WO2025239347A1 - 顕微鏡装置 - Google Patents

顕微鏡装置

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WO2025239347A1
WO2025239347A1 PCT/JP2025/017325 JP2025017325W WO2025239347A1 WO 2025239347 A1 WO2025239347 A1 WO 2025239347A1 JP 2025017325 W JP2025017325 W JP 2025017325W WO 2025239347 A1 WO2025239347 A1 WO 2025239347A1
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WO
WIPO (PCT)
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pupil
light
illumination
optical system
microscope apparatus
Prior art date
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Pending
Application number
PCT/JP2025/017325
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English (en)
French (fr)
Inventor
諭史 池田
直樹 福武
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Nikon Corp
Original Assignee
Nikon Corp
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Filing date
Publication date
Application filed by Nikon Corp filed Critical Nikon Corp
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Pending legal-status Critical Current
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements

Definitions

  • the present invention relates to a microscope device.
  • Patent Document 1 describes a microscope apparatus having an optical element that is provided at the pupil position of an illumination optical system and has a light transmittance distribution that monotonically increases/decreases across the entire illumination pupil.
  • a microscope apparatus is a microscope apparatus including a detection optical system and one of the following (1) and (2): (1) An illumination optical system that illuminates a sample, and an optical element arranged at a pupil or near the pupil of the illumination optical system or at a position conjugate to the pupil or near the pupil. (2) An LED array that illuminates the sample without going through the illumination optical system.
  • the light intensity distribution in the plane of the pupil or near the pupil where the optical element is arranged or in a plane conjugate to the pupil or near the pupil, and the light intensity distribution in the LED array each include a first region where the light intensity changes along a predetermined direction according to a monotonically increasing function or an upwardly convex function, and a second region other than the first region where the light intensity is approximately zero.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a microscope apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is an enlarged view of the stage.
  • FIG. 3A shows the light intensity distribution in the pupil plane
  • FIG. 3B shows the POTF distribution and the XZ cross section of a three-dimensional image of a bead.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of a method for reproducing the light intensity distribution of the left illumination pupil.
  • 5A, 5B, and 5C are diagrams showing the state of a sine function over the entire pupil, a sine function over half the pupil, and a uniform distribution over half the pupil, respectively.
  • 6A, 6B, and 6C show the XZ cross section of the three-dimensional image and the distribution of POTF in the cases of FIGS.
  • FIG. 7A shows the XZ cross section of the POTF distribution and three-dimensional image.
  • FIG. 7B shows the XZ cross section of the POTF distribution and three-dimensional image.
  • FIG. 7C shows the XZ cross section of the POTF distribution and three-dimensional image.
  • Fig. 8A shows a case where the light intensity at the pupil edge is distributed according to a sine function
  • Fig. 8B shows the distribution of the POTF and the XZ cross section of a three-dimensional image in the case of Fig. 8A.
  • FIG. 8A shows a case where the light intensity at the pupil edge is distributed according to a sine function
  • Fig. 8B shows the distribution of the POTF and the XZ cross section of a three-dimensional image in the case of Fig. 8A.
  • FIG. 9A shows the light intensity distribution of the illumination pupil, the distribution of the POTF, and the XZ cross section of the three-dimensional image when the point where the light intensity becomes 0 is shifted in the +Fx direction from the origin by 10% of the pupil radius of the illumination pupil.
  • FIG. 9B shows the light intensity distribution of the illumination pupil, the distribution of the POTF, and the XZ cross section of the three-dimensional image when the point where the light intensity becomes 0 is shifted in the +Fx direction from the origin by 30% of the pupil radius of the illumination pupil.
  • FIG. 10A shows the light intensity distribution of the illumination pupil, the distribution of the POTF, and the XZ cross section of the three-dimensional image when the point where the light intensity becomes 0 is shifted in the ⁇ Fx direction from the origin by 10% of the pupil radius of the illumination pupil.
  • FIG. 10B shows the light intensity distribution of the illumination pupil, the distribution of the POTF, and the XZ cross section of the three-dimensional image when the point where the light intensity becomes 0 is shifted in the ⁇ Fx direction from the origin by 30% of the pupil radius of the illumination pupil.
  • FIG. 11A shows the case where the light intensity of the pupil half in the pupil plane of the illumination pupil varies according to a sine function.
  • FIG. 11A shows the case where the light intensity of the pupil half in the pupil plane of the illumination pupil varies according to a sine function.
  • FIG. 11B shows the case where the light intensity of the pupil half in the pupil plane of the illumination pupil varies according to a linear function.
  • FIG. 11C shows the case where the light intensity of the pupil half in the pupil plane of the illumination pupil varies according to a tan function.
  • FIG. 12A shows the case where the period of the sine function is 1/4 or less.
  • FIG. 12B shows the case where the period of the sine function is 1.5/4.
  • FIG. 12C shows a case where the period of the sine function is 1/2 period.
  • FIG. 15A shows the XZ cross section of the POTF XZ distribution and three-dimensional image.
  • FIG. 15B shows the YZ cross section of the distribution and three-dimensional image of POTF YZ .
  • FIG. 16 shows how the line of constant light intensity in the illumination pupil curves along the Fy axis direction.
  • FIG. 17 is a diagram showing the light intensity distribution of two illumination pupils in the Fx direction and the light intensity distribution of two illumination pupils in the Fy direction.
  • FIG. 18 is an image of a three-dimensional refractive index distribution obtained using the light intensity distribution of the four illumination pupils in FIG.
  • FIG. 19 is a schematic configuration diagram of a microscope apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 20 is a diagram showing two types of intensity modulation elements T1(+) and T1(-).
  • FIG. 21 is a schematic diagram of a microscope apparatus according to the third embodiment.
  • FIG. 22 is a diagram showing the light intensity distribution according to the third embodiment.
  • FIG. 23 is a schematic diagram of a microscope apparatus in which an LED array is used as an optical element.
  • FIG. 24 is a schematic diagram of a microscope apparatus according to the fourth embodiment.
  • FIG. 25 is a schematic diagram of a microscope apparatus according to the fifth embodiment.
  • FIG. 26 is a schematic diagram of a microscope apparatus according to the sixth embodiment.
  • FIG. 27 is a schematic diagram of a microscope apparatus according to the seventh embodiment.
  • the microscope apparatus 1 shown in FIG. 1 is an inverted microscope, but may be an upright microscope.
  • the microscope apparatus 1 according to the first embodiment includes a stage 2, a transmitted illumination light source 5, an incident illumination light source 6, a transmitted illumination optical system 10, an incident illumination optical system 20, a detection optical system 40, a detector (detection unit) 60, a second detector (second detection unit) 261, a control unit 65, an image processing unit 66, an operation input unit 67, and an image display unit 70.
  • the optical axis of the transmitted illumination optical system 10 is denoted as Ax1
  • the optical axis of the detection optical system 40 is denoted as Ax2.
  • optical axis Ax1 of the transmitted illumination optical system 10 and the optical axis Ax2 of the detection optical system 40 are basically the same optical axis (i.e., coaxial) as the optical axis of the microscope apparatus 1, but for convenience of explanation, they are separately represented as the optical axis Ax1 of the transmitted illumination optical system 10 and the optical axis Ax2 of the detection optical system 40.
  • the stage 2 is formed using a transparent parallel plate.
  • the stage 2 supports the sample SA.
  • the sample SA is a phase object such as a cell.
  • the stage 2 is provided with a stage driver 3.
  • the stage driver 3 moves the stage 2 along the optical axis Ax1 of the transmitted illumination optical system 10.
  • the coordinate axis extending in the optical axis direction of the transmitted illumination optical system 10 is the z-axis.
  • the stage drive unit 3 By moving the stage 2 in the z-direction using the stage drive unit 3, it is possible to acquire image data of the cross section of the sample SA at a predetermined position Z0, a position Z0+ ⁇ z that is + ⁇ z away from position Z0, a position Z0- ⁇ z that is - ⁇ z away from position Z0, a position Z0+2 ⁇ z that is +2 ⁇ z away from position Z0, a position Z0-2 ⁇ z that is -2 ⁇ z away from position Z0, etc.
  • the transmitted illumination light source 5 generates illumination light in a predetermined wavelength band.
  • the transmitted illumination optical system 10 comprises, in order from the transmitted illumination light source 5 side, a collector lens 12, a field stop 14, a relay lens 15, an optical element 16, an aperture stop 17, and a condenser lens 18.
  • the transmitted illumination light source 5 is configured using, for example, a halogen lamp. When a halogen lamp is used as the transmitted illumination light source 5, it is preferable to provide an element that narrows the wavelength band of the illumination light. Narrowing the wavelength band of the illumination light can improve the accuracy of calculated values such as POTF.
  • the wavelength band of the illumination light can be narrowed by inserting a bandpass filter 13 with predetermined spectral transmittance characteristics in the optical path between the collector lens 12 and relay lens 15 in the transmitted illumination optical system 10.
  • the spectral transmittance characteristics of the bandpass filter 13 are set based on the wavelength band of the illumination light appropriate for the observation purpose, such as bright-field observation or fluorescence observation.
  • a bandpass filter 13 into the optical path between the field stop 14 and the relay lens 15 in the transmitted illumination optical system 10.
  • a filter cube (not shown) equipped with a bandpass filter may also be inserted into the optical path of the transmitted illumination optical system 10.
  • the optical element 16 and aperture stop 17 are arranged on a plane perpendicular to the optical axis Ax1 of the transmitted illumination optical system 10 at position P0 of the pupil (hereinafter sometimes referred to as the illumination pupil) between the relay lens 15 and the condenser lens 18 in the transmitted illumination optical system 10.
  • the optical element 16 is arranged adjacent to the aperture stop 17 (for example, above the aperture stop 17 as shown in Figure 1).
  • the plane perpendicular to the optical axis Ax1 of the transmitted illumination optical system 10 at position P0 of the illumination pupil is referred to as the plane of the illumination pupil.
  • the optical element 16 is a flat plate that is optically transparent and whose light transmittance changes within the plane of the plate.
  • This plate is formed, for example, by depositing a film that can reduce light transmittance (has light-blocking properties) onto a parallel plate such as a glass substrate.
  • a metal film is deposited.
  • the optical element 16 can be said to be an intensity modulation element.
  • the optical element 16 may also be a liquid crystal element that can change the light transmittance.
  • the light transmittance of the optical element 16 changes within the plane of the illumination pupil.
  • the light intensity from the optical element 16 changes continuously (or discretely) within the plane of the illumination pupil.
  • the light intensity distribution from the optical element 16 (in other words, the light intensity distribution on the plane of the illumination pupil) is determined by the light intensity changing depending on the location of the optical element 16. It is preferable that the light intensity distribution (amount of change) generated by the optical element 16 has 16 or more levels (16 divisions between the minimum and maximum intensity).
  • any one of a plurality of optical elements 16 that provide different light intensity distributions can be selected and placed at the illumination pupil position P0.
  • the microscope apparatus 1 is equipped with a switching control unit 160 that controls switching to any one of the plurality of optical elements 16 that provide different light intensity distributions and placing it in the plane of the illumination pupil (or in a plane conjugate to the illumination pupil).
  • the switching control unit 160 may change the light intensity distribution by rotating or controlling a single optical element 16. Details of the light intensity of the optical element 16 will be described later. Note that the position at which the optical element 16 is placed is not limited to the illumination pupil position P0.
  • the optical element 16 may be placed in a plane perpendicular to the optical axis Ax1 at a position conjugate to the illumination pupil (in other words, a plane conjugate to the illumination pupil). Furthermore, as will be described later, when an LED array is used as the optical element 16 to illuminate the sample SA directly (without via a condenser lens), the LED array is placed near the pupil of the illumination pupil or in a position conjugate to the vicinity of the pupil.
  • ⁇ is the wavelength of the light source
  • s is the size of the coherent light source (the maximum distance between two points within an incoherent surface light source that can be considered coherent)
  • z is the distance from the light source to the sample.
  • ⁇ is the wavelength of the LED array
  • s is the maximum distance between two points on the light-emitting surface of each LED in the LED array that can be considered coherent (two points that are further apart will be incoherent)
  • z is the distance from the LED array to the sample (stage). Since two points that are about the same distance apart as the wavelength on the light-emitting surface of each LED are coherent, if we assume that s ⁇ ⁇ , then N ⁇ ⁇ /z.
  • N ⁇ 1 it is in the Fraunhofer region, and the LED array can be considered to be near the pupil.
  • the illumination NA by the LED array without a condenser lens is NAill, it can be expressed by the following equation (1) using the distance z from the sample SA or stage 2 and the radius R of the LED array.
  • the following formula (2) may be used.
  • the illumination NA is approximately 0.8.
  • the advantage of direct illumination from an LED array is that it resolves the trade-off between the distance z and the illumination NA.
  • the condenser lens 18 is positioned above and facing the stage 2. It is possible to select one of multiple condenser lenses 18 with different optical characteristics and place it above the stage 2.
  • the incident-light illumination light source 6 generates excitation light in a predetermined wavelength band.
  • the incident-light illumination optical system 20 comprises, in order from the sample SA side, an objective lens unit 21 and a filter cube 231.
  • the objective lens unit 21 comprises multiple objective lenses 22, a lens holder 25, and a unit driver 26.
  • the objective lenses 22 are arranged facing each other below the stage 2.
  • the lens holder 25 holds multiple objective lenses 22 with different focal lengths.
  • the lens holder 25 is configured using, for example, a revolver or turret.
  • the unit driver 26 drives the lens holder 25 to select one of the multiple objective lenses 22 and place it below the stage 2.
  • the unit driver 26 may also move the lens holder 25 along the z-axis. In this case, the stage driver 3 may be used in combination, or the stage driver 3 may not be used.
  • the filter cube 231 is always inserted in the optical path of the detection optical system 40, which includes the epi-illumination optical system 20.
  • the filter cube 231 reflects the excitation light emitted from the epi-illumination light source 6 toward the stage 2.
  • the filter cube 231 transmits fluorescence generated in the sample SA on the stage 2 by irradiation with excitation light from the epi-illumination light source 6 toward the first imaging lens 41 of the detection optical system 40.
  • the filter cube 231 transmits light (detection light) that has been transmitted or diffracted by the sample SA by irradiation with illumination light from the transmitted illumination optical system 10.
  • the filter cube 231 has an excitation filter 232 that transmits the excitation light from the epi-illumination light source 6.
  • the filter cube 231 has an absorption filter 233 that absorbs excitation light reflected by the sample SA, the stage 2, etc.
  • the absorption filter 233 transmits the fluorescence and detection light from the sample SA.
  • the detection optical system 40 includes an objective lens unit 21 and a filter cube 231.
  • the detection optical system 40 includes, in order from the incident-light illumination optical system 20 side, a first imaging lens 41, a dichroic filter 242, a first mirror 43, a lens 44, a second mirror 45, a collimator lens 46, and a half mirror 47.
  • the detection optical system 40 also includes a third imaging lens 50.
  • a second imaging lens 48, a third mirror 49, and an eyepiece lens 55 are arranged on the optical path of light passing through the half mirror 47.
  • the ratio of transmittance to reflectance of the half mirror 47 is set to, for example, 1:1.
  • a portion of the light incident on the half mirror 47 is reflected by the half mirror 47 and enters the third imaging lens 50.
  • the light that passes through the third imaging lens 50 forms an image at a predetermined first image plane IA.
  • the position of the predetermined first image plane IA is a position conjugate to the focal position of the objective lens 22.
  • a detector 60 is positioned at the first image plane IA of the detection optical system 40.
  • Another portion of the light that enters the half mirror 47 passes through the half mirror 47 and enters the second imaging lens 48.
  • the light that passes through the second imaging lens 48 is reflected by the third mirror 49 and forms an image at a predetermined second image plane IB.
  • the position of the predetermined second image plane IB is a position conjugate to the focal position of the objective lens 22.
  • the observer can use the eyepiece 55 to observe the image of the sample SA formed on the second image plane IB.
  • the detector 60 uses an imaging element such as a CCD or CMOS.
  • the dichroic filter 242 separates light based on differences in wavelength. Specifically, as part of the light incident on the dichroic filter 242, fluorescence emitted from the sample SA (due to irradiation with excitation light from the incident-light illumination optical system 20) is reflected by the dichroic filter 242 and forms an image at a predetermined third image plane IC.
  • the position of the predetermined third image plane IC is conjugate to the focal position of the objective lens 22.
  • a second detector 261 is disposed at the third image plane IC of the detection optical system 40.
  • light (detection light) transmitted or diffracted by the sample SA passes through the dichroic filter 242 and is reflected by the first mirror 43.
  • the detection light reflected by the first mirror 43 forms an image at a predetermined first image plane IA where the detector 60 is disposed.
  • the second detector 261 uses an imaging element such as a CCD or CMOS.
  • a half mirror may also be used.
