CN112033723B - 一种紫椴种子的石蜡切片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种紫椴种子的石蜡切片方法，包括以下步骤：(1)切口；(2)固定；(3)脱水和透明；(4)浸蜡和包埋；(5)切片；(6)粘片；(7)染色；(8)封固得紫椴种子的石蜡切片。本发明制备的紫椴种子石蜡切片组织结构完整，不变形，种皮，胚乳细胞界限清晰，清晰可见种胚；可为研究紫椴种子萌发过程的结构特征、动态变化以及其他树种切片方法等提供理论和技术支撑，同时又因植物种子的形态结构、解剖学特征受其生长环境影响较大，亦可为其在分类、鉴定等方面提供依据；本发明方法操作简便，易于推广，可为制备具有致密种皮和不饱满种仁的种子切片提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物解剖学技术领域，更具体的说是涉及一种紫椴种子的石蜡切片方法。
背景技术
紫椴(Tilia amurensis)是椴树科(Tiliaceae)椴树属(Tilia)的高大落叶乔木，为国家二级保护树种。紫椴种子具有休眠机制，已有研究表明，紫椴种子休眠的原因除生理后熟和种子中的抑制物质外，种皮的机械障碍也是导致其发芽率低的重要因素，这给紫椴实生苗木的人工繁育带来一定的困难。
对紫椴种子进行解剖结构等方面的研究，可为研究紫椴种子萌发过程的结构特征、动态变化提供理论和技术支撑。
然而由于紫椴种皮柱状石细胞排列紧密，且果皮与种皮之间存有空隙，传统石蜡切片方法对于紫椴种子无法适用，存在着难以浸蜡的难题，导致难以形成连续的蜡带，致使切片不能很好的保持固有结构，容易变形。因此，提供一种有利于保持组织固有结构、不变形的紫椴种子石蜡切片方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种紫椴种子的石蜡切片方法，该方法制作的紫椴种子切片可以保持紫椴种子的固有结构，不变形。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种紫椴种子的石蜡切片方法，包括以下步骤：
(1)切口：在紫椴种子样本中部一侧纵向切开一个切口；
(2)固定：将带切口的紫椴种子样本置于FAA固定液中固定24h；
(3)脱水和透明：
用乙醇洗脱紫椴种子样本中的固定液；之后用不同浓度乙醇对紫椴种子样本进行逐级脱水；再依次用无水乙醇-二甲苯混合溶液和二甲苯进行透明处理；
(4)浸蜡和包埋：
步骤(3)完成后，将紫椴种子样本和二甲苯转入鼓风干燥箱的蜡杯中，逐次少量地添加石蜡碎屑直至饱和，形成二甲苯-石蜡糊状混合物；将鼓风干燥箱的温度升至56℃浸蜡处理，24h后打开蜡杯盖子蒸发去除二甲苯；再将鼓风干燥箱的温度升至65℃，用预热为熔融状的新石蜡替换蜡杯中原有石蜡，最后将石蜡和紫椴种子样本倒入纸盒中进行包埋；
(5)切片：
步骤(4)所得包埋后的紫椴种子样本经自然风干，切成10μm薄片；
(6)粘片：用明胶粘贴剂将步骤(5)所述薄片固定在载玻片上；
(7)染色：用二甲苯脱去切片上的石蜡，再用逐级降低浓度的乙醇对切片进行复水，最后用番红和固绿染色剂进行染色；
(8)封固：将固封剂滴到切片中央，缓慢盖上盖玻片，自然风干，得紫椴种子的石蜡切片。
本发明方法在对紫椴种子结构研究的基础上，对紫椴种子进行切口，再组合适宜的石蜡切片条件，制备具有清晰的解剖结构，且不变形的紫椴种子石蜡切片。本发明可为研究紫椴种子萌发过程的结构特征、动态变化以及其他树种切片方法等提供理论和技术支撑，同时又因植物种子的形态结构、解剖学特征受其生长环境影响较大，亦可为其在分类、鉴定等方面提供依据。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述切口的长度为种子纵向长度的1/2，深度为刺破果皮不伤及胚乳。
以上技术方案的有益效果是：通过对切口长度和深度的限定，使石蜡可浸入紫椴种皮而又不伤及紫椴种子，使得紫椴种子的石蜡切片方法成为可能。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述FAA固定液包括50％乙醇溶液、40％甲醛溶液和冰醋酸，且其体积比为89:6:5；且所述FAA固定液体积为所述紫椴种子样本体积的20倍以上。
以上技术方案的有益效果是：该配比条件的FAA固定液渗透力强，可以防止紫椴种子原生质的收缩，阻止紫椴种子样本过于坚硬。FAA固定液的用量为紫椴种子样本体积的20倍以上，可有效避免紫椴种子样本中的水分对固定液的稀释，保证固定效果。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)：
