WO2026005252A1 - 파수딜과 젤라틴을 이용한 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 - Google Patents

파수딜과 젤라틴을 이용한 줄기세포 유래 간세포 분화 방법

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WO2026005252A1
WO2026005252A1 PCT/KR2025/005783 KR2025005783W WO2026005252A1 WO 2026005252 A1 WO2026005252 A1 WO 2026005252A1 KR 2025005783 W KR2025005783 W KR 2025005783W WO 2026005252 A1 WO2026005252 A1 WO 2026005252A1
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hepatocytes
gelatin
differentiation
composition
stem cells
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탁은영
최지완
강서온
김지예
이주영
안혜인
남궁정만
윤영인
이승규
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Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Original Assignee
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
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    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a method for differentiating stem cells from hepatocytes using fasudil and gelatin.
  • differentiation refers to the process by which cells in the early stages acquire the characteristics of each tissue.
  • a representative example of this can be seen in the development of animals.
  • a single cell called a fertilized egg created when a sperm and an egg unite, must undergo 'differentiation' to develop into various tissue cells such as bone, heart, and skin.
  • Stem cells which possess this differentiation ability, are cells at the stage before differentiating into the individual cells that make up a tissue. They are cells that can proliferate indefinitely in an undifferentiated state and have the potential to differentiate into cells of various tissues when stimulated by specific differentiation stimuli.
  • mesenchymal stem cells are derived from human fetal and adult tissues, such as bone marrow, umbilical cord matrix, and placenta, as well as various adult tissues.
  • fetal tissues such as the umbilical cord matrix and placenta are excellent sources of human MSCs due to their unique advantages, including painless collection procedures, rapid self-renewal, and the ability to differentiate into three germ layers. Therefore, human umbilical cord matrix-derived MSCs (hUCM-MSCs) and their differentiated cells have recently been utilized in therapeutic medicine for tissue regeneration to treat various diseases.
  • liver accounting for approximately 3% of human body weight, is an organ that performs crucial functions.
  • Hepatocytes the core cells of the liver, are responsible for the biosynthesis and breakdown of glycogen, proteins, lipids, nucleic acids, and vitamins, as well as the detoxification of toxic substances.
  • most patients with liver disease lack this normal liver function due to liver tissue damage, which reduces the regenerative capacity of hepatocytes.
  • the number of deaths from liver disease in Korea is reported to be as high as 11,000 per 100,000 people.
  • histocompatible liver tissue transplantation is currently the most effective treatment for liver disease, it suffers from the significant difficulty of finding donors.
  • stem cells significant attention is being focused on cell therapy using stem cells.
  • stem cells the use of differentiated cells from stem cells for therapeutic purposes remains limited.
  • hepatocyte-like cells differentiated from human mesenchymal stem cells using known protocols exhibit characteristics more similar to fetal hepatocytes than adult cells in terms of transcriptomic profile, liver function, and metabolic activity. Therefore, various differentiation methods are being developed to address these challenges, including approaches utilizing genetic modification, microenvironmental manipulation, and the addition of cytokines and growth factors.
  • transcriptome changes are closely related to cell type differentiation when determining stem cell fate. Therefore, sequencing tools such as RNA sequencing have recently been widely used to analyze the transcriptome of differentiated cells worldwide.
  • cell fate is not simply determined by changes in transcriptional regulation.
  • Cell differentiation and lineage commitment are influenced by signaling pathways that involve communication between the nucleus and various biological processes, as well as interactions between cytoplasmic macromolecules and organelles.
  • metabolic changes accompany stem cell differentiation, which are known to play a crucial role in stem cell fate determination. Mitochondria play a pivotal role in cellular metabolism, determining cell fate and function.
  • lipid droplets (LDs) storage organelles central to lipid and energy homeostasis, have been reported to be related to stem cell fate determination. While the organelle status of stem cells is crucial for determining stem cell fate, it remains unknown whether regulation of organelle status in stem cells influences hepatic differentiation.
  • the present inventors confirmed that the differentiation of hUCM-MSCs into hepatocytes is affected not only by changes in the transcriptome but also by the state of cell organelles, and when fasudil, which induces differentiation into endoderm in the early stage of differentiation of stem cells into hepatocytes, is used in a culture vessel coated with high-viscosity gelatin, the differentiation efficiency of stem cells into hepatocytes can be improved by suppressing the formation of lipid droplets and activating the function of mitochondria, and when low-viscosity gelatin is added to the medium in the differentiation maturation (late) stage, the differentiation efficiency of hepatocytes into hepatocytes and the function of differentiated hepatocytes can be improved by reducing the accumulation of lipid droplets and activating mitochondria, thereby completing the present invention.
  • the present inventors conducted extensive research to develop an efficient stem cell-derived hepatocyte differentiation method, and as a result, they confirmed that when fasudil, which induces differentiation into endoderm in the early stage of differentiation, is used in a culture vessel coated with high-viscosity gelatin, the differentiation efficiency of stem cells into hepatocytes can be improved by suppressing the formation of lipid droplets and activating the function of mitochondria, and when low-viscosity gelatin is added to the medium in the differentiation maturation (late) stage, the accumulation of lipid droplets can be reduced and the function of differentiated hepatocytes can be improved by activating mitochondria, thereby completing the present invention.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for differentiating stem cells into hepatoblasts, which comprises a step of culturing stem cells in a medium containing a ROCK inhibitor in a culture vessel coated with gelatin to induce differentiation into hepatoblasts.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for culturing hepatocytes, comprising at least one selected from the group consisting of (a) a first composition comprising a ROCK inhibitor as an active ingredient; and (b) a second composition comprising gelatin as an active ingredient, characterized in that the first composition is added to a culture vessel coated with gelatin.
  • Another object of the present invention is to provide a hepatocyte culture kit comprising a hepatocyte culture composition according to the present invention and an instruction manual.
  • the present invention provides a method for differentiation of stem cells derived from hepatocytes, comprising a step of culturing stem cells in a culture medium containing a ROCK inhibitor in a gelatin-coated culture vessel to induce differentiation into hepatoblasts.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells derived from one or more tissues selected from the group consisting of umbilical cord stroma, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, and placenta, but are not limited thereto.
  • the ROCK inhibitor may be at least one selected from the group consisting of Fasudil, Ripasudil, RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, and Y-30141, but is not limited thereto.
  • the ROCK inhibitor may be included in the medium at a concentration of, but not limited to, 1 to 50 ⁇ M.
  • the gelatin may be coated on a culture vessel at a concentration of 0.1 to 10%, but is not limited thereto.
  • the step of inducing differentiation into hepatoma cells may be performed for 1 to 10 days, but is not limited thereto.
  • the step of inducing differentiation into hepatocytes may include, but is not limited to, the following steps:
  • (a-2) A step of culturing the hepatic endoderm in a medium containing growth factors, bone morphogenetic proteins, and wnt signal activators to induce differentiation into hepatocytes;
  • step (a-2) is performed in a culture vessel that is not coated with gelatin.
  • the method may further include, but is not limited to, a step of culturing hepatocytes in a medium containing gelatin to induce differentiation into hepatocytes.
  • the gelatin may be included in the medium at a concentration of, but not limited to, 0.1 mg/ml to 10 mg/ml.
  • the step of inducing differentiation into hepatocytes may include, but is not limited to, the following steps:
  • (b-2) A step of adding gelatin to the medium containing the above oncostatin M and further culturing to induce differentiation into hepatocytes.
  • the present invention provides a composition for culturing hepatocytes, comprising at least one selected from the group consisting of (a) a first composition comprising a ROCK inhibitor as an active ingredient; and (b) a second composition comprising gelatin as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for culturing hepatocytes, characterized in that the first composition is added to a culture vessel coated with gelatin.
  • the culture may induce differentiation of stem cells into hepatocytes, but is not limited thereto.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells derived from one or more tissues selected from the group consisting of umbilical cord matrix, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, and placenta, but are not limited thereto.
  • the ROCK inhibitor may be any one selected from the group consisting of, but not limited to, Fasudil, Ripasudil, RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, and Y-30141.
  • the ROCK inhibitor may be included at a concentration of, but not limited to, 1 to 50 ⁇ M.
  • the gelatin of the second composition may be included in the medium at a concentration of 0.1 mg/ml to 10 mg/ml, but is not limited thereto.
  • the second composition may further comprise, but is not limited to, oncostatin M.
  • gelatin may be coated on the culture vessel at a concentration of 0.1 to 10%, but is not limited thereto.
  • the first composition and the second composition may be used simultaneously, separately, or sequentially for culturing hepatocytes, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a hepatocyte culture kit including a composition for hepatocyte culture according to the present invention and an instruction manual.
  • the description may describe a method for differentiating stem cells derived from hepatocytes according to the present invention, but is not limited thereto.
  • the method for differentiating stem cells into hepatocytes induces differentiation of stem cells into endoderm with a ROCK inhibitor in the initial stage of differentiation of stem cells into hepatocytes, but suppresses the formation of lipid droplets that occur during this process by culturing cells in a culture dish coated with high-viscosity gelatin, activates mitochondrial function, upregulates the expression of endodermal genes, and downregulates the expression of ectoderm and mesodermal genes, thereby improving the differentiation efficiency of stem cells into hepatocytes.
  • hepatocytes obtained using this method are expected to be useful as cell therapeutic agents for the treatment of liver diseases, transplants, etc.
  • Figure 1a shows the results of confirming the change in the expression of endoderm markers (GATA4, SOX17, FOXA2) after treating hUCM-MSCs with 10 ⁇ M fasudil.
  • Figure 1b shows the results of confirming the change in the expression of endoderm markers (GATA4, SOX17, FOXA2) after treating hUCM-MSCs with fasudil for 72 hours.
  • Figure 1d shows the results of measuring the number of lipid droplets in hUCM-MSCs after treatment with Pasudil.
  • Figure 1e illustrates a protocol for inducing differentiation of hUCM-MSCs into hepatoblasts.
  • Figure 1g shows the results of confirming the expression of hepatocyte-related genes (AFP and HNF4A) on day 0, day 3, or day 7 of pasudil treatment.
  • Figure 1h shows the results of confirming mitochondrial function in hUCM-MSCs after treatment with Pasudil.
  • Figure 2a shows the results of examining mitochondrial function after culturing hUCM-MSCs on 0.1% or 1% gelatin-coated dishes.
  • Figure 2b shows the protocol for differentiation of hUCM-MSCs into hepatoblasts using a gelatin-coated dish and a phosphatase inhibitor.
  • Figure 2d shows the results of confirming the expression of endoderm markers (GATA4, SOX17, FOXA2) in hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish on days 0, 3, and 7.
  • Figure 2e shows the results of confirming the expression of hepatocyte-related genes (AFP, HNF4A) in hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish on days 0, 3, and 7 of differentiation.
  • AFP hepatocyte-related genes
  • Figure 2f shows the results of confirming the expression of ectoderm markers (PAX6, SOX1, OTX2) on the third day of differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish.
  • Figure 2g shows the results of confirming the expression of mesodermal markers (MIXL2, CDX2) on the third day of differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish.
  • Figure 3b shows the results of comparing the number of lipid droplets on the third day of differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish according to the viscosity of the coated gelatin.
  • Figures 3c and 3d show the results of comparing the mitochondrial function according to the viscosity of the coated gelatin on the third day of differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish.
  • Figure 3c shows the results of OCR measurement
  • Figure 3d shows the results of confirming the changes in mitochondrial respiration.
  • Figure 3e shows the results of comparing the number of mycochondria copies on the third day of differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish according to the viscosity of the coated gelatin.
  • Figure 4a shows a differentiation protocol from hepatocytes to hepatocytes using 0.1% or 1% gelatin.
  • Figure 4c shows the results of confirming the expression of mature hepatocyte-related genes (ALB, CYP3A4, CYP1A2, HNF1A, and HNF4A) on day 5 after differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish and adding 0.1% or 1% gelatin.
  • Figure 4d shows the results of Western blotting to confirm the expression of ALB and CYP3A4 proteins on the 5th day after differentiation of hUCM-MSCs treated with fasudil in a gelatin-coated dish and differentiation by adding 0.1% or 1% gelatin.
  • Figure 4e shows the results of Western blotting to confirm the expression of ALB and CYP3A4 proteins on day 5 after differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish and adding 0.1% or 1% gelatin, as confirmed by densitometric analysis.
  • Figure 4f shows the results of confirming the expression of hepatocyte-specific miRNA (miR-122, miR-192) on the 5th day after differentiation of hUCM-MSCs treated with fasudil in a gelatin-coated dish and adding 0.1% or 1% gelatin.
