∶葛根素(1∶1)2mg/100g;
低剂量组:生物碱∶葛根素(1∶1)1mg/100g;
处方2:生物碱∶葛根素(1∶2)2mg/100g;
处方3:生物碱∶葛根素(2∶1)2mg/100g;
试验结果及统计学处理
实验结果见下表13。
表13 川芎总生物碱和葛根总黄酮不同配比及用量对血瘀证模型大鼠血流变性的影响(
X±s)
组别 |
切变率1/200s全血粘度(mPa·S) |
切变率1/30s全血粘度(mPa·S) |
切变率1/5s全血粘度(mPa·S) |
切变率1/1s全血粘度(mPa·S) |
切变率1/100s血浆粘度(mPa·S) |
红细胞压积(L/L) |
空白组模型组生物碱组葛根组 |
4.66±1.937.77±2.64**5.34±1.19△5.01±1.41△ |
6.55±2.8210.40±2.41**7.65±1.93△7.42±1.27△ |
12.47±0.61317.80±0.39*13.27±0.23△13.48±0.58△ |
31.33±1.81144.56±4.92*38.69±0.5738.42±4.06 |
2.49±0.953.82±1.56*3.65±0.923.74±0.69 |
0.49±0.120.64±0.17*0.51±0.082△0.49±0.091△ |
处方1 |
低剂量 | 5.33±1.67△ | 7.67±2.05△ | 14.89±0.31 | 37.75±6.44 | 3.57±0.91 | 0.52±0.059 |
中剂量 | 4.79±1.91△ | 6.57±1.4△△ | 1.94±0.40△△ | 32.41±3.22△ | 2.54±0.13△ | 0.49±0.097△ |
高剂量 | 4.57±1.93△△ | 6.32±1.7△△ | 11.71±0.55△△ | 28.48±4.09△△ | 2.31±0.04△ | 0.48±0.08△ |
处方2 |
2mg/100g | 5.12±1.01△ | 7.42±0.95△ | 13.92±0.65△ | 35.75±4.34△ | 2.81±0.24△ | 0.57±0.043 |
处方3 |
2mg/100g | 5.41±0.54△ | 7.38±1.25△ | 13.46±2.37△ | 34.75±3.48△ | 2.61±0.57△ | 0.52±0.062△ |
注:模型组与空白对照组相比,*P<0.05;**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05;△△P<0.01
从表13可见,模型组大鼠血流变性各指标与空白组指标比较,全血粘度、血浆粘度以及红细胞压积均显著升高,其中全血粘度(切变率1/200s),全血粘度(切变率1/30s)极显著升高(p<0.01=,说明“血瘀”证大鼠造模成功。与模型组比较,在试验给药剂量下,川芎总生物碱提取物和葛根总黄酮提取物对“血瘀”证大鼠全血粘度(切变率1/200s,1/30s,1/5s)、红细胞压积可显著降低,对全血粘度(切变率1/1s)、血浆粘度具有降低作用趋势(p>0.05);两药配伍组中,1∶1配伍后低剂量组可显著降低“血瘀”证大鼠全血粘度(切变率1/200s,1/30s)、对全血粘度(切变率1/5s,1/1s)、血浆粘度以及红细胞压积具有降低作用趋势;中剂量组对“血瘀”证大鼠全血粘度(切变率1/200s,1/1s)、血浆粘度(切变率1/100s)以及红细胞压积均可显著降低,对全血粘度(切变率1/30s,1/5s)可极显著降低,比相同剂量组,但二者配伍比例不同的处方2和处方3对对“血瘀”证大鼠各血流变性指标具有更加明显的降低;处方1高剂量组对“血瘀”证大鼠全血粘度(切变率1/200s,1/30s,1/5s,1/1s)可极显著降低、对血浆粘度(切变率1/100s)以及红细胞压积均可显著降低。因此,在确保处方有效的前提下,可选择川芎总生物碱和葛根总黄酮二者1∶1配伍中剂量组。
试验例2 本发明药物缓释固体分散体药代动力学试验
为进一步研究本发明药物缓释固体分散体在体内的吸收和代谢情况,进行了犬体内药动学试验。
根据现有资料,葛根总黄酮目前针对葛根素的药动学研究较多。药动学结果显示,葛根素大鼠口服给药后24小时,约37%在粪便和肠道内容物中回收,说明口服生物利用度低。正常人口服葛根素后36小时仅有0.78%原形物自尿中排出,72小时后自粪便排出73.3%,说明人口服葛根素吸收极少。
试验仪器,试药及动物
岛津LC-10A高效液相色谱仪,高速离心机,肝素钠,比格犬(体重10kg±0.5kg),本发明药物普通胶囊(自制),本发明药物缓释胶囊(自制)。
色谱条件
色谱柱:Kromasil C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱。
流动相:乙腈-水(15∶85)
流速:0.8ml/min;柱温:35℃;检测波长:250nm。
试验方法
健康比格犬,试验前禁食24小时,正常饮水,按8粒/只(每粒胶囊约含葛根素35mg,生物碱35mg)拌以少量食物随机交叉口服给药,于不同时间点前肢静脉取血3ml,处理,测定。
空白血浆的处理
取空白血浆1.0ml,加甲醇2.0mL,涡流混匀1min,高速离心(10000r/min)5min,倾取上清液,50℃N2吹干,加1mL甲醇溶解,微孔滤膜滤过,取续滤液,注入高效液相色谱仪。
含药血浆的处理
前肢静脉取血后,加肝素钠100μg/ml抗凝,10000r/min离心10min,分离血浆,精密量取血浆1.0mL,精密加甲醇2.0mL,涡流混匀1min,高速离心(10000r/min)5min,倾取上清液,50℃N2吹干,加1mL甲醇溶解,微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品,注入高效液相色谱仪,测定各指标。
样品含量测定
按照前述拟订的取样及样品处理方法,分别测定犬单剂量口服本发明药物缓释胶囊和普通胶囊后各取样点血药浓度,结果见表14,表15。
表14 本发明药物缓释胶囊药动学试验测定结果
样品 |
葛根素血药浓度(μg/ml) |
10min |
20min |
0.5h |
1h |
1.5h |
2h |
3h |
4h |
6h |
8h |
10h |
12h |
123MeanSD |
0.160.210.170.180.026 |
