WO2026012767A1 - Procede de preparation de complexes moleculaires non covalents comprenant de l'acide hyaluronique et une fraction peptidique, compositions cosmetiques et pharmaceutiques les comprenant et leurs utilisations - Google Patents

Procede de preparation de complexes moleculaires non covalents comprenant de l'acide hyaluronique et une fraction peptidique, compositions cosmetiques et pharmaceutiques les comprenant et leurs utilisations

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WO2026012767A1
WO2026012767A1 PCT/EP2025/068159 EP2025068159W WO2026012767A1 WO 2026012767 A1 WO2026012767 A1 WO 2026012767A1 EP 2025068159 W EP2025068159 W EP 2025068159W WO 2026012767 A1 WO2026012767 A1 WO 2026012767A1
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ppm
hyaluronic acid
molecular complex
hybrid
composition
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Ludivine MUR
Florian LABARRADE
Yolene FERREIRA
Isabelle Imbert
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Original Assignee
ISP Investments LLC
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Publication date
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    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
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    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • Non-covalent compounds comprising hyaluronic acid and a peptide fraction, cosmetic and pharmaceutical compositions comprising them and their uses
  • the present invention belongs to the field of ingredients comprising hyaluronic acid. It relates more particularly to a method for preparing covalently non-bonded molecular complexes, comprising hyaluronic acid and at least one peptide fraction, and their cosmetic and pharmaceutical uses.
  • Hyaluronic acid or hyaluronan
  • hyaluronan is a linear polymer of glycosaminoglycans with a molar mass ranging from 100 to 10,000 kDa. It is naturally present in the extracellular matrix of epithelial, nervous, and connective tissues of vertebrates. It can form bonds with proteins, lipids, or carbohydrates to create supramolecular structures capable of trapping large quantities of water and ions.
  • hyaluronic acid contributes to lubrication, protects areas of friction, and maintains cartilage elasticity. In the skin, it contributes to hydration, turgor, and tissue cohesion. It also plays a role in controlling angiogenesis, inflammation, and wound healing.
  • the hyaluronic acid content decreases in the skin during aging, particularly in the epidermis, and its degradation is increased in certain inflammatory or degenerative pathologies such as osteoarthritis.
  • Peptides are also widely used in the cosmetics industry, primarily in the form of short-chain peptides of synthetic or natural origin. Examples include tripeptide-1, with the sequence GHK, whether or not it is copper-bound, which stimulates collagen production, and certain peptides marketed by Ashland, such as the peptide with the sequence (Gly-Pro-Gln)2, marketed under the name ColloxylTM, described in European patent No. 1406589, for its effectiveness in the treatment of skin and hair aging, the tripeptide with the trade name ATPeptideTM described in patent No.
  • peptide extracts have also been described for their beneficial properties on the skin. These are generally aqueous plant extracts or fermentation products that can be hydrolyzed, thereby improving their tolerance and bioavailability.
  • Patent document EP3527194B1 describes a method for preparing composite particles comprising hyaluronic acid (of high molecular weight, greater than 100 kDa) and at least one peptide not involving chemical reactions.
  • the peptide must be in the form cationic, at a pH less than or equal to 5.
  • This method makes it possible to obtain particles of a defined size (less than 500 nm) which are thought to improve skin penetration.
  • this technique requires adjusting the pH to a value lower than the pKa of each peptide so that it is entirely in its cationic form.
  • the inventors have developed a process for preparing molecular complexes comprising at least one peptide and non-crosslinked and non-functionalized hyaluronic acid, to produce a molecular complex exhibiting satisfactory stability and biological properties superior to the molecules used in isolation.
  • the invention relates first to a process for preparing a molecular complex comprising a peptide fraction and hyaluronic acid, characterized in that the molecular complex is not linked by covalent bonds and is obtained by the following process: a) solubilize hyaluronic acid powder of a molecular weight between 3 kDa and 10 kDa, and preferably between 3 kDa and 5 kDa, in an aqueous solvent, preferably water, at a concentration between 5000 ppm and 10,000 ppm under moderate stirring, for a time between 5 min and 30 minutes, at a temperature between 20°C and 50°C, preferably between 20°C and 30°C; b) add the peptide fraction in powder form, comprising at least one synthetic peptide or one purified from plants, algae, fungi or yeasts, comprising 3 to 12 amino acids and preferably 3 to 9 amino acids, into the solution prepared in the previous step, at a concentration between 10 ppm and 25000
  • the second object of the invention is the molecular complex obtained according to the process of the invention.
  • the invention has as its third object a composition comprising an effective amount of the molecular complex of the invention as an active agent and a physiologically acceptable medium.
  • the fourth object of the invention is the cosmetic use of the composition of the invention to reduce the signs of skin aging and in particular to firm the skin, improve its elasticity and hydration, reduce and limit the appearance of wrinkles and fine lines and also improve the homogeneity of the complexion.
  • the invention has as its fifth object a composition according to the invention for its use in aesthetic and regenerative medicine to improve healing, limit inflammation, or for its use to repair cartilage and treat osteoarthritis.
  • FIG. 1 Comparison of the molecular structures of the molecular complexes obtained according to example 1 and at different pH by FTIR.
  • FIG. 2 Evaluation of the effectiveness of the molecular complex of example 1 on the expression of different types of collagen and the synthesis of hyaluronic acid in ex vivo skin biopsies.
  • FIG. 3 Demonstration of the synergistic properties of the molecular complex of example 1 on the expression of collagen I in ex vivo skin biopsies.
  • FIG. 4 Evaluation of the effect of the molecular complex obtained according to the process of example 1 compared to the mixture from process 2 according to example 2.
  • FIG. 5 Demonstration of the texturizing effect of the hybrid of example 1 formulated at 5%. a) evaluation made by consumer volunteers and b) evaluation made by experts. [0028] [Fig. 6]: Demonstration of the hydrating properties of the hybrid of example 1 formulated at 5% in the short term and long term.
  • hyaluronic acid means an unbranched carbohydrate polymer formed by alternating units of glucuronic acid and N-acetylglucosamine, having a molecular weight between 3 kDa and 10 kDa.
  • compositions described in this application may "include”, “consist of” or “consist essentially of”, the essential compounds or the optional ingredients.
  • composition essentially of means that the composition or component may include additional ingredients, but only if the additional ingredients do not alter the basic characteristics or new characteristics of the composition or use described in this application.
  • physiologically acceptable medium means a solvent suitable for any route of administration in the body, for example oral route or injection, and more particularly for contact with the external layers of the skin, scalp or hair, without toxicity, irritation, undue allergic response and similar or intolerance reaction, and proportionate to a reasonable benefit/risk ratio, at the concentrations used.
  • an effective quantity is meant the minimum quantity of molecular complex according to the invention which is necessary to obtain at least one of the desired biological activities.
  • Tripeptide-1 refers to the peptide with the sequence H-Gly-His-Lys-OH
  • "Hexapeptide-9” means the peptide consisting of the sequence (SEQ ID: No. 1), H-Gly-Pro-GIn-Gly-Pro-GIn-OH, marketed under the name CollaxylTM biofunctional by Ashland.
  • molecular complex(s) means one or more complexes formed of hyaluronic acid and a peptide fraction, not covalently linked, in solution, obtained by self-assembly.
  • self-assembly means the phenomenon of spontaneous association of molecules of different nature to form supramolecular structures not covalently linked to each other.
  • peptide fraction means at least one synthetic peptide or one purified peptide from plants, algae, fungi or yeasts, comprising from 3 to 12 amino acids and preferably from 3 to 9 amino acids,
  • hybrid means a particular formulation comprising 5% to 40% of the molecular complex of the invention, incorporated into a cosmetic vector composed of water, glycerin and 1% to 10% of a mixture of several carboxymethyl celluloses of different grades and degrees of substitution.
  • peptide means a molecule composed of 2 to 12 amino acids linked together by peptide bonds, of natural or synthetic origin, linear or cyclic, substituted or unsubstituted.
  • the term “texturizing effect” means an effect which improves the consistency and feel of a cosmetic composition.
  • the present invention relates to a new method for preparing molecular complexes of hyaluronic acid and a peptide fraction, capable of self-assembling in a non-covalent manner.
  • the invention thus relates as its first object a process for preparing a molecular complex comprising a peptide fraction and hyaluronic acid, characterized in that the molecular complex is not linked by covalent bonds and is obtained by the following process: a) solubilizing hyaluronic acid powder with a molecular weight between 3 kDa and 10 kDa, and preferably between 3 kDa and 5 kDa, in an aqueous solvent, preferably water, at a concentration between 5000 ppm and 10000 ppm under moderate stirring, for a time between 5 min and 30 min, at a temperature between 20°C and 50°C, preferably between 20°C and 30°C; b) adding the peptide fraction comprising at least one synthetic peptide or one purified from plants, algae, fungi, or yeasts, comprising of 3 to 12 amino acids and preferably of 3 to 9 amino acids, in the solution prepared in the previous step, so as to obtain a concentration of between
  • the spatial organization of hyaluronic acid is controlled by the combination of physicochemical factors such as molecular weight, biopolymer concentration, temperature, pH and dissolution method.
  • Hyaluronic acid of intermediate or high molecular weight i.e. greater than 100 kDa, at a concentration less than 1 mg/ml is in the form of long supercoiled chains, stabilized by numerous inter-chain interactions (De Souza A. et al., Carbohydrate Polymers 222 (201), 1 15001). This spatial conformation is not very favorable to the formation of complexes by self-assembly with peptides, such as those present in the peptide fraction described in the present invention.
  • hyaluronic acid of low molecular weight i.e. less than 10 kDa
  • the process of the present invention is therefore based on the rearrangement of the spatial architecture of hyaluronic acid in solution in the form of short antiparallel double helices.
  • This spatial conformation of hyaluronic acid promotes its non-covalent self-assembly with peptides to form stable molecular complexes.
  • the hyaluronic acid is in powder form, and the solvent is an aqueous solvent that may optionally contain different types of solutes.
  • the solvent is pure water.
  • the stirring method may include any methods known to a person skilled in the art, such as magnetic stirring.
  • the solubilization time must be between 5 min and 30 minutes and is proportional to the molecular weight of the hyaluronic acid used as well as its concentration.
  • the hyaluronic acid is at a concentration between 5000 ppm and 10000 ppm.
  • step b) of the process the peptide fraction is added to the hyaluronic acid solution obtained in the previous step.
  • the peptide fraction is in powder form.
  • Solubilization is carried out under moderate stirring, at a temperature between 20°C and 50°C, preferably between 20°C and 30°C.
  • the stirring method may include any method known to those skilled in the art, such as magnetic stirring. This step continues until all components are completely dissolved.
  • the peptide fraction may contain one or more peptides, which may have a linear or cyclic structure and be of natural or synthetic origin.
  • the peptides may or may not carry chemical modifications well known to those skilled in the art, such as one or more amidations, carboxylations, myristoylations, palmitoylations, or farnesylations, or any combination of such modifications.
