WO2026018802A1 - 微小有用物質を含む濃縮液の製造方法 - Google Patents

微小有用物質を含む濃縮液の製造方法

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WO2026018802A1
WO2026018802A1 PCT/JP2025/025076 JP2025025076W WO2026018802A1 WO 2026018802 A1 WO2026018802 A1 WO 2026018802A1 JP 2025025076 W JP2025025076 W JP 2025025076W WO 2026018802 A1 WO2026018802 A1 WO 2026018802A1
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WO
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hollow fiber
useful
fiber membrane
raw material
liquid
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PCT/JP2025/025076
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English (en)
French (fr)
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太史 前田
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Daicel Corp
Original Assignee
Daicel Corp
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for producing a concentrated solution containing minute useful substances.
  • One known method for concentrating useful micro-substances such as extracellular vesicles is to use a separation membrane.
  • Patent Document 1 describes a method for recovering useful substances, which includes a bleeding step in which culture medium is discharged from a cell culture vessel and an equal volume of fresh medium to the discharged culture medium is added to the culture vessel, and a filtration step in which the culture medium extracted from the culture vessel is filtered using a porous membrane that does not substantially have a dense layer, wherein the filtration in the filtration step is tangential flow filtration and the velocity of the permeate in the filtration step is 1.0 LMH or less.
  • the useful minute substances may be selected from the group consisting of proteins, viruses, exosomes, and nucleic acids.
  • Patent Document 2 describes an exosome extraction device and exosome extraction method that can efficiently collect large amounts of exosomes, a type of extracellular vesicle.
  • the exosome extraction device described in Patent Document 2 filters a liquid containing exosomes supplied from a raw liquid supply unit using a first filter and a second filter, each with different functions, to concentrate the exosomes in the liquid.
  • JP 2018-76291 A Japanese Patent Application Laid-Open No. 2021-145649
  • This disclosure has been made in light of the above circumstances, and aims to provide a method for effectively producing a concentrated solution of minute useful substances.
  • a method for producing a concentrated liquid containing useful micro-substances comprising: adding an oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester to a primary liquid raw material containing useful micro-substances to obtain a secondary liquid raw material; and applying the secondary liquid raw material to a hollow fiber membrane to concentrate the secondary liquid raw material.
  • a method for concentrating a liquid raw material containing useful micro-substances comprising: adding an oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester to a primary liquid raw material containing useful micro-substances to obtain a secondary liquid raw material; and applying the secondary liquid raw material to a hollow fiber membrane.
  • the present disclosure provides a method for effectively producing a concentrated solution containing minute useful substances.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an example of an apparatus used in the manufacturing method of the present disclosure.
  • a method for producing a concentrated liquid containing useful micro-substances includes adding an oxyethylene adduct of sorbitan unsaturated fatty acid ester to a primary liquid feedstock containing useful micro-substances to obtain a secondary liquid feedstock, and applying the secondary liquid feedstock to a hollow fiber membrane to concentrate the secondary liquid feedstock. Concentrating the secondary liquid feedstock, obtained by adding an oxyethylene adduct of sorbitan unsaturated fatty acid ester to the primary liquid feedstock containing useful micro-substances, using a hollow fiber membrane tends to improve the recovery efficiency (concentration) of useful micro-substances.
  • the concentrated liquid containing the useful micro substance means a liquid in which the concentration of the useful micro substance is higher than that of the liquid raw material.
  • the concentration of the useful micro substance in the concentrated liquid depends on the concentration of the useful micro substance in the liquid raw material, but is preferably 0.1 to 500 ng/ml, more preferably 0.5 to 200 ng/ml, and even more preferably 1 to 100 ng/ml.
  • micro-useful substance refers to a micro-substance containing nucleic acids (such as microRNA, messenger RNA, and DNA), proteins, lipids, and/or various metabolic products.
  • the diameter of the micro-useful substance is preferably 10 to 1000 nm, more preferably 15 to 500 nm, and even more preferably 20 to 200 nm.
  • the micro-useful substance is preferably a particle covered with a lipid bilayer, and examples of the lipid bilayer-covered particle include extracellular vesicles. Extracellular vesicles are a collective term for particles without a nucleus that are covered with a lipid bilayer and are released outside of cells. These particles include nucleic acids, proteins, lipids, metabolic products, and examples of such particles include exosomes, microvesicles, and apoptotic vesicles.
  • the primary liquid raw material is not particularly limited as long as it contains a micro-substance, and examples thereof include a cell culture medium or dispersion.
  • the concentration of the micro-substance in the primary liquid raw material is not particularly limited.
  • the culture medium is preferably a cell culture supernatant, more preferably a mesenchymal stem cell culture supernatant.
  • Mesenchymal stem cells containing extracellular vesicles can be derived from various sources, such as bone marrow, blood, fat, umbilical cord, umbilical cord blood, periosteum, perichondrium, and other somatic tissues. Culturing methods for the above-described cells are described, for example, in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-67175 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-52360.
  • the secondary liquid raw material contains a minute useful substance and an oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester.
  • concentration of the minute useful substance in the secondary liquid raw material is not particularly limited.
  • the secondary liquid source may include, for dilution, pure water; filtered water such as tap water, groundwater, or river water; various aqueous solutions, etc.
  • physiological saline or a medical or biochemical buffer solution examples include Tris-HCl buffer (TBS), phosphate buffer solution (PBS), sodium citrate buffer solution, citrate-phosphate buffer solution, acetate buffer solution, borate buffer solution, etc.
  • oxyethylene adduct of sorbitan unsaturated fatty acid ester examples include oxyethylene adducts of esters of sorbitan and monounsaturated or polyunsaturated fatty acids.
  • monounsaturated or polyunsaturated fatty acids include unsaturated fatty acids having 10 to 30 carbon atoms (preferably 12 to 28, more preferably 13 to 27, even more preferably 15 to 25, and particularly preferably 18 to 22).
  • oxyethylene adducts of sorbitan unsaturated fatty acid esters include polyoxyethylene sorbitan oleate, polyoxyethylene sorbitan linolenate, polyoxyethylene sorbitan arachidonate, polyoxyethylene sorbitan eicosapentaenoate, and polyoxyethylene sorbitan docosahexaenoate.
  • oxyethylene adducts of esters of monounsaturated fatty acids and sorbitan are preferred, and polyoxyethylene sorbitan oleate is more preferred.
  • the concentration of the oxyethylene adduct of sorbitan unsaturated fatty acid ester in the secondary liquid raw material is preferably 1 to 1000 ppm, more preferably 10 to 500 ppm, and even more preferably 50 to 250 ppm.
  • the material of the hollow fiber membrane can be appropriately designed depending on the intended use of the present disclosure and the properties of the liquid containing the minute useful substance.
  • organic polymer materials such as polyvinyl fluoride (PVDF), polyethersulfone (PES), polysulfone (PSf), polyolefins (PE, PP, PTFE, etc.), polyamides, polyacrylonitrile, cellulose acetate (CA), and their modified forms can be used.