所述用乙醇洗脱紫椴种子样本中的固定液的操作依次是用70％乙醇洗脱紫椴种子样本1h，然后更换等量的70％乙醇，再洗脱1h；
所述用不同浓度乙醇对紫椴种子样本进行逐级脱水，依次是85％乙醇处理2h、90％乙醇处理2h、95％乙醇处理2h、100％乙醇处理1h和100％乙醇处理1h；
所述对紫椴种子样本进行透明处理，依次是等体积的无水乙醇和二甲苯混合溶液处理12h、二甲苯处理2h和二甲苯处理2h；
其中，本步骤所述70％乙醇、所述不同浓度乙醇、所述无水乙醇和二甲苯混合溶液以及所述二甲苯的体积均为所述紫椴种子样本体积的20倍以上。
以上技术方案的有益效果是：用70％乙醇将紫椴种子样本中的固定液彻底地替换洗脱出来；然后用浓度依次升高的乙醇溶液进行逐级脱水，使紫椴种子样本变硬，形状更加稳定；将紫椴种子样本中的水分全部除净可使包埋剂渗透进所有组织；而透明过程中从无水乙醇、无水乙醇-二甲苯的混合溶液逐渐过渡到二甲苯，可有效避免紫椴种子样本的收缩。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)：
所述石蜡碎屑溶解于二甲苯时，鼓风干燥箱的温度是40℃；
所述蒸发二甲苯的时间是6～8h；
所述用预热为熔融状的新石蜡替换蜡杯中原有石蜡的操作进行3次，每次间隔2h；
所述包埋时调整紫椴种子样本使切面方向向下。
以上技术方案的有益效果是：用石蜡将紫椴种子样本中的透明剂替换出来，替换3次可使石蜡完全进入到细胞的各个部分，使石蜡紧密贴合在细胞壁的内外，有利于保持切片性状完整。
作为本发明优选的技术方案，步骤(5)所述切片：
待包埋后的紫椴种子样本自然风干后，拆去纸盒，将蜡块修整成正方体或长方体，粘在小木块支座上，切片。
作为本发明优选的技术方案，步骤(6)所述粘片具体为：
用明胶粘贴剂将步骤(5)所述薄片粘贴在载玻片上，滴一滴4％的福尔马林；再将载玻片置于展片台上，待切片完全展开后，用滤纸吸去多余溶液；
其中所述展片台温度为36～45℃。
所述明胶粘贴剂的配方包括明胶粉末1g、石碳酸2g、甘油15ml和蒸馏水100ml。
以上技术方案的有益效果是：粘片可固定切片，使紫椴种子样本在后序的融蜡、染色过程中不会从载玻片上脱落下来。而滴加福尔马林可对紫椴种子样本和明胶起到防腐的作用。
作为本发明优选的技术方案，步骤(7)染色步骤依次为：
二甲苯处理20min、体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇处理10min、无水乙醇处理10min、95％乙醇处理10min、90％乙醇处理10min、85％乙醇处理10min、70％乙醇处理10min、1％番红染剂染色4h、50％乙醇处理5s、70％乙醇处理5min、85％乙醇处理5min、95％乙醇处理5min、无水乙醇处理3min、无水乙醇处理3min、固绿染剂染色30s、体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇处理5min、二甲苯处理5min和二甲苯处理5min；
其中，所述二甲苯、所述体积比1:1的二甲苯和无水乙醇以及所述不同浓度乙醇的体积均为所述紫椴种子石蜡切片体积的20倍以上。
以上技术方案的有益效果是：用二甲苯、二甲苯和无水乙醇、无水乙醇逐渐融蜡并彻底脱蜡；脱蜡后的紫椴种子样本切片再经逐渐降低浓度的乙醇溶液处理，使切片中的水分逐级增加，可以保护细胞和切片的形状，使染色均匀效果佳。若无此逐级复水的过程，则会导致紫椴种子切片严重变形，染色困难。
本发明的又一目的是提供上述石蜡切片制备方法在制备具有致密种皮和不饱满种仁的种子切片中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种紫椴种子的石蜡切片方法，该方法使紫椴种子的石蜡切片方法成为可能，通过本发明制备的紫椴种子石蜡切片组织结构完整，不变形，种皮，胚乳细胞界限清晰，清晰可见种胚；可为研究紫椴种子萌发过程的结构特征、动态变化以及其他树种切片方法等提供理论和技术支撑，同时又因植物种子的形态结构、解剖学特征受其生长环境影响较大，亦可为其在分类、鉴定等方面提供依据；本发明方法操作简便，易于推广，可为制备具有致密种皮和不饱满种仁的种子切片提供技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1提供的紫椴种子石蜡切片示意图；