  • the peptides may or may not be associated with a vitamin, a trace element, or any other compound to form associations well known to those skilled in the art.
  • the concentration of peptide fraction can be between 10 ppm and 25000 ppm, preferably between 30 ppm and 5500 ppm, by weight relative to the total weight of the solution obtained at the end of step b).
  • the peptide fraction is composed of at least one synthetic peptide of a length of 3 to 12 amino acids, and preferably of 3 to 9 amino acids.
  • the peptide fraction comprises at least tripeptide-1 (of sequence GHK).
  • the peptide fraction comprises at least hexapeptide-9 of sequence (Gly-Pro-Gln)2 (SEQ ID No 1).
  • the process for preparing the present application can also be carried out with a peptide fraction comprising at least one peptide from plants, algae, fungi or yeasts, comprising from 3 to 12 amino acids and preferably from 3 to 9 amino acids.
  • the mass ratio between hyaluronic acid and the peptide fraction is between 10/1 and 2/1, preferably between 4/1 and 2/1.
  • Steps a) and b) can be carried out in either the reverse order indicated above.
  • step c) of the process the pH is adjusted to a value between 2 and 3.5, preferably between 2.5 and 3, using an acid such as citric, lactic or hydrochloric acid, preferably citric acid is used.
  • an acid such as citric, lactic or hydrochloric acid, preferably citric acid is used.
  • the process of the invention thus exploits the ability of hyaluronic acid to form these particular structures at pH levels close to 2.5 to 3, allowing the formation of molecular complexes by self-assembly with a peptide fraction.
  • the stirring method may include any methods known to a person skilled in the art, such as magnetic stirring.
  • step e) the pH is adjusted to a value between 4.5 and 6.5, preferably between 4.5 and 5.5, by adding a basic solution, preferably concentrated sodium hydroxide.
  • step e) The solution obtained in step e) constitutes the molecular complex within the meaning of the invention.
  • the process can be continued by a step f) in which the molecular complex is diluted in a cosmetic carrier such as a mixture of water, glycerin, and cellulose derivatives.
  • a cosmetic carrier such as a mixture of water, glycerin, and cellulose derivatives.
  • the cellulose derivatives used can be sodium carboxymethyl celluloses, marketed under the name blanoseTM carboxymethylcellulose (CMC) by Ashland.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • Ashland a mixture of water, glycerin, and cellulose derivatives.
  • the total concentration of CMCs can be between 1% and 10%, and preferably between 1% and 3%.
  • the cosmetic vector consists of 40% to 52% water, 47% to 57% glycerin and 1% to 3% of a mixture of several carboxymethyl celluloses.
  • the molecular complex can thus be incorporated into this cosmetic vector at a concentration of between 5% and 40%, preferably at a concentration of between 5% and 15%, and even more preferably at a concentration of 10%, by weight relative to the total weight of the mixture.
  • the molecular complex comprises a peptide fraction comprising hexapeptide-9 (SEQ ID: No. 1) and tripeptide-1.
  • tripeptide-1 is present at a concentration between 500 ppm and 5000 ppm, preferably at a concentration between 1000 ppm and 3000 ppm, by weight relative to the total weight of the molecular complex.
  • hexapeptide-9 is present at a concentration between 20 ppm and 500 ppm, preferably at a concentration between 50 ppm and 300 ppm, by weight relative to the total weight of the molecular complex.
  • the invention further relates to the hybrid that can be obtained according to steps a) to f) of the process described above, that is to say that the molecular complex at a concentration of between 5% and 40%, preferably at a concentration of between 5% and 15%, and even more preferably at a concentration of 10%, by weight relative to the total weight of the mixture, has been incorporated into a cosmetic vector comprising 40% to 52% water, 47% to 57% glycerin and 1% to 3% of a mixture of several carboxymethyl celluloses.
  • a third object of the invention is a composition comprising, as an active agent, an effective amount of the molecular complex described above and a physiologically acceptable medium.
  • the molecular complex is present in the composition at a concentration of between 0.01% and 10% by weight relative to the total weight of the composition, preferably at a concentration of between 0.05% and 5% by weight relative to the total weight of the composition, and even more preferably at a concentration of between 0.1% and 2% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the molecular complex is pre-diluted to a concentration of between 5% and 40%, preferably between 5% and 15%, and even more preferably to 10% in a cosmetic vector such as a mixture of water, glycerin and cellulose derivatives to form a hybrid.
  • a cosmetic vector such as a mixture of water, glycerin and cellulose derivatives
  • the cosmetic vector comprises 40% to 52% water, 47% to 57% glycerin and 1% to 3% of a mixture of several carboxymethyl celluloses.
  • the composition comprises from 1% to 10% of hybrid and preferably 5% of hybrid by weight relative to the total weight of the composition.
  • the molecular complex of the invention forms a composition described as a hybrid which exhibits rheological parameters and a texturizing effect are particularly sought after in a cosmetic composition.
  • composition of the present application is formulated to be administered by any suitable route, including injection, oral route, or external topical route, and the formulation of the compositions will be adapted by a person skilled in the art.
  • the composition of the present application is in a form suitable for topical application and comprises a physiologically acceptable medium, particularly suitable for this type of application.
  • compositions may in particular be in the form of an aqueous, hydroalcoholic or oily solution or gel, an oil-in-water, water-in-oil emulsion or multiple emulsions; they may also be in the form of suspensions, or even powders, suitable for application to the skin, mucous membranes, lips and/or hair.
  • the composition may be more or less viscous and may also have the appearance of a cream, lotion, fluid, milk, serum, ointment, gel, paste, balm or mousse. It may also be in solid form, such as a stick, or be applied to the skin as an aerosol.
  • physiologically acceptable media commonly used in the intended field of application include formulation aids such as solvents, thickeners, gelling agents, diluents, emulsifiers, antioxidants, colorants, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, esters, vegetable oils or butters, etc.
  • formulation aids such as solvents, thickeners, gelling agents, diluents, emulsifiers, antioxidants, colorants, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, esters, vegetable oils or butters, etc.
  • the composition may include, in addition to the active agent, i.e. the molecular complex, at least one other active agent having cosmetic effects similar and/or complementary to those of the invention.
  • Such additional active agents may also be selected according to their chemical composition, from the group comprising: amino sugars, glucosamine, D-glucosamine, N-acetylglucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, mannosamine, N-acetylmannosamine, galactosamine, N-acetylgalactosamine, vitamin B3 and its derivatives, niacinamide, sodium dehydroacetate, dehydroacetic acid and its salts, phytosterols, salicylic acid compounds, hexamidines, dialkanoyl dihydroxyproline compounds, soy extracts and derivatives, equol, isoflavones, flavonoids, phytantriol, farnesol, geraniol, bisabolol, peptides and their derivatives, di-, tri-, tetra-, penta-, and hexapeptides and their derivatives, lys-thr-thr-
  • the invention relates to a composition comprising the molecular complex for its use to improve healing, limit inflammation, or for its use to repair cartilage and treat osteoarthritis.
  • Hyaluronic acid in powder form is solubilized in 1 litre of osmosis water at a concentration of 6000 ppm, at room temperature (20 °C) under medium intensity magnetic stirring for 5 minutes.
  • the molecular complex obtained above may be diluted to a concentration of 10% in a cosmetic vector itself composed of 40% to 52% water, 47% to 57% glycerin, and 1% to 3% of a mixture of several carboxymethyl celluloses of different grades and degrees of substitution.
  • This particular mixture has the advantage of being easily incorporated into a finished cosmetic formulation and is described in this application as a “hybrid”.
  • Example 2 FTIR characterization of the molecular complex obtained according to process 1 of Example 1, in comparison with mixtures obtained at different pH levels
  • the infrared spectrum obtained is between 600 and 4000 cm-1 and can be divided into two:
  • the part of the "functional groups" from -4000 cm-1 to 1500 cm-1 is a region of the spectrum that is easily analyzable.
  • the "footprint region” goes from 1500 cm-1 to 600 cm-1. This is a complex area to interpret, having only a comparative value.
  • the powders are deposited so as to completely cover the diamond of the FT-IR spectrometer.
  • the samples are then pressed with a pressure force of 80 using a gauge, in order to remove the air trapped between the grains.
  • Example 6 Evaluation of the effect of the molecular complex obtained according to the method of Example 1 compared to method 2 of Example 2 on the expression of collagens I and IV
  • Protocol The expression of these two collagens is evaluated by indirect immunofluorescence on skin biopsies previously treated by topical application of the molecular complex obtained according to method 1 at a concentration of 0.5% diluted in PBS, for 48 hours (twice a day).
  • skin biopsies are treated by topical application of the mixture from method 2 of Example 2 at a concentration of 0.5% diluted in PBS, for 48 hours (twice a day).
  • Control biopsies incubated in parallel under the same conditions receive Phosphate Buffer Saline (PBS). At the end of incubation, the biopsies are fixed and embedded in paraffin for histological sectioning.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • Detection of collagens I and IV is performed by incubation with anti-Collagen I (Proteintech) and anti-Collagen IV (Merck Millipore) antibodies. After two hours of incubation followed by rinsing, the sections are incubated with a fluorophore-coupled anti-rabbit secondary antibody (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) to detect collagen I. The sections are then incubated with a fluorophore-coupled anti-mouse secondary antibody (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) to detect collagen IV. The sections are then examined under an epifluorescence microscope (Nikon Eclipse Ni), controlled by NIS-Element software (Nikon). Expression levels are quantified by image analysis (Volocity® software, Improvision).
  • Example 7 Formulation of the hybrid from Example 1 in an aqueous gel
  • Example 8 Evaluation of the effect of the hybrid according to example 1 on the texture of a cream
  • Protocol comparative double-blind study against a cream containing 5% silicone, conducted on the back of the hand of 8 expert volunteers and 10 consumer volunteers.
  • [0169] [table 6]: questionnaire for expert volunteers.
  • Protocol Two comparative, double-blind, placebo-controlled studies were conducted on the faces of 30 volunteers of Asian origin (aged 40 to 63 years) and on the faces of 34 volunteers of Caucasian origin (aged 37 to 69 years). The Volunteers of Asian descent were randomly assigned to one side of a mask containing the hybrid and the other side a placebo for 25 minutes. Volunteers of Caucasian descent were randomly divided into two groups of 17 volunteers, homogeneous in age and gender, and were assigned to either the cream containing the 5% hybrid or the placebo.
  • the placebo side received the same treatment formula but not containing the hybrid.
  • the placebo group received the same treatment formula but without the hybrid.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation d'un complexe moléculaire comprenant une fraction peptidique et de l'acide hyaluronique d'un poids moléculaire compris entre 1 et 10 kDa, caractérisé en ce que le complexe n'est pas lié par des liaisons covalentes. L'invention concerne encore les compositions cosmétiques comprenant un tel complexe moléculaire et leurs utilisations cosmétiques pour réduire les signes du vieillissement cutané. L'invention concerne également des compositions comprenant un tel complexe moléculaire pour ses utilisations en médecine esthétique et régénérative pour améliorer la cicatrisation, limiter l'inflammation, ou pour leurs utilisations pour réparer le cartilage et traiter l'arthrose.

