WO2026014267A1 - 遺伝子変異の検査方法及び検査装置 - Google Patents

遺伝子変異の検査方法及び検査装置

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WO2026014267A1
WO2026014267A1 PCT/JP2025/023181 JP2025023181W WO2026014267A1 WO 2026014267 A1 WO2026014267 A1 WO 2026014267A1 JP 2025023181 W JP2025023181 W JP 2025023181W WO 2026014267 A1 WO2026014267 A1 WO 2026014267A1
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nucleic acid
target nucleic
probe
detecting
target
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稔也 津田
光芳 大場
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Toyo Kohan Co Ltd
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Toyo Kohan Co Ltd
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a method and device for testing genetic mutations using nucleic acid probes used in DNA chips, etc.
  • SNVs single nucleotide variants
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a DNA chip also known as a DNA microarray.
  • a DNA chip has nucleic acid probes (a wild-type probe corresponding to the wild type and a mutant probe corresponding to the mutant type) that correspond to the genetic mutation being tested immobilized on a substrate.
  • genomic DNA collected from the subject as a template
  • a nucleic acid amplification reaction is carried out using a pair of primer sets that sandwich a region containing the genetic mutation being tested, yielding labeled nucleic acid fragments.
  • a solution containing the obtained nucleic acid fragments is brought into contact with the DNA chip under specified reaction conditions. If the solution contains nucleic acid fragments with genetic mutations, a signal from the mutant probe can be detected.
  • Genetic mutations are not limited to SNVs and SNPs; DNA chips with nucleic acid probes corresponding to sequences are also used for microsatellite, DNA methylation, and chimeric gene testing.
  • a system using a DNA chip it is possible to test whether or not the nucleic acid fragments at the end of nucleic acid amplification (endpoint) contain any of the genetic mutations being tested.
  • endpoint nucleic acid amplification
  • Patent Document 1 As a system for quantifying nucleic acids using a DNA chip, as disclosed in Patent Document 1, a system is known in which the signal intensity based on hybridization between a target nucleic acid and a probe is measured, and the signal intensity is compared with the signal intensity based on hybridization between a known amount of oligonucleotide and the probe, thereby correcting for the amount of target nucleic acid and quantifying it. Furthermore, Patent Document 2 discloses a method in which quantitative analysis or qualitative analysis by real-time PCR and qualitative analysis using a DNA chip are performed simultaneously in a single reaction system. However, these prior art technologies are techniques for quantifying the amount (copy number) of target nucleic acid present.
  • the present invention aims to provide a genetic mutation testing method and testing device that can quantitatively analyze the proportion of genetic mutations present in the target gene using nucleic acid probes.
  • the inventors conducted extensive research and discovered that when a nucleic acid fragment containing a genetic mutation to be tested is amplified by a nucleic acid amplification reaction, the nucleic acid amplification reaction can be confirmed to be in the exponential amplification phase by detecting the amplified product in the reaction solution, and then the nucleic acid fragment containing the genetic mutation contained in the reaction solution in the exponential amplification phase can be detected using a nucleic acid probe, thereby enabling quantitative analysis of the genetic mutation, leading to the completion of the present invention.
  • a method for testing for a genetic mutation comprising: a step of carrying out a nucleic acid amplification reaction to amplify a region containing a genetic mutation to be tested; a step of confirming that the nucleic acid amplification reaction is in the exponential amplification phase by detecting an amplification product in a reaction solution of the nucleic acid amplification reaction; a step of detecting a target nucleic acid containing a target base to be detected in the genetic mutation and a non-target nucleic acid containing a non-target base corresponding to the target base, which are contained in the reaction solution confirmed to be in the exponential amplification phase, using a nucleic acid probe for detecting a target nucleic acid having a sequence complementary to a region containing the target base to be detected in the target nucleic acid, a nucleic acid probe for detecting a non-target nucleic acid having a sequence complementary to a region containing the non-target nucleic acid having a sequence complementary to a region
  • a method for testing a genetic mutation according to (1) wherein there are a plurality of regions containing the genetic mutation to be tested, and for each of the regions, a step of carrying out the nucleic acid amplification reaction and a step of confirming that the nucleic acid amplification reaction is in the exponential amplification phase are carried out, and the target nucleic acid and non-target nucleic acid contained in the reaction solution for each of the regions confirmed to be in the exponential amplification phase are detected.
  • the amplification detection probe has a sequence complementary to a region in the target nucleic acid and the non-target nucleic acid that does not overlap with a region having a sequence complementary to the nucleic acid probe for detecting a target nucleic acid, the nucleic acid probe for detecting a non-target nucleic acid, and the common probe.
  • the abundance ratio of the target base in the gene mutation to be tested is calculated based on the signal intensity from the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid and the signal intensity from the nucleic acid probe for detecting the non-target nucleic acid or the common probe.
  • a genetic mutation testing device comprising: a nucleic acid amplification reaction detection unit that performs a nucleic acid amplification reaction to amplify a region containing a genetic mutation to be tested and confirms that the nucleic acid amplification reaction is in the exponential amplification phase by detecting an amplified product in a reaction solution in the nucleic acid amplification reaction; a detection unit that receives the reaction solution from the nucleic acid amplification reaction detection unit and detects at least the target nucleic acid using a nucleic acid probe for detecting a target nucleic acid having a sequence complementary to a region containing a target base in a target nucleic acid containing a target base to be detected in the genetic mutation, a nucleic acid probe for detecting a non-target nucleic acid having a sequence complementary to a region containing a non-target base in a non-target nucleic acid containing a non-target base corresponding to the target base to be detected, or a common probe having
  • the detection unit is a genetic mutation testing device described in (11), which includes a DNA chip mounting unit that mounts a DNA chip on which the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid and the nucleic acid probe for detecting the non-target nucleic acid or the common probe are fixed to a carrier.
  • the nucleic acid amplification reaction detection unit is provided with a plurality of reaction vessels for carrying out nucleic acid amplification reactions that amplify regions containing different genetic mutations to be tested, and the liquid delivery device includes a switching device that switches the flow path that supplies reaction liquid to the detection unit between the plurality of reaction vessels.
  • the genetic mutation testing device according to (11), wherein the detection unit detects target nucleic acids and non-target nucleic acids using the common probe.
  • the liquid delivery device is a genetic mutation testing device described in (11) that includes a flow path connecting the nucleic acid amplification reaction detection unit and the detection unit, a valve arranged on the flow path, and a pump device connected to the flow path.
  • the hybridization buffer solution contains a blocking nucleic acid that contains a base sequence complementary to the non-target nucleic acid that contains the non-detection target base.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention enable quantitative analysis of genetic mutations using nucleic acid probes corresponding to the genetic mutations. By applying the genetic mutation testing method and testing device of the present invention, it becomes possible to quantitatively analyze genetic mutations, such as the ratio of mutant to wild-type.
  • FIG. 1 is a configuration diagram schematically illustrating an example of a genetic mutation testing device according to the present invention. 1 is a flowchart showing steps for testing for a gene mutation using the device for testing for a gene mutation according to the present invention.
  • FIG. 1 is a configuration diagram schematically illustrating another example of the genetic mutation testing device according to the present invention.
  • FIG. 10 is a configuration diagram schematically illustrating yet another example of the genetic mutation testing device according to the present invention.
  • FIG. 2 is a characteristic diagram showing a calibration curve obtained using a PCR reaction solution for the V617F mutation of the JAK2 gene in Example 1.
  • FIG. 1 is a characteristic diagram showing a logarithmically transformed calibration curve obtained using a PCR reaction solution for the V617F mutation of the JAK2 gene in Example 1.
  • FIG. 1 is a characteristic diagram showing the relationship between the mutation rate quantified in Example 1 and the actually measured mutation rate.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing a calibration curve obtained using a PCR reaction solution for the V617F mutation of the JAK2 gene in Example 2.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing a logarithmically transformed calibration curve obtained using a PCR reaction solution for the V617F mutation of the JAK2 gene in Example 2.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the relationship between the mutation rate quantified in Example 2 and the actually measured mutation rate.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention quantitatively detect a target nucleic acid containing a genetic mutation to be tested using a nucleic acid probe.
  • the genetic mutation to be tested for is, for example, a single nucleotide variant (SNV) or single nucleotide polymorphism (SNP), which refers to a difference in a base at a specific position in genomic DNA.
  • SNV single nucleotide variant
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a specific genetic mutation will have multiple bases.
  • one of these bases will be referred to as the target base, and bases other than the target base will be referred to as non-target bases.
  • the target base to be detected refers to, for example, a specific nucleic acid residue at a specific position in genomic DNA, and is not particularly limited to, a specific type of base in a base sequence such as a single nucleotide polymorphism (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a specific single nucleotide polymorphism can take A (adenine) or C (cytosine)
  • either of the bases i.e., A (adenine) in the single nucleotide polymorphism
  • the target base to be detected may be either a major allele or a minor allele in a genetic polymorphism, and may or may not be a risk allele.
  • target nucleic acid refers to a nucleic acid molecule containing the base to be detected, i.e., a nucleic acid fragment.
  • the target nucleic acid may be a nucleic acid molecule made of DNA, a nucleic acid molecule made of RNA, a nucleic acid molecule containing DNA and RNA (DNA-RNA complex), or a fragmented molecule such as cell-free DNA.
  • DNA-RNA complex DNA and RNA
  • nucleic acid also refers to adenine, cytosine, guanine, thymine, and uracil, as well as artificial nucleic acids such as peptide nucleic acid (PNA) and locked nucleic acid (LNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • a target nucleic acid containing the target base can be prepared by amplifying a specific region of genomic DNA containing a gene mutation using a nucleic acid amplification method.
  • the target nucleic acid may also be cDNA obtained by reverse transcription from transcription products collected from individual organisms, tissues, or cells.
  • the base length of the target nucleic acid is not particularly limited, but can be, for example, 60 to 1,000 bases, preferably 60 to 500 bases, and more preferably 60 to 200 bases.
  • a nucleic acid molecule (nucleic acid fragment) containing a non-target base corresponding to the target base is referred to as a non-target nucleic acid.
  • a non-target nucleic acid a nucleic acid molecule (nucleic acid fragment) containing a non-target base corresponding to the target base.
  • bases other than the target base are non-target bases.
  • a single nucleotide polymorphism at a given position can take A (adenine) or C (cytosine), and A (adenine) in the single nucleotide polymorphism is the target base, then C (cytosine) in the single nucleotide polymorphism is the non-target base.
  • a nucleic acid fragment containing the mutant type can be used as the target nucleic acid, and a nucleic acid fragment containing a wild-type base (the forward or reverse strand of the major allele), which is not the base to be detected, can be used as the non-target nucleic acid.
  • the non-target nucleic acid containing the non-target base will be obtained simultaneously when the target nucleic acid containing the target base is obtained as described above.
  • the target nucleic acid is obtained by a nucleic acid amplification reaction such as a polymerase chain reaction, if one allele contains the non-target base, the non-target nucleic acid will be amplified along with the target nucleic acid.
  • a nucleic acid probe having a base sequence complementary to at least a region in the target nucleic acid that contains the target base is used.
  • the nucleic acid probe is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 bases long, and preferably 15 to 25 bases long.
  • the base complementary to the target base is preferably located at the center of the character string. Note that, for nucleic acid probes consisting of an even number of bases, the center of the character string includes cases where the base is shifted by one position toward the 5' end or 3' end.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention can use a common probe having a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and non-target nucleic acid.
  • the common region is a region of base sequence common to the target nucleic acid and non-target nucleic acid that does not contain the target base or non-target base.
  • the common region can be a region that does not overlap with the region to which the nucleic acid probe that detects the target nucleic acid hybridizes and the region to which the nucleic acid probe that detects the non-target nucleic acid hybridizes.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention can be applied to any system that includes hybridization, which refers to the complementary binding between nucleic acid molecules in a target nucleic acid and a nucleic acid probe.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention can be based on Southern hybridization, Northern hybridization, or in situ hybridization.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention are preferably used in a system in which a nucleic acid probe is immobilized on a carrier (including a substrate, hollow fiber, or microparticle), and the immobilized nucleic acid probe is used to detect (including qualitative and quantitative) the target nucleic acid.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention are preferably used in a system that uses a DNA chip (DNA microarray) in which nucleic acid probes are immobilized on a substrate.
  • the following describes an exemplary system in which the genetic mutation testing method and testing device of the present invention are used to detect target nucleic acids using a DNA chip (DNA microarray).
  • the nucleic acid probes for detecting target nucleic acids are preferably single-stranded DNA, and can be obtained by chemical synthesis using, for example, a nucleic acid synthesizer.
  • the nucleic acid synthesizer may be a device known as a DNA synthesizer, fully automated nucleic acid synthesizer, automatic nucleic acid synthesizer, or the like.
  • the nucleic acid probes for detecting target nucleic acids are preferably used in the form of a microarray by immobilizing their 5'-end or 3'-end on a carrier.
  • Materials for the carrier can be those known in the art and are not particularly limited.
  • Examples include precious metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten, and compounds thereof, and conductive materials such as carbon, represented by graphite and carbon fiber; silicon materials, represented by single crystal silicon, amorphous silicon, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride; composite materials of these silicon materials, represented by SOI (silicon-on-insulator); inorganic materials, such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramics, forsterite, and photosensitive glass; polyethylene, polypropylene, cyclic polyisoprene, and the like.
  • precious metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten, and compounds thereof
  • conductive materials such as carbon, represented by graphite and carbon fiber
  • silicon materials represented by single crystal silicon, amorphous silicon, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride
  • composite materials of these silicon materials represented by SOI (silicon
  • suitable carriers include organic materials such as olefin, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenolic resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene-acrylonitrile copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, polyphenylene oxide, and polysulfone.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, but a flat plate is preferred.
  • the carrier preferably has a carbon layer such as diamond-like carbon (DLC) on its surface, and chemically modified groups such as amino groups, carboxyl groups, epoxy groups, formyl groups, hydroxyl groups, and active ester groups.
  • DLC diamond-like carbon
  • Carriers having a carbon layer and chemically modified groups on their surface include those having a carbon layer and chemically modified groups on the surface of a substrate, and those having chemically modified groups on the surface of a substrate made of a carbon layer. Materials known in the art can be used for the substrate, and there are no particular restrictions, and the same materials as those listed above as carrier materials can be used.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention can quantitatively analyze target nucleic acids in a subject using a DNA chip prepared in this manner. Specifically, the process includes the steps of first extracting DNA from a sample derived from the subject, using the extracted DNA as a template to amplify a region containing the genetic mutation being tested through a nucleic acid amplification reaction, and detecting at least the target nucleic acid using the DNA chip during the exponential amplification phase of the nucleic acid amplification reaction.
  • the subject is typically a human being who is the subject of genetic testing, and may be a patient suffering from a disease associated with a specific genetic mutation.
  • sample derived from the subject There are no particular limitations on the sample derived from the subject. Examples include blood-related samples (blood, serum, plasma, etc.), lymph, feces, cancer cells, tissue or organ fragments, and extracts.
  • DNA is extracted from a sample collected from a subject.
  • a disrupter called a blender, mixer, or homogenizer
  • an organic solvent phenol/chloroform
  • the cells can be disrupted using a surfactant, adsorbed onto a silica column, and then centrifuged, or DNA can be adsorbed onto silica-coated magnetic beads and then separated using a magnet.
  • an amplification reaction is carried out using the obtained DNA as a template to amplify the nucleic acid region containing the genetic mutation to be tested, preferably the DNA.
  • amplification methods include polymerase chain reaction (PCR), loop-mediated isothermal amplification (LAMP), and isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids (ICAN).
  • PCR polymerase chain reaction
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • ICAN isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids
  • the method for labeling the amplified nucleic acid is not particularly limited, but for example, the primers used in the amplification reaction may be pre-labeled, or labeled nucleotides may be used as substrates in the amplification reaction.
  • the labeling substance is not particularly limited, but radioisotopes, fluorescent dyes, or organic compounds such as digoxigenin (DIG) or biotin may be used.
  • This reaction system also contains buffers necessary for nucleic acid amplification and labeling, a heat-stable DNA polymerase, a pair of primers specific to the region to be amplified, labeled nucleotide triphosphates (specifically, nucleotide triphosphates labeled with a fluorescent label, etc.), nucleotide triphosphates, magnesium chloride, etc.
  • Nucleic acid amplification reactions consist of three steps: thermal denaturation, annealing, and extension. These three steps constitute one cycle, and by repeating multiple cycles, it is possible to synthesize nucleic acid fragments containing the genetic mutation being tested for.
  • the procedure for repeating these three steps is called a thermal cycle, and the number of times the three steps are repeated is called the number of thermal cycles.
  • the nucleic acid amplification reaction may be comprised of two steps: a thermal denaturation step and an annealing and extension step, called two-step PCR, in which annealing and extension are performed at the same temperature.
