CN102165320A - 用于去除特定的种子组织或结构进行种子分析的方法 - Google Patents

用于去除特定的种子组织或结构进行种子分析的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种减少资源的方法，该方法用于选择以商业数量生产的种子或用于研究。收集作为候选者用于选择的种子样品并给予标识符。去除来自候选种子的特定组织或结构。对候选种子或去除的组织或结构进行试验或分析。记录试验或分析的结果使其与种子标识符相关。对结果进行评价并对是否选择候选种子用于商业生产或用于研究做出决策判断。节约了与让植物在实验田或温室中生长并从生长植物取组织样品相关的时间、空间和劳动力。

Description

用于去除特定的种子组织或结构进行种子分析的方法
I.背景
A.发明领域
本发明涉及用于分析种子的方法以及根据该分析来对种子及其后续用途做出决策，具体地说，本发明涉及用于积极有效地去除特定种子组织或结构以便能够测试和分析种子及其被去除的组织或结构的方法。
B.技术问题
种子公司的一个主要目的是开发种子，该种子可生长成合乎作物生产者商业要求的植物。种子公司针对合乎商业要求的种子的研究与开发投入大量资源。
常规的研究与开发技术往往很费力并需要大量的土地和空间。研究中涉及的所有或大部分种子都种植在研究试验田。在从种子萌发长出植株后，从各植株获得组织样品。把该组织样品送到实验室以得出关于种子和来自种子的植物的研究与开发所需要的信息。
这些方法是产业中众所周知的。土地、劳动力和机器的资源成本是巨大的。
成千英亩(如果不是几十万英亩的话)的实验田可能被使用。从事耕作、种植、维护、获取植物组织样品、把植物组织样品送到实验室、在实验室进行分析的工人和机器的合适数目是巨大的。时间也是一种因素和成本。关于植物及其种子是否应当用于生产商业数量或种子的决策，或者关于植物及其种子是否应当用于进一步研究的决策，都必须等到来自出苗植物的组织样品是可行的。
一种典型的方法如下。把已知亲缘、表型或基因型的种子种植在室外实验田或种植在温室内。在田间或温室内必须生长出统计学上有效的植物数量。这包括相当大的物理空间和劳动力。在植物出苗后，从植株上取出组织样品。进行试验以鉴定出样品的遗传组成或其它特征。当然，这种方法需要花费大量的时间。植物必须生长到组织样品可以非破坏性地采集的点。样品必须小心地处理并送到实验室。遗传试验必须在目标基因的鉴定做出之前进行。
可以获得具有获取并测试(遗传学或别的方法)相关遗传材料、或组织、部分或结构而无需一定要从种子长到植物的方法，可能是有益的。正如技术人员所了解的，劳动力、时间和空间上的节约可以是巨大的。
从大多数生长植物中获取具有相关细胞材料的组织样品并不是很难。按照惯例，用某种工具(例如手工操作的叶片钻孔器)取出来自生长植物的相对小部分组织或组织样品。如果恰当做到了，那么在小的叶片钻孔器正常情况下不显著地影响植物的健康或生存力的意义上，样品的取出就是非破坏性的。例如，用叶片钻孔器钻取相关细胞用于植物分析。虽然这样的叶片样品对植物来说不是破坏性的，并且相对容易送到实验室和进行保存，从种子公司实验田中获得来自正常数量的植物的植物组织样品仍然是劳动力和时间的巨大投入。它要求各植物长在生长地点并获取叶片样品。
来自试验田植物结出的种子也具有相关的细胞材料。然而，为了获取它并对它进行试验或测定而不显著地影响种子的生存力或萌发潜力，则完全是另外一回事。大多数种子及其部分的大小相对小是一个原因。另一个是某些种子中的有关组织或结构仅仅是整个种子的一个子集(subset)，并且许多回数(times)是在外壳(outer cover)的里面。这使得它很难仅仅获取或获得有关材料。此外，某些种子的组成使得非破坏性取样很困难。玉米种子的坚韧外层或组织即粒壳(pericarp)就是一个例子。若不使用破坏或损伤种子的方法则很难去除。再者，所有的这些问题对复粒种子的高通量获取和取样都是有对抗作用的。精确去除小目标的特定组织或结构以获取其它特定组织或结构，并且如此有效地进行，是有重大意义的挑战。
因此，产业上需要显著地减少用来评价植物及其种子以用于潜在商业生产或进一步用于植物和种子研究与开发的资源。本领域还需要从种子去除和/或获取特定组织或结构的方法，包括以非破坏性的和相对高通量的方式。
II.发明概述
本发明的一个方面是一种方法，该方法用于减少将以商业数量生产的种子选择所耗资源。收集种子作为用于可能选择的候选者，并分别给予标识符。去除单粒候选种子的特定组织或结构以暴露或获取该候选种子的特定组织、部分或结构，或者以分离和收集特定组织、部分或结构。对候选种子的暴露的组织或去除的组织进行试验或分析。对该试验或分析的结果进行评价并可以对是否选择该候选种子类型进行例如商业生产做出决策。这些结果可以记录下来并且与种子的标识符相联系。该方法避开了实验田或温室中生长植物以及从生长植物取组织样品的时间、空间和劳动力。可以用相对高通量方法直接从种子快速做出决策。
根据本发明这一方面的一种装置可包括种子保持器(seed holder)和进行协调以便去除特定种子组织或结构的工具。种子保持器把一粒种子与另一粒种子隔离开并将其递给所述工具进行组织去除。然后，可以对该种子中的任一暴露组织或来自该种子的去除组织进行试验。
在本发明的另一个方面，方法包括受控制激光，其以相对快速和精确的方式切除、切割、分离或去除来自种子的组织、部分或结构以获得或暴露种子的所需部分，而不显著地影响种子生存力或萌发潜力。可以对种子的有关暴露部分或组织进行试验或分析，和/或对种子的去除部分或组织进行试验或分析。
在另一个方面，方法包括自动化步骤或自动化组件，其中可以移动到组织去除站的多粒候选种子具有去除的特定组织、部分或结构，并且具有进行试验和评价的任一(或两者)保留种子或其去除的组织。所述试验或评价可包括但不限于在细胞、分子或纳米级水平上的遗传、物理或化学分析。
III.附图简述
A.附图
图1是根据本发明一个方面的通用方法的流程图。
图2是举例说明与实施图1方法的第一个具体实施例1有关的装置和功能性的框图。
图3是根据实施例1的本发明一个方面的示意局部透视图。
图4A-C是图3的板18的平面图。
图4D是板18一个孔的放大的局部剖视图，进一步显示该孔中玉米种子的定位。
图5A和5B是典型玉米种子的放大的平面和侧面剖视图。
图6A举例说明在激光切除之前，大量玉米种子沉积在板18相应各孔中的一种方式。
图6B图解说明单粒种子沉积在板18各孔中的一种备选方式。
图7是允许为板18各孔设计切除区域的软件模板的平面示意图。
图8A是举例说明激光切除的放大的示意侧面仰视图，激光切除可去除来自种子的组织，在种子一个表面留下了矩形棱柱形状的空腔。
图8B是图8A激光切除的种子的放大的顶部平面图。
图9A-C举例说明来自种子的激光切除、特别是粒壳部分的去除以暴露或去除种子胚乳中的某些的矩形棱柱空腔80的各种视图。
图10A-C显示具有矩形棱柱空腔组合的种子，即空腔的替代切除图案。
图11A-C显示可以用激光切除成单籽粒的图案的又一个替代实施例，矩形形状中有第一通道和矩形形状中有第二通道，第二通道与第一通道间隔开，并围绕第一通道。
图12A-C显示种子中激光切除图案的另一个实施例的各种视图，此处矩形棱柱通过粒壳以暴露或切除种子胚的一部分。
图13A-C类似于图10A-C，但举例说明控制激光以产生更圆的图案。
图14A-C类似于图11A-C，但举例说明控制激光以产生圆形图案。
图15是根据本发明的一个备选实施方案的实施例2的图解说明，其中来自种子激光切除的碎片通过真空收集到容器中，然后对容器内的碎片或去除组织进行试验或分析，并与种子中的暴露组织对照。
图16是根据实施例2的方法的局部剖面侧面仰视图。
图17是用任选真空系统去除一组种子激光切除所产生的碎片的按比例缩小的图解说明，每粒种子都定位在盘或板的孔中。
图18是使用激光进行切割的任选种子切割器和基于磁力的种子保持和定向系统的图解说明。
IV.发明详述
A.概要
为了更好地理解本发明，下面详细地描述了本发明的若干示例性实施方案。要经常参考附图。用参考数字和字母来标明附图中的某些部件和位置。在整个附图中，用相同的参考数字或字母来标明相同或相似的部件和位置，除非另有说明。
B.示例性实施方案的正文
下面所描述的示例性实施方案主要是在玉米和玉米种子方面。然而，应当理解，这只不过是本发明多个方面可使用的种子的一个实施例。另外，主要示例性实施方案的正文是去除玉米籽粒的相对少量的组织或结构以(a)暴露和测试种子的特定内部组织或结构或(b)测试被去除的组织或结构。去除可被有意控制以最小化或避免对种子生存力或萌发潜力的有害作用。然而，本发明可用于实际上去除更多的组织、甚至到威胁或破坏种子生存力的点，如果应用时需要这样的话。
所述实施方案可以类似方式应用于其它种子。实例包括但不限于燕麦、大豆、小麦、黑麦、水稻、油菜(canola)、芸薹(Brassica sp.)、高粱、向日葵、大麦、黍、苜蓿、棉花、花生、亚麻、红花、棕榈、橄榄、篦麻、椰子、粟、拟南芥(arabidopsis)、番茄或高粱的种子。
C.示例性的通用方法
图1举例说明根据本发明一个方面的通用示例性方法200。方法200允许对种子进行选择以用于进一步研究或商业生产而无需从种子生长到植物后再测试植物的活组织。该方法可避免从种子生长到植物，然后获取非破坏性样品进行分析，再选择决策时所需要使用的土地、劳动力、时间、设备和材料。该方法对种子可以是非破坏性的，允许多个样品的相对高通量，且基本上自动化。方法200包括以下步骤。
对不同基因型和/或不同玉米品种的大量玉米籽粒进行分析和比较，以鉴定和选择是否有任何基因型和/或品种可用于进一步研究与开发或种植，生产商业或研究规模的数量。该方法同样适用于其它种子特异性试验或分析，这些对于技术人员来说都是显而易见的。
1.候选种子的鉴定(步骤201/202)
采用一个或多个因素来决定哪粒种子将是用于评价的候选种子(图1，步骤201)。在该实施例中，预先选择一组分别具有不同性状或基因型和/或玉米品种的大量单独的候选种子。将各候选种子与其它的候选种子分离开，但与可以鉴定候选种子的信息相联系(步骤202)。该同一性(identity)可以通过该方法与各种子相维持。各种子的鉴定可以是通过特定信息和/或通过与种子相关信息或身份有关的某些代码。它可以被记录或存储(例如在计算机的数据库)。其它方法是可能的。
候选种子的预选择可以基于任何数目的因素或标准。从事研究工作的科学家们选出了多个因素或标准。因素和标准的类型实例是本领域公知的。其中一些是基因型、表型、亲缘、性状或特征。这些因素或标准的进一步论述可以在诸如以下的参考文献中找到：(a)Chahal，G.S & Gosal，S.S.，2002.“Principles and Procedures of Plant Breeding”，Alpha Science International，United Kingdom；(b)Falconer，D.S.1989.“Introduction to Quantitative Genetics”，第三版，Longman.Burnt Mill；和(c)Frisch，M.& Melchinger，A.E.，2005.“Selection Theory for Marker-assisted Backcrossing.”Genetics：Published Articles Ahead of Print，于2005年3月31日发表，10.1534/遗传学.104.035451；这些参考文献都通过引用结合到本文中。