Description

Description
Titre de l'invention : PROCEDE DE PREPARATION DE COMPLEXES MOLECULAIRES
NON COVALENTS COMPRENANT DE L’ACIDE HYALURONIQUE ET UNE FRACTION PEPTIDIQUE, COMPOSITIONS COSMETIQUES ET PHARMACEUTIQUES LES COMPRENANT ET LEURS UTILISATIONS
Domaine technique
[0001 ] La présente invention appartient au domaine des ingrédients comprenant de l’acide hyaluronique. Elle concerne plus particulièrement une méthode de préparation de complexes moléculaires non liés covalemment, comprenant de l’acide hyaluronique et au moins une fraction peptidique composée d’une fraction peptidique, et leurs utilisations cosmétiques et pharmaceutiques.
Arrière-plan technique de l’invention
[0002] L'acide hyaluronique ou hyaluronane est un polymère linéaire de glycosaminoglycane dont la masse molaire est comprise entre 100 et 10 000 kDa. Il est naturellement présent dans la matrice extracellulaire des tissus épithéliaux, nerveux et conjonctifs des vertébrés. Il peut engager des liaisons avec des protéines, des lipides ou des glucides pour former des structures supramoléculaires capables d’emprisonner une grande quantité d’eau et d’ions.
[0003] Dans les articulations, l'acide hyaluronique participe à la lubrification, à la protection des zones de frottement et au maintien de l'élasticité du cartilage. Dans la peau, il participe à l'hydratation, à la turgescence et à la cohésion des tissus. Il joue également un rôle dans le contrôle de l'angiogenèse, de l'inflammation et de la cicatrisation.
[0004] Ces multiples propriétés, couplées à une biocompatibilité et une biodégradabilité élevées, ont fait de l’acide hyaluronique une molécule très utilisée en médecine, bio-ingénierie et cosmétique.
[0005] Toutefois, la teneur en acide hyaluronique diminue dans la peau au cours du vieillissement, en particulier dans l’épiderme, et sa dégradation est accrue dans certaines pathologies inflammatoires ou dégénératives comme l’arthrose.
[0006] Les peptides sont également très utilisés dans le domaine de la cosmétique, majoritairement sous forme de peptides à chaîne courte d’origine synthétique ou naturelle. On peut citer le tripeptide-1 , de séquence GHK, lié ou non au cuivre, qui stimule la production de collagène, ou certains peptides commercialisés par la société Ashland, comme le peptide de séquence (Gly-Pro-Gln)2, commercialisé sous le nom ColloxylTM, décrit dons le brevet européen No 1406589, pour son efficacité dans le traitement du vieillissement de la peau et des cheveux, le tripeptide de nom commercial ATPeptide™ décrit dans le brevet No FR2846883), l’hexapeptide de nom commercial Peptide vinci™ 02 décrit dans le brevet FR284178, ou encore le dipeptide dimérisé de nom commercial Quintescine™ décrit dans le brevet No EPI 79 188B1 .
[0007] De nombreux extraits peptidiques ont également été décrits pour leurs propriétés bénéfiques sur la peau. Ce sont généralement des extraits aqueux de plantes ou des produits de fermentations qui peuvent être hydrolysés, ce qui améliore leur tolérance et leur biodisponibilité.
[0008] De très nombreuses formules cosmétiques contiennent à la fois des peptides et de l’acide hyaluronique, comme celles décrites dans les documents de brevets EP1815843A2, KR2023134758 et CN1 16942584. Toutefois rien dans ces documents ne suggère que les formulations aient été optimisées pour permettre la formation de complexes entre l’acide hyaluronique et les peptides.
[0009] On connaît aussi dans l’art antérieur des molécules hybrides d’acide hyaluronique et de peptides, formés par la création de liaisons covalentes entre les deux composés, très largement utilisés dans l'industrie cosmétique comme produits injectables de comblement dermique ou pour l'application topique. Ceci implique l’utilisation d’agents de réticulation, ou la modification chimique préalable d’au moins un des deux composants. Par exemple le document WO2017098474A1 décrit une composition d’acide hyaluronique dont la chaîne polymérique a été modifiée pour porter des groupes hydrophobes capables de se lier covalemment à un peptide antimicrobien.
[0010] Un des problèmes posés par ces techniques est la toxicité, voire les effets cancérogènes des agents de réticulation qui peuvent être libérés dans l’organisme au cours de la dégradation de l’acide hyaluronique (Xue Y, et al. Synthesis of hyaluronic acid hydrogels by crosslinking the mixture of high-molecular-weight hyaluronic acid and low-molecular-weight hyaluronic acid with 1 ,4-butanediol diglycidyl ether. RSC Adv. 2020;10(12):7206-7213 ; Faivre J et al. Crosslinking hyaluronic acid soft-tissue fillers: current status and perspectives from an industrial point of view. Expert review of medical devices vol. 18,12 (2021 ): 1 175-1 187).
[001 1 ] D’autres documents décrivent la fonctionnalisation chimique des molécules d’acide hyaluronique pour permettre la création de ponts covalents aminés inter chaînes, pour améliorer la stabilité in vivo d’un hydrogel à usage esthétique (US1 1224566B2), ou la création de pont covalents disulfures pour préparer des complexes utiles dans les soins de la peau (CN1 169661 14A).
[0012] Le document de brevet EP3527194B1 décrit, quant à lui, une méthode pour la préparation de particules composites comprenant de l’acide hyaluronique (de hauts poids moléculaire, supérieur à 100 kDa) et au moins un peptide n’impliquant pas de réactions chimiques. Dans ce cas, le peptide doit se trouver sous forme cationique, à un pH inférieur ou égal à 5. Cette méthode permet d’obtenir des particules de taille définie (moins de 500 nm) supposées améliorer la pénétration cutanée. Toutefois, cette technique implique d’ajuster le pH à une valeur inférieure au pKa de chaque peptide pour que celui-ci soit entièrement sous forme cationique.
[0013] Pour pallier les problèmes techniques de l’état de l’art, les inventeurs ont développé un procédé de préparation de complexes moléculaires comprenant au moins un peptide et de l’acide hyaluronique non réticulé et non fonctionnalisé, pour produire un complexe moléculaire présentant une stabilité satisfaisante et des propriétés biologiques supérieures aux molécules utilisées isolément.
[0014] Un avantage du procédé décrit dans la présente demande est qu’il permet de s’affranchir de la nécessité de se placer dans des conditions de pH inférieure au pKa du ou des peptides utilisés afin de former des cations capables d’autoassemblage avec les polymères anioniques d’acide hyaluronique.
[0015] Un autre avantage du procédé décrit ci-dessous est qu’il est simple à mettre en œuvre, plus naturel et donc plus respectueux de l’environnement que les procédés de l’art antérieur, puisqu’il n’implique pas de modifications chimiques préalables des composés, ni l’utilisation d’agents de réticulation potentiellement toxiques.
[0016] A la connaissance des inventeurs, aucun document de l’art antérieur ne décrit le procédé de préparation de la présente demande.
Résumé de l’invention
[0017] L’invention a pour premier objet un procédé de préparation d’un complexe moléculaire comprenant une fraction peptidique et de l’acide hyaluronique, caractérisé en ce que le complexe moléculaire n’est pas lié par des liaisons covalentes et est obtenu par le procédé suivant : a) solubiliser la poudre d’acide hyaluronique d’un poids moléculaire compris entre 3 kDa et 10 kDa, et préférentiellement entre 3 kDa et 5 kDa, dans un solvant aqueux, de préférence de l’eau, à une concentration comprise entre 5000 ppm et 10 000 ppm sous agitation modérée, pendant un temps compris entre 5 min et 30 minutes, à une température comprise entre 20°C et 50°C, préférentiellement entre 20°C et 30°C ; b) ajouter la fraction peptidique sous forme de poudre, comprenant au moins un peptide synthétique ou purifié à partir de plantes, d’algues, de champignons ou de levures, comprenant de 3 à 12 acides aminés et préférentiellement de 3 à 9 acides aminés, dans la solution préparée à l’étape précédente, à une concentration comprise entre 10 ppm et 25000 ppm, préférentiellement entre 30 ppm et 5 500 ppm, sous agitation modérée, à une température comprise entre 20°C et 50°C; préférentiellement entre 20°C et 30°C ; c) ajuster le pH à une valeur comprise entre 2 et 3,5, de préférence entre 2,5 et
3; d) laisser sous agitation moyenne pendant une durée comprise entre 30 min et 3 heures, de préférence 1 heure, à une température comprise entre 20°C et 50°C, préférentiellement entre 20°C et 30°C; e) ajuster le pH à une valeur comprise entre 4.5 et 6.5, préférentiellement entre 4.5 et 5.5.
[0018] L’invention a pour deuxième objet le complexe moléculaire obtenu selon le procédé de l’invention.
[0019] L’invention a pour troisième objet une composition comprenant une quantité efficace du complexe moléculaire de l’invention en tant qu’agent actif et un milieu physiologiquement acceptable.
[0020] L’invention a pour quatrième objet l’utilisation cosmétique de la composition de l’invention pour réduire les signes du vieillissement cutané et en particulier pour raffermir la peau, améliorer son élasticité et son hydratation, atténuer et limiter l’apparition des rides et ridules et également améliorer l’homogénéité du teint.
[0021 ] L’invention a pour cinquième objet une composition selon l’invention pour son utilisation en médecine esthétique et régénérative pour améliorer la cicatrisation, limiter l’inflammation, ou pour son utilisation pour réparer le cartilage et traiter l’arthrose.
Brève description des figures
[0022] Les figures suivantes illustrent les avantages qui découlent de l’invention et des modes de réalisation non limitatifs qui sont présentés dans la description :
[0023] [Fig. 1 ] Comparaison des structures moléculaires des complexes moléculaires obtenus selon l’exemple 1 et à différents pH par FTIR.
[0024] [Fig. 2] Evaluation de l’efficacité du complexe moléculaire de l’exemple 1 sur l’expression de différents types de collagènes et la synthèse d’acide hyaluronique dans des biopsies de peau ex vivo.
[0025] [Fig. 3] Mise en évidence des propriétés synergiques du complexe moléculaire de l’exemple 1 sur l’expression du collagène I dans des biopsies de peau ex vivo.
[0026] [Fig. 4] : Evaluation de l’effet du complexe moléculaire obtenu selon le procédé de l’exemple 1 comparé au mélange issu du procédé 2 selon l’exemple 2.
[0027] [Fig. 5] : Mise en évidence de l’effet texturant de l’hybride de l’exemple 1 formulé à 5%. a) évaluation faite par les volontaires consommateurs et b) évaluation faite par les experts. [0028] [Fig. 6] : Mise en évidence des propriétés hydratantes de l’hybride de l’exemple 1 formulé à 5% à court terme et long terme.