图2附图为本发明对比例1提供的紫椴种子石蜡切片示意图；
图3附图为本发明对比例2提供的紫椴种子石蜡切片示意图；
图4附图为本发明对比例3提供的紫椴种子石蜡切片示意图；
图5附图为本发明对比例4提供的紫椴种子石蜡切片示意图；
图6附图为本发明对比例5提供的紫椴种子石蜡切片示意图；
图7附图为本发明对比例8提供的紫椴种子石蜡切片示意图；
图8附图为本发明对比例9提供的紫椴种子石蜡切片示意图；
图9附图为本发明对比例10提供的紫椴种子石蜡切片示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种紫椴种子的石蜡切片及其制备方法，所涉及的原料和试剂均为市售可得，对其来源不做具体限定。发明中所涉及到的方法，如无特别提及，均为常规操作方法，在此不再一一赘述。
实施例1
(1)切口：将紫椴种子样本沿中部一侧纵向切开一个长度为种子纵向长度的1/2，深度为刺破果皮不伤及胚乳的切口；
(2)固定：将带切口的紫椴种子样本置于FAA固定液中固定24h；FAA固定液包括50％乙醇溶液、40％甲醛溶液和冰醋酸，且其体积比为：50％乙醇溶液：40％甲醛溶液：冰醋酸＝89:6:5，FAA固定液的用量为紫椴种子样本体积的20倍。
(3)脱水和透明：
用70％乙醇洗脱紫椴种子样本中的固定液，洗脱1h后，更换等量70％乙醇，再次洗脱1h；
再对紫椴种子样本用不同浓度乙醇进行逐级脱水；具体为85％乙醇2h→90％乙醇2h→95％乙醇2h→100％乙醇1h→100％乙醇1h；
之后对紫椴种子样本进行透明处理；具体为等体积的无水乙醇和二甲苯混合溶液12h→二甲苯2h→二甲苯2h；
本步骤中70％乙醇、不同浓度乙醇、无水乙醇和二甲苯混合溶液以及二甲苯的用量均为紫椴种子样本体积的20倍；
(4)浸蜡和包埋：
步骤(3)完成后，将二甲苯和紫椴种子样本转入40℃鼓风干燥箱的蜡杯中，逐次少量地添加石蜡碎屑使其溶解于二甲苯中，直至饱和，形成二甲苯-石蜡糊状混合物；
将鼓风干燥箱温度调至56℃，浸蜡24h，打开蜡杯的盖子，蒸发二甲苯6～8h；
再将鼓风干燥箱温度调至65℃，用预热为熔融状的新的石蜡替换蜡杯中原有的石蜡，使新的石蜡浸没紫椴种子样本，每隔2h替换一次，替换3次后将石蜡和紫椴种子样本倒入纸盒中，调整紫椴种子样本使其切面方向向下进行包埋；
(5)切片：
步骤(4)所得包埋后的紫椴种子样本自然风干后，拆去纸盒，将蜡块修整成正方体或长方体，粘在小木块支座上，切成10μm的薄片；
(6)粘片：用明胶粘贴剂将步骤(5)所得薄片粘贴在载玻片上，滴一滴4％的福尔马林；再将载玻片置于展片台上，待切片完全展开后，用滤纸吸去多余溶液；其中所述展片台温度为36～45℃。
(7)染色：用二甲苯脱去切片上的石蜡，再用逐级降低浓度的乙醇对切片进行复水，最后用番红和固绿染色剂进行染色；
具体为二甲苯20min→1:1的二甲苯：无水乙醇10min→无水乙醇10min→95％乙醇溶液10min→90％乙醇溶液10min→85％乙醇溶液10min→70％乙醇溶液10min→1％番红染剂4h→50％乙醇溶液5s→70％乙醇溶液5min→85％乙醇溶液5min→95％乙醇溶液5min→无水乙醇3min→无水乙醇3min→固绿染剂30s→1:1的二甲苯：无水乙醇5min→二甲苯5min→二甲苯5min；
本步骤二甲苯、1:1的二甲苯和无水乙醇以及不同浓度乙醇的用量均为紫椴种子石蜡切片体积的20倍。
(8)封固：将固封剂滴到切片中央，缓慢盖上盖玻片，自然风干，得紫椴种子的石蜡切片(参见附图1)。
对比例1
步骤(2)中FAA固定液固定紫椴种子样本的时间为6h，其他操作同实施例1(参见附图2)。
对比例2
步骤(2)中FAA固定液固定紫椴种子样本的时间为12h，其他操作同实施例1(参见附图3)。
对比例3
步骤(2)中FAA固定液固定紫椴种子样本的时间为18h，其他操作同实施例1(参见附图4)。
对比例4
步骤(2)中FAA固定液固定紫椴种子样本的时间为30h，其他操作同实施例1(参见附图5)。
对比例5
步骤(2)中FAA固定液固定紫椴种子样本的时间为36h，其他操作同实施例1(参见附图6)。
对比例6
步骤(4)中浸蜡时间为48h，其他操作同实施例1。
对比例7
步骤(4)中浸蜡时间为72h，其他操作同实施例1。
对比例8
步骤(5)中切片厚度为8μm，其他操作同实施例1(参见附图7)。
对比例9
步骤(5)中切片厚度为12μm，其他操作同实施例1(参见附图8)。
对比例10