2.单粒种子的分离(步骤204)
通过多种方法中的任一种分离单粒候选种子以把它用来去除特定组织(图1，步骤204)以获取或暴露该种子的某个(些)特定组织、部分或结构进行试验，或收集去除的组织进行试验。对于本说明书的目的而言，有时将种子的组织、部分或结构统统称为组织。分离的一个实施例是将候选种子置于空腔或孔内。另一个是通过某种装置抓住、保持住或箝制住种子或者将种子抓到、夹到或箝到某种装置(例如用真空；通过钳夹作用)。另一个是将物质施加到种子上，种子被吸引至或保持在表面或元件上(例如胶粘剂；磁性材料)。其它的是可能的。基本功能是保持种子进行精确和有效的组织去除及将所述种子与其它的分离开来，同时保持所述种子的身份。
3.特定组织的去除(步骤205)
从种子的规定位置去除种子的组织。多种方法都可以使用。在某些方法中，可以用来将种子以某种方式第一次定向。这可能有助于规定组织的去除。
组织去除的一个实施例是使用激光(参见图3)。根据后面更详细地描述，激光的强度可以精确地控制。它也可以聚焦到可以有效地用来仅仅自种子一侧去除相对小面积的组织的束宽，和聚焦到相对小的可控深度。
激光束可以按各种方式操作以实现组织去除。一个实施例是可编程光栅扫描。控制激光束以程序化速度和方向相对于待去除区域移动。
激光束可以聚焦在种子上和跨种子精确地移动以切除它碰到的种子部分并去除组织。切除通过一个来源限定，以去除或破坏，尤其通过切割、刮擦或蒸发(汽化)去除或破坏(Merriam-Webster Online Dictionary 2007)。另一个来源将其描述为通过蒸发、切削或其它腐蚀性方法去除来自物体表面的物质(WIKIPEDIA.“Ablation”article[在线]，[于2008-08-18检索]。从因特网上检索<URL：(http://en.wikipedia.org/wlki/Ablalion>)。本文使用的切除是指去除或分离来自种子的此种子组织的这些动作或类似动作。在某些情形下，这基本上都会导致具有某组织被去除的候选种子暴露或允许接触到内部组织。切除可导致产生一块或正好几块去除组织(更多在切割或切削的意义上)。或者，切除可导致被去除的组织基本上呈碎块状(更多在来自磨蚀、腐蚀性过程的碎片或非常小的颗粒、甚至灰尘样的意义上，等等)。或者，切除可导致被去除的材料蒸发、升华或成浆。
激光可以按这些方式起作用以去除来自种子的特定组织。正如较早前提到的，可以将去除的组织收集起来用于试验或分析。或者，可以对保留种子进行试验或分析，因为可以设计组织去除以暴露或允许触及保留种子内的组织。
就玉米而论，可以控制激光束以去除粒壳区域，从而获得非破坏性地触及感兴趣的底层种子组织、部分或结构。正如图5A和5B中玉米籽粒横切面所显示的，两种可能性是胚74或胚乳76。胚74通常位于种子的尖帽末端67(tip cap end)处或其附近，及比另一个更接近种子的扁平一侧。胚乳大致沿胚侧的整个对侧延伸，但外侧变宽并占据相对于尖帽(tip cap)的种子末端内部的大部分。因此，触及来自玉米种子变平一侧的胚或胚乳是可能的，无需去除更多间插的(intervening)种子组织。特别是，可以通过基本上去除少量外种皮或粒壳而使胚或胚乳暴露出来。
经过初始化和校正，可以控制激光仅仅足以去除粒壳而获得足够的内部入口(internal access)，可以对某些所需要的内部组织或结构进行测定。也可以控制激光仅仅足以去除粒壳而获得足够触及内部，而不显著地影响种子的生存力或萌发潜力。
凭经验测试，可以调节激光束的功率和速度以满足这些目的。如图8-14所示，所去除的面积通常是籽粒一侧总面积的一部分。切除的典型深度将是通过粒壳后正好足以暴露但不破坏靶标的内部组织或结构。经过适当的安装、校正和经验测试，通过控制激光所产生的热量，仅仅去除某些种子组织，及仅仅去除这么多的种子组织以获取感兴趣的底层组织或结构，激光的操作对种子可以是非破坏性的。这样的操作在通常不显著地降低保留种子的生存力或其萌发潜力的意义上是非破坏性的。已经发现，激光包括在控制切除的移动、面积和深度的高准确度及切除效率方面的多种益处。
然而，非破坏性的种子组织去除的其它方法是可能的。一个实例是喷水器或喷磨料器(abrasive jet)(例如，市场上购自Berkeley Chemical Research，Inc.，Berkeley，CA 94706-026；Flow International Corporation，Kent，WA USA；和其它公司)。另一个是带有合适大小的刀片(bit)和尖头(tip)(例如镌刻、切割、磨碎、雕刻、砂磨或挖刨刀尖(routing bit tip)，可得自种类繁多的商业位置或在线得自Robert Bosch Tool Corporation)的磨碎工具(例如Dremel牌MultiProTM旋转工具)。去除来自种子的组织的可替代工具或方法的其它描述和说明参见美国申请序列号11/939,402，申请日为2007年11月13日，该申请已转让给本申请的所有人并通过引用全部结合到本文中。图18中的系统在申请序列号11/939,402中也有更详细的描述，它提供通过切去种子的一个单块而去除来自种子的组织的一个具体实施例。在图18的实施例中，切割工具是激光。
4.种子特异性分析(步骤206)
许多分析都可应用于已去除组织后的种子或来自该种子的去除组织。一个实施例是遗传分析。通过本领域已知的方法，例如，胚的暴露允许进行测定来检测核酸，通过该核酸可获得有关该种子的遗传信息。
一种这样的方法的一个实施例如下。在准备任何数目的PCR分析时，可以把经切除的种子浸入聚合酶链式反应(PCR)混合物中。检测器可以产生表示某些PCR方面的信号，由该信号可以获得基因型分型。这样一种信号的细节及其应用是众所周知的。种类繁多的PCR检测器是市售的。一个实例是PCR光学检测器(例如Chromo4TM实时PCR检测器，得自Bio-Rad Laboratories，Inc.，Life Science Research Group，2000 Alfred Nobel Drive，Hercules，CA 94547 USA)。
可以用核苷酸序列来分离来自其它生物、特别是其它植物、更特别是其它单子叶植物的相应序列。按这种方式，可以用例如PCR、杂交等方法来基于其序列同源性鉴定这类序列或其片段。
在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以由从任何感兴趣的植物提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，其中公开于Innis等(编著)，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand(编著)，(1995)PCR Strategies(Academic Press，new York)；和Innis和Gelfand(编著)，(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)，这些文献通过引用全文结合至本文中。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
在杂交技术中，使用全部或部分的核苷酸序列作为与存在于所选生物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组或cDNA文库)中的其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针。杂交探针可以为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可用诸如32p的可检测基团或任何其它可检测标记物进行标记。制备杂交探针以及构建基因组文库的方法是本领域公知的。
为了在多种条件下实现特异性杂交，这样的探针包括独特的且一般是长度至少约10个核苷酸或长度至少约20个核苷酸的序列。这样的探针可用于通过PCR扩增选定植物的相应序列。该技术可用于从需要的生物中分离出另外的编码序列，或作为诊断测定来确定生物中编码序列的存在情况。杂交技术包括平板DNA文库(或者为噬菌斑或者为菌落)的杂交筛选。
这些序列的杂交可以在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指探针与其靶序列的杂交程度在检测上高于与其它序列的杂交程度的条件(例如相对于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，在不同环境下将有差异。通过控制杂交严格性和/或洗涤条件，可鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。
另一种分析可以是细胞水平分析。关于玉米的一个实施例描述于Gabriella Consonni等，“ Genetic Analysis as a Tool to Investigate the Molecular Mechanisms Underlying Seed Development in
再一个实施例是纳米级分析。参见例如Georg H.H.等，“Analysis of Detergent-Resistant Membranes in Arabidopsis.Evidence for Plasma Membrane Lipid”(在阿布属中清洁剂抗性膜的分析：质膜脂质的证据)，Plant Physiol.2005年1月；137(1)：104-116，其通过引用结合到本文中。
化学分析是另一个实施例。例如，可进行多种试验来鉴定组织的化学性状。
当然，其它的方法或分析也是可能的。组织去除步骤为这样的分析提供样品。本领域技术人员熟悉可在种子上进行的不同分析和试验。
5.从候选种子中选择(步骤211)
一旦分析已经完成，来自该分析的结果或信息可以用于例如将一种种子与另一种种子区别开，或者鉴定种子的性状。这可用于相对于另一种选择一种种子，或者因为其性状选择种子。一个实施例是通过基因型分型表明是比其它基因型更抗旱的种子。通过用激光对种子的有效的非破坏性切除(或种子组织的其它去除)，以及通过合适的基因型分型测定，可以鉴定出具有抗旱遗传组成的种子。
如图1所图解说明的，可以从大量不同候选种子中进行选择。鉴定并收集不同的候选种子1，2，....，n(步骤202)。第一样品种子1(步骤203)通过步骤204、205和206进行加工处理，并记录来自步骤206的试验的结果或数据(步骤207)。一种或多种其它样品种子(例如样品2，3，....，n)进行类似的加工处理(步骤204-206)，各自存储的试验结果(207)与其鉴定信息(202)相关。这在两种或更多种样品(步骤210)之间提供一种比较基础，随后在两种或更多种(步骤211)认为是所需要的种子之间进行选择(例如用于进一步研究或商业生产)。如图1所示，样品间的比较可以基于任何能够用样品的种子特异性试验进行分析的多种因素。
重要的是，非破坏性的组织去除和分析允计做出这样的鉴定而不用将种子种植并等待去测试来自其生长植物的组织样品或者在种子种植并生长成植物时必须使用土地或温室空间、劳动力和供应。种子组织进行测试或者获取有关底层组织或结构进行测试时的受控制、准确、非破坏性去除，允计根据种子的组织进行分析后做出选择，而无需根据从种子生长出的植物进行分析后做出选择。如可以理解的那样，这代表了种子公司的选择过程中对时间、劳动力和资源(包括土地资源)的潜在巨大节约。受控制、准确、非破坏性组织去除能够基本上实现自动化，因此提高了植物选择过程的处理量(through put)和效率。