Description détaillée de l’invention
Définitions
[0029] Tous les termes utilisés dans la présente description ont le sens le plus largement connu, sauf mention contraire. Pour les besoins de l’invention les termes suivants sont définis comme suit :
[0030] Dans la présente demande, on entend par « acide hyaluronique » un polymère glucidique non ramifié formé par l'alternance d'unités d’acide glucuronique et de N-acetylglucosamine, ayant un poids moléculaire compris entre 3 kDa et 10 kDa.
[0031 ] Quand une gamme de valeur est décrite, les bornes de cette gamme doivent être comprises comme incluant explicitement les bornes supérieure et inférieure de ladite gamme, ainsi que toutes les valeurs intermédiaires de la gamme. Par exemple, une gamme de valeur comprise entre 1 % et 10 % doit être comprise comme incluant 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, et 10 %, ainsi que toutes les valeurs décimales entre 1 % et 10 %.
[0032] Les valeurs numériques en pourcentage et en ppm (parties par million) sont en poids, c’est-à-dire le poids d’un composé par rapport au poids total du mélange envisagé, sauf spécifié autrement.
[0033] Les compositions décrites dans la présente demande peuvent « comprendre », « consister en » ou « consister essentiellement en », les composés essentiels ou les ingrédients optionnels.
[0034] « Consister essentiellement en » signifie que la composition ou le composant peut inclure des ingrédients additionnels, mais seulement si les ingrédients additionnels ne modifient pas les caractéristiques de base ou les nouvelles caractéristiques de la composition ou de l’utilisation décrite dans la présente demande.
[0035] On entend par« milieu physiologiquement acceptable » un solvant adapté pour toute voie d’administration dans l’organisme, par exemple voie orale ou injection, et plus particulièrement pour une mise en contact avec les couches externes de la peau, du cuir chevelu ou des phanères, sans toxicité, irritation, réponse allergique indue et similaire ou réaction d’intolérance, et proportionné à un rapport avantage/risque raisonnable, aux concentrations utilisées.
[0036] Par « quantité efficace » on désigne la quantité minimum de complexe moléculaire selon l’invention qui est nécessaire pour obtenir au moins une des activités biologiques recherchées.
[0037] On entend par« Tripeptide-1 », le peptide de séquence H-Gly-His-Lys-OH [0038] On entend par « Hexapeptide-9 », le peptide consistant en la séquence (SEQ ID : No 1 ), H-Gly-Pro-GIn-Gly-Pro-GIn-OH, commercialisé sous le nom de CollaxylTM biofunctional par Ashland.
[0039] On entend dans la présente demande par« complexe(s) moléculaire(s) » un ou des complexe(s)formés d’acide hyaluronique et d’une fraction peptidique, non liés covalemment, en solution, obtenus par autoassemblage .
[0040] On entend dans la présente demande par« autoassemblage », le phénomène d’association spontanée de molécules de nature différente pour former des structures supramoléculaires non liées covalemment entre elles.
[0041 ] On entend dans la présente demande par “fraction peptidique” au moins un peptide synthétique ou purifié à partir de plantes, d’algues, de champignons ou de levures, comprenant de 3 à 12 acides aminés et préférentiellement de 3 à 9 acides aminés,
[0042] On entend dans la présente demande par« hybride » une formulation particulière comprenant de 5 % à 40 % du complexe moléculaire de l’invention, incorporé dans un vecteur cosmétique composé d’eau, de glycérine et de 1 % à 10 % d’un mélange de plusieurs carboxyméthyl celluloses de grades et de degrés de substitution différents.
[0043] On entend par« peptide », une molécule composée de 2 à 12 acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques, d’origine naturelle ou synthétique, linéaire ou cyclique, substitué ou non.
[0044] On entend par« effet texturant » un effet qui permet d'améliorer la consistance et le toucher d’une composition cosmétique.
Procédé de préparation
[0045] La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de préparation de complexes moléculaires d’acide hyaluronique et d’ une fraction peptidique, capables de s’autoassembler de manière non covalente.
[0046] L’invention a ainsi pour premier objet un procédé de préparation d’un complexe moléculaire comprenant une fraction peptidique et de l’acide hyaluronique, caractérisé en ce que le complexe moléculaire n’est pas lié par des liaisons covalentes et est obtenu par le procédé suivant : a) solubiliser la poudre d’acide hyaluronique d’un poids moléculaire compris entre 3 kDa et 10 kDa, et préférentiellement entre 3 kDa et 5 kDa, dans un solvant aqueux, de préférence de l’eau, à une concentration comprise entre 5000 ppm et 10000 ppm sous agitation modérée, pendant un temps compris entre 5 min et 30 minutes, à une température comprise entre 20°C et 50°C, préférentiellement entre 20°C et 30°C ; b) ajouter la fraction peptidique comprenant au moins un peptide synthétique ou purifié à partir de plantes, d’algues, de champignons ou de levures, comprenant de 3 à 12 acides aminés et préférentiellement de 3 à 9 acides aminés, dans la solution préparée à l’étape précédente, de manière à obtenir une concentration comprise entre 10 ppm et 25000 ppm, préférentiellement entre 30 ppm et 5500 ppm, puis laisser sous agitation modérée, à une température comprise entre 20°C et 50°C; préférentiellement entre 20°C et 30°C ; c) ajuster le pH à une valeur comprise entre 2 et 3,5, de préférence entre 2,5 et 3; d) laisser sous agitation moyenne pendant une durée comprise entre 30 min et 3 heures, de préférence 1 heure, à une température comprise entre 20°C et 50°C, préférentiellement entre 20°C et 30°C; e) ajuster le pH à une valeur comprise entre 4.5 et 6.5, préférentiellement entre 4.5 et 5.5.
[0047] L’organisation spatiale de l’acide hyaluronique est contrôlée par la combinaison de facteurs physico-chimiques tels que le poids moléculaire, la concentration du biopolymère, la température, le pH et la méthode de dissolution.
[0048] L’acide hyaluronique d’un poids moléculaire intermédiaire ou élevé, c’est-à- dire supérieur à 100 kDa, à une concentration inférieure à 1 mg/ml se présente sous forme de longues chaînes surenroulées, stabilisées par de nombreuses interactions inter-chaînes (De Souza A. et al., Carbohydrate Polymers 222 (201 ), 1 15001 . Cette conformation spatiale est peu favorable à la formation de complexes par autoassemblage avec des peptides, tels que ceux présents dans la fraction peptidique décrite dans la présente invention.
[0049] Les inventeurs ont mis en évidence qu’il était avantageux, pour mettre en œuvre le procédé de la présente invention, d’utiliser de l’acide hyaluronique de petit poids moléculaire, c’est à dire inférieur à 10 kDa, et de se placer dans des conditions favorisant la conformation spatiale de l’acide hyaluronique en double hélice.
[0050] Le procédé de la présente invention repose donc sur le réarrangement de l’architecture spatiale de l’acide hyaluronique en solution sous forme de courtes doubles hélices antiparallèles. Cette conformation spatiale de l’acide hyaluronique favorise son autoassemblage non covalent avec des peptides pour former des complexes moléculaires stables.
[0051 ] A l’étape a) du procédé, l’acide hyaluronique est sous forme de poudre, et le solvant est un solvant aqueux pouvant éventuellement contenir différents types de solutés. De préférence le solvant est de l’eau pure.
[0052] La méthode d’agitation peut comprendre toutes méthodes connues de l’Homme du métier, comme par exemple l’agitation magnétique. [0053] Le temps de solubilisation doit être compris entre 5 min et 30 minutes et est proportionnel au poids moléculaire de l’acide hyaluronique utilisé ainsi qu’à sa concentration.
[0054] A la fin de l’étape a) l’acide hyaluronique est à une concentration comprise entre 5000 ppm et 10000 ppm.
[0055] A l’étape b)du procédé, on ajoute la fraction peptidique dans la solution d’acide hyaluronique obtenue à l’étape précédente. La fraction peptidique est sous forme de poudre.
[0056] La solubilisation, s’effectue sous agitation moyenne, à une température comprise entre 20°C à 50°C, préférentiellement comprise entre 20°C et 30°C. La méthode d’agitation peut comprendre toutes méthodes connues de l’Homme du métier, comme par exemple l’agitation magnétique. Cette étape se poursuit jusqu’à dissolution complète de tous les composants.
[0057] Pour réaliser l’étape b), la fraction peptidique peut contenir un ou plusieurs peptides, qui peuvent avoir une structure linéaire ou cyclique, être d’origine naturelle ou synthétique. Lorsque les peptides sont synthétiques, ils peuvent ou non porter des modifications chimiques bien connues de l’homme du métier, comme par exemple une ou plusieurs amidations, carboxylations, myristoylations, palmitoylations, ou encore farnésylations, ou toute combinaison de telles modifications. Lorsque les peptides sont synthétiques, ils peuvent ou non être associés à une vitamine, ou à un oligoélément ou à tout autre composé pour former des associations bien connues de l’homme du métier.
[0058] La concentration en fraction peptidique peut être comprise entre 10 ppm et 25000 ppm, préférentiellement entre 30 ppm et 5500 ppm, en poids par rapport au poids total de la solution obtenue à la fin de l’étape b).
[0059] Dans un mode de réalisation particulier, la fraction peptidique est composée d’au moins un peptide synthétique d’une longueur de 3 à 12 acides aminés, et de préférence de 3 à 9 acides aminés.
[0060] Dans un mode de réalisation particulier, la fraction peptidique comprend au moins du tripeptide-1 (de séquence GHK).
[0061 ] Dans un mode de réalisation particulier, la fraction peptidique comprend au moins du peptide de formule générale (I) comprenant la séquence (Gly-Pro-Gln)n, dans lequel n, est compris entre 1 et 3 et l’extrémité carboxylique est amidée ou non. Quand n égale 3, alors le peptide a la séquence (SEQ ID No 2)
[0062] Dans un mode de réalisation particulier, la fraction peptidique comprend au moins de l’hexapeptide-9 de séquence (Gly-Pro-Gln)2 (SEQ ID No 1 ).
[0063] Dans un autre mode de réalisation particulier, la fraction peptidique comprend de l’hexapeptide-9 (SEQ ID : No 1 ) et du tripeptide-1. [0064] Dans ce dernier mode de réalisation particulier, le tripeptide-1 est présent à une concentration comprise entre 500 ppm et 5000 ppm, de préférence à une concentration comprise entre 1000 ppm et 3000 ppm, en poids par rapport au poids total de solution de l’étape b).
[0065] Dans ce même mode de réalisation particulier, l’hexapeptide-9 est présent à une concentration comprise entre 20 ppm et 500 ppm, de préférence à une concentration comprise entre 50 ppm et 300 ppm, , en poids par rapport au poids total de solution de l’étape b) (ou complexe moléculaire).
[0066] Alternativement, le procédé de préparation de la présente demande peut également être réalisé avec une fraction peptidique comprenant au moins un peptide issus de plantes, d’algues, de champignons ou de levures, comprenant de 3 à 12 acides aminés et préférentiellement de 3 à 9 acides aminés.