  • Figure 5a shows the results of measuring the amount of human albumin secreted on the 5th day after differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish and adding 0.1% or 1% gelatin (undiff: undifferentiated cells).
  • Figure 5b shows the results of measuring CYP3A4 activity on the 5th day after differentiation of hUCM-MSCs treated with fasudil in a gelatin-coated dish and adding 0.1% or 1% gelatin.
  • Figure 5d shows the results of checking the fluorescence intensity of lipid droplets on the 5th day after differentiation of hUCM-MSCs treated with fasudil in a gelatin-coated dish and adding 0.1% or 1% gelatin.
  • Figure 5e shows the results of checking the number of mitochondrial copies on the fifth day after differentiation of hUCM-MSCs differentiated by treating with fasudil in a gelatin-coated dish and adding 0.1% or 1% gelatin.
  • Figure 6 schematically illustrates a method for differentiating stem cell-derived hepatocytes according to the present invention.
  • the present inventors confirmed that when fasudil, which induces differentiation into endoderm in the early stage of differentiation of stem cells into hepatocytes, was used in a culture dish coated with high-viscosity (1%) gelatin, the formation of lipid droplets that occur during differentiation into endoderm was suppressed and mitochondrial function was activated, thereby improving the differentiation efficiency of stem cells into hepatocytes.
  • low-viscosity (0.1%) gelatin was added to the medium at the differentiation maturation (late) stage, the accumulation of lipid droplets was reduced and mitochondria were activated, thereby improving the differentiation efficiency of hepatocytes into hepatocytes and the function of differentiated hepatocytes.
  • the present invention provides a method for differentiation of stem cells into hepatocytes, comprising a step of culturing stem cells in a culture medium containing a ROCK inhibitor in a gelatin-coated culture vessel to induce differentiation into hepatoblasts.
  • the stem cell may be a mesenchymal stem cell derived from one or more types of tissue selected from the group consisting of umbilical cord stroma, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, and placenta, and according to one embodiment of the present invention, the stem cell may be a human umbilical cord stroma mesenchymal stem cell, but is not limited thereto.
  • the ROCK inhibitor may be at least one selected from the group consisting of Fasudil, Ripasudil, RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, and Y-30141, and according to one embodiment of the present invention, it may be Fasudil, but is not limited thereto.
  • Fasudil can not only increase the viability of stem cells, but is also characterized by being effective in differentiation as a small molecule, unlike general cytokines (protein type) used for differentiation.
  • gelatin used in the present invention refers to a derived protein obtained by hydrolyzing collagen, a natural polymer protein that constitutes animal bones, leather, tendons, cartilage, etc.
  • the general composition of gelatin may be composed of about 84 to 90% protein, 8 to 12% water, and 2 to 4% mineral salts.
  • gelatin may have various gel strengths and viscosities.
  • gelatin may be isolated or synthesized from natural substances, and the type of its raw material is not limited, and may be produced by hydrolyzing collagen isolated from leather, bone shell, etc. of mammals or fish.
  • the gelatin is 0.1 to 10%, 0.1 to 9%, 0.1 to 8%, 0.1 to 7%, 0.1 to 6%, 0.1 to 5%, 0.1 to 4%, 0.1 to 3%, 0.1 to 2%, 0.1 to 1%, 0.2 to 1%, 0.3 to 1%, 0.4 to 1%, 0.5 to 1%, 0.6 to 1%, 0.7 to 1%, 0.8 to 1%, 0.9 to 1%, 0.3 to 8%, 0.3 to 7%, 0.3 to 6%, 0.3 to 5%, 0.3 to 4%, 0.3 to 3%, 0.3 to 2%, 0.3 to It can be coated on a culture vessel at a concentration of 1%, 0.5 to 6%, 0.5 to 5%, 0.5 to 4%, 0.5 to 3%, 0.5 to 2%, 0.5 to 1%, 0.7 to 5%, 0.7 to 4%, 0.7 to 3%, 0.7 to 2%, 0.7 to 1%, 0.9 to 5%, 0.9 to 3%
  • the step of inducing differentiation into hepatocytes may be performed for 1 to 10 days, 1 to 9 days, 1 to 8 days, 1 to 7 days, 1 to 6 days, 1 to 5 days, 1 to 4 days, 1 to 3 days, 1 to 2 days, 2 to 8 days, 2 to 7 days, 2 to 6 days, 2 to 5 days, 2 to 4 days, 2 to 3 days, 3 to 7 days, 3 to 6 days, 3 to 5 days, 3 to 4 days, 4 to 7 days, 5 to 7 days, 6 to 7 days, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, or 7 days, but is not limited thereto.
  • the step of inducing differentiation into hepatocytes may include or consist of the following steps:
  • (a-2) A step of culturing the hepatic endoderm in a medium containing growth factors, bone morphogenetic proteins, and wnt signal activators to induce differentiation into hepatocytes;
  • step (a-2) is performed in a culture vessel that is not coated with gelatin.
  • the medium containing the ROCK inhibitor of step (a-1) is a DMEM/F12 medium supplemented with 1 to 20% fetal bovine serum, 0.1 to 5% non-essential amino acids, 0.1 to 5% antibiotic-antimycotic, and 0.05 to 5 mM L-ascorbic acid, wherein the ROCK inhibitor is present at a concentration of 1 to 50 ⁇ M, 1 to 40 ⁇ M, 1 to 30 ⁇ M, 1 to 20 ⁇ M, 1 to 10 ⁇ M, 2 to 40 ⁇ M, 2 to 30 ⁇ M, 2 to 20 ⁇ M, 2 to 10 ⁇ M, 5 to 30 ⁇ M, 5 to 20 ⁇ M, 5 to 10 ⁇ M, 10 to 30 ⁇ M, 10 to 20 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, It may be included in the medium at a concentration of, but is not limited to, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇
  • the step (a-1) may be performed in a culture vessel coated with gelatin for 1 to 5 days, 1 to 4 days, 1 to 3 days, 1 to 2 days, 2 to 4 days, 2 to 3 days, 3 to 5 days, 3 to 4 days, 1 day, 2 days, or 3 days, but is not limited thereto.
  • the medium containing the growth factor, bone morphogenetic protein, and wnt signal activator of step (a-2) may be IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco) supplemented with 0.01 to 1% polyvinyl alcohol, 1 to 50 mM nicotinamide, 1 to 50 ng/ml hHGF, 0.1 to 5% ITS, and 0.1 to 5% penicillin/streptomycin, but is not limited thereto.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco
  • the "growth factor” may be at least one selected from the group consisting of basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF2), epidermal growth factor (EGF), and insulin-like growth factor-1 (IGF-1), and according to one embodiment of the present invention, the growth factor may be FGF2 (bFGF), but is not limited thereto.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • FGF2 FGF2
  • the "bone morphogenic protein” may include any protein belonging to the BMP family, and may be, for example, at least one selected from the group consisting of BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, and BMP10. According to one embodiment of the present invention, the bone morphogenic protein may be BMP4, but is not limited thereto.
  • the "wnt signal activator” is CHIR99021, BIO((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime), BIO-acetoxime((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime), 3F8(5-Ethyl-7,8-dimethoxy-H-pyrrolo[3,-4-c]isoquinoline1,3(2H)-dione), A070722(1-(7-Methoxyquinoiin-4-yl)-3-[6-(tr-ifluoromethyl)pyridin-2-yl]urea), ARA014418(N-[(4-Methoxyphenyl)methyl]-N'-(5-ni-tro-2-thiazolyl)urea), SB216763(3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrol
  • the growth factor in a medium containing the growth factor, bone morphogenetic protein, and wnt signal activator, is present at a concentration of 1 to 50 ng/ml, 1 to 30 ng/ml, 1 to 10 ng/ml, 5 to 30 ng/ml, 5 to 20 ng/ml, 5 to 10 ng/ml, 10 to 20 ng/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 3 ng/ml, 4 ng/ml, 5 ng/ml, 6 ng/ml, 7 ng/ml, 8 ng/ml, 9 ng/ml, or 10 ng/ml;
  • the bone morphogenetic protein is present at a concentration of 1 to 50 ng/ml, 1 to 30 ng/ml, 1 to 20 ng/ml, 1 to 10 ng/ml, 5 to 30 ng/ml, 5 to 20 ng/ml, 10 to 20 ng/ml, 20 to 30 ng/ml, 15 ng/ml, 16 ng/ml, 17 ng/ml, 18 ng/ml, 19 ng/ml, or 20 ng/ml; and
  • the wnt signal activator may be included at a concentration of, but is not limited to, 1 to 5 ⁇ M, 1 to 4 ⁇ M, 1 to 3 ⁇ M, 1 to 2 ⁇ M, 2 to 3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, or 5 ⁇ M.
  • the step (a-2) may be performed in a culture vessel without a gelatin coating for, but is not limited to, 1 to 5 days, 1 to 4 days, 1 to 3 days, 1 to 2 days, 2 to 4 days, 2 to 3 days, 3 to 5 days, 3 to 4 days, 4 to 5 days, 1 day, 2 days, 3 days, or 4 days.
  • the method may further include a step of culturing hepatocytes in a medium containing gelatin to induce differentiation into hepatocytes, and the step of inducing differentiation into hepatocytes may include or consist of the following steps:
  • (b-2) A step of adding gelatin to the medium containing the above oncostatin M and further culturing to induce differentiation into hepatocytes.
  • oncostatin M in the present invention is a pleiotropic cytokine belonging to the interleukin-6 (IL-6) family, and is known to be quite similar to leukemia inhibitory factor (LIF) in terms of structure and function. It is known to be an important factor in liver development, hematopoiesis, infection, and central nervous system development, and there are also reports that it is associated with bone formation and destruction.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • the medium containing oncostatin M of the step (b-1) is IMDM supplemented with 0.1 to 5 ⁇ M dexamethasone, 0.1 to 5% ITS, 1 to 50 ng/ml hHGF, and 0.1 to 5% penicillin/streptomycin, wherein the oncostatin M may be included in the medium at a concentration of 1 to 50 ng/ml, 1 to 30 ng/ml, 1 to 20 ng/ml, 1 to 10 ng/ml, 5 to 30 ng/ml, 5 to 20 ng/ml, 10 to 20 ng/ml, 20 to 30 ng/ml, 15 ng/ml, 16 ng/ml, 17 ng/ml, 18 ng/ml, 19 ng/ml, or 20 ng/ml, It is not limited to this.
  • the step (b-1) may be performed in a culture vessel without gelatin coating for 5 to 10 days, 5 to 9 days, 5 to 8 days, 5 to 7 days, 5 to 6 days, 6 to 9 days, 6 to 8 days, 6 to 7 days, 7 to 9 days, 7 to 8 days, 8 to 9 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, or 10 days, but is not limited thereto.
  • the gelatin of the step (b-2) is 0.1 mg/ml to 10 mg/ml, 0.1 mg/ml to 9 mg/ml, 0.1 mg/ml to 8 mg/ml, 0.1 mg/ml to 7 mg/ml, 0.1 mg/ml to 6 mg/ml, 0.1 mg/ml to 5 mg/ml, 0.1 mg/ml to 4 mg/ml, 0.1 mg/ml to 3 mg/ml, 0.1 mg/ml to 2 mg/ml, 0.1 mg/ml to 1 mg/ml, 0.5 mg/ml to 8 mg/ml, 0.5 mg/ml to 6 mg/ml, 0.5 mg/ml to 5 mg/ml, 0.5 mg/ml to 3 mg/ml, 0.5 mg/ml to 1 mg/ml, 1 mg/ml to 8 mg/ml, 1 It can be added (included) to the medium at a concentration of 1 mg/ml to 7 mg/ml, 1 mg
  • the gelatin of the step (b-2) is 0.01 to 1%, 0.01 to 0.9%, 0.01 to 0.8%, 0.01 to 0.7%, 0.01 to 0.6%, 0.01 to 0.5%, 0.01 to 0.4%, 0.01 to 0.3%, 0.01 to 0.2%, 0.01 to 0.1%, 0.01 to 0.05%, 0.05 to 0.8%, 0.05 to 0.6%, 0.05 to 0.5%, 0.05 to 0.3%, 0.05 to 0.1%, 0.1 to 0.8%, 0.1 to 0.7%, 0.1 to 0.6%, It can be added (included) to the medium at a concentration of 0.1 to 0.5%, 0.1 to 0.4%, 0.1 to 0.3%, 0.1 to 0.2%, or 0.05 to 0.2%, and preferably can be added (included) to the medium at a concentration of 0.1 to 0.5%, but is not limited thereto, and any low viscosity gelatin can be included.