  • these two steps are repeated as one cycle to synthesize a nucleic acid fragment containing the genetic mutation being tested for.
  • the procedure for repeating these two steps is called a thermal cycle, and the number of times the two steps are repeated is called the number of thermal cycles.
  • the thermal denaturation step is a process in which a reaction solution containing template DNA is heated to typically 90°C or higher to convert it into single-stranded DNA.
  • the first thermal denaturation step in the thermal cycle is preferably carried out for a relatively long time (1 to 5 minutes) when genomic DNA is used as the template.
  • the second and subsequent thermal denaturation steps are preferably carried out for a relatively short time (1 to 90 seconds), as their purpose is to convert the double-stranded amplification product into single-stranded.
  • the annealing step involves heating a reaction solution containing single-stranded template DNA and a pair of primer sets to a temperature typically between 40 and 75°C, allowing these primers to specifically bind (anneal) to the template DNA.
  • the temperature for the annealing step is set appropriately depending on the sequence and length of the primers. Typically, the temperature for the annealing step is set within ⁇ 5°C of the Tm value of the primers used.
  • the temperature of the reaction solution is raised to approximately 72°C while the primer is annealed to the template DNA, and a thermostable polymerase (such as Taq DNA polymerase) is used to synthesize a complementary strand from the end of the primer.
  • a thermostable polymerase such as Taq DNA polymerase
  • the complementary strand of the template DNA is synthesized from a labeled primer, or by incorporating labeled free nucleotides. Therefore, for the genetic mutation being tested, both the target nucleic acid containing the base to be detected and the non-target nucleic acid containing the base not to be detected are labeled.
  • the duration of the extension step is set appropriately depending on the length of the nucleic acid fragment to be amplified and the reactivity of the enzyme used.
  • the exponential amplification phase in thermal cycling is the period during which the amplification efficiency in thermal cycling is 70% or higher, preferably 80% or higher, more preferably 90% or higher, even more preferably 95% or higher, and most preferably 98% or higher.
  • amplification efficiency is a value expressed as a percentage of the increase in the amount of nucleic acid fragment per cycle. In other words, an amplification efficiency of 100% means that the amplified fragment doubles per cycle. Therefore, when defining the exponential amplification phase, there are no particular limitations on the upper limit of amplification efficiency, and it can be, for example, a value between 100% and 110%.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention confirm that a nucleic acid amplification reaction is in the exponential amplification phase by detecting the amplified product in the reaction solution during the nucleic acid amplification reaction. More specifically, the nucleic acid amplification reaction is carried out using a reaction solution containing a fluorescent dye (amplification detection probe), and the amplification of nucleic acid by polymerase chain reaction is monitored in real time. Whether the nucleic acid amplification reaction is in the exponential amplification phase can be confirmed based on the obtained fluorescence intensity value.
  • the amplification detection probe can be any fluorescent probe whose fluorescence intensity changes with nucleic acid amplification by PCR.
  • amplification detection fluorescent probes include TaqMan (registered trademark) probe, Eprobe (registered trademark), QProbe (registered trademark), and dyes (SYBR green I) that specifically intercalate into double-stranded nucleic acids and emit fluorescence.
  • the TaqMan probe method uses a probe in which a sequence-specific oligonucleotide is labeled with a reporter and a quencher. As the PCR reaction progresses, the TaqMan probe is hydrolyzed, increasing the distance between the reporter and quencher and emitting a fluorescent signal.
  • Eprobe is normally quenched by the two fluorescent dye moieties bound to each other, but emits fluorescence upon hybridization with template DNA.
  • QProbe binds to PCR amplification products and reduces its fluorescence during annealing. Therefore, the fluorescence during annealing in PCR can be measured and the process of nucleic acid amplification can be monitored by observing the increase in the fluorescence quenching rate.
  • the amplification detection probe be designed so as not to affect the hybridization reaction between the amplification product and the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid, the nucleic acid probe for detecting the non-target nucleic acid, and the common probe.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention detect target nucleic acids and non-target nucleic acids contained in a nucleic acid amplification reaction solution that has been confirmed to be in the exponential amplification phase as described above, and can quantitatively analyze the target nucleic acid based on this.
  • a hybridization reaction between the target nucleic acid detection nucleic acid probe and the target nucleic acid is carried out, and the amount of nucleic acid hybridized to the target nucleic acid detection nucleic acid probe can be measured, for example, by detecting a label.
  • the signal from the label can be detected using a fluorescent scanner, and the signal intensity can be quantified by analyzing this using image analysis software.
  • the hybridization reaction is preferably carried out under stringent conditions.
  • Stringent conditions refer to conditions under which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, these conditions refer to hybridization reactions at 50°C for 16 hours, followed by washing in 2xSSC/0.2% SDS at 25°C for 10 minutes and 2xSSC at 25°C for 5 minutes.
  • the hybridization buffer composition of the present invention may contain salts necessary for hybridization reactions, such as SSC, and known blocking agents, such as SDS.
  • Figure 1 shows a nucleic acid amplification reaction using template DNA containing 80% wild-type DNA and 20% mutant DNA, with the horizontal axis representing the number of thermal cycles and the vertical axis representing the amount of DNA amplified.
  • the 80:20 ratio of wild-type DNA to mutant DNA contained in the template DNA is not maintained near the end of the thermal cycle. Therefore, it is clear that quantitative analysis of target nucleic acids is not possible using the reaction solution after the end of the thermal cycle.
  • the 80:20 ratio of wild-type DNA to mutant DNA contained in the template DNA is roughly maintained. Therefore, quantitative analysis of target nucleic acids is possible by detecting the target nucleic acids during the exponential amplification phase of the thermal cycle.
  • the abundance ratio of the target nucleic acid to the non-target nucleic acid i.e., the mutation ratio
  • the signal intensities of the nucleic acid probe for detecting a target nucleic acid and the nucleic acid probe for detecting a non-target nucleic acid are measured, and a judgment value for evaluating the signal intensity from the nucleic acid probe for detecting a target nucleic acid is calculated.
  • An example of how to calculate the judgment value is a method using the formula: [signal intensity from nucleic acid probe for detecting a target nucleic acid]/([signal intensity from nucleic acid probe for detecting a target nucleic acid]+[signal intensity from nucleic acid probe for detecting a non-target nucleic acid]).
  • the genetic mutation testing method and testing device are not limited to the configuration described above, and can also use a so-called blocking nucleic acid to prevent non-target nucleic acids in the nucleic acid amplification reaction solution from non-specifically hybridizing to the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid.
  • the blocking nucleic acid can be mixed with a reaction solution containing the target nucleic acid and non-target nucleic acid, and the resulting mixture can be brought into contact with a DNA chip to allow a hybridization reaction between the target nucleic acid and the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid to proceed.
  • the reaction solution containing the target nucleic acid and non-target nucleic acid can be mixed with a solution containing the blocking nucleic acid on the DNA chip to allow specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid to proceed simultaneously.
  • hybridization of the blocking nucleic acid to the non-target nucleic acid prevents the non-target nucleic acid from hybridizing to the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid.
  • the blocking nucleic acid has a base sequence complementary to a region of the non-target nucleic acid that contains the non-target base. Therefore, the blocking nucleic acid can hybridize with the non-target nucleic acid that contains the non-target base under conditions that allow hybridization of the target nucleic acid containing the non-target base with the nucleic acid probe.
  • the position of the base corresponding to the non-target base is not particularly limited. Furthermore, although there are no particular limitations on the blocking nucleic acid, it is preferable that the length be 60% or more of the base length of the nucleic acid probe. Furthermore, it is preferable that the length of the blocking nucleic acid be 140% or less of the base length of the nucleic acid probe. For example, if the nucleic acid probe is 25 bases long, the base length of the blocking nucleic acid is preferably 15 to 35 bases long.
  • the blocking nucleic acid may contain mismatched bases (non-complementary bases) at positions corresponding to bases other than the non-target bases to be detected contained in the non-target nucleic acid.
  • the number of mismatched bases can be 1 to 3, preferably 1 to 2.
  • the number of mismatched bases can be 1 to 5, preferably 1 to 4.
  • the concentration of the blocking nucleic acid is not particularly limited, but can be set appropriately depending on, for example, the concentration of the non-target nucleic acid and/or the concentration of the target nucleic acid, or the primer concentration.
  • the concentration of the blocking nucleic acid in the composition can be 0.01 to 2 ⁇ M, preferably 0.02 to 1.5 ⁇ M, and more preferably 0.05 to 1.5 ⁇ M.
  • the value determined by the above formula: [signal intensity from nucleic acid probe for detecting target nucleic acids]/([signal intensity from nucleic acid probe for detecting target nucleic acids]+[signal intensity from nucleic acid probes for detecting non-target nucleic acids]) may be insufficient for quantitative analysis of the target nucleic acid. In this case, it is preferable to measure the total amount of target nucleic acid and non-target nucleic acid using a common probe.
  • the common probe has a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and the non-target nucleic acid. Therefore, even if the blocking nucleic acid hybridizes with the non-target nucleic acid, the common probe can hybridize with the same non-target nucleic acid.
  • the formula for calculating the aforementioned judgment value can be [signal intensity from nucleic acid probe for detecting target nucleic acid] / [signal intensity from common probe]. This formula makes it possible to calculate the ratio of target nucleic acid to the total combined target nucleic acid and non-target nucleic acid, eliminating the influence of blocking nucleic acid.
  • the "signal intensity from nucleic acid probe for detecting target nucleic acid” may be referred to as “MPFI” (Mutant Probe Fluorescent Intensity), and the “signal intensity from the common probe” may be referred to as “CPFI” (Common Probe Fluorescent Intensity).
  • the calibration curve can be prepared by using various samples with known mutation ratios (samples containing target nucleic acids and non-target nucleic acids in known ratios) to detect the target nucleic acids and non-target nucleic acids contained in the nucleic acid amplification reaction solution during the exponential amplification phase, and then using the determination value calculated using the above formula.
  • the calibration curve shows the relationship between the determination value calculated as described above and the ratio of target nucleic acids and non-target nucleic acids contained in the nucleic acid amplification reaction solution, or the amount of target nucleic acid.
  • the method for creating a calibration curve is not particularly limited, but examples include a method in which a preset fluorescence intensity in a nucleic acid amplification reaction is set as the exponential amplification phase, target nucleic acids and non-target nucleic acids are detected at that fluorescence intensity, and a calibration curve is created from the determination value calculated using the above formula.
  • examples of a method for creating a calibration curve include a method in which the exponential amplification phase (the region of high linearity in the amplification curve) is examined based on an amplification curve obtained in a nucleic acid amplification reaction using a sample with a known mutation rate, the number of thermal cycles in the exponential amplification phase is determined, target nucleic acids and non-target nucleic acids are detected at that number of thermal cycles, and a calibration curve is created from the determination value calculated using the above formula.
  • a nucleic acid amplification reaction is carried out using a sample with a reference mutation rate (for example, a sample with a 100% mutation rate), the fluorescence of the reaction solution is detected at predetermined intervals (for example, every cycle), the reaction solution that has reached a preset fluorescence intensity is removed, and the target nucleic acid and non-target nucleic acids contained in the reaction solution are detected.
  • the fluorescence of the reaction solution is detected using a fluorescent probe for amplification detection
  • the target nucleic acid is detected using a nucleic acid probe for target nucleic acid detection
  • the target nucleic acid and non-target nucleic acids are detected using a common probe.
  • one method for determining the exponential amplification phase is to determine it from the amplification curve of a fluorescent probe used for amplification detection.
  • a method is known in which the exponential amplification phase is calculated from the fluorescence intensity at which a predetermined threshold is reached.
  • this method may not be suitable when the dynamic range of detection changes. Therefore, for example, the exponential amplification phase can be calculated using the following method.
  • the method for determining the fluorescence intensity threshold for the exponential amplification phase involves first setting several tentative fluorescence intensity thresholds (Tentative Threshold Probe Fluorescent Intensity, hereinafter referred to as TTh.PFI) using the amplification curve of the nucleic acid fragment obtained from the amplification detection fluorescent probe, with the reached fluorescence intensity value being the upper limit of the dynamic range of the amplification detection fluorescent probe.
  • TTh.PFI tentative Threshold Probe Fluorescent Intensity
  • the reaction solution is removed and a judgment value is calculated using the above formula based on the signal intensities from the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid, the nucleic acid probe for detecting the non-target nucleic acid, and the common probe, and the true fluorescence intensity threshold (Th.PFI) is determined from the linearity of the obtained calibration curve.
  • the exponential amplification phase may also be determined by performing regression analysis, etc., from the amplification curve of the nucleic acid fragment detected with the amplification detection fluorescent probe.
  • the reciprocal of the judgment value obtained from a sample with a 100% mutation rate can be used as a correction coefficient.
  • This correction coefficient can be multiplied by the judgment value obtained from known mutation rate samples (e.g., a sample with a 1%, 10%, 50%, or 100% mutation rate), including the 100% mutation rate sample, to correct the slope a of the calibration curve. More specifically, if the judgment value for a sample with a 100% mutation rate is calculated using the formula [signal intensity from the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid]/[signal intensity from the common probe], the correction coefficient is calculated as [signal intensity from the common probe]/[signal intensity from the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid].
  • the corrected judgment value can be calculated from the judgment values calculated for various known mutation rate samples.
  • the corrected judgment value will be 1 for a sample with a 100% mutation rate, and the judgment values for other mutation rate samples will be distributed in the range of 0 to 1.
  • a scatter plot can be created with the corrected judgment value (judgment value x correction coefficient) on the horizontal axis and the known mutation rate on the vertical axis, and a linear approximation line can be obtained using the least squares method.
  • the ratio of the rate of change on the horizontal axis to the rate of change on the vertical axis will be constant, so the intercept b can be accurately corrected by logarithming both axes.
  • This procedure allows the slope a and intercept b to be corrected, resulting in a calibration curve in which various errors have been normalized.
  • a calibration curve for a preset TTh.PFI can be created.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention may use the calibration curve created as described above, but it is preferable to set multiple TTh.PFIs and create calibration curves in the same way, and then select and use from the multiple calibration curves the calibration curve (Th.PFI) that has the most linear relationship between the corrected judgment value and the mutation rate.
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention are not limited to using the calibration curve showing the relationship between the corrected judgment value and the mutation rate described above, and it is preferable to also use a "logarithmically transformed calibration curve" obtained by logarithmically transforming both sides of the equation showing the calibration curve.
  • calibration curves for multiple TTh.PFIs as described above, and also prepare logarithmically transformed calibration curves corresponding to the prepared calibration curves.
  • a set with high linearity is selected for both calibration curves. Specifically, among calibration curves showing the relationship between the corrected judgment value and the mutation rate whose coefficients of determination exceed a predetermined value (e.g., R2 ⁇ 0.99), the set of calibration curves with the highest coefficients of determination in the corresponding logarithmically transformed calibration curves is selected.
  • the genetic mutation testing method and testing device can use the calibration curves included in the selected set.
  • another method for determining the fluorescence intensity threshold during the exponential amplification phase is to use a pseudo target with a copy number equivalent to that of the amplified product.
  • the dynamic range of the nucleic acid probe for detecting target nucleic acids, the nucleic acid probe for detecting non-target nucleic acids, and the common probe can be calculated.
  • Multiple pseudo targets can be used to calculate Th.PFI using the same procedure as above, or the Tm can be calculated based on the results obtained from a single pseudo target.
  • pseudo targets include synthetic DNA such as oligonucleotide DNA and plasmid DNA, and DNA spiked with target nucleic acids. These pseudo targets are pre-labeled with fluorescent substances, allowing the amounts of the nucleic acid probe for detecting target nucleic acids, the nucleic acid probe for detecting non-target nucleic acids, and the common probe to be measured using a detection system such as a cooled CCD camera, and their dynamic ranges can be determined.
  • the dynamic ranges of the nucleic acid probes for detecting target nucleic acids, the nucleic acid probes for detecting non-target nucleic acids, and the common probe can also be measured using analytical equipment. In this case, surface analysis methods such as SEM, TEM, XRD, XPS, AES, GDS, ellipsometer, and absorbance measurement can be used.
  • the dynamic range can be determined by using these spectroscopic devices to measure the amounts of the nucleic acid probes for detecting target nucleic acids, the nucleic acid probes for detecting non-target nucleic acids, and the common probe present on the surface of the DNA chip.
  • the proportion of target nucleic acid (mutation proportion) in a subject can be analyzed. Specifically, a portion or all of the reaction solution from a nucleic acid amplification reaction that has been confirmed to be in the exponential amplification phase is removed, and the target nucleic acid and non-target nucleic acids contained in the removed reaction solution are detected. Specifically, for example, a judgment value is calculated from the fluorescence intensity (MPFI) observed with the nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid and the fluorescence intensity (CPFI) observed with the common probe, and this is multiplied by a correction coefficient to calculate a corrected judgment value, allowing the mutation proportion to be analyzed based on the calibration curve.