[0067] De manière très avantageuse, le ratio massique entre l’acide hyaluronique et la fraction peptidique est compris entre 10/1 et 2/1, préférentiellement entre 4/1 et 2/1.
[0068] Les étapes a) et b) peuvent indifféremment être réalisées dans l’ordre inverse qu’indiqué ci-dessus.
[0069] A l’étape c) du procédé, on ajuste le pH à une valeur comprise entre 2 et 3,5, de préférence entre 2,5 et 3, à l’aide d’un acide tel que l’acide citrique, lactique ou chlorhydrique, de préférence on utilise l’acide citrique.
[0070] En effet, à des pH proches de 2,5 à 3, la littérature rapporte des changements structurels significatifs de l’acide hyaluronique, avec formation de doubles hélices antiparallèles (Snetkov, Petr et al. “Hyaluronic Acid: The Influence of Molecular Weight on Structural, Physical, Physico-Chemical, and Degradable Properties of Biopolymer.” Polymers vol. 12,8 1800. 1 1 Aug. 2020).
[0071 ] Toutefois, à un pH inférieur à 2,5, l’acide hyaluronique se trouve sous forme simple brin, très rapidement hydrolysé.
[0072] Le procédé de l’invention exploite ainsi la capacité de l’acide hyaluronique à former ces structures particulières à des pH proches de 2,5 à 3, permettant la formation de complexes moléculaires par autoassemblage avec une fraction peptidique.
[0073] A l’étape d) la méthode d’agitation peut comprendre toutes méthodes connues de l’Homme du métier, comme par exemple l’agitation magnétique.
[0074] A l’étape e) on ajuste le pH à une valeur comprise entre 4,5 et 6,5, de préférence entre 4.5 et 5.5, par ajout d’une solution basique, de préférence de l’ hydroxyde de sodium concentré.
[0075] Cette augmentation du pH permet de piéger le ou les peptides contenus dans la fraction peptidique par la brusque modification de l’organisation spatiale des doubles hélices d’acide hyaluronique formées à l’étape c). Cette étape permet l’ autoassemblage moléculaire d’ordre supérieur, et la formation de complexes moléculaires stables.
[0076] Les inventeurs ont ainsi pu démontrer que le procédé de la présente demande conduit à la formation complexes moléculaires stables, ce qui n’était pas suggéré dans l’état de l’art.
[0077] La solution obtenue à l’étape e) constitue le complexe moléculaire au sens de l’invention.
[0078] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé peut être poursuivi par une étape f) dans laquelle le complexe moléculaire est dilué dans un vecteur cosmétique tel qu’un mélange d’eau, de glycérine et de dérivés de celluloses. Les dérivés de celluloses utilisés peuvent être des carboxylméthyl celluloses de sodium, commercialisées sous le nom de blanose™ carboxyméthylcellulose (CMC) par Ashland. On peut par exemple mélanger plusieurs CMC ayant des grades et des degrés de substitution différents. La concentration totale des CMC peut être comprise entre 1 % et 10 %, et préférentiellement entre 1 % et 3 %.
[0079] Ce mélange particulier est décrit sous le nom d’hybride dans la présente demande.
[0080] Avantageusement, le vecteur cosmétique se compose de 40 % à 52% d’eau, de 47 % à 57 % de glycérine et de 1 % à 3 % d’un mélange de plusieurs carboxyméthyl celluloses.
[0081 ] Le complexe moléculaire pourra ainsi être incorporé dans ce vecteur cosmétique à une concentration comprise entre 5 % et 40 %, préférentiellement à une concentration comprise entre 5 % et 15 %, et encore plus préférentiellement à une concentration de 10 %, en poids par rapport au poids total du mélange.
[0082] Lorsqu’il est incorporé dans le vecteur cosmétique ci-dessus, le complexe moléculaire de l’invention forme un mélange qualifié d’hybride.
Complexes moléculaires
[0083] L’invention a pour deuxième objet le complexe moléculaire susceptible d’être obtenu selon les étapes a) à e) du procédé décrit ci-dessus.
[0084] Dans un mode de réalisation particulier, le complexe moléculaire comprend une fraction peptidique comprenant de l'hexapeptide-9 (SEQ ID : No 1 ) et du tripeptide-1 .
[0085] Dans ce dernier mode de réalisation particulier, le tripeptide-1 est présent à une concentration comprise entre 500 ppm et 5000 ppm, de préférence à une concentration comprise entre 1000 ppm et 3000 ppm, en poids par rapport au poids total du complexe moléculaire.
[0086] Dans ce même mode de réalisation particulier, l’hexapeptide-9 est présent à une concentration comprise entre 20 ppm et 500 ppm, de préférence à une concentration comprise entre 50 ppm et 300 ppm, en poids par rapport au poids total du complexe moléculaire.
[0087] L’analyse comparative par FTIR (Spectrométrie Infra-Rouge à Transformée de Fourier) a montré que le complexe moléculaire de l’invention a une structure spécifique, différente des structure obtenues par des procédés comparatifs, comme illustré dans la figure 1 .
[0088] Les études de stabilité ont montré que le complexe moléculaire de l’invention présente une stabilité remarquable après 15 jours à 50 °C.
[0089] L’invention a encore pour objet, l’hybride susceptible d’être obtenu selon les étapes a) à f) du procédé décrit ci-dessus, c’est-à-dire que le complexe moléculaire à une concentration comprise entre 5 % et 40 %, préférentiellement à une concentration comprise entre 5 % et 15 %, et encore plus préférentiellement à une concentration de 10 %, en poids par rapport au poids total du mélange, a été incorporé dans un vecteur cosmétique comprenant de 40 % à 52 % d’eau, de 47 % à 57 % de glycérine et de 1 % à 3 % d’un mélange de plusieurs carboxyméthyl celluloses.
Compositions
[0090] Un troisième objet de l’invention est une composition comprenant en tant qu 'agent actif, une quantité efficace du complexe moléculaire décrit ci-dessus et un milieu physiologiquement acceptable.
[0091 ] Avantageusement, le complexe moléculaire est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,01 % et 10 % en poids par rapport au poids total de la composition, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % en poids par rapport au poids total de la composition, et encore plus préférentiellement à une concentration comprise entre 0,1 % et 2 % en poids par rapport au poids total de la composition.
[0092] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le complexe moléculaire est préalablement dilué à une concentration comprise entre 5 % et 40 %, préférentiellement entre 5 % et 15 %, et encore plus préférentiellement à 10 % dans un vecteur cosmétique tel qu’un mélange d’eau, de glycérine et de dérivés de celluloses pour former un hybride.
[0093] Avantageusement, le vecteur cosmétique comprend de 40 % à 52 % d’eau, de 47 % à 57 % de glycérine et de 1 % à 3 % d’un mélange de plusieurs carboxyméthyl celluloses.
[0094] Dans ce mode particulier de réalisation, la composition comprend de 1 % à 10 % d’hybride et préférentiellement 5 % d’hybride en poids par rapport au poids total de la composition.
[0095] Lorsqu’il est incorporé dans le vecteur cosmétique ci-dessus, le complexe moléculaire de l’invention forme une composition qualifiée d’hybride qui présente des paramètres rhéologiques et un effet texturant particulièrement recherchés dans une composition cosmétique.
[0096] La composition de la présente demande est formulée pour être administrée par toute voie appropriée, notamment par injection, voie orale, ou voie topique externe, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier.
[0097] Préférentiellement, la composition de la présente demande se présente sous une forme adaptée à l’application par voie topique et comprend un milieu physiologiquement acceptable, particulièrement adapté à ce type d’application.
[0098] Les compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution ou d’un gel aqueux, hydroalcooliques ou huileux, d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de suspensions, ou encore poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les cheveux.
[0099] La composition peut être plus ou moins visqueuse et avoir également l’aspect d’une crème, d’une lotion, d’un fluide, d’un lait, d’un sérum, d’une pommade, d’un gel, d’une pâte, d’un baume ou d’une mousse. Elle peut aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquée sur la peau sous forme d’aérosol.
[0100] A titre de milieu physiologiquement acceptable communément utilisé dans le domaine d'application envisagé, on peut citer par exemple des adjuvants nécessaires à la formulation, tels que des solvants, des épaississants, des gélifiants, des diluants, des émulsionnants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d’odeur, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, des esters, des huiles ou beurres végétaux, etc.
[0101 ] Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l’invention.
[0102] Avantageusement, la composition peut comprendre, outre l’agent actif, c’est-à-dire le complexe moléculaire, au moins un autre agent actif présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à ceux de l'invention.
[0103] De tels agent actifs additionnels peuvent également être choisis selon leur composition chimique, dans le groupe comprenant : les sucres aminés, glucosamine, D-glucosamine, N-acetyl- glucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, mannosamine, N-acetyl mannosamine, galactosamine, N-acétyl galactosamine, vitamine B3 et ses dérivés, le niacinamide, déhydro-acétate de sodium, l'acide déhydroacétique et ses sels, phytosterols, composés d'acide salicylique, hexamidines, composés dihydroxyproline de dialkanoyl, extraits et dérivés de soja, equol, isoflavones, flavonoïdes, phytantriol, farnesol, géraniol, bisabolol, peptides et leurs dérivés, di -, tri -, tétra -, penta -, et hexapeptides et leurs dérivés, lys-thr-thr-lys- ser, palmitoyl-lys-thr-thr-lys-ser, carnosine, composés d'acide aminé N-acyl, rétinoïdes, propionate de rétinyl, rétinol, palmitate de rétinyl, acétate de rétinyl, rétinal, acide rétinoïque, vitamines hydrosolubles, ascorbates, vitamine C, glucoside ascorbyl, palmitate ascorbyl, magnesium ascorbyl phosphate, sodium ascorbyl phosphate, vitamines et leurs sels et dérivés, provitamines et leurs sels et dérivés, éthyle de panthénol, vitamine A et ses dérivés, vitamine B et ses dérivés, vitamine Bl , vitamine B2, vitamine B6, vitamine B 12, vitamine E, vitamine F, vitamine K et ses dérivés, acide pantothénique et ses dérivés, éther éthylique de pantothényle, panthénol et ses dérivés, panthénol éthylique, dexpanthénol, biotine, acides aminés et leurs sels et les dérivés, acides aminés hydrosolubles, asparagine, alanine, indol, acide glutamique, vitamines insolubles dans l'eau, bêta-ionol, cedrol, et leurs dérivés, acides aminés insolubles dans l'eau, tyrosine, tryptamine, matériaux particulaires, hydroxytoluène butylé, hydroxyanisole butylé, allantoine, nicotinate de tocophérol, tocophérol, esters de tocophérol, palmitoyl-gly-his-lys, phytostérol, hydroxy acides, acide glycolique, acide lactique, acide lactobionique, kétoacides, acide pyruvique, acide phytique, acide lysophosphatidique, stilbenes, cinnamates, resveratrol, kinétine, zeatin, dimethylaminoethanol, peptides naturels, les peptides de soja, sels de sucres acides, gluconate de manganèse, gluconate de zinc, olamine de piroctone, 3,4,4'- trichlorocarbanilide, triclocarban, pyrithione de zinc, hydroquinone, acide kojique, acide ascorbique, magnésium ascorbyl phosphate, ascorbyl glucoside, pyridoxine, l'aloe vera, les alcools de terpène, allantoine, bisabolol, glycyrrhizinate dipotassique, acide de glycérol, de sorbitol, de pentaerythritol, de pyrrolidone et ses sels, dihydroxyacetone, erythrulose, glycéraldéhyde, tartaraldehyde, l'essence de clou de girofle, le menthol, le camphre, l'essence d'eucalyptus, eugénol, le lactate de menthyle, le distillât d'hamamélis, copolymère d'eicosene et vinyl pyrrolidone, iodopropyl butylcarbamate, un polysaccharide, un acide gras essentiel, un salicylate, un acide glycyrrhétinique, des caroténoïdes, des céramides et des pseudo-céramides, un lipide complexe, les huiles en général d'origine naturelle tels le beurre de karité, l'huile d'abricot, l'huile d'onagre, l'huile de pruneau, l'huile de palme, l'huile de monoï, l’huile de kahai, hydroquinone, l 'HEPES, la procystéine, l'O-octanoyl-6-D- maltose, le sel disodique d'acide méthyl glycine diacétique, les stéroïdes tels que la diosgénine et les dérivés de la DHEA, la DHEA déhydroépiandrostérone et/ou un précurseur ou dérivé chimique ou biologique, le N-éthylcarbonyl-4-para- aminophénol, les alpha hydroxy acides, les bêta hydroxy acides, les hydratants, les enzymes hydrolytiques épidermiques, les extraits de plantes, les phytohormones, les extraits de levure, un inhibiteur de métalloprotéinases, les enzymes, les inhibiteurs enzymatiques, les inducteurs enzymatiques, les coenzymes, les agents chélatants, les extraits végétaux et dérivés de plantes, les huiles essentielles, les extraits marins, les agents venant d'un procédé de biofermentation et/ou de biotechnologie, les sels minéraux, les extraits cellulaires.