就玉米种子而论，至少外(粒壳)组织的去除很困难。对于大规模的种子，这没有考虑到如此做可实际或可行的有效和/或非破坏性。玉米种子的粒壳78(图5A和图5B)是相对坚硬的种子组织(有点像指甲)，难以与底层种子组织结构分开。任何去除粒壳部分以暴露籽粒里面的组织或结构都是既费力又困难的。这是本领域众所周知的。已尝试过多种方法来去除粒壳。一些方法包括化学浴(浸渍)或机械方法(例如磨碎)。这些都需要工人很小心并且耗时。它们也往往会对种子造成破坏。
暴露玉米种子的内部组织的一个重要原因是为了获取雄性和雌性遗传材料来测定和评价遗传内容物。这使得研究人员有能力知道种子是否含有目标基因。如果含有，则种子可以被鉴定为候选种子用于进一步研究或用于生产商业数量的种子。方法200中，可用受控制的力量以非破坏性的方式去除特定的种子组织。这又允许可以进行试验和分析、选种，然后将选出的种子种植，使其萌发，供进一步使用。一种进一步使用是从选出的种子开发商业数量的种子；例如种子公司的商品种子产品。
但是另外或或者，种子组织的去除提供了种子样品用于试验。本方法不仅可用于去除粒壳部分，而且可用于去除特定类型和数量的内部组织(例如胚乳或胚)。举例来说，激光的受控制操作可以切除粒壳区域以及正好位于粒壳之下的胚部分。来自切除的碎片(即被去除的组织)可以收集起来并进行试验。该碎片基本上是候选种子样品。因此，对碎片的试验就是对种子的试验。如果适当地控制，那么组织可以通过激光切除以保留种子的非破坏性方式去除，致使保留种子仍保留萌发潜力。然而，这并不是所需要的。通过取出候选种子的少量样品，可以马上对样品进行试验，使得可以对种子及其性状做出快速决策。因为取样和试验可以在单粒种子上进行(这对植物或植物的其它种子是非破坏性的)，所以，对于许多候选种子，本方法可以不仅快速而且提供相对高通量。
处理种子以去除种子的某些相对精确量的组织的方法还有其它有益的应用。存在需要去除种子某些部分的各种情形。上述方法采用多个步骤非破坏性地取出所需种子组织。种子组织或暴露的种子组织的其它应用是本领域众所周知的。
D.具体的实施例1(图2-14)
图2-14举例说明图1方法的一个具体的途径(approach)。去除种子组织的切除工具或方法是激光。在这个具体的实施例中，用特定的种子保持器(seed holder)来使候选种子相对于激光定位。
图2给出实施图1方法200的系统和装置300的示意框图说明。准备并提供多个种子样品301A-N用于种子处理系统302的加工和分析。种子处理系统302把样品301传递给种子保持器305，种子保持器305限定试验位置320。组织去除工具302可由定位器304控制以对试验位置320中的种子进行操作，具体地讲是从种子的规定区域去除规定量的种子组织。一旦组织被去除，就在种子上进行种子特异性试验306。正如所显示的，在该实施例中，试验是在试验位置上进行的，试验位置与组织去除步骤的位置相同。这可以节约时间并提高流通的效率。收集试验结果307并可以记录在例如计算机存储器308。
参考号310-315显示这些样品的通用流动途径和来自这些样品的试验结果。这些运行中的许多都可以基本上自动化。这使得多样品种子可以使用最少的人工步骤处理，因而可以提高精确度和效率。
图3举例说明激光切除系统10，激光切除系统10可用作组织去除工具来实施图1和图2的示例性方法200和示例性系统300。
1.组织去除工具
在图3所显示的系统10中，激光器16是组织去除工具。一个实例是FirestarTM f201系列，型号FSF201SB，水冷密封二氧化碳(CO2)，200瓦激光器，市场上购自Synrad，Inc.of Mukiteo，Washington(USA)。激光器16具有典型的特征和可调节性(例如功率或强度)。
CO2型激光器已被证明效率高以及价格合理，高功率。它在红外波长下工作。它广泛应用于切割和焊接，但也常常用于外科手术，因为多数生物组织中的水都会吸收可见光的CO2激光器频率。可以使用其它类型的气体激光器，也可以使用其它类型的激光器(例如化学激光器、金属蒸气激光器、固态激光器(例如YAG)和半导体)。
激光器16通常可包括光学包装，例如束传递组件(参见图8中的参考数字130)，以聚焦和控制激光束。也可以使用常规辅助设备，例如电源、控制电路，等等。这样的光学设备和辅助设备通常可得自激光器销售商或制造商，如它们来自Synrad。至于以上鉴定的FSF201SB激光器，使用束传递系统，束传递系统转移来自密封激光器的原激光束并使其聚焦在切割种子的位置(例如试验位置)。光学系统的一个实例是Haas激光器技术公司的产品1.25”系列束传递系统，带有5”聚焦透镜。可以使用任何经典类型的激光切割系统，包括飞行光学系统、混合系统和枢轴-束(pivot-beam)系统，以精确地控制激光束相对于其靶标应用的移动。
凭经验测试和校正，激光器16可以设定为切除种子一侧的图案或区域至相对可控深度。根据制造商的安装说明书，激光器16可以构造成产生根据玉米籽粒表面的所需切除设计的某一宽度、功率、调制(modulation)和颜色的激光束132，以去除粒壳区域并触及粒壳下面的组织，并且这样做是非破坏性的。
应当理解，激光器可以如此精确地和精密地控制，如有需要，有可能在种子籽粒表面上蚀刻标记、字母或数字，如果理想的话。一种用途是直接在种子上作标记以辨别种子样品。
为了适当地控制玉米种子组织去除的位置、大小和深度，组织去除工具理想的是应当具有预定空间分辨率。切除可以视种子的不同而不同。它可以横穿板18从种子到种子变化。它可以按去除的组织量(例如面积和体积)、去除的组织位置或哪种组织被去除(例如粒壳、胚乳和/或胚)而变化。如果将对象暴露给细胞进行遗传试验，则激光切除可以剖开种子的特定组织、部分或结构的内部。在一个实施例中，然后可以将经切除的种子置于溶液(或加入到孔40的溶液，在其中进行种子切除)中以提取DNA，然后对其进行分析。所述溶液和DNA提取方法是本领域技术人员熟知的。
应当理解，用其它形式的能量或力量来去除来自种子的组织或结构也是可能的。一些例子先前已有提及。
在激光切除的这个实施例中，激光能量作为切除模式的设定和应用类似于医学、通常是外科手术或生物学应用中的激光切除。其中种子同人体软组织类似，因为它是生物并含有大量的水。
该过程受到材料的性质及其吸收能量的能力的巨大影响。因此，切除激光器的波长应当具有最小吸收深度(absorption depth)。尽管这些激光器平均可以有低的功率，但是它们可以提供按下列公式得出的峰强度和积分通量(fluence)：
强度(W/cm2)＝平均功率(W)/焦点面积(cm2)
峰强度(W/cm2)＝峰功率(W)/焦点面积(cm2)
积分通量(J/cm2)＝激光脉冲能量(J)/焦点面积(cm2)
而峰功率是：
峰功率(W)＝脉冲能量(J)/脉冲持续时间(s)。
种子的激光切除类似于激光软组织手术。高聚焦激光束与软组织的相互作用使含水量高的软组织基本上汽化。这样一种激光可产生非常小的切口。CO2激光波长(例如10,600nm)被含水生物组织高度吸收。它也往往比固态Er:YAG激光器的成本低，其特征也在于被水高度吸收的波长。
进行种子的切除类似于角膜的表面切除，其应用于若干类型的眼科折射手术(例如LASIK和LASEK)。通过用聚焦激光束照射固体而从该固体中去除物质。在低激光通量时，物质被所吸收的激光能量加热并蒸发或升华。在高激光通量时，物质通常转变成等离子体。通常，激光切除是指用脉冲激光去除物质，但有可能用连续波激光束切除物质，如果激光强度足够高的话。
经过其激光能量被吸收的深度并因此被单激光脉冲去除的物质量，取决于物质的光学性质和激光波长。激光脉冲可以在非常宽范围的持续时间(毫秒至飞秒)和通量内变化，并且可以准确地进行控制。
激光器配置(setup)的类型可包括但不限于移动材料、混合系统和飞行选项(options)系统。移动材料具有固定切割头并移动其下方的物质。它需要极少的光学装置，但需要移动工作物或对物质进行切除。混合激光器提供以一个轴移动的桌子并沿较短的轴移动其头。飞行光学装置的特征是在工作物上方以两个水平维数移动的固定桌和切割头(带激光束)。束移动的另一个实施例是通过旋转或振动镜。镜以可追踪表面上所需图案的方式移动。
激光接触表面的接触点应当在激光的光学系统的焦平面上并通常与其焦点同步。这个点通常很小(例如小于毫米的分数，取决于波长)。只有当激光束经过表面的上方，该焦点里面的面积才显著地受到影响。由激光传递的能量使焦点下方的物质表面发生变化。它可以使表面加热并随后使物质汽化，或许可以使物质断裂(称为“玻璃(glass)”或“玻璃化(glass up)”)和使表面剥落。这就是物质怎样被去除。
通过对控制器进行编程，可以在诸如种子的物体上蚀刻出不同的图案，以使激光束随时间穿越特殊的图案。小心地调整激光束的轨迹以实现物质的一致去除深度。要避免十字交叉路径。也要考虑激光束移动的速度。改变激光束的强度和分布允许更多柔性。例如，通过改变激光的时间比例(称为“任务周期”)，在每个脉冲期间开启，传递到表面的功率可以根据物质适当地控制。
正如本领域技术人员可认识到的，下面是在控制激光器操作中的因素：
(a)电动机相对于种子移动激光束的速度；
(b)激光器的瓦数(通常为确定量，例如75瓦)，
(c)激光器的频率(控制当激光击中种子产生的热量)。
另外，其它操作也可以影响激光器取样。可以使用压缩空气(例如30psi)去除来自激光冲击的区域的碎片。真空是备用的。
可以通过鼓风机或真空泵的通风作用来去除由该过程引起的烟雾，以及去除种子表面的碎片，使得激光器基本上能够持续不断地镌刻物质。
2.种子保持器
每粒种子都可保持在通过组织去除工具进行组织去除的位置。一个实施例是容器，包括由在底和开放顶部之间的侧壁所限定的孔或空腔。图3和图4A-D显示具有许多(96个)孔40按加标行矩阵和加标列矩阵(8行A-H和12列1-12)排列的多孔容器或多孔板18。各孔位置可以按行/列加标记(例如A/1，A/2，......H11，H12)。以这种方式，可以记录相对于具体孔有关孔内种子的鉴定信息，其中放入种子以保持板18中各种子和其身份之间的关系。如图4A所示，在该实施例中，孔40在板18顶部42相等地间隔开。96孔40与常规数目的植物育种测定或许多实验室试验中所使用的种子或样品相对应。
板18可以是种类繁多的材料和构型中的任一种。其主要功能是使各种子相对于组织去除工具保持在固定位置并且与其它种子隔开，这样在种子之间没有混杂。
板18的一个实施例具有以下特征。它是其中有圆柱形状机器加工孔40的固体金属。金属的实例包括但不限于铝、钢或黄铜、或它们的合金。其它的是可能的。或者，可以使用塑料。塑料的实例是丙烯酸塑料。其它材料是可能的。实例有橡胶或金属箔。材料应当与组织去除工具及其力量相匹配。
铝的实例将是6061级粗铝。各孔的侧壁和底可构造成吸收激光、减少反射和/或引起激光的扩散性反射，如果使用激光束组织去除工具的话。对于金属或金属的合金，这些表面可以进行粉末涂层、阳极化、喷砂、上漆或另外构造或配制成减少反射或基本上光扩散。
在板18的实施例中，将其设计成每孔装一粒种子。各个孔都具有特殊的设计元素，它有助于将种子放在孔的中心(例如下文所讨论的锥形底)。孔也用使激光反射减至最小或为光扩散的物质进行粉末涂层。一个实例是AlestaTM牌粉末涂料，得自DuPont of Wilmington，DE USA。喷砂和阳极化是改变表面、尤其是铝的其它方法，以使其更少镜状、更多扩散。其它的方法是可能的。