  • the step (b-2) may be performed in a culture vessel without gelatin coating for 1 to 10 days, 1 to 9 days, 1 to 8 days, 1 to 7 days, 1 to 6 days, 1 to 5 days, 1 to 4 days, 1 to 3 days, 1 to 2 days, 2 to 8 days, 2 to 7 days, 2 to 6 days, 2 to 5 days, 2 to 4 days, 2 to 3 days, 3 to 6 days, 3 to 5 days, 3 to 4 days, 4 to 5 days, 5 to 10 days, 5 to 9 days, 5 to 8 days, 5 to 7 days, 5 to 6 days, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, or 5 days, but is not limited thereto.
  • the method for differentiating stem cells from hepatocytes may include steps generally applicable to those skilled in the art of the present invention, such as a step of pretreating stem cells to make them suitable for culturing, a step of obtaining differentiated hepatocytes, etc.
  • the present invention provides a method for differentiating stem cell-derived hepatocytes, comprising the following steps:
  • the present invention provides a composition for culturing hepatocytes, comprising at least one selected from the group consisting of (a) a first composition comprising a ROCK inhibitor as an active ingredient; and (b) a second composition comprising gelatin as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for culturing hepatocytes, characterized in that the first composition is added to a culture vessel coated with gelatin.
  • the term “culture” means the proliferation, growth, maintenance and differentiation of cells isolated from a living body, a two-dimensional or three-dimensional aggregate thereof, a tissue or a part of a tissue in vitro. Accordingly, the term “culture” encompasses the entire process of obtaining a target substance under an artificial environment using a starting material (cell, tissue or tissue analog), and "culture composition” includes all of a “proliferation composition”, a “growth composition”, a “maintenance composition” and a “differentiation-inducing composition”. Specifically, in the hepatocyte culture composition, "culture” means inducing differentiation of stem cells into hepatocytes to obtain hepatocytes.
  • the culture composition may additionally include a basal media composition for stem cell culture.
  • a basal media composition for stem cell culture may be used as the basal media, and examples thereof include, but are not limited to, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), ⁇ -MEM (Alpha Modification of Eagle's Medium), F12 (Nutrient Mixture F-12), and DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12).
  • the basal media for stem cell culture used in the present invention may be DMEM/F12 and IMDM media, but are not limited thereto.
  • the first composition may be a DMEM/F12 medium composition supplemented with 1 to 20% fetal bovine serum including a ROCK inhibitor, 0.1 to 5% nonessential amino acids, 0.1 to 5% antibiotic-antimycotic, and 0.05 to 5 mM L-ascorbic acid
  • the second composition may be, but is not limited to, IMDM supplemented with 0.1 to 5 ⁇ M dexamethasone including gelatin, 0.1 to 5% ITS, 1 to 50 ng/ml hHGF, and 0.1 to 5% penicillin/streptomycin, and the second composition may further include oncostatin M.
  • adding the first composition to a culture vessel coated with gelatin means adding the first composition as a medium composition to the culture vessel coated with gelatin, and culture may be performed in a culture vessel coated with gelatin using the first composition as a medium.
  • the ROCK inhibitor in the first composition may be included at a concentration of, but is not limited to, 1 to 50 ⁇ M, 1 to 40 ⁇ M, 1 to 30 ⁇ M, 1 to 20 ⁇ M, 1 to 10 ⁇ M, 2 to 40 ⁇ M, 2 to 30 ⁇ M, 2 to 20 ⁇ M, 2 to 10 ⁇ M, 5 to 30 ⁇ M, 5 to 20 ⁇ M, 5 to 10 ⁇ M, 10 to 30 ⁇ M, 10 to 20 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, or 10 ⁇ M.
  • the gelatin of the second composition is 0.1 mg/ml to 10 mg/ml, 0.1 mg/ml to 9 mg/ml, 0.1 mg/ml to 8 mg/ml, 0.1 mg/ml to 7 mg/ml, 0.1 mg/ml to 6 mg/ml, 0.1 mg/ml to 5 mg/ml, 0.1 mg/ml to 4 mg/ml, 0.1 mg/ml to 3 mg/ml, 0.1 mg/ml to 2 mg/ml, 0.1 mg/ml to 1 mg/ml, 0.5 mg/ml to 8 mg/ml, 0.5 mg/ml to 6 mg/ml, 0.5 mg/ml to 5 mg/ml, 0.5 mg/ml to 3 mg/ml, 0.5 mg/ml to 1 mg/ml, 1 mg/ml to 8 mg/ml, 1 mg/ml to It may be included at a concentration of 7 mg/ml, 1 mg/ml to 6 mg/ml, 1 mg/ml to
  • the first composition and the second composition can be used simultaneously, separately, or sequentially for culturing hepatocytes, and according to one embodiment of the present invention, in the process of differentiating stem cells into hepatocytes, the first composition can be used in the step of inducing differentiation from stem cells into hepatocytes, preferably the step of inducing differentiation from stem cells into hepatic endoderm, and the second composition can be used in the step of inducing differentiation from hepatocytes into hepatocytes, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a hepatocyte culture kit including a composition for hepatocyte culture according to the present invention and an instruction manual.
  • the above description may describe a method for differentiating stem cells derived from hepatocytes according to the present invention, but is not limited thereto.
  • kits refers to a tool that enables differentiation of stem cells into hepatocytes using the method according to the present invention.
  • the kit of the present invention may include other components, compositions, solutions, devices, etc. typically required for storage and processing methods thereof. Specifically, each component may be applied at least once without limitation, there is no restriction on the order in which each material is applied, and the application of each material may be performed simultaneously or in microseconds.
  • the kit may include a container; instructions; and the like.
  • the container may serve to package the substance, and may also serve to store and fix the substance.
  • the material of the container may take the form of, for example, a bottle, a tub, a sachet, an envelope, a tube, an ampoule, and the like, and these may be formed partially or wholly from plastic, glass, paper, foil, wax, and the like.
  • the container may be initially equipped with a completely or partially detachable stopper, which may be part of the container or may be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means, and may also be equipped with a stopper for allowing access to the contents by means of a syringe needle.
  • the kit may include an outer package, and the outer package may include instructions for the use of the components.
  • step of ⁇ or “step of ⁇ ” do not mean “step for ⁇ .”
  • hUCM-MSCs Human umbilical cord matrix-mesenchymal stem cells
  • Asan Institute for Life Sciences, Seoul Stem cells were cultured on 0.1% gelatin-coated cell culture dishes in DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; GenDEPOT, USA), 1% non-essential amino acids (NEAA), 1% antibiotic-antimycotic (Gibco, USA), and 0.2 mM L-ascorbic acid. Cells were manually subcultured every 3–4 days at a 1:3–1:5 dilution.
  • Complementary DNA cDNA was synthesized using the Ultrascript 2.0 cDNA Synthesis Kit (PCR Biosystems, UK), and qRT-PCR was performed using HOT FIREPol EvaGreen qPCR Supermix (SOLIS BIODYNE, Tartu, Estonia) on a CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). For analysis, mRNA levels were normalized to GAPDH. Primer sequences are listed in Table 1.
  • RT-qPCR was performed to evaluate the expression of hepatic mature miRNAs (miR-122 and miR-192) in undifferentiated and differentiated cells. Specifically, cDNA was synthesized from total RNA using the miRCURY LNA RT Kit (Qiagen, Germany) according to the manufacturer's instructions. RT-qPCR analysis was performed using the miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany) with miRNA-specific primers purchased from Qiagen. The cycling conditions were as follows: 95°C for 2 min, followed by 40 cycles of denaturation at 95°C for 10 s, and annealing and extension at 56°C for 1 min. The cycle threshold was determined using Bio-Rad CFX Maestro software (CFX Maestro, version 1.1; Bio-Rad Laboratories). All experiments were repeated three times, and RNU6B was used as an internal control.
  • Mitochondrial DNA (mtDNA) copy number was measured using the Absolute Human Mitochondrial DNA Copy Number Quantification qPCR assay kit (ScienCell, CA, USA). Before assessing mtDNA copy number, total DNA was isolated using the QIAamp DNA 117 Mini Kit (Qiagen). Briefly, cycle thresholds for each sample were measured in triplicate using nuclear-specific and mitochondrial-specific probes. The assay was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Human albumin secreted from differentiated cells was detected using a Human Albumin ELISA kit (Bethyl Laboratories, TX, USA) according to the manufacturer's instructions. Albumin secretion was normalized to culture days and total cell number.
  • Enzyme activity was measured using the P450-Glo CYP3A4 kit (Promega, USA) according to the manufacturer's instructions. Luminescence was measured using a GloMax 96 Microplate Luminometer (Promega). CYP3A4 activity was normalized to the culture date and double-stranded DNA content of each sample.
  • Hepatic differentiation was performed using a modified version of a previously reported method (Cells. 2020;9(6), Stem Cell Research & Therapy. 2021;12(1):569). Briefly, stem cells were seeded at 7000 cells/cm 2 in cell culture medium on 0.1% or 1% gelatin-coated dishes.
  • the cells were pretreated with stem cell culture medium (DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; GenDEPOT, USA), 1% non-essential amino acids (NEAA), 1% antibiotic-antimycotic (Gibco, USA), and 0.2 mM L-ascorbic acid) and 10 ⁇ M fasudil (AdooQ Bioscience, CA, USA) for 3 days.
  • stem cell culture medium DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; GenDEPOT, USA), 1% non-essential amino acids (NEAA), 1% antibiotic-antimycotic (Gibco, USA), and 0.2 mM L-ascorbic acid
  • 10 ⁇ M fasudil AdooQ Bioscience, CA, USA
  • differentiated cells were cultured in liver maturation medium consisting of stage 2 basal medium and 20 ng/ml oncostatin M (OSM) for 8 days. After 8 days, the medium was replaced with liver maturation medium consisting of stage 2 basal medium, 20 ng/ml OSM, and 0.1% gelatin (1 mg/ml) or 1% gelatin (10 mg/ml), and cultured for 5 days. The differentiation medium was changed every 2 days.
  • OSM oncostatin M
  • the composition of the first-stage basal medium was as follows: IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco) supplemented with 0.1% polyvinyl alcohol (PVA; Sigma Aldrich), 10 mM nicotinamide (Sigma Aldrich), 20 ng/ml hHGF (human hepatocyte growth factor; Peprotech, USA), 1% ITS (insulin-transferrin-selenium; Gibco), and 1% penicillin/streptomycin (GeneDirx, Taiwan) was used.
  • composition of the 2-step basal medium is as follows: IMDM supplemented with 1 ⁇ M dexamethasone, 1% ITS, 20 ng/ml hHGF, and 1% penicillin/streptomycin.
  • Total cellular protein (15 ⁇ g) was separated by 8–15% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) and transferred to Immobilon PVDF membranes (Immobilon polyvinylidene fluoride membranes; Millipore, MA, USA).
  • the membrane was blocked with 8% bovine serum albumin (BSA; GenDEPOT) in TBST (Tris-buffered saline with Tween 20; 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) and probed with anti-albumin (Abcam, UK) and anti-CYP3A4 (Santa Cruz, USA) primary antibodies.
  • BSA bovine serum albumin
  • TBST Tris-buffered saline with Tween 20; 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20
  • anti-albumin Abcam, UK
  • ODT optical diffraction tomography
  • RI refractive index
  • LD quantification and volumetric analysis were performed using TomoAnalysis software from TomoCube, and fluorescent staining was used to ensure precision.
  • 250 nM MitoTracker dye (Invitrogen, CA, USA) for mitochondrial labeling and Biotium LipidSpot 488 lipid droplet stain (1:1000 dilution) were used to stain mitochondria and LDs, respectively. Live-cell staining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • ⁇ were observed using a confocal laser scanning microscope, Zeiss LSM 880 (Carl Zeiss, Germany). Specifically, cells were fixed overnight with 4% formaldehyde, washed with PBST (PBS containing Tween 20), permeabilized with 0.5% Triton X-100, and blocked with PBST containing 1% BSA. The samples were then stained with Biotium LipidSpot 488 lipid droplet stain. Nuclei were counterstained with NucBlue fixed cell ready probe reagent (DAPI; Invitrogen) for 10 min, and the fluorescence signals were detected using a Zeiss LSM 880 confocal laser scanning microscope.
  • DAPI NucBlue fixed cell ready probe reagent
  • OCR oxygen consumption rate
  • Example 1 Organelle status of differentiated cells affecting the early stage of liver differentiation.
  • the stem cells changed to a slightly more ovoid shape and the mitochondrial morphology changed.
  • LDs were induced inside the cells, and the number of LDs increased (P ⁇ 0.001).
  • Mitochondrial functions such as adenosine triphosphate (ATP) production, are related to differentiation efficiency and are reduced when excessive LDs are induced. Therefore, we hypothesized that fasudil-induced LDs would affect mitochondrial function, and to confirm this, we examined mitochondrial function in fasudil-treated cells. As expected, as shown in Fig. 1h, mitochondrial function was reduced in cells treated with fasudil on the third day of differentiation (P ⁇ 0.001).