[0104] A titre d’exemples, on peut encore citer les peptides commercialisés par Ashland sous les noms de Chronogen™, Laminixyl™ IS, Peptide Q10™, Collaxyl™ (brevet FR2827170, Ashland), Peptide vinci™ 01 (brevet FR2837098, Ashland), Peptide vinci™ 02 (brevet FR2841781, Ashland), ATPeptide™ (brevet FR2846883, Ashland) et l’extrait d’Artémia salina, commercialisé sous le nom GP4G™ (FR2817748, Ashland).
Utilisations
[0105] L’invention a pour quatrième objet l’utilisation cosmétique de l’une des compositions comprenant le complexe moléculaire ou l’hybride décrit précédemment pour réduire au moins un signe du vieillissement cutané choisi parmi: raffermir la peau, améliorer son élasticité et son hydratation, atténuer et limiter l’apparition des rides et ridules et également améliorer l’homogénéité du teint.
[0106] Le terme « utilisation cosmétique » signifie que l’utilisation est prévue pour des individus ayant une peau, un cuir chevelu ou des phanères sains.
[0107] Par « signes du vieillissement cutané » on entend toute modification de l'aspect extérieur de la peau due au vieillissement comme, par exemple, l’apparition de rides et ridules au niveau des coins des lèvres et des pattes d’oie, le flétrissement, la perte d'élasticité, de fermeté et/ou de tonus de la peau, l’apparition d’un teint plus terne et moins homogène mais également toutes modifications internes de la peau qui ne se traduisent pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, l’amincissement de la peau, ou toutes dégradations internes de la peau consécutives à des agressions extérieures produisant des radicaux libres, telles que la pollution et les rayonnements solaires incluant les UV.
[0108] La matrice extracellulaire est un des premiers déterminants de la morphologie faciale, le complexe moléculaire de l’invention a donc été testé sur l’expression des collagènes I, III, IV, V, VI, VII, XVII et de l’acide hyaluronique et a montré un effet positif sur l’expression de ces composés.
[0109] L’invention concerne ainsi l’utilisation cosmétique de la composition comprenant le complexe moléculaire ou l’hybride décrit précédemment pour augmenter l’expression des collagènes I, III, V, VI, VIII, XI, XIIX, XXIV, XXVII, impliqués dans le vieillissement cutané et plus généralement dans le relâchement de la peau et l’apparition de rides et ridules et pour augmenter l’expression des collagènes IV, VII, XVII présents dans la jonction dermo- épidermique et également augmenter l’expression de l’acide hyaluronique.
[01 10] La composition de l’invention a été testée sur l’expression du collagène I et a montré un effet positif supérieur à l’effet obtenu en utilisant chaque composé séparément, ce qui démontre un effet de synergie entre les différents composants du complexe moléculaire.
[01 1 1 ] L’invention concerne encore l’utilisation cosmétique de l’hybride décrit précédemment pour augmenter l’effet texturant d’une formulation.
[01 12] L’invention concerne encore une méthode de traitement cosmétique pour réduire au moins un signe du vieillissement cutané choisi parmi : raffermir la peau, améliorer son élasticité et son hydratation, atténuer et limiter l’apparition des rides et ridules et également améliorer l’homogénéité du teint, comprenant l’application topique sur au moins une zone de peau à traiter, de l’une des compositions décrites précédemment.
[01 13] L’invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant un tel complexe moléculaire ou hybride qui peuvent se présenter sous forme de compositions injectables, pour administration orale ou pour application topique, pour leurs utilisations pour stimuler l’expression de l’acide hyaluronique et des collagènes dans diverses applications en médecine esthétique et régénérative.
[01 14] En particulier, l’invention a pour objet une composition comprenant le complexe moléculaire pour son utilisation pour améliorer la cicatrisation, limiter l’inflammation, ou pour son utilisation pour réparer le cartilage et traiter l’arthrose.
Exemples
[01 15] La présente invention est illustrée au moyen des exemples non limitatifs suivants :
Exemple 1 : Préparation d’un complexe moléculaire comprenant de l’acide hyaluronique d’un poids moléculaires 3 kDa à 5 kDa et de deux peptides
[01 16] Principe : le but de cette expérience est d’obtenir un complexe moléculaire constitué d’acide hyaluronique avec des peptides dont les interactions moléculaires sont les plus fortes possibles.
[01 17] Protocole : L’acide hyaluronique utilisé est commercialisé sous le nom de microHATM Super Active Hyaluronic Acid par Bloomage Biotech. Il est issu de la fermentation bactérienne, se présente sous forme de poudre et a un poids moléculaire compris entre 3 kDa et 5 kDa.
[01 18] a) L’acide hyaluronique sous forme poudre est solubilisé dans 1 litre d’eau osmosée à une concentration de 6000 ppm, à température ambiante (20 °C) sous agitation magnétique de moyenne intensité pendant 5 minutes.
[01 19] b) Le tripeptide-1 à une concentration de 2000 ppm et l'hexapeptide-9 à une concentration de 200 ppm, sous forme de poudre, sont solubilisés à température ambiante sous agitation moyenne pendant 20 minutes dans la solution obtenue à l’étape a). Le pH initial de cette solution est 7.2.
[0120] c) Le pH est ajusté par addition d’acide citrique dilué à 50 % pour atteindre la valeur de pH 2.8.
[0121 ] d) La solution est maintenue pendant 1 heure sous agitation magnétique moyenne, à température ambiante, à pH acide 2.8.
[0122] e) Le pH est réajusté à une valeur de 5.0 par l’ajout d’hydroxyde de sodium concentré. [0123] Résultats : la solution contenant le complexe moléculaire obtenue est incolore et limpide.
[0124] Optionnellement, le complexe moléculaire obtenu ci-dessus peut être dilué à une concentration de 10 % dans un vecteur cosmétique lui-même composé de 40 % à 52 % d’eau, de 47 à 57% de glycérine et de 1 % à 3 % d’un mélange de plusieurs carboxyméthyl celluloses de grades et de degrés de substitution différents. Ce mélange particulier présente l’avantage d’être facile à incorporer dans une formulation cosmétique finie et est décrit dans la présente demande sous le nom de « hybride ».
Exemple 2 : Caractérisation par FTIR du complexe moléculaire obtenu selon le procédé 1 de l’exemple 1 , en comparaison avec des mélanges obtenus à des pH différents
[0125] Principe : le but de cette expérience est de valider l’intérêt du procédé de l’exemple 1 , et en particulier le rôle des ajustements de pH, en comparant les structures moléculaires des différents mélanges d’acides hyaluronique et de peptides obtenus selon différents procédés de préparation, par FTIR (Spectrométrie Infra-Rouge à Transformée de Fourier).
[0126] Le spectre infrarouge obtenu est compris entre 600 et 4000 cm-1 et peut être divisé en deux :
[0127] La partie des « groupes fonctionnels » de -4000 cm-1 à 1500 cm-1 est une région du spectre facilement analysable.
[0128] La « région empreinte » va de 1500 cm-1 à 600 cm-1 . Il s'agit d'une zone complexe à interpréter, ayant uniquement une valeur comparative.
[0129] Protocole : Les trois procédés réalisés sont présentés ci-dessous dans le tableau 1 :
[0130] [Tableau 1 ] [0131 ] Les solutions obtenues selon les 3 procédés ci-dessus sont congelées à moins 80°C puis lyophilisées afin d’obtenir une poudre analysable par spectrométrie FTIR sur un spectromètre FT-IR Perkin Elmer Spectrum 100 équipé d’un module ATR diamant qui permet d’analyser des poudres sans préparation particulière.
[0132] Les poudres sont déposées de manière à recouvrir complètement le diamant du spectromètre FT-IR. Les échantillons sont ensuite pressés avec une force de pression de 80 à l’aide d’une jauge, afin d’éliminer l’air emprisonné entre les grains.
[0133] Résultats : Les spectres des trois complexes moléculaires obtenus par FTIR présentés dans la figure 1 montrent des profils différents aussi bien dans la région des groupes fonctionnels que dans la région « empreinte ». Les mélanges d’acide hyaluronique et de peptide obtenus selon les 3 procédés ont des structures moléculaires différentes et ont aussi une « région empreinte » spécifique.
[0134] La mesure des facteurs de corrélation entre les différents spectres permet d’apprécier la différence de structure entre les différents mélanges obtenus.
[0135] En effet, des spectres identiques ont une corrélation de 1 , mais plus le facteur de corrélation diminue, plus les spectres, et donc les structures moléculaires, sont différents.
[0136] Ainsi, le facteur de corrélation entre les spectres des mélanges obtenus par les procédés 1 et 3 est faible (0,163234), ce qui démontre d’importantes différences dans leur structure. Conclusion : Les ajustements de pH provoquent d’importantes modifications de la structure des complexes moléculaires obtenus.