步骤(5)中切片厚度为15μm，其他操作同实施例1(参见附图9)。对实施例和不同对比例得到紫椴种子石蜡切片进行评价，结果见表1.
表1
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种紫椴种子的石蜡切片方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)切口：在紫椴种子样本中部一侧纵向切开一个切口；所述切口的长度为种子纵向长度的1/2，深度为刺破果皮不伤及胚乳；
(2)固定：将带切口的紫椴种子样本置于FAA固定液中固定24h；
(3)脱水和透明：
用乙醇洗脱紫椴种子样本中的固定液；之后用不同浓度乙醇对紫椴种子样本进行逐级脱水；再依次用无水乙醇-二甲苯混合溶液和二甲苯进行透明处理；
(4)浸蜡和包埋：
步骤(3)完成后，将紫椴种子样本和二甲苯转入鼓风干燥箱的蜡杯中，逐次添加石蜡碎屑直至饱和，形成二甲苯-石蜡糊状混合物；将鼓风干燥箱的温度升至56℃浸蜡处理，24h后打开蜡杯盖子蒸发去除二甲苯；再将鼓风干燥箱的温度升至65℃，用预热为熔融状的新石蜡替换蜡杯中原有石蜡，最后将石蜡和紫椴种子样本倒入纸盒中进行包埋；
(5)切片：
步骤(4)所得包埋后的紫椴种子样本经自然风干，切成10μm薄片；
(6)粘片：用明胶粘贴剂将步骤(5)所述薄片固定在载玻片上；
(7)染色：用二甲苯脱去切片上的石蜡，再用逐级降低浓度的乙醇对切片进行复水，最后用番红和固绿染色剂进行染色；
(8)封固：将固封剂滴到切片中央，缓慢盖上盖玻片，自然风干，得紫椴种子的石蜡切片。
2.根据权利要求1所述的一种紫椴种子的石蜡切片方法，其特征在于，步骤(2)所述FAA固定液包括50％乙醇溶液、40％甲醛溶液和冰醋酸，其体积比为89:6:5；
且所述FAA固定液体积为所述紫椴种子样本体积的20倍以上。
3.根据权利要求1所述的一种紫椴种子的石蜡切片方法，其特征在于，步骤(3)：
所述用乙醇洗脱紫椴种子样本中的固定液的操作依次是用70％乙醇洗脱紫椴种子样本1h，然后更换等量的70％乙醇，再洗脱1h；
所述用不同浓度乙醇对紫椴种子样本进行逐级脱水，依次是85％乙醇处理2h、90％乙醇处理2h、95％乙醇处理2h、100％乙醇处理1h和100％乙醇处理1h；
所述对紫椴种子样本进行透明处理，依次是等体积的无水乙醇和二甲苯混合溶液处理12h、二甲苯处理2h和二甲苯处理2h；
其中，本步骤所述70％乙醇、所述不同浓度乙醇、所述无水乙醇和二甲苯混合溶液以及所述二甲苯的体积均为所述紫椴种子样本体积的20倍以上。
4.根据权利要求1所述的一种紫椴种子的石蜡切片方法，其特征在于，步骤(4)
所述石蜡碎屑溶解于二甲苯时，鼓风干燥箱的温度是40℃；
所述蒸发二甲苯的时间是6～8h；
所述用预热为熔融状的新石蜡替换蜡杯中原有石蜡的操作进行3次，每次间隔2h；
所述包埋时调整紫椴种子样本使切面方向向下。
5.根据权利要求1所述的一种紫椴种子的石蜡切片方法，其特征在于，步骤(5)所述切片：待包埋后的紫椴种子样本自然风干后，拆去纸盒，将蜡块修整成正方体或长方体，粘在小木块支座上，切片。
6.根据权利要求1所述的一种紫椴种子的石蜡切片方法，其特征在于，步骤(6)所述粘片具体为，用明胶粘贴剂将步骤(5)所述薄片粘贴在载玻片上，滴一滴4％的福尔马林；再将载玻片置于展片台上，待切片完全展开后，用滤纸吸去多余溶液；
其中所述展片台温度为36～45℃。
7.根据权利要求1所述的一种紫椴种子的石蜡切片方法，其特征在于，步骤(7)染色步骤依次为二甲苯处理20min、体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇处理10min、无水乙醇处理10min、95％乙醇处理10min、90％乙醇处理10min、85％乙醇处理10min、70％乙醇处理10min、1％番红染剂染色4h、50％乙醇处理5s、70％乙醇处理5min、85％乙醇处理5min、95％乙醇处理5min、无水乙醇处理3min、无水乙醇处理3min、固绿染剂染色30s、体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇处理5min、二甲苯处理5min和二甲苯处理5min；
其中，所述二甲苯、所述体积比1:1的二甲苯和无水乙醇以及所述不同浓度乙醇的体积均为所述紫椴种子石蜡切片体积的20倍以上。