  • PVDF polyvinyl fluoride
  • PES polyethersulfone
  • PSf polysulfone
  • PE polyolefins
  • CA polyamides
  • polyacrylonitrile cellulose acetate
  • CA cellulose acetate
  • CA cellulose acetate
  • CA membrane a hollow fiber membrane made of CA
  • the reason for this is that the surface charge of biomolecules is weakly negative, and the CA membrane is also weakly negative, so the biomolecules and the CA membrane are not attracted to each other by strong Coulomb forces, and the shear force of cross-flow filtration is easily functioning by appropriately controlling the circulation linear velocity.
  • minute amounts of useful substances deposited on the membrane surface of the hollow fiber membrane can be more efficiently recovered by the method described below.
  • the average inner diameter of the hollow fiber membrane can be designed as needed depending on the intended use of the present disclosure and the properties of the liquid containing the useful micro-substance.
  • hollow fiber membranes with an average inner diameter of 0.2 mm to 1.4 mm can be used.
  • the "average inner diameter of the hollow fiber membrane” in this disclosure is a value calculated by cutting a single hollow fiber membrane along an arbitrary plane perpendicular to the longitudinal direction and calculating the diameter of the smallest circle inscribed in the hollow portion of the cut surface. In this disclosure, the diameter is measured at any 10 to 100 points on the cut surface, and the average value is defined as the "average inner diameter.”
  • the hollow fiber membrane may have an average outer diameter of 0.3 mm to 2.0 mm. In one embodiment, when the average inner diameter of the hollow fiber membrane is 0.2 mm to 1.0 mm, the average outer diameter may be 0.3 mm to 1.4 mm. In another embodiment, when the average inner diameter of the hollow fiber membrane is 1.0 mm to 1.4 mm, the average outer diameter may be 1.5 mm to 2.0 mm.
  • the "average outer diameter of the hollow fiber membrane" is a value calculated from the diameter of the smallest circle that encompasses the outer edge of the cut surface of a hollow fiber membrane cut in the same manner as the aforementioned average inner diameter of the hollow fiber membrane. In the present disclosure, the diameters are measured at any 10 to 100 locations on the cut surface, and the average value is defined as the "average outer diameter.”
  • the hollow fiber membrane may have an average inner diameter of 0.6 mm to 1.4 mm, from the viewpoint of easily ensuring a membrane thickness that does not make the hollow fiber membrane too flexible and easily improving the recovery efficiency of useful minute substances deposited on the membrane surface of the hollow fiber membrane.
  • the average inner diameter may be adjusted depending on the liquid viscosity of the liquid containing the useful micro substance during operation.
  • the liquid viscosity is high (for example, when the liquid viscosity is 10 to 30 mPa ⁇ s at a liquid temperature of 20°C and a shear rate of 25 s -1 ), it is preferable to use a large-diameter hollow fiber membrane having an average inner diameter of 1.0 mm to 1.4 mm.
  • the liquid viscosity of the liquid containing the useful micro substance during operation is low (for example, when the liquid viscosity is less than 10 mPa ⁇ s at a liquid temperature of 20°C and a shear rate of 25 s -1 ), it is preferable to use a hollow fiber membrane having an average inner diameter of 0.6 mm to 1.0 mm. Note that, if the average inner diameter of the hollow fiber membrane is large, the effective membrane area tends to decrease when the hollow fiber membrane is used as a hollow fiber membrane module. Therefore, from the viewpoint of easily suppressing a decrease in the effective membrane area when used as a hollow fiber membrane module, it is preferable to use a hollow fiber membrane having an average inner diameter of 0.2 mm to 1.0 mm.
  • the molecular weight cutoff of the hollow fiber membrane can be designed as appropriate depending on the intended use, the properties of the liquid raw material containing the minute useful substance, etc. In one embodiment, the molecular weight cutoff may be 5,000 to 3,000,000, or may be 10,000 to 1,000,000. It is preferable to use a hollow fiber membrane with a molecular weight cutoff slightly lower than that of the minute useful substance (for example, a hollow fiber membrane having a molecular weight cutoff approximately 10 to 50% lower than the molecular weight of the minute useful substance). In one embodiment, when the minute useful substance is an exosome, the molecular weight cutoff of the hollow fiber membrane is preferably 50,000 to 1,000,000, more preferably 70,000 to 800,000, and even more preferably 100,000 to 500,000.
  • the molecular weight cutoff can be evaluated by the ⁇ globulin permeability % (( ⁇ globulin concentration in permeate/ ⁇ globulin concentration in solution (100 mg/L) ⁇ 100) when a 100 mg/L solution of ⁇ globulin (bovine serum ⁇ globulin manufactured by SIGMA, molecular weight 150,000) in a phosphate buffer solution is cross-flow permeated through the hollow fiber membrane 30 at a filtration pressure of 0.1 MPa (membrane surface velocity: 0.2 m/s).
  • the hollow fiber membrane 30 preferably has a ⁇ globulin permeability of 5% to 95%, more preferably 10 to 80%, and even more preferably 10 to 70%.
  • FUS5082 polyethersulfone membrane; molecular weight cutoff 500,000, gamma globulin permeability 70%
  • FUC1582 cellulose acetate membrane; molecular weight cutoff 150,000, gamma globulin permeability 10%
  • the hollow fiber membrane may be a hollow fiber membrane module in which a plurality of hollow fiber membranes are housed in a case housing having a plurality of liquid inlets and outlets.
  • hollow fiber membranes used in a hollow fiber membrane module.
  • the number of membranes incorporated into the module can be designed appropriately to obtain the required effective membrane area, depending on the intended use of the present disclosure and the weight of the useful micro-substance to be concentrated, etc.
  • the hollow fiber membranes are preferably bundled together with an adhesive or the like and stored in the container.
  • a liquid containing useful micro-substances when supplied from the first liquid inlet/outlet and/or second liquid inlet/outlet of the hollow fiber membrane module, the liquid flows into one side of the hollow fiber membrane bundle in the container (inside or outside the hollow fiber membrane bundle) and is concentrated in the hollow fiber membrane bundle.
  • the permeated liquid that permeates the hollow fiber membrane bundle flows out the other side of the hollow fiber membrane bundle (inside or outside the hollow fiber membrane bundle) and is discharged from the third liquid inlet/outlet.
  • the concentrated liquid that remains inside or outside the hollow fiber membrane bundle without permeating can be discharged (recovered) from the hollow fiber membrane module through the first liquid inlet/outlet and/or second liquid inlet/outlet.
  • the ⁇ -globulin permeability of the hollow fiber membrane module disclosed herein is preferably 5 to 90%, more preferably 10 to 80%, from the viewpoint of concentration efficiency.
  • the filling rate of the hollow fiber membrane module disclosed herein is preferably 5 to 55%, more preferably 20 to 55%, and even more preferably 25 to 55%.
  • the filling rate refers to the percentage of the total cross-sectional area of the outer diameter portion of the hollow fiber membrane bundle relative to the cross-sectional area of the hollow fiber membrane module, typically a cylindrical container, in the short direction.
  • a filling rate of 5 to 55% allows for more efficient recovery of minute amounts of useful substances deposited on the membrane surface of the hollow fiber membranes while optimizing the size of the hollow fiber membrane module.
  • an oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester is added to a primary liquid feedstock containing useful micro-substances.
  • the timing of adding the oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester is not particularly limited.