  • ATP adenosine triphosphate
  • Example 2 Effect of gelatin viscosity on hepatoblast induction of hUCM-MSCs.
  • hUCM-MSCs were cultured on 0.1% or 1% gelatin-coated dishes, as shown in Fig. 2b, and differentiation was performed under these conditions.
  • Fig. 2c the phenotypes of differentiated cells were similar in all groups on day 7.
  • the dynamics of gene expression related to hepatic endoderm and hepatoblasts were analyzed on days 0, 3, and 7 of differentiation. As a result, as shown in Fig.
  • endoderm-related genes SOX17, FOXA2
  • hepatoblast-related genes AFP, HNF4A
  • GATA4 hepatoblast-related genes
  • fasudil is known as a promoter for differentiation of cells derived from the ectoderm and mesoderm, including neurons and cardiomyocytes. Therefore, the gene expression of ectoderm (PAX6, SOX1, OTX2) and mesoderm (MIXL2, CDX2) markers was examined in differentiated cells on day 3 of differentiation. As shown in Figure 2f, the expression of ectoderm genes (PAX6 and OTX2) was suppressed in the 1% gelatin and fasudil groups (P ⁇ 0.05). In addition, as shown in Figure 2g, the mesodermal gene MIXL2 was downregulated in the 1% gelatin and fasudil groups (P ⁇ 0.01).
  • Example 3 High viscosity gelatin inhibited the induction of LD and improved mitochondrial function.
  • the improved differentiation efficiency in the 1% gelatin and fasudil groups may be attributed to the downregulation of ectodermal and mesodermal gene expression as well as the modulation of organelle status, including reduced LD production and activated mitochondrial function.
  • Example 4 Low viscosity gelatin that synergistically improves the efficiency and function of hepatocyte-like cells (HLCs).
  • HLCs hepatoblasts induced using 1% gelatin coating and fasudil were differentiated into HLCs, as shown in Figure 4a.
  • the plates were not coated, and gelatin was added to the stage 2 differentiation medium.
  • HLCs were induced from hepatoblasts using OSM for 8 days, and maturation was performed for 5 days by adding gelatin at various viscosities of 0% (no gelatin added), 0.1%, or 1%.
  • Figure 4b on day 20 of differentiation, the HLC phenotypes were similar in all groups.
  • hepatocyte-specific miRNAs such as miR-122 and miR-192.
  • Figure 4f hepatocyte-specific miRNAs were significantly upregulated in the presence of 0.1% gelatin.
  • the method for differentiating stem cells into hepatocytes induces differentiation of stem cells into endoderm with a ROCK inhibitor in the initial stage of differentiation of stem cells into hepatocytes, but suppresses the formation of lipid droplets that occur during this process by culturing cells in a culture dish coated with high-viscosity gelatin, activates mitochondrial function, upregulates the expression of endodermal genes, and downregulates the expression of ectoderm and mesodermal genes, thereby improving the differentiation efficiency of stem cells into hepatocytes.
  • hepatocytes obtained using this method are expected to be useful as cell therapeutic agents for treating liver diseases, transplants, etc., and thus have industrial applicability.

Landscapes

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Abstract

본 발명은 파수딜과 젤라틴을 이용한 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 등에 관한 것으로, 본 발명에 따른 줄기세포 유래 간세포 분화 방법은 줄기세포의 간세포로의 분화 초기 단계에서 파수딜로 줄기세포의 내배엽으로의 분화를 유도하며, 배양용기의 고점도 젤라틴 코팅을 통해 지질방울 생성을 억제하고, 미토콘드리아의 기능을 활성화하며, 내배엽 유전자의 발현을 상향 조절하고, 외배엽 및 중배엽 유전자의 발현을 하향 조절함으로써 줄기세포의 간모세포로의 분화 효율을 향상시켰다. 또한, 분화 성숙(후기) 단계에서 배지에 저점도 젤라틴을 첨가함으로써 지질방울의 축적을 억제하고, 미토콘드리아를 활성화함으로써 간모세포의 간세포로의 분화 효율을 향상시키고, 분화된 간세포의 기능을 향상시킴으로써, 줄기세포의 간세포로의 분화 효율을 향상시켰다. 따라서, 이를 이용하여 수득한 간세포는 간질환의 치료용 세포 치료제, 이식체 등으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

파수딜과 젤라틴을 이용한 줄기세포 유래 간세포 분화 방법
본 발명은 파수딜과 젤라틴을 이용한 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 등에 관한 것이다.
본 발명은 2024년 6월 28일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2024-0085745호에 기초한 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 원용된다.
일반적으로 분화란 초기 단계의 세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 말하는데, 그 대표적인 예는 동물의 발생 과정에서 볼 수 있다. 즉, 정자와 난자가 결합하여 만들어진 수정란이라는 하나의 세포가 뼈, 심장, 피부 등의 다양한 조직 세포로 만들어지기 위해서는 '분화'가 일어나야 하는 것이다. 이러한 분화능력을 가지고 있는 줄기세포(stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하며 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 의미한다.
줄기세포 중 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 골수, 탯줄 기질(Umbilical cord matrix), 및 태반과 같은 인간 태아 및 성인 조직, 및 다양한 성인 조직에서 유래한다. 특히, 태아 유래 조직인 탯줄 기질과 태반은 통증 없는 수집 절차, 빠른 자가 재생, 3배엽으로 분화할 수 있는 능력과 같은 탁월한 장점으로 인해 인간 MSC의 훌륭한 공급원이다. 따라서, 최근에는 인간 탯줄 기질 유래 중간엽 줄기세포(human umbilical cord matrix-derived MSCs, hUCM-MSCs)와 이들의 분화세포가 다양한 질병을 치료하기 위한 치료의학에서 조직 재생에 활용되고 있다.
한편, 간은 인간 체중의 3% 정도를 차지하며, 중요한 기능을 수행하는 장기이다. 간을 이루는 핵심세포인 간세포는 글리코겐, 단백질, 지질, 핵산, 비타민류 등의 생합성 및 분해의 기능과 독성이 있는 물질을 해독하는 기능을 나타낸다. 그러나 이런 정상적인 간 기능을 갖지 못하는 간질환 환자의 대부분은 간 조직 손상으로 인해 간세포의 재생 능력이 감소함에 따른다. 현재 국내 간질환 사망자는 10만 명당 1만 천명에 이른다는 보고가 있다. 간질환의 경우, 조직적합성을 갖는 간 조직 이식이 현재까지 가장 효과적인 치료방법으로 알려져 있으나, 공여자를 찾기에 어려움이 따른다는 중대한 단점이 있다. 이에 대한 대안으로 현재 줄기세포에 대한 연구가 활발해지면서 줄기세포를 이용한 세포 치료에 많은 관심이 집중되고 있으나, 줄기세포에서 분화된 세포를 치료에 사용하는 데에는 제약이 있다.
줄기세포에서 분화된 세포를 사용하는 데 가장 큰 장애물 중 하나는 분화 프로토콜의 효율성과 성숙한 세포의 제한된 표현형으로, 예를 들어, 알려진 프로토콜을 이용하여 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화시킨 간세포 유사 세포는 전사체 프로파일, 간 기능 및 대사 활동 측면에서 성인 세포보다 태아 간세포와 더 유사한 특성을 나타낸다는 문제점이 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위해, 유전자 변형, 미세 환경 조정, 사이토카인 및 성장 인자 추가를 이용한 접근법 등을 포함하여 다양한 분화 방법이 개발되고 있다.
한편, 줄기세포의 운명을 결정할 때 전사체 변화는 세포 유형의 분화와 밀접한 관련이 있다. 따라서, 최근에는 RNA 시퀀싱과 같은 시퀀싱 도구를 사용하여 분화된 세포의 전사를 세계적으로 널리 분석하고 있다. 그러나 세포의 운명은 전사 조절만 변경하는 것이 아니고, 세포 분화와 직계 속박(lineage commitment)은 핵과 다양한 생물학적 과정 사이의 통신과 세포질 거대분자 및 세포소기관 상호작용을 포함하는 신호 전달 경로에 의해 영향을 받는다. 특히 줄기세포가 분화할 때 대사의 변화가 동반되며, 이는 줄기세포의 운명 결정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 세포 대사에서 미토콘드리아 역할은 세포의 운명과 기능을 결정하는 데 중추적인 역할을 한다. 또한 지질 및 에너지 항상성의 중심에 있는 저장 세포소기관과 관련된 지질방울(lipid droplet; LD)도 줄기세포의 운명 결정과 관련이 있는 것으로 보고되었다. 줄기세포의 세포소기관 상태는 줄기세포의 운명을 결정하는 데 중요하지만, 줄기세포의 세포소기관 상태의 조절이 간 분화에 영향을 미치는지 알려져 있지 않았다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 hUCM-MSC의 간세포로의 분화가 전사체 변화뿐만 아니라 세포소기관의 상태에 의해서도 영향을 받는 것을 확인하였으며, 줄기세포의 간세포로의 분화 초기 단계에서 내배엽으로 분화를 유도하는 파수딜을 고점도의 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 사용할 경우, 지질방울의 생성을 억제하고, 미토콘드리아의 기능을 활성화함으로써 줄기세포의 간모세포로의 분화 효율을 향상시킬 수 있고, 분화 성숙(후기) 단계에서 배지에 저점도의 젤라틴을 첨가할 경우, 지질방울의 축적을 줄이고 미토콘드리아를 활성화하여 간모세포의 간세포로의 분화 효율과 분화된 간세포의 기능을 향상시킬 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 효율적인 줄기세포 유래 간세포 분화 방법을 개발하기 위해, 예의 연구한 결과, 분화 초기 단계에서 내배엽으로 분화를 유도하는 파수딜을 고점도의 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 사용할 경우, 지질방울의 생성을 억제하고, 미토콘드리아의 기능을 활성화함으로써 줄기세포의 간모세포로의 분화 효율을 향상시킬 수 있고, 분화 성숙(후기) 단계에서 배지에 저점도의 젤라틴을 첨가할 경우, 지질방울의 축적을 줄이고 미토콘드리아를 활성화하여 간모세포의 간세포로의 분화 효율과 분화된 간세포의 기능을 향상시킬 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 줄기세포를 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 ROCK 억제제를 포함한 배지에 배양하여 간모세포(hepatoblast)로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) ROCK 억제제를 유효성분으로 포함하는 제1조성물; 및 (b) 젤라틴을 유효성분으로 포함하는 제2조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 간세포 배양용 조성물로서, 상기 제1조성물은 젤라틴이 코팅된 배양용기에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 간세포 배양용 조성물, 및 설명서를 포함하는 간세포 배양용 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포를 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 ROCK 억제제를 포함한 배지에 배양하여 간모세포(hepatoblast)로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 줄기세포는 탯줄 기질, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 ROCK 억제제는 파수딜 (Fasudil), 리파수딜 (Ripasudil), RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, 및 Y-30141로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ROCK 억제제는 1 내지 50 μM의 농도로 배지에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 젤라틴은 0.1 내지 10%의 농도로 배양용기에 코팅될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 간모세포로의 분화를 유도하는 단계는 1 내지 10일 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 간모세포로의 분화를 유도하는 단계는 하기 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(a-1) 줄기세포를 (고점도 젤라틴이 코팅된 배양용기에서) ROCK 억제제를 포함하는 배지에 배양하여 간 내배엽으로의 분화를 유도하는 단계; 및
(a-2) 상기 간 내배엽을 성장 인자, 골 형성 단백질, 및 wnt 신호 활성자를 포함하는 배지에서 배양하여 간모세포로의 분화를 유도하는 단계,
단, 상기 (a-2) 단계는 젤라틴이 코팅되지 않은 배양용기에서 수행됨.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법은 간모세포를 젤라틴을 포함하는 배지에서 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 젤라틴은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 배지에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 간세포로의 분화를 유도하는 단계는 하기 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(b-1) 상기 간모세포를 온코스타틴 M을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(b-2) 상기 온코스타틴 M을 포함하는 배지에 젤라틴을 첨가하고 추가적으로 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계.