8.权利要求1-7任一所述的方法在制备具有致密种皮和不饱满种仁的种子切片中的应用。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002281808A (ja) * | 2001-03-26 | 2002-10-02 | Toko Corp | 木本植物種子の早期検定法 |
| CN103460855A (zh) * | 2013-10-11 | 2013-12-25 | 栗宁宁 | 一种檫树种子促萌发方法 |
| CN103630421A (zh) * | 2013-12-03 | 2014-03-12 | 沈阳农业大学 | 一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法 |
| KR20150012566A (ko) * | 2013-07-25 | 2015-02-04 | 전남과학대학교 산학협력단 | 수박품종의 재 분화 방법 |
| CN104849110A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-08-19 | 成都大学 | 一种植物组织的石蜡切片方法 |
| CN105699142A (zh) * | 2016-02-18 | 2016-06-22 | 石河子大学 | 用于质地紧密坚硬植物材料的石蜡切片制作方法 |
| CN107202720A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-09-26 | 安徽省农业科学院园艺研究所 | 一种石榴籽粒的石蜡切片方法 |
| CN108414318A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-08-17 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 一种杜鹃花种子的石蜡切片制作方法 |
| CN109632433A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-04-16 | 安徽丰絮农业科技股份有限公司 | 一种用于检测棉花种子质量的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102165320A (zh) * | 2008-08-22 | 2011-08-24 | 先锋国际良种公司 | 用于去除特定的种子组织或结构进行种子分析的方法 |
| AU2015256250A1 (en) * | 2014-05-06 | 2016-11-17 | Dow Agrosciences Llc | System for seed preparation and method of use |
| BR102016017683B1 (pt) * | 2015-07-31 | 2021-10-05 | Dow Agrosciences Llc | Sistema / aparelho de corte de semente |
-
2020
- 2020-10-10 CN CN202011079054.3A patent/CN112033723B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002281808A (ja) * | 2001-03-26 | 2002-10-02 | Toko Corp | 木本植物種子の早期検定法 |
| KR20150012566A (ko) * | 2013-07-25 | 2015-02-04 | 전남과학대학교 산학협력단 | 수박품종의 재 분화 방법 |
| CN103460855A (zh) * | 2013-10-11 | 2013-12-25 | 栗宁宁 | 一种檫树种子促萌发方法 |
| CN103630421A (zh) * | 2013-12-03 | 2014-03-12 | 沈阳农业大学 | 一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法 |
| CN104849110A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-08-19 | 成都大学 | 一种植物组织的石蜡切片方法 |
| CN105699142A (zh) * | 2016-02-18 | 2016-06-22 | 石河子大学 | 用于质地紧密坚硬植物材料的石蜡切片制作方法 |