对于塑料，材料本身就可吸收光或使光扩散，或者反射阻减性构造(reflection-deterring texturing)可以进行机器加工或模制成塑料。另一种减少反射的方法是改变限定孔的底和/或侧壁的几何形状。使这些部分的表面成角，可有助于阻减离开孔开放顶部的不想要的激光束反射。
通过对每粒单独的种子使用单独的孔，每粒种子与其它种子的单一化和分离是自动实现的。每个孔40都是具有锥形埋头的底58的圆柱形碗状物。
可以用多种方法完成对种子的定位和定向。关于板18，每个孔40做得比籽粒60的最长尺寸宽一些，但具有锥形埋头底面58(floor 58)。这有助于把玉米种子60放在孔40的中心。典型玉米种子的形状和内部内容物见图5A和图5B所示。注意：胚74怎样位于种子尖帽末端(tip cap end)66附近，和一个平扁侧面(flattened side face)62附近。胚乳76占据尖帽62对面的大部分侧面和末端。已经发现，孔40的底面或底58的锥形埋头帮助把玉米种子(或任何种子或颗粒)自动地放在孔40的中心。另外，按合适的直径，孔40和锥形埋头倾向于一般平行于跨过孔40底的平面，定位具有其平扁面的玉米种子。这使得玉米种子最大的表面面积侧之一暴露在孔40的顶部。对于每个孔，激光可以根据任何深度设定(参见图8中的平面D)。经过初始化和经验测试，可以建立一组种子样品颗粒的平均深度。这避免了针对每粒种子都必须调整切割深度。已经发现，对大多数玉米种子工作良好。然而，切割的深度以及切除的面积可以根据每个种子样品进行差异控制，或者如果需要的话，它们可以根据不同类型的种子或不同品种的种子进行调整，因为平均种子大小可以变化。如可以理解的那样，激光可以跨越种子相同的位置进行多次扫描以增量式去除组织直到某一最终的深度。或者，用一次扫描切割到最终的深度。经验测试可以建立理想的过程。
图6A举例说明种子保持器的替代实施例。泡罩包装(blister pack)类型元件100具有底板或基底，其上有多个孔穴，塑料泡形状透明塑料容器102从孔穴延伸。更多细节可以参见美国专利申请序列号60/975,389，申请日为2007年9月26日，该申请已转让给本申请的所有人并通过引用全部结合到本文中。容器或泡102类似于板18的孔40。每个泡将接受种子、使种子单一化和使一粒种子与另一粒种子隔离开。释放板(release sheet)可以可移动地粘在或连在基底100中孔穴的顶部上方以密封泡102的内容物，如果需要的话。图6A显示泡罩包装100，其被构造成相对于板18的孔40的数目和间隔，具有相同的数目和间隔的泡102。泡罩包装100可用于存放候选种子样品(以加上标签的方式)(8行x12列)，并且在泡102上方有释放板。通过去除来自泡罩包装100的释放板，这96个样品可以容易地转移到板18的96个孔中，将具有空孔的板18倒放在泡罩包装100上，并且孔40和泡102对齐，然后将泡罩包装100和板18都颠倒过来使种子从泡罩包装100转移到板18。但是，泡罩包装100的另一种用途是可用作板18的替代物。泡罩包装100可以放置成孔穴朝上并且它们上面无需任何释放板。可以将各种子籽粒放入各自的泡内。然后，可以对组织去除工具按照关于板18的说明进行操作，以移动到第一个泡102内的种子上并对该种子进行操作，然后移动到下一粒种子和泡，等等。
其它种子保持器是可能的。例如，具有适合于接受器或托架(cradle)的头的支承架(pedestal)或针(pin)可用于保持单粒种子，与其它种子隔离开，其方式是可递给组织去除工具，并由组织去除工具对其进行操作。支架(rack)或压机(press)和密封容器中的管子是可隔离种子并使各种子保持在某一位置用于组织去除的装置的其它实施例。
图18举例说明替代种子保持器的一个实施例。在系统150中，轮子154与种子填充器装置152同步转动。轮子154装有多个磁铁156A-F，磁铁156A-F围绕其周长相等的间隔开。每粒种子60先前已经上漆或浸入磁性或基于铁的油漆158。同步和一般同时地，种子60B自种子填充器152落下。在落下种子60C之前，通过基于铁的油漆158的磁性吸引力吸引到磁铁156C而与磁铁156C相结合，朝向激光器16的激光束132旋转。种子60D处在试验位置并具有被激光束132去除的组织。经过加工的种子60E朝向刮刀162移动。种子60F用刮刀162从其磁铁156F进行敲打。因此，系统150同样使种子单一化和使一粒种子与另一粒种子隔离开，并使用组织去除工具。此外，即使无需容器(例如孔或泡)，各种子也相当均一地定位。事实上，通过把磁性油漆158(例如磁性引发剂油漆，市场上可购自11 Hawthorn Parkway，Vernon Hills，IL 60061 USA的Rust-oleum，或磁性墙壁油漆，得自Kling Magnetics，PO Box 348 343 Rt.295-Chatham，NY 12037USA)放在各种子60上的同一位置(这里是在其冠上)，系统150一般使各粒种子均一定位。它可以使各粒种子60更均一地和自动化地以相同的一般取向定向至激光束132。关于系统如系统150的更多细节可以参见美国申请序列号11/939,402，申请日为2007年11月13日，该申请已转让给本申请的所有人并通过引用结合到本文中。该通过引用结合至本文的申请公开了适用于种子外部的一部分的金属或铁磁材料的应用。然后，种子可以被自动地吸引到(永磁或电磁的)磁场。根据种子上磁性油漆的位置，种子可以按预定取向自动地定位。这将允许使用组合来相对于组织去除工具定位和保持种子。
系统150也可以使用自动化种子填充器或运动系统按有序方式移动种子填充器斜槽110B，以便种子60在激光加工处理之后，置于盘或泡罩包装100B的各个孔或泡内(参见种子60A-F将怎样以行和列形式连续沉积终止的说明)。或者，自动化电动定位器或运动控制器可以相对于斜槽110B以这种有序的方式移动盘100B。
可进行程序化和自动化的种子填充器或其它类似种子或颗粒处理组件可得自多个销售商，包括ElmorTM产品得自Elmor Angewandt Elektronik of Mangelegg 58 CH-6430 Schwyz，Switzerland。这样的机器可以按时落下一粒种子，或者连续填装多孔容器，像多孔板18或多泡泡罩或泡包装。其它类型的小颗粒处理器或传送器(conveyor)均可用来移动、单一化、转移个体种子或用别的方法处理个体种子。这类机器的另一个来源是填充器(filler)和包装机，包括用于种子的填充器和包装机，得自Visser International Trade & Engineering B.V.，P.O.box5103，3295 ZG′s-Gravendeel，The Netherlands。
虽然图18中的系统150说明使用激光器通过合适配置和控制切去每粒种子的种皮(clip)或部分，系统150可用于正好切除或去除少量的表面组织，如关于系统110所描述的。这将很可能需要当种子60处于激光束路径时，轮子154至少在一瞬间停止，激光束132光栅扫描跨过种子60的一侧。
3.自动化处理
可以用市售的设备使系统10的多个功能自动化或半自动化。实施例如下。
如图3所示，板或其它种子保持器18可以定位在激光器16移动场内的基底12。在这个实施例中，板18具有96个间隔放置的孔40，其大小为每个孔接受一个玉米籽粒60。
已经发现，可以用系统10以自动化方式对大量种子(这里为96个)相对快速地进行加工处理。然而，由于种子的切除是用激光能量，因此怎样把每粒种子递给激光束并不是无足轻重的事。同样，使用可用于组织去除的其它力量存在复杂性(例如喷水，磨碎)。
基底12(平台，桌子等)支撑框架14，框架14又支撑自动化组织去除工具。在图3中，工具是激光器16，激光器16通过XYZ定位系统20或其它电动定位装置或系统可编程地移动。
可以使用种类繁多的市售电动定位器中的任一种。图3图解说明可移动轨道22可以沿着框架14的顶部通过计算机控制的电动机24移动。套件(carriage)26可以跨过轨道22通过计算机控制的电动机28移动。激光器16可以相对于套件30上板18的上表面上下移动，这是通过电动机32由计算机控制的。套件30在与套件26相连的臂上移动。如图3所示，这允许激光器16相对于板18的多个自由度移动。组织去除工具的三维移动相对于种子保持器发生的方式可以变化。有可能种子保持器可以相对于激光器移动，或者它们两者彼此相对移动。
控制器36，例如是市售的，可以与计算机38连通。计算机38包括软件，该软件允许用户对XYZ定位器20的移动编程，并因此使激光器16相对于板18中各孔40移动。控制器36可通过分线盒34中的某种电源执行该程序，分线盒34将控制电动机24、28和32以非常精确地定位激光器16及其激光束32，并且使激光束跨种子移动。按这一方式，可以完成96孔盘18的每个孔40中的单粒种子的自动化激光切除，无需手工劳动或控制。
具有可编程控制的定位系统的实例可得自Synrad并由诸如以下的公司制造：Techno Inc.of New Hyde Park，New York USA；Anorad Corp.of Shirley，New York USA；和Aerotech，Inc.of Pittsburgh，PA USA。
其它自动化的实施例将包括种子填充器，如先前所讨论的。它可用于移动单粒种子并将其落在种子保持器的规定孔、泡或指定位置。
此外，在组织已被去除之后，设备可用于把种子从孔、泡或其它位置移动到指定位置。一个实施例将是磁性带或其它磁性涂层或附件用到每粒种子60上，如上面关于图18中所描述的，允许每粒种子在多个位置之间自动移动。电磁或其它磁化物体可用于从一批种子60中挑选出个体种子60，将这些个体化种子移动到各自孔40上方的位置，然后让它们在孔40内沉积下来。通过反过来的过程，在切除之后，该系统可以把种子从每个孔中抓出来并将它们移到另一个站点。又一个替代物将是真空系统，例如可以用普通技术人员的技能开发，并且可用于将种子从一批中吸出来，将它们单一化，让它们在孔40内沉积下来，然后按适当的时间取出它们。
此外，对于另外的功能，还可以使用种子保持器例如板18或泡罩包装100，或具有孔或空腔的其它种子保持器，单一化、隔离和保持种子，通过组织去除工具进行操作。孔40、泡102等也可像测定容器一样起作用。一个实施例是在组织去除之后，可直接将聚合酶链式反应(PCR)的液体混合物加入到孔40或泡102中。反应可以发生，并对诸如本领域技术人员熟知的各种数据中的任一个进行分析。这避免了必须移动并保持对复粒种子鉴定的示踪。这样的原位种子特异性分析可有效地进行并具有多样品的相对高通量。可以记录与每粒种子身份有关的分析结果(例如记录在数据库或别的地方)。然后，可以以多种方式使用这些结果。
自动化液体处理设备也可用于以受控制的预编程的方式移动液体或液体混合物或悬浮液。一个实施例是上述液体PCR测定。例如，在组织去除之后，液体可用于种子的其它试验。这样的液体处理设备是市售的并广泛用于实验室环境。实例有自动化液体处理系统，得自PerkinElmer Life And Analytical Sciences，Inc.，940 Winter Street，Waltham，Massachusetts 02451 USA。