Exemple 3 : Evaluation de la stabilité des complexes moléculaires par spectrophotométrie et colorimétrie
[0137] Principe : le but de cette expérience est d’évaluer la stabilité du complexe moléculaire obtenu selon l’exemple 1 (procédé 1 ) et le mélange obtenu selon le procédé 2 de l’exemple 2 décrits dans le tableau 1 , et en particulier d’évaluer l’impact des modifications de pH sur la stabilité.
[0138] Protocole : Les solutions obtenus par les procédés 1 et 2 (décrit dans le tableau 1 ) ont été placées 15 jours à 50°C. Les différences d’aspect des solutions ont ensuite été analysées par spectrophotométrie en mesurant les paramètres L* a* b*. L* représente la luminance de la solution, a* et b* expriment l’écart de la couleur par rapport à une solution non colorée, a* représentant la valeur sur un axe vert- rouge et b* sur un axe bleu-jaune.
[0139] La couleur des solutions a été mesurée selon l’échelle de Gardner, qui permet de comparer les couleurs des liquides sur une échelle allant de 0 à 18 ; 0 étant un liquide incolore et 18 étant un liquide marron foncé.
[0140] Résultat : Au jour 0, les 2 solutions sont limpides et incolores. Après 15 jours à 50°C, le complexe moléculaire de l’exemple 1 (procédé 1 ) a des paramètres colorimétriques semblables au jour O, alors que le complexe moléculaire obtenu par le procédé 2, c’est-à-dire sans ajustement du pH est devenu jaune. Les résultats sont présentés dans le tableau 2.
[0141 ] [Tableau 2] complexe moléculaire stable après 15 jours à 50 °C, contrairement au complexe moléculaire obtenu sans ajustement du pH.
Exemple 4 : Evaluation de l’effet de l’hybride comprenant le complexe moléculaire sur l’expression de différents types de collagènes et de l’acide hyaluronique
[0143] Principe : Le but de cette expérience est de démontrer un effet de l’hybride obtenu selon l’exemple 1 et comprenant donc 10 % de complexe moléculaire sur l’expression des collagènes I, III, IV, V, VI, VII, XVII et de l’acide hyaluronique dans des biopsies de peau humaine ex vivo.
[0144] Protocole : L’expression des différents collagènes et de l’acide hyaluronique est évaluée par immunofluorescence indirecte sur des biopsies de peau, traitées au préalable par application topique de l’hybride obtenu selon l’exemple 1 à une concentration de 5 % dilué dans du PBS, pendant 48 heures (2 fois par jour). Des biopsies de contrôle incubées en parallèle dans les mêmes conditions reçoivent du Phosphate Buffer Saline (PBS). Au terme de l’incubation, les biopsies sont fixées et incluses en paraffine et en milieu de montage pour cryostats, pour la réalisation de coupes histologiques.
[0145] La détection des différends collagènes, et de l’acide hyaluronique est réalisée par incubation avec des anticorps anti-Collagène I (Proteintech) ; anti- Collagène III (Proteintech), anti-Collagène IV (Merck Millipore), anti-Collagène V (Proteintech), anti-Collagène VI (Proteintech), anti-Collagène VII (Sigma-Aldrich), anti-Collagène XVII (Abeam) et une sonde HABP (hyaluronan-binding protein) - biotinylée (Merck-millipore). Après deux heures d’incubation suivie de rinçages, les coupes sont incubées en présence de l’anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) pour détecter les collagènes I, III, V, VI, et XVII. Les coupes sont incubées en présence de l’anticorps secondaire anti-souris couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) pour détecter les collagènes IV et VIL Un système biotine/streptavidine couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) est utilisé pour détecter l’acide hyaluronique. Les coupes sont ensuite examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse Ni), piloté par le logiciel NIS-Element (Nikon). Les niveaux d’expression sont quantifiés par analyse d’image (logiciel Volocity®, Improvision). [0146] Résultats : Lorsque les biopsies ont été traitées par l’hybride à 5 %, l’expression des collagènes I, III, IV, V, VI, VII, XVII et de l’acide hyaluronique a augmenté de façon significative, après 48 heures de traitement en comparaison avec les échantillons de contrôle. Les résultats sont présentés dans la figure 2.
[0147] Conclusion : l’hybride obtenu selon l’exemple 1 , comprenant 10 % de complexe moléculaire a montré un effet positif sur l’expression des collagènes I, III, IV, V, VI, VII, XVII et la synthèse d’acide hyaluronique dans des biopsies de peau humaine ex vivo.
Exemple 5 : Evaluation de l’effet synergique de l’hybride comprenant le complexe moléculaire sur l’expression du collagène I
[0148] Principe : Le but de cette expérience est de démontrer un effet synergique de l’hybride obtenu selon l’exemple 1 comprenant 10 % de complexe moléculaire sur l’expression du collagène I dans des biopsies de peau humaine ex vivo.
[0149] Protocole : Le traitement par l’hybride de l’exemple 1 est réalisé comme dans l’exemple 4.
[0150] Les traitements en conditions contrôles sont réalisés comme suit :
[0151 ] Des solutions mères d’acide hyaluronique à 600 ppm, d’hexapeptide-9 à 20 ppm et de tripeptide-1 à 200 ppm, ont été diluées à 5 % dans du PBS.
[0152] La détection du collagène I est réalisée par incubation avec de l’anticorps anti-Collagène I (Proteintech). Après deux heures d’incubation suivie de rinçages, les coupes sont incubées en présence de l’anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) pour détecter le collagènes I. Les coupes sont ensuite examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse Ni), piloté par le logiciel NIS-Element (Nikon). Finalement Les niveaux d’expression sont quantifiés par analyse d’image (logiciel Volocity®, Improvision).
[0153] Résultats : Lorsque les biopsies ont été traitées par l’hybride à 5 %, l’expression du collagène I a augmenté de manière plus importante que lorsque les biopsies ont été traitées séparément par le tripeptide-1 à 5 %, l'hexapeptide-9 à 5 % ou l’acide hyaluronique à 5 %, tel que présenté dans la figure 3.
[0154] Conclusion : L’hybride comprenant 10 % du complexe moléculaire de l’exemple 1 a montré un effet synergique sur l’expression du collagène I, puisque les effets de l’hybride sont supérieurs à l’augmentation moyenne de l’expression du collagène I propre à chacun des composés pris séparément.
Exemple 6 : Evaluation de l’effet du complexe moléculaire obtenu selon le procédé de l’exemple 1 comparé au procédé 2 de l’exemple 2 sur l’expression des collagènes I et IV
[0155] Principe : Le but de cette expérience est de comparer l’effet du complexe moléculaire obtenu selon le procédé 1 de l’exemple 1 versus l’effet du mélange obtenu selon le procédé 2 de l’exemple 2 sur l’expression des collagènes I et IV dans des biopsies de peau humaine ex vivo.
[0156] Protocole : L’expression de ces deux collagènes est évaluée par immunofluorescence indirecte sur des biopsies de peau, traitées au préalable par application topique du complexe moléculaire obtenu selon le procédé 1 à une concentration de 0.5 % dilué dans du PBS, pendant 48 heures (2 fois par jour). En parallèle, des biopsies de peau sont traitées par application topique du mélange issu du procédé 2 de l’exemple 2 à une concentration de 0.5 % dilué dans du PBS, pendant 48 heures (2 fois par jour). Des biopsies de contrôle incubées en parallèle dans les mêmes conditions reçoivent du Phosphate Buffer Saline (PBS). Au terme de l’incubation, les biopsies sont fixées et incluses en paraffine pour la réalisation de coupes histologiques.
[0157] La détection des collagènes I et IV est réalisée par incubation avec des anticorps anti-Collagène I (Proteintech) et anti-Collagène IV (Merck Millipore). Après deux heures d’incubation suivie de rinçages, les coupes sont incubées en présence de l’anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) pour détecter le collagène I. Les coupes sont incubées en présence de l’anticorps secondaire anti-souris couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) pour détecter les collagènes IV. Les coupes sont ensuite examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse Ni), piloté par le logiciel NIS-Element (Nikon). Les niveaux d’expression sont quantifiés par analyse d’image (logiciel Volocity®, Improvision).
[0158] Résultats : Lorsque les biopsies ont été traitées par le complexe moléculaire obtenu selon le procédé 1 et par le mélange obtenu selon le procédé 2 à 0.5 %, l’expression des collagènes I et IV a augmenté de façon significative, après 48 heures de traitement en comparaison avec les échantillons de contrôle. L’augmentation de l’expression des collagènes I et IV observé sur les biopsies traitées par le complexe moléculaire obtenu selon le procédé 1 est significativement supérieure à l’augmentation observée suite au traitement des biopsies avec le mélange obtenu selon le procédé 2. Les résultats sont présentés dans la figure 4.
[0159] Conclusion : Le complexe moléculaire obtenu selon le procédé 1 de l’exemple 1 a montré un effet supérieur sur l’expression des collagènes I et IV, par rapport à un mélange obtenu selon le procédé 2.
Exemple 7 : Formulation de l’hybride de l’exemple 1 dans un gel aqueux
[0160] [Tableau 3] : Liste des Ingrédients pour la formulation d’un gel aqueux
[réf.. # 12951 ]
[0161 ] Description : gel transparent
[0162] pH : 5,5 - 6,5
[0163] viscosité : 3,000 - 6,000
Exemple 8: Evaluation de l’effet de l’hybride selon l’exemple 1 sur la texture d’une crème
[0164] Principe : évaluer l’effet texturant de l’hybride selon l’exemple 1 , formulé à 5% et comparer sa texture à une crème contenant 5% de silicone
[0165] Protocole : étude comparative en double aveugle contre une crème contenant 5 % de silicone, menée sur le dos de la main de 8 volontaires experts et 10 volontaires consommateurs.
[0166] [Tableau 4]: formule de soin contenant l’hybride de l’exemple 1 à 5% utilisée dans le test texturant.
[0167] [Tableau 5]: formule de soin contenant le silicone à 5% utilisé dans le test texturant.
[0168] Les 8 volontaires expert ont comparé l’effet texturant des 2 crèmes suivant le questionnaire du tableau 6 et les 10 volontaires consommateurs suivant le questionnaire du tableau 7.
[0169] [tableau 6] : questionnaire pour les volontaires experts.
[0170] [tableau 7] : questionnaire pour les volontaires consommateurs.
[0171 ] Les mesures ont été effectuées à 21°C +/-1 et avec un taux d’humidité relative de 50 % +/- 5.
[0172] Les résultats montrent que les volontaires experts et consommateurs ont donné des scores comparables aux deux crèmes trouvant la texture des deux crèmes similaires comme illustré dans la figure 5.
[0173] Conclusion du test : les résultats ci-dessus démontrent que l’hybride selon l’exemple 1 formulé à 5% procure un effet texturant à la crème.