| CN107202720A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-09-26 | 安徽省农业科学院园艺研究所 | 一种石榴籽粒的石蜡切片方法 |
| CN108414318A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-08-17 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 一种杜鹃花种子的石蜡切片制作方法 |
| CN109632433A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-04-16 | 安徽丰絮农业科技股份有限公司 | 一种用于检测棉花种子质量的方法 |
Non-Patent Citations (20)
| Title |
|---|
| Embryology of Myosoton and Stellaria and its taxonomic significance (Caryophyllaceae);LIU WANG 等;PHYTOTAXA;20170509;124-134 * |
| Linkage Mapping and Comparative Transcriptome Analysis of Firmness in Watermelon (Citrullus lanatus);lei sun 等;《Front. Plant Sci.》;第1-14页 * |
| Seed Coat Structural and Permeability Properties ofTilia miquelianaSeeds;Wu Y 等;Journal of Plant Growth Regulation;20200701;1198-1209 * |
| 三倍体西瓜种子萌发障碍与种皮的关系;戴思慧;孙小武;熊兴耀;肖杰;黄智;;湖南农业大学学报(自然科学版)(第04期);第50-55页 * |
| 东北红豆杉种子生物学特性研究进展;秦祎婷 等;北方园艺;20141215;171-175 * |
| 华榛、羽叶丁香种子形态构造特点的研究;姜在民, 蔡靖, 崔宏安;陕西林业科技(第03期);第15-17页 * |
| 天目琼花种子萌发生理生化特性研究;张谦;中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技;20200115;1-60 * |
| 张春宇 等.《植物学实验》.中国农业大学出版社,2007,第113-115页. * |
| 彭玲.《普通生物学实验》.华中科技大学出版社,2006,第35页. * |
| 怎样制作小麦"种子"的切片;李正理;李懋学;;生命世界(第01期);第23-24页 * |
| 杨玲.花楸种子生物学研究.东北林业大学出版社,2008,61-64. * |
| 椒目种皮的石蜡切片制备方法及显微鉴别研究;曹蔚 等;陕西中医;20120305;353-354 * |
| 毛鸡骨草种子四唑染色法的研究;谭伟东;朱艳霞;柯芳;叶志文;钟一雄;董青松;;大众科技(第03期);第11+30-31页 * |
| 澳洲野生棉种子叶色素腺体延缓形成的组织结构观察;祝水金, 季道藩, 汪若海, 王红梅;棉花学报(第02期);第26-32页 * |
| 硫酸处理药用植物硬实种子的研究;刘丽莎;中国中药杂志;19970225(第02期);11-13+62 * |
| 紫椴种子休眠原因的初步研究;王九龄 等;《林业科学》(第3期);第317-324页 * |
| 蓝靛果忍冬种子结构与幼苗初生结构的研究;栾志慧;张启昌;其其格;鲍玉春;;吉林工程技术师范学院学报;20060925(第09期);43-46 * |
| 虎皮鹦鹉胃和十二指肠组织结构的光镜和电镜观察;王昱;何九军;杨小录;崔文辉;王振福;;西北民族大学学报(自然科学版)(第02期);第47-51页 * |
| 长白山森林不同演替阶段采伐林隙土壤种子库特征;张智婷 等;《应用生态学报》;第1293-1298页 * |
| 黄柏种子的解剖构造研究;梁晴 等;《时珍国医国药》;第2931-2935页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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