  • MPFI fluorescence intensity
  • CPFI fluorescence intensity
  • the genetic mutation testing method and testing device of the present invention can perform quantitative analysis of each genetic mutation when there are multiple regions containing genetic mutations to be tested.
  • myeloproliferative neoplasms MPN
  • JAK2, CALR, and MPL myeloproliferative neoplasms
  • Quantitative analysis can be performed on these multiple genetic mutations. Specifically, for each region containing genetic mutations, a nucleic acid amplification reaction is performed and a step of confirming that the nucleic acid amplification reaction is in the exponential amplification phase is performed.
  • reaction solutions in the exponential amplification phase are combined, and the target nucleic acid and non-target nucleic acids corresponding to each genetic mutation contained in the resulting reaction solution can be detected using the corresponding nucleic acid probe for detecting the target nucleic acid and the nucleic acid probe for detecting the non-target nucleic acid or a common probe.
  • the next detection step is performed using only the reaction solutions for which it has been confirmed that the nucleic acid amplification reaction is in the exponential amplification phase for each genetic mutation region (reaction solutions at the optimal timing for quantification). This allows for more accurate quantitative analysis of each target nucleic acid.
  • multiple nucleic acid probes with different target bases can be arranged so that multiple gene mutations can be tested on a single DNA chip. That is, detection can be performed using a DNA chip on which nucleic acid probes for detecting target nucleic acids corresponding to each of multiple gene mutations and nucleic acid probes for detecting non-target nucleic acids or a common probe are immobilized on a carrier.
  • each reaction solution the above-mentioned nucleic acid amplification reaction is carried out using a pair of primer sets specific to regions containing different gene mutations, and part or all of each reaction solution is sampled at the optimal time during the exponential amplification phase for that reaction solution, allowing the target nucleic acid to be quantitatively analyzed for multiple gene mutations using a single DNA chip.
  • both the process of confirming that the nucleic acid amplification reaction is in the exponential amplification phase and the process of detecting the target nucleic acid and non-target nucleic acid may be performed by detecting the fluorescence of the fluorescent probe for amplification detection. In this case, it is possible to omit labels added to the primers or nucleotide substrates.
  • a fluorescent probe for amplification detection is used in the detection process as well, it is necessary to select a fluorescent probe for amplification detection that emits light even when the target nucleic acid is hybridized to the nucleic acid probe for target nucleic acid detection on the DNA chip.
  • Eprobe registered trademark
  • an amplification detection probe such as Eprobe is also used in the step of detecting target nucleic acids and non-target nucleic acids
  • an amplification detection probe when used in the detection step, it is preferable to design the amplification detection probe so that it has a sequence complementary to a region of the target nucleic acid and non-target nucleic acid that does not overlap with regions having sequences complementary to the nucleic acid probe for detecting target nucleic acids, the nucleic acid probe for detecting non-target nucleic acids, and the common probe. This prevents inhibition of hybridization of the target nucleic acid and non-target nucleic acid to each probe, allowing for smooth detection of the target nucleic acid and non-target nucleic acid.
  • Nucleic acid amplification reaction detection unit 2 is equipped with a reaction vessel 4 that stores reagents and substances necessary for the nucleic acid amplification reaction, and a first temperature control unit 5 that controls the reaction solution in reaction vessel 4 to a predetermined temperature. Furthermore, at least a portion of the surface of reaction vessel 4 is transparent to measure fluorescence from the reaction solution, and an imaging unit 9A is equipped in a position facing the transparent portion.
  • the detection unit 3 includes a DNA chip mounting unit 7 that mounts a DNA chip 6 having nucleic acid probes for detecting target nucleic acids, nucleic acid probes for detecting non-target nucleic acids, and a common probe; a second temperature control unit 8 that controls the hybridization reaction solution supplied to the DNA chip 6 mounted on the DNA chip mounting unit 7 to a predetermined temperature; and an imaging unit 9B that is positioned opposite the surface of the DNA chip 6 on which the various probes are immobilized.
  • the nucleic acid amplification reaction detection unit 2 and the detection unit 3 are connected via a flow path 10 that allows the solution to pass through.
  • the first temperature control unit 5 and second temperature control unit 8 each include a metal block with high thermal conductivity and a temperature control device that heats/cools the metal block.
  • the testing device 1 also includes a hybridization buffer tank 12 connected to the DNA chip mounting section 7 via a flow path 11, and a cleaning solution tank 14 connected to the DNA chip mounting section 7 via a flow path 13.
  • the testing device 1 also includes a waste liquid tank 16 connected to the DNA chip mounting section 7 via a flow path 15.
  • the testing device 1 also includes a pump device 18 connected to the waste liquid tank 16 via a flow path 17.
  • liquid supply shut-off valves 19A, 19B, 19C, and 19D are disposed midway through flow paths 10, 11, 13, and 15.
  • intake valves 20A, 20B, 20C, and 20D are attached to the reaction chamber 4, hybridization buffer tank 12, washing solution tank 14, and waste tank 16, respectively.
  • These liquid supply shut-off valves 19A, 19B, 19C, and 19D can open and close the flow paths, directing the pressure of the pump device 18 to the flow path to which liquid is to be sent.
  • the testing device 1 is equipped with a liquid supply device that includes the pump device 18, liquid supply shut-off valves 19A, 19B, 19C, and 19D, and intake valves 20A, 20B, 20C, and 20D.
  • This liquid supply device can send various solutions to the detection unit 3 via flow paths 10, 11, and 13, and can send waste liquid to the waste tank 16 via flow path 15.
  • liquid supply shutoff valves 19A, 19B, 19C, and 19D can move reagents in the reaction chamber 4 or DNA chip mounting section 7 to another location connected by a flow path when they temporarily expand or contract due to temperature fluctuations.
  • the liquid supply shutoff valves are not particularly limited, and can be made of materials that have been treated to be hydrophobic or hydrophilic, or materials that change shape due to heat, etc.
  • a shape that can be physically opened and closed by external stress is preferred, and one example is a diaphragm valve that is pressed down by an actuator, or a rotary valve that is opened and closed by rotation.
  • the testing device 1 configured as above can detect target nucleic acids and non-target nucleic acids contained in a nucleic acid amplification reaction solution that has been confirmed to be in the exponential amplification phase, and quantitatively analyze the target nucleic acid based on this.
  • a flowchart for quantitatively analyzing target nucleic acids is shown in Figure 3.
  • a nucleic acid amplification reaction is first carried out in the reaction chamber 4 for a region containing the genetic mutation to be tested. At this time, the reaction chamber 4 is filled with a reaction solution consisting of reagents necessary for the nucleic acid amplification reaction.
  • the reaction chamber 4 can be filled with the reaction solution by an operator, or it can be filled into the reaction chamber 4 from a different flow path (not shown). Furthermore, by setting the thermal cycle for the nucleic acid amplification reaction in advance, the first temperature control unit 5 can control the temperature and processing time of the reaction solution in the reaction chamber 4 according to the set thermal cycle.
  • the imaging unit 9A measures the fluorescence generated by the amplification detection fluorescent probe contained in the reaction solution in the reaction vessel 4, and the nucleic acid amplification reaction is monitored by the fluorescence intensity.
  • a predetermined fluorescence intensity corresponding to the exponential amplification phase is observed, part or all of the reaction solution is removed and sent to the DNA chip mounting unit 7, which has the DNA chip 6 mounted thereon.
  • the reaction solution in the reaction vessel 4 can be sent to the DNA chip mounting unit 7 by operating the pump device 18 while the intake valve 20A and the liquid supply shutoff valves 19A and 19D are open and the other intake valves 20B, 20C, and 20D and the liquid supply shutoff valves 19B and 19C are closed.
  • the testing device 1 can be set to temporarily suspend the thermal cycle performed by the first temperature control unit 5 and wait until the liquid transfer is completed in one temperature range of the thermal cycle (e.g., 95°C).
  • hybridization buffer is supplied from the hybridization buffer tank 12 to the DNA chip mounting section 7.
  • intake valve 20B and feed shutoff valves 19B and 19D are opened, and the other intake valves 20A, 20C, and 20D and feed shutoff valves 19A and 19C are closed, and the pump device 18 is operated.
  • the hybridization buffer may have a composition that includes the blocking nucleic acid described above.
  • the second temperature control section 8 adjusts the temperature of the solution supplied to the DNA chip mounting section 7 to a preset hybridization temperature.
  • the second temperature control section 8 can also preheat before the reaction if necessary.
  • the reaction solution and hybridization buffer solution are sent separately through different flow paths, but it is also possible to mix the reaction solution and hybridization buffer solution and then send the mixed solution to the DNA chip mounting section 7.
  • the detection unit 3 detects the target nucleic acid and non-target nucleic acid hybridized to the probe.
  • a cleaning solution is delivered to the DNA chip mounting unit 7 to clean the DNA chip 6.
  • the cleaning solution can be delivered from the cleaning solution tank 14.
  • the intake valve 20C and the liquid delivery shutoff valves 19C and 19D are opened, and the other intake valves 20A, 20B, and 20D and the liquid delivery shutoff valves 19A and 19B are closed, and the pump device 18 is operated.
  • the second temperature control unit 8 can also lower the cleaning temperature to a temperature lower than the hybridization reaction temperature (e.g., 25°C).
  • the mixture of the reaction solution and hybridization buffer solution may be discharged into the waste tank 16, and then the washing solution may be pumped as described above, or the mixture of the reaction solution and hybridization buffer solution may be discharged into the waste tank 16 by pumping the washing solution as described above.
  • the surface of the DNA chip 6 on which the nucleic acid probes for detecting target nucleic acids, the nucleic acid probes for detecting non-target nucleic acids, and the common probe are immobilized is imaged by the imaging unit 9B, and the signal intensity of each probe is measured using image analysis software on a computer (not shown). Furthermore, the target nucleic acid can be quantitatively analyzed using the same computer based on the measured signal intensity.
  • the testing device 1 of the present invention it is possible to deliver nucleic acid amplification reaction solution in which the nucleic acid amplification reaction has been confirmed to be in the exponential amplification phase, and detect target and non-target nucleic acids based on hybridization reactions with each probe using a DNA chip 6.
  • the reaction chamber 4 and the DNA chip mounting section 7 were connected via a flow path 10, and the nucleic acid amplification reaction solution was delivered using a configuration including a pump device 18, delivery shutoff valves 19A, 19B, 19C, and 19D, and intake valves 20A, 20B, 20C, and 20D.
  • the mechanism for delivering the nucleic acid amplification reaction solution is not limited to this configuration, and some or all of the nucleic acid amplification reaction solution can also be delivered using a pipette device attached to a drive arm.
  • the above-mentioned liquid delivery operation is performed by suction using the pump device 18.
  • the testing device 1 can also perform the above-mentioned liquid delivery operation by using a pressure pump connected upstream of the nucleic acid amplification reaction detection unit 2, hybridization buffer tank 12, and washing liquid tank 14.
  • the hybridization buffer solution is sent directly to the DNA chip mounting section 7 from the hybridization buffer solution tank 12 connected to the DNA chip mounting section 7 via the flow path 11, but it may also be sent to the DNA chip mounting section 7 after first merging with the flow path 10.
  • testing device 1 shown in Figure 2 is equipped with a DNA chip mounting section 7 on which a DNA chip 6 can be mounted, and is configured so that the DNA chip 6 can be attached and detached.
  • the testing device 1 is not limited to this configuration, and may also be configured so that each probe is directly fixed to the detection section 3.
  • the testing device 1 shown in Figure 2 may, if necessary, be equipped with a nucleic acid extraction unit (not shown) upstream of the nucleic acid amplification reaction detection unit 2 for extracting template DNA from a sample derived from a subject.
  • the nucleic acid extraction unit can be composed of a disrupter such as a blender, mixer, or homogenizer for disrupting cells, or a nucleic acid extraction device including an organic solvent (phenol/chloroform), a silica membrane, an anion exchange resin column, magnetic beads, etc.
  • the DNA extracted in the nucleic acid extraction unit is mixed with the reagents necessary for the nucleic acid amplification reaction and sent to the reaction chamber 4 of the nucleic acid amplification reaction detection unit 2, which is connected via a flow path.
  • the mixing operation of the extracted DNA and the reagents may be performed after the DNA and the reagents are each loaded into the reaction chamber 4.
  • the DNA and the reagents can be loaded separately into the reaction chamber 4, and the loaded DNA and reagents can be mixed inside the reaction chamber 4.
  • the DNA and the reagents may be mixed in advance, and the resulting mixture may be loaded into the reaction chamber 4.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing another example of a genetic mutation testing device according to the present invention.
  • the nucleic acid amplification reaction solution is delivered from a nucleic acid amplification reaction detection unit 2 having one reaction chamber 4, but the testing device according to the present invention is not limited to this configuration. That is, as shown schematically in FIG. 4, the genetic mutation testing device 1 according to the present invention may be configured to include a nucleic acid amplification reaction detection unit 2 having multiple reaction chambers 4 (five in the example of FIG. 4). In this case, the temperatures of the multiple reaction chambers 4 may be controlled collectively by a single first temperature control unit 5, or may be controlled individually by multiple first temperature control units 5.
  • each of the multiple reaction vessels 4 and the detection unit 3 are connected via flow paths 10, and a liquid delivery shutoff valve 19A is disposed midway along the flow path 10.
  • an intake valve 20A is attached to each reaction vessel 4.
  • the switching device can be equipped with a control device for controlling the timing of opening and closing of each liquid supply shutoff valve 19A and intake valve 20A.
  • the multiple reaction chambers 4 of the nucleic acid amplification reaction detection unit 2 can be configured to perform nucleic acid amplification reactions that amplify regions containing different genetic mutations to be tested.
  • the DNA chip 6 mounted on the DNA chip mounting unit 7 has nucleic acid probes for detecting target nucleic acids and nucleic acid probes for detecting non-target nucleic acids or a common probe fixed to a carrier, which correspond to each genetic mutation, allowing the target nucleic acids and non-target nucleic acids contained in the reaction solution in the multiple reaction chambers 4 to be detected.
  • reaction solutions sent from each reaction chamber 4 to the DNA chip mounting section 7 are mixed, and then, as in Figure 2, a hybridization reaction and washing process take place in the DNA chip mounting section 7 before detection. This means that the hybridization reaction between the reaction solution and the probes on the DNA chip 6 only needs to be carried out once, enabling efficient quantitative analysis.
  • the flow paths 10 leading from each reaction chamber 4 to the DNA chip mounting section 7 join just before the DNA chip mounting section 7, but a reservoir may be provided at the joining point to ensure smooth joining and mixing of the reaction solutions from each reaction chamber 4.
  • the pump device 18 is not limited to the configuration shown in the figure, and a pressure pump may also be connected upstream of each reaction chamber 4.
  • a method for amplifying multiple regions each containing a different genetic mutation to be tested can also be implemented by using the testing device 1 in Figure 2 and using amplification detection fluorescent probes with different fluorescent colors for each region.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing yet another example of a genetic mutation testing device according to the present invention. Similar to the example in FIG. 4, the testing device 1 in FIG. 5 is equipped with a nucleic acid amplification reaction detection unit 2 having multiple reaction chambers 4.
  • each reaction chamber 4 is connected to an independent DNA chip mounting unit 7, and these multiple DNA chip mounting units 7 form the detection unit 3.
  • a connection port 21 is provided upstream of the intake valve 20A of each reaction chamber 4.
  • the hybridization buffer tank and washing solution tank are not directly connected to the DNA chip mounting unit 7 and are not shown.
  • each reaction chamber 4 is filled with a reaction solution consisting of reagents necessary for the nucleic acid amplification reaction from the connection port 21, and the nucleic acid amplification reaction is carried out until a predetermined fluorescence intensity corresponding to the exponential amplification phase is observed, similar to the testing device 1 shown in Figure 2.
  • a cleaning solution for washing away excess reagent is sent from the connection port 21 to the DNA chip mounting section 7 via the reaction chamber 4, washing the DNA chip 6 and discharging it into the waste tank 16.
  • a rinse solution is sent from the connection port 21 to the DNA chip mounting section 7 via the reaction chamber 4, rinsing the DNA chip 6 and discharging it into the waste tank 16.
  • the cleaning solution and rinse solution are sent from the reaction chamber 4 to the DNA chip mounting section 7 and then discharged into the waste tank 16
  • the specified intake valve 20A and the corresponding liquid supply shut-off valves 19A and 19D are opened and the pump device 18 is operated, just as when sending the reaction solution.
  • the DNA chip 6 is then imaged by the imaging unit 9B, and the signal intensity of each probe is measured and analyzed, just as in Figure 2.
  • connection port 21 Various liquids can be injected through the connection port 21 by an operator, or by connecting a tank for each liquid (not shown) to the connection port 21 via a flow path.