0.310.340.310.320.0173 |
0.710.680.680.690.017 |
1.701.671.681.680.0153 |
2.442.392.552.460.082 |
3.093.173.183.140.0493 |
4.614.534.584.560.040 |
5.295.335.365.330.0351 |
4.614.694.704.670.049 |
3.523.603.543.550.0872 |
2.562.512.592.560.040 |
1.681.701.791.730.0586 |
表15 本发明药物参比制剂普通胶囊药动学试验测定结果
样品号 |
葛根素血药浓度(μg/ml) |
10min |
20min |
30min |
40min |
60min |
2h |
3h |
4h |
5h |
6h |
8h |
123MeanSD |
1.571.551.611.580.0306 |
5.835.855.915.860.0416 |
6.686.716.786.720.0513 |
6.326.396.356.360.0351 |
5.775.795.855.810.0416 |
4.894.835.024.930.0971 |
3.593.493.713.650.1102 |
2.802.732.792.780.0379 |
2.272.292.412.340.0757 |
1.481.531.591.530.0551 |
0.590.640.700.650.0551 |
试验结果处理与分析
将所得试验数据用3P87软件进行药动学数据处理,得到如下结果:
本发明药物缓释胶囊药动学模型模拟结果:
表16 用3P87计算的本发明药物缓释胶囊与普通胶囊药动学参数
参数 |
单位 |
普通制剂 |
缓释制剂 |
AAlphaKaLagtimeT1/2alphaT1/2(beta)TpeakCmaxAUCCL/F(S)V/F(C) |
μg/ml1/h1/hhhhhμg/mlμg/ml·gmg/h(μg/ml)mg/(μg/ml) |
25.56213.73264.64990.13400.18572.27210.40776.743022.255812.760724.8687 |
9.90751.12610.53220.00460.61552.93363.78534.629039.82323.7854422.2845 |
根据室模型及权重计算各组药动学参数,并对各组药动学数据用DPS3.1统计软件进行方差分析,结果见表17,表18:
表17 本发明药物普通胶囊及缓释胶囊中葛根素的药动学参数
Parameter |
Common-release capsule |
Sustained-release capsule |
No.1 |
No.2 |
No.3 |
mean |
No.1 |
No.2 |
No.3 |
mean |
AAlphaKaLagtimeT1/2alphaT1/2(beta)TpeakCmaxAUCCL/F(S)V/F(C) |
25.05093.65794.55690.13130.18202.22670.39956.608121.810712.505524.3713 |
25.53653.72894.64530.13390.18552.26980.40736.736322.233512.747924.8438 |
26.09893.81104.74750.13680.18962.31980.41636.884622.723213.028725.3909 |
25.56213.73264.64990.13400.18572.27210.40776.743022.255812.760724.8687 |
10.11561.14970.54340.00470.62842.99523.86484.726240.65953.8649431.1525 |
9.70941.10360.52160.00450.60322.87493.70964.536439.02673.7097413.8388 |
9.89761.12500.53170.00460.61492.93073.78154.624439.78343.7816421.8622 |
9.90751.12610.53220.00460.61552.93363.78534.629039.82323.7854422.2845 |
表18 本发明药物普通胶囊及缓释胶囊中葛根素的主要药动学参数方差分析表
Parameter |
Common-releasecapsule |
Sustained-releasecapsule |
df |
均方 |
F值 |
P |
AUC(0→∞)CmaxTmax |
22.2558±0.45676.7430±0.13840.4077±0.0084 |
39.8232±0.81714.6290±0.0953.7853±0.0777 |
111 |
462.92036.703517.1123 |
1056.612475.9545607.575 |
<0.01<0.01<0.01 |
由表17,表18数据分析结果可知,本发明药物缓释胶囊和参比制剂普通胶囊在犬体内的过程均符合二室模型,主要药动学参数:Tpeak(参比)=0.4077h、Cmax(参比)=6.7430μg/ml、AUC(参比)=22.2558μg/ml·g,Tpeak(缓释)=3.7853h、Cmax(缓释)=4.6290μg/ml、AUC(缓释)=39.8232μg/ml·g。缓释胶囊Cmax比普通胶囊低31.4%,Tpeak延后3.37h,说明缓释制剂体内缓释效果明显。
根据药动学参数AUC比较缓释胶囊和普通胶囊相对生物利用度:
AUC缓释/AUC普通×100%=相对生物利用度(%)
将缓释胶囊和普通胶囊AUC代入上式,计算可得缓释制剂中葛根素的相对生物利用度为普通制剂的178.9%,提高了1.7倍多。可见,在利用缓释固体分散技术后,大大提高了葛根素的生物利用度。
通过药效学试验说明,本发明药物原料川芎、葛根配伍,能有效的治疗颈椎病,达到协同增效的作用,其中进一步将川芎中的活性成分川芎生物碱及葛根活性成分葛根总黄酮配比使用,减少服用剂量,便于制剂及制备成中药缓释剂型,使缓释功效充分适于本发明的适应症,达到长效目的,质量稳定,可控性强,为临床提供了一种新的选择。