如图3所示，计算机38不仅可用于促进对自动化处理设备进行编程，而且可以用于记录和存储关于组织去除和/或种子上进行的任何种子特异性分析的信息。
其它处理组件可包括用于保持样品或样品集身份的示踪的子系统。条形码或其它机器可读的标记或标签(例如RF标签)可以固定在任何包括种子的容器、载体、盘或板上。这将允许可以保留样品与原始鉴定信息的关系。
4.操作
为了图3中系统10的有效、高通量操作，使个体籽粒60沉积在板18各自的孔40内。图6A举例说明这样做的一种可能方式。泡罩包装100，具有96个透明塑料泡102，可以装有已知来源或身份的种子。剥落的胶粘剂覆盖层(未显示)可在泡102的每一个中都含有种子，甚至当泡罩包装100被颠倒时。泡罩包装100可以引起去除切除板18、剥落的覆盖层，并将板18倒置，以便孔40的每一个都与泡102对准排列。泡包装100和板18的组合可以交叉翻转，来自泡包装100的96粒种子中的每一个都将落入相应的孔40和板18。然后，可以把板18放在基底12上的参考位置。在切除之后，可用反过来的程序将种子放回泡包装100的泡102用于移到下一步骤，如果需要的话。
图6B显示一个替代的系统。种子管110可以与种子单一化装置(singulator)112连通。此组合可以把单粒种子向下递送到管110，管110可与孔40对准。管110可移动到下一个孔40和下一个单粒种子被递送，依此类推。盘或种子填充器都是市售的。较早时已经给出实例。
有其它方式把种子放入孔40内。一种就是人工把种子放入每个孔40内。这可能是优选的，因为使用者可以确保种子位于孔40的中心并且玉米籽粒既平又宽的一侧相对于孔40中开放顶部基本上面都朝上。如先前提及的，板18可有意制造成对于每个孔40都具有锥形底58以有助于把籽粒60放入孔40的中心，因为这样一种孔的几何形状促进玉米种子以宽的扁平一侧面都朝上的方式平放。
一旦单粒种子60位于各孔40内，并且板18位于其系统10的基底12上的参考位置，控制器36就用激光器16开始切除过程以去除来自种子的特定组织。
如图7所举例说明的，在PC 38上，控制器36可包括软件，该软件允许用户可以根据每个孔40设计特定的切除图案。PC 38上的计算机显示器124可以显示每个孔40的中心。用户可以指定或设计与孔40相关的特定切除图案。如图7所示，图案在水平面上可以是矩形(参见参考数字122)。矩形图案122的尺寸可以选择并且甚至可以显示在计算机屏幕124上。用户也可以选择功率水平、颜色、调制和其它有关操作参数以控制矩形形状在每粒种子中怎样被切除、切割、蚀刻或以别的方式成形，以及深度。
正如可以认识到的那样，各种各样的图案用激光器16都是可能的。图8A和图8B及图9A-C举例说明可能形状的一个实施例。
在这个实施例中，激光器16用光学部件130构造成产生激光束132，激光束132的切割宽度为0.0005(在1/4英寸焦长度)。形状122的尺寸为0.2平方英寸，如图8B所举例说明的，控制器36是程序化的，以便激光束132对籽粒60表面前后地扫描以切除或去除组织来做出该形状。如图8B所示，激光束将从形状122的一侧到另一侧切割第一斜面92A为0.0005。然后，它将沿略微不同的路径往回走(参考号96B)。它将前后地扫描进行地蚀刻或切除另外的材料，但保持矩形形状122直到达到最后的深度。图8B举例说明线性路径92A到92H。事实上，在图7的程序化形状122中，大约有30-40次扫描来完成空腔80的切去。
在这个实施例中，在玉米籽粒中正好足够的组织被切除就露出其底层的有关组织或结构。通过激光束以相对快速方式扫描，完成了种子组织的切除而无需过度加热或其它条件，这些实际上会负面地影响发芽势。自动化系统10可以允许96个不同的种子按此方式依次切除而无需任何人工步骤。
图8A用示意图说明且不是按比例绘制矩形棱柱形状的空腔80。激光以该形状切除来自种子60的材料以去除外部粒壳并暴露内部组织。这可以是胚乳。它可以是胚。在任何情况下，该过程可以构造成不会显著地影响玉米种子60的发芽势。图9B和图9C显示对于该种子通过激光器16产生的空腔80的替代视图。
应理解，激光器16产生空腔80的确切方式可以变化。激光束132可以用XYZ定位器前后地移动，例如图1所示的。或者，可以有光学方法去改变激光束132的角度或产生激光束的前后扫描切割作用。
一旦板18参考A1位置上孔40内的种子60(参见图4A)的激光切除已完成，激光器16就可通过控制器36移动到板18位置A2上孔40上方参考的位置，并且针对该孔和种子，可以进行激光切除过程以蚀刻形状122。一旦完成，激光器16就移动到位置A3，依此类推，直到行1完成为止。然后，可以开始下一行并继续进行直到所有96个位置都完成为止。
可以理解，目的通常是去除足够材料以合理地获取种子60的特定内部组织。对于这些目的，被切除的面积位于种子60一侧的绝对中心或者它精确地到某一深度并不是必需的。通过经验测试和调整，及每个孔40内种子60的相对一致定位(即，同孔40中心的可能定位一致)，对激光进行编程以切割放在孔40中心的中心的形状122，通常导致切除足够材料以获取合理地暴露至所需要的内部组织。
这些形状122的程序化在许多系统中并不复杂。商业系统通常允许对形状作出选择并显示在打印文件(print file)，然后该文件被传输到控制器36。PC38或控制器36的合适模板或图形用户界面(GUI)允许调整空腔40的形状、面积和深度。
图10A-C到图14A-C包括在内正好给出切除的形状和深度可以怎样变化的几个额外实施例。如图10A-C所举例说明的，种子60表面顶上附近的第一个较大的矩形棱柱空腔可被形成至第一深度。然后，较小面积的矩形棱柱形状可以蚀刻到较低的深度。第三个，仍然是较小的矩形棱柱可以蚀刻到仍然较低的深度。这产生了楼梯步阶型空腔80B。图11A-C显示在种子中可以蚀刻出两个矩形通道，较小的一个与较大的一个空间上间隔并在较大一个的里面。图12A-C说明胚上方矩形区域的去除。图13A-C和图14A-C显示图案可以不是矩形，例如更圆。当然，更复杂的形状是可能的。
激光束的高度柔性可以制造空腔几乎无限数量的形状和深度。这些形状也可以设计成非破坏性地去除组织以暴露感兴趣的底层种子组织。因为激光可以有这样的相对窄的束宽，该系统允许激光束相对于待切除颗粒或物品(item)非常精确和精密地定位。激光束的光栅扫描允许切割的最终深度的进行性和准确控制。任选地，激光束可以针对物品或种子的非常具体的部分。例如，激光切除可以针对玉米籽粒进行程序化以去除正好位于一端的尖帽处或其附近的组织或者正好位于另一端附近的组织或它们之间某一部位的组织。基于矢量(vector-based)的激光束控制也是可能的。基于矢量(vector-based)的移动遵循图案的直线和曲线。
一旦所有96粒种子都已切除，它们就准备好做试验(如有需要)以获得关于种子的信息。例如，各种遗传试验方法或测定可以用于鉴定种子中存在的遗传材料。根据对种子的这种直接测试，植物研究人员可因此做出该种子对于植物高级或育种实验中的继续使用或对于商业生产是否是理想的快速决定。
种子组织特定部分的去除、或保留的种子部分的暴露部分的用途，都可用于特殊的实验室试验，其可包括直接DNA、RNA、脂质或蛋白质分离。因此，这个实施方案可用于植物育种过程，其中可以直接从种子相对快速地获取对具有所需性状或特征并随后用于在田间或温室萌发直到成熟的种子的鉴定情况。遗传分析试验的实施例描述于美国专利6,472,185和6,368,806，所述专利通过引用结合到本文中。
正如本领域众所周知的，通过各种技术，在此整个过程中可知道并保存各种子的身份及其历史。例如，在泡罩包装实施例中，图6A，条形码108或其它机器可读的标记可适用于泡罩包装100，其鉴定出利用行和列指示字母/数字，以孔到孔为基础，关于泡罩包装内的种子的原始和必需信息。通过把各种子保持在泡罩包装中(在板18中)其相应的列和行位置，再后退到泡罩包装100或后退到某些其它96孔盘，可以保持各种子的身份。这将允许种子可以用已知的目标基因鉴定及其身份通过记录该阵列的96个位置的位置得以保持。
E.具体的实施例2(图15-17)
代替去除组织以获取候选种子的内部，或在某些情况下除此之外，可以收集去除的组织(或其部分)并对其进行试验或分析。此类试验或分析可以用来做出选择决策。
图15以示意图的形式显示一个具体的实施例。图15与图1类似，但具有以下主要区别。
图15的方法400利用某些组织去除工具或方法402来去除来自候选种子401A的特定组织。种子401A可以在某种保持器组件中定位或位于位置405。可以将去除的组织(或其部分)收集在收集容器403中。对所收集的去除组织进行种子特异性分析(参考号406)。所得结果用(步骤407)来做出决策(例如选择或不选择种子401A类型供进一步使用)。任选地，试验结果和/或决策可以由计算机408存储或运用。
可以理解，实施例1或2可以至少部分地自动化。而且，任一个实施例本身可提供快速、局部样品收集和分析。举例来说，便携式激光器装置可以充当实验生长试验田。可以把来自生长玉米植物的候选种子取出、放入单孔40并进行激光切除。可以将合适溶液加入到孔40内的经切除的种子上，将DNA抽提到该溶液中，取出溶液并进行遗传学评估或别的评估。或者，通过激光切除去除的组织可以放入合适溶液或其它测定中，并用别的遗传学方法进行评估。这些评估可以用来做出关于取自候选种子的植物的生长地点决策。这避免了取样后再返回到很远的实验室和交通费开支并始终监视哪株植物与哪粒种子相联系。
图16和图17说明从候选种子取出的组织可以怎样收集起来用于分析的一个实施例。种子70被激光器16切除，例如在实施例1中论述的。可以使激光切除所产生的一缕微细颗粒或小颗粒(从它们时常漂浮在空气中的意义上讲它们像烟一样起作用)与种子60分离开。有时，它们重新调配(reformulate)和包被孔40的各个侧面。这需要在每个切除过程之后清洁板18。真空罩(vacuum hood)或真空头140(例如透明塑料)可以固定在光学装置或激光器16上。可以在孔40内种子60的切除期间，用孔40上方的激光器16使其降低。通过在操作性连通中利用真空罩140，通过真空管144到真空142，这些微细物可以基本上(如果不是全部的话)被去除以消除这一问题。
或者，通过真空或别的方法收集这些微细颗粒可导致收集足够的材料进行试验，而不是测试种子。这将需要感兴趣的激光切除组织进行试验。例如，如果正好需要粒壳进行试验，则可以控制激光以正好切除粒壳。所去除的粒壳颗粒可以通过真空收集起来，然后对其进行试验。另一方面，如果需要胚乳进行试验，则激光可以切除粒壳，所去除的粒壳颗粒可以不理或去除，然后激光可以切除暴露出的胚乳，可将其通过例如真空收集到容器中。通过去除胚上方的粒壳，可以收集胚组织，然后激光切除暴露出的胚，通过真空收集胚颗粒。
图16以简化形式说明从单粒候选种子的激光切除和真空收集。密封或密封衬垫141密封罩140至围绕保持种子70的孔40的表面。可以对激光器16进行操作以引起激光束132切除种子70。可以对真空源142(例如真空泵)进行操作以引起微细颗粒从孔40移动到容器146，但使种子70留在适当的位置。可以取出容器146并且所收集的颗粒来自经过试验的种子70。
真空系统的实例包括各种各样的市售颗粒过滤系统或可去除和/或收集微细颗粒或收集的烟处理机(fume handler)。颗粒提取设备市场上可得自诸如以下的公司：AER of Old Saybrook，CT USA和Fumex of Kennesaw，VA USA。这种设备通常用于工业空气过滤/空气污染控制系统，以单独或组合形式用于烟雾(mist)、粉尘(dust)、烟(smoke)、尘雾(fume)和气体/蒸气污染物。该系统可包括筒状和袋状粉尘/烟雾收集器、湿粉尘收集器、静电除尘器、介质过滤系统和其它组件。