  • a barrier filter is used in conjunction with the half mirror. Specifically, a first barrier filter is provided that absorbs a portion of the light reflected by the half mirror (detection light from sample SA), and a second barrier filter is provided that absorbs a portion of the light that passes through the half mirror (fluorescence from sample SA).
  • a first barrier filter is provided that absorbs a portion of the light reflected by the half mirror (detection light from sample SA)
  • a second barrier filter is provided that absorbs a portion of the light that passes through the half mirror (fluorescence from sample SA).
  • the illumination light emitted from the transmitted illumination light source 5 enters the collector lens 12 (through the bandpass filter 13 if a halogen lamp is used as the transmitted illumination light source 5).
  • the illumination light that passes through the collector lens 12 becomes parallel light, passes through the field stop 14, and enters the relay lens 15.
  • the illumination light that passes through the relay lens 15 passes through the optical element 16 and the aperture stop 17 and enters the condenser lens 18.
  • the illumination light that passes through the condenser lens 18 becomes parallel light and enters the sample SA on the stage 2.
  • the transmitted illumination optical system 10 illuminates the sample SA on the stage 2 with illumination light from the transmitted illumination light source 5.
  • the detection light that has passed through or is diffracted by the sample SA enters the objective lens 22, which serves as the detection optical system 40.
  • the detection light that has passed through the objective lens 22 enters the filter cube 231.
  • the detection light incident on the filter cube 231 passes through the filter cube 231 and passes through the absorption filter 233 before entering the first imaging lens 41.
  • the detection light transmitted through the first imaging lens 41 enters the dichroic filter 242.
  • the detection light incident on the dichroic filter 242 passes through the dichroic filter 242 and is reflected by the first mirror 43 to form an image at a predetermined intermediate image plane IM and enters the lens 44.
  • the detection light transmitted through the lens 44 is reflected by the second mirror 45 and enters the collimator lens 46.
  • the detection light transmitted through the collimator lens 46 becomes parallel light and enters the half mirror 47.
  • a portion of the detection light incident on the half mirror 47 is reflected by the half mirror 47 and enters the third imaging lens 50.
  • the detection light transmitted through the third imaging lens 50 forms an image at a predetermined first image plane IA where the detector 60 is located.
  • Another portion of the detection light incident on the half mirror 47 passes through the half mirror 47 and enters the second imaging lens 48.
  • the detection light transmitted through the second imaging lens 48 is reflected by the third mirror 49 and forms an image on a predetermined second image plane IB.
  • the detector 60 detects the detection light from the sample SA via the detection optical system 40 and outputs a detection signal of the detection light. In other words, the detector 60 captures an image of the sample SA via the detection optical system 40.
  • the detection signal is a signal that indicates the signal intensity detected by the detector 60 in accordance with the intensity of the light (detection light). Specifically, if the detector 60 is a CCD, it is a signal at each pixel of the CCD. In other words, the detection signal is a signal that indicates the signal intensity detected by the detector 60 in accordance with the intensity of the image of the sample SA.
  • the excitation light emitted from the epi-illumination light source 6 passes through the excitation filter 232 of the epi-illumination optical system 20 and enters the filter cube 231.
  • the excitation light that enters the filter cube 231 is reflected by the filter cube 231 and enters the objective lens 22.
  • the excitation light that passes through the objective lens 22 is incident on the sample SA on the stage 2.
  • the epi-illumination optical system 20 illuminates the sample SA on the stage 2 with the excitation light from the epi-illumination light source 6.
  • the irradiation with the excitation light excites the fluorescent substance contained in the sample SA, causing it to emit fluorescence.
  • the fluorescence from the sample SA enters the objective lens 22, which serves as the detection optical system 40.
  • the fluorescence that passes through the objective lens 22 enters the filter cube 231.
  • the fluorescence that enters the filter cube 231 passes through the filter cube 231, passes through the absorption filter 233 and enters the first imaging lens 41.
  • the fluorescence that passes through the first imaging lens 41 is incident on the dichroic filter 242.
  • the fluorescence that is incident on the dichroic filter 242 is reflected by the dichroic filter 242 and forms an image on a predetermined third image plane IC where the second detector 261 is located.
  • the second detector 261 detects fluorescence from the sample SA via the detection optical system 40 and outputs a detection signal of the fluorescence.
  • the detection signal of the light (detection light) output from the detector 60 and the detection signal of the fluorescence output from the second detector 261 are transmitted to the image processing unit 66 via the control unit 65.
  • the control unit 65 performs overall control of the microscope device 1.
  • the control unit 65 is electrically connected to the stage driving unit 3, unit driving unit 26, detector 60, image processing unit 66, operation input unit 67, image display unit 70, switching control unit 160, etc.
  • the image processing unit 66 generates refractive index data for the sample SA based on the detection signal of light (detection light) output from the detector 60 by illuminating the sample SA using the transmitted illumination optical system 10 and detecting light from the sample SA via the detection optical system 40 (in other words, bright-field observation).
  • the refractive index data for the sample SA refers to data representing the refractive index of the sample SA, such as data on the refractive index at each position on the sample SA, i.e., data showing the refractive index distribution in the sample SA.
  • the refractive index data for the sample SA is stored in a memory unit (not shown), for example, as a look-up table.
  • the image processing unit 66 also generates image data (hereinafter sometimes referred to as image data of the refractive index distribution of the sample SA) in which the brightness value of each pixel is set according to the refractive index value at each position on the refractive index distribution in the sample SA.
  • the image processing unit 66 also generates image data (hereinafter sometimes referred to as image data of the refractive index distribution of the sample SA) in which the brightness value of each pixel is set according to the signal intensity value of the detection signal at each position on the sample SA (each pixel of the detector 60) based on the detection signal of the detection light output from the detector 60.
  • the image processing unit 66 Based on the fluorescence detection signal output from the second detector 261, the image processing unit 66 generates image data (hereinafter sometimes referred to as image data of the sample SA obtained by fluorescence observation) in which the brightness value of each pixel is set according to the signal intensity value of the detection signal at each position on the sample SA (each pixel of the second detector 261).
  • the image display unit 70 displays an image of the refractive index distribution of the sample SA based on image data of the refractive index distribution of the sample SA generated by the image processing unit 66.
  • the image display unit 70 also displays an image of the sample SA observed by bright field observation based on image data of the sample SA observed by bright field observation generated by the image processing unit 66.
  • the image display unit 70 also displays an image of the sample SA observed by fluorescence observation based on image data of the sample SA observed by fluorescence observation generated by the image processing unit 66.
  • the detector 60 detects the detection light from the sample SA via the detection optical system 40
  • the second detector 261 detects the fluorescence from the sample SA via the detection optical system 40. Therefore, it is possible to generate an image of the three-dimensional refractive index distribution in the sample SA and an image of the sample SA obtained by fluorescence observation at the same time, allowing the user to compare and observe both images.
  • the image processing unit 66 determines the two-dimensional or three-dimensional refractive index distribution of the sample SA as refractive index data for the sample SA.
  • An example of a method for determining the three-dimensional refractive index distribution is described in PCT/JP2022/025272 (paragraphs 0047-0072, paragraph 0093), and the description of PCT/JP2022/025272 is incorporated herein by reference.
  • an optical element 16 is provided at the illumination pupil position P0 in the transmitted illumination optical system 10, which changes the light intensity distribution within the plane of the illumination pupil, for example, as shown in Figure 4.
  • this embodiment can provide a microscope apparatus 1 that is capable of acquiring images with excellent S/N and Z-direction sectioning. This is explained in detail below.
  • DIC Different Interference Contrast microscopy
  • OTF Optical Transfer Function
  • Equation (3) Equation (3) can be approximated as Equation (4).
  • the only option is to set illumination ⁇ 1 and make the light intensity distribution within the pupil plane of the illumination pupil a sine function (see Figure 3(A)).
  • resolution can be increased by reducing the shear amount ⁇ . Therefore, by reducing the shear amount ⁇ in equation (4) and determining that the sine function is 1/2 period or less, a POTF (Phase Optical Transfer Function) distribution and image such as that shown in Figure 3(B) can be obtained.
  • a nearly spherical bead is used as the sample SA.
  • Figure 3(A) shows the light intensity distribution in the pupil plane of the illumination pupil IP
  • the right side of Figure 3(A) shows the light intensity distribution in the pupil plane of the detection pupil DP.
  • the light intensity monotonically increases according to a sine function in the +Fx direction (and monotonically decreases according to a sine function in the -Fx direction), with equal light intensity areas distributed along a straight line extending in the Fy direction.
  • the pupil plane of the detection pupil DP the light intensity is 1 (light transmittance is 100%).
  • illumination ⁇ is set to 1.
  • Figure 3(B) shows the POTF distribution (left side of Figure 3(B)) and the XZ cross section of a 3D image of a bead (right side of Figure 3(B)) for the case of Figure 3(A).
  • Figure 4 shows that the light intensity distribution of the illumination pupil IP on the left side of Figure 4 can be reproduced by taking the difference in the light intensity distribution of the two illumination pupils IP on the right side.
  • Figures 5(A), (B), and (C) respectively show the case where the light intensity is distributed over the entire pupil surface of the illumination pupil IP, increasing monotonically in the +Fx direction according to a sine function (hereinafter sometimes referred to as "full pupil sine function”), the case where the light intensity is distributed over half the pupil surface of the illumination pupil IP, increasing monotonically in the +Fx direction according to a sine function (hereinafter sometimes referred to as "half pupil sine function”), and the case where the light intensity is distributed uniformly over half the pupil surface of the illumination pupil IP.
  • Figures 6(A), (B), and (C) show the XZ cross section of the 3D image and the POTF distribution for Figures 5(A), (B), and (C), respectively.
  • the best Z sectioning is achieved when the light intensity across the entire pupil of the illumination pupil IP in the +Fx direction is distributed in a monotonically increasing manner according to a sine function.
  • Figure 7A shows the POTF distribution and the XZ cross section of the three-dimensional image for the case of Figure 5(A) (top row of Figure 7A), the POTF distribution and the XZ cross section of the three-dimensional image for the case of the illumination pupil IP obtained by inverting the illumination pupil IP in Figure 5(A) (middle row of Figure 7A), and the POTF distribution and the XZ cross section of the three-dimensional image when the difference is taken between the illumination pupil IP in Figure 5(A) and the illumination pupil IP obtained by inverting the illumination pupil IP in Figure 5(A) (bottom row of Figure 7A).
  • FIG. 7B shows the POTF distribution and the XZ cross section of the three-dimensional image in the case of FIG. 5(B) (the upper part of FIG.
  • Figure 7C shows the POTF distribution and the XZ cross section of the three-dimensional image in the case of Figure 5(C) (top row of Figure 7C), the POTF distribution and the XZ cross section of the three-dimensional image in the case of an illumination pupil IP obtained by inverting the illumination pupil IP of Figure 5(C) (middle row of Figure 7C), and the POTF distribution and the XZ cross section of the three-dimensional image when the difference between the illumination pupil IP of Figure 5(C) and the illumination pupil IP obtained by inverting the illumination pupil IP of Figure 5(C) is taken (bottom row of Figure 7C).
  • the illumination pupil IP has a light intensity distribution that follows a function in which the light intensity is 0 only at the origin.
  • the point where the light intensity is zero may be shifted from the origin to some extent. We will now explain in detail how far the point where the light intensity is zero may be shifted from the origin.
  • Figure 9A shows the light intensity distribution of the illumination pupil IP, the distribution of the POTF, and the XZ cross section of the 3D image when the point where the light intensity becomes 0 is shifted from the origin in the +Fx direction by 10% of the pupil radius of the illumination pupil IP.
  • Figure 9B shows the light intensity distribution of the illumination pupil IP, the distribution of the POTF, and the XZ cross section of the 3D image when the point where the light intensity becomes 0 is shifted from the origin in the +Fx direction by 30% of the pupil radius of the illumination pupil IP.
  • Figure 10A shows the light intensity distribution of the illumination pupil IP, the distribution of the POTF, and the XZ cross section of the 3D image when the point where the light intensity becomes zero is shifted in the -Fx direction from the origin by 10% of the pupil radius of the illumination pupil IP.
  • Figure 10B shows the light intensity distribution of the illumination pupil IP, the distribution of the POTF, and the XZ cross section of the 3D image when the point where the light intensity becomes zero is shifted in the -Fx direction from the origin by 30% of the pupil radius of the illumination pupil IP.
  • the point where the light intensity becomes 0 be in the range of +30% to -30% from the origin when converted into illumination pupil radius.
  • the pupil radius of the illumination pupil IP can be read as the effective illumination pupil radius.
  • the light intensity in the pupil plane of the illumination pupil IP changes according to a sine function.
  • the light intensity in the pupil plane of the illumination pupil IP is not limited to a sine function, and may change according to a function that behaves similarly to a sine function.
  • Functions that behave similarly to a sine function include, for example, monotonically increasing/monotonically decreasing functions such as linear functions, cosine functions, tangent functions, exponential functions, and higher-order functions.
  • Figures 11A to 11C show cases where the light intensity of half the pupil within the pupil plane of the illumination pupil IP varies according to a sine function (an example of an upwardly convex function) (Figure 11A), a linear function ( Figure 11B), and a tangent function (Figure 11C).
  • (e) is a 3D image after subtraction.
  • the brightness values of the images are all aligned.
  • the degree of shading in the image when viewed in the XY plane will also increase. If the degree of shading in the XY plane is large, the outline of the cells serving as the sample will become unclear. This is therefore undesirable from the perspective of image analysis.
  • Such an upwardly convex function is, for example, a sine function, a cosine function, or any other periodic function.
  • such an upwardly convex function is, for example, a logarithmic function, an error function, or any other higher-order function.
  • the larger the period of the sine function the smaller the contribution of high-frequency components.
  • the larger the period of the sine function the larger the value of the POTF after subtraction. This corresponds to an increase in the shear amount in the DIC imaging method, which means that contrast increases but resolution deteriorates. In this way, the shear amount can be changed by changing the period of the sine function.
  • Z sectioning also deteriorates, so from the perspective of achieving both S/N and Z sectioning, it is desirable that the period of the sine function be 1/2 period or less, and even more desirable that it be 1/4 period or less. If it is 1/2 period or more, the sine function will take a negative value, which is not desirable.
  • illumination ⁇ >1 is sufficient, and the illumination pupil IP does not necessarily have to be a monotonically increasing function; it may have a maximum value along the way.
  • 15A shows the distribution of POTF XZ and the XZ cross section of the three-dimensional image in the case of FIG. 14( a) (top row), the distribution of POTF XZ and the XZ cross section of the three-dimensional image in the case of FIG. 14( b) (middle row), and the distribution of POTF XZ and the XZ cross section of the three-dimensional image in the case of taking the difference between the illumination pupil in FIG. 14( a) and the illumination pupil in FIG. 14( b) (bottom row).
  • Fig. 15B shows the distribution of POTF YZ and the YZ cross section of the three-dimensional image in the case of Fig. 14(a) (top), the distribution of POTF YZ and the YZ cross section of the three-dimensional image in the case of Fig. 14(b) (middle), and the distribution of POTF YZ and the YZ cross section of the three-dimensional image in the case of taking the difference between the illumination pupil in Fig. 14(a) and the illumination pupil in Fig. 14(b) (bottom).
  • illumination ⁇ is set to 1.
  • the light intensity of the illumination pupil IP has taken a constant value in the Fy-axis direction at each Fx coordinate, as shown in Figure 5(B), for example.
  • the line of constant light intensity of the illumination pupil IP may not be parallel to the Fy-axis direction, but may be curved.
  • the degree of curvature can be up to ⁇ 30% of the pupil radius of the illumination pupil IP from the origin.
  • the microscope apparatus 1 includes an illumination optical system 10 that illuminates the sample SA, a detection optical system 40, and an optical element 16 located at the illumination pupil position P0 of the illumination optical system 10 or at a position conjugate to the illumination pupil.
  • the light intensity distribution includes a first region (see region IP1 in FIG. 5B) in which the light intensity varies along a predetermined direction according to a monotonically increasing function or an upwardly convex function, and a second region (see region IP2 in FIG. 5B) other than the first region, in which the light intensity is approximately zero.
  • this embodiment describes the light intensity of the second region as zero, the effect of this embodiment can be achieved if the light intensity of the second region is 10% or less of the maximum value of the light intensity distribution. Therefore, the concept of the light intensity of the second region being approximately zero includes the case where the light intensity of the second region is 10% or less of the maximum value of the light intensity distribution. This also applies to other embodiments described below (including cases where the light intensity in the fourth region is approximately zero, as well as the light intensity in the second region).
  • contrast is increased by an optical element 16 having a light intensity distribution in the illumination pupil IP that is, for example, a half-pupil sinusoidal function, and assuming that differences are taken, it is possible to provide a microscope apparatus 1 that can acquire images that are excellent in both S/N and Z-direction sectioning.