  • the flow paths merge immediately before the waste liquid tank 16, resulting in little loss of reaction liquid and allowing for a simplified and more compact flow path design.
  • the pump device 18 is located downstream of the waste liquid tank 16, but this configuration is not limiting. Liquid may also be delivered by connecting a pressure pump upstream of the connection port 21 and operating the pressure pump.
  • the device in Figure 4 and the device in Figure 5 are not alternatives; when amplifying multiple regions in separate reaction chambers 4, the reaction solutions from some of the reaction chambers 4 may be combined and detected in a single DNA chip mounting section 7, while the reaction solutions from the other reaction chambers 4 may be sent to individual DNA chip mounting sections 7 for detection.
  • Example 1 [Quantitative test of mutation rate using IC5] 1. Preparation of calibration curve samples
  • the V617F mutation in the JAK2 gene was the mutation to be tested.
  • a mutant-type plasmid containing the mutant type and a wild-type plasmid containing the wild-type type were prepared using FASMAC's artificial gene synthesis service.
  • the wild-type plasmid for the JAK2 gene was a plasmid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the mutant-type plasmid was a plasmid containing the same region except for the above-mentioned mutation (the V617F mutation in the JAK2 gene).
  • the copy numbers of the prepared mutant and wild-type JAK2 gene plasmids were quantified in advance using a Bio-Rad ddPCR, and the plasmids were mixed so that the mutation rate for the JAK2 V617F mutation was 1%, 5%, 20%, 50%, or 100%.
  • the mixed JAK2 gene was then adjusted with TE buffer so that the total copy number of the mutant and wild-type plasmids was 5 ⁇ 10 / ⁇ L, and this was used as a calibration curve sample.
  • a fluorescent probe for amplification detection (Eprobe (registered trademark)) shown in Table 2, which is necessary for fluorescence detection during PCR, was designed and produced through DNAFORM's oligo synthesis service.
  • the bases marked with T E were conjugated with a fluorescent dye (Oxazole Yellow) from the same company.
  • the above fluorescent probe for amplification detection hybridizes with the amplification product, but is designed to have a sequence complementary to a region in the amplification product that does not overlap with regions having sequences complementary to the nucleic acid probe for detecting target nucleic acids, the nucleic acid probe for detecting non-target nucleic acids, and the common probe.
  • the primer set designed as above and the fluorescent probe for amplification detection were mixed to the composition shown in Table 3 to prepare a primer-probe mix.
  • the PCR thermal cycle was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 22, 25, 28, 31, 34, 37, and 40 cycles, each consisting of 95°C for 30 seconds, 59°C for 30 seconds, and 72°C for 45 seconds, with a final temperature of 4°C.
  • PCR was performed using a Thermo Fisher Scientific StepOne real-time PCR system, and fluorescence detection was performed during annealing (59°C for 30 seconds) using the FAM setting.
  • TTh.PFI 2,000, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000, 15,000, and 20,000.
  • DNA Chip In this example, a mutant probe (nucleic acid probe for detecting target nucleic acid) corresponding to the V617F mutation in the JAK2 gene, a corresponding wild-type probe (nucleic acid probe for detecting non-target nucleic acid), and a common probe common to both the wild-type and mutant types were designed.
  • the common probe specifically hybridizes to the amplified nucleic acid regardless of whether or not the gene mutation is present in the amplified nucleic acid.
  • the base sequences of the designed probes are shown in Table 5.
  • the reaction solution in the designated PCR tube was heated to 49.5°C using automatic operation, and the DNA chip needle was inserted and the hybridization reaction was carried out for 30 minutes. After the hybridization reaction, the DNA chip needle was quickly immersed in a cleaning solution bath and agitated 30 times so that the DNA chip went in and out of the surface of the cleaning solution. After washing, the DNA chip needle was immersed in a rinse solution bath and agitated 80 times so that the DNA chip went in and out of the surface of the rinse solution.
  • the DNA chip needle was slowly immersed in the detection solution tank, and a 640 nm single-wavelength laser was irradiated, capturing the fluorescence on the CCD camera for 2 seconds.
  • M1, M5, M10, and M50 the MPFI and CPFI in TTh.PFI, as well as the judged values, were calculated in the same manner as for M100.
  • the obtained judged values for M1, M5, M10, M50, and M100 were each multiplied by the correction coefficient A to calculate the corrected judged values.
  • a scatter plot was created with the corrected judgement values for M1, M5, M10, M50, and M100 plotted on the X-axis and the known mutation rate on the Y-axis, and linear approximation line I ( Figure 6) was constructed using the least squares method.
  • a scatter plot was also created with the logarithmic transformation values (Log%) of the corrected judgement values for M1, M5, M20, M50, and M100 plotted on the X-axis and the logarithmic transformation values (Log%) of the known mutation rate on the Y-axis, and linear approximation line II ( Figure 7) was constructed using the least squares method.
  • the mutant and wild-type plasmids prepared in 1 above were mixed so that the mutation rates were 0%, 0.25%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, or 100%, respectively.
  • the concentrations were quantified using Qubit (Thermo Fisher Scientific).
  • the mixed plasmid DNA was diluted with TE buffer to 0.08 and 0.32 pg/ ⁇ L, respectively, to prepare samples for quantification.
  • PCR reaction solution prepared as described above, a PCR thermal cycle was performed at 95°C for 5 minutes, followed by one cycle of 95°C for 30 seconds, 59°C for 30 seconds, and 72°C for 45 seconds, and the reaction solution was removed from the device at the temperature cycle where Th.PFI was reached.
  • the same DNA chip and hybridization reaction solution as in 5. and 6. above were prepared, and the hybridization reaction was carried out under the same conditions as in 7. above.
  • Example 2 [Quantitative test of mutation rate using OY]
  • a calibration curve was created using the fluorescent dye IC5 (Ex 640 nm/Em 660 nm) of the hybridized PCR product, whereas in Example 2, a calibration curve was created using the amplification detection fluorescent probe Oxazole Yellow (Ex 490 nm/Em 510 nm) that binds to the hybridized PCR product. Only the changes from Example 1 are described below. The item numbers for each item correspond to those in Example 1.
  • Hybridization Method the hybridization reaction was carried out in the same manner as in 7. of Example 1, except that the light source and filter shown in Table 9 were installed in a genetic analyzer BIOSHOT HT-32 (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.), the rinsed DNA chip needle was slowly immersed in a detection solution tank, and the fluorescence was captured by a CCD camera for 2 seconds upon irradiation with a 488 nm single-wavelength laser.
  • BIOSHOT HT-32 manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.
  • TTh.PFIs set in Example 1, section 4 were substituted into the resulting sixth-order polynomial to calculate MPFI and CPFI.
  • the judgment value was calculated using the formula: [MPFI]/[CPFI], and the reciprocal of the judgment value at M100 (i.e., [CPFI]/[MPFI]) was used as the correction coefficient A.
  • M1, M5, M10, and M50 the MPFI and CPFI in TTh.PFI, as well as the judged values, were calculated in the same manner as for M100.
  • the obtained judged values for M1, M5, M10, M50, and M100 were each multiplied by the correction coefficient A to calculate the corrected judged values.
  • a scatter plot was created with the corrected judgement values for M1, M5, M10, M50, and M100 plotted on the X-axis and the known mutation rate on the Y-axis, and linear approximation line I ( Figure 9) was created using the least squares method.
  • a scatter plot was also created with the logarithmic transformation values (Log%) of the corrected judgement values for M1, M5, M20, M50, and M100 plotted on the X-axis and the logarithmic transformation values (Log%) of the known mutation rate on the Y-axis, and linear approximation line II ( Figure 10) was created using the least squares method.
  • ⁇ indicates that the coefficient of determination of linear approximation line I is R2 ⁇ 0.99, meaning that there is linearity.
  • ⁇ indicates that the coefficient of determination is R2 ⁇ 0.99, meaning that there is no linearity.
  • ⁇ indicates that the coefficient of determination of linear approximation line I is R2 ⁇ 0.99, and that the coefficient of determination of linear approximation line II is the highest.
  • judgment value [MPFI]/[CPFI] ⁇ correction coefficient A.

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Abstract

核酸プローブを用いて、検査対象の遺伝子変異の存在割合を定量的に分析することができる遺伝子変異の検査方法を提供することを目的とする。　本発明の遺伝子変異の検査方法は、検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を実施する工程と、前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを、前記核酸増幅反応における反応液中の増幅産物を検出することにより確認する工程と、前記指数関数的増幅期にあることが確認された前記反応液に含まれる、前記遺伝子変異における検出対象塩基を含むターゲット核酸及び検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸を、前記ターゲット核酸における検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するターゲット核酸検出用核酸プローブと、前記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有する非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸に共通する共通領域であって前記検出対象塩基もしくは前記非検出対象塩基を含む領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブとを用いて検出する工程と、前記反応液に含まれるターゲット核酸を定量分析する工程とを含むことを特徴とする。

Description

遺伝子変異の検査方法及び検査装置
　本発明は、ＤＮＡチップ等に利用される核酸プローブを用いた遺伝子変異の検査方法及び検査装置に関する。
　癌をはじめとする様々な疾患において、原因となる遺伝子変異やマーカーとなる遺伝子変異が同定されている。また、癌の予後予測に関連する遺伝子変異や、薬の副作用に関連する遺伝子変異も同定されている。例えば、一塩基バリアント（Single Nucleotide Variant（ＳＮＶ））や、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism（ＳＮＰ））は、このような遺伝子変異の典型である。
　このような遺伝子変異を検査する一つのシステムとして、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイとも称す）を利用したシステムが知られている。ＤＮＡチップには、検査対象の遺伝子変異に対応した核酸プローブ（野生型に対応する野生型プローブと、変異型に対応する変異型プローブ）が基板に固定された構成を有する。被検査者から採取したゲノムＤＮＡを鋳型とし、検査対象の遺伝子変異を含む領域を挟みこむ一対のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、標識を有する核酸断片を得る。得られた核酸断片を含む溶液を所定の反応条件下でＤＮＡチップに接触させる。溶液中に遺伝子変異を有する核酸断片が含まれていれば、変異型プローブからのシグナルを検出することができる。
　上述したような基本原理により、被検査者のゲノムＤＮＡにおける遺伝子変異の有無を調べることができる。なお、遺伝子変異としてＳＮＶやＳＮＰに限らず、マイクロサテライトやＤＮＡメチル化、キメラ遺伝子検査においても同様に、配列に対応する核酸プローブを有するＤＮＡチップが用いられる。