  • the secondary liquid feedstock may be prepared by adding the oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester to the primary liquid feedstock before the liquid feedstock is fed into the hollow fiber membrane, or the secondary liquid feedstock may be mixed with the oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester within the hollow fiber membrane.
  • the oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester may be added through an inlet separate from the inlet for the primary liquid feedstock, and the primary liquid feedstock and the oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester may be mixed within the hollow fiber membrane to obtain the secondary liquid feedstock.
  • the timing of starting to feed the primary liquid feedstock to the hollow fiber membrane and the timing of adding the oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester may be the same or different.
  • the method of addition is not limited, and for example, the primary liquid raw material may be added at room temperature (for example, 25° C.) while being stirred.
  • the amount of the oxyethylene adduct of sorbitan unsaturated fatty acid ester added to the first liquid raw material can be appropriately adjusted so that the concentration of the oxyethylene adduct of sorbitan unsaturated fatty acid ester in the second liquid raw material is 1 to 1000 ppm, 10 to 500 ppm, or 50 to 250 ppm.
  • the secondary liquid feedstock is applied to a hollow fiber membrane to concentrate the secondary liquid feedstock.
  • Applying the secondary liquid raw material to the hollow fiber membrane means passing the secondary liquid raw material through at least a portion of the inside of the hollow fiber membrane, and in one embodiment means sending the liquid from one end to the other end.
  • Concentrating means increasing the concentration of a specific substance in the target liquid.
  • the process of concentrating the secondary liquid raw material means increasing the concentration of useful micro-substances in the secondary liquid raw material.
  • the liquid that passes through the hollow fiber membrane is referred to as the "permeate,” and the liquid that does not pass through the hollow fiber membrane and remains in the hollow fiber membrane is referred to as the "concentrate.”
  • the concentrating apparatus shown in Fig. 1 includes a first tank 10, a second tank 20, and a hollow fiber membrane 30.
  • a concentrated liquid recovery tank 35 for recovering a concentrated liquid (final concentrated liquid) is connected to the hollow fiber membrane 30 via a three-way stopcock 40.
  • First filtration step First, a secondary liquid raw material prepared in advance is placed in the first tank 10.
  • a pump (not shown) or the like is operated (for example, by using a liquid feed pump (not shown) or by supplying gas (nitrogen (N 2 ) gas, etc.) into the first tank 10 from a gas supply source (not shown)) to pressurize the secondary liquid raw material stored in the first tank 10 into the inside of the hollow fiber membrane 30.
  • gas nitrogen (N 2 ) gas, etc.
  • the useful micro-substances are filtered without passing through the hollow fiber membrane 30, and the secondary liquid raw material is concentrated.
  • the first filtration step can be performed. Note that in this embodiment, the process of filtering the liquid in the first tank 10 through the hollow fiber membrane 30 and sending it to the second tank 20 is all referred to as the first filtration step.
  • the gas used for pressurization can be selected from inert gases such as nitrogen gas, argon, and helium, carbon dioxide, and clean air filtered with a HEPA filter.
  • the permeate that permeates the hollow fiber membrane 30 is discharged outside the system, and the concentrated liquid (first concentrated liquid) is sent to the second tank 20.
  • the concentrated liquid first concentrated liquid
  • a space remains above the second tank 20 where no first concentrated liquid is present.
  • the hollow fiber membrane 30 is arranged to connect the liquid inlet/outlet of the first tank 10 to the liquid inlet/outlet at the connection part of the second tank 20.
  • the hollow fiber membrane 30 can be connected to the liquid inlet/outlet of the first tank 10, for example, by fitting the open end of the hollow fiber membrane 30 into a thin tube such as a syringe needle fixed to the liquid inlet/outlet side of the first tank 10.
  • the hollow fiber membrane 30 can also be connected to the liquid inlet/outlet of the second tank 20 in a similar manner.
  • one hollow fiber membrane 30 is shown, but multiple membranes may be used, for example, as a hollow fiber membrane bundle consisting of 2 to 150 membranes.
  • a hollow fiber membrane module may also be used, in which multiple hollow fiber membranes 30 (hollow fiber membrane bundle) are housed in a case housing with multiple liquid inlets and outlets. When used as a hollow fiber membrane bundle, one or both ends can be joined together with an adhesive.
  • the multiple liquid inlets and outlets of the hollow fiber membrane module can be connected to the liquid inlets and outlets of the first tank 10 and the second tank 20, and the liquid permeation outlet of the hollow fiber membrane module can be connected to the permeate tank.
  • filtration is preferably performed at a membrane surface velocity in the range of 0.3 m/sec to 4.0 m/sec, and more preferably at a membrane surface velocity in the range of 0.5 m/sec to 3.5 m/sec. If the membrane surface velocity is below 0.3 m/sec, purification efficiency decreases. Conversely, if it exceeds 4 m/sec, the pressure level required to increase the membrane surface velocity becomes too high, and the shear force applied to the useful micro-substances during filtration also becomes too high, which may result in deterioration of the useful micro-substances.
  • the inlet pressure of the hollow fiber membrane 30 (on the liquid inlet/outlet 10a side of the first tank 10) is preferably adjusted to 0.01 MPa to 0.2 MPa, more preferably to 0.015 MPa to 0.15 MPa, and even more preferably to 0.02 MPa to 0.12 MPa.
  • a pump (not shown) or the like is operated to supply gas (nitrogen gas in this example) from a gas supply source (not shown) into the second tank 20, and the liquid (first concentrated liquid) in the second tank 20 is pressurized and passed through the inside of the hollow fiber membrane 30 for filtration.
  • gas nitrogen gas in this example
  • the entire process of filtering the liquid in the second tank 20 with the hollow fiber membrane 30 and sending it to the first tank 10 is referred to as the second filtration step.
  • the filtered permeate is stored in a permeate tank, and the concentrate (second concentrate) containing the minute useful substances is sent to the first tank 10.
  • the first tank 10 and the second tank 20 are cylindrical in shape, but are not limited to this, and the shape and volume can be determined depending on the conditions of the installation location and the processing amount.
  • the first tank 10 and the second tank 20 are preferably transparent so that the liquid level inside can be visually observed.
  • the material of the first tank 10 and the second tank 20 is not limited, and may be, for example, glass, metal or alloy, resin (e.g., acrylic resin such as polyacrylonitrile or polyacrylic ester; polycarbonate; fluororesin, etc.), etc.
  • the first tank 10 and the second tank 20 preferably have the same shape and the same volume.
  • the first tank 10 and the second tank 20 may be disposed at the same height with a gap therebetween.
  • the membrane surface velocity in the second filtration step is preferably set to the same range as the membrane surface velocity in the first filtration step.
  • the inlet pressure of the hollow fiber membrane 30 (on the liquid inlet/outlet side of the second tank 20) in the second filtration step is preferably adjusted to 0.01 MPa to 0.2 MPa, more preferably 0.015 MPa to 0.15 MPa, and even more preferably 0.02 MPa to 0.12 MPa.
  • the outlet pressure of the hollow fiber membrane 30 (on the liquid inlet/outlet side of the first tank 10) in the second filtration step is preferably adjusted to 0.03 MPa or less, more preferably 0.01 MPa or less, and even more preferably 0 MPa.