또한, 본 발명은 (a) ROCK 억제제를 유효성분으로 포함하는 제1조성물; 및 (b) 젤라틴을 유효성분으로 포함하는 제2조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 간세포 배양용 조성물로서,
상기 제1조성물은 젤라틴이 코팅된 배양용기에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 배양은 줄기세포의 간세포로의 분화를 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 탯줄 기질(umbilical cord matrix), 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ROCK 억제제는 파수딜 (Fasudil), 리파수딜 (Ripasudil), RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, 및 Y-30141로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ROCK 억제제는 1 내지 50 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 제2조성물의 젤라틴은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 배지에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 제2조성물은 온코스타틴 M을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배양용기에 젤라틴은 0.1 내지 10%의 농도로 코팅될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 제1조성물 및 제2조성물은 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 간세포의 배양에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 간세포 배양용 조성물, 및 설명서를 포함하는 간세포 배양용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 설명서는 본 발명에 따른 줄기세포 유래 간세포 분화 방법이 기재된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 간세포 분화 방법은 줄기세포의 간세포로의 분화 초기 단계에서 ROCK 억제제로 줄기세포의 내배엽으로의 분화를 유도하되 이때 발생되는 지질방울의 생성을 고점도 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 세포를 배양함으로써 억제하고, 미토콘드리아의 기능을 활성화하며, 내배엽 유전자의 발현을 상향 조절하고, 외배엽 및 중배엽 유전자의 발현을 하향 조절함으로써 줄기세포의 간모세포로의 분화 효율을 향상시켰다. 또한, 분화 성숙(후기) 단계에서 배지에 저점도 젤라틴을 첨가함으로써 지질방울의 축적을 억제하고, 미토콘드리아를 활성화함으로써 간모세포의 간세포로의 분화 효율을 향상시키고, 분화된 간세포의 기능을 향상시킴으로써, 줄기세포의 간세포로의 분화 효율을 향상시켰다. 따라서, 이를 이용하여 수득한 간세포는 간질환의 치료용 세포 치료제, 이식체 등으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 hUCM-MSC에 10 μM의 파수딜을 처리한 후 내배엽 마커(GATA4, SOX17, FOXA2)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 hUCM-MSC에 파수딜을 72시간 처리한 후 내배엽 마커(GATA4, SOX17, FOXA2)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 파수딜 처리 후 hUCM-MSC에 대한 단층촬영 분석 결과를 나타낸 것이다 (빨간색: 미토콘드리아, 녹색: lipid droplet; 미세관찰 스케일바=200 μm, 단층 촬영 스케일바=10 μm).
도 1d는 파수딜 처리 후 hUCM-MSC에서 lipid droplet의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1e는 hUCM-MSC의 간모세포로의 분화를 유도하기 위한 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 1f는 파수딜 처리 후, 내배엽의 형태를 확인한 결과를 나타낸 것이다 (스케일바=100 μm).
도 1g는 파수딜 처리 0일차, 3일차, 또는 7일차에 간세포 관련 유전자(AFP 및 HNF4A)의 발현을 확인한 결과는 나타낸 것이다.
도 1h는 파수딜 처리 후, hUCM-MSC에서 미토콘드리아의 기능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 0.1%, 또는 1% 젤라틴 코팅 접시에서 hUCM-MSC를 배양한 후 미토콘드리아 기능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 파수딜과 젤라틴 코팅 접시를 이용한 hUCM-MSC의 간모세포로의 분화 과정 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 2c는 젤라틴 코팅 접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC의 형태를 확인한 결과를 나타낸 것이다 (스케일바=100 μm).
도 2d는 젤라틴 코팅 접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에서 내배엽 마커(GATA4, SOX17, FOXA2)의 발현을 0일차, 3일차, 7일차에 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에서 간모세포-관련 유전자(AFP, HNF4A)의 발현을 분화 0일차, 3일차, 7일차에 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2f는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC의 분화 3일차에 외배엽 마커(PAX6, SOX1, OTX2)의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2g는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC의 분화 3일차에 중배엽 마커(MIXL2, CDX2)의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC의 분화 3일차 단층촬영 분석 결과를 코팅된 젤라틴의 점도에 따라 나타낸 것이다 (빨간색: 미토콘드리아, 녹색: lipid droplet; 스케일바=10 μm).
도 3b는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC의 분화 3일차 lipid droplet의 수를 코팅된 젤라틴의 점도에 따라 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c 및 도 3d는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC의 분화 3일차에 미코톤드리아 기능을 코팅된 젤라틴의 점도에 따라 비교한 결과로, 도 3c는 OCR 측정 결과, 도 3d는 미토콘드리아의 호흡 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC의 분화 3일차에 미코톤드리아 복제수를 코팅된 젤라틴의 점도에 따라 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 0.1% 또는 1% 젤라틴을 이용한 간모세포로부터 간세포로의 분화 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 4b는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 세포의 형태를 확인한 결과를 나타낸 것이다 (스케일바=100μm).
도 4c는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 성숙 간세포 관련 유전(ALB, CYP3A4, CYP1A2, HNF1A, 및 HNF4A)의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4d는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 ALB, CYP3A4 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4e는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 ALB, CYP3A4 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블롯팅을 농도계 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4f는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 간세포 특이적 miRNA(miR-122, miR-192)의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 인간 알부민의 분비량을 측정한 결과를 나타낸 것이다 (undiff: 미분화 세포).
도 5b는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 CYP3A4 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 lipid droplet을 확인한 결과를 나타낸 것이다 (파란색: 핵, 초록색: lipid droplet; 스케일바=20 μm).
도 5d는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 lipid droplet의 형광 강도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5e는 젤라틴 코팅접시에서 파수딜을 처리해 분화시킨 hUCM-MSC에 0.1% 또는 1%의 젤라틴을 첨가하여 분화시킨 후 5일차에 미토콘드리아의 복제수를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 줄기세포 유래 간세포 분화 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
본 발명자들은 줄기세포의 간세포로의 분화 과정 중 분화 초기 단계에서 내배엽으로 분화를 유도하는 파수딜을 고점도(1%)의 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 사용할 경우, 내배엽으로의 분화 과정에서 발생하는 지질방울의 생성이 억제되고, 미토콘드리아의 기능이 활성화됨으로써 줄기세포의 간모세포로의 분화 효율이 향상되었음을 확인하였다. 또한, 분화 성숙(후기) 단계에서 배지에 저점도(0.1%)의 젤라틴을 첨가할 경우, 지질방울의 축적이 감소하고 미토콘드리아가 활성화되어 간모세포의 간세포로의 분화 효율과 분화된 간세포의 기능을 향상시킬 수 있는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 줄기세포를 젤라틴이 코팅된 배양 용기에서 ROCK 억제제를 포함한 배지에 배양하여 간모세포(hepatoblast)로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄 기질, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 줄기세포는 인간 탯줄 기질 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 파수딜 (Fasudil), 리파수딜 (Ripasudil), RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, 및 Y-30141로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 파수딜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 파수딜은 줄기세포의 생존력을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 분화에 사용되는 일반적인 cytokines (단백질 형식)과는 다르게 저분자(Small molecule)로 분화에 효율적인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "젤라틴"이란, 동물의 뼈, 가죽, 힘줄, 연골 등을 구성하는 천연 고분자 단백질인 콜라겐(교원질)을 가수분해하여 얻어지는 유도 단백질이다. 젤라틴의 일반적 구성 성분은 약 단백질(protein): 84 내지 90%, 수분(water): 8 내지 12% 및 무기염류(mineral salts): 2 내지 4%로 구성될 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 다양한 젤 강도(gel strength), 점도(viscosity)를 가질 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 천연물질로부터 분리 또는 합성될 수 있으며, 그 원료의 종류는 한정되지 않으며, 포유동물 또는 어류 등 의 가죽, 뼈 껍질 등으로부터 분리된 콜라겐을 가수분해하여 생산할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 젤라틴은 0.1 내지 10%, 0.1 내지 9%, 0.1 내지 8%, 0.1 내지 7%, 0.1 내지 6%, 0.1 내지 5%, 0.1 내지 4%, 0.1 내지 3%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.2 내지 1%, 0.3 내지 1%, 0.4 내지 1%, 0.5 내지 1%, 0.6 내지 1%, 0.7 내지 1%, 0.8 내지 1%, 0.9 내지 1%, 0.3 내지 8%, 0.3 내지 7%, 0.3 내지 6%, 0.3 내지 5%, 0.3 내지 4%, 0.3 내지 3%, 0.3 내지 2%, 0.3 내지 1%, 0.5 내지 6%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 4%, 0.5 내지 3%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.7 내지 5%, 0.7 내지 4%, 0.7 내지 3%, 0.7 내지 2%, 0.7 내지 1%, 0.9 내지 5%, 0.9 내지 3%, 0.9 내지 1%, 1 내지 5%, 1 내지 3%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1%의 농도로 배양용기에 코팅될 수 있으며, 바람직하게는, 1 내지 5%의 농도(고점도)로 배양용기에 코팅될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 간모세포로의 분화를 유도하는 단계는 1 내지 10일, 1 내지 9일, 1 내지 8일, 1 내지 7일, 1 내지 6일, 1 내지 5일, 1 내지 4일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 8일, 2 내지 7일, 2 내지 6일, 2 내지 5일, 2 내지 4일, 2 내지 3일, 3 내지 7일, 3 내지 6일, 3 내지 5일, 3 내지 4일, 4 내지 7일, 5 내지 7일, 6 내지 7일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 간모세포로의 분화를 유도하는 단계는 하기 단계를 포함하거나 하기 단계로 이루어진 것일 수 있다:
(a-1) 줄기세포를 (고점도 젤라틴이 코팅된 배양용기에서) ROCK 억제제를 포함하는 배지에 배양하여 간 내배엽으로의 분화를 유도하는 단계; 및
(a-2) 상기 간 내배엽을 성장 인자, 골 형성 단백질, 및 wnt 신호 활성자를 포함하는 배지에서 배양하여 간모세포로의 분화를 유도하는 단계,
단, 상기 (a-2) 단계는 젤라틴이 코팅되지 않은 배양용기에서 수행됨.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a-1) 단계의 ROCK 억제제를 포함하는 배지는 1 내지 20% 소태아혈청, 0.1 내지 5% 비필수 아미노산, 0.1 내지 5% 항생제-항진균제, 및 0.05 내지 5mM L-아스코르빈산이 보충된 DMEM/F12 배지로, 상기 ROCK 억제제는 1 내지 50 μM, 1 내지 40 μM, 1 내지 30 μM, 1 내지 20 μM, 1 내지 10 μM, 2 내지 40 μM, 2 내지 30 μM, 2 내지 20 μM, 2 내지 10 μM, 5 내지 30 μM, 5 내지 20 μM, 5 내지 10 μM, 10 내지 30 μM, 10 내지 20 μM, 1 μM, 2 μM , 3 μM , 4 μM , 5 μM , 6 μM , 7 μM , 8 μM , 9 μM , 또는 10 μM 의 농도로 배지에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a-1) 단계는 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 1 내지 5일, 1 내지 4일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 4일, 2 내지 3일, 3 내지 5일, 3 내지 4일, 1일, 2일, 또는 3일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a-2) 단계의 성장 인자, 골 형성 단백질, 및 wnt 신호 활성자를 포함하는 배지는 0.01 내지 1% polyvinyl alcohol, 1 내지 50 mM nicotinamide, 1 내지 50 ng/ml hHGF, 0.1 내지 5% ITS, 0.1 내지 5% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "성장 인자"는 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF, FGF2), 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor; EGF), 및 인슐린-유사 성장 인자-1(Insulin-like growth factor-1; IGF-1)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 성장 인자는 FGF2(bFGF)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "골 형성 단백질"은 BMP 패밀리 단백질에 속하는 한 모두 포함될 수 있으며, 예를 들어 BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, 및 BMP10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 골 형성 단백질은 BMP4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "wnt 신호 활성자"는 CHIR99021, BIO((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime), BIO-아세톡심((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime), 3F8(5-Ethyl-7,8-dimethoxy-H-pyrrolo[3,-4-c]isoquinoline1,3(2H)-dione), A070722(1-(7-Methoxyquinoiin-4-yl)-3-[6-(tr-ifluoromethyl)pyridin-2-yl]urea), ARA014418(N-[(4-Methoxyphenyl)methyl]-N'-(5-ni-tro-2-thiazolyl)urea), SB216763(3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), SB415286(3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione), TC-G24(N-(3-Chioro-4-methylphenyl)-5-(4-ni-trophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amine), TCS2002(2-ethyl-5-[3-[4-(methylsulfinyi)ph-enyl]-5-benzofuranyi]-1,3,4-oxadiazole), 및 TWS119(3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,-3-d]pyrimidin-4-yl]oxyphenol ditrifluoroacetate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 wnt 신호 활성자는 CHIR99021일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 성장 인자, 골 형성 단백질, 및 wnt 신호 활성자를 포함하는 배지에서 상기 성장 인자는 1 내지 50 ng/ml, 1 내지 30 ng/ml, 1 내지 10 ng/ml, 5 내지 30 ng/ml, 5 내지 20 ng/ml, 5 내지 10 ng/ml, 10 내지 20 ng/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 3 ng/ml, 4 ng/ml, 5 ng/ml, 6 ng/ml, 7 ng/ml, 8 ng/ml, 9 ng/ml, 또는 10 ng/ml의 농도;
상기 골 형성 단백질은 1 내지 50 ng/ml, 1 내지 30 ng/ml, 1 내지 20 ng/ml, 1 내지 10 ng/ml, 5 내지 30 ng/ml, 5 내지 20 ng/ml, 10 내지 20 ng/ml, 20 내지 30 ng/ml, 15 ng/ml, 16 ng/ml, 17 ng/ml, 18 ng/ml, 19 ng/ml, 또는 20 ng/ml의 농도; 및
상기 wnt 신호 활성자는 1 내지 5 μM, 1 내지 4 μM, 1 내지 3 μM, 1 내지 2 μM, 2 내지 3 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 또는 5 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a-2) 단계는 젤라틴 코팅이 없는 배양용기에서 1 내지 5일, 1 내지 4일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 4일, 2 내지 3일, 3 내지 5일, 3 내지 4일, 4 내지 5일, 1일, 2일, 3일, 또는 4일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 간모세포를 젤라틴을 포함하는 배지에서 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 간세포로의 분화를 유도하는 단계는 하기 단계를 포함하거나 하기 단계로 이루어진 것일 수 있다:
(b-1) 상기 간모세포를 온코스타틴 M을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(b-2) 상기 온코스타틴 M을 포함하는 배지에 젤라틴을 첨가하고 추가적으로 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계.