　ところで、ＤＮＡチップを利用したシステムでは、上述したように、核酸増幅が終了した時点（エンドポイント）での核酸断片を用いて検査対象の遺伝子変異を有するものが含まれているかを検査することができる。言い換えれば、ＤＮＡチップを利用したシステムによれば、検査対象の遺伝子変異に関して定量的な測定をするのではなく、定性評価が可能となっている。
　一方、ＤＮＡチップを利用して核酸を定量するシステムとしては、特許文献１に開示されるように、ターゲット核酸とプローブとのハイブリダイズに基づくシグナル強度を測定し、既知量のオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリダイズに基づくシグナル強度と比較することで、ターゲット核酸の量を補正して定量するシステムが知られている。また、特許文献２には、リアルタイムＰＣＲによる定量分析又は定性分析と、ＤＮＡチップを用いた定性分析とを同時に単一の反応系で行う方法が開示されている。しかしこれらの先行技術では、ターゲット核酸の存在量（コピー数）を定量するための技術である。
特開２００７－０９７５７４号公報 特許第５６８９４４６号
　以上のように、ＤＮＡチップ等に利用されている核酸プローブを用いた遺伝子変異の検査では、検査対象の遺伝子変異の有無を測定する、又は存在量（コピー数）を定量するに過ぎず、野生型遺伝子に対する遺伝子変異の存在割合を定量分析することはできないといった問題があった。そこで、本発明は、核酸プローブを用いて、検査対象の遺伝子変異の存在割合を定量的に分析することができる遺伝子変異の検査方法及び検査装置を提供することを目的とする。
　上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、検査対象の遺伝子変異を含む核酸断片を核酸増幅反応により増幅する際、核酸増幅反応における反応液中の増幅産物を検出することにより核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認し、その後に指数関数的増幅期にある反応液に含まれる遺伝子変異を含む核酸断片を核酸プローブを用いて検出することで、当該遺伝子変異を定量的に分析できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の要旨は次のとおりである。
　（１）検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を実施する工程と、前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを、前記核酸増幅反応における反応液中の増幅産物を検出することにより確認する工程と、前記指数関数的増幅期にあることが確認された前記反応液に含まれる、前記遺伝子変異における検出対象塩基を含むターゲット核酸及び検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸を、前記ターゲット核酸における検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するターゲット核酸検出用核酸プローブと、前記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有する非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸に共通する共通領域であって前記検出対象塩基もしくは前記非検出対象塩基を含む領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブとを用いて検出する工程と、前記反応液に含まれるターゲット核酸を定量分析する工程とを含む、遺伝子変異の検査方法。
　（２）前記検出する工程では、前記ターゲット核酸検出用核酸プローブと、前記非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記共通プローブとを担体に固定したＤＮＡチップを使用する（１）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（３）前記検査対象の遺伝子変異を含む領域が複数であり、それぞれの前記領域について、前記核酸増幅反応を実施する工程と、前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認する工程とを行い、前記指数関数的増幅期にあることが確認された、それぞれの前記領域についての反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する（１）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（４）前記反応液が増幅検出用プローブを含み、前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認する工程、並びに前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸を検出する工程の両方を、前記増幅検出用プローブからのシグナルを検出することにより行う（１）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（５）前記増幅検出用プローブのＴｍ値が、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブのＴｍ値より高い（４）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（６）前記増幅検出用プローブは、前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸における、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブに相補的な配列を有する領域と重ならない領域に対して相補的な配列を有する（４）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（７）前記定量分析する工程では、前記ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度と、前記非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記共通プローブからのシグナル強度とに基づいて、検査対象の遺伝子変異における検出対象塩基の存在割合を算出する（１）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（８）前記定量分析する工程では、ターゲット核酸と非ターゲット核酸とを既知の割合で含むサンプルを複数用いて作成した検量線を用い、前記ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度と、前記非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記共通プローブからのシグナル強度とに基づいて、検査対象の遺伝子変異における検出対象塩基の存在割合を定量する（１）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（９）前記定量分析する工程では、式：［ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度］/([ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]+[非ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度])で算出した判定値、又は、式：[ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]/[共通プローブからのシグナル強度]で算出した判定値を用いる（１）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（１０）前記検出する工程は、前記非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸の存在下で行う（１）に記載の遺伝子変異の検査方法。
　（１１）検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを、前記核酸増幅反応における反応液中の増幅産物を検出することにより確認する核酸増幅反応検出部と、前記核酸増幅反応検出部から反応液が供給され、前記遺伝子変異における検出対象塩基を含むターゲット核酸における検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するターゲット核酸検出用核酸プローブと、検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有する非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸に共通する共通領域であって前記検出対象塩基もしくは前記非検出対象塩基を含む領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブとを用いて少なくともターゲット核酸を検出する検出部と、前記核酸増幅反応検出部から反応液を前記検出部に供給する送液装置とを備える遺伝子変異の検査装置。
　（１２）前記検出部は、前記ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び前記非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記共通プローブを担体に固定したＤＮＡチップを搭載するＤＮＡチップ搭載部を備える（１１）に記載の遺伝子変異の検査装置。
　（１３）前記核酸増幅反応検出部は、それぞれ別の検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を行う複数の反応槽を備え、前記送液装置は、前記検出部に反応液を供給する流路を前記複数の反応槽間で切り替える切替装置を含む（１１）に記載の遺伝子変異の検査装置。
　（１４）前記検出部は、前記共通プローブにて、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する（１１）に記載の遺伝子変異の検査装置。
　（１５）前記送液装置は、前記核酸増幅反応検出部と前記検出部とを連結する流路、当該流路上に配設されたバルブ、当該流路に接続されたポンプ装置を備える（１１）に記載の遺伝子変異の検査装置。
　（１６）前記検出部に対して、ハイブリダイズ緩衝液を供給するハイブリダイズ緩衝液タンクを備え、前記送液装置は、前記核酸増幅反応検出部から指数関数的増幅期にある核酸増幅反応の反応液を前記検出部に供給するとともに、前記ハイブリダイズ緩衝液タンクからハイブリダイズ緩衝液を前記検出部に供給する（１１）に記載の遺伝子変異の検査装置。
　（１７）前記ハイブリダイズ緩衝液は、前記非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を含む（１６）に記載の遺伝子変異の検査装置。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2024-112187号の開示内容を包含する。
　本発明に係る遺伝子変異の検査方法及び検査装置によれば、遺伝子変異に対応した核酸プローブを用いて、当該遺伝子変異を定量的に分析することができる。本発明に係る遺伝子変異の検査方法及び検査装置を適用することで、例えば、野生型に対する変異型の割合といった遺伝子変異の定量的な分析が可能となる。
野生型ＤＮＡを８０％及び変異型ＤＮＡを２０％の割合とした鋳型ＤＮＡを用いて核酸増幅反応を行ったときの、サーマルサイクル数を横軸とし、ＤＮＡ増幅量を縦軸とした特性図である。 本発明に係る遺伝子変異の検査装置の一例を模式的に示す構成図である。 本発明に係る遺伝子変異の検査装置を用いて遺伝子変異を検査する工程を示すフローチャートである。 本発明に係る遺伝子変異の検査装置の別の一例を模式的に示す構成図である。 本発明に係る遺伝子変異の検査装置のさらに別の一例を模式的に示す構成図である。 実施例１における、ＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ変異についてのＰＣＲ反応液を用いて得られた検量線を示す特性図である。 実施例１における、ＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ変異についてのＰＣＲ反応液を用いて得られた対数変換後検量線を示す特性図である。 実施例１で定量した変異割合と、実測した変異割合との関係を示す特性図である。 実施例２における、ＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ変異についてのＰＣＲ反応液を用いて得られた検量線を示す特性図である。 実施例２における、ＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ変異についてのＰＣＲ反応液を用いて得られた対数変換後検量線を示す特性図である。 実施例２で定量した変異割合と、実測した変異割合との関係を示す特性図である。
　本発明に係る遺伝子変異の検査方法及び検査装置は、検査対象の遺伝子変異を含むターゲット核酸を核酸プローブによって定量的に検出するものである。
　検査対象の遺伝子変異とは、一例として、一塩基バリアント（ＳＮＶ）や一塩基多型（ＳＮＰ）であり、ゲノムＤＮＡの所定の位置における塩基の相違を意味する。すなわち、特定の遺伝子変異については、複数の塩基が存在することとなる。このうち１つの塩基を以下の説明においては検出対象塩基と称し、検出対象塩基以外の塩基を非検出対象塩基と称する。
　検出対象塩基とは、例えばゲノムＤＮＡの所定の位置における所定の核酸残基を意味しており、特に限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）等の塩基配列における特定の塩基の種類を意味している。例えば、所定の一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうるとして、いずれか一方の塩基、すなわち当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすることができる。ここで、検出対象塩基としては、遺伝子多型におけるメジャーアレル及びマイナーアレルのいずれでも良いし、リスクアレルであってもなくても良い。
　ここで、ターゲット核酸とは、検出対象塩基を含む核酸分子、すなわち核酸断片を意味する。ターゲット核酸は、ＤＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＲＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＤＮＡとＲＮＡとを含む核酸分子（ＤＮＡ－ＲＮＡ複合体）でも良いし、セルフリーＤＮＡのように断片化されたものであっても良い。また、核酸としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル、並びに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）等の人工核酸を含む意味である。
　検出対象塩基を含むターゲット核酸は、遺伝子変異を含むゲノムＤＮＡ上の所定の領域を核酸増幅法により増幅することで調製することができる。また、ターゲット核酸としては、生物個体、組織及び細胞から採取した転写産物から逆転写反応により得られるｃＤＮＡとしても良い。ターゲット核酸の塩基長としては、特に限定されないが、例えば６０～１０００塩基とすることができ、６０～５００塩基とすることが好ましく、６０～２００塩基とすることがより好ましい。
　なお、検出対象塩基を含むターゲット核酸に対して、当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む核酸分子（核酸断片）を非ターゲット核酸と称する。例えば、ゲノムＤＮＡにおける所定の位置で取りうる複数の塩基のうち、１つの塩基を検出対象塩基とした場合、検出対象塩基以外の塩基を非検出対象塩基とする。より具体的に、所定の位置における一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうる場合、当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすると、当該一塩基多型におけるＣ（シトシン）が非検出対象塩基ということになる。
　また、例えば、所定の多型やバリアントにおける変異型（マイナーアレルの順鎖又は逆鎖）を検出対象塩基とした場合、当該変異型を含む核酸断片をターゲット核酸とし、非検出対象塩基である野生型（メジャーアレルの順鎖又は逆鎖）を含む核酸断片を非ターゲット核酸とすることができる。
　非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸は、所定の遺伝子変異についてゲノムＤＮＡ上に非検出対象塩基が存在する場合、上述のように検出対象塩基を含むターゲット核酸を取得する際に同時に取得される。例えば、ターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、一方のアレルが非検出対象塩基であれば、ターゲット核酸とともに非ターゲット核酸が増幅されることとなる。
　本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置では、検出対象塩基を含むターゲット核酸を検出するには、ターゲット核酸において、少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを使用する。核酸プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。また、検出対象塩基に相補的な塩基は、核酸プローブを構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなる核酸プローブについては５’末端又は３’末端方向に１つずれている場合を含む意味である。
　特に、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置では、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブを使用することができる。共通領域とは、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する塩基配列の領域であって、検出対象塩基及び非検出対象塩基を含まない領域である。例えば、共通領域は、ターゲット核酸を検出する核酸プローブがハイブリダイズする領域、非ターゲット核酸を検出する核酸プローブがハイブリダイズする領域と重複しない領域とすることができる。
　本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置では、ターゲット核酸と核酸プローブにおける核酸分子同士の相補的な結合を意味するハイブリダイゼーションを含むならば、如何なる系にも適用することができる。すなわち、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置は、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーションに基づくことができる。特に、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置は、担体（基板、中空繊維、微粒子を含む）に核酸プローブを固定し、固定化した核酸プローブを用いてターゲット核酸を検出（定性、定量を含む）する系に使用することが好ましい。より具体的に、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置は、核酸プローブを基板に固定したＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた系とすることが好ましい。
　以下、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置を、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いてターゲット核酸を検出する際に使用する系を例示的に説明する。なお、上述したターゲット核酸を検出するための核酸プローブ（ターゲット核酸検出用核酸プローブ）、非ターゲット核酸を検出するための核酸プローブ（非ターゲット核酸検出用核酸プローブ）及び共通プローブは、より好ましくは一本鎖ＤＮＡであり、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
　本例において、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブは、その５’末端又は３’末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイの形態で用いることが好ましい。担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン及びそれらの化合物等の貴金属、及びグラファイト、カーボンファイバーに代表される炭素等の導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素等に代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）等に代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス等の無機材料；ポリエチレン、ポリプロピレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホン等の有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
　なお担体として、好ましくは表面にダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Diamond Like Carbon）等のカーボン層と、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基及び活性エステル基等の化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、及びカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
　本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置では、このように作製したＤＮＡチップを用いて、被検者におけるターゲット核酸を定量的に分析することができる。具体的には、先ず、被検者由来の試料からＤＮＡを抽出する工程と、抽出したＤＮＡを鋳型とし、核酸増幅反応により検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する工程と、核酸増幅反応における指数関数的増幅期でＤＮＡチップを用いて少なくともターゲット核酸を検出する工程とを含む。
　被検者は通常ヒトであり、遺伝子変異を検査する対象であり、所定の遺伝子変異が関連する疾患に罹患した患者を挙げることができる。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿等）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織又は臓器の破砕物及び抽出物等が挙げられる。
　まず、被検者から採取した試料からＤＮＡを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばブレンダー、ミキサー、ホモジナイザーと呼ばれる破砕機によって細胞を破壊し、有機溶媒（フェノール／クロロホルム）を用いて精製しても良いし、界面活性剤によって細胞を破壊し、シリカカラムに吸着させて遠心分離しても良く、シリカコーティングされた磁性ビーズにＤＮＡを吸着させて、磁石で引き寄せてＤＮＡを分離しても良い。