  • the liquid containing the minute useful substance can be concentrated by repeating the first filtration step and the second filtration step multiple times.
  • the dilution factor of the target solution in the first tank 10 of the first filtration step with the buffer solution i.e., the dilution factor of the target solution in the first filtration step
  • the dilution factor of the target solution in the first filtration step can be increased, for example, in the range of 2 to 15 times by volume, and preferably in the range of 2 to 10 times by volume. In this way, by alternately performing the first filtration step and the second filtration step, a concentrated solution having an increased concentration of useful micro substances can be obtained.
  • the concentration step is preferably carried out so that the concentration of useful micro substances in the resulting concentrated liquid is 5 times or more, more preferably 7 times or more, and even more preferably 10 times or more, compared to the concentration of the secondary liquid raw material.
  • the recovery rate of useful micro substances is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, and even more preferably 70% or more.
  • the amount of minute useful substances can be measured using an ELISA kit (for example, CD9-Capture human exosome ELISA kit (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)).
  • the amount can be measured using the ExoScreen method described in Cytometry Research 26(1):1-6, 2016, “New Developments in Liquid Biopsy Using Exosomes,” by Yusuke Yoshioka and Takahiro Ochiya.
  • a method for concentrating a liquid feedstock containing useful micro-substances includes adding an oxyethylene adduct of a sorbitan unsaturated fatty acid ester to a primary liquid feedstock containing useful micro-substances to obtain a secondary liquid feedstock, and applying the secondary liquid feedstock to a hollow fiber membrane.
  • the process of obtaining the secondary liquid raw material and the process of applying the secondary liquid raw material to the hollow fiber membrane in this embodiment are the same as those in the embodiment of the method for producing a concentrated liquid containing useful minute substances, and therefore the description thereof will be omitted.
  • the primary liquid source was prepared by adding 2 ⁇ l of exosome solution (20 ng of exosomes) to 150 ml of TBS. Next, polyoxyethylene sorbitan oleate was added to the primary liquid source to a concentration of 100 ppm to obtain a secondary liquid source. Concentration of the secondary liquid feed was carried out at room temperature (about 20° C.) using the apparatus 1 shown in FIG.
  • First tank 10 and second tank 20 Material: Glass Length: 25cm Inner diameter: 3cm Capacity: 180cm3 Concentrated liquid recovery tank 35 Capacity: 50cm3 Hollow fiber membrane 30 Inner diameter: 0.8 mm Outer diameter: 1.3mm Length: 60cm Membrane area: 15cm2 Molecular weight cutoff: 150,000 Material: Cellulose acetate (CA) manufactured by Daisen Membrane Systems Co., Ltd.
  • CA Cellulose acetate
  • the amount of exosomes in the final concentrate was measured using a CD9-Capture human exosome ELISA kit (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation), and the exosome recovery rate was 73%.
  • the exosome concentration in the secondary liquid raw material was 133 pg/ml, and the exosome concentration in the final concentrate was 1293 pg/ml, indicating that the exosome concentration in the final concentrate (concentration factor) was 9.7 times higher than the exosome concentration in the secondary liquid raw material.
  • Example 1 Alternating tangential flow filtration was performed in the same manner as in Example 1, in which the first filtration step and the second filtration step were repeated multiple times, except that polyoxyethylene sorbitan oleate was not added, to obtain approximately 10 mL of a final concentrate, and the recovery rate and concentration ratio were determined.
  • Example 2-5 Alternating tangential flow filtration was performed in the same manner as in Example 1, in which the first filtration step and the second filtration step were repeated multiple times, except that an additive shown in Table 1 was added instead of polyoxyethylene sorbitan oleate, to obtain approximately 10 mL of a final concentrate, and the recovery rate and concentration ratio were determined.