  • the specified direction is preferably a first direction (for example, the +Fx direction) originating near the optical axis of the illumination optical system 10.
  • the specified direction is the first direction originating near the center of the LED array.
  • the vicinity of the optical axis of the illumination optical system 10 be in the range from a position starting from the optical axis and moving in the first direction by 30% of the radius of the surface of the illumination pupil IP to a position starting from the optical axis and moving in the opposite direction from the first direction by 30% of the radius of the surface of the illumination pupil IP.
  • the vicinity of the center of the LED array be in the range from a position starting from the center and moving in the first direction by 30% of the radius of the surface of the LED array to a position starting from the center and moving in the opposite direction from the first direction by 30% of the radius of the surface of the LED array.
  • the upward convex function is a sine function, a cosine function, or any other periodic function, and it is preferable that the light intensity varies within a range of 1/2 the period of the periodic function or less, and more preferably within a range of 1/4 the period of the periodic function or less.
  • the upwardly convex function may be a logarithmic function, an error function, or any other higher-order function.
  • the above discussion has focused on S/N and Z-sectioning, but this can also be applied to image processing.
  • the image processing unit 66 can determine the two-dimensional or three-dimensional refractive index distribution of the sample SA as refractive index data for the sample SA.
  • the better the S/N of the image the more resistant it will be to noise when deconvolving.
  • the better the Z-sectioning of the original image the better the Z-sectioning of the resulting ODT (Optical Diffraction Tomography) image will be.
  • FIG. 17 shows the light intensity distribution of two illumination pupils IP in the Fx direction and the light intensity distribution of two illumination pupils IP in the Fy direction.
  • illumination ⁇ is set to 1 in FIG. 17.
  • Four optical elements 16 having the light intensity distribution of the illumination pupils IP shown in FIG. 17 are placed in the light path by switching as needed using the switching control unit 160, and four images are acquired.
  • the switching control unit 160 may control one optical element 16 to change its intensity distribution by rotating it 90 degrees, thereby acquiring four images.
  • An image of the refractive index distribution can be obtained by merging, in frequency space, the difference between the images obtained via the light intensity distribution of the two illumination pupils IP in the Fx direction and the difference between the images obtained via the light intensity distribution of the two illumination pupils IP in the Fy direction.
  • the switching control unit 160 controls the LED array to switch as needed to the intensity distribution shown in FIG. 17, and four images are acquired.
  • Figure 18 is an image of the three-dimensional refractive index distribution obtained using the light intensity distributions of the four illumination pupils IP in Figure 17. Note that it is possible to generate an image of the refractive index distribution by using the light intensity distributions of at least two illumination pupils IP, rather than using all four illumination pupils IP.
  • Second Embodiment When observing a three-dimensional culture sample using a microscope, multiple scattering increases, so it is preferable to use a long wavelength. Long wavelengths are assumed to be 1300 nm or 1700 nm, but are not limited to these. However, as the wavelength increases, water absorption becomes more significant, so it is preferable to be able to measure the absorption distribution and refractive index distribution of the sample separately. This is possible by applying the microscope device 1 described above.
  • FIG. 19 is a schematic diagram of a microscope apparatus 301 according to the second embodiment.
  • the microscope apparatus 301 according to this embodiment is a laser scanning type, but may also have a transmitted illumination system configuration like the microscope apparatus 1 according to the first embodiment.
  • the microscope device 301 has a microscope section 350, a stage 2, a control section 90, and an image processing section 91.
  • the microscope section 350 has a light source unit 351, an illumination optical system 360, a detection optical system 370, and a detector 380.
  • the light source unit 351 is also called a beam steering unit.
  • the light source unit 351 has a light source 352, a first lens 353, a first galvanometer mirror 354, a second lens 355, a third lens 356, a second galvanometer mirror 357, and a fourth lens 358.
  • the light source 352 is configured using a laser light source.
  • the light source 352 emits illumination light in a predetermined wavelength band.
  • the first lens 353 collimates the illumination light emitted from the light source 352.
  • the first galvanometer mirror 354 reflects the illumination light from the first lens 353 toward the second lens 355.
  • the first galvanometer mirror 354 can change the direction of the illumination light by changing the orientation of its reflecting surface. By changing the direction of the illumination light, the first galvanometer mirror 354 changes the focusing position of the illumination light on the sample SA in the y direction.
  • the second lens 355 and the third lens 356 direct the illumination light reflected by the first galvanometer mirror 354 to the second galvanometer mirror 357. Note that if the first galvanometer mirror 354 and the second galvanometer mirror 357 are positioned conjugate to the pupil, the second lens 355 and the third lens 356 do not need to be provided.
  • the second galvanometer mirror 357 changes the direction of travel of the illumination light, thereby changing the focal position of the illumination light on the sample SA in the x direction.
  • the fourth lens 358 focuses the illumination light reflected by the second galvanometer mirror 357 at a predetermined intermediate image plane IM and makes it incident on the illumination optical system 360.
  • the position of the predetermined intermediate image plane IM is conjugate to the focal position of the objective lens 367 on the sample SA.
  • the first galvanometer mirror 354, the second galvanometer mirror 357, and the stage drive unit can change the focal position of the illumination light on the sample SA in three dimensions (x, y, and z), allowing at least a portion of the sample SA to be scanned three-dimensionally.
  • the first galvanometer mirror 354, the second galvanometer mirror 357, and the stage drive unit form a scanning unit that scans the light focused on the sample SA over at least a portion of the sample SA.
  • the illumination optical system 360 focuses and irradiates the illumination light L emitted from the light source unit 351 (light source 352) in the +z direction onto the sample SA.
  • the illumination optical system 360 has, in order from the light source unit 351 side, a mirror 361, a tube lens 362, and an objective lens unit 366.
  • the mirror 361 reflects the illumination light L emitted from the light source unit 351 (light source 352) towards the tube lens 362.
  • the tube lens 362 collimates the illumination light L reflected by the mirror 361.
  • the objective lens unit 366 has multiple illumination objective lenses 367, a lens holder 368, and a unit driver 369.
  • the illumination objective lenses 367 are arranged below and facing the stage 2.
  • the lens holder 368 holds multiple illumination objective lenses 367 with different optical characteristics.
  • the lens holder 368 is configured using, for example, a nosepiece or turret.
  • the unit driver 369 drives the lens holder 368 to select one of the multiple illumination objective lenses 367 and place it below the stage 2.
  • the unit driver 369 may also move the lens holder 368 along the z-axis. In this case, the aforementioned stage driver may be used in combination, or the stage driver may not be used.
  • the illumination objective lens 367 arranged below the stage 2, focuses the illumination light L that has passed through the tube lens 362 onto the sample SA.
  • the detection optical system 370 receives light from the sample SA in response to illumination light irradiation from the side opposite the illumination optical system 360 across the sample SA.
  • the detection optical system 370 has, in order from the sample SA side, a detection objective lens 371, an aperture stop 372, an optical element 316, a condenser lens 374, a mirror 376, and a relay lens 377.
  • the detection objective lens 371 is provided on the opposite side of the sample SA from the illumination objective lens 367. As the detection objective lens 371, any one of multiple detection objective lenses 371 with different optical properties can be selected and placed above the stage 2. Light from the sample SA in response to illumination light irradiation is incident on the detection objective lens 371.
  • the aperture stop 372 and optical element 316 are arranged in a plane conjugate with the detection pupil of the detection objective lens 371 in the detection optical system 370 (a plane perpendicular to the optical axis of the detection optical system 370 at position P2A conjugate with the detection pupil).
  • the optical element 316 is arranged adjacent to the aperture stop 372 (for example, above the aperture stop 372 as shown in Figure 19).
  • the optical element 316 is configured in the same manner as the optical element 16 according to the first embodiment.
  • the condenser lens 374 condenses light that has passed through the aperture stop 372 and the optical element 316.
  • the mirror 376 reflects the light that has passed through the condenser lens 374 towards the relay lens 377.
  • the relay lens 377 allows the light reflected by the mirror 376 to enter the detector 380.
  • Detector 380 is positioned at position P2B conjugate with the detection pupil in the detection optical system 370. Detector 380 is configured similarly to detector 60 according to the first embodiment. Detector 380 detects light from sample SA via the detection optical system 370.
  • illumination light emitted from light source 352 of light source unit 351 is incident on first lens 353.
  • the illumination light that passes through first lens 353 becomes parallel light and is reflected by first galvanometer mirror 354.
  • the illumination light reflected by first galvanometer mirror 354 passes through second lens 355 and third lens 356, and is reflected by second galvanometer mirror 357.
  • the illumination light reflected by second galvanometer mirror 357 passes through fourth lens 358 and is emitted outside light source unit 351. In this way, light source unit 351 emits illumination light.
  • Illumination light L emitted from the light source unit 351 is reflected by mirror 361 of the illumination optical system 360 and enters tube lens 362.
  • Illumination light L that passes through tube lens 362 becomes parallel light and enters illumination objective lens 367.
  • Illumination light L that passes through illumination objective lens 367 is focused and irradiated onto sample SA on stage 2.
  • the illumination optical system 360 focuses and irradiates illumination light L emitted from the light source unit 351 (light source 352) onto sample SA in the +z direction.
  • the detection light that passes through sample SA from the illumination optical system 360 is incident on the detection objective lens 371 of the detection optical system 370.
  • the detection light that passes through detection objective lens 371 passes through aperture stop 372 and optical element 316 and is incident on condenser lens 374.
  • the detection light that passes through condenser lens 374 is reflected by mirror 376 and is incident on relay lens 377.
  • the detection light that passes through relay lens 377 is incident on detector 380.
  • Detector 380 detects light (detection light) from sample SA via detection optical system 370 and outputs a detection signal of the light.
  • the detection signal of the light (detection light) output from detector 380 is sent to image processing unit 91 via control unit 90.
  • the microscope device 301 is equipped with a switching control unit 560 that controls switching to one of the plurality of optical elements 316 that provide different light intensity distributions and placing it at position P2A.
  • the switching control unit 560 may change the light intensity distribution by rotating or controlling one optical element 316.
  • the optical element 316 is arranged within the detection optical system 370 (in a plane conjugate with the detection pupil of the detection optical system 370).
  • the Köhler illumination microscope which is the microscope apparatus 1 according to the first embodiment
  • the non-confocal laser microscope according to this embodiment can obtain the same POTF when the conditions, such as NA, are the same. This is described, for example, in PCT/JP2022/025272 (paragraph 0080), and the description of PCT/JP2022/025272 is incorporated herein. This means that in a non-confocal laser microscope, the relationship between the illumination optical system and the detection optical system is reversed compared to a Köhler illumination microscope.
  • the optical element 16 was arranged in the plane of the illumination pupil of the illumination optical system 10 (or in a plane conjugate with the illumination pupil), but in the microscope apparatus 301 according to this embodiment, the optical element 316 is arranged in the plane of the detection pupil of the detection optical system 370 (or in a plane conjugate with the detection pupil).
  • the plane conjugate to the illumination pupil coincides with the plane of the detection pupil or a plane conjugate to the detection pupil.
  • the concept of a plane (position) conjugate to the illumination pupil or the vicinity of the illumination pupil includes the detection pupil or the vicinity of the detection pupil, or a plane (position) conjugate to the detection pupil or the vicinity of the detection pupil.
  • the numerical aperture of the illumination optical system 10 is equal to or greater than the numerical aperture of the detection optical system 40 (i.e., illumination ⁇ 1), but in the non-confocal laser microscope of this embodiment, the numerical aperture of the illumination optical system 360 is equal to or less than the numerical aperture of the detection optical system 370 (i.e., illumination ⁇ 1).
  • the numerical aperture of the illumination optical system 10 is 0.9 times or greater than the numerical aperture of the detection optical system 40, and in the non-confocal laser microscope of this embodiment, the numerical aperture of the illumination optical system 360 is 0.9 times or less the numerical aperture of the detection optical system 370.
  • intensity modulation elements T1(+) and T1(-) shown in Figure 20 are used as the optical element 316.
  • These intensity modulation elements T1(+) and T1(-) are configured so that the light intensity distribution in half the pupil monotonically increases (decreases) according to a linear function.
  • the switching control unit 560 controls switching between the two intensity modulation elements T1(+) and T1(-) and arranging them in a plane conjugate with the detection pupil. It is also possible to obtain the same effect as the intensity modulation element T1(-) by using only one type of intensity modulation element T1(+) and rotating it 180 degrees (flipping it) to swap the first and second regions.
  • the detector 380 detects light from the sample SA via the detection optical system 370 by changing the light intensity distribution using the switching control unit 560, and outputs multiple (here, two types) detection signals.
  • the image processing unit 91 then generates a difference image based on multiple images formed from the multiple detection signals output by the detector 380, and generates an image representing the refractive index distribution of the sample SA based on this difference image.
  • the image processing unit 91 also generates a sum image based on the multiple images, and generates an image representing the absorption distribution of the sample SA based on this sum image.
  • FIG. 21 is a schematic diagram of a microscope apparatus 401 according to the third embodiment.
  • the microscope apparatus 401 according to the third embodiment is a Köhler illumination microscope similar to that of the first embodiment, but may also be a non-confocal laser microscope similar to that of the second embodiment. Components common to those of the first embodiment are designated by the same reference numerals, and descriptions thereof will be omitted.
  • the microscope apparatus 401 includes a detector 460, which is a color camera, and an optical element 416 serving as an intensity modulation element that generates a light intensity distribution as shown in FIG. 22 within the pupil plane of the illumination pupil.
  • a bandpass filter 417 is positioned in front of the optical element 416, transmitting different wavelength ranges on the left and right sides of the illumination pupil.
  • the illumination optical system 10 to irradiate the sample SA with a first light (e.g., R light) and a second light (e.g., G light) that is different from the first light.
  • a first light e.g., R light
  • a second light e.g., G light
  • the color camera can capture images for each of R, G, and B
  • a single image capture using only the optical element 416 can simultaneously capture images corresponding to R and G, for example.
  • a sum-difference image can be generated using these images corresponding to R and G, thereby generating an image that represents the refractive index and absorption distribution of the sample SA.
  • the light intensity distribution shown in FIG. 22 includes a first region in which the intensity of the first light passing through the bandpass filter 417 and transmitting through the right half of the illumination pupil IP varies along a predetermined direction according to a monotonically increasing function (or an upwardly convex function); a second region other than the first region in which the intensity of the first light is approximately zero; a third region in which the intensity of the second light passing through the bandpass filter 417 and transmitting through the left half of the illumination pupil IP varies along a direction opposite to the first direction according to a monotonically increasing function (or an upwardly convex function); and a fourth region other than the third region in which the intensity of the second light is approximately zero.
  • the first region and the fourth region overlap, and the second region and the third region overlap, resulting in the light intensity distribution shown in FIG. 22.
  • the first region and the third region are symmetrical with respect to a direction perpendicular to the first direction
  • the second region and the fourth region are symmetrical with respect to a direction perpendicular to the first direction.
  • an LED array 516 may be used as the optical element 416, and the sample SA may be illuminated by adjusting the RGB of the LED array 516.
  • the LED array 516 also functions as the light source 5. The LED array 516 is then placed near the pupil of the illumination pupil or at a position conjugate to the pupil.
  • Figure 23 is a schematic diagram of a microscope device 501 in which an LED array 516 is used as the optical element 416 without using a light source 5.
  • the LED array 516 is adjusted so that the intensity of G light monotonically increases in the +Fx direction in the right half of the illumination pupil, and the LED array 516 is adjusted so that the intensity of R light monotonically decreases in the +Fx direction in the left half of the illumination pupil.
  • light from the LED array 516 illuminates the sample SA via the condenser lens 18, but it is also possible to illuminate the sample SA directly without using the condenser lens 18.
  • the LED array 516 is placed near the pupil of the illumination pupil or at a position conjugate to the vicinity of the pupil.
  • a diffuser plate may be placed between the LED array 516 and the condenser lens 18.
  • FIG. 24 is a schematic diagram of a microscope apparatus 601 according to the fourth embodiment.
  • the microscope apparatus 601 according to the fourth embodiment is a Köhler illumination microscope similar to that of the first embodiment, but may also be a non-confocal laser microscope similar to that of the second embodiment. Components common to those of the first embodiment are designated by the same reference numerals, and descriptions thereof will be omitted.
  • the microscope device 601 includes a detector 660, which is a polarization camera, and an optical element 416 as an intensity modulation element that generates a light intensity distribution as shown in FIG. 22 within the pupil plane of the illumination pupil.
  • a first polarizer 618 (with its transmission axis set at 45°) that transmits only 45° linearly polarized light from the unpolarized light emitted from the light source 5, and a second polarizer 619 that extracts each polarized light before it enters the illumination pupil, are positioned in front of (or behind) the optical element 416.