　次に、得られたＤＮＡを鋳型として用いて増幅反応を行い、検査対象の遺伝子変異を含む核酸領域を、好ましくはＤＮＡを増幅させる。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーを予め標識しておく方法を使用しても良いし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用しても良い。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）やビオチン等の有機化合物等を使用することができる。
　また、この反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、増幅する領域に特異的な一対のプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸及び塩化マグネシウム等を含む反応系である。
　核酸増幅反応は、熱変性（denaturation）、アニーリング（annealing）及び伸長（extension）の３つの工程から構成される。この３つの工程を１つのサイクルとして、複数のサイクルを繰り返すことによって、検査対象の遺伝子変異を含む核酸断片を合成することができる。この３つの工程を繰り返す手順をサーマルサイクルと呼び、３つの工程の繰り返し回数をサーマルサイクル数と呼ぶ。
　また、核酸増幅反応は、２ステップＰＣＲと呼称される、アニーリングと伸長を同一温度で行うことで、熱変性工程とアニーリング及び伸長工程の２つの工程から構成されても良い。この場合、これら２つの工程を１つのサイクルとして繰り返すことによって、検査対象の遺伝子変異を含む核酸断片を合成することができる。この場合、これら２つの工程を繰り返す手順をサーマルサイクルと呼び、２つの工程の繰り返し回数をサーマルサイクル数と呼ぶ。
　熱変性（denaturation）工程は、鋳型となるＤＮＡを含む反応液を通常９０℃以上に加熱することで一本鎖ＤＮＡとする工程である。サーマルサイクルにおける初回の熱変性工程は、ゲノムＤＮＡを鋳型とする場合には比較的長い時間（１～５分）とすることが好ましい。また、２回目以降の熱変性工程は、二本鎖として得られた増幅産物を一本鎖とすることが目的となるため比較的短い時間（１～９０秒）とすることが好ましい。
　アニーリング（annealing）工程は、一本鎖となった鋳型のＤＮＡ及び一対のプライマーセットを含む反応液を通常４０～７５℃の範囲の温度とし、これらプライマーを鋳型ＤＮＡに特異的に結合（anneal）させる工程である。なお、アニーリング工程の温度は、プライマーの配列や長さに依存して適宜設定される。通常は、使用するプライマーのＴｍ値の±５℃の範囲でアニーリング工程の温度を設定する。
　伸長（extension）工程は、プライマーが鋳型ＤＮＡにアニーリングした状態で反応液の温度を約７２℃とし、耐熱性ポリメラーゼ（Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ等）によるプライマーの端部から相補鎖を合成する工程である。なお、この反応では、標識を付したプライマーからの鋳型ＤＮＡの相補鎖を合成するか、標識を付加したフリーのヌクレオチドを取り込みながら鋳型ＤＮＡの相補鎖を合成する。よって、検査対象の遺伝子変異について、検出対象塩基を含むターゲット核酸、非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸が標識されることとなる。伸長工程の時間は、増幅する核酸断片の長さ、使用する酵素の反応性に依存して適宜設定される。
　サーマルサイクルにおける指数関数的増幅期とは、サーマルサイクルにおいて増幅効率が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上となる期間である。ここで増幅効率とは、サイクル毎に増加する核酸断片量を割合で示した値である。すなわち、増幅効率が１００％であるとは、サイクル毎に増幅断片が２倍になることを意味する。よって指数関数的増幅期を規定する際、増幅効率の上限値は特に限定されず、例えば１００～１１０％の値とすることができる。
　本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置では、核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを、核酸増幅反応における反応液中の増幅産物を検出することにより確認する。より具体的には、蛍光色素（増幅検出用プローブ）を含む反応液を用いて核酸増幅反応を行い、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅をリアルタイムでモニタリングし、得られる蛍光強度値に基づいて核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認することができる。
　上記増幅検出用プローブとしては、PCRによる核酸増幅に伴い蛍光強度値が変化する蛍光プローブ等を特に限定されることなく利用することができる。増幅検出用蛍光プローブの例として、TaqMan（登録商標）プローブ、Eprobe（登録商標）、QProbe（登録商標）、２本鎖核酸に特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素（SYBR green I）等が挙げられる。TaqManプローブ法では、配列特異的なオリゴヌクレオチドにレポーターとクエンチャーを標識したプローブを用いる。PCR反応が進むと、TaqManプローブが加水分解され、レポーターとクエンチャーの距離が離れ、蛍光シグナルを発する。また、Eprobeは、通常はプローブにおける２つの蛍光色素部位が互いに結合して消光状態にあるが、鋳型となるDNAとハイブリダイズすることにより蛍光を発するものである。さらに、QProbeは、アニーリング時にPCR増幅産物に結合し、蛍光が減少するため、PCRにおけるアニーリング時の蛍光を測定し、その蛍光消光率の増加によって、核酸増幅反応の過程をモニタリングすることができる。なお、増幅検出用プローブは、増幅産物とターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブとのハイブリダイズ反応に影響しないように設計することが好ましい。
　そして、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置では、上記のように指数関数的増幅期にあることが確認された核酸増幅反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出し、これに基づいてターゲット核酸を定量的に分析することができる。ターゲット核酸を定量的に分析するには、ターゲット核酸検出用核酸プローブとターゲット核酸のハイブリダイゼーション反応を行い、ターゲット核酸検出用核酸プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。
　ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、５０℃で１６時間ハイブリダイズ反応させた後、２×ＳＳＣ／０．２％　ＳＤＳ、２５℃、１０分及び２×ＳＳＣ、２５℃、５分の条件で洗浄する条件をさす。すなわち、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物には、ハイブリダイゼーション反応に必要な塩、例えばＳＳＣや、公知のブロッキング剤、例えばＳＤＳが含まれていても良い。
　本発明に係る遺伝子変異の検査方法及び検査装置によって、ターゲット核酸を定量的に分析できることについて図１を用いて説明する。なお、図１は、野生型ＤＮＡを８０％及び変異型ＤＮＡを２０％の割合とした鋳型ＤＮＡを用いて核酸増幅反応を行い、サーマルサイクル数を横軸とし、ＤＮＡ増幅量を縦軸として示している。図１に示すように、鋳型ＤＮＡに含まれる野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとの比率である８０：２０は、サーマルサイクルの終了時の近傍では維持されていない。よって、サーマルサイクル終了後の反応液を用いてターゲット核酸を定量的に分析することはできないことが判る。一方、図１の破線で示した範囲、すなわち、サーマルサイクルにおける指数関数的増幅期においては、鋳型ＤＮＡに含まれる野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとの比率である８０：２０がおおよそ維持されている。したがって、サーマルサイクルにおける指数関数的増幅期においてターゲット核酸を検出することによって、ターゲット核酸の定量的な分析が可能となる。
　より具体的には、指数関数的増幅期における核酸増幅反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出することで、ターゲット核酸と非ターゲット核酸の存在割合（すなわち、変異割合）を算出することができる。
　具体的には、ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び非ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナルに基づいてターゲット核酸を定量的に分析する場合、具体的には、ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び非ターゲット核酸検出用核酸プローブにおけるシグナル強度をそれぞれ測定し、ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度を評価するための判定値を算出する。判定値の算出例としては、例えば、式：[ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]/([ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]+[非ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度])を使用する方法が挙げられる。
　ところで、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置は、上述した構成に限定されず、核酸増幅反応液中の非ターゲット核酸が、ターゲット核酸検出用核酸プローブに非特異的にハイブリダイズすることを防止するため、いわゆるブロッキング用核酸を使用することもできる。ブロッキング用核酸は、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液と混合しておき、得られた混合液をＤＮＡチップに接触させてターゲット核酸とターゲット核酸検出用核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を進行させることができる。また、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液と、ブロッキング用核酸を含む溶液とをＤＮＡチップ上にて混合して、ターゲット核酸とターゲット核酸検出用核酸プローブとの特異的なハイブリダイズを同時に進行させても良い。これらいずれの場合でも、ブロッキング用核酸が非ターゲット核酸にハイブリダイズすることで、非ターゲット核酸がターゲット核酸検出用核酸プローブとハイブリダイズすることを防止できる。
　ブロッキング用核酸は、非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有する。よって、ブロッキング用核酸は、検出対象塩基を有するターゲット核酸と核酸プローブとがハイブリダイズできる条件下において、非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とハイブリダイズすることができる。
　ブロッキング用核酸において、非検出対象塩基に対応する塩基の位置は特に限定されない。また、ブロッキング用核酸としては、特に限定されないが、核酸プローブの塩基長に対して６０％以上の長さであることが好ましい。また、ブロッキング用核酸は、核酸プローブの塩基長に対して１４０％以下の長さであることが好ましい。例えば核酸プローブの長さが２５塩基長とすると、ブロッキング用核酸の塩基長は１５～３５塩基長であることが好ましい。
　さらに、ブロッキング用核酸は、非ターゲット核酸に含まれる非検出対象塩基以外の塩基に対応する位置にミスマッチな塩基（相補的でない塩基）を含んでいても良い。ブロッキング用核酸が１５塩基長である場合、ミスマッチな塩基は１～３個とすることができ、１～２個であることが好ましい。また、ブロッキング用核酸が２５塩基長である場合、ミスマッチな塩基は１～５個とすることができ、１～４個であることが好ましい。
　さらにまた、ブロッキング用核酸の濃度は、特に限定されないが、例えば、非ターゲット核酸の濃度及び/又はターゲット核酸の濃度に応じて、又はプライマー濃度に応じて適宜設定することができる。具体的にブロッキング用核酸の組成物中の濃度は、０．０１～２μＭとすることができ、０．０２～１．５μＭとすることが好ましく、０．０５～１．５μＭとすることがより好ましい。
　なお、ブロッキング用核酸を使用して、非ターゲット核酸とターゲット核酸検出用核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを防止した場合、非ターゲット核酸と非ターゲット核酸検出用核酸プローブとの特異的なハイブリダイズもまた阻害されることとなる。この場合、非ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度が大きく低下する。この場合、上記の式：[ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]/([ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]+[非ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度])による判定値は、ターゲット核酸の定量的な分析には不十分である可能性がある。この場合、ターゲット核酸と非ターゲット核酸との総量を共通プローブで測定することが好ましい。
　共通プローブは、上述したように、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する共通領域に対して相補的な配列を有している。よって、共通プローブは、ブロッキング用核酸が非ターゲット核酸とハイブリダイズしていたとしても、同じ非ターゲット核酸とハイブリダイズすることができる。
　共通プローブを使用する場合、上述した判定値を算出する式としては、[ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]/[共通プローブからのシグナル強度]を適用することができる。この式によれば、ブロッキング用核酸の影響を排除して、ターゲット核酸と非ターゲット核酸を併せた全体に対するターゲット核酸の割合を算出することができる。なお、変異型を含む核酸断片をターゲット核酸とする場合、以下では、「ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度」を「MPFI」（Mutant Probe Fluorescent Intensity）、「共通プローブからのシグナル強度」を「CPFI」（Common Probe Fluorescent Intensity）と称することがある。
　また、予め検量線を作成しておくことでターゲット核酸について絶対定量することができる。検量線としては、様々な既知の変異割合サンプル（ターゲット核酸と非ターゲット核酸を既知の割合で含むサンプル）を用いて、指数関数的増幅期における核酸増幅反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出し、上記式で算出した判定値から作成することができる。すなわち、検量線は、上述したように算出した判定値と、核酸増幅反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸の割合やターゲット核酸の量との関係を表している。
　検量線の作成方法としては、特に限定されないが、核酸増幅反応において予め設定した蛍光強度を指数関数的増幅期とし、当該蛍光強度におけるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出し、上記式で算出した判定値から検量線を作成する方法を挙げることができる。あるいは、検量線の作成方法としては、既知の変異割合サンプルを用いた核酸増幅反応で得られる増幅曲線に基づいて指数関数的増幅期（増幅曲線において直線性が高い領域）を調べ、指数関数的増幅期のサーマルサイクル数を決定し、当該サーマルサイクル数におけるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出し、上記式で算出した判定値から検量線を作成する方法を挙げることができる。
　ここで、検量線はy=xの一次直線となることが理想だが、種々の誤差（作業者による誤差、試薬の誤差、測定機器の誤差等）によって、y=ax+bとなることが多い。そのため、検量線の傾きaと切片bをそれぞれ正規化することで、y=xに近づけることができる。
　具体的には、基準の変異割合としたサンプル（例えば、変異割合100%サンプル）を用いて、核酸増幅反応を行い、所定の間隔（例えば１サイクル毎）で反応液の蛍光を検出し、予め設定した蛍光強度に到達した反応液を取り出し、反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する。ここでは、増幅検出用蛍光プローブにより反応液の蛍光を検出し、ターゲット核酸検出用核酸プローブによりターゲット核酸を検出し、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を共通プローブで検出するものとする。
　まず、指数関数的増幅期を決定する方法として、増幅検出用蛍光プローブの増幅曲線から指数関数的増幅期を決定する方法が挙げられる。具体的には、予め定めた閾値に到達した蛍光強度で指数関数的増幅期を計算する方法が知られている。しかし、この方法は検出するダイナミックレンジが変わる場合においては適さない場合がある。そこで、例えば、以下の方法により指数関数的増幅期を計算することができる。
　指数関数的増幅期の蛍光強度閾値を決定する方法としては、まず、増幅検出用蛍光プローブから得られた核酸断片の増幅曲線により、到達した蛍光強度値を増幅検出用蛍光プローブのダイナミックレンジの上限値として、いくつかの仮の蛍光強度閾値（Tentative Threshold Probe Fluorescent Intensity、以下TTh.PFI）を設定する。そして、設定したTTh.PFIにおいて、反応液を取り出し、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブからのシグナル強度に基づき上記式によって判定値を算出し、得られた検量線の直線性から真の蛍光強度閾値（Th.PFI）を決定する。なお、増幅検出用蛍光プローブで検出した核酸断片の増幅曲線から回帰分析等を行うことによって指数関数的増幅期を決定しても良い。
　TTh.PFIにおける判定値の算出では、変異割合100%サンプルから得られた判定値の逆数を補正係数として使用することができる。この補正係数は変異割合100%サンプルを含む既知の変異割合サンプル（例えば変異割合1%サンプル、10%サンプル、50%サンプル、100%サンプル等）から得られた判定値に乗じることで、検量線の傾きaを補正することができる。より具体的には、変異割合100%サンプルについて、[ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]/[共通プローブからのシグナル強度]で判定値を求めた場合、補正係数＝[共通プローブからのシグナル強度]/[ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]を求める。そして、様々な既知の変異割合サンプルについて算出した判定値に当該補正係数を乗ずることで、様々な既知の変異割合サンプルについて算出した判定値から補正後の判定値を算出することができる。補正後の判定値は、変異割合100%サンプルにおける判定値が１で、その他の変異割合サンプルにおける判定値が０以上１以下の範囲に分布することとなる。
　次に、傾きaを正規化した既知変異割合サンプルを元に、横軸に補正後判定値（判定値×補正係数）、縦軸に既知変異割合をプロットした散布図を作成し、最小二乗法によって線形近似直線を得ることができる。この時、横軸の変化率と縦軸の変化率の比は一定となることから、両軸を対数化することで切片bを正確に補正することができる。
　このような手順により、傾きaと切片bを補正することができ、種々の誤差を正規化した検量線を得ることができる。
　判定値を算出するためのMPFIとCPFIを求める方法としては、例えば、蛍光強度と温度サイクル値との関係について近似曲線を作成する方法が挙げられる。この方法では、作成した近似曲線において、予め設定したTTh.PFIとなるMPFIとCPFIを求めることができる。なお、近似曲線としては、回帰分析によって得られる近似曲線であれば特に限定されず、例えば、線形近似曲線、指数近似曲線、対数近似曲線、多項近似曲線、累乗近似曲線、冪乗近似曲線、移動平均曲線、シグモイド曲線を挙げることができる。
　以上のようにして、予め設定したTTh.PFIのときの検量線を作成することができる。本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置は、上述のように作成した検量線を使用しても良いが、複数のTTh.PFIを設定して同様に検量線を作成し、複数の検量線のなかから、補正後の判定値と変異割合との関係がより直線的である検量線（Th.PFI）を選択して使用することが好ましい。
　複数のTTh.PFIとしては、その値が等間隔となるように適宜設定することができる。例えば、１６ビットのカメラによって撮影する場合の蛍光強度は65535が上限値となり、TTh.PFIの等間隔幅としては1～65535の範囲、好ましくは5～50000の範囲、より好ましくは10～10000の幅となるように複数のTTh.PFIを設定することができる。このような範囲の幅で設定した複数のTTh.PFIについて検量線を作成し、より直線性の高い検量線を選択する。具体的には、得られた複数の検量線について決定係数R2を算出し、決定係数R2がより１に近い検量線を、より直線性の高い検量線として選択することができる。しかし、複数の露光画像を用いて、近似直線を描き、蛍光強度を外挿することもできる。このような場合、TTh.PFIの等間隔幅も拡張されるため、拡張された最大値を上限値として、TTh.PFIの等間隔幅を設定することもできる。
　また、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置では、上述した補正後判定値と変異割合との関係を示す検量線を使用する形態に限定されず、検量線を示す式の両辺を対数変換した「対数変換後の検量線」を併せて使用することが好ましい。
　すなわち、上述のように複数のTTh.PFIについて検量線を作成し、さらに作成した検量線に対応する対数変換後検量線も作成することが好ましい。補正後判定値と変異割合との関係を示す検量線と対数変換後検量線のセットを複数のTTh.PFIについて作成した後、双方の検量線について直線性が高いセットを選択する。具体的には、補正後判定値と変異割合との関係を示す検量線の決定係数が所定の値（例えば、R2≧0.99）を超えたもののうち、対応する対数変換後検量線における決定係数が最も高い検量線のセットを選択する。本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置では、選択したセットに含まれる検量線を使用することができる。