  • polyoxyethylene sorbitan oleate not only achieved a higher recovery rate and concentration factor than when no additive was added or when bovine serum albumin was added, but also achieved a higher recovery rate and concentration factor than when polyoxyethylene sorbitan laurate, polyoxyethylene sorbitan stearate, or polyoxyethylene sorbitan palmitate, which have similar structures, were added.
  • the manufacturing method disclosed herein can be used to produce a concentrated solution containing minute useful substances.

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Abstract

微小有用物質の濃縮液を製造する方法を提供する。　微小有用物質を含む濃縮液を製造する方法であって、微小有用物質を含む一次液体原料に、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加して二次液体原料を得ること、及び前記二次液体原料を中空糸膜に適用し、前記二次液体原料を濃縮することを含む、微小有用物質を含む濃縮液の製造方法とする。

Description

微小有用物質を含む濃縮液の製造方法
　本開示は、微小有用物質を含む濃縮液の製造方法に関する。
　細胞外小胞などの微小有用物質を濃縮する方法としては、例えば、分離膜を用いた方法が知られている。
　特許文献１には、細胞の培養槽から培養液を排出し、排出した培養液と同量の新鮮培地を前記培養槽に加えるブリーディング工程と、前記培養槽から抽出した培養液を、実質的に緻密層を有しない多孔膜を用いてろ過するろ過工程とを含み、前記ろ過工程におけるろ過がタンジェンシャルフローろ過であり、前記ろ過工程における透過液の速度が１．０ＬＭＨ以下である、有用物質を回収する方法が記載されている。特許文献１には、前記微小有用物質が、タンパク質、ウィルス、エクソソーム、及び核酸からなる群から選択されてもよいことが記載されている。
　また、特許文献２には、細胞外小胞の１種であるエクソソームを効率的かつ大量に採取可能なエクソソーム抽出装置及びエクソソーム抽出方法が記載されている。特許文献２に記載のエクソソーム抽出装置は、原液供給部から供給されたエクソソームを含む液体を、それぞれ役割の異なる、第１フィルター及び第２フィルターでろ過し、液体中のエクソソームを濃縮している。
特開２０１８－７６２９１号公報 特開２０２１－１４５６４９号公報
　一般に、液体原料中の微小有用物質の濃度は高くないことが多い。そのため、微小有用物質を高濃度で含む液（微小有用物質の濃縮液）が求められている。
　本開示は上記事情に鑑みてなされたものであり、微小有用物質の濃縮液を効果的に製造する方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本開示では以下の手段を採用できる。
［１］微小有用物質を含む濃縮液を製造する方法であって、微小有用物質を含む一次液体原料に、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加して二次液体原料を得ること、及び前記二次液体原料を中空糸膜に適用し、前記二次液体原料を濃縮することを含む、微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
［２］微小有用物質を含む液体原料を濃縮する方法であって、微小有用物質を含む一次液体原料に、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加して二次液体原料を得ること、及び前記二次液体原料を中空糸膜に適用することを含む、微小有用物質を含む液体原料の濃縮方法。
　本開示によれば、微小有用物質を含む濃縮液を効果的に製造する方法を提供できる。
本開示の製造方法に用いた装置の一例を示す概略構成図である。
　以下、図面を用いて本開示の一例を説明するが、各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本開示の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。本明細書に開示された各々の態様は、本明細書に開示された他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。また、特定のパラメータについて、複数の上限値及び下限値が記載されている場合、これらの上限値及び下限値の内、任意の上限値と下限値とを組合せて好適な数値範囲とすることができる。また、本開示に記載されている数値範囲の下限値及び／又は上限値は、その数値範囲内の数値であって、実施例で示されている数値に置き換えてもよい。本明細書において数値範囲を示す「Ｘ～Ｙ」との表現は、「Ｘ以上Ｙ以下」であることを意味している。
［微小有用物質を含む濃縮液を製造する方法］
　本開示の一実施形態に係る微小有用物質を含む濃縮液を製造する方法は、微小有用物質を含む一次液体原料に、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加して二次液体原料を得ること、及び前記二次液体原料を中空糸膜に適用し、前記二次液体原料を濃縮することを含む。微小有用物質を含む一次液体原料にソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加した二次液体原料を中空糸膜で濃縮することにより、微小有用物質の回収効率（濃度）が向上しやすい。それにより、微小有用物質を含む濃縮液を効果的に製造することができる。そのメカニズムは現段階では明らかではないが、非限定的なメカニズムとして、液中での微小有用物質の構造安定化への寄与が考えられる。
　微小有用物質を含む濃縮液とは、液体原料よりも微小有用物質の濃度が高められた液体を意味する。濃縮液中の微小有用物質の濃度としては、液体原料中の微小有用物質の濃度によるが、０．１～５００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、０．５～２００ｎｇ／ｍｌであることがより好ましく、１～１００ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
　以下に、各用語について詳述する。各工程の詳細については後述する。
（微小有用物質）
　微小有用物質とは、核酸（マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡなど）、タンパク質、脂質及び／又は各種代謝産物などを含む微小な物質を意味する。微小有用物質の直径は、１０～１０００ｎｍであることが好ましく、１５～５００ｎｍであることがより好ましく、２０～２００ｎｍであることがさらに好ましい。一実施形態において、微小有用物質は、脂質二重膜で覆われた粒子であることが好ましく、脂質二重膜で覆われた粒子としては、細胞外小胞が挙げられる。細胞外小胞とは、細胞外に放出される脂質二重層で覆われた核をもたない粒子を総称しており、核酸、タンパク質、脂質、代謝産物などを含み、エクソソーム、マイクロベシクル及びアポトーシス小胞などが該当する。
（一次液体原料）
　一次液体原料としては、微小有用物質を含む液であれば特に限定されないが、例えば細胞の培養液や分散液等を採用できる。また、一次液体原料中の微小有用物質の濃度は特に限定されない。培養液は、細胞の培養上清液が好ましく、間葉系幹細胞の培養上清液がより好ましい。細胞外小胞を含む間葉系幹細胞としては、骨髄、血液、脂肪、臍帯、臍帯血、骨膜、軟骨膜など、及び他の体細胞組織などの様々な起源に由来するものを用いることができる。その培養方法については、例えば特開２０１１－６７１７５号公報、特開２００３－５２３６０号公報に記載されている。
（二次液体原料）
　二次液体原料は、微小有用物質及びソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を含む。二次液体原料中の微小有用物質の濃度は特に限定されない。
　一実施形態において、二次液体原料は、希釈のために、純水；水道水、地下水、又は河川水等の濾過水；種々の水溶液等を含んでもよい。微小有用物質がエクソソームである場合には、生理食塩水、医療用又は生化学用の緩衝液を用いることが好ましい。前記緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝液（ＴＢＳ）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を使用することができる。
（ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物）
　ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物としては、ソルビタンと一価又は多価不飽和脂肪酸とのエステルのオキシエチレン付加物が挙げられる。一価又は多価不飽和脂肪酸としては、炭素数が１０～３０（好ましくは１２～２８、より好ましくは１３～２７、さらに好ましくは１５～２５、特に好ましくは１８～２２）の不飽和脂肪酸が挙げられる。ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物の具体例としては、例えば、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、リノレン酸ポリオキシエチレンソルビタン、アラキドン酸ポリオキシエチレンソルビタン、イコサペンタエン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ドコサヘキサエン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどが挙げられる。中でも、一価不飽和脂肪酸とソルビタンとのエステルのオキシエチレン付加物であることが好ましく、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであることがより好ましい。
　二次液体原料中のソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物の濃度は、１～１０００ｐｐｍが好ましく、１０～５００ｐｐｍがより好ましく、５０～２５０ｐｐｍがさらに好ましい。
（中空糸膜）
　中空糸膜の材質は、本開示の使用目的や微小有用物質を含む液の性質等に応じて、適宜、設計することができる。
　具体的には、ポリビニルデンフロライド（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ポリオレフィン（ＰＥ、ＰＰ、ＰＴＦＥ等）、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、セルロースアセテート（ＣＡ）等の有機ポリマー系材料及びそれらの変性体を適用できる。このうち、微小有用物質が、エクソソーム等の生体分子である場合は、セルロースアセテート（ＣＡ）製の中空糸膜を使用することが好ましい。ＣＡ製の中空糸膜（以下、「ＣＡ膜」と記載することもある）を使用することで、濃縮処理時のろ過速度の低下を抑え、かつ中空糸膜の膜表面に堆積した微小有用物質の回収効果をより向上させることができる。その理由として、生体分子の表面電荷が弱い負電荷であり、ＣＡ膜も弱い負電荷であるため、生体分子とＣＡ膜とが強いクーロン力で引き合うことが無く、循環線速度を適正に制御することによってクロスフローろ過のせん断力が機能しやすいこと等が挙げられる。また、ＣＡ膜を用いることにより、後述の方法で中空糸膜の膜表面に堆積した微小有用物質をより効率的に回収できる。
　中空糸膜の平均内径は、本開示の使用目的や微小有用物質を含む液の性質等に応じて、適時設計することができる。一実施形態において、０．２ｍｍ～１．４ｍｍの平均内径を有する中空糸膜を採用できる。なお、本開示における「中空糸膜の平均内径」は、１本の中空糸膜を長手方向に対して垂直な任意の面で切断し、その切断面の中空部と内接する最少の円の直径より算出した値である。本開示では、上記の切断面における任意の１０箇所以上１００箇所以下の前記直径を測定し、その平均値を「平均内径」とする。
　一実施形態において、中空糸膜は、平均外径が０．３ｍｍ～２．０ｍｍであってもよい。一実施形態において、中空糸膜の平均内径が０．２ｍｍ～１．０ｍｍである場合の平均外径は、０．３ｍｍ～１．４ｍｍであってもよい。またその他の実施形態において、中空糸膜の平均内径が１．０ｍｍ～１．４ｍｍである場合の平均外径は、１．５ｍｍ～２．０ｍｍであってもよい。なお、「中空糸膜の平均外径」は、前述の中空糸膜の平均内径と同じ方法で切断した中空糸膜において、その切断面の外縁を内包する最小の円の直径より算出した値である。本開示では、上記の切断面における任意の１０箇所以上１００箇所以下の前記直径を測定し、その平均値を「平均外径」とする。
　本実施形態の使用目的において、中空糸膜が柔軟になりすぎない膜厚を確保しやすく、かつ中空糸膜の膜表面に堆積した微小有用物質の回収効率が向上しやすい観点からは、中空糸膜の平均内径は０．６ｍｍ～１．４ｍｍであってもよい。
　さらに、微小有用物質を含む液の運転時の液粘度によって前記平均内径を調整してもよい。液粘度が高い場合（例えば、液温２０℃、せん断速度２５ｓ－１における液粘度が、１０～３０ｍＰａ・ｓである場合）は、平均内径が１．０ｍｍ～１．４ｍｍの太径中空糸膜を用いることが好ましい。また、微小有用物質を含む液の運転時の液粘度が低い場合（例えば、液温２０℃、せん断速度２５ｓ－１における液粘度が、１０ｍＰａ・ｓ未満である場合）は、平均内径が０．６ｍｍ～１．０ｍｍの中空糸膜を用いることが好ましい。なお、中空糸膜の平均内径が大きくなると、前記中空糸膜を中空糸膜モジュールとして用いる場合に、有効膜面積が低下しやすくなる。よって、中空糸膜モジュールとした場合の有効膜面積の低下を抑制しやすい観点からは、平均内径が０．２ｍｍ～１．０ｍｍの中空糸膜を用いることが好ましい。
　中空糸膜の分画分子量は、使用目的や、微小有用物質を含む液体原料の性質等に応じて、適時設計することができる。一実施形態において、前記分画分子量は５，０００～３００万であってもよく、１万～１００万であってもよい。微小有用物質よりも少し低い分画分子量の中空糸膜（例えば、微小有用物質の分子量よりも１０～５０％程度低い分画分子量を有する中空糸膜等）を用いることが好ましい。一実施形態において、微小有用物質がエクソソームである場合、中空糸膜の分画分子量は５万～１００万であることが好ましく、７万～８０万であることがより好ましく、１０万～５０万であることがさらに好ましい。
　分画分子量は、リン酸緩衝液中のγグロブリン（ＳＩＧＭＡ製牛血清γグロブリン、分子量１５万）１００ｍｇ／Ｌの溶液を中空糸膜３０にろ過圧力０．１ＭＰａでクロスフロー透過（膜面速度：０．２ｍ／ｓ）させた場合のγグロブリンの透過率％（（透過液中のγグロブリン濃度／溶液中のγグロブリン濃度（１００ｍｇ／Ｌ）×１００）によって評価することができる。中空糸膜３０は、γグロブリンの透過率が５％～９５％であることが好ましく、１０～８０％がより好ましく、１０～７０％がさらに好ましい。
　中空糸膜３０としては、ダイセン・メンブレン・システムズ（株）のＦＵＳ５０８２（ポリエーテルスルホン膜；分画分子量５０万、γグロブリン透過率７０％）、ダイセン・メンブレン・システムズ（株）のＦＵＣ１５８２（酢酸セルロース膜；分画分子量１５万、γグロブリン透過率１０％）などを使用することができる。
（中空糸膜モジュール）
　一実施形態において、中空糸膜は、複数の液出入口を有するケースハウジング内に複数本の中空糸膜が収容されている中空糸膜モジュールであってもよい。
　中空糸膜モジュールに用いる中空糸膜の本数は、特に限定されない。本開示の使用目的及び濃縮される微小有用物質の重量等に応じて、適宜、必要な有効膜面積が得られるようモジュール内に組み入れる本数を設計することができる。
　中空糸膜は接着剤等で束ねられて前記容器内に収納されることが好ましい。本開示において、微小有用物質を含む液が中空糸膜モジュールの第１の液の出入口及び／又は第２の液の出入口から供給されると、容器内の中空糸膜束の一方側（中空糸膜束の内側又は外側）へ液が流れ込んで、中空糸膜束で濃縮される。中空糸膜束を透過した透過液は中空糸膜束の他方側（中空糸膜束の外側又は内側）へ流れ出て、第３の液の出入口から排出される。この時、透過されることなく中空糸膜束の内側又は外側に滞留した濃縮液は、第１の液の出入口及び／又は第２の液の出入口から中空糸膜モジュール外へ排出（回収）することができる。
　本開示の中空糸膜モジュールのγ－グロブリン透過率は、微小有用物質が細胞外小胞である場合は、濃縮の効率性の観点から、５～９０％が好ましく、１０～８０％がより好ましい。
　本開示の中空糸膜モジュールにおける充填率は、５～５５％が好ましく、２０～５５％がより好ましく、２５～５５％が更に好ましい。前記充填率とは、中空糸膜モジュールの、一般的には筒状容器の短手方向の断面積に占める、中空糸膜束の外径部の断面積の総和の百分率を指す。前記充填率が５～５５％であれば、中空糸膜モジュールの大きさを最適化しつつ、中空糸膜の膜表面に堆積した微小有用物質をより効率的に回収できる。
　以下に、本実施形態の製造方法における各工程について簡単に説明する。
（一次液体原料の準備工程）
　まず、微小有用物質を含む一次液体原料を準備する。
（二次液体原料の準備工程）
　二次液体原料の準備工程では、微小有用物質を含む一次液体原料に、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加する。ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加するタイミングは特に限定されず、液体原料が中空糸膜内に送液される前に一次液体原料に添加して二次液体原料としてもよく、中空糸膜内で一次液体原料とソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物とが混合するように添加してもよい。後者の場合、例えば、中空糸膜における一次液体原料の入口とは別の入口からソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加して、中空糸膜内で一次液体原料とソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物とを混合し、二次液体原料が得られるようすることが含まれる。さらに、後者の場合は、一次液体原料を中空糸膜に送液し始めるタイミングと、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加するタイミングとは同じであってもよく、異なっていてもよい。添加方法は、限定されず、例えば室温（例えば２５℃）において、一次液体原料を攪拌させながら添加してもよい。
　ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物の一次液体原料への添加量は、二次液体原料中のソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物の濃度が１～１０００ｐｐｍ、１０～５００ｐｐｍ、又は５０～２５０ｐｐｍとなるように適宜調節することができる。
（二次液体原料の濃縮工程）
　二次液体原料の濃縮工程では、二次液体原料を中空糸膜に適用し、二次液体原料を濃縮する。
　二次液体原料を中空糸膜に適用するとは、二次液体原料を中空糸膜の内側の少なくとも一部を通過させることを意味し、一実施形態においては一端側から他端側方向に送液することを意味する。濃縮するとは、対象の液体中の特定の物質の濃度を、より高い濃度とすることを意味する。二次液体原料の濃縮工程においては、二次液体原料中の微小有用物質の濃度をより高い濃度とすることを意味する。ここで、二次液体原料を中空糸膜に適用した際に、中空糸膜を透過した液を「透過液」と記載し、中空糸膜を透過せず中空糸膜に滞留した液を「濃縮液」と記載する。
　以下に、本開示の一実施形態にかかる二次液体原料の濃縮工程について図１を用いて説明する。図１に示す濃縮装置は、第１タンク１０及び第２タンク２０と、中空糸膜３０とを備える。この例において、中空糸膜３０には、三方活栓４０を介して、濃縮液（最終濃縮液）を回収する濃縮液回収タンク３５が接続されている。
（第１ろ過工程）
　まず、第１タンク１０内に、予め準備した二次液体原料を入れる。図示していないポンプなどを作動させ（例えば、図示していない送液ポンプを用いたり、図示していないガス供給源からガス（窒素（Ｎ２）ガス等）を第１タンク１０内に供給することで）、第１タンク１０内に貯蔵された二次液体原料を中空糸膜３０の内側に圧入する。このとき、微小有用物質は中空糸膜３０を透過せずにろ過され、二次液体原料が濃縮される。このようにして、第１ろ過工程を実施することができる。なお、本実施形態では、第１タンク１０内の液体を中空糸膜３０でろ過して第２タンク２０に送る工程を全て第１ろ過工程という。
　加圧のためのガスとしては、窒素ガス、アルゴン、ヘリウムなどの不活性ガス、二酸化炭素、ＨＥＰＡフィルターなどでろ過された清浄な空気などから選ばれるガスを使用することができる。中空糸膜３０を透過した透過液は系外に排出され、濃縮液（第１濃縮液）は第２タンク２０に送られる。第２タンク２０内に第１濃縮液が入った状態では、第２タンク２０の上部には第１濃縮液が存在していない空間が残っている。
　図１に示す例では、中空糸膜３０は、第１タンク１０の液体出入口と第２タンク２０の接続部にある液体出入口を接続して配置されている。中空糸膜３０と第１タンク１０の液体出入口との接続は、例えば、第１タンク１０の液体出入口側に固定された注射針のような細管に中空糸膜３０の開口端部を嵌め込むことで行うことができる。中空糸膜３０と第２タンク２０の液体出入口との接続も同様に実施することができる。
　図１では、中空糸膜３０は１本が示されているが、複数本でもよく、例えば２～１５０本からなる中空糸膜束として使用することができる。また、複数本の中空糸膜３０（中空糸膜束）が、複数の液出入口を有するケースハウジング中に収容された中空糸膜モジュールを使用してもよい。前記中空糸膜束として使用するときは、一端部又は両端部を接着剤で一体化することができる。前記中空糸膜モジュールを使用する場合には、中空糸膜モジュールの複数の液出入口と第１タンク１０の液体出入口と第２タンク２０の液体出入口を接続し、さらに中空糸膜モジュールの液透過出口と透過液タンクを接続することができる。
　第１ろ過工程は、膜面速度が０．３ｍ／ｓｅｃ～４．０ｍ／ｓｅｃの範囲でろ過することが好ましく、膜面速度が０．５ｍ／ｓｅｃ～３．５ｍ／ｓｅｃの範囲でろ過することがより好ましい。膜面速度が０．３ｍ／ｓｅｃを下回ると精製効率が低下し、逆に４ｍ／ｓｅｃを上回ると、膜面速度を上昇させるための圧力レベルが高くなりすぎてしまい、ろ過時において微小有用物質に対して加えられる剪断力も高くなりすぎる結果、微小有用物質を変質させるおそれがある。前記膜面速度を前記範囲内に維持する方法は、中空糸膜３０の入口圧力（第１タンク１０の液体出入口１０ａ側）の圧力を０．０１ＭＰａ～０．２ＭＰａに調整することが好ましく、０．０１５ＭＰａ～０．１５ＭＰａに調整することがより好ましく、０．０２ＭＰａ～０．１２ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
（第２ろ過工程）
　第２ろ過工程では、図示していないポンプなどを作動させ、図示していないガス供給源からガス（この例では窒素ガス）を第２タンク２０内に供給し、第２タンク２０内の液体（第１濃縮液）を加圧して、中空糸膜３０の内側に通してろ過することができる。なお、本実施形態では、第２タンク２０内の液体を中空糸膜３０でろ過して第１タンク１０に送る工程を全て第２ろ過工程という。
　ろ過した透過液は透過液タンクに貯め、微小有用物質を含む濃縮液（第２濃縮液）は第１タンク１０に送られる。
　第１タンク１０と第２タンク２０は、図１ではシリンダー形状であるが、これに限定されるものではなく、形状及び容積は設置場所の状況や処理量に応じて決定することができる。第１タンク１０と第２タンク２０は、目視で内部の液面が観察できる透明性を有しているものが好ましい。
　第１タンク１０と第２タンク２０の材質は、限定されず、例えば、ガラス、金属又は合金、樹脂（例えば、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸エステルなどのアクリル系樹脂；ポリカーボネート；フッ素樹脂等）等であってよい。
　第１タンク１０と第２タンク２０は、同一形状で、同一容積であることが好ましい。第１タンク１０と第２タンク２０は、それぞれが間隔をおいて、同じ高さ位置になるように配置されることができる。
　第２ろ過工程における膜面速度は第１ろ過工程場合の膜面速度と同じ範囲にすることが好ましい。前記膜面速度を前記範囲内に維持するために、第２ろ過工程における中空糸膜３０の入口圧力（第２タンク２０の液体出入口側）は、０．０１ＭＰａ～０．２ＭＰａに調整することが好ましく、０．０１５ＭＰａ～０．１５ＭＰａに調整することがより好ましく、０．０２ＭＰａ～０．１２ＭＰａに調整することがさらに好ましい。前記膜面速度を前記範囲内に維持するために、第２ろ過工程における中空糸膜３０の出口圧力（第１タンク１０の液体出入口側）の圧力は、０．０３ＭＰａ以下に調整することが好ましく、０．０１ＭＰａ以下に調整することがより好ましく、０ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
　その後、第１ろ過工程及び第２ろ過工程を複数回繰り返すことで微小有用物質を含む液体を濃縮することができる。第１ろ過工程及び第２ろ過工程を複数回繰り返すときは、繰り返し回数が増加するにつれて、第１ろ過工程の第１タンク１０におけるろ過対象の緩衝液による希釈倍数（即ち、第１ろ過工程のろ過対象の希釈倍数）を、例えば、２容量倍～１５容量倍の範囲で増加させることができ、好ましくは２容量倍～１０容量倍の範囲で増加させることができる。
　このように第１ろ過工程と第２ろ過工程を交互に実施する交互タンジェンシャルフローろ過により、微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得ることができる。
　得られる濃縮液中の微小有用物質の濃度は、二次液体原料の濃度と比較して５倍以上になるように濃縮工程を実施することが好ましく、７倍以上になるように実施することがより好ましく、１０倍以上になるように実施することがさらに好ましい。微小有用物質の回収率は、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましい。
　微小有用物質の量は、エライザ法を用いたキット（例えば、ＣＤ９－Ｃａｐｔｕｒｅ　ヒトエクソソームＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（富士フイルム和光純薬株式会社製））を用いて測定することができる。また、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２６（１）：１～６，２０１６，「Ｅｘｏｓｏｍｅによるリキッドバイオプシーの新展開」，吉岡祐亮，落谷孝広に記載のＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法を用いて測定することができる。
［微小有用物質を含む液体原料を濃縮する方法］
　本開示の一実施形態にかかる微小有用物質を含む液体原料を濃縮する方法は、微小有用物質を含む一次液体原料に、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加して二次液体原料を得ること、及び前記二次液体原料を中空糸膜に適用することを含む。
　本実施形態にかかる二次液体原料を得る工程及び二次液体原料を中空糸膜に適用する工程は、上記微小有用物質を含む濃縮液の製造方法の実施形態と同様であり、その説明を省略する。
　以下に実施例を示して本開示を更に具体的に説明するが、これらの実施例により本開示の解釈が限定されるものではない。
　実施例等で用いた各種原料及びその製造方法は以下の通りである。
（一次液体原料）
・トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ニッポンジーン社製）