  • the second polarizer 619 is positioned so that the transmission axis of its left half coincides with the vibration direction of P-polarized light and the transmission axis of its right half coincides with the vibration direction of S-polarized light, corresponding to the light intensity distribution within the pupil plane of the illumination pupil generated by the optical element 416.
  • Detector 660 which is a polarization camera, can simultaneously capture two images by detecting the P-polarized light and S-polarized light that ultimately reach the image sensor of detector 660, and can then use these images to generate a sum-difference image.
  • FIG. 25 is a schematic diagram of a microscope device 701 according to the fifth embodiment. Components common to the second embodiment are given the same reference numerals and will not be described further.
  • an optical element 716 serving as an intensity modulation element is placed at the position of the detection pupil.
  • the optical element 716 is the same as the optical element 416 according to the third embodiment shown in FIG. 22.
  • the light source unit 351 further includes a ⁇ /2 plate 720 that converts the linearly polarized light emitted from the light source 352 into the desired linearly polarized light
  • the detection optical system 370 further includes a polarizer 719 that extracts each polarized light before it enters the detection pupil.
  • the polarizer 719 is the same as the second polarizer 619.
  • the linearly polarized light emitted from light source 352 is converted to the desired linearly polarized light using ⁇ /2 plate 720, and then each polarization is extracted using polarizer 719 before entering the detection pupil.
  • the light that passes through optical element 716 is then finally detected by detector 380, which is a PMT (Photomultiplier Tube).
  • detector 380 which is a PMT (Photomultiplier Tube).
  • PMT Photomultiplier Tube
  • the combination of polarizer 719 and optical element 716 causes the part that passes through optical element 716 to switch over time (P polarization passes through the left half, S polarization passes through the right half), making it possible to quickly acquire two images and generate a sum-difference image using these images.
  • the polarized light may be rotated before entering the polarizer 719 due to the plastic container or optical system.
  • an element that converts polarized light into unpolarized light such as a depolarizer, is inserted into the microscope section 350 (light source unit 351). This can be resolved by then placing a new polarizer with a 45° transmission axis immediately after the detection objective lens 371 (between the objective lens 371 and the polarizer 719).
  • the polarizer with a 45° transmission axis itself may be rotated at high speed to quickly switch the polarization components entering the polarizer 719, or an LCVR may be placed after the polarizer with a 45° transmission axis and before the polarizer 719 to rotate the polarization axis.
  • the microscope devices according to the fourth and fifth embodiments are both of a transmissive type, they may also be of a reflective type.
  • Sixth Embodiment A method will be described that enables faster imaging of light intensity distributions of multiple illumination pupils by combining a laser scanning non-confocal microscope configuration similar to that of the second embodiment with lock-in amplifier detection.
  • FIG. 26 is a schematic diagram of a microscope device 801 according to the sixth embodiment. Components common to the second embodiment are given the same reference numerals and will not be described again.
  • an optical element 816 serving as an intensity modulation element is placed at the position of the detection pupil.
  • the optical element 816 is an intensity modulation element that can modulate the intensity of light passing through it over time.
  • the optical element 816 can quickly modulate the light intensity distribution over time (e.g., a sine wave) into a half-pupil sine function for the right and left halves of the pupil.
  • Lock-in amplifier detection is then performed by the detector 380 so as to synchronize with the modulation of the light intensity distribution. This makes it possible to acquire images at high speed.
  • infertility treatment particularly in vitro fertilization (IVF)
  • insemination is performed after increasing the contrast of the egg using modulation contrast imaging.
  • polarized light observation is used to visualize the egg's spindle during sperm injection to prevent damage to the spindle.
  • FIG 27 is a schematic diagram of a microscope apparatus 901 according to the seventh embodiment.
  • the microscope apparatus 901 according to the seventh embodiment is a Köhler illumination microscope. Components common to the first embodiment are designated by the same reference numerals and will not be described further.
  • the microscope apparatus 901 according to the seventh embodiment has a polarizer 902 arranged in front of an optical element 916 as an intensity modulation element in the illumination optical system 10, and a polarizer (analyzer) 903 arranged in front of the first imaging lens 41 in the detection optical system 240.
  • the optical element 916 has a light intensity distribution of the illumination pupil that is a half-pupil sine function and is rotatable by a switching control unit (not shown).
  • the orientation of the shading in the image can be changed by rotating the optical element 916.
  • interference colors including sensitive colors
  • a lambda plate or a lambda/4 plate is inserted in the optical path before or after the analyzer 903.
  • some operators may wish to increase the contrast of the egg cell for observation.
  • this can be achieved by shifting the optical element 916 itself in a predetermined direction that intersects with the optical axis; that is, by shifting the point at which the light intensity of the optical element 916 becomes 0 in a predetermined direction within a range from a position starting from the optical axis of the illumination optical system and proceeding in the +Fx direction by 30% of the radius of the illumination pupil surface to a position starting from the optical axis and proceeding in the -Fx direction by 30% of the radius of the illumination pupil surface.

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Abstract

顕微鏡装置（１）は、検出光学系（４０）と、（１）試料ＳＡを照明する照明光学系（１０）、及び照明光学系の瞳若しくは瞳近傍の位置または瞳若しくは瞳近傍と共役な位置に設けられた光学素子（１６）、（２）照明光学系を介することなく前記試料を照明するＬＥＤアレイ（５１６）、のいずれか一方とを備える。光学素子が配置された瞳若しくは瞳近傍の面内または瞳若しくは瞳近傍と共役な面内における光の強度分布及びＬＥＤアレイにおける光の強度分布それぞれは、光の強度が単調増加関数または上に凸な関数に従って所定方向に沿って変化する第１領域ＩＰ１と、第１領域以外の領域であって光の強度が略ゼロである第２領域ＩＰ２とを含む。

Description

顕微鏡装置
　本発明は、顕微鏡装置に関する。
　近年、非染色で３次元観察可能な顕微鏡装置が求められている。このような顕微鏡装置を用いて３次元観察を行う上では、Ｓ／ＮおよびＺ方向のセクショニングの両方に優れた照明方法が必要である。
　特許文献１には、照明光学系の瞳位置に設けられ、照明瞳の全体にわたって単調増加／減少する光の透過率分布を有する光学素子を有する顕微鏡装置が記載されている。
　しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡装置では、Ｚセクショニングには優れるが、照明σ（照明ＮＡ／検出ＮＡ）～０．９近傍で使用されるため、Ｓ／Ｎに劣る。
特開２０２０－０８５９８８号公報
　本発明に係る顕微鏡装置は、検出光学系と、次の（１）、（２）のいずれか一方と、を備える顕微鏡装置であって、
　　（１）試料を照明する照明光学系、及び前記照明光学系の瞳若しくは瞳近傍の位置または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な位置に設けられた光学素子
　　（２）前記照明光学系を介することなく前記試料を照明するＬＥＤアレイ
　前記光学素子が配置された前記瞳若しくは前記瞳近傍の面内または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な面内における光の強度分布及び前記ＬＥＤアレイにおける光の強度分布それぞれは、前記光の強度が単調増加関数または上に凸な関数に従って所定方向に沿って変化する第１領域と、前記第１領域以外の領域であって前記光の強度が略ゼロである第２領域と、を含む。