본 발명에서 용어, "온코스타틴 M(oncostatin M)"은 인터류킨-6(IL-6) 군에 속하는 다발성 사이토카인(pleiotropic cytokine)으로서, 구조와 기능에 있어 백혈병 억제인자(leukemia inhibitory factor; LIF)와 상당히 유사한 것으로 알려져 있다. 간 발달, 혈액생성, 감염, 중추신경계 발달에 있어 중요한 인자로 알려져 있으며, 뼈 형성 및 파괴와도 연관되어 있다는 보고도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (b-1) 단계의 온코스타틴 M을 포함하는 배지는 0.1 내지 5 μM 덱사메타손, 0.1 내지 5% ITS, 1 내지 50 ng/ml hHGF, 0.1 내지 5% 페니실린/스트렙토마이이신이 보충된 IMDM으로, 상기 온코스타틴 M은 1 내지 50 ng/ml, 1 내지 30 ng/ml, 1 내지 20 ng/ml, 1 내지 10 ng/ml, 5 내지 30 ng/ml, 5 내지 20 ng/ml, 10 내지 20 ng/ml, 20 내지 30 ng/ml, 15 ng/ml, 16 ng/ml, 17 ng/ml, 18 ng/ml, 19 ng/ml, 또는 20 ng/ml의 농도로 배지에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (b-1) 단계는 젤라틴 코팅이 없는 배양용기에서 5 내지 10일, 5 내지 9일, 5 내지 8일, 5 내지 7일, 5 내지 6일, 6 내지 9일, 6 내지 8일, 6 내지 7일, 7 내지 9일, 7 내지 8일, 8 내지 9일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b-2) 단계의 젤라틴은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 9 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 8 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 7 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 6 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 4 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 3 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 1 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 8 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 6 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 3 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 1 mg/ml, 1 mg/ml 내지 8 mg/ml, 1 mg/ml 내지 7 mg/ml, 1 mg/ml 내지 6 mg/ml, 1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 1 mg/ml 내지 4 mg/ml, 1 mg/ml 내지 3 mg/ml, 1 mg/ml 내지 2 mg/ml, 1 mg/ml 내지 1.5 mg/ml, 또는 0.5 mg/ml 내지 1.5 mg/ml의 농도로 배지에 첨가(포함)될 수 있으며, 바람직하게는 1 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 배지에 첨가(포함)될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 저점도 젤라틴이라면 모두 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b-2) 단계의 젤라틴은 0.01 내지 1%, 0.01 내지 0.9%, 0.01 내지 0.8%, 0.01 내지 0.7%, 0.01 내지 0.6%, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.4%, 0.01 내지 0.3%, 0.01 내지 0.2%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 0.05 내지 0.8%, 0.05 내지 0.6%, 0.05 내지 0.5%, 0.05 내지 0.3%, 0.05 내지 0.1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.7%, 0.1 내지 0.6%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.4%, 0.1 내지 0.3%, 0.1 내지 0.2%, 또는 0.05 내지 0.2%의 농도로 배지에 첨가(포함)될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 0.5%의 농도로 배지에 첨가(포함)될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 저점도 젤라틴이라면 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (b-2) 단계는 젤라틴 코팅이 없는 배양용기에서 1 내지 10일, 1 내지 9일, 1 내지 8일, 1 내지 7일, 1 내지 6일, 1 내지 5일, 1 내지 4일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 8일, 2 내지 7일, 2 내지 6일, 2 내지 5일, 2 내지 4일, 2 내지 3일, 3 내지 6일, 3 내지 5일, 3 내지 4일, 4 내지 5일, 5 내지 10일, 5 내지 9일, 5 내지 8일, 5 내지 7일, 5 내지 6일, 1일, 2일, 3일, 4일, 또는 5일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법은 본 발명의 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 적용되는 단계, 예를 들어, 줄기세포 등을 배양에 적합하도록 전처리하는 단계, 분화된 간세포를 수득하는 단계 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 줄기세포 유래 간세포 분화 방법을 제공한다:
(a) (고점도 젤라틴이 코팅된 배양용기에서) 줄기세포를 ROCK 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 간 내배엽으로의 분화를 유도하는 단계;
(b) 상기 간 내배엽을 성장 인자, 골 형성 단백질, 및 wnt 신호 활성자를 포함하는 배지에서 배양하여 간모세포로의 분화를 유도하는 단계;
(c) 상기 간모세포를 온코스타틴 M을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(d) 상기 온코스타틴 M을 포함하는 배지에 젤라틴을 첨가하고 추가적으로 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계.
또한, 본 발명은 (a) ROCK 억제제를 유효성분으로 포함하는 제1조성물; 및 (b) 젤라틴을 유효성분으로 포함하는 제2조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 간세포 배양용 조성물로서,
상기 제1조성물은 젤라틴이 코팅된 배양용기에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양용기에 젤라틴은 0.1 내지 10%, 0.1 내지 9%, 0.1 내지 8%, 0.1 내지 7%, 0.1 내지 6%, 0.1 내지 5%, 0.1 내지 4%, 0.1 내지 3%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.2 내지 1%, 0.3 내지 1%, 0.4 내지 1%, 0.5 내지 1%, 0.6 내지 1%, 0.7 내지 1%, 0.8 내지 1%, 0.9 내지 1%, 0.3 내지 8%, 0.3 내지 7%, 0.3 내지 6%, 0.3 내지 5%, 0.3 내지 4%, 0.3 내지 3%, 0.3 내지 2%, 0.3 내지 1%, 0.5 내지 6%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 4%, 0.5 내지 3%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.7 내지 5%, 0.7 내지 4%, 0.7 내지 3%, 0.7 내지 2%, 0.7 내지 1%, 0.9 내지 5%, 0.9 내지 3%, 0.9 내지 1%, 1 내지 5%, 1 내지 3%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1%의 농도로 코팅될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "배양"은 생체로부터 분리된 세포, 이들의 2차원 또는 3차원적 집합체, 조직 또는 조직의 일부를 체외에서 증식, 성장, 유지 및 분화시키는 것을 의미한다. 이에, 용어 "배양"은 출발 물질(세포, 조직 또는 조직 유사체)을 이용하여 인공적인 환경 하에서 목적 물질을 수득하는 전 과정을 포괄하는 의미이며, 이에 “배양용 조성물"은 "증식용 조성물", "성장용 조성물", "유지용 조성물" 및 "분화 유도용 조성물"을 모두 포함하는 의미이다. 구체적으로, 상기 간세포 배양용 조성물에서 "배양"은 줄기세포의 간세포로의 분화를 유도하여 간세포를 수득하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양용 조성물은 줄기세포 배양용 기본 배지(basal media) 조성물을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 기본 배지로는 당업계에서 줄기세포 배양에 이용되는 다양한 배지가 사용될 수 있으며, 예를 들어 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12), 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명에서 이용되는 줄기세포 배양용 기본 배지는 DMEM/F12 및 IMDM 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1조성물은 ROCK 억제제를 포함하는 1 내지 20% 소태아혈청, 0.1 내지 5% 비필수 아미노산, 0.1 내지 5% 항생제-항진균제, 및 0.05 내지 5mM L-아스코르빈산이 보충된 DMEM/F12 배지 조성물일 수 있고, 상기 제2조성물은 젤라틴을 포함하는 0.1 내지 5 μM 덱사메타손, 0.1 내지 5% ITS, 1 내지 50 ng/ml hHGF, 0.1 내지 5% 페니실린/스트렙토마이이신이 보충된 IMDM일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 제2조성물은 온코스타틴 M을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 제1조성물이 젤라틴이 코팅된 배양용기에 첨가된다는 것은 젤라틴이 코팅된 배양용기에 배지 조성물로 첨가되는 것을 의미하는 것으로, 상기 제1조성물을 배지로 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 배양이 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1조성물에서 ROCK 억제제는 1 내지 50 μM, 1 내지 40 μM, 1 내지 30 μM, 1 내지 20 μM, 1 내지 10 μM, 2 내지 40 μM, 2 내지 30 μM, 2 내지 20 μM, 2 내지 10 μM, 5 내지 30 μM, 5 내지 20 μM, 5 내지 10 μM, 10 내지 30 μM, 10 내지 20 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 또는 10 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제2조성물의 젤라틴은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 9 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 8 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 7 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 6 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 4 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 3 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 1 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 8 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 6 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 3 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 1 mg/ml, 1 mg/ml 내지 8 mg/ml, 1 mg/ml 내지 7 mg/ml, 1 mg/ml 내지 6 mg/ml, 1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 1 mg/ml 내지 4 mg/ml, 1 mg/ml 내지 3 mg/ml, 1 mg/ml 내지 2 mg/ml, 1 mg/ml 내지 1.5 mg/ml, 또는 0.5 mg/ml 내지 1.5 mg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제2조성물의 젤라틴은 0.01 내지 1%, 0.01 내지 0.9%, 0.01 내지 0.8%, 0.01 내지 0.7%, 0.01 내지 0.6%, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.4%, 0.01 내지 0.3%, 0.01 내지 0.2%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 0.05 내지 0.8%, 0.05 내지 0.6%, 0.05 내지 0.5%, 0.05 내지 0.3%, 0.05 내지 0.1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.7%, 0.1 내지 0.6%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.4%, 0.1 내지 0.3%, 0.1 내지 0.2%, 또는 0.05 내지 0.2%의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 0.5%의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제1조성물 및 제2조성물은 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 간세포의 배양에 사용될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예 따르면, 줄기세포로부터 간세포로의 분화 과정 중 줄기세포로부터 간모세포로의 분화를 유도하는 단계, 바람직하게는 줄기세포로부터 간 내배엽으로의 분화를 유도하는 단계에서 제1조성물, 간모세포로부터 간세포로의 분화를 유도하는 단계에서 제2조성물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 간세포 배양용 조성물, 및 설명서를 포함하는 간세포 배양용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 설명서는 본 발명에 따른 줄기세포 유래 간세포 분화 방법이 기재된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "키트"는 본 발명에 따른 방법으로 줄기세포를 간세포로 분화할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 물질 외에도 이들의 보관, 처리 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 구체적인 예로는 이때, 각 구성은 1회 이상 횟수에 제한 없이 적용될 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서; 등을 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 물질을 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있으며, 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 지시서를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "포함하는"이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 세포 배양
아산줄기세포센터(서울 아산생명과학연구원)에서 hUCM-MSC(human umbilical cord matrix-mesenchymal stem cells)를 획득하였다. 줄기세포는 0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 접시에서 DMEM/F12 배지에 10% 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS; GenDEPOT, 미국), 1% 비필수 아미노산(Non-Essential amino acids, NEAA), 1% 항생제-항진균제(Gibco, 미국), 및 0.2mM L-아스코르빈산(L-ascorbic acid)을 보충한 배양액에서 배양하였다. 3-4일마다 1:3~1:5로 희석하여 수동으로 계대배양하였다.
2. 정량적 RT-PCR(Quantitative RT-PCR)
제조업체의 지침에 따라 RNeasy 미니 키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)는 Ultrascript 2.0 cDNA 합성 키트(PCR Biosystems, 영국)를 사용하여 합성하고, qRT-PCR은 CFX Connect Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)에서 HOT FIREPol EvaGreen qPCR Supermix (SOLIS BIODYNE, Tartu, Estonia)를 사용하여 수행하였다. 분석을 위해 mRNA 수준을 GAPDH로 정규화하였다. 프라이머 서열은 표 1에 개시하였다.