　また、指数関数的増幅期の蛍光強度閾値を決定する方法としては、上述した方法のほかに、増幅産物とコピー数が同等の疑似ターゲットを用いる方法が挙げられる。疑似ターゲットのコピー数を指数関数的増幅期の増幅産物と同等に揃えて反応させることで、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ、及び共通プローブのダイナミックレンジを計算することができる。疑似ターゲットは複数揃えて上記と同様の手順でTh.PFIを算出しても良く、単一の疑似ターゲットから得られた結果を基にＴｍ計算によって算出しても良い。疑似ターゲットとしては、例えばオリゴヌクレオチドＤＮＡやプラスミドＤＮＡといった合成ＤＮＡや、標的核酸をスパイクさせたＤＮＡ等が挙げられる。これらの疑似ターゲットには予め蛍光物質が標識されていることで、冷却CCDカメラ等の検出系を用いてターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ、及び共通プローブの存在量を測定することができ、これらのダイナミックレンジを決定することができる。
　また、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ、及び共通プローブのダイナミックレンジを分析装置等を用いて測定しておくこともできる。この場合、SEM、TEM、XRD、XPS、AES、GDS、エリプソメーター、吸光測定といった表面分析方法が挙げられる。これらの分光装置を用いてDNAチップ表面に存在するターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ、および共通プローブの存在量を測定することにより、ダイナミックレンジを決定することができる。
　以上のように作成した検量線を使用することで、被検者におけるターゲット核酸の割合（変異割合）を分析することができる。具体的には、指数関数的増幅期にあることを確認した核酸増幅反応の反応液の一部又は全部を取り出し、取り出した反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する。具体的には、例えば、ターゲット核酸検出用核酸プローブで観察された蛍光強度（MPFI）と、共通プローブで観察された蛍光強度（CPFI）とから判定値を算出し、それに補正係数を乗じて補正後判定値を算出し、検量線に基づいて変異割合を分析することができる。
　また、本発明にかかる遺伝子変異の検査方法及び検査装置においては、検査対象の遺伝子変異を含む領域が複数である場合に、それぞれの遺伝子変異の定量的な分析を行うことができる。例えば、骨髄増殖性腫瘍（MPN：Myeloproliferative neoplasms）には、３つの遺伝子：JAK2、CALR及びMPLを含む複数の遺伝子の変異が関わるとされており、このような複数の遺伝子変異を検査対象として定量分析を行うことができる。具体的には、遺伝子変異を含むそれぞれの領域について、核酸増幅反応を実施する工程と、核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認する工程とを行った後、指数関数的増幅期にある各反応液を統合して、得られた反応液に含まれる、それぞれの遺伝子変異に対応するターゲット核酸及び非ターゲット核酸を、対応するターゲット核酸検出用核酸プローブと、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は共通プローブとによって検出することができる。それぞれの遺伝子変異を含む領域について核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認した反応液（定量に最適なタイミングにある反応液）のみを用いて次の検出工程を行うため、各ターゲット核酸の定量的な分析をより高精度に行うことができる。
　検出工程においては、１つのＤＮＡチップで複数の遺伝子変異を検査できるように、検出対象塩基が異なる多数の核酸プローブを配置することができる。すなわち、複数の遺伝子変異のそれぞれに対応する、ターゲット核酸検出用核酸プローブと、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は共通プローブとが担体に固定されたＤＮＡチップを使用して検出を行うことができる。そして、各反応液においては、それぞれ相異なる遺伝子変異を含む領域に特異的な一対のプライマーセットを用いて上述した核酸増幅反応を行い、それぞれの反応液から、その反応液にとって指数関数的増幅期にある最適なタイミングで反応液の一部又は全部をサンプリングし、１つのＤＮＡチップを使用して複数の遺伝子変異についてターゲット核酸を定量的に分析することができる。
　なお、上述の実施形態では、核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認するため増幅検出用蛍光プローブを用いて反応液の蛍光を検出し、その一方で、ターゲット核酸の定量分析を行う際には、予め標識を付加したプライマーや増幅反応の基質として標識ヌクレオチドを使用し、それらの標識の蛍光を測定することで、ターゲット核酸検出用核酸プローブにハイブリダイズしたターゲット核酸を検出する例について説明したが、これに限られない。すなわち、反応液に含まれる増幅検出用蛍光プローブを利用し、核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認する工程と、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する工程の両方を、増幅検出用蛍光プローブの蛍光を検出することにより行っても良い。この場合、プライマーや基質となるヌクレオチドに付加する標識を省略することができる。このように検出する工程においても増幅検出用蛍光プローブを利用する場合は、ＤＮＡチップ上のターゲット核酸検出用核酸プローブにターゲット核酸がハイブリダイズした状態でも発光する増幅検出用蛍光プローブを選択する必要があり、適用可能な増幅検出用蛍光プローブの例としてEprobe（登録商標）を挙げることができる。また、Eprobe等の増幅検出用プローブをターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する工程においても利用する場合には、増幅検出用プローブのＴｍ値が、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブのＴｍ値より高くなるように設計することが好ましい。これにより、増幅産物が各プローブにハイブリダイズした状態において増幅産物と増幅検出用プローブとが解離することがなく、各プローブにハイブリダイズした増幅産物（ターゲット核酸及び非ターゲット核酸）を適切に検出することができる。さらに、増幅検出用プローブを検出工程において利用する場合には、増幅検出用プローブは、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸における、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブに相補的な配列を有する領域と重ならない領域に対して相補的な配列を有するように設計することが好ましい。これにより、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の各プローブへのハイブリダイズが阻害されず、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の検出が円滑に行われる。
　以下、本発明にかかる遺伝子変異の検査装置について図面を参照して説明する。図２に模式的に示すように検査装置１は、検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を行い、その核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを、核酸増幅反応における反応液中の増幅産物を検出することにより確認する核酸増幅反応検出部２と、核酸増幅反応検出部２から反応液が供給されるとともに当該反応液に含まれるターゲット核酸を検出する検出部３とを備えている。核酸増幅反応検出部２は、核酸増幅反応に必要な試薬や物質を溜める反応槽４と、反応槽４内の反応液を所定の温度に制御する第１温度制御部５とを備えており、さらに、反応液からの蛍光を測定するため、反応槽４の表面は少なくとも一部が透明であり、その透明部分に対向する位置に配設された撮像部９Ａを備えている。検出部３は、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブ等を有するＤＮＡチップ６を搭載するＤＮＡチップ搭載部７と、ＤＮＡチップ搭載部７に搭載されたＤＮＡチップ６に供給されるハイブリダイズ反応液を所定の温度に制御する第２温度制御部８と、ＤＮＡチップ６の各種プローブが固定された表面に対向する位置に配設された撮像部９Ｂとを備えている。検査装置１において、核酸増幅反応検出部２と検出部３とは、溶液が通過できる流路１０を介して連結されている。なお、第１温度制御部５及び第２温度制御部８は、熱伝導性の高い金属ブロック及び当該金属ブロックを加熱/冷却する温度制御装置を備える。
　また、検査装置１は、流路１１を介してＤＮＡチップ搭載部７と連結されたハイブリダイズ緩衝液タンク１２、流路１３を介してＤＮＡチップ搭載部７と連結された洗浄液タンク１４を備えている。さらに、検査装置１は、流路１５を介してＤＮＡチップ搭載部７と連結された廃液槽１６を備えている。さらにまた、検査装置１は、廃液槽１６に流路１７を介して連結されたポンプ装置１８を備えている。
　なお、検査装置１において、流路１０、１１、１３及び１５の途中に送液遮断バルブ１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ及び１９Ｄが配設されている。また、検査装置１において、反応槽４、ハイブリダイズ緩衝液タンク１２、洗浄液タンク１４及び廃液槽１６にはそれぞれ吸気バルブ２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ及び２０Ｄが取り付けられている。これら送液遮断バルブ１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ及び１９Ｄにより流路を開閉することができ、ポンプ装置１８の圧力を送液したい流路へと誘導する。すなわち、検査装置１は、ポンプ装置１８と、送液遮断バルブ１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ及び１９Ｄと、吸気バルブ２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ及び２０Ｄとを含む送液装置を備えている。この送液装置によれば、流路１０、１１及び１３を介して検出部３へ各種溶液を送液することができ、流路１５を介して廃液槽１６へ廃液を送液することができる。
　また、これら送液遮断バルブ１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ及び１９Ｄは、温度変動に伴って反応槽４やＤＮＡチップ搭載部７内の試薬が一時的に膨張、収縮する場合、流路で繋がった別の部位に移動させることができる。送液遮断バルブとしては、特に限定されないが、疎水性あるいは親水処理を施したもの、熱等によって形状変化する素材といったものを限定されることなく使用できるが、外部応力によって物理的に開閉可能な形状が好ましく、一例としてはアクチュエータによって押さえつけるダイヤフラムバルブ、あるいは回転によって開閉される回転バルブを使用することが好ましい。
　以上のように構成された検査装置１では、上述したように、指数関数的増幅期にあることを確認した核酸増幅反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出し、これに基づいてターゲット核酸を定量的に分析することができる。ターゲット核酸を定量的に分析するフローチャートを図３に示す。ターゲット核酸を定量的に分析するには、先ず、反応槽４において、検査対象の遺伝子変異を含む領域の核酸増幅反応を行う。このとき、反応槽４には、核酸増幅反応に必要な試薬類からなる反応液が充填される。反応槽４に対する反応液の充填は操作者が行っても良いし、図示しない異なる流路から反応槽４に充填されても良い。また、核酸増幅反応におけるサーマルサイクルを予め設定しておくことで、設定したサーマルサイクルに従って第１温度制御部５が反応槽４内の反応液の温度、処理時間を制御することができる。
　検査装置１では、反応槽４内の反応液に含まれる増幅検出用蛍光プローブによって生ずる蛍光を撮像部９Ａにより測定し、核酸増幅反応を蛍光強度によってモニタリングする。そして、指数関数的増幅期に対応する所定の蛍光強度が観測された時点で、反応液の一部又は全部を取り出し、ＤＮＡチップ６を搭載しているＤＮＡチップ搭載部７へと送液する。具体的には吸気バルブ２０Ａ及び送液遮断バルブ１９Ａ及び１９Ｄを開放し、その他の吸気バルブ２０Ｂ、２０Ｃ及び２０Ｄ並びに送液遮断バルブ１９Ｂ及び１９Ｃを閉塞した状態で、ポンプ装置１８を作動させることで反応槽４内の反応液をＤＮＡチップ搭載部７へ送液することができる。
　このとき、検査装置１では、第１温度制御部５によるサーマルサイクルを一時中断し、サーマルサイクルの１つの温度域（例えば９５℃）で送液が完了するまで待機するように設定することができる。
　また、ＤＮＡチップ搭載部７には、反応液に加えて、ハイブリダイズ緩衝液タンク１２からハイブリダイズ緩衝液が供給される。ハイブリダイズ緩衝液をＤＮＡチップ搭載部７に供給（送液）するには、吸気バルブ２０Ｂ及び送液遮断バルブ１９Ｂ及び１９Ｄを開放し、その他の吸気バルブ２０Ａ、２０Ｃ及び２０Ｄ並びに送液遮断バルブ１９Ａ及び１９Ｃを閉塞した状態で、ポンプ装置１８を作動させる。これにより、ハイブリダイズ緩衝液タンク１２内のハイブリダイズ緩衝液をＤＮＡチップ搭載部７へ送液することができる。なお、ハイブリダイズ緩衝液は、上述したブロッキング用核酸を含む組成とすることができる。
　これにより、ＤＮＡチップ搭載部７において、反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸と、ＤＮＡチップ６の各種プローブとのハイブリダイズが進行する。このとき、ＤＮＡチップ搭載部７に供給された溶液の温度を第２温度制御部８が予め設定されたハイブリダイズ温度に調節する。また、第２温度制御部８は、必要な場合は反応前に予備加熱することもできる。なお、本例では、反応液とハイブリダイズ緩衝液とをそれぞれ異なる流路で別途送液しているが、反応液とハイブリダイズ緩衝液を混合してから混合液をＤＮＡチップ搭載部７に送液することもできる。
　次に、検査装置１では、検出部３にてプローブにハイブリダイズしたターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する。具体的には、先ず、ＤＮＡチップ搭載部７に洗浄液を送液し、ＤＮＡチップ６を洗浄する。洗浄液は、洗浄液タンク１４から送液することができる。洗浄液をＤＮＡチップ搭載部７に供給（送液）するには、吸気バルブ２０Ｃ及び送液遮断バルブ１９Ｃ及び１９Ｄを開放し、その他の吸気バルブ２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｄ並びに送液遮断バルブ１９Ａ及び１９Ｂを閉塞した状態で、ポンプ装置１８を作動させる。この洗浄時において、第２温度制御部８は、ハイブリダイズ反応温度よりも低い洗浄温度（例えば２５℃）へ下げることもできる。
　なお、ＤＮＡチップ６を洗浄する際には、反応液とハイブリダイズ緩衝液との混合液を廃液槽１６に廃液した後、上述のように洗浄液を送液しても良いし、上述のように洗浄液を送液することで反応液とハイブリダイズ緩衝液との混合液を廃液槽１６に廃液しても良い。
　そして、ＤＮＡチップ６におけるターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブを固定した表面を撮像部９Ｂで撮像し、図示しないコンピュータにおいて画像解析ソフトにより各プローブにおけるシグナル強度を測定する。また、測定したシグナル強度に基づいて、同コンピュータにてターゲット核酸を定量的に分析することができる。
　以上のように、本発明にかかる検査装置１を利用することで、核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認した核酸増幅反応液を送液してＤＮＡチップ６を用いた各プローブとのハイブリダイズ反応に基づいてターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出することができる。上述した例では、反応槽４とＤＮＡチップ搭載部７とを流路１０を介して連結するとともに、ポンプ装置１８と送液遮断バルブ１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ及び１９Ｄと吸気バルブ２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ及び２０Ｄといった構成により核酸増幅反応液を送液していた。しかし、核酸増幅反応液を送液する機構（送液装置）としては、このような構成に限定されず、駆動アームに配設したピペット装置を用いて核酸増幅反応液の一部又は全部を供給することもできる。
　また、図２に示した検査装置１では、ポンプ装置１８が吸引することで上述した送液動作を行っていた。しかし、検査装置１は、核酸増幅反応検出部２、ハイブリダイズ緩衝液タンク１２及び洗浄液タンク１４の上流に接続された加圧ポンプを使用することで上述した送液動作を行うことも可能である。
　また、図２に示した検査装置１では、流路１１を介してＤＮＡチップ搭載部７と連結されたハイブリダイズ緩衝液タンク１２から直接、ＤＮＡチップ搭載部７へとハイブリダイズ緩衝液が送られていたが、直接でなく予め流路１０に合流してからＤＮＡチップ搭載部７へ送られても良い。
　さらに、図２に示した検査装置１では、ＤＮＡチップ６を搭載できるＤＮＡチップ搭載部７を備え、ＤＮＡチップ６を着脱可能な構成とした。しかし、検査装置１は、このような構成に限定されず、検出部３に各プローブを直接固定した構成であっても良い。
　また、図２に示した検査装置１では、必要に応じて、核酸増幅反応検出部２の上流に、被検者由来の試料から鋳型となるＤＮＡを抽出する核酸抽出部（図示せず）を備えていても良い。核酸抽出部は、細胞を破壊するためのブレンダー、ミキサー、ホモジナイザー等の破砕機や、有機溶媒（フェノール／クロロホルム）、シリカメンブレン、陰イオン交換樹脂カラム、磁性ビーズ等を含む核酸抽出装置から構成することができる。
　核酸抽出部において抽出されたＤＮＡは、核酸増幅反応に必要な試薬類と混合され、流路を介して連結された核酸増幅反応検出部２の反応槽４内に送液される。抽出されたＤＮＡと試薬類との混合操作は、ＤＮＡ及び試薬類のそれぞれを反応槽４へ充填した後に行っても良い。すなわち、ＤＮＡ及び試薬類を別々に反応槽４へ充填し、反応槽４内において充填されたＤＮＡ及び試薬類を混合することができる。あるいは、予めＤＮＡ及び試薬類を混合し、得られた混合物を反応槽４へ充填するように構成しても良い。
　図４は、本発明に係る遺伝子変異の検査装置の別の一例を模式的に示す構成図である。図２に示した検査装置１では、一つの反応槽４を有する核酸増幅反応検出部２から核酸増幅反応液を送液するものであったが、本発明の検査装置はこのような構成に限定されるものではない。すなわち、図４に模式的に示すように、本発明に係る遺伝子変異の検査装置１は、複数（図４の例では５つ）の反応槽４を有する核酸増幅反応検出部２を備える構成であっても良い。この場合、複数の反応槽４に対しては、１つの第１温度制御部５により一括して温度制御しても良いし、複数の第１温度制御部５によりそれぞれ個別に温度制御しても良い。
　また、図４の検査装置１は、複数の反応槽４のそれぞれに接続された流路と、当該流路上に配設され、検出部３に反応液を供給する流路を複数の反応槽４間で切り換える切替装置とを有する送液装置を備える。図４の検査装置１では、複数の反応槽４のそれぞれと検出部３とは流路１０を介して連結されており、流路１０の途中には送液遮断バルブ１９Ａが配設されている。また、各反応槽４には吸気バルブ２０Ａが取り付けられている。複数の反応槽４に接続されたこれらの送液遮断バルブ１９Ａ及び吸気バルブ２０Ａが、全体として、検出部３に反応液を供給する流路を複数の反応槽４間で切り換える切替装置として機能する。すなわち、複数の反応槽４のうちの特定の反応槽に接続された送液遮断バルブ１９Ａ及び吸気バルブ２０Ａを適切なタイミングで開放することにより、ポンプ装置１８の圧力を送液したい流路１０へと誘導し、複数の反応槽４のうち１つの反応槽４と検出部３とを連通させることができる。なお、切替装置は、必要に応じて、それぞれの送液遮断バルブ１９Ａ及び吸気バルブ２０Ａの開放・閉塞のタイミングを制御するための制御装置を備えることができる。
　図４の検査装置１においては、核酸増幅反応検出部２の複数の反応槽４が、それぞれ別の検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を行うように構成することができる。そして、ＤＮＡチップ搭載部７に搭載されるＤＮＡチップ６には、それぞれの遺伝子変異に対応する、ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は共通プローブが担体に固定されており、複数の反応槽４内の反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出することができる。
　それぞれの反応槽４からＤＮＡチップ搭載部７へ送られた反応液は混合され、そして図２と同様にＤＮＡチップ搭載部７でハイブリダイズ反応、洗浄工程を経て検出が行われる。これにより反応液とＤＮＡチップ６上のプローブとのハイブリダイズ反応を行う工程が１回で済み、効率的な定量分析が可能となる。
　なお、図４では、各反応槽４からＤＮＡチップ搭載部7に至る流路１０はＤＮＡチップ搭載部７の手前で合流しているが、各反応槽４からの反応液の合流、混合をスムーズに行うための貯留部を合流部位に設けても良い。また、ポンプ装置１８は図示の構成に限らず、各反応槽４の上流側に加圧ポンプを接続する構成でも良い。
　それぞれ別の検査対象の遺伝子変異を含む複数の領域を増幅する方法としては、図４の検査装置１を用いるほか、図２の検査装置１においてそれぞれの領域ごとに異なる蛍光色の増幅検出用蛍光プローブを用いることで実施することもできる。
　図５は、本発明に係る遺伝子変異の検査装置のさらに別の一例を模式的に示す構成図である。図５の検査装置１では、図４の例と同様に、複数の反応槽４を有する核酸増幅反応検出部２を備えている。
　そして図４とは異なり、各反応槽４からの流路はそれぞれ独立したＤＮＡチップ搭載部７に接続され、これら複数のＤＮＡチップ搭載部７により検出部３が構成されている。また図５では、各反応槽４の吸気バルブ２０Ａの上流側に接続ポート２１が設けられている。さらに、ハイブリダイズ緩衝液タンク、洗浄液タンクはＤＮＡチップ搭載部７に直接には接続されておらず、図示していない。
　図５の検査装置１において、各反応槽４に接続ポート２１から核酸増幅反応に必要な試薬類からなる反応液が充填され、指数関数的増幅期に対応する所定の蛍光強度が観測されるまで核酸増幅反応を行う点は、図２に示した検査装置１と同様である。
　図５においては、反応液が指数関数的増幅期にあることが確認されると、接続ポート２１へ引き戻し、接続ポート２１にハイブリダイズ緩衝液を注入して接続ポート２１で反応液と混合し、混合液をＤＮＡチップ搭載部７に送液する。その後、ＤＮＡチップ搭載部７において反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸とＤＮＡチップ６の各種プローブとのハイブリダイズを行う点は図２と同様である。反応槽４から反応液をＤＮＡチップ搭載部７へ送液する際には、所定の吸気バルブ２０Ａとそれに対応する送液遮断バルブ１９Ａ及び１９Ｄを開放し、ポンプ装置１８を作動させることにより行う。
　次に、接続ポート２１から、余分な試薬を洗浄するための洗浄液を反応槽４を介してＤＮＡチップ搭載部７に送液し、ＤＮＡチップ６を洗浄して廃液槽１６に排出する。続いて、接続ポート２１から、リンス液を反応槽４を介してＤＮＡチップ搭載部７に送液し、ＤＮＡチップ６をリンスして廃液槽１６に排出する。洗浄液及びリンス液を反応槽４からＤＮＡチップ搭載部７へ送液し、その後に廃液槽１６に排出する際には、反応液を送液する場合と同様に、所定の吸気バルブ２０Ａとそれに対応する送液遮断バルブ１９Ａ及び１９Ｄを開放し、ポンプ装置１８を作動させることにより行う。その後、撮像部９ＢでＤＮＡチップ６を撮像し、各プローブにおけるシグナル強度を測定、解析する点は、図２と同様である。