図１は、第１実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 図２は、ステージの拡大図である。 図３（Ａ）は瞳面内における光の強度分布を示し、図３（Ｂ）はＰＯＴＦの分布およびビーズの３次元像のＸＺ断面を示す。 図４は、左側の照明瞳の光強度分布の再現方法の説明図である。 図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）は、それぞれ瞳全面ｓｉｎ関数、瞳半分ｓｉｎ関数、瞳半分一様分布の状態を示す図である。 図６（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）は、それぞれ図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）の場合の３次元像のＸＺ断面およびＰＯＴＦの分布を示す。 図７Ａは、ＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面を示す。 図７Ｂは、ＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面を示す。 図７Ｃは、ＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面を示す。 図８（Ａ）は、瞳端部分において光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合を示す。図８（Ｂ）は、図８（Ａ）の場合のＰＯＴＦの分布と３次元像のＸＺ断面を示す。 図９Ａは、光の強度が０になる箇所が照明瞳の瞳半径の１０％分原点から＋Ｆｘ方向にずれている場合の、照明瞳の光強度分布、ＰＯＴＦの分布及び３次元像のＸＺ断面を示す。 図９Ｂは、光の強度が０になる箇所が照明瞳の瞳半径の３０％分原点から＋Ｆｘ方向にずれている場合の照明瞳の光強度分布、ＰＯＴＦの分布及び３次元像のＸＺ断面を示す。 図１０Ａは、光の強度が０になる箇所が照明瞳の瞳半径の１０％分原点から－Ｆｘ方向にずれている場合の、照明瞳の光強度分布、ＰＯＴＦの分布及び３次元像のＸＺ断面を示す。 図１０Ｂは、光の強度が０になる箇所が照明瞳の瞳半径の３０％分原点から－Ｆｘ方向にずれている場合の照明瞳の光強度分布、ＰＯＴＦの分布及び３次元像のＸＺ断面を示す。 図１１Ａは、照明瞳の瞳面内において瞳半分の光の強度が、ｓｉｎ関数に従って変化する場合を示す。 図１１Ｂは、照明瞳の瞳面内において瞳半分の光の強度が、１次関数に従って変化する場合を示す。 図１１Ｃは、照明瞳の瞳面内において瞳半分の光の強度が、ｔａｎ関数に従って変化する場合を示す。 図１２Ａは、ｓｉｎ関数の周期が１／４以下の場合を示す。 図１２Ｂは、ｓｉｎ関数の周期が１．５／４周期の場合を示す。 図１２Ｃは、ｓｉｎ関数の周期が１／２周期の場合を示す。 図１３は、ｓｉｎ関数の周期を１／４周期より大きくした場合で、照明σ＝１．１の場合を示す。 図１４は、図３（Ａ）の照明瞳ＩＰをＦｙ＝０の軸で半分に分割したものである。 図１５Ａは、ＰＯＴＦＸＺの分布および３次元像のＸＺ断面を示す。 図１５Ｂは、ＰＯＴＦＹＺの分布および３次元像のＹＺ断面を示す。 図１６は、照明瞳の光強度が一定のラインがＦｙ軸方向に沿って湾曲している様子を示す。 図１７は、Ｆｘ方向の２つの照明瞳の光強度分布とＦｙ方向の２つの照明瞳の光強度分布を示す図である。 図１８は、図１７の４つの照明瞳の光強度分布を用いて得られた３次元屈折率分布の画像である。 図１９は、第２実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 図２０は、２種類の強度変調素子Ｔ１（＋）、Ｔ１（－）を示す図である。 図２１は、第３実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 図２２は、第３実施形態に係る光の強度分布を示す図である。 図２３は、光学素子としてＬＥＤアレイを使用した場合の顕微鏡装置の概略構成図である。 図２４は、第４実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 図２５は、第５実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 図２６は、第６実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 図２７は、第７実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。
　以下、図面を参照して本発明に係る各実施形態について説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、本発明を実施する場合の一例を示すものであって、本発明を以下に説明する具体的構成に限定するものではない。本発明の実施にあたっては、各実施形態に応じた具体的構成が適宜採用されてよい。便宜上、実質的に同一の要素には同一の符号を付し、その説明を省略する場合がある。以下の説明で用いる図は、特徴を分かり易くするために、便宜上、構成部品を拡大して示している場合があり、各構成部品の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
　＜第１実施形態＞
　まず、図１を用いて、第１実施形態に係る顕微鏡装置１について説明する。図１に示される顕微鏡装置１は倒立顕微鏡であるが、正立顕微鏡であってもよい。第１実施形態に係る顕微鏡装置１は、ステージ２と、透過照明用光源５と、落射照明用光源６と、透過照明光学系１０と、落射照明光学系２０と、検出光学系４０と、検出器（検出部）６０と、第２の検出器（第２の検出部）２６１と、制御部６５と、画像処理部６６と、操作入力部６７と、画像表示部７０とを備える。ここで、透過照明光学系１０の光軸をＡｘ１、検出光学系４０の光軸をＡｘ２と表す。なお、透過照明光学系１０の光軸Ａｘ１と検出光学系４０の光軸Ａｘ２は、基本的に、顕微鏡装置１の光軸と共通の光軸（つまり、同軸）であるが、説明の便宜上、透過照明光学系１０の光軸Ａｘ１と検出光学系４０の光軸Ａｘ２に分けて表す。
　ステージ２は、透明の平行平板を用いて形成される。ステージ２は、試料ＳＡを支持する。試料ＳＡは、例えば細胞等の位相物体である。ステージ２には、ステージ駆動部３が設けられる。ステージ駆動部３は、ステージ２を透過照明光学系１０の光軸Ａｘ１に沿って移動させる。
　図２に示すように、透過照明光学系１０の光軸方向に延びる座標軸をｚ軸とする。ステージ駆動部３によりステージ２をｚ方向に移動させることで、所定の位置Ｚ０、位置Ｚ０から＋Δｚだけ離れた位置Ｚ０＋Δｚ、位置Ｚ０から－Δｚだけ離れた位置Ｚ０－Δｚ、位置Ｚ０から＋２Δｚだけ離れた位置Ｚ０＋２Δｚ、位置Ｚ０から－２Δｚだけ離れた位置Ｚ０－２Δｚ…における試料ＳＡの断面の画像データを取得することが可能である。
　透過照明用光源５は、所定の波長帯域の照明光を発生させる。透過照明光学系１０は、透過照明用光源５側から順に、コレクタレンズ１２と、視野絞り１４と、リレーレンズ１５と、光学素子１６と、開口絞り１７と、コンデンサレンズ１８とを有する。透過照明用光源５は、例えばハロゲンランプ等を用いて構成される。透過照明用光源５としてハロゲンランプが用いられる場合、照明光の波長帯域を狭くする素子が設けられることが好ましい。照明光の波長帯域を狭くすることで、ＰＯＴＦ等の計算値の精度を高くすることができる。例えば、透過照明光学系１０におけるコレクタレンズ１２とリレーレンズ１５との間の光路に、所定の分光透過率特性を有するバンドパスフィルタ１３を挿入することで、照明光の波長帯域を狭くすることが可能である。バンドパスフィルタ１３の分光透過率特性は、明視野観察や蛍光観察などの観察の用途に応じた照明光の波長帯域に基づいて設定される。
　なお、透過照明光学系１０における視野絞り１４とリレーレンズ１５との間の光路に、バンドパスフィルタ１３を挿入してもよい。上記のようなバンドパスフィルタ１３に限らず、透過照明光学系１０の光路に、バンドパスフィルタを備えたフィルターキューブ（図示せず）を挿入してもよい。
　光学素子１６および開口絞り１７は、透過照明光学系１０におけるリレーレンズ１５とコンデンサレンズ１８との間の瞳（以降、照明瞳と称する場合がある。）の位置Ｐ０において透過照明光学系１０の光軸Ａｘ１と垂直な面に配置される。光学素子１６は、開口絞り１７に隣接して（一例として、図１のように開口絞り１７の上側に）配置される。照明瞳の位置Ｐ０における透過照明光学系１０の光軸Ａｘ１と垂直な面を、照明瞳の面と称する。
　光学素子１６は、一例として、光の透過性を有する平板であって、この平板の面内で光の透過率が変化する平板である。この平板は、例えば、ガラス基板等の平行平板に、光の透過率を低減させることが可能な（遮光性のある）膜を蒸着させることにより形成される。一例として、金属膜を蒸着させる。例えば、膜が蒸着される平行平板の部位に応じて膜厚を変化させることにより、平行平板の部位に応じて光の透過率を変化させることができる（膜厚が厚いほど、透過率は低くなる）。この場合、光学素子１６は、強度変調素子であると言える。光学素子１６は、光の透過率を変化させることが可能な液晶素子でもよい。
　この光学素子１６を照明瞳の面に配置することによって、照明瞳の面内で光の透過率を変化させることができ、照明瞳の面内で光の強度を変化させることができる。したがって、光学素子１６の光の透過率が照明瞳の面内で変化すると言える。光学素子１６による光の強度は、照明瞳の面内で連続的（もしくは離散的）に変化する。なお、光学素子１６の部位に応じて光の強度が変化することにより、光学素子１６による光の強度分布（言い換えれば、照明瞳の面における光の強度分布）が決まる。光学素子１６によって生じる光の強度分布（変化量）は１６階調（強度の最小と最大の間で１６分割）以上あることが好ましい。
　光学素子１６として、異なる光の強度分布を与える複数の光学素子１６のうちいずれかを選択して照明瞳の位置Ｐ０に配置することが可能である。この場合、顕微鏡装置１は、異なる光の強度分布を与える複数の光学素子１６のうちいずれかに切り替えて照明瞳の面内（または照明瞳と共役な面内）に配置する制御を行う切替制御部１６０を備える。切替制御部１６０は、１つの光学素子１６を回転または制御することで、光の強度分布を変化させてもよい。光学素子１６の光の強度の詳細については、後述する。なお、光学素子１６が配置される位置は、照明瞳の位置Ｐ０に限られない。例えば、光学素子１６は、照明瞳と共役な位置において光軸Ａｘ１と垂直な面（言い換えれば、照明瞳と共役な面）に配置されてもよい。また、後述するが、光学素子１６としてＬＥＤアレイを用いて試料ＳＡをダイレクトに（コンデンサレンズを介さず）照明する場合には、ＬＥＤアレイは照明瞳の瞳近傍または該瞳近傍と共役な位置に配置される。
　ＬＥＤアレイの位置が、照明瞳の瞳近傍または該瞳近傍と共役な位置に配置される場合について、次に定義されるフレネル数Ｎを用いて説明する。
ただし、λは光源の波長、ｓはコヒーレント光源の大きさ（インコヒーレント面光源内のコヒーレントと見做せる２点間の最大距離）、ｚは光源から試料までの距離である。
　ＬＥＤアレイの場合、λはＬＥＤアレイの波長、sはＬＥＤアレイの各ＬＥＤの発光面内のコヒーレントと見做せる２点間の最大距離（最大距離を超える２点間はインコヒーレントとなる）、ｚはＬＥＤアレイから試料（ステージ）までの距離である。各ＬＥＤの発光面内の波長程度離れた２点はコヒーレントなので、s≒λと仮定すると、Ｎ≒λ/ｚとなる。
　Ｎ＜＜１のとき、フラウンフォーファー領域となり、ＬＥＤアレイは、該瞳近傍と見做してよい。ここで、例えばＬＥＤアレイの波長λ＝５６０ｎｍ、距離ｚ＝２８ｍｍとすると、Ｎ＝０．００００２なので、瞳近傍に配置されているといえる。
　また、コンデンサレンズを介さない場合のＬＥＤアレイによる照明ＮＡをＮＡillとすると、試料ＳＡまたはステージ２からの距離ｚ、ＬＥＤアレイの半径Ｒを用いて以下の式（１）で表せる。
　または以下の式（２）のようにしても良い。
ここで、例えば半径Ｒ＝３７．５ｍｍ、距離ｚ＝２８ｍｍとすると、照明ＮＡ≒０．８となる。従来のコンデンサレンズを用いた照明系では距離ｚ＝２８ｍｍかつ照明ＮＡ＝０．８を満たすことが難しい。理由はコンデンサレンズの径が大きくなってしまい製造的な難易度やコストが高くなるためである。ＬＥＤアレイからダイレクトで照明するメリットは距離ｚと照明ＮＡのトレードオフを解決できる点にある。
　コンデンサレンズ１８は、ステージ２の上方に対向して配置される。コンデンサレンズ１８として、光学特性が異なる複数のコンデンサレンズ１８のうちいずれかを選択してステージ２の上方に配置することが可能である。
　落射照明用光源６は、所定の波長帯域の励起光を発生させる。落射照明光学系２０は、試料ＳＡ側から順に、対物レンズユニット２１と、フィルターキューブ２３１とを有する。対物レンズユニット２１は、複数の対物レンズ２２と、レンズ保持部２５と、ユニット駆動部２６とを有する。対物レンズ２２は、ステージ２の下方に対向して配置される。レンズ保持部２５は、焦点距離が異なる複数の対物レンズ２２を保持する。レンズ保持部２５は、例えば、レボルバやターレット等を用いて構成される。ユニット駆動部２６は、レンズ保持部２５を駆動し、複数の対物レンズ２２のうちいずれかを選択してステージ２の下方に配置することが可能である。なお、ユニット駆動部２６は、レンズ保持部２５をｚ軸に沿って移動させてもよい。この場合、ステージ駆動部３を併用してもよいし、ステージ駆動部３を使わなくてもよい。
　フィルターキューブ２３１は、落射照明光学系２０を含む検出光学系４０の光路に常時挿入される。フィルターキューブ２３１は、落射照明用光源６から出射した励起光をステージ２に向けて反射させる。フィルターキューブ２３１は、落射照明用光源６からの励起光の照射によってステージ２上の試料ＳＡで発生した蛍光を検出光学系４０の第１結像レンズ４１に向けて透過させる。フィルターキューブ２３１は、透過照明光学系１０からの照明光の照射によって試料ＳＡを透過もしくは回折した光（検出光）を透過させる。フィルターキューブ２３１は、落射照明用光源６からの励起光を透過させる励起フィルター２３２を有する。フィルターキューブ２３１は、試料ＳＡやステージ２等で反射した励起光を吸収する吸収フィルター２３３を有する。吸収フィルター２３３は、試料ＳＡからの蛍光および検出光を透過させる。
　検出光学系４０は、対物レンズユニット２１と、フィルターキューブ２３１とを含む。検出光学系４０は、落射照明光学系２０側から順に、第１結像レンズ４１と、ダイクロイックフィルター２４２と、第１ミラー４３と、レンズ４４と、第２ミラー４５と、コリメータレンズ４６と、ハーフミラー４７とを有する。さらに、検出光学系４０は、第３結像レンズ５０を有する。また、ハーフミラー４７を透過する光の光路上に、第２結像レンズ４８と、第３ミラー４９と、接眼レンズ５５とが配置される。
　ハーフミラー４７の透過率と反射率の比率は、例えば１：１に設定される。ハーフミラー４７に入射した光の一部は、当該ハーフミラー４７で反射して第３結像レンズ５０に入射する。第３結像レンズ５０を透過した光は、所定の第１像面ＩＡで結像する。ここで、所定の第１像面ＩＡの位置は、対物レンズ２２の焦点位置と共役な位置である。検出光学系４０の第１像面ＩＡに、検出器６０が配置される。ハーフミラー４７に入射した光の他の一部は、当該ハーフミラー４７を透過して第２結像レンズ４８に入射する。第２結像レンズ４８を透過した光は、第３ミラー４９で反射して所定の第２像面ＩＢで結像する。ここで、所定の第２像面ＩＢの位置は、対物レンズ２２の焦点位置と共役な位置である。観察者は、接眼レンズ５５を用いて第２像面ＩＢに結像された試料ＳＡの像を観察することが可能である。なお、検出器６０には、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子が用いられる。
　ダイクロイックフィルター２４２は、光の波長の違いにより光を分離する。具体的には、ダイクロイックフィルター２４２に入射した光の一部として、（落射照明光学系２０からの励起光の照射によって）試料ＳＡから出射した蛍光は、当該ダイクロイックフィルター２４２で反射して所定の第３像面ＩＣで結像する。ここで、所定の第３像面ＩＣの位置は、対物レンズ２２の焦点位置と共役な位置である。検出光学系４０の第３像面ＩＣに、第２の検出器２６１が配置される。ダイクロイックフィルター２４２に入射した光の他の一部として、（透過照明光学系１０からの照明光の照射によって）試料ＳＡを透過もしくは回折した光（検出光）は、当該ダイクロイックフィルター２４２を透過して第１ミラー４３で反射する。第１ミラー４３で反射した検出光は、検出器６０が配置される所定の第１像面ＩＡで結像する。なお、第２の検出器２６１には、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子が用いられる。
　なお、ダイクロイックフィルター２４２に限らず、ハーフミラーを用いてもよい。この場合、当該ハーフミラーと共にバリアフィルタを用いる。具体的には、当該ハーフミラーを反射した光の一部の光（試料ＳＡからの検出光）を吸収する第１のバリアフィルタを設け、当該ハーフミラーを透過した光の一部の光（試料ＳＡからの蛍光）を吸収する第２のバリアフィルタを設ける。この構成により、当該ハーフミラーを反射した、試料ＳＡからの蛍光による像を第２の検出器２６１で撮像することができ、当該ハーフミラーを透過した、試料ＳＡからの検出光による像を検出器６０で撮像することができる。
　本実施形態において、透過照明用光源５から出射した照明光は、（透過照明用光源５としてハロゲンランプが用いられる場合にはバンドパスフィルタ１３を通って）コレクタレンズ１２に入射する。コレクタレンズ１２を透過した照明光は、平行光となって視野絞り１４を通り、リレーレンズ１５に入射する。リレーレンズ１５を透過した照明光は、光学素子１６と開口絞り１７とを通ってコンデンサレンズ１８に入射する。コンデンサレンズ１８を透過した照明光は、平行光となってステージ２上の試料ＳＡに入射する。これにより、透過照明光学系１０は、透過照明用光源５からの照明光によって、ステージ２上の試料ＳＡを照明する。試料ＳＡを透過もしくは回折した光（以降、検出光と称する場合がある）は、検出光学系４０としての対物レンズ２２に入射する。対物レンズ２２を透過した検出光は、フィルターキューブ２３１に入射する。フィルターキューブ２３１に入射した検出光は、当該フィルターキューブ２３１を透過し、吸収フィルター２３３を通って第１結像レンズ４１に入射する。第１結像レンズ４１を透過した検出光は、ダイクロイックフィルター２４２に入射する。ダイクロイックフィルター２４２に入射した検出光は、当該ダイクロイックフィルター２４２を透過して第１ミラー４３で反射して所定の中間像面ＩＭで結像し、レンズ４４に入射する。レンズ４４を透過した検出光は、第２ミラー４５で反射してコリメータレンズ４６に入射する。コリメータレンズ４６を透過した検出光は、平行光となって、ハーフミラー４７に入射する。ハーフミラー４７に入射した検出光の一部は、当該ハーフミラー４７で反射して第３結像レンズ５０に入射する。第３結像レンズ５０を透過した検出光は、検出器６０が配置される所定の第１像面ＩＡで結像する。ハーフミラー４７に入射した検出光の他の一部は、当該ハーフミラー４７を透過して第２結像レンズ４８に入射する。第２結像レンズ４８を透過した検出光は、第３ミラー４９で反射して所定の第２像面ＩＢで結像する。
　検出器６０は、検出光学系４０を介して試料ＳＡからの検出光を検出し、当該検出光の検出信号を出力する。なお、検出器６０は、検出光学系４０を介して試料ＳＡの像を撮像すると言い換えることができる。ここで、検出信号とは、光（検出光）の強度に応じて検出器６０で検出された信号強度を示す信号である。具体的には、検出器６０がＣＣＤの場合、ＣＣＤの各画素における信号である。なお、検出信号は、試料ＳＡの像の強度に応じて検出器６０で検出された信号強度を示す信号と言い換えることができる。