图17说明具有多个孔40的盘可以与图16的真空萃取激光切除系统一起使用。这本身就可提供从大量候选种子中有效地真空收集被去除的切除组织。
真空收集的一个替代法将是在每个孔40中加入凝胶物质。凝胶对激光束是透射的。由激光切除产生的微细颗粒往往可以通过凝胶收集和悬浮在凝胶中。激光可能必须调整(其可凭经验测试完成)到使用较深的切割功率，如果使用凝胶的话。对在凝胶中收集的微细颗粒可进行萃取、收集和测定都是可能的。为了产生足量的微细颗粒用于某些试验，激光器或其它组织去除工具可能必须去除更多的组织，相比如果正好去除足以暴露内部组织而言。
F.任选和备选方案
将会认识到，本发明可以采取许多形式和实施方案。本文详细描述的实施方案仅通过实施例予以说明而不是限制性的。对本领域技术人员显而易见的各种变化都包括在本发明之内。然而，下面提供了任选、备选和变通方案的另外几个实施例。
1.种子的类型
以类似的方式，以上描述的系统和方法均适用于除玉米种子以外的种子。可能需要调整，这都在本领域技术人员的能力范围之内。
2.组织去除工具的类型
正如先前所讨论的，从候选种子去除其组织可以通过不同的方法或组件(统称为“工具”)来完成。激光器就是一种这样的工具。它可以在一种模式中用来产生小颗粒。在另一种模式中可以用来将种子切成小块(参见例如图18和所示同样构造的相关描述并描述于美国申请序列号11/939,402，申请日为2007年11月13日，该申请已转让给本申请的所有人并通过引用全部结合到本文中)。
其它组织去除工具先前已有提及。申请序列号11/939,402包括了另外的细节和实施例。
3.对种子分析的类型
可以在种子上进行各种测定。先前已给出了某些实施例。一个实施例是测定溶液可以在种子60被切除或组织被去除或暴露之后直接置入孔40内。溶液可以进行提取和进行试验以鉴定感兴趣的遗传材料。准备时，可以将各孔排干并将种子移到载体(carrier)或包装中供进一步使用。或者，已鉴定为具有目标基因的种子可以在板18的阵列中从其相关位置取出，并将保留种子弃去。另一个替代的方案是，在切除之后，将种子60移到另一容器中，可以在该容器中进行测定。另外的试验类型可包括但不限于细胞、分子或纳米级水平上的遗传、物理或化学分析。某些非限制性的实施例是：
a.光谱；
b.遗传；
c.各种核苷酸提取和指纹分析(例如DNA、RNA分离)；
d.蛋白质和脂质分离；
e.表型分型；
f.性状或特征鉴定；
g.遗传标记辅助鉴定和选择；
h.高通量筛选。
本领域技术人员熟悉可在生物组织上进行的分析类型，并且可能在对于种子做出研究与开发决策以及商业生产决策方面是理想的或需要的。
遗传分析试验的几个实施例如下。与群体成员间的遗传多态性相对应的标记可以通过本领域已很好建立的方法进行检测。这些方法包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性(RFLP)检测法、同工酶标记物检测法、等位基因特异性杂交(ASH)检测法、植物基因组的扩增可变序列检测法、自动维持序列复制检测法、简单序列重复(SSRs)检测法、单核苷酸多态性(SNPs)检测法或扩增片段长度多态性(AFLPs)检测法。存在其它的方法。也存在和可以使用根据物理或化学性状的多种分析。
仅提及了种子或种子组织分析的几种方法。其它的是本领域技术人员已知的。可以对种子的样品部分进行分析，或可以对取样后种子的剩余部分进行分析。样品可以是单个小块或多个小块。它甚至可以是多个小颗粒。一个实施例是什么可以称为所产生的碎片，例如，当激光切除种子时。如所讨论的，所述碎片散布在小颗粒中并可以是像一缕粉尘或烟一样。可以将其收集起来进行分析。实时荧光分析是检测某些基因存在的一个实例。收集来自激光切除的种子碎片的另一个实施例是使用在种子上面一侧和面向种子有胶粘剂的带状物(tape)。激光可以通过此带状物或者在它周围通过，切除种子并且引起一缕碎片上升。碎片将粘在带状物上。可以用实时荧光分析来分析带状物上的碎片。
另一个选项是分析已经过切除的种子。例如，激光切除可去除碎片，留下具有空腔的种子(参见例如图12A-C)。可以将合适的溶液加入到空腔内以使遗传材料从种子提取到溶液中。可以对溶液进行分析，例如，为了说明一个或多个基因的存在情况。
a.种子分析的应用类型
试验应用的实施例包括但不限于诸如以下的事件：
a.针对性状或特征的植物育种过程；
b.DNA或非DNA鉴定；
c.具有所需性状或特征的种子的鉴定，用于后续在田间或温室中萌发至成熟。
d.基于所需性状的存在与否进行选择；
e.基于遗传标记的存在与否进行选择。
来自试验种子的信息用途描述于美国专利第7,227,065号，其通过引用结合到本文中。实施例如下。
除了进行表型观察之外，也可以检查植物的基因型。植物的基因型可以用来鉴定同一品种或相关品种的植物。例如，基因型可以用来确定植物的谱系。有许多基于实验室的技术可用于植物基因型的分析、比较和表征；在这些技术当中有同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态DNAs(RAPDs)、任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹分析(DAF)、序列表征扩增区域(SCARs)、扩增片段长度多态性(AFLPs)、简单序列重复(SSRs)(它们也被称为微卫星(Microsatellites))和单核苷酸多态性(SNPs)。
同工酶电泳和RFLPs，其论述可参见Lee，M.，“Inbred Lines of Maize and Their Molecular Markers(自交系玉米及其分子标记)，”TheMaize Handbook，(Springer-Verlag，New York，Inc.1994，第423-432页)(通过引用结合到本文中)，已经广泛地用来测定遗传组成。同工酶电泳具有相对低数目的可利用标记物和低数目的等位基因变体。RFLPs允许更多鉴别，因为它们在玉米中具有较高程度的等位基因变异，并且可以发现较大数目的标记物。这些方法均因以下参考文献中论述的SSRs而失色：Smith等，“An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize(Zea mays L.)：comparisons with data from RFLPs and pedigree(在玉米中SSR基因座作为分子标记物用途的评价(Zea mays L.)：与RFLP和谱系的数据比较)”，Theoretical and Applied Genetics(1997)，第95卷，163-173和Pejic等，“Comparative analysis of genetic similarity among maize inbreds detected by RFLPs，RAPDs，SSRs，and AFLPs(通过RFLPs，RAPDs，SSRs和AFLPs检测的玉米自交系中基因相似性的比较分析)，”Theoretical and Applied Genetics(1998)，1248-1255，通过引用结合到本文中。SSR技术比RFLPs应用更有效、更实际。可以常规使用更多标记基因座。采用SSRs与采用RFLPs相比较而言，每个标记基因座可以发现更多等位基因。单核苷酸多态性也可用于鉴定本发明的独特遗传组成和保留该独特遗传组成的子代系。为了提高整体分辨率，可以将各种分子标记技术结合起来使用。
玉米DNA分子标记连锁图谱已经快速构建并在遗传研究中广泛实现。一种这样的研究描述于Boppenmaier等，“Comparisons among strains of inbreds for RFLPs(自交系株中RFLPs的比较)”，Maize Genetics Cooperative Newsletter，65：1991，第90页，其通过引用结合到本文中。
在植物育种方法中可以使用分子标记，其包括通过使用诸如以下的技术鉴定出的标记物：同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态DNAs(RAPDs)、任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹分析(DAF)、序列表征扩增区域(SCARs)、扩增片段长度多态性(AFLPs)、单核苷酸多态性(SNPs)和简单序列重复(SSRs)。
分子标记的一种应用是数量性状基因座(Quantitative Trait Loci，QTL)作图。QTL作图是已知与对定量性状具有可检测效应的等位基因紧密连锁的标记的应用。育种过程中的选择基于在植物基因组中与正作用等位基因连锁的标记的累积和/或与负作用等位基因连锁的标记的消除。
在定量性状选择的育种过程中也可以使用分子标记。例如，与等位基因紧密连锁的标记或含有在实际的目标等位基因内的序列的标记，可以用来在回交育种程序中选择含有目标等位基因的植物。标记也可用来根据轮回亲本的基因组和针对供体亲本的标记进行选择。采用该程序，可以使来自所选植物中保留的供体亲本的基因组的量减至最低。它也可以用来减少在回交程序中所需要的轮回亲本的回交数目。分子标记在选择过程中的应用常常被称为遗传标记增强选择。
植物育种的目的是在单变种或杂种中组合不同的所需性状。对于农田作物，这些性状可包括抗病虫害、耐热和抗旱、减少作物成熟的时间、较高产量和更好的农艺品质。随着许多作物的机械化收获，诸如萌发、植丛建立(stand establishment)、生长速度、成熟、株高和穗高等植物特征的均一性变得很重要。传统的植物育种在开发新的改良商品作物中是一种重要的工具。
农田作物通过利用植物的授粉方法的多项技术进行育种。如果花粉从一朵花转移到同一株植物的同一朵或另一朵花上，则植物是自花授粉的。当用同一家系或品系内的个体来授粉，则植物是近缘授粉的。如果花粉来自不同家系或品系的不同植物上的花朵，则植物是异花授粉的。本文所用的术语“异花授粉(cross pollination)”和“异型杂交(out-cross)”不包括自花授粉或近缘授粉。
一直进行自花授粉并根据类型选择了许多世代的植物成为几乎所有基因座都是纯合的并产生纯育后代的均一种群。两个不同的纯合系之间的杂交产生许多基因座可能都是杂合的杂种植物的均一种群。两株分别在大量基因座是杂合的植物的杂交将产生遗传上不同的异源植物种群并且将是不均一的。
玉蜀黍(Zea mays L.)，在美国常常称为玉米(corn)，可以通过自花授粉和异花授粉技术两者进行育种。玉米在同一植株上具有分离的雄花和雌花，分别位于雄花花穗(tassel)和雌花花穗(ear)上。在玉米中，当风将来自雄花花穗的花粉吹到从雌花花穗顶部伸出的穗丝上，自然授粉就发生了。
在玉米植物育种程序中杂种玉米变种的开发包括以下三个步骤：(1)从不同的种质库中根据初始育种杂交选择植物；(2)使来自若干世代育种杂交的所选植物自花受精，产生一系列自交系，自交系在个体上是纯育的并且高度均一；和(3)让所选自交系与一种不相关的自交系杂交产生杂种子代(F1)。在足量的近交之后，成功的杂交子代将只用来改良开发近交的种子。优选地，自交系在其约95％或以上的基因座应当包含纯合等位基因。