・エクソソーム溶液「ＣＯＬＯ２０１細胞由来エクソソーム」（エクソソーム濃度：１０μｇ／ｍＬ）（富士フイルム和光純薬株式会社製）
（二次液体原料）
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン「ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート」（富士フイルム和光純薬株式会社製）
・ウシ血清アルブミン（富士フイルム和光純薬株式会社製）
・ラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン「ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート」（富士フイルム和光純薬株式会社製）
・ステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン「ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート」（富士フイルム和光純薬株式会社製）
・パルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン「ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート」（富士フイルム和光純薬株式会社製）
［実施例１］
　一次液体原料として、ＴＢＳ１５０ｍｌに、エクソソーム溶液２μｌ（エクソソーム：２０ｎｇ）を添加したものを準備した。次いで、一次液体原料に、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを１００ｐｐｍとなるように添加し、二次液体原料を得た。
　二次液体原料の濃縮は、図１に示す装置１を使用して室温（約２０℃）で実施した。
・第１タンク１０及び第２タンク２０
　　材質：ガラス
　　長さ：２５ｃｍ
　　内径：３ｃｍ
　　容量：１８０ｃｍ３
・濃縮液回収タンク３５
　　容量：５０ｃｍ３
・中空糸膜３０
　　内径：０．８ｍｍ
　　外径：１．３ｍｍ
　　長さ：６０ｃｍ
　　膜面積：１５ｃｍ２
　　分画分子量：１５万
　　材質：酢酸セルロース（ＣＡ）製
　　ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社製
（第１ろ過工程）
（１）二次液体原料１５０ｍｌを第１タンク１０内に充填した。
（２）第１タンクの上部空間に窒素ガスを圧力０．０２５ＭＰａで供給し、中空糸膜３０の内側に二次液体原料を通過させつつタンジェンシャルフローろ過を行った。この際、中空糸膜３０の内側を流れる膜面速すなわち膜面速度は３．３ｍ／ｓであった。膜面速度は、第２タンクでの濃縮液量の増加速度から算出した。
　透過液は中空糸膜を透過し系外に排出され、濃縮液（第１濃縮液）は第２タンク内に移行させた。
（第２ろ過工程）
（３）第１タンク１０の二次液体原料が中空糸膜３０の内側を通過してろ過され、大部分が第２タンク２０に移行したとき、窒素ガスを第２タンク２０に供給し、同時に第１タンクの圧力を開放した。
（４）この操作によって、第１濃縮液を第２タンク２０から第１タンク１０に移行させながらろ過を行い、透過液は中空糸膜を透過し系外に排出され、濃縮液（第２濃縮液）は第１タンク１０内に移行させた。
　同様の第１ろ過工程と第２ろ過工程を複数回繰り返す交互タンジェンシャルフローろ過を行った。交互タンジェンシャルフローろ過は、液量が約１０ｍｌになるまで行い、エクソソーム濃度が高められた濃縮液（最終濃縮液）を濃縮液回収タンク３５に排出し回収した。
　ＣＤ９－Ｃａｐｔｕｒｅ　ヒトエクソソームＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（富士フイルム和光純薬株式会社製）を用いて最終濃縮液中のエクソソーム量を測定したところ、エクソソームの回収率は７３％であった。二次液体原料中のエクソソーム濃度は１３３ｐｇ／ｍｌであり、最終濃縮液中のエクソソーム濃度は１２９３ｐｇ／ｍｌであったことから、二次液体原料におけるエクソソーム濃度に対する最終濃縮液のエクソソーム濃度（濃縮倍率）は、９．７倍となったことが分かった。
［比較例１］
　オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを添加しなかった以外は、実施例１と同様に、第１ろ過工程と第２ろ過工程を複数回繰り返す交互タンジェンシャルフローろ過を行い、最終濃縮液約１０ｍＬを得て、回収率及び濃縮倍率を求めた。
［比較例２－５］
　オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンに替えて表１に記載の添加剤を添加した以外は、実施例１と同様に、第１ろ過工程と第２ろ過工程を複数回繰り返す交互タンジェンシャルフローろ過を行い、最終濃縮液約１０ｍＬを得て、回収率及び濃縮倍率を求めた。
　結果を表１に示す。
　上記に示されるように、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを添加することで、添加剤を加えない場合やウシ血清アルブミンを添加した場合より高い回収率及び濃縮倍率が達成されただけでなく、類似の構造を持つラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、又はパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンを添加した場合と比較しても、より高い回収率及び濃縮倍率が達成された。
　本開示の製造方法は、微小有用物質を含む濃縮液を製造するときに利用することができる。
１　　濃縮装置
１０　第１タンク
２０　第２タンク
３０　中空糸膜
３５　濃縮液回収タンク
４０　三方活栓

Claims (12)

  1. 　微小有用物質を含む濃縮液を製造する方法であって、
    　微小有用物質を含む一次液体原料に、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加して二次液体原料を得ること、及び
    　前記二次液体原料を中空糸膜に適用し、前記二次液体原料を濃縮することを含む、微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  2. 　前記二次液体原料を濃縮することが、中空糸膜を用いたろ過を含み、
    　前記ろ過が一方向又は交互方向のタンジェンシャルフローろ過である、請求項１に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  3. 　前記タンジェンシャルフローろ過が、
    　前記二次液体原料を前記中空糸膜の一端側の第１開口部から圧入してろ過し、透過液と第１濃縮液に分離する第１ろ過工程と、
    　前記第１濃縮液を前記中空糸膜の他端側の第２開口部から圧入してろ過し、透過液と第２濃縮液に分離する第２ろ過工程と、を有しており、
    　前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程とを交互に複数回実施することを含む、請求項２に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  4. 　前記第１ろ過工程及び前記第２ろ過工程が、窒素ガス、不活性ガス、二酸化炭素、及びＨＥＰＡフィルターでろ過された空気から選ばれる１以上のガスを導入することで圧入して実施されるものである、請求項３に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  5. 　前記中空糸膜が、内径が０．２ｍｍ～１．４ｍｍ、分画分子量が５０００～３００万のものである、請求項３に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  6. 　前記ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物が、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  7. 　微小有用物質が、脂質二重膜で覆われた粒子を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  8. 　脂質二重膜で覆われた粒子が、細胞外小胞である、請求項７に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  9. 　前記中空糸膜が、複数の液出入口を有するケースハウジング内に複数本の中空糸膜が収容されている中空糸膜モジュールである、請求項１から５のいずれか一項に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  10. 　前記一次液体原料が、細胞の培養上清液を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  11. 　前記一次液体原料が、間葉系幹細胞の培養上清液を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の微小有用物質を含む濃縮液の製造方法。
  12. 　微小有用物質を含む液体原料を濃縮する方法であって、
    　微小有用物質を含む一次液体原料に、ソルビタン不飽和脂肪酸エステルのオキシエチレン付加物を添加して二次液体原料を準備すること、及び
    　前記二次液体原料を中空糸膜に適用することを含む、微小有用物質を含む液体原料の濃縮方法。
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