　落射照明用光源６から出射した励起光は、落射照明光学系２０の励起フィルター２３２を通ってフィルターキューブ２３１に入射する。フィルターキューブ２３１に入射した励起光は、当該フィルターキューブ２３１で反射して対物レンズ２２に入射する。対物レンズ２２を透過した励起光は、ステージ２上の試料ＳＡに入射する。これにより、落射照明光学系２０は、落射照明用光源６からの励起光によって、ステージ２上の試料ＳＡを照明する。励起光の照射によって、試料ＳＡに含まれる蛍光物質が励起されて蛍光が出射する。試料ＳＡからの蛍光は、検出光学系４０としての対物レンズ２２に入射する。対物レンズ２２を透過した蛍光は、フィルターキューブ２３１に入射する。フィルターキューブ２３１に入射した蛍光は、当該フィルターキューブ２３１を透過し、吸収フィルター２３３を通って第１結像レンズ４１に入射する。第１結像レンズ４１を透過した蛍光は、ダイクロイックフィルター２４２に入射する。ダイクロイックフィルター２４２に入射した蛍光は、当該ダイクロイックフィルター２４２で反射して、第２の検出器２６１が配置される所定の第３像面ＩＣで結像する。
　第２の検出器２６１は、検出光学系４０を介して試料ＳＡからの蛍光を検出し、当該蛍光の検出信号を出力する。
　検出器６０から出力された光（検出光）の検出信号及び第２の検出器２６１から出力された蛍光の検出信号は、制御部６５を介して画像処理部６６に送信される。
　制御部６５は、顕微鏡装置１の全体的な制御を行う。制御部６５は、ステージ駆動部３、ユニット駆動部２６、検出器６０、画像処理部６６、操作入力部６７、画像表示部７０、切替制御部１６０等と電気的に接続される。
　画像処理部６６は、透過照明光学系１０を用いて試料ＳＡを照明し、検出光学系４０を介して試料ＳＡからの光を検出すること（言い換えれば、明視野観察）によって検出器６０から出力された光（検出光）の検出信号に基づいて、試料ＳＡに関する屈折率のデータを生成する。ここで、試料ＳＡに関する屈折率のデータとは、試料ＳＡの屈折率を表すデータであり、例えば、試料ＳＡにおける各位置での屈折率のデータ、すなわち試料ＳＡにおける屈折率分布を示すデータである。また、試料ＳＡに関する屈折率のデータは、例えばルックアップテーブルとして記憶部（図示せず）に記憶される。また、画像処理部６６は、試料ＳＡにおける屈折率分布の各位置での屈折率の値に応じて各画素の輝度値を設定した画像データ（以降、試料ＳＡの屈折率分布の画像データと称する場合がある）を生成する。また、画像処理部６６は、検出器６０から出力された検出光の検出信号に基づいて、試料ＳＡにおける各位置（検出器６０の各画素）での検出信号の信号強度の値に応じて各画素の輝度値を設定した画像データ（以降、明視野観察による試料ＳＡの画像データと称する場合がある）を生成する。なお、画像処理部６６は、第２の検出器２６１から出力された蛍光の検出信号に基づいて、試料ＳＡにおける各位置（第２の検出器２６１の各画素）での検出信号の信号強度の値に応じて各画素の輝度値を設定した画像データ（以降、蛍光観察による試料ＳＡの画像データと称する場合がある）を生成する。
　画像表示部７０は、画像処理部６６で生成された試料ＳＡの屈折率分布の画像データに基づいて、試料ＳＡにおける屈折率分布の画像を表示する。また、画像表示部７０は、画像処理部６６で生成された明視野観察による試料ＳＡの画像データに基づいて、明視野観察による試料ＳＡの画像を表示する。なお、画像表示部７０は、画像処理部６６で生成された蛍光観察による試料ＳＡの画像データに基づいて、蛍光観察による試料ＳＡの画像を表示する。
　本実施形態では、検出器６０が検出光学系４０を介して試料ＳＡからの検出光を検出し、第２の検出器２６１が検出光学系４０を介して試料ＳＡからの蛍光を検出する。そのため、同時刻における、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布の画像と、蛍光観察による試料ＳＡの画像とを生成することができ、ユーザーによる両画像の比較観察が可能となる。
　次に、画像処理部６６により、試料ＳＡに関する屈折率のデータとして試料ＳＡにおける２次元または３次元の屈折率分布を求める方法について説明する。３次元の屈折率分布を求める方法は、一例としてＰＣＴ／ＪＰ２０２２／０２５２７２（段落００４７～００７２、段落００９３）に記載されており、ＰＣＴ／ＪＰ２０２２／０２５２７２の記載を本明細書に組み込む。
　また、ＰＣＴ／ＪＰ２０２２／０２５２７２に記載の式（１０）と式（１１）とを用いて、３次元の屈折率分布を求める場合、屈折率の補正が必要となる。この屈折率の補正についても、ＰＣＴ／ＪＰ２０２２／０２５２７２（段落００７５）に記載されており、ＰＣＴ／ＪＰ２０２２／０２５２７２の記載を本明細書に組み込む。ただし、ｍｉｓｓｉｎｇ　ｃｏｎｅについては、昨今ＡＩ（Artificial Intelligence）を用いた推定も行われている。例えば、Xi Chen et al. Nature photonics 17,250-258(2023)に記載されているように、Ｚセクショニングのある蛍光コンフォーカル画像と屈折率画像を学習させることでｍｉｓｓｉｎｇ　ｃｏｎｅが埋まった３次元疑似蛍光画像を作成することが可能である。ＡＩを用いるメリットは推定時間の削減にある。
　特許文献１に記載の顕微鏡装置では、照明光学系の瞳位置に、照明瞳の全体にわたって単調増加／減少する光の透過率分布を有する光学素子が設けられている。これにより、特許文献１に記載の顕微鏡装置は、Ｚ方向のセクショニングに優れる。しかし、照明σ（照明ＮＡ／検出ＮＡ）～０．９近傍で使用されるため、ＤＣ成分（背景成分）の寄与が大きく、得られる画像のＳ／Ｎに劣る。
　本実施形態に係る顕微鏡装置１では、透過照明光学系１０における照明瞳の位置Ｐ０に、光の強度分布が照明瞳の面内で例えば図４に示すように変化する光学素子１６が設けられる。これにより、本実施形態によれば、Ｓ／ＮおよびＺ方向のセクショニングの両方に優れた画像を取得することが可能な顕微鏡装置１を提供することができる。以下詳細に説明する。
　Ｚセクショニングに優れることで有名なＤＩＣ（Differential Interference Contrast microscopy）の結像式は、以下の式（３）に示されるように、明視野のＯＴＦ（Optical Transfer Function）とｓｉｎ関数との積で表される。
　ここで（ξ,η,ζ）はＸＹＺ瞳座標であり、Δはシア量であり、θはバイアス角（ポラライザの調整角度）であり、ｋは波数である。バイアス角θはＤＩＣの結像において吸収成分と屈折率成分のバランスを取るためにあるので、バイアス角θを無視すると、式（３）は式（４）のように近似することができる。
　これを瞳のアポダイゼーションで実現する場合は、照明σ≧１とした上で、照明瞳の瞳面内での光の強度分布をｓｉｎ関数とするしかない（図３（Ａ）参照）。さらに、ＤＩＣではシア量Δを小さくすることで分解能を高くすることができる。このため、式（４）においてシア量Δを小さくし、ｓｉｎ関数が１／２周期以下となるように決めると、図３（Ｂ）に示すようなＰＯＴＦ（Phase Optical Transfer Function）の分布と像が得られる。なお、試料ＳＡとして球体に近いビーズを使用している。ここで、ＰＯＴＦとは、有効点像分布（Effective Point Spread Function）の虚部を３次元フーリエ変換したものである。なお、Ｆｘ＝ξ／λである。
　図３（Ａ）の左側は照明瞳ＩＰの瞳面内における光の強度分布を示し、図３（Ａ）の右側は検出瞳ＤＰの瞳面内における光の強度分布を示す。図３（Ａ）に示されるように、照明瞳ＩＰの瞳面内において、光の強度が＋Ｆｘ方向においてｓｉｎ関数に従って単調に増加（－Ｆｘ方向においてｓｉｎ関数に従って単調に減少）しており、光の強度の等しい部分がＦｙ方向へ延びる直線状に分布している。一方、検出瞳ＤＰの瞳面内においては光の強度は１である（光の透過率は１００％である）。なお、図３において、照明σ＝１に設定している。図３（Ｂ）は、図３（Ａ）の場合におけるＰＯＴＦの分布（図３（Ｂ）の左側）およびビーズの３次元像のＸＺ断面（図３（Ｂ）の右側）を示す。
　このように、照明瞳ＩＰの瞳面内において図３（Ａ）のような光強度分布を用いることができれば、Ｚセクショニング能が高く、Ｓ／Ｎが高い画像を取得することができる。
　しかし実際には、照明瞳ＩＰはＬＥＤ（Light-Emitting Diode）光源等による光の強度分布を持つため、照明瞳単体で負の値を取ることができない。そこで、図３（Ａ）のような照明瞳ＩＰの光強度分布を実現するためには、例えば、図４に示されるように、光の強度が０になるＦｘ＝０の軸で照明瞳ＩＰを２分割し、分割した２つの照明瞳ＩＰの光強度分布の差分を取る必要がある。図４は、右側の２つの照明瞳ＩＰの光強度分布の差分を取ることで、図４における左側の照明瞳ＩＰの光強度分布が再現できることを示している。
　次に、照明瞳ＩＰを半分にした状態では、どのようなＳ／ＮとＺセクショニングが得られるのか詳しく見てみる。
　図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）は、それぞれ、照明瞳ＩＰの瞳全面で光の強度が＋Ｆｘ方向においてｓｉｎ関数に従って単調に増加して分布する場合（以下、「瞳全面ｓｉｎ関数」という場合がある。）、照明瞳ＩＰの瞳面の半分で光の強度が＋Ｆｘ方向においてｓｉｎ関数に従って単調に増加して分布する場合（以下、「瞳半分ｓｉｎ関数」という場合がある。）、照明瞳ＩＰの瞳面の半分で光の強度が一様に分布する場合を示す。なお、図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）において、照明σ＝１（照明ＮＡ＝０．８）に設定している。
　図６（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）は、それぞれ、図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）の場合の３次元像のＸＺ断面およびＰＯＴＦの分布を示す。図６（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）から分かるように、最も優れたＺセクショニングを示しているのは、図６（Ａ）の場合の照明瞳ＩＰの瞳全面で光の強度が＋Ｆｘ方向においてｓｉｎ関数に従って単調に増加して分布する場合である。
　次に、図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）の照明瞳ＩＰと、図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）の照明瞳ＩＰを反転（Ｆｘ＝０の軸で１８０度回転）して得られる照明瞳ＩＰとの差分を取った場合を考える。図７Ａは、図５（Ａ）の場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ａの上段）、図５（Ａ）の照明瞳ＩＰを反転して得られる照明瞳ＩＰの場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ａの中段）、図５（Ａ）の照明瞳ＩＰと図５（Ａ）の照明瞳ＩＰを反転して得られる照明瞳ＩＰとの差分をとった場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ａの下段）を示す。図７Ｂは、図５（Ｂ）の場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ｂの上段）、図５（Ｂ）の照明瞳ＩＰを反転して得られる照明瞳ＩＰの場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ｂの中段）、図５（Ｂ）の照明瞳ＩＰと図５（Ｂ）の照明瞳ＩＰを反転して得られる照明瞳ＩＰとの差分をとった場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ｂの下段）を示す。図７Ｃは、図５（Ｃ）の場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ｃの上段）、図５（Ｃ）の照明瞳ＩＰを反転して得られる照明瞳ＩＰの場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ｃの中段）、図５（Ｃ）の照明瞳ＩＰと図５（Ｃ）の照明瞳ＩＰを反転して得られる照明瞳ＩＰとの差分をとった場合のＰＯＴＦの分布および３次元像のＸＺ断面（図７Ｃの下段）を示す。
　図７Ａの下段の図と図７Ｂの下段の図との比較から分かるように、差分後のＰＯＴＦの分布は、照明瞳ＩＰの瞳全面で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合（図５（Ａ）の場合）と照明瞳ＩＰの瞳面の半分で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合（図５（Ｂ）の場合）とで、完全に一致している。このことは、実空間での３次元像のＸＺ断面を見ても明らかである。
　一方、図７Ａの下段の図と図７Ｂの下段の図とで、コントラスト値を比較すると、照明瞳ＩＰの瞳面の半分で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合（図５（Ｂ）の場合）は、照明瞳ＩＰの瞳全面で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合（図５（Ａ）の場合）に対して２倍近くコントラスト値が大きいことが分かる。これは、照明瞳ＩＰの瞳全面で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合（図５（Ａ）の場合）よりも照明瞳ＩＰの瞳面の半分で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合（図５（Ｂ）の場合）の方がＳ／Ｎが優れていることを意味する。
　瞳半分という意味では、図７Ｂの場合と図７Ｃの場合は同じであるが、図７Ｂの場合では、瞳半分がｓｉｎ関数に従う光強度分布を有しているため、図７Ｃの場合と比べてコントラストが優れている。
　以上から、差分を取ることを前提とすれば、照明瞳ＩＰの瞳面の半分で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合（図５（Ｂ）の場合）において、Ｓ／ＮおよびＺセクショニングの両方が優れていることが分かる。
　なお、図５の例では、Ｆｘ＝０（原点）で光の強度が０になる照明瞳ＩＰを考えたが、原点以外で光の強度が０になるとどのような結果が得られるのか見てみる。
　図８（Ａ）は、照明瞳ＩＰの瞳端部分において光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合を示している。このように、Ｆｘ＝０の原点以外でも光の強度が０となっている。図８（Ｂ）は、図８（Ａ）の場合のＰＯＴＦの分布と３次元像のＸＺ断面を示している。なお、図８において、照明σ＝１（照明ＮＡ＝０．８）に設定している。図８（Ｂ）から明らかなように、この場合ＰＯＴＦの内部が埋まらず（低周波の構造が抜けている）、像劣化が生じている。ところで、図５（Ａ）の照明瞳ＩＰの瞳全面で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合のように照明瞳ＩＰが原点において光の強度を有すると、上述した通り、Ｓ／Ｎの観点で劣ってしまう。
　したがって、差分を取ることを前提とするならば、照明瞳ＩＰは、原点のみで光の強度が０となるような関数に従う光強度分布を有することが望ましい。
　なお、原点のみで光の強度が０になることに関して、光の強度が０になる箇所がある程度は原点からずれていてもよい。では、光の強度が０になる箇所がどの程度原点からずれていてもよいのかについて詳しく説明する。
　まず、光の強度が０になる箇所が＋Ｆｘ方向にずれている場合について考える。図９Ａは、光の強度が０になる箇所が照明瞳ＩＰの瞳半径の１０％分原点から＋Ｆｘ方向にずれている場合の、照明瞳ＩＰの光強度分布、ＰＯＴＦの分布及び３次元像のＸＺ断面を示している。図９Ｂは、光の強度が０になる箇所が照明瞳ＩＰの瞳半径の３０％分原点から＋Ｆｘ方向にずれている場合の照明瞳ＩＰの光強度分布、ＰＯＴＦの分布及び３次元像のＸＺ断面を示している。
　図９Ａおよび図９Ｂから分かるように、光の強度が０になる箇所が照明瞳ＩＰの瞳半径の３０％より大きく＋Ｆｘ方向にずれると、低周波の抜けが目立ち、像質が悪化する。また、高周波成分の寄与が高くなりエッジでのぎらつきが強くなる。
　次に、光の強度が０になる箇所が－Ｆｘ方向にずれている場合について考える。図１０Ａは、光の強度が０になる箇所が照明瞳ＩＰの瞳半径の１０％分原点から－Ｆｘ方向にずれている場合の、照明瞳ＩＰの光強度分布、ＰＯＴＦの分布及び３次元像のＸＺ断面を示している。図１０Ｂは、光の強度が０になる箇所が照明瞳ＩＰの瞳半径の３０％分原点から－Ｆｘ方向にずれている場合の照明瞳ＩＰの光強度分布、ＰＯＴＦの分布及び３次元像のＸＺ断面を示している。
　図１０Ａおよび図１０Ｂから分かるように、光の強度が０になる箇所が照明瞳ＩＰの瞳半径の３０％より大きく－Ｆｘ方向にずれると、ＰＯＴＦの分布は一様になりＺセクショニングは良くなるが、Ｓ／Ｎは悪化してしまう。Ｓ／Ｎの改善度が、照明瞳ＩＰの瞳全面で光の強度がｓｉｎ関数に従って分布する場合に対して１．５倍を切ってしまう。
　以上のことから、光の強度が０になる箇所は、照明瞳半径換算で原点から＋３０％以上－３０％以下の範囲であることが望ましい。なお、図９Ａ～図１０Ｂにおいて、照明σ＝１（照明ＮＡ＝０．８）に設定している。また、照明σ＞１の場合は、照明瞳ＩＰの瞳半径を有効照明瞳半径と読み替えればよい。
　なお今までは、照明瞳ＩＰの瞳面内での光の強度がｓｉｎ関数に従って変化する場合について議論してきた。しかしながら、照明瞳ＩＰの瞳面内での光の強度は、ｓｉｎ関数（正弦関数）に限らず、ｓｉｎ関数に似た挙動を示す関数に従って変化してもよい。ｓｉｎ関数に似た挙動を示す関数として、例えば、１次関数、ｃｏｓ関数（余弦関数）、ｔａｎ関数（正接関数）、指数関数、高次関数等の単調増加／単調減少関数がある。