在玉米的育种过程期间，品系的活力降低。当两个不同的自交系杂交产生杂种子代(F1)时，活力被恢复。自交系的纯合性和同质性的一个重要结果在于自交种限定对之间的杂种可以无限期地繁殖，只要自交亲本的同质性得以保持。一旦鉴定出产生优良杂种的近交种，就可以利用这些近交亲本生产连续供应的杂种种子，然后可以从这种杂种种子供应产生杂种玉米植物。
自交系可用于生产单杂交杂种、双杂交杂种或三品种杂交杂种。单杂交种是当两个自交系杂交产生F1子代时产生的。双杂交种是由四个自交系成对杂交(A x B和C x D)，然后两个F1杂交种再次杂交(A x B)x(C x D)所产生的。三品种杂交种是由三个自交系产生的，其中三个自交系中的两个杂交(A x B)，然后所得的F1杂交种与第三个自交系杂交(A x B)x C。在每一种情况下，来自母本的粒壳组织是杂种种子的组成部分并且可以保护杂种种子。
大规模商品玉米杂种生产，正如今天所实际采用的，需要使用某种形式的雄性不育系统，雄性不育系统控制或灭活雄性能育性。一种控制植物中雄性能育的可靠方法也提供改良植物育种的机会。这对玉米杂种的开发尤为真实，其依赖于某种雄性不育系统。有若干种方式可以对玉米植物进行操作以便雄性不育。这些包括使用人工或机械去雄(或去雄花花穗)、细胞质遗传雄性不育、细胞核遗传雄性不育、杀配子剂等。
杂交玉米种子常常通过掺入人工或机械去雄的雄性不育系统来生产。将玉米的两种自交品种的交替带状播种条(Alternate strips)种植在田间，并在花粉落下(shed)之前，从自交种之一(雌性)去除带有花粉的雄花花穗。前提是与外来玉米花粉源足够隔离，去雄近交种的雌性花穗将仅来自另一自交种(雄性)才能育，因此所产生的种子是杂种并将形成杂种植物。
通过使用细胞质雄性不育(CMS)自交种，可以避免花大量劳力的去雄过程。CMS自交种的植物是雄性不育的，因为其遗传因子在细胞质中，与细胞核正好相反，所以核连锁基因在回交期间没有发生转移。因此，这一特征只通过玉米植物的母本遗传，因为只有雌性才为受精种子提供细胞质。CMS植物用来自另一个不是雄性不育的自交种的花粉受精。来自第二自交种的花粉可以贡献或不贡献使杂种植物雄性能育的基因，根据杂交种的预定用途，任一选项都可能是优选的。相同的杂种种子、由去雄能育玉米产生的部分和采用CMS系统产生的部分可以混合以保证适当花粉负荷在杂种植物生长时为受精作用所利用。CMS系统自1950年代以来一直在成功地使用，并且雄性不育性状定期回交成自交系。参见Wych，第585-586页，1998。
有若干种赋予可利用的遗传雄性不育的方法，例如，在赋予雄性不育的基因组内分离位置上的多突变基因(公开于美国专利第4,654,465和4,727,219号(Brar等人))和染色体易位(由Patterson描述于美国专利第3,861,709和3,710,511号)。这些专利和所引用的所有专利都通过引用结合到本文中。除了这些方法之外，先锋高级育种公司(Pioneer Hi-Bred)的Albertsen等人在美国专利第5,432,068号中还描述了一种核雄性不育系统，它包括：鉴定对雄性能育至关重要的基因；使这个对雄性能育至关重要的天然基因沉默；去除来自必需雄性能育基因的天然启动子并用诱导型启动子代替它；插入该遗传工程基因后返回到植物；因此产生作为雄性不育的植物，因为诱导型启动子没有处于“开(on)”状态，导致雄性能育基因没有被转录。通过诱导或拧“开(on)”该启动子，使能育性得以恢复，诱导或拧“开”该启动子又使赋予雄性能育的基因被转录。
本领域赋予遗传雄性不育的这些方法和其它方法都具有它们自身的益处和缺点。某些其它的方法使用了多个步骤，例如将编码与雄性组织特定启动子相关的细胞毒性物质的基因或其中鉴定出对能育性至关重要的基因的反义系统和对植物中插入该基因是反义的基因递送到植物中(参见Fabinjanski等，EPO 89/3010153.8公布号329,308和PCT申请PCT/CA90/00037，公布号为WO 90/08828)。
另一个可用于控制雄性不育的系统利用杀配子剂。杀配子剂不是遗传系统，而是一种局部施用的化学药品。这些化学药品影响对雄性能育至关重要的细胞。这些化学药品的应用仅影响在生长季节施用了杀配子剂的植物的能育性(参见Carlson，Glenn R.，美国专利第4,936,904号)。杀配子剂的应用、应用的定时和基因型特异性常常限制该方法的实用性并且在所述有情况下并不是合适的。
雄性不育自交种的应用只不过是玉米杂种生产中的一种因素。玉米植物育种程序中玉米杂种的开发一般需要纯合自交系的开发、这些品系的杂交和杂交结果的评价。玉米植物育种程序将来自两种或以上自交系或各种其它种质源的遗传背景进行结合产生育种群体，由该育种群体通过所需表型自花授粉和选择而开发的新的自交系。杂交种也可以用作植物育种材料的一种来源或者用作去开发或获得新玉米品系的来源群体。本领域已知的并在玉米植物育种程序中使用的植物育种技术包括但不限于轮回选择、混合选择、集团选择、回交、制造双单倍体、谱系育种、开放授粉育种、限制性片段长度多态性增强选择、遗传标记增强选择和转化。通常使用这些技术的组合。从杂交种获得的自交系可以利用上述植物育种技术进行开发。使新的自交系与其它自交系杂交，对来自这些杂交的杂种进行评价，从而确定其中哪一些具有商业潜力。最古老最传统的分析方法是观察表型性状，但也可以使用基因型分析。育种方法的描述也可以在以下几种参考书之一中找到(例如Allard，Principles of Plant Breeding，1960；Simmonds，Principles of Crop Improvement，1979；Fehr，“Breeding Methods for Cultivar Development”，Production and Uses，第二版，Wilcox编辑，1987)。
回交可以用来改良自交系和利用这些自交系产生的杂种。回交可以用来将特定的所需性状从一个品系即供体亲本转移到称为轮回亲本的自交系，轮回亲本具有总体良好的农艺特征但还缺乏所需要的性状。通过轮回亲本与供体亲本(非轮回亲本)第一次杂交，可以完成所需要的性状到具有总体良好农艺特征的自交系的这种转移。然后，使这次杂交的子代与轮回亲本回交，接着在所得到的子代中根据从非轮回亲本转移来的所需性状进行选择。通常，在根据所需性状进行选择的四代或以上回交之后，子代将基本上含有轮回亲本的所有基因，只是控制所需性状的基因除外。但是如果在选择期间使用分子标记或者用原种种质(elite germplasm)作为供体亲本，则回交代的数目可以少一些。然后，使最后的回交代自交，得到基因发生了转移的纯育子代。
回交也可以与谱系育种结合使用，以开发新的自交系。例如，可以产生F1，F1与其亲本系之一回交，得到BC1。让子代自交并进行选择，以便新开发出的自交系具有轮回亲本的许多属性并且还具有非轮回亲本的若干所需属性。
轮回选择是在植物育种程序中为了改良植物种群而使用的一种方法。该方法使多个单株彼此交叉授粉后形成子代，然后让子代生长。然后通过任何数目的方法选出优良子代，其中包括单株、半同胞子代、全同胞子代、自交子代和顶交子代。所选出的子代彼此交叉授粉后形成子代的另一种群。将该种群种植，再次选择优良植株进行彼此交叉授粉。轮回选择是一种循环过程，因此可以按需重复多次。轮回选择的目的是为了改良种群性状。然后可以将改良种群用作育种材料的来源以获得在杂种使用的自交系或者用作人造栽培种的亲本。人造栽培种是由若干所选自交系的互交所形成的所得子代。混合选择，当与本申请较早论述的分子标记增强选择结合使用时是一种很有用的技术。
在育种程序中，双单倍体的产生也可以用来开发自交系。双单倍体通过来自杂合植物的一组染色体(1N)加倍而产生，从而产生完全纯合的个体。例如，参见Wan等，“Efficient Production of Doubled Haploid Plants Through Colchicine Treatment of Anther-Derived Maize Callus”，Theoretical and Applied Genetics，77：889-892，1989和美国专利申请2003/0005479。这可能是有利的，因为此过程省去了为从杂合来源获得纯合植物所需要的自交世代。
单倍体诱导系统已经开发用于各种植物以产生单倍体组织、单倍体植物和单倍体种子。单倍体诱导系统可以通过所选系(作为雌性)与诱导系杂交，产生来自任何基因型的单倍体植物。对于玉米，这样的诱导系包括Stock 6(Coe，1959，Am.Nat.93：381-382；Sharkar和Coe，1966，Genetics 54：453-464)、RWS(参见Geiger，H.H.Application of the in-vivo-haploid induction in hybrid maize breeding′，[在线]，[于2008-08-18检索]，自因特网检索<https://www.uni-hohenheim.de/％7Eipspwww/350b/indexe.html#Project3>)、KEMS(Deimling，Roeber，和Geiger，1997，Vortr.Pfianzenzuchtg 38：203-224)或KMS和ZMS(Chalyk，Bylich & Chebotar，1994，MNL 68：47；Chalyk和Chebotar，2000，Plant Breeding 119：363-364)，和不定型配子体(ig)突变(Kermicle 1969Science 166：1422-1424)；这些参考文献的公开内容都通过引用结合到本文中。
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杂种种子生产需要由母本产生的花粉被消除或失活。花粉的不完全去除或失活为自花授粉提供了潜在可能性。这种偶然的自花授粉种子可能非故意地收获并与杂种种子一起包装。另外，因为父本在田间靠近母本生长，所以存在雄性自交种子可能非故意地收获并与杂种种子一起包装的概率非常低。一旦来自杂种袋的种子被种植，鉴定并选择这些自花授粉植株是有可能的。这些自花授粉植株将在遗传上等同于用来生产杂种的自交系中的一个。尽管在杂种种子袋中包括有自交系的可能性存在，但是发生的概率非常低，因为种子公司为了避免这样的情况采取了很多措施。值得说明的是，将杂种种子卖给种植者用来生产粮食和饲料而不是用来育种或种子生产。对于植物育种领域的技术人员来说，商品杂种种子中非故意地包括的这些自交植株都可以被鉴定和选择出来，因为当与杂种相比较时，它们的活力减低。自交系通过其较低的活力外观根据其营养和/或繁殖特征(包括株高较矮、穗尺寸小、穗和籽粒形状、穗轴颜色或其它特征)被鉴定出来。
这些自花授粉系的鉴定也可以通过分子标记分析来完成。参见“The Identification of Female Selfs in Hybrid Maize：A Comparison Using Electrophoresis and Morphology(在杂种玉米中雌株自身的鉴定：使用电泳和形态学的比较)”，Smith，J.S.C.和Wych，R.D.，Seed Science and Technology 14，第1-8页(1995)，该参考文献的公开内容特意通过引用结合到本文中。通过这些技术，可以通过分析沿着基因组在各种基因座上的等位基因组成，来证实自花授粉系的纯合性。这些方法允许对本文所公开的发明的快速鉴定。另外可参见“Identification of Atypical Plants in Hybrid Maize Seed by Postcontrol and Electrophoresis(通过后控制和电泳鉴定杂交玉米种子中的非典型植物)”Sarca，V.等，Probleme de Genetica Teoritica si Aplicata Vol.20(1)，第29-42页。