미분화된 세포 및 분화된 세포에서 간 성숙 miRNA(miR-122 및 miR-192)의 발현을 평가하기 위해 RT-qPCR을 수행하였다. 구체적으로, 제조사의 지침에 따라 miRCURY LNA RT 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. RT-qPCR 분석은 Qiagen에서 구입한 miRNA 특이적 프라이머와 함께 miRCURY LNA SYBR Green PCR 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 수행하였다. 사이클 조건은 다음과 같다: 95°C에서 2분 동안 배양한 다음 95°C에서 10초 동안 변성을 40회 반복, 56°C에서 1분간 어닐링(annealing) 및 연장. 사이클 임계값은 Bio-Rad CFX Maestro software (CFX Maestro, version 1.1; Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 결정하였다. 모든 실험은 세 번 반복하였으며, 내부 대조군으로 RNU6B를 사용하였다.
3. 미토콘드리아 DNA 복제수(copy number) 예측
mtDNA(Mitochondrial DNA) 복제수는 Absolute Human Mitochondrial DNA Copy Number Quantification qPCR assay kit(ScienCell, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. mtDNA 복제수를 평가하기 전에 QIAamp DNA 117 Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 총 DNA를 분리하였다. 간략하게, 핵 특이적 및 미토콘드리아 특이적 프로브를 사용하여 각 샘플에 대한 주기 임계값을 삼중으로 측정하였다. 분석은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
4. 분비된 인간 알부민(albumin) 검출
분화된 세포에서 분비된 인간 알부민을 제조업체의 지침에 따라 Human Albumin ELISA kit (Bethyl Laboratories, TX, USA)를 사용하여 검출하였다. 알부민 분비는 배양일과 총 세포 수로 정규화하였다.
5. 시험관 내 CYP3A4 활성 측정
효소 활성은 제조업체의 지침에 따라 P450-Glo CYP3A4 키트(Promega, 미국)를 사용하여 측정하였다. 발광은 GloMax 96 Microplate Luminometer (Promega)로 측정하였다. CYP3A4 활성은 각 샘플의 배양일과 이중 가닥 DNA 함량으로 정규화하였다.
6. 시험관 내 간 분화
간 분화는 이전에 보고된 방법(Cells. 2020;9(6), Stem Cell Research & Therapy. 2021;12(1):569) 일부를 수정하여 수행하였다. 간략하게, 줄기세포를 세포 배양 배지에 7000 cell/cm2로 0.1% 또는 1% 젤라틴 코팅 접시에 시딩(seeding)하였다. 코팅 접시에 줄기세포가 부착되도록 1일 동안 배양한 후, 세포를 줄기세포 배양액(DMEM/F12 배지에 10% 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS; GenDEPOT, 미국), 1% 비필수 아미노산(Non-Essential amino acids, NEAA), 1% 항생제-항진균제(Gibco, 미국), 및 0.2mM L-아스코르빈산(L-ascorbic acid)을 보충한 배양액)과 10 μM 파수딜(fasudil, AdooQ Bioscience, CA, USA) 로 3일 동안 전처리하였다. 다음으로, 세포를 1단계 기본 배지, 10 ng/ml FGF2, 20 ng/ml BMP4, 3 μM CHIR99021로 구성된 간모세포(hepatoblast) 유도 배지에서 4일간 배양하였다. 마지막으로, 분화된 세포를 2단계 기본 배지와 20 ng/ml OSM(oncostatin M)으로 구성된 간 성숙 배지에서 8일 동안 배양하였다. 8일 후, 배지를 2단계 기본 배지, 20 ng/ml OSM, 0.1% 젤라틴(1 mg/ml) 또는 1% 젤라틴(10 mg/ml)으로 구성된 간 성숙 배지로 교체하여 5일 동안 배양하였다. 분화 배지는 2일마다 교체하였다.
1단계 기본 배지의 구성은 다음과 같다: 0.1% polyvinyl alcohol(PVA; Sigma Aldrich), 10 mM nicotinamide(Sigma Aldrich), 20 ng/ml hHGF(human hepatocyte growth factor; Peprotech, 미국), 1% ITS(insulin-transferrin-selenium; Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신(GeneDirx, 대만)이 보충된 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco)을 사용하였다.
2단계 기본 배지의 구성은 다음과 같다: 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 1% ITS, 20 ng/ml hHGF, 1% 페니실린/스트렙토마이이신이 보충된 IMDM.
모든 성장 인자는 Peprotech에서 구입하였다.
7. 단백질 추출 및 웨스턴 블롯팅
웨스턴 블롯팅을 위해 세포를 트립신(Trypsine) 처리하고 얼음처럼 차가운 PBS로 세척한 다음 protease and phosphatase inhibitor cocktail (Sigma Aldrich) 이 포함된 RIPA 용해 완충액(50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM EGTA, 1 mM DTT, 1% Triton X-100)에 용해시켰다. 용해 후, 13,000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 그런 다음, Bradford assay를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 총 세포 단백질(15 μg)을 8-15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후 Immobilon PVDF membrane(Immobilon polyvinylidene fluoride membranes; Millipore, MA, USA)으로 옮겼다. 멤브레인을 TBST(Tris-buffered saline with Tween 20; 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) 중 8% BSA(bovine serum albumin; GenDEPOT)로 차단하고, 항-알부민(Abcam, 영국) 및 항-CYP3A4(Santa Cruz, USA) 1차 항체로 탐침(probe)하였다. TBST로 세척한 후, 1차 항체는 horseradish peroxidase conjugated anti-mouse 2차 항체와 enhanced chemiluminescence detection system(Amersham, UK)을 사용하여 검출하였다.
8. 분화된 세포의 세포소기관 분석
굴절률 단층 촬영(refractive index(RI) tomography)을 이용한 무표지(Label-free) 광학 회절 단층 촬영(optical diffraction tomography, ODT)은 ODT 현미경(HT-X1; Tomocube Inc, 한국)을 사용하여 hUCM-MSC에서 수행하였다. ODT는 3차원 RI 단층 촬영을 사용하여 37℃ 온도에서 5% CO2의 제어된 대기에서 450nm LED(light-emitting diode)로 조명된 다양한 각도에서 캡처한 48개의 중첩된 2차원 홀로그램에서 단일 hUCM-MSC를 재구성하였다. 세포의 3차원 RI 단층 촬영 재구성을 위해 Mach-Zehnder interferometer가 통합된 HT-X1 현미경을 사용하였다. LD 정량화 및 체적 분석은 TomoCube의 TomoAnalysis 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며 정밀도를 보장하기 위해 형광 염색을 사용하였다. 미토콘드리아 라벨링용 250 nM MitoTracker 염료(Invitrogen, CA, 미국)와 Biotium LipidSpot 488 지질방울 염색(1:1000 희석)을 각각 미토콘드리아와 LD를 염색하는데 사용하였다. 생세포 염색은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
또한, 공초점 레이저 스캐닝 현미경인 Zeiss LSM 880(Carl Zeiss, 독일)을 사용하여 세포를 관찰하였다. 구체적으로, 세포를 4% 포름알데히드로 하룻밤 동안 고정한 뒤, PBST(Tween 20이 포함된 PBS)로 세척하고, 0.5% 트리톤 X-100으로 투과시킨 다음 1% BSA가 포함된 PBST로 차단하였다. 그런 다음 샘플을 Biotium LipidSpot 488 지질방울 염색으로 염색하였다. 핵은 10분 동안 NucBlue 고정 세포 레디프로브 시약(DAPI; Invitrogen)으로 상대 염색하고, 형광 신호는 Zeiss LSM 880 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 검출하였다.
9. 해마 분석(Seahorse assay): ATP 생성률을 정량화하는 실험
분화된 세포에서 OCR(oxygen consumption rate)을 측정하기 위해, 줄기세포를 0.1% 또는 1% 젤라틴 코팅된 XFe24 세포 배양 플레이트(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에 7000 cell/cm2로 시딩한 다음 분화를 유도하였다. 미토콘드리아 OCR은 XF24 extracellular flux analyzer (Agilent Technologies)에서 XF Cell MitoStress test kit를 사용하여 측정하였다. OCR 값은 세포 DNA의 양에 따라 정규화하였다.
10. 통계 분석
통계 분석은 GraphPad Prism 버전 6.0(GraphPad Software, 미국)을 사용하여 수행하였다. 3개 이상의 데이터 세트에 대한 비교는 일원 분산 분석 또는 이원 분산 분석(ANOVA)과 Bonferroni의 다중 비교 테스트(Bonferroni's multiple comparison test)를 통해 수행하였다. 두 그룹 간 비교는 two-tailed Student's t-test를 사용하여 수행하였다. P값이 0.05 미만이면 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
[실시예]
실시예 1. 간 분화의 초기 단계에 영향을 미치는 분화된 세포의 세포소기관 상태
이전 연구에서 ROCK 억제제인 파수딜(fasudil)이 세포 분화의 초기 단계에서 중요한 과정인 hUCM-MSC의 간 내배엽으로의 분화에 어떤 영향을 미치는지 확인한 결과, ROCK 억제제가 줄기세포 생존력을 향상시킬 뿐만 아니라 인간 만능 줄기세포(human pluripotent stem cell; hPSC)의 내배엽으로의 유도를 촉진하는 것으로 확인되었다. 또한, 분화에 사용되는 일반적인 단백질(ex. cytokine)만 사용한 경우보다 저분자(파수딜)을 사용할 경우 분화 효율이 증가하는 것으로 나타났다(Cell Stem Cell. 2009;4(4):348-58). 따라서, 파수딜이 hUCM-MSC의 간 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 파수딜의 적정 농도와 처리 시간을 확인하였다. 그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 기존에 보고된 hPSC에 사용된 파수딜의 농도(Molecular metabolism. 2017;6(7):640-50)와는 달리 10 μM의 고농도에서 내배엽 마커(GATA4, SOX17, FOXA2)가 유의하게 증가하였으며, 72시간 처리 시 효과적인 것으로 나타났다 (P < 0.05). 또한, 줄기세포 운명의 대사와 조절에 중요한 것으로 알려진 분화세포 내 LD(lipid droplet), 미토콘드리아와 같은 세포소기관의 상태를 확인하기 위해 단층촬영 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 줄기세포가 조금 더 난형 모양으로 변화하고 미토콘드리아 형태가 달라졌다. 또한, 도 1c 및 도 1d에 나타낸 바와 같이, 세포 내부에서 LD가 유도되었고, LD의 수가 증가하였다(P <0.001).
다음으로, 도 1e에 나타낸 바와 같이, 간 내배엽의 다음 단계에 대한 평가로 파수딜의 사용이 간모세포(hepatoblast)의 분화 효율을 증가시키는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 1f에 나타낸 바와 같이, 분화된 세포의 표현형이 대조군과 파수딜 처리군 모두에서 유사한 것으로 나타났다. 그러나, 도 1g에 나타낸 바와 같이, 간세포 관련 유전자(AFP 및 HNF4A)의 발현이 파수딜 처리군에서는 억제된 것으로 나타났다(P <0.001). 내배엽 유전자 상향조절에도 불구하고 간세포 분화 효율이 감소한 이유를 확인하기 위해 미토콘드리아 기능 검사를 수행하였다. ATP (adenosine triphosphate) 생성과 같은 미토콘드리아 기능은 분화 효율과 관련이 있으며, 과도한 LD가 유도되면 감소한다. 따라서, 파수딜에 의해 유도된 LD가 미토콘드리아 기능에 영향을 미칠 것으로 가정하고 이를 확인하기 위해 파수딜을 처리한 세포에서 미토콘드리아의 기능을 확인하였다. 확인 결과, 예상대로, 도 1h에 나타낸 바와 같이, 분화 3일차에 파수딜을 처리한 세포에서 미토콘드리아 기능이 감소하였다(P <0.001).