　しかしながら、ＰＯＴＦの内部の埋まり方という観点では、これら単調増加関数がすべて同じ挙動を示すわけではない。図１１Ａ～図１１Ｃに、照明瞳ＩＰの瞳面内において瞳半分の光の強度が、ｓｉｎ関数（上に凸な関数の一例）（図１１Ａ）、１次関数（図１１Ｂ）、ｔａｎ関数（図１１Ｃ）に従って変化する場合について示す。なお、図１１Ａ～図１１Ｃにおいて、（ｃ）は差分後のＰＯＴＦの分布であり、（ｄ）は（ｃ）のグラフのＦｚ＝０の軸（図中の実矢印）上でのＰＯＴＦの値を示す図である。（ｅ）は差分後の３次元像である。図１１Ａ～図１１Ｃにおいて像の輝度値はすべて揃えて表示している。なお、図１１Ａ～図１１Ｃにおいて、照明σ＝１（照明ＮＡ＝０．８）に設定している。
　図１１Ａ～図１１Ｃから分かるように、１次関数（図１１Ｂ）よりも下に凸な関数の方が、差分後のＰＯＴＦの一様性の観点で優れている。一方で、Ｚセクショニングの観点では、３次元像内に発生するハロの影響も考慮しなくてはならない。このハロは、図１１Ｃ（ｅ）の３次元像のＸＺ断面から分かるように、照明瞳ＩＰの瞳面内において瞳半分の光強度がｔａｎ関数（図１１Ｃ）に従って変化する場合に最も大きく発生している。このハロが生じると、デフォーカス時に他のＺ面への影響度合いを無視できなくなる。このため、Ｚセクショニングが悪くなってしまう。なお、似たような現象は、輪帯照明をした際にも生じることが分かっている。
　差分後のＰＯＴＦの一様性を重視して、図１１Ｃのような照明瞳分布にしてしまうと、ＸＹ平面で見た際の像の陰影度合いも大きくなってしまう。ＸＹ平面での陰影度合いが大きいと、試料としての細胞の輪郭が不明瞭になってしまう。このため、画像解析の観点でも好ましくない。以上より、照明瞳ＩＰの瞳面内における瞳半分の光の強度は、１次関数もしくは、少なくとも１次関数より上に凸な単調増加関数に従って変化することが望ましい。このような上に凸な関数は、例えば、正弦関数、余弦関数、その他の周期関数のうちいずれかである。また、このような上に凸な関数は、例えば、対数関数、誤差関数、その他の高次関数のうちいずれかである。
　次に、照明瞳ＩＰが半分のままで、照明瞳ＩＰの瞳面内で光の強度が従う関数が瞳半分の内部で単調増加「ではない」場合を考える。例としてｓｉｎ関数を考え、その周期が１／４周期以下の場合と、それ以上の場合とで差分後のＰＯＴＦの分布および３次元像の違いを比較する。図１２Ａ～図１２Ｃは、それぞれｓｉｎ関数の周期が１／４以下の場合、ｓｉｎ関数の周期が１．５／４周期の場合、ｓｉｎ関数の周期が１／２周期の場合を示している。なお、図１２Ａ～図１２Ｃにおいて、照明σ＝１に設定している。
　図１２Ａ～図１２Ｃから分かるように、ｓｉｎ関数の周期が大きくなるほど、高周波成分の寄与が小さくなっている。一方で、ｓｉｎ関数の周期が大きくなるほど、差分後のＰＯＴＦの値は大きくなっている。これは、ＤＩＣの結像式でシア量が増大したことに相当し、コントラストが増大する代わりに解像度が悪くなることを意味する。このように、ｓｉｎ関数の周期を変化させることで、シア量を変化させることができる。解像度が悪くなると、Ｚセクショニングも悪くなるため、Ｓ／ＮおよびＺセクショニングを両立するという観点においては、ｓｉｎ関数の周期は１／２周期以下であることが望ましく、１／４周期以下であることがさらに望ましい。１／２周期以上となると、ｓｉｎ関数が負の値を取るようになるため好ましくない。
　図１２Ａ～図１２Ｃにおいて、照明σ＝１で使用する場合は、ｓｉｎ関数の周期は１／４周期以下であることがより好ましいことを述べた。しかしながら、実際の顕微鏡装置の構成において、対物レンズの開口数は様々であり、それと合致する照明ＮＡ（例：コンデンサレンズ）を厳密に確保することが難しいことから、厳密に照明σ＝１となる場合は稀である。
　この場合、照明σ＞１で使用すればよく、必ずしも照明瞳ＩＰも単調増加関数である必要はなく、途中で最大値を持ってもよい。図１３は、ｓｉｎ関数の周期を１／４周期より大きくした場合で、照明σ＝１．１（照明ＮＡ＝０．８８、検出ＮＡ＝０．８）の場合における例を示す図である。図１３（ａ）に示されるように、Ｆｘ＝０．８で光の強度は最大値１をとっている。図１３（ｃ）および図１３（ｄ）に示されるＰＯＴＦ及び３次元像は、照明σ＝１でｓｉｎ関数の周期を１／４周期以下とした場合のものと同じである。これは、検出瞳ＤＰにてＮＡ＝０．８であることから、検出瞳ＤＰにて外側がケラれてしまうため、有効照明瞳で考えればｓｉｎ関数が単調増加関数に帰着するためである。すなわち、照明瞳ＩＰにおける光の強度分布は検出光学系４０の瞳の最外周近傍において最大値をとる。なお、照明σ＞１であれば、任意のσにおいてこの理屈は成り立つ。
　今までは、図５（Ａ）の照明瞳ＩＰの瞳全面におけるｓｉｎ関数に従う光強度分布をＦｘ＝０の軸で半分に分割していたが、Ｆｙ＝０の軸で半分に分割することもできる。図１４は、図５（Ａ）の照明瞳ＩＰをＦｙ＝０の軸で半分に分割したものである。
　図１５Ａは、図１４（ａ）の場合のＰＯＴＦＸＺの分布および３次元像のＸＺ断面（上段）、図１４（ｂ）場合のＰＯＴＦＸＺの分布および３次元像のＸＺ断面（中段）、図１４（ａ）の照明瞳と図１４（ｂ）の照明瞳との差分をとった場合のＰＯＴＦＸＺの分布および３次元像のＸＺ断面（下段）を示す。
　図１５Ｂは、図１４（ａ）の場合のＰＯＴＦＹＺの分布および３次元像のＹＺ断面（上段）、図１４（ｂ）場合のＰＯＴＦＹＺの分布および３次元像のＹＺ断面（中段）、図１４（ａ）の照明瞳と図１４（ｂ）の照明瞳との差分をとった場合のＰＯＴＦＹＺの分布および３次元像のＹＺ断面（下段）を示す。なお、図１４、図１５Ａおよび図１５Ｂにおいて、照明σ＝１に設定している。
　図１５Ａおよび図１５Ｂから分かるように、照明瞳をＦｙ＝０の軸で半分に分割した場合でも、コントラストは上昇する。ただし、Ｙ方向にもＰＯＴＦが値を持ってしまい、Ｘ方向とＹ方向とでＺセクショニングに差が生じてしまう。この点において、Ｆｘ＝０の軸で照明瞳を半分に分割する方が望ましい。
　また、これまでは、例えば図５（Ｂ）のように、照明瞳ＩＰの光強度は、各Ｆｘ座標においてＦｙ軸方向に一定の値を取っていた。しかしながら、照明瞳ＩＰの光強度が各Ｆｘ座標においてＦｙ軸方向に一定の値を取る必要はない。例えば、図１６に示されるように、照明瞳ＩＰの光強度が一定のラインがＦｙ軸方向に対して平行ではなく、湾曲するような形状であってもよい。その湾曲の程度は、原点から照明瞳ＩＰの瞳半径の±３０％まで可能である。
　以上のように、本実施形態に係る顕微鏡装置１は、試料ＳＡを照明する照明光学系１０と、検出光学系４０と、照明光学系１０の照明瞳の位置Ｐ０または照明瞳と共役な位置に設けられた光学素子１６とを有する。そして、光学素子１６が配置された照明瞳の面内または照明瞳と共役な面内において、光の強度分布は、光の強度が単調増加関数または上に凸な関数に従って所定方向に沿って変化する第１領域（図５（Ｂ）の領域ＩＰ１を参照。）と、第１領域以外の領域であって光の強度が略ゼロである第２領域（図５（Ｂ）の領域ＩＰ２を参照。）とを含む。なお、本実施形態では、第２領域の光の強度は０として説明しているが、実際には、第２領域の光の強度が、光の強度分布の最大値の１０％以下であれば、本実施形態の作用効果を奏する。そのため、第２領域の光の強度が略ゼロの概念は、第２領域の光の強度が光の強度分布の最大値の１０％以下の場合を含むものである。これは、後述する他の実施形態においても同様である（第２領域の光の強度だけでなく、第４領域の光の強度が略ゼロの場合も含む）。
　これにより、本実施形態によれば、例えば瞳半分ｓｉｎ関数の照明瞳ＩＰの光強度分布を有する光学素子１６によりコントラストが上昇し、差分を取ることを前提とすれば、Ｓ／ＮおよびＺ方向のセクショニングの両方に優れた画像を取得することが可能な顕微鏡装置１を提供することができる。
　また、所定方向は、照明光学系１０の光軸の近傍を起点とした第１方向（一例として、＋Ｆｘ方向）であることが好ましい。なお、ＬＥＤアレイの場合、所定方向は、ＬＥＤアレイの中心の近傍を起点とした第１方向である。
　また、照明光学系１０の光軸の近傍は、該光軸を起点として照明瞳ＩＰの面の半径の３０％分第１方向に進んだ位置から、該光軸を起点として照明瞳ＩＰの面の半径の３０％分第１方向とは反対の方向に進んだ位置までの範囲であることが好ましい。なお、ＬＥＤアレイの場合、ＬＥＤアレイの中心の近傍は、該中心を起点としてＬＥＤアレイの面の半径の３０％分第１方向に進んだ位置から、該中心を起点としてＬＥＤアレイの面の半径の３０％分第１方向とは反対の方向に進んだ位置までの範囲であることが好ましい。
　また、上に凸な関数は、正弦関数、余弦関数、その他の周期関数のうちいずれかであることが好ましく、また、光の強度は、周期関数の１／２周期以下の範囲で変化することが好ましく、周期関数の１／４周期以下の範囲で変化することがより好ましい。
　また、上に凸な関数は、対数関数、誤差関数、その他の高次関数のうちいずれかであってもよい。
　以上、Ｓ／ＮとＺセクショニングに着目して議論してきたが、これは画像処理へも応用が可能である。画像処理部６６により、試料ＳＡに関する屈折率のデータとして試料ＳＡにおける２次元または３次元の屈折率分布を求めることが可能である。屈折率分布を求める際、画像のＳ／Ｎが良い方がデコンボリューションする際にノイズに強くなる。また、元画像のＺセクショニングが良いほど、求まるＯＤＴ（Optical　Diffraction　Tomography）画像のＺセクショニングも良くなる。
　さらに、今まではＦｘ方向の２つの照明瞳ＩＰの光強度分布の差分を取っていたが、Ｆｙ方向にも２つの照明瞳ＩＰの光強度分布の差分を取り、合計で４つの照明瞳ＩＰの光強度分布のＰＯＴＦを合成して屈折率分布を求めても良い。これにより等方的な像を得ることが可能になる。
　図１７は、Ｆｘ方向の２つの照明瞳ＩＰの光強度分布とＦｙ方向の２つの照明瞳ＩＰの光強度分布を示す図である。なお、図１７において、照明σ＝１に設定している。図１７に示される照明瞳ＩＰの光強度分布を有する４つの光学素子１６を切替制御部１６０により随時切り替えて光路に配置し、４つの画像を取得する。または、切替制御部１６０により１つの光学素子１６を９０°回転させることで強度分布を変化させる制御を行い、４つの画像を取得するようにしてもよい。Ｆｘ方向の２つの照明瞳ＩＰの光強度分布を介して得られた画像の差分と、Ｆｙ方向の２つの照明瞳ＩＰの光強度分布を介して得られた画像の差分とを周波数空間でマージすることで、屈折率分布の画像を得ることができる。また、光学素子１６として、ＬＥＤアレイを使用した場合は、切替制御部１６０により、ＬＥＤアレイを制御して、図１７に示す強度分布に随時切り替えて、４つの画像を取得する。
　図１８は、図１７の４つの照明瞳ＩＰの光強度分布を用いて得られた３次元屈折率分布の画像である。なお、計４つの照明瞳ＩＰの光強度分布すべてを用いずに、最低２つの照明瞳ＩＰの光強度分布を用いても屈折率分布の画像を生成することができる。
　＜第２実施形態＞
　顕微鏡装置を用いて３次元培養サンプルを観察する場合、多重散乱が大きくなるので、使用波長は長波長にするのがよい。長波長は１３００ｎｍや１７００ｎｍを想定するが、これに限られない。しかし、長波長になるほど水の吸収を無視できなくなるので、サンプルの吸収分布と屈折率分布を分離して測定できることが好ましい。上記の顕微鏡装置１を応用すればそれが可能である。
　図１９は、第２実施形態に係る顕微鏡装置３０１の概略構成図である。本実施形態に係る顕微鏡装置３０１はレーザー走査型であるが、第１実施形態に係る顕微鏡装置１のような透過照明系の構成を取ってもよい。
　第２実施形態に係る顕微鏡装置３０１は、図１９に示されるように、顕微鏡部３５０と、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。顕微鏡部３５０は、図１９に示されるように、光源ユニット３５１と、照明光学系３６０と、検出光学系３７０と、検出器３８０とを有する。光源ユニット３５１は、ビーム操作ユニット（Beam Steering unit）とも称される。光源ユニット３５１は、図１９に示されるように、光源３５２と、第１レンズ３５３と、第１ガルバノミラー３５４と、第２レンズ３５５と、第３レンズ３５６と、第２ガルバノミラー３５７と、第４レンズ３５８とを有する。
　光源３５２は、レーザー光源を用いて構成される。光源３５２は、所定の波長帯域の照明光を発光させる。第１レンズ３５３は、光源３５２から発光した照明光を平行にする。第１ガルバノミラー３５４は、第１レンズ３５３からの照明光を第２レンズ３５５に向けて反射させる。第１ガルバノミラー３５４は、反射面の向きを変化させることにより、照明光の進行方向を変化させることが可能である。第１ガルバノミラー３５４が照明光の進行方向を変化させることで、試料ＳＡにおける照明光の集光位置をｙ方向に変化させる。第２レンズ３５５および第３レンズ３５６は、第１ガルバノミラー３５４で反射した照明光を第２ガルバノミラー３５７に入射させる。なお、第１ガルバノミラー３５４と第２ガルバノミラー３５７が瞳と共役な位置に配置される場合、第２レンズ３５５および第３レンズ３５６は、設けられていなくてもよい。
　第２ガルバノミラー３５７が照明光の進行方向を変化させることで、試料ＳＡにおける照明光の集光位置をｘ方向に変化させる。第４レンズ３５８は、第２ガルバノミラー３５７で反射した照明光を所定の中間像面ＩＭで集光させて、照明光学系３６０に入射させる。所定の中間像面ＩＭの位置は、試料ＳＡにおける対物レンズ３６７の焦点位置と共役な位置である。第１ガルバノミラー３５４と、第２ガルバノミラー３５７と、ステージ駆動部により、試料ＳＡにおける照明光の集光位置を３次元方向（ｘ方向とｙ方向とｚ方向の３つの方向）に変化させて、試料ＳＡの少なくとも一部を３次元的に走査することが可能である。つまり、第１ガルバノミラー３５４と、第２ガルバノミラー３５７と、ステージ駆動部により、試料ＳＡに集光する光を試料ＳＡの少なくとも一部に亘って走査する走査部が形成される。
　照明光学系３６０は、光源ユニット３５１（光源３５２）から発光した照明光Ｌを＋ｚ方向に向けて試料ＳＡに集光して照射する。照明光学系３６０は、図１９に示されるように、光源ユニット３５１側から順に、ミラー３６１と、チューブレンズ３６２と、対物レンズユニット３６６とを有する。ミラー３６１は、光源ユニット３５１（光源３５２）から発光した照明光Ｌをチューブレンズ３６２に向けて反射させる。チューブレンズ３６２は、ミラー３６１で反射した照明光Ｌを平行にする。
　対物レンズユニット３６６は、複数の照明用対物レンズ３６７と、レンズ保持部３６８と、ユニット駆動部３６９とを有する。照明用対物レンズ３６７は、ステージ２の下方に対向して配置される。レンズ保持部３６８は、光学特性が異なる複数の照明用対物レンズ３６７を保持する。レンズ保持部３６８は、例えば、レボルバやターレット等を用いて構成される。ユニット駆動部３６９は、レンズ保持部３６８を駆動し、複数の照明用対物レンズ３６７のうちいずれかを選択してステージ２の下方に配置することが可能である。なお、ユニット駆動部３６９は、レンズ保持部３６８をｚ軸に沿って移動させてもよい。この場合、前述のステージ駆動部を併用してもよいし、ステージ駆動を使わなくてもよい。ステージ２の下方に配置された照明用対物レンズ３６７は、チューブレンズ３６２を透過した照明光Ｌを試料ＳＡに集光する。
　検出光学系３７０は、試料ＳＡを挟んで照明光学系３６０と反対の側から照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける。検出光学系３７０は、図１９に示されるように、試料ＳＡ側から順に、検出用対物レンズ３７１と、開口絞り３７２と、光学素子３１６と、集光レンズ３７４と、ミラー３７６と、リレーレンズ３７７とを有する。検出用対物レンズ３７１は、試料ＳＡを挟んで照明用対物レンズ３６７と反対の側に設けられる。検出用対物レンズ３７１として、光学特性が異なる複数の検出用対物レンズ３７１のうちいずれかを選択してステージ２の上方に配置することが可能である。検出用対物レンズ３７１には、照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光が入射する。
　開口絞り３７２および光学素子３１６は、検出光学系３７０における検出用対物レンズ３７１の検出瞳と共役な面（検出瞳と共役な位置Ｐ２Ａにおいて検出光学系３７０の光軸と垂直な面）に配置される。光学素子３１６は、開口絞り３７２に隣接して（一例として、図１９のように開口絞り３７２の上側に）配置される。光学素子３１６は、第１実施形態に係る光学素子１６と同様に構成される。集光レンズ３７４は、開口絞り３７２および光学素子３１６を通った光を集光する。ミラー３７６は、集光レンズ３７４を透過した光をリレーレンズ３７７に向けて反射させる。リレーレンズ３７７は、ミラー３７６で反射した光を検出器３８０に入射させる。
　検出器３８０は、検出光学系３７０における検出瞳と共役な位置Ｐ２Ｂに配置される。検出器３８０は、第１実施形態に係る検出器６０と同様に構成される。検出器３８０は、検出光学系３７０を介して試料ＳＡからの光を検出する。
　本実施形態において、試料ＳＡの明視野観察を行う場合、光源ユニット３５１の光源３５２から発光した照明光は、第１レンズ３５３に入射する。第１レンズ３５３を透過した照明光は、平行光となって第１ガルバノミラー３５４で反射する。第１ガルバノミラー３５４で反射した照明光は、第２レンズ３５５および第３レンズ３５６を透過し、第２ガルバノミラー３５７で反射する。第２ガルバノミラー３５７で反射した照明光は、第４レンズ３５８を透過して光源ユニット３５１の外部に射出される。これにより、光源ユニット３５１は、照明光を発光させる。
　光源ユニット３５１（光源３５２）から発光した照明光Ｌは、照明光学系３６０のミラー３６１で反射してチューブレンズ３６２に入射する。チューブレンズ３６２を透過した照明光Ｌは、平行光となって照明用対物レンズ３６７に入射する。照明用対物レンズ３６７を透過した照明光Ｌは、集光されてステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、照明光学系３６０は、光源ユニット３５１（光源３５２）から発光した照明光Ｌを＋ｚ方向に向けて試料ＳＡに集光して照射する。