Exemple 9 : Evaluation in vivo (clinique) de l’hybride selon l’exemple 1 formulé à 5% sur l’apparition des rides ainsi que sur l’hydratation et l’élasticité de la peau. Effet à court et long terme.
[0174] Principe : Etudier l’efficacité in vivo de l’hybride selon l’exemple 1 , formulé à 5% et faire le lien avec la composition de l’hybride et les résultats in vitro obtenus sur les différents collagens.
[0175] Protocole : 2 études comparatives en double aveugle contre placebo ont été menées sur le visage de 30 volontaires d’origine asiatique (âgés de 40 à 63 ans) et sur le visage de 34 volontaires d’origine caucasienne (âgés de 37 à 69 ans). Les volontaires d’origine asiatique ont appliqué d’un côté un masque contenant l’hybride et d’un côté le placebo pendant 25 minutes, d’une manière aléatoire faite par randomisation. Les volontaires d’origine caucasienne ont été répartis aléatoirement en deux groupes de 17 volontaires homogène en âge et en genre et ont appliqué soit la crème contenant l’hybride à 5% soit le placebo.
[0176] [Tableau 8] : Formule de soin contenant l’hybride de l’exemple 1 à 5% utilisée pour le test clinique sur peau asiatique.
[0177] Le côté placebo a reçu la même formule de soin mais ne contenant pas l’hybride.
[0178] [Tableau 9] : Formule de soin contenant l’hybride de l’exemple 1 à 5% utilisée dans le test clinique sur peau caucasienne.
[0179] Le groupe placebo a reçu la même formule de soin mais ne contenant pas l’hybride.
[0180] Durée de l’étude : 1 jour pour l’étude sur peau asiatique et 28 jours pour l’étude sur peau caucasienne.
[0181 ] Visites de contrôle : à T0 (mesure avant application), T30min et T4h pour l’étude sur peau asiatique
[0182] à D0 (premier jour de l’étude), D14 (14 jours après application) et D28 (28 jours après application) pour l’étude sur peau caucasienne.
[0183] Mesures :
[0184] - Mesure de l’hydratation de la peau avec le Corneometer® CM 825
(Courage & Khazaka®) [0185] - Acquisitions de la topographie de la peau des pattes d’oie par réplique de silicone et analysée par le logiciel VL650 et par projection de franges et stéréométrie associé au système AEAVA-HE® (Eotech®). Les différents paramètres des rides des pattes d’oie (circonférence, profondeur, longueur...) ont été mesurés et des représentations 2D et 3D de la topographie de la peau ont été effectuées.
[0186] - Photos couleur du visage avec leVisia-CR® et le banc HeadScan* V03 (Orion Concept*).
[0187] - mesure de l’élasticité de la peau avec le cutometer® dual MPA 580 (Courage & Khazaka®)
[0188] - Évaluation sur une échelle de 0 à 100 par un expert et par les volontaires de l’état de la peau du visage au toucher et selon l’aspect visuel des paramètres suivants :
[0189] - hydratation de la peau : 0 correspondant à une peau sèche et déshydratée et 100 à une peau très bien hydratée.
[01 0] - Ride de la patte d’oie : 0 correspondant à une peau lisse sans ride et 100 à une peau avec des rides marquées et très visibles.
[0191 ] - Tonicité de la peau : 0 correspondant à une peau flasque sans tonicité et 100 à une peau très ferme avec une très bonne tonicité
[0192] Les mesures ont été effectuées sur le sujet après de 15 minutes de repos dans une pièce à 21°C +/-1 et avec un taux d’humidité relative de 50 % +/- 5.
[0193] Résultats :
[0194] Comme illustré dans la figure 6, les résultats des mesures de l’hydratation montrent une augmentation de celle-ci après 30 min et 4h l’application sur peau asiatique ainsi qu’après 14 et 28 jours d’application sur peau caucasienne. Ces résultats soutiennent l’intérêt de diluer à une concentration de 10 % notre complexe moléculaire dans 90 % d’un vecteur cosmétique connu pour ces propriétés hydratantes
[0195] Les résultats des mesures de la topographie de la peau au niveau des pattes d’oie montrent une diminution des différents paramètres des rides après application de la crème contenant l’hybride comparé au placebo. Sur peau asiatique, une diminution de la longueur, de la profondeur, de l’aire mais aussi du nombre de rides est observée 4h après le retrait du masque. Concernant l’étude sur peau caucasienne une diminution est observée après 1 mois d’application pour la circonférence et l’aire des rides pour le groupe ayant appliqué la crème contenant l’hybride à 5% comparé au placebo. Les résultats sont résumés dans le tableau 10. [0196] [Tableau 10] : résultats des mesures de la topographie de la peau au niveau des pattes d’oie lors de l’étude sur peau asiatique et lors de l’étude sur peau caucasienne.
*: significatif; *** : hautement significatif, ****: extrêmement significatif avec e test t de Student
[0197] Une amélioration de l’élasticité de la peau est observée après application de la crème contenant l’hybride comparé au placebo aussi bien dans l’étude asiatique que caucasienne.
[01 8] Ces résultats sont en adéquation avec les résultats obtenus in vitro sur les différents collagènes mais aussi montrent l’intérêt de diluer à une concentration de 10% notre complexe moléculaire dans 90% d’un vecteur cosmétique. En effet, le vecteur cosmétique permet d’obtenir un effet rapide après application en apportant une bonne hydratation à la peau et donc améliorant le microrelief et l’élasticité de celle-ci. L’effet long terme est quant à lui obtenu par le complexe moléculaire qui en agissant sur plusieurs familles de collagène va permettre une diminution des rides et une amélioration de l’élasticité.
[0199] Ces résultats sont confirmés par l’observation des photos couleur du visage et l’évaluation de l’expert et des volontaires.
[0200] Conclusion des tests : les résultats ci-dessus démontrent que l’hybride selon l’exemple 1 formulé à 5% permet à court terme et long terme d’atténuer et de limiter l’apparition des rides et ridules, d’améliorer l’élasticité de la peau mais aussi l’hydratation.

Claims

Revendications
[Revendication 1 ] Procédé de préparation d’un complexe moléculaire comprenant une fraction peptidique et de l’acide hyaluronique, caractérisé en ce que le complexe moléculaire n’est pas lié par des liaisons covalentes et est obtenu par le procédé suivant : a) solubiliser la poudre d’acide hyaluronique d’un poids moléculaire compris entre 3 kDa et 10 kDa, et préférentiellement entre 3 kDa et 5 kDa, dans un solvant aqueux, de préférence de l’eau, à une concentration comprise entre 5 000 ppm et 10000 ppm sous agitation modérée, pendant un temps compris entre 5 min et 30 minutes, à une température comprise entre 20°C et 50°C, préférentiellement entre 20°C et 30°C ; b) ajouter la fraction peptidique sous forme de poudre, comprenant au moins un peptide synthétique ou purifié à partir de plantes, d’algues, de champignons ou de levures, comprenant de 3 à 12 acides aminés et préférentiellement de 3 à 9 acides aminés, dans la solution préparée à l’étape précédente, à une concentration comprise entre 10 ppm et 25 000 ppm, préférentiellement entre 30 ppm et 5 500 ppm, sous agitation modérée, à une température comprise entre 20°C et 50°C; préférentiellement entre 20°C et 30°C ; c) ajuster le pH à une valeur comprise entre 2 et 3,5, de préférence entre 2,5 et 3; d) laisser sous agitation moyenne pendant une durée comprise entre 30 min et 3 heures, de préférence 1 heure, à une température comprise entre 20°C et 50°C, préférentiellement entre 20°C et 30°C; e) ajuster le pH à une valeur comprise entre 4.5 et 6.5, préférentiellement entre 4.5 et 5.5.
[Revendication 2] Procédé de la revendication 1 , dans lequel la fraction peptidique de l’étape b) consiste en un mélange de tripeptide-1 à une concentration comprise entre 500 ppm et 5000 ppm, de préférence entre 1000 ppm et 3000 ppm, et d’hexapeptide-9 de séquence (SEQ ID : No 1 ) à une concentration comprise entre 20 ppm et 500 ppm, de préférence entre 50 ppm et 300 ppm, dans la solution d’acide hyaluronique obtenue à l’étape précédente.
[Revendication 3] Procédé de l’une des revendications 1 ou 2, dans lequel le ratio massique entre l’acide hyaluronique et la fraction peptidique est compris entre 10/1 et 2/ 1 , et préférentiellement entre 4/1 et 2/ 1 .
[Revendication 4] Procédé de l’une des revendications 1 à 3, comprenant en outre une étape f) dans laquelle 5 % à 40 %, préférentiellement 5 % à 15 % et encore plus préférentiellement 10 % du complexe moléculaire obtenu à l’étape e) est dilué dans un vecteur cosmétique comprenant de l’eau, de la glycérine et un mélange de plusieurs carboxyméthyl celluloses de grades et de degrés de substitution différents, pour obtenir un hybride.
[Revendication 5] Procédé de la revendication 4, dans lequel le vecteur cosmétique comprend de 40 % à 52 % d’eau, de 47 à 57% de glycérine et de 1 % à 3 % d’un mélange de carboxyméthyl celluloses.
[Revendication 6] Complexe moléculaire obtenu par le procédé de l’une des revendications 1 à 3.
[Revendication 7] Hybride obtenu par le procédé de l’une des revendications 4 ou 5.
[Revendication 8] Composition comprenant une quantité efficace du complexe moléculaire de la revendication 6 en tant qu’agent actif et un milieu physiologiquement acceptable.
[Revendication 9] Composition de la revendication 8, caractérisée en ce qu’elle comprend entre 0,01 % et 10 %, préférentiellement entre 0,05 % et 5 % et encore plus préférentiellement entre 0,1 % et 2 % du complexe moléculaire, en poids par rapport au poids total de la composition.
[Revendication 10] Composition comprenant une quantité efficace de l’hybride de la revendication 7 en tant qu’agent actif et un milieu physiologiquement acceptable.
[Revendication 1 1 ] Composition de la revendication 10, caractérisée en ce qu’elle comprend entre 1 % et 10 % et préférentiellement 5 % d’hybride, en poids par rapport au poids total de la composition.
[Revendication 12] Utilisation cosmétique de la composition de l’une des revendications 8 à 1 1 pour réduire au moins un signe du vieillissement cutané choisi parmi: raffermir la peau, améliorer son élasticité et son hydratation, atténuer et limiter l’apparition des rides et ridules et également améliorer l’homogénéité du teint.
[Revendication 13] Utilisation cosmétique selon la revendication 12, dans laquelle l’expression des collagènes I, III, IV, V, VI, VII, XXVII XVII et XXIV, ainsi que l’expression de l’acide hyaluronique sont augmentées.
[Revendication 14] Composition de l’une des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation en médecine esthétique et régénérative pour améliorer la cicatrisation, limiter l’inflammation, ou pour son utilisation pour réparer le cartilage et traiter l’arthrose.
[Revendication 15] Utilisation de l’hybride de la revendication 7 pour augmenter l’effet texturant d’une formulation.
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