상기 결과로부터, 파수딜이 hUCM-MSC의 간 분화 초기 단계에 전사적으로 영향을 미치지만 세포소기관 상태로 인해 내배엽의 다음 단계에는 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 젤라틴 점도가 hUCM-MSC의 간모세포 유도에 미치는 영향
파수딜 처리 결과를 바탕으로 미토콘드리아 기능이 분화 효율과 상관관계가 있는 것으로 가정하였다. 따라서, 다음 단계로 ECM(extracellular matrix) 성분을 통해 미토콘드리아 기능을 강화하고자 하였다. 또한, 본 실험 결과에서 확인된 바와 같이, 0.1% 또는 1% 젤라틴 코팅 접시에서 hUCM-MSC를 배양할 경우, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 기저(basal) 산화 인산화, 최대(maximal) 산화 인산화, ATP 생성, 및 양성자 누출(proton leak)과 같은 미토콘드리아 활성화 수준이 증가하였다(P <0.001). 이전에 진행된 연구 결과에 따르면, 분화된 세포에서 산화적 인산화 수준과 ATP 생산의 증가는 특정 계통 분화에 필요한 것으로 확인되었다(Dynamic changes in mitochondrial biogenesis and antioxidant enzymes during the spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. 2006;348(4):1472-8, Glycolytic network restructuring integral to the energetics of embryonic stem cell cardiac differentiation. 2010;48(4):725-34). 따라서, ECM으로 사용되는 젤라틴이 파수딜과 함께 분화 효율을 시너지적으로 향상시킬 수 있을 것으로 예상되었다.
젤라틴이 간 분화에 미치는 영향을 평가하기 위해 도 2b에 나타낸 바와 같이, 0.1% 또는 1% 젤라틴 코팅 접시에서 hUCM-MSC를 배양하고 이러한 조건에서 분화를 진행시켰다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, 분화된 세포의 표현형은 7일차에 모든 그룹에서 유사하게 나타났다. 다음으로 분화 0일, 3일, 7일차에 간 내배엽 및 간모세포와 관련된 유전자 발현의 역학을 분석하였다. 그 결과, 도 2d 및 도 2e에 나타낸 바와 같이, 1% 젤라틴과 파수딜 처리군에서 GATA4를 제외한 내배엽-관련 유전자(SOX17, FOXA2)와 간모세포-관련 유전자(AFP, HNF4A)가 다른 군에 비해 유의하게 상향 조절되는 것으로 나타났다. 그러나, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 흥미롭게도 간모세포 분화가 진행됨에 따라 1% 젤라틴 및 파수딜 그룹과 달리 0.1% 젤라틴 및 파수딜 그룹에서는 간모세포 마커(AFP 및 HNF4A)가 감소하였다(#a 및 #b, P <0.01).
저점도 젤라틴 그룹과 고점도 젤라틴 그룹에서 관찰된 분화 효율의 차이를 확인하기 위해 줄기세포의 초기 분화 운명을 확인하였다. 특히, 파수딜은 뉴런과 심근세포를 포함하는 외배엽과 중배엽에서 유래하는 세포의 분화를 위한 프로모터(promoter)로 알려져 있다. 따라서 분화 3일차에 분화된 세포에서 외배엽(PAX6, SOX1, OTX2) 및 중배엽(MIXL2, CDX2) 마커의 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 2f에 나타낸 바와 같이, 1% 젤라틴과 파수딜 그룹에서 외배엽 유전자(PAX6 및 OTX2)의 발현이 억제된 것으로 나타났다(P <0.05). 또한, 도 2g에 나타낸 바와 같이, 1% 젤라틴과 파수딜 그룹에서 중배엽 유전자 MIXL2는 하향 조절된 것으로 나타났다(P <0.01).
상기 결과로부터 고점도 젤라틴이 외배엽 및 중배엽 관련 유전자의 발현을 억제하여 내배엽의 운명을 유도하는 것을 알 수 있었다.
젤라틴 점도에 따른 줄기세포의 운명 결정이 세포소기관 상태에 영향을 받을 수 있다는 점을 고려하여, 다음으로 고점도 젤라틴이 분화된 세포의 세포소기관에 미치는 영향을 확인하였다.
실시예 3. 고점도 젤라틴은 LD의 유도를 억제하고 미토콘드리아 기능을 향상시켰다.
고점도 젤라틴이 세포소기관 조절을 통해 줄기세포의 운명에 미치는 영향을 분석하기 위해 단층 촬영 및 미토콘드리아 기능 분석을 수행하였다. 단층 촬영 분석은 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy)보다 세포소기관을 더 정확하게 관찰할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 분화 3일차에 분화된 세포의 미토콘드리아의 LD와 형태를 단층 촬영으로 분석하였다. 그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 1% 젤라틴과 파수딜을 처리한 그룹은 0.1% 젤라틴과 파수딜을 처리한 그룹보다 LD 유도가 낮은 것으로 나타났으며(P <0.001), 이는 고점도 젤라틴이 파수딜에 의해 유도된 LD 생성을 억제한다는 것을 시사한다. 또한, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 0.1% 젤라틴과 파수딜 그룹에서는 미토콘드리아 형태가 과융합 유도되는 것으로 나타났다.
다음으로, 과도한 LD 유도 및 과융합 형태의 미토콘드리아가 세포 미토콘드리아 기능에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, 해마 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 3c 및 도 3d에 나타낸 바와 같이, 1% 젤라틴과 파수딜 그룹에서 전체 OCR 수치가 가장 높게 나타났다(P <0.05). 또한, 모든 그룹에서 mtDNA 복제수를 측정하였다. 이전 연구에서 분화를 지원하기 위해 mtDNA 수준이 점차 증가하는 것으로 확인되었다. 따라서, 분화가 효율적일수록 mtDNA 복제수가 더 높아질 것으로 예상되었다. 도 3e에 나타낸 바와 같이, 본 실험에서는 1% 젤라틴과 파수딜 그룹에서 mtDNA 복제수가 더 높은 것으로 나타났다(P <0.001).
요약하면, 1% 젤라틴과 파수딜 그룹에서 향상된 분화 효율은 외배엽 및 중배엽 유전자 발현의 하향 조절뿐만 아니라 LD 생성 감소 및 활성화된 미토콘드리아 기능을 포함한 세포소기관 상태의 조절에 기인한 것으로 볼 수 있다.
실시예 4. HLC(hepatocyte-like cell)의 효율성과 기능을 시너지적으로 향상시키는 저점도 젤라틴
마지막으로, 젤라틴이 간세포 성숙에 미치는 영향을 확인하기 위해, 1% 젤라틴 코팅과 파수딜을 사용하여 유도한 간모세포 도 4a에 나타낸 바와 같이, HLC로 분화시켰다. 이 단계에서는 접시를 코팅하지 않고 2단계 분화 배지에 젤라틴을 추가하여 사용하였다. 구체적으로, 8일 동안 OSM을 사용하여 간모세포로부터 HLC를 유도하였고, 5일 동안 0%(젤라틴을 첨가하지 않음), 0.1%, 또는 1%의 다양한 점도로 젤라틴을 첨가하여 성숙을 진행하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 분화 20일차에 HLC 표현형은 모든 그룹에서 유사했다. 그러나 전사 분석 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 저점도(0.1%) 젤라틴 그룹에서 다른 그룹에 비해 성숙 간세포 관련 유전자(ALB, CYP3A4, CYP1A2, HNF1A 및 HNF4A)의 발현이 유의하게 증가한 것을 나타났다(P <0.01). 또한, 도 4d 및 도 4e에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯팅을 통해 이들 단백질(ALB(알부민) 및 CYP3A4)의 발현을 확인한 결과, 0.1% 젤라틴 그룹의 ALB 수치는 0% 젤라틴 그룹과 비슷했으나, CYP3A4 발현은 현저히 높은 것으로 나타났다(P <0.01). 또한, 성숙 효율은 miR-122 및 miR-192와 같은 간세포 특이적 miRNA의 발현을 통해 평가하였다. 그 결과, 도 4f에 나타낸 바와 같이, 0.1% 젤라틴이 존재할 때 간세포 특이적 miRNA가 유의하게 상향 조절되는 것으로 나타났다.
다음으로, 단백질 합성과 해독에서 간세포의 주요 역할을 고려하여 알부민 분비 및 CYP3A4 활성을 측정하였다. 이전 연구 결과와 일치하게, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 0.1% 젤라틴을 첨가한 HLC에서 간 기능이 유의적으로 향상된 것으로 나타났다(P <0.001). 전반적으로, 간세포의 사양(specification) 및 성숙은 간모세포 분화와 대조적으로 저점도 젤라틴에서 더 효율적인 것으로 나타났다. 따라서, 이를 이해하기 위해 20일차 HLC의 LD와 mtDNA 복제수에 초점을 맞춰 분화된 세포소기관의 상태를 분석하였다. 공초점 영상 분석 결과, 도 5c 및 도 5d에 나타낸 바와 같이, 0.1% 젤라틴을 간세포 성숙에 사용한 경우 LD가 더 적게 유도되는 것을 확인했으며(P <0.05), 도 5e에 나타낸 바와 같이, mtDNA 복제수의 유의미한 증가가 동일한 그룹에서 확인되었다 (P <0.001).
상기 결과는 저점도 젤라틴이 초기 분화 단계에서의 역할과 달리 HLC의 성숙에 유리하다는 것을 의미하며, 세포소기관 상태가 간세포의 효율성과 기능을 결정하는 데 중추적인 역할을 한다는 것을 강조한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 간세포 분화 방법은 줄기세포의 간세포로의 분화 초기 단계에서 ROCK 억제제로 줄기세포의 내배엽으로의 분화를 유도하되 이때 발생되는 지질방울의 생성을 고점도 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 세포를 배양함으로써 억제하고, 미토콘드리아의 기능을 활성화하며, 내배엽 유전자의 발현을 상향 조절하고, 외배엽 및 중배엽 유전자의 발현을 하향 조절함으로써 줄기세포의 간모세포로의 분화 효율을 향상시켰다. 또한, 분화 성숙(후기) 단계에서 배지에 저점도 젤라틴을 첨가함으로써 지질방울의 축적을 억제하고, 미토콘드리아를 활성화함으로써 간모세포의 간세포로의 분화 효율을 향상시키고, 분화된 간세포의 기능을 향상시킴으로써, 줄기세포의 간세포로의 분화 효율을 향상시켰다. 따라서, 이를 이용하여 수득한 간세포는 간질환의 치료용 세포 치료제, 이식체 등으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대되는 바, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (21)

  1. 줄기세포를 젤라틴이 코팅된 배양용기에서 ROCK 억제제를 포함한 배지에 배양하여 간모세포(hepatoblast)로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 탯줄 기질, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 ROCK 억제제는 파수딜 (Fasudil), 리파수딜 (Ripasudil), RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, 및 Y-30141로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 ROCK 억제제는 1 내지 50 μM의 농도로 배지에 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 젤라틴은 0.1 내지 10%의 농도로 배양용기에 코팅된 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 간모세포로의 분화를 유도하는 단계는 1 내지 10일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 간모세포로의 분화를 유도하는 단계는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법:
    (a-1) 줄기세포를 ROCK 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 간 내배엽으로의 분화를 유도하는 단계; 및
    (a-2) 상기 간 내배엽을 성장 인자, 골 형성 단백질, 및 wnt 신호 활성자를 포함하는 배지에서 배양하여 간모세포로의 분화를 유도하는 단계,
    단, 상기 (a-2) 단계는 젤라틴이 코팅되지 않은 배양용기에서 수행됨.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 간모세포를 젤라틴을 포함하는 배지에서 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 젤라틴은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 배지에 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 간세포로의 분화를 유도하는 단계는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 간세포 분화 방법:
    (b-1) 상기 간모세포를 온코스타틴 M을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b-2) 상기 온코스타틴 M을 포함하는 배지에 젤라틴을 첨가하고 추가적으로 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계.
  11. (a) ROCK 억제제를 유효성분으로 포함하는 제1조성물; 및 (b) 젤라틴을 유효성분으로 포함하는 제2조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 간세포 배양용 조성물로서,
    상기 제1조성물은 젤라틴이 코팅된 배양용기에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 배양은 줄기세포의 간세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 줄기세포는 탯줄 기질, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 ROCK 억제제는 파수딜 (Fasudil), 리파수딜 (Ripasudil), RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, 및 Y-30141로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 ROCK 억제제는 1 내지 50 μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 제2조성물의 젤라틴은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 제2조성물은 온코스타틴 M을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 배양용기에 젤라틴은 0.1 내지 10%의 농도로 코팅된 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 제1조성물 및 제2조성물은 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 간세포의 배양에 사용되는 것을 특징으로 하는, 간세포 배양용 조성물.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항의 간세포 배양용 조성물, 및 설명서를 포함하는 간세포 배양용 키트.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 설명서는 제1항의 줄기세포 유래 간세포 분화 방법이 기재된 것인, 간세포 배양용 키트.
PCT/KR2025/005783 2024-06-28 2025-04-29 파수딜과 젤라틴을 이용한 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 Pending WO2026005252A1 (ko)

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KR1020240085745A KR20260003527A (ko) 2024-06-28 2024-06-28 파수딜과 젤라틴을 이용한 줄기세포 유래 간세포 분화 방법
KR10-2024-0085745 2024-06-28

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