另一种形式的商品杂种生产包括使用雄性不育杂种种子和雄性授粉种子的混合物。当种植时，所得雄性不育杂种植物由授粉植株来授粉。该方法主要用于生产具有增强品质谷粒性状(例如高含油量)的谷物，因为在授粉者中表达的所需品质谷粒性状也将在雄性不育杂种植物上结出的谷粒中表达。在这种方法中，所需品质谷粒性状不是必须通过加长程序例如轮回回交选择被掺入到自交亲本系中。这种方法的一种用途描述于美国专利第5,704,160和5,706,603号。
在植物育种领域中有许多重要的因素要考虑，例如识别重要的形态特征和生理特征的能力，设计目标基因型性状和表型性状的评价技术的能力，和找出和利用新的或改进的组合中所需性状的基因的能力。
由玉米植物育种程序引起的商品玉米杂种系开发的目的是开发新的自交系以生产合并产生谷物高产量和优良农艺外观的杂种。育种者探寻的主要性状之一是产量。然而，许多其它的主要农艺性状在杂种组合中十分重要并对产量有影响或者在别的方面提供杂种组合中的优良外观。这样的性状包括收获时谷粒水分百分比、相对成熟度、抗茎杆折断、抗根部倒伏、谷粒品质和抗病虫害。另外，品系本身必须具有亲本性状的可接受外观，亲本性状例如种子产量、籽粒大小、花粉产生，所有这些都影响提供以足够数量和质量进行杂交的亲本系的能力。已经表明，这些性状处于遗传控制之下，许多(若不是全部的话)性状都受到多个基因的影响。
育种者采用了各种方法帮助确定哪些植物应当从分离种群选择出来并最终确定哪些自交系将用来开发杂交种进行商业化。除了对种质和育种者使用的其它技能的知识之外，选择过程的组成部分依赖于与使用统计分析相结合的实验设计。实验设计和统计分析用来帮助确定哪些植物、哪些植物家系和最终哪些自交系和杂种组合对感兴趣的一种或多种性状来说明显好一些或不同。实验设计方法用来评估错误，以便可以更准确地确定两个自交系或两个杂种系之间的差异。统计分析包括计算平均值、测定变异源的统计显著性和计算合适的方差组分。5％或1％显著性水平习惯用来确定给定性状发生的差异是否真实或者是否由环境或实验误差引起。植物育种领域的普通技术人员将知道怎样评价两种植物品种的性状以确定由这些品种表达的两种性状之间是否没有显著差异。例如，参见Fehr，Walt，Principles of Cultivar Development，第261-286页(1987)，其通过引用结合到本文中。平均性状数值可用于确定性状差异是否显著，优选对在相同环境条件下生长的植物性状进行测量。
4.任选的便携式系统
采用上述方法和装置的多个方面，对生长在田间或温室中的植物选取便携式激光器切除种子或叶片的一小部分，同时在植物上，收集或获取植物的特定组织，并且就地分析该组织或将其收集在与标识符相关的容器中，并拿着它返回实验室进行分析，可能是切实可行的。
5.激光镌刻以切割泡罩包装中的种子和捕获飞行中的经切割的种子
图18中公开了另一个选项。可将激光器16调整到切割模式(例如镌刻模式)，它可以通过合适的配置对整个种子进行完全切割、解剖或分离。这将允许种子整块被分离，然后收集(例如泡罩包装100A的孔)。这可以进行自动化和同步化，以便复粒种子可以被系列切割，然后将其切去的多个小块收集起来。可以保持与小块所来源种子的关系。一个实施例是同时收集同样加标容器(另一个泡罩包装100B)中的每粒种子。
6.复粒种子的批量分离分析(Bulk segregate Analysis，BSA)
有可能利用类似的方法和装置对复粒种子进行批量分离分析(BSA)。组织去除工具可以安装成去除来自同一孔(例如板18孔40)的复粒种子的组织。然后，来自复粒种子的组织可以通过BSA进行分析。
可以使用图18。可以从复粒种子中收集切下的多个小块。或者，可以将复粒切割种子置入同一孔内。激光切除可以设定至将这些多个小块切成可用来进行BSA的大小。或者，磨碎机构可以把种子磨碎成混合的微细颗粒。
BSA的一个实施例描述于S Quarrie等，“Bulk segregant analysis with molecular markers and its use for improving drought resistance in maize(利用分子标记物进行批量分离分析及其用于提高玉米耐干旱的用途)”，Journal of Experimental Botany，第50卷，1299-1306，版权1999，Oxford University Press，其通过引用结合到本文中。
7.复粒种子的同时取样
任选地，可以对多粒种子进行同时取样。一个实施例将是把多粒种子定位在已知位置，然后同时去除或暴露种子组织，或每粒种子的一部分。把多粒种子定位在已知位置的方法示于和描述于例如美国申请序列号12/336,084，申请日为2008年12月16日，该申请已转让给本申请的所有人并通过引用全部结合到本文中。切除、去除或暴露种子组织的一种方式是用激光器(如本文所述)。同时从大量种子切除、去除或暴露种子组织的一种方式是将单激光束分裂成多激光束，每束激光都控制到种子的合适位置并且控制功率和用其它操作特征切除或去除种子组织，以产生样品(例如来自种子的小片(chip)，其大小足够用于分析)。有许多分裂激光束的方式用于此目的。在美国专利6,562,698和6,327,090中论述了几个实施例，这两个专利通过引用结合到本文中。其它的也是可能的。
或者，单头可装有多激光器或一个或多个激光束分裂器，其中每个激光器构造成产生一束或多束以切除或去除来自种子的组织。再者，可能有多头，每个都有激光器照此去做。该系统可控制各束的产生和操作，以及怎样针对其相应种子。本领域技术人员可以校正各激光器或激光束，怎样将其定向或移动到操作位置，和操作以完成同时切除的特征，或复粒种子的组织、小片或样品去除。例如，可以用来实现这些实施方案的激光器构造是在激光器中加入电流计头(galvo head)。

Claims (35)

1.一种用于以商业数量生产或用于研究的种子的有资源效率的选择方法，所述方法包括：
a.提供一种或多种候选种子；
b.唯一地鉴定所述一种或多种候选种子中的每一粒；
c.去除第一候选种子的特定组织或结构；
d.进行以下的种子特异性分析
i.第一候选种子，和/或
ii.第一候选种子的去除的特定组织或结构；
e.存储来自与第一候选种子的唯一鉴定相关的种子特异性分析的数据；和
f.运用所述数据评价第一候选种子是否应当被选择出来用于以商业数量生产或用于研究。
2.权利要求1的方法，其中所述评价将所述数据或由所述数据得出的结论与其它种子的类似数据或结论进行比较。
3.权利要求1的方法，所述方法还包括提供许多候选种子并去除来自第二候选种子的特定组织或结构；进行第二候选种子，和/或第一候选种子的去除的特定组织或结构的种子特异性分析；存储来自与第二候选种子的唯一鉴定相关的种子特异性分析的数据；和运用所述数据评价第二候选种子是否应当被选择出来用于以商业数量生产或用于研究。
4.权利要求3的方法，其中所述评价将所述数据或由所述数据得出的结论与和第一候选种子有关的类似数据或结论进行比较。
5.权利要求1的方法，其中去除组织或结构的步骤不显著地影响种子的生存力或萌发。
6.权利要求1的方法，其中所述去除步骤包括使用激光束。
7.权利要求6的方法，所述方法还包括所述种子与其它种子隔离开。
8.权利要求7的方法，其中隔离所述种子包括将所述种子置于有底和侧壁的孔或空腔内。
9.权利要求8的方法，其中所述底和侧壁具有扩散或控制激光束反射的表面特征。
10.权利要求9的方法，其中所述表面特征包括一个或多个与激光束、表面质地、表面涂层或表面处理有关的表面角。
11.权利要求1的方法，所述方法还包括将步骤a至步骤e中的一个或多个自动化。
12.权利要求1的方法，其中所述种子特异性分析包括遗传分析、化学或物理分析、性状或特征分析和表型分析中的一个或多个。
13.权利要求1的方法，其中所述种子包括农业种子。
14.权利要求1的方法，所述方法还包括许多候选种子，所述候选种子中每一个与包含基因型或表型中一个或多个的其它种子有至少一种差异。
15.权利要求1的方法，其中所述种子包括玉米。
16.权利要求15的方法，其中所述组织或结构包括玉米种子的粒壳部分。
17.权利要求16的方法，其中所述粒壳部分正好足以暴露感兴趣的底层组织或结构。
18.权利要求17的方法，其中所述底层组织或结构包括胚或胚乳。
19.权利要求1的方法，所述方法还包括将种子置于容器中与种子的唯一标识符相关的加标位置上。
20.一种用于去除特定种子组织或结构以确保进行种子特异性分析的方法，所述方法包括：
a.使用激光非破坏性地切除、切割或去除来自种子的组织或结构；
b.测试所述种子的组织或结构或所述种子的被去除的组织或结构；和
c.将试验结果用于评价种子是否应当被选择出来供进一步使用。
21.权利要求20的方法，其中所述进一步使用是在种子的研究与开发以及在商业数量生产中的进一步使用。
22.一种产品，所述产品通过权利要求20的方法以商业数量生产。
23.权利要求20的方法，所述方法还包括控制激光正好足以切除、切割或去除种子的外层组织或结构以暴露感兴趣的底层组织或结构。
24.权利要求20的方法，所述方法还包括使用激光切去种子的一部分。
25.权利要求24的方法，所述方法还包括收集种子并切去种子的一部分。
26.一种使允许种子选择的样品组织所需要的时间和空间减少的方法，所述种子用于以商业数量生产或用于研究，所述方法包括：
a.提供许多候选种子；
b.唯一地鉴定所述候选种子中的每一粒；
c.去除各候选种子的特定组织或结构；
d.进行各候选种子或被去除的组织或结构的种子特异性分析；
e.存储来自与各候选种子唯一鉴定相关的种子特异性分析的数据；和
f.运用所述数据评价任何候选种子是否应当被选择出来用于以商业数量生产或用于研究，而无需培育种子。
27.权利要求26的方法，其中所述去除特定组织或结构的步骤是在各种子上自动进行的。
28.权利要求27的方法，其中所述自动去除包括控制与各种子有关的激光束。
29.权利要求28的方法，其中所述种子特异性分析包括遗传、非遗传、纳米级、光谱、表型或细胞水平分析中的一个或多个。
30.一种测试、去除或暴露种子的特定种子结构或组织的方法，所述方法包括：
a.用激光非破坏性地切除种子的外层组织以暴露底层组织或结构；和
b.直接测试暴露的底层组织或结构的遗传内容物。
31.权利要求30的方法，其中所述测试是针对DNA、RNA、蛋白质或脂质。
32.权利要求30的方法，其中所述切除涉及相对小体积的组织，包括玉米籽粒的粒壳。
33.权利要求30的方法，其中所述切除涉及包含在空腔或孔内的单粒种子，该空腔或孔具有使非扩散性激光反射最小化的表面质地、处理或涂层。
34.权利要求30的方法，其中所述切除是在许多种子上进行的，各种子在各自的孔或空腔内。
35.权利要求34的方法，其中所述各自的孔或空腔是在单一元件中形成的。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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