　接続ポート２１からの各種液体の注入は操作者が行っても良いし、図示しない各種液体のタンクを流路によって接続ポート２１に接続して行っても良い。
　図５の装置では、廃液槽１６の直前に流路を合流させるため、反応液のロスが少なく、流路設計を単純化、小型化することができる。また、図５の装置では、ポンプ装置１８を廃液槽１６の下流に配置しているが、この構成に限定されるものではなく、接続ポート２１の上流に加圧ポンプを接続し、その加圧ポンプを作動させることにより送液を行っても良い。
　なお、図４の装置と図５の装置は択一的ではなく、複数の領域をそれぞれの反応槽４で増幅する場合に、一部の反応槽４の反応液は合流させて１つのＤＮＡチップ搭載部７で検出し、他の反応槽４の反応液はそれぞれ個別のＤＮＡチップ搭載部７に送液し検出するようにしても良い。
　図４及び図５の検査装置１におけるその他の構成は、図２に示した検査装置１と同様である。
　以下、実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
［IC5を使用した変異割合定量試験］
１．検量線サンプルの調製
　本実施例では、JAK2遺伝子におけるV617F変異を検査対象の変異とした。遺伝子の変異について、変異型を有する変異型プラスミドと、野生型を有する野生型プラスミドとをFASMAC社の人工遺伝子合成サービスを通じて作製した。JAK2遺伝子の野生型プラスミドとしては、配列番号１に示した塩基配列を挿入したプラスミドを用いた。また、変異型プラスミドとしては、上述した変異（JAK2遺伝子のV617F変異）を有する以外は同じ領域を挿入したプラスミドを用いた。
　作製したJAK2遺伝子に関する変異型プラスミド及び野生型プラスミドについて、予めバイオラッド社製のddPCRでコピー数を定量し、JAK2 V617F変異についての変異割合が1%、5%、20%、50%又は100%となるように混合した。そして、混合したJAK2遺伝子について、変異型プラスミド及び野生型プラスミドの合計のコピー数が5×103/μLとなるようにTE緩衝液で調整したものを検量線サンプルとした。
２．リアルタイムPCRの実施
　調製した検量線サンプル5種類（変異割合：1%、5%、10%、50%又は100%）を用いて、JAK2遺伝子の所定の領域を、プライマーセットを加えて増幅した。このPCRに際して表１に示すプライマーセットを設計し、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のオリゴ受託合成サービスを通じて作製した。なお、表１に示したプライマーセットのうち、「F」を付したフォワードプライマーに蛍光標識（IC5）を付加している。
　次に、PCR中の蛍光検出に必要な表２に示す増幅検出用蛍光プローブ（Eprobe（登録商標））を設計し、ダナフォーム社のオリゴ受託合成サービスを通じて作製した。なお、表２に示した塩基配列のうち、TEを付した塩基に同社の蛍光色素（Oxazole Yellow）を付加している。なお、上記増幅検出用蛍光プローブは増幅産物とハイブリダイズ反応するが、増幅産物における、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ、及び共通プローブに相補的な配列を有する領域とは重ならない領域に対して相補的な配列を有するように設計している。
　以上のように設計したプライマーセットと増幅検出用蛍光プローブを表３の組成となるよう混合し、プライマープローブミックスを調製した。
　そして、検量線サンプル及びプライマープローブミックスを用いて表４に示す組成のPCR反応液を調製した。
　以上のように調製したPCR反応液を用いてPCRのサーマルサイクルを95℃で5分間の後、95℃で30秒、59℃で30秒及び72℃で45秒を１サイクルとして計22、25、28、31、34、37、40サイクル行い、最終的に4℃を維持した。PCRはサーモフィッシャーサイエンティフィック社のStepOneリアルタイムPCRシステムを用いて行い、アニーリング時（59℃で30秒）にFAM設定で蛍光検出を行った。
３．増幅曲線の作成
　得られた蛍光強度値は、蛍光が検出されなかった1～5サイクルの蛍光強度平均値をバックグラウンド値として事前に差し引いた値を使用し、6次多項近似曲線を作成した。
４．TTh.PFIの設定とMPFI、CPFIの算出
　得られた増幅曲線からダイナミックレンジの上限値を20000に設定し、TTh.PFI = 2000、4000、6000、8000、10000、15000、20000に設定した。
５．DNAチップ
　本実施例では、JAK2遺伝子におけるV617F変異に対応する変異型プローブ（ターゲット核酸検出用核酸プローブ）とこれに対応する野生型プローブ（非ターゲット核酸検出用核酸プローブ）、及び野生型並びに変異型に共通する共通プローブを設計した。共通プローブは、増幅核酸に含まれる遺伝子変異が存在するか存在しないかに関わらず当該増幅核酸に対して特異的にハイブリダイズする。設計したプローブの塩基配列を表５に示した。
６．ハイブリダイズ反応液の調製
　本実施例では、PCRのサーマルサイクルを経て増幅された22、25、28、31、34、37、40サイクルで取り出した各PCR増幅産物を含む反応液30μLと、ハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS/0.2nM JAK2遺伝子用ブロッカー150nM（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製））15μLを指定のPCRチューブ（4titude製4ti-0750/TA）に加え、泡立てないようにピペッティングで数回撹拌した。JAK2遺伝子用ブロッカーを表６に示した。
７．ハイブリダイズ反応
　上記５．で説明した各種プローブを固定化したDNAチップを、遺伝子解析装置BIOSHOT HT-32（東洋鋼鈑製）にセットしてハイブリダイズ反応を実施した。上記６．で調製した溶液を含むPCRチューブ、指定のPCRチューブに挿入するためにDNAチップを固定したDNAチップニードル、さらに、DNAチップのハイブリダイズ反応後、余分な試薬を洗浄するための洗浄液（0.1×SSC/0.1%SDS溶液、室温）、リンス液（1×SSC溶液、室温）、蛍光検出用の検出液（1×SSC溶液、室温）をBIOSHOT HT-32内にセットし、運転を開始した。
　自動運転により、指定のPCRチューブ内の反応液が49.5℃に加熱された状態で、DNAチップニードルが挿入され、ハイブリダイズ反応を30分間実行した。ハイブリダイズ反応後に、DNAチップニードルを洗浄液槽内に素早く浸漬し、DNAチップが洗浄液水面に出入りするように30回撹拌した。洗浄後のDNAチップニードルはリンス液槽内に浸漬され、DNAチップがリンス液水面を出入りするように80回撹拌した。
　リンス後のDNAチップニードルを検出液槽にゆっくりと浸漬し、640nmの単波長レーザーの照射によって、CCDカメラに2秒間蛍光を取り込んだ。
８．検量線の作成
　本実施例において、得られた蛍光強度値はプローブがスポットされていない箇所をバックグラウンド値として事前に差し引いた値を使用した。まず、変異割合100%の検量線サンプル（以下、M100）から得られた温度サイクル毎の蛍光強度値（7種類）から6次多項近似曲線を作成した。
　得られた6次多項式に、上記４．で設定した複数のTTh.PFIを代入し、MPFIとCPFIを算出した。また、式：[MPFI]/[CPFI]により判定値を算出し、M100における判定値の逆数（すなわち、[CPFI]/[MPFI]）を補正係数Aとした。
　次に、変異割合1%、5%、10%及び50%の検量線サンプル（以下、M1、M5、M10及びM50）について、M100と同様にTTh.PFIにおけるMPFIとCPFI、そして判定値を算出した。得られたM1、M5、M10、M50、M100の判定値に、それぞれ補正係数Aを乗じて補正後判定値をそれぞれ算出した。
　X軸にM1、M5、M10、M50及びM100の補正後判定値、Y軸に既知の変異割合をプロットした散布図を作成し、最小二乗法を用いた線形近似直線I（図６）を作成した。また、X軸にM1、M5、M20、M50、M100の補正後判定値の対数変換値（Log%）、Y軸に既知の変異割合の対数変換値（Log%）をプロットした散布図を作成し、最小二乗法を用いた線形近似直線II（図７）を作成した。
９．結果
　JAK2遺伝子におけるV617F変異について、各TTh.PFIにおける補正係数、補正後判定値、線形近似直線I及び線形近似直線IIのそれぞれの傾きa、切片b及びR2値を表７に示す。
　表７において、「○」は線形近似直線Iの決定係数がR2≧0.99のときであり、直線性ありを意味している。また、「×」は同決定係数がR2＜0.99のときであり、直線性なしを意味している。「○○」は線形近似直線Iの決定係数がR2≧0.99のときであり、かつ線形近似直線IIの決定係数が最も高い条件を示している。表７における「○○」を付した条件であれば、判定値に基づいて変異割合を正確に算出することができる。
　これら線形近似直線I及び線形近似直線IIに基づいて「○○」となるTTh.PFI=6000を真のTh.PFIとした。
１０．定量用サンプルの調製
　上記１．で作製した変異型プラスミド及び野生型プラスミドを、変異割合がそれぞれ0%、0.25%、0.5%、1%、2.5%、5%、10%又は100%となるように混合し、Qubit（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で濃度定量し、混合したプラスミドDNAが0.08、0.32pg/μLとなるようにTE緩衝液を用いて希釈したものを定量用サンプルとした。
１１．リアルタイムPCRの実施
　定量用サンプル8種類（0%、0.25%、0.5%、1%、2.5%、5%、10%、100%）を用いて、JAK2遺伝子の所定の領域を、上記２．で使用したプライマープローブセットを用いて同時に増幅した。反応液の組成を表８に示した。
　以上のように調製したPCR反応液を用いてPCRのサーマルサイクルを95℃で5分間の後、95℃で30秒、59℃で30秒及び72℃で45秒を１サイクルとして行い、Th.PFIに到達した温度サイクルで装置から反応液を取り出した。
　次に、上記５．及び６．と同様のDNAチップ及びハイブリダイズ反応液を準備し、上記７．と同条件でハイブリダイズ反応を行った。
１２．判定値の算出
　得られたMPFIとCPFIの比を算出し、上記８．で得た補正係数Aを乗じて補正後判定値を算出した。すなわち、補正後判定値=[MPFI]/[CPFI]×補正係数Aで求めた。得られた補正後判定値は対数変換し、上記８．で得た検量線（線形近似曲線II）に代入し変異割合へと変換した。すなわち式：y=1.0970x -0.2490を適用して、補正係数A=0.784とした。
１３．ddPCRとの変異割合比較
　上記１０．の定量用サンプルについて、X軸にddPCRで測定した変異割合（Log%）、Y軸に検量線を用いて算出した変異割合をプロットし、最小二乗法を用いて線形近似した結果を図８に示した。図８に示すように、決定係数R2≧0.95以上となっており、非常に相関性の高い結果が得られた。
（実施例２）
[OYを使用した変異割合定量試験]
　実施例１はハイブリダイズしたPCR産物の蛍光色素IC5（Ex640nm/Em660nm）を使用して検量線を作成したのに対して、実施例２ではハイブリダイズしたPCR産物に結合している増幅検出用蛍光プローブOxazole Yellow（Ex490nm/Em510nm）を使用して検量線を作成する。以下には実施例１からの変更点のみを記載する。各項目の項目番号は、実施例１の項目番号と対応している。
７．ハイブリダイズ方法
　本実施例では、遺伝子解析装置BIOSHOT HT-32（東洋鋼鈑製）に、表９の光源とフィルターを設置し、リンス後のDNAチップニードルを検出液槽にゆっくりと浸漬し、488nmの単波長レーザーの照射によって、CCDカメラに2秒間蛍光を取り込んだ以外は、実施例１の７．と同様にしてハイブリダイズ反応を行った。
８．検量線の作成
　本実施例において、得られた蛍光強度値はプローブがスポットされていない箇所をバックグラウンド値として事前に差し引いた値を使用した。まず、変異割合100%の検量線サンプル（以下、M100）から得られた温度サイクル毎の蛍光強度値（7種類）から6次多項近似曲線を作成した。
　得られた6次多項式に、実施例１の４．で設定した複数のTTh.PFIを代入し、MPFIとCPFIを算出した。また、式：[MPFI]/[CPFI]により判定値を算出し、M100における判定値の逆数（すなわち、[CPFI]/[MPFI]）を補正係数Aとした。
　次に、変異割合1%、5%、10%及び50%の検量線サンプル（以下、M1、M5、M10及びM50）について、M100と同様にTTh.PFIにおけるMPFIとCPFI、そして判定値を算出した。得られたM1、M5、M10、M50、M100の判定値に、それぞれ補正係数Aを乗じて補正後判定値をそれぞれ算出した。
　X軸にM1、M5、M10、M50及びM100の補正後判定値、Y軸に既知の変異割合をプロットした散布図を作成し、最小二乗法を用いた線形近似直線I（図９）を作成した。またX軸にM1、M5、M20、M50、M100の補正後判定値の対数変換値（Log%）、Y軸に既知の変異割合の対数変換値（Log%）をプロットした散布図を作成し、最小二乗法を用いた線形近似直線II（図１０）を作成した。
９．結果
　JAK2遺伝子におけるV617F変異について、各TTh.PFIにおける補正係数、補正後判定値、線形近似直線I及び線形近似直線IIのそれぞれの傾きa、切片b及びR2値を表１０に示す。
　表１０において、「○」は線形近似直線Iの決定係数がR2≧0.99のときであり、直線性ありを意味している。また、「×」は同決定係数がR2＜0.99のときであり、直線性なしを意味している。「○○」は線形近似直線Iの決定係数がR2≧0.99のときであり、かつ線形近似直線IIの決定係数が最も高い条件を示している。表１０における「○○」を付した条件であれば、判定値に基づいて変異割合を正確に算出することができる。
　これら線形近似直線I及び線形近似直線IIに基づいて「○○」となるTTh.PFI=6000を真のTh.PFIとした。
１２．判定値の算出
　得られたMPFIとCPFIの比を算出し、実施例２で得た補正係数Aを乗じて判定値を算出した。すなわち、判定値=[MPFI]/[CPFI]×補正係数Aで求めた。得られた判定値は対数変換し、上記８．で得た検量線（線形近似曲線II）に代入し変異割合へと変換した。すなわち式：y=1.0985x -0.2863を適用して、補正係数A=0.978とした。
１３．ddPCRとの変異割合比較
　本実施例の定量用サンプル（実施例１の１０．の定量用サンプルと同じ）について、X軸にddPCRで測定した変異割合（Log%）、Y軸に検量線を用いて算出した変異割合をプロットし、最小二乗法を用いて線形近似した結果を図１１に示した。図１１に示すように、決定係数R2≧0.95以上となっており、非常に相関性の高い結果が得られた。
１　検査装置
２　核酸増幅反応検出部
３　検出部
４　反応槽
５　第１温度制御部
６　ＤＮＡチップ
７　ＤＮＡチップ搭載部
８　第２温度制御部
９Ａ、９Ｂ　撮像部
１０、１１、１３、１５、１７　流路
１２　ハイブリダイズ緩衝液タンク
１４　洗浄液タンク
１６　廃液槽
１８　ポンプ装置
１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ　送液遮断バルブ
２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ　吸気バルブ
２１　接続ポート
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (17)

  1. 　検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を実施する工程と、
    　前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを、前記核酸増幅反応における反応液中の増幅産物を検出することにより確認する工程と、
    　前記指数関数的増幅期にあることが確認された前記反応液に含まれる、前記遺伝子変異における検出対象塩基を含むターゲット核酸及び検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸を、前記ターゲット核酸における検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するターゲット核酸検出用核酸プローブと、前記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有する非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸に共通する共通領域であって前記検出対象塩基もしくは前記非検出対象塩基を含む領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブとを用いて検出する工程と、
    　前記反応液に含まれるターゲット核酸を定量分析する工程とを含む、
    遺伝子変異の検査方法。
  2. 　前記検出する工程では、前記ターゲット核酸検出用核酸プローブと、前記非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記共通プローブとを担体に固定したＤＮＡチップを使用する請求項１に記載の遺伝子変異の検査方法。
  3. 　前記検査対象の遺伝子変異を含む領域が複数であり、
    　それぞれの前記領域について、前記核酸増幅反応を実施する工程と、前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認する工程とを行い、
    　前記指数関数的増幅期にあることが確認された、それぞれの前記領域についての反応液に含まれるターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する請求項１に記載の遺伝子変異の検査方法。
  4. 　前記反応液が増幅検出用プローブを含み、
    　前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを確認する工程、並びに前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸を検出する工程の両方を、前記増幅検出用プローブからのシグナルを検出することにより行う請求項１に記載の遺伝子変異の検査方法。
  5. 　前記増幅検出用プローブのＴｍ値が、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブのＴｍ値より高い請求項４に記載の遺伝子変異の検査方法。
  6. 　前記増幅検出用プローブは、前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸における、ターゲット核酸検出用核酸プローブ、非ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び共通プローブに相補的な配列を有する領域と重ならない領域に対して相補的な配列を有する請求項４に記載の遺伝子変異の検査方法。
  7. 　前記定量分析する工程では、前記ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度と、前記非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記共通プローブからのシグナル強度とに基づいて、検査対象の遺伝子変異における検出対象塩基の存在割合を算出する請求項１に記載の遺伝子変異の検査方法。
  8. 　前記定量分析する工程では、ターゲット核酸と非ターゲット核酸とを既知の割合で含むサンプルを複数用いて作成した検量線を用い、前記ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度と、前記非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記共通プローブからのシグナル強度とに基づいて、検査対象の遺伝子変異における検出対象塩基の存在割合を定量する請求項１に記載の遺伝子変異の検査方法。
  9. 　前記定量分析する工程では、式：［ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度］/([ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]+[非ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度])で算出した判定値、又は、式：[ターゲット核酸検出用核酸プローブからのシグナル強度]/[共通プローブからのシグナル強度]で算出した判定値を用いる請求項１に記載の遺伝子変異の検査方法。
  10. 　前記検出する工程は、前記非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸の存在下で行う請求項１に記載の遺伝子変異の検査方法。
  11. 　検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を行い、前記核酸増幅反応が指数関数的増幅期にあることを、前記核酸増幅反応における反応液中の増幅産物を検出することにより確認する核酸増幅反応検出部と、
    　前記核酸増幅反応検出部から反応液が供給され、前記遺伝子変異における検出対象塩基を含むターゲット核酸における検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するターゲット核酸検出用核酸プローブと、検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有する非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記ターゲット核酸及び前記非ターゲット核酸に共通する共通領域であって前記検出対象塩基もしくは前記非検出対象塩基を含む領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブとを用いて少なくともターゲット核酸を検出する検出部と、
    　前記核酸増幅反応検出部から反応液を前記検出部に供給する送液装置と
    を備える遺伝子変異の検査装置。
  12. 　前記検出部は、前記ターゲット核酸検出用核酸プローブ及び前記非ターゲット核酸検出用核酸プローブ又は前記共通プローブを担体に固定したＤＮＡチップを搭載するＤＮＡチップ搭載部を備える請求項１１に記載の遺伝子変異の検査装置。
  13. 　前記核酸増幅反応検出部は、それぞれ別の検査対象の遺伝子変異を含む領域を増幅する核酸増幅反応を行う複数の反応槽を備え、
    　前記送液装置は、前記検出部に反応液を供給する流路を前記複数の反応槽間で切り替える切替装置を含む請求項１１に記載の遺伝子変異の検査装置。
  14. 　前記検出部は、前記共通プローブにて、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を検出する請求項１１に記載の遺伝子変異の検査装置。
  15. 　前記送液装置は、前記核酸増幅反応検出部と前記検出部とを連結する流路、当該流路上に配設されたバルブ、当該流路に接続されたポンプ装置を備える請求項１１に記載の遺伝子変異の検査装置。
  16. 　前記検出部に対して、ハイブリダイズ緩衝液を供給するハイブリダイズ緩衝液タンクを備え、前記送液装置は、前記核酸増幅反応検出部から指数関数的増幅期にある核酸増幅反応の反応液を前記検出部に供給するとともに、前記ハイブリダイズ緩衝液タンクからハイブリダイズ緩衝液を前記検出部に供給する請求項１１に記載の遺伝子変異の検査装置。
  17. 　前記ハイブリダイズ緩衝液は、前記非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を含む請求項１６に記載の遺伝子変異の検査装置。
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