　照明光学系３６０の方から試料ＳＡを透過した検出光は、検出光学系３７０の検出用対物レンズ３７１に入射する。検出用対物レンズ３７１を透過した検出光は、開口絞り３７２と光学素子３１６とを通って集光レンズ３７４に入射する。集光レンズ３７４を透過した第検出光は、ミラー３７６で反射してリレーレンズ３７７に入射する。リレーレンズ３７７を透過した検出光は、検出器３８０に入射する。検出器３８０は、検出光学系３７０を介して試料ＳＡからの光（検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。検出器３８０から出力された光（検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
　光学素子３１６として、異なる光の強度分布を与える複数の光学素子３１６のうちいずれかを選択して位置Ｐ２Ａに配置することが可能である。この場合、顕微鏡装置３０１は、異なる光の強度分布を与える複数の光学素子３１６のうちいずれかに切り替えて位置Ｐ２Ａに配置する制御を行う切替制御部５６０を備える。切替制御部５６０は、１つの光学素子３１６を回転または制御することで、光の強度分布を変化させてもよい。
　ここで、本実施形態では、第１実施形態と異なり、光学素子３１６は検出光学系３７０内（検出光学系３７０の検出瞳と共役な面）に配置されている。第１実施形態に係る顕微鏡装置１であるケーラー照明顕微鏡および本実施形態に係る非共焦点レーザー顕微鏡は、ＮＡ等の条件が同じである場合、同じＰＯＴＦが得られることが知られている。このことについては、一例としてＰＣＴ／ＪＰ２０２２／０２５２７２（段落００８０）に記載されており、ＰＣＴ／ＪＰ２０２２／０２５２７２の記載を本明細書に組み込む。これは、非共焦点レーザー顕微鏡では、ケーラー照明顕微鏡と比較して、照明光学系と検出光学系の関係が逆転することを意味する。つまり、第１実施形態に係る顕微鏡装置１では、光学素子１６は照明光学系１０の照明瞳の面（もしくは照明瞳と共役な面）に配置されていたが、本実施形態に係る顕微鏡装置３０１では、光学素子３１６は検出光学系３７０の検出瞳の面（もしくは検出瞳と共役な面）に配置されることになる。そして、照明瞳と共役な面が検出瞳の面もしくは検出瞳と共役な面に一致する。つまり、照明瞳若しくは照明瞳近傍と共役な面（位置）の概念は、検出瞳若しくは検出瞳近傍、又は検出瞳若しくは検出瞳近傍と共役な面（位置）を含むものである。また、第１実施形態のケーラー照明顕微鏡では、照明光学系１０の開口数は、検出光学系４０の開口数以上（つまり照明σ≧１）であったが、本実施形態の非共焦点レーザー顕微鏡では、照明光学系３６０の開口数は、検出光学系３７０の開口数以下（つまり照明σ≦１）である。好ましくは、第１実施形態のケーラー照明顕微鏡では、照明光学系１０の開口数は、検出光学系４０の開口数の０．９倍以上であり、本実施形態の非共焦点レーザー顕微鏡では、照明光学系３６０の開口数は、検出光学系３７０の開口数の０．９倍以下である。
　本実施形態に係る顕微鏡装置３０１では、光学素子３１６として、例えば図２０に示される２種類の強度変調素子Ｔ１（＋）、Ｔ１（－）を使用する。これら強度変調素子Ｔ１（＋）、Ｔ１（－）は瞳半分の光強度分布が１次関数に従って単調増加（単調減少）するように構成されている。
　切替制御部５６０は、２つの強度変調素子Ｔ１（＋）、Ｔ１（－）のうちいずれかに切り替えて検出瞳と共役な面内に配置する制御を行う。なお、１種類の強度変調素子Ｔ１（＋）のみを用いて、これを１８０度回転させ（反転させ）第１領域と第２領域とを入れ替えることで、強度変調素子Ｔ１（－）と同じ作用を得てもよい。
　検出器３８０は、切替制御部５６０により光の強度分布を変化させることで、検出光学系３７０を介した試料ＳＡからの光を検出し、複数（ここでは２種類）の検出信号を出力する。そして、画像処理部９１は、検出器３８０により出力された複数の検出信号により形成された複数の画像に基づいて差分画像を生成し、この差分画像に基づいて試料ＳＡの屈折率分布を表す画像を生成する。また、画像処理部９１は、該複数の画像に基づいて和画像を生成し、この和画像に基づいて試料ＳＡの吸収分布を表す画像を生成する。
　なお、差分画像から屈折率分布を表す画像を生成する方法、及び和画像から吸収分布を表す画像を生成する方法については、一例としてMichael Chen et al. Biomedical Optics Express Vol.7, Issue 10, pp.3940-3950 (2016)に記載されており、Michael Chen et al. Biomedical Optics Express Vol.7, Issue 10, pp.3940-3950 (2016)の記載を本明細書に組み込む。
　＜第３実施形態＞
　次に、カラーカメラを使用して、より高速に複数の照明瞳の光強度分布による撮像を可能にする方法について説明する。
　図２１は、第３実施形態に係る顕微鏡装置４０１の概略構成図である。第３実施形態に係る顕微鏡装置４０１は、第１実施形態と同様のケーラー照明顕微鏡であるが、第２実施形態と同様の非共焦点レーザー顕微鏡であってもよい。第１実施形態と共通する構成については同符号を付し、説明を省略する。
　第３実施形態に係る顕微鏡装置４０１は、カラーカメラである検出器４６０と、図２２に示されるような光の強度分布を照明瞳の瞳面内に生じさせる強度変調素子としての光学素子４１６とを有する。光学素子４１６は、照明光学系１０の照明瞳の位置Ｐ０に配置されており、Ｆｘ＝０の軸に対して左右で光の強度分布が対称になっている。そして、光学素子４１６の前に照明瞳の左右で透過する波長域が異なるようなバンドパスフィルタ４１７が配置されている。これにより、照明光学系１０は、第１光（例えばＲ光）と第１光とは異なる第２光（例えばＧ光）を試料ＳＡに照射することができる。カラーカメラはＲ，Ｇ，Ｂごとに画像を取得することが可能であるため、図２２に示されるような強度分布を生じさせる光学素子４１６のみを用いた１回の撮像により、例えばＲとＧに相当する画像を同時に取得することができる。これらＲとＧに相当する画像を用いて和差分画像を生成することで、試料ＳＡの屈折率分布および吸収分布を表す画像を生成することができる。
　図２２に示される光の強度分布は、バンドパスフィルタ４１７を通過し照明瞳ＩＰの右半分を透過する第１光の強度が単調増加関数（または上に凸な関数）に従って所定方向に沿って変化する第１領域と、第１領域以外の領域であって当該第１光の強度が略ゼロである第２領域とを含み、バンドパスフィルタ４１７を通過し照明瞳ＩＰの左半分を透過する第２光の強度が単調増加関数（または上に凸な関数）に従って前記第１方向とは反対の方向に沿って変化する第３領域と、第３領域以外の領域であって第２光の強度が略ゼロである第４領域とを含む。第１領域と第４領域とが重畳し、第２領域と第３領域とが重畳して、図２２に示すような光の強度分布となる。第１領域と第３領域は、第１方向に垂直な方向に対して対称であり、第２領域と第４領域は、第１方向に垂直な方向に対して対称である。
　また、光源５を使用せず、光学素子４１６としてＬＥＤアレイ５１６を使用してＬＥＤアレイ５１６のＲＧＢを工夫することで試料ＳＡを照明するようにしてもよい。この場合、ＬＥＤアレイ５１６は光源５としても機能する。そして、ＬＥＤアレイ５１６は照明瞳の瞳近傍または該瞳近傍と共役な位置に配置される。
　図２３は、光源５を用いず光学素子４１６としてＬＥＤアレイ５１６を使用した場合の顕微鏡装置５０１の概略構成図である。例えば、図２２に示されるように、照明瞳の右半分ではＧ光の強度が＋Ｆｘ方向に単調増加するようにＬＥＤアレイ５１６を調整し、照明瞳の左半分ではＲ光の強度が＋Ｆｘ方向に単調減少するようにＬＥＤアレイ５１６を調整する。なお、図２３では、ＬＥＤアレイ５１６からの光は、コンデンサレンズ１８を介して試料ＳＡを照明しているが、コンデンサレンズ１８を介さずダイレクトに試料ＳＡを照明するようにしてもよい。この場合でも、ＬＥＤアレイ５１６は照明瞳の瞳近傍または該瞳近傍と共役な位置に配置される。ＬＥＤアレイ５１６とコンデンサレンズ１８との間に拡散板を配置してもよい。
　なお、ここではカラーカメラを用いた例を説明したが、ダイクロイックミラーなどで波長を分離して複数のモノクロカメラで画像を取得するようにしてもよい。
　＜第４実施形態＞
　第３実施形態のほかに、偏光素子を使用することで、より高速に複数の照明瞳の光強度分布による撮像を可能にする方法について説明する。
　図２４は、第４実施形態に係る顕微鏡装置６０１の概略構成図である。第４実施形態に係る顕微鏡装置６０１は、第１実施形態と同様のケーラー照明顕微鏡であるが、第２実施形態と同様の非共焦点レーザー顕微鏡であってもよい。第１実施形態と共通する構成については同符号を付し、説明を省略する。
　第４実施形態に係る顕微鏡装置６０１は、偏光カメラである検出器６６０と、図２２に示されるような光の強度分布を照明瞳の瞳面内に生じさせる強度変調素子としての光学素子４１６とを有する。光学素子４１６は、照明光学系１０の照明瞳の位置Ｐ０に配置されており、Ｆｘ＝０の軸に対して左右で光の強度分布が対称になっている。そして、光学素子４１６の前（または後）には、光源５から射出された無偏光の光から４５°直線偏光のみを透過させる第１偏光子６１８（透過軸を４５°に設定）と、照明瞳への入射前に各偏光をそれぞれ取り出す第２偏光子６１９とが配置されている。第２偏光子６１９は、光学素子４１６によって生じる照明瞳の瞳面内の光の強度分布に対応させて、その左半分の透過軸をＰ偏光の振動方向と一致するように、その右半分の透過軸をＳ偏光の振動方向と一致するように配置しているので、左半分はＰ偏光、右半分はＳ偏光を取り出すことができる。偏光カメラである検出器６６０は、最終的に検出器６６０の撮像素子に届いたＰ偏光、Ｓ偏光をそれぞれ検出することで、２つの画像を同時に取得することができ、これら画像を用いて和差分画像を生成することができる。
　さらに、図２４に示されるように、光学素子４１６と第２偏光子６１９を一体に９０°回転させ、光学素子４１６によって生じる照明瞳の瞳面内の光の強度分布を９０°回転させた状態で撮像を行うことにより、図１７及び図１８において説明した等方的な像を取得することが可能である。なお、偏光カメラの代わりに、検出光学系４０に偏光ビームスプリッタを配置して偏光を分離し、２つのカメラを用いて画像を取得するようにしてもよい。
　＜第５実施形態＞
　第２実施形態と同様のレーザー走査型非共焦点顕微鏡の構成において、偏光素子を使用することで、より高速に複数の照明瞳の光強度分布による撮像を可能にする方法について説明する。
　図２５は、第５実施形態に係る顕微鏡装置７０１の概略構成図である。第２実施形態と共通する構成については同符号を付し、説明を省略する。レーザー走査型非共焦点顕微鏡の場合は、強度変調素子としての光学素子７１６は、検出瞳の位置に配置される。光学素子７１６は、図２２に示される第３実施形態に係る光学素子４１６と同じである。
　第５実施形態に係る顕微鏡装置７０１において、光源ユニット３５１は、光源３５２から出射した直線偏光を所望の直線偏光に変換するλ／２板７２０を更に有し、検出光学系３７０は、検出瞳への入射前に各偏光をそれぞれ取り出す偏光子７１９を更に有する。偏光子７１９は、第２偏光子６１９と同じである。
　光源３５２から射出された直線偏光をλ／２板７２０を用いて所望の直線偏光にした後、検出瞳への入射前に偏光子７１９を用いて各偏光を取り出す。その後、光学素子７１６を透過した光を最終的にＰＭＴ（Photomultiplier Tube）である検出器３８０で検出する。ここで、λ／２板７２０を高速に回転させることで、λ／２板７２０を通過した後の偏光を、Ｓ偏光からＰ偏光に瞬時に変化させることが可能である。すると、偏光子７１９と光学素子７１６の組み合わせにより、時間的に光学素子７１６を通過する箇所が切り替わることになり（Ｐ偏光は左半分、Ｓ偏光は右半分）、高速に２つの画像を取得することができるとともに、これら画像を用いて和差分画像を生成することができる。
　さらに、第４実施形態で説明したのと同様に、光学素子７１６によって生じる照明瞳の瞳面内の光の強度分布を９０°回転させて同様の撮像を行うことで、図１７及び図１８において説明した等方的な像を取得することも可能である。なお、上記はλ／２板７２０を高速回転させる方法を記載したが、例えばλ／２板７２０を固定し４５°偏光を射出するようにしてもよい。その場合は、偏光子７１９にＳ偏光とＰ偏光が共に入射することになるので、リレーレンズ３７７の前に偏光ビームスプリッタを配置して光路を分岐し、リレーレンズ３７７と検出器３８０の組み合わせを２つ用いて、それぞれのパターンにおける像を同時に取得することも可能である。さらに、λ／２板７２０の回転では切り換え速度に限りがあるので、より高速に偏光制御するために、ＬＣＶＲ（液晶可変波長板）を用いて偏光軸を回転させてもよい。
　ただし現実には、偏光子７１９に入射する前に、プラスチック容器や光学系依存で偏光が回ってしまうことが考えられる。このような場合には、顕微鏡部３５０(光源ユニット３５１)内にデポラライザなど偏光を無偏光に変換する素子を挿入する。その上で、検出用対物レンズ３７１の直後（対物レンズ３７１と偏光子７１９との間）に新たに別の偏光子として、４５°方向に透過軸を持つ偏光子を配置することで解消可能である。その場合、偏光子７１９に入射する偏光成分を高速で切り替えるために４５°方向に透過軸を持つ偏光子自体を高速で回転させても良いし、４５°方向に透過軸を持つ偏光子の後、偏光子７１９の前にＬＣＶＲを配置して偏光軸を回転させても良い。なお、第４実施形態及び第５実施形態に係る顕微鏡装置はともに透過型構成であるが、反射型構成の顕微鏡装置であってもよい。
　＜第６実施形態＞
　第２実施形態と同様のレーザー走査型非共焦点顕微鏡の構成において、ロックインアンプ検出と組み合わせることで、より高速に複数の照明瞳の光強度分布による撮像を可能にする方法について説明する。
　図２６は、第６実施形態に係る顕微鏡装置８０１の概略構成図である。第２実施形態と共通する構成については同符号を付し、説明を省略する。レーザー走査型非共焦点顕微鏡の場合は、強度変調素子としての光学素子８１６は、検出瞳の位置に配置される。光学素子８１６は、時間的に透過する光の強度を変調可能な強度変調素子である。光学素子８１６は、図２６に示されるように、光の強度分布を時間的（例えばｓｉｎ波）に右半分／左半分の瞳半分ｓｉｎ関数へ高速に変調できる。そして、光の強度分布の変調と同期させるように検出器３８０でロックインアンプ検出を行う。これにより、像の取得を高速に行うことが可能である。
　＜第７実施形態＞
　不妊治療とりわけＩＶＦ(In Vitro Fertilization)に於いては、変調コントラスト法を用いて卵子のコントラストを上げた上で人工授精を行なうが、精子をインジェクションする際に卵子の紡錘体を傷つけないように偏光観察を用いて紡錘体を可視化するケースが存在する。
　ＩＶＦでは可能な限り迅速な施術が必要とされるため、変調コントラスト観察と偏光観察の切り替えを少なくしたいという要望がある。照明瞳の瞳面内の光の強度分布として、瞳半分ｓｉｎ関数の強度分布を生じさせる光学素子を使用する場合は、偏光の影響を受けないことから偏光観察と同時に画像を取得することが可能であり、特に偏光素子の切り替えを必要としないため、作業者の負担を軽減することが可能である。また、偏光観察に於いては背景の色味を変えたいという要望もある。その場合は、光路の途中にλ板やλ／４板などを挿入することで鋭敏色を含めた干渉色の調整も可能である。
　図２７は、第７実施形態に係る顕微鏡装置９０１の概略構成図である。第７実施形態に係る顕微鏡装置９０１は、ケーラー照明顕微鏡である。第１実施形態と共通する構成については同符号を付し、説明を省略する。第７実施形態に係る顕微鏡装置９０１は、照明光学系１０において強度変調素子としての光学素子９１６の前に配置された偏光子（ポラライザ）９０２を有し、検出光学系２４０において第１結像レンズ４１の前に配置された偏光子（アナライザ）９０３を有する。光学素子９１６は、瞳半分ｓｉｎ関数の照明瞳の光強度分布を有し、不図示の切替制御部により回転可能に構成されている。光学素子９１６を回転させることで像の陰影の方位を変更可能である。鋭敏色を含めた干渉色の調整を行う場合、アナライザ９０３の前後の光路の途中にλ板やλ／４板などを挿入する。また、作業者によっては卵細胞のコントラストを上げて観察したいというケースもある。その場合には、光学素子９１６自体を光軸に交差する所定方向にずらして、つまり光学素子９１６の光の強度が０になる箇所を、照明光学系の光軸を起点として照明瞳の面の半径の３０％分＋Ｆｘ方向に進んだ位置から当該光軸を起点として照明瞳の面の半径の３０％分－Ｆｘ方向に進んだ位置までの範囲で所定方向にずらすことで実現できる。
　以上、本開示の各実施形態について説明したが、本開示は、上記各実施形態に限定して解釈されるものではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲内において種々の実施形態及び組み合わせに適用することができる。
１・・・顕微鏡装置、ＳＡ・・・試料、１０・・・照明光学系、４０・・・検出光学系、１６・・・光学素子
 

Claims (30)

  1. 　検出光学系と、次の（１）、（２）のいずれか一方と、を備える顕微鏡装置であって、
    　　（１）試料を照明する照明光学系、及び前記照明光学系の瞳若しくは瞳近傍の位置または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な位置に設けられた光学素子
    　　（２）前記照明光学系を介することなく前記試料を照明するＬＥＤアレイ
    　前記光学素子が配置された前記瞳若しくは前記瞳近傍の面内または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な面内における光の強度分布及び前記ＬＥＤアレイにおける光の強度分布それぞれは、
    　　前記光の強度が単調増加関数または上に凸な関数に従って所定方向に沿って変化する第１領域と、
    　　前記第１領域以外の領域であって前記光の強度が略ゼロである第２領域と、を含む、顕微鏡装置。
  2. 　前記瞳若しくは前記瞳近傍の面内または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な面内における前記光の強度分布及び前記ＬＥＤアレイにおける前記光の強度分布それぞれは、前記第１領域と、前記第２領域と、からなる、請求項１に記載の顕微鏡装置。
  3. 　前記顕微鏡装置が前記（１）を備える場合、前記所定方向は、前記照明光学系の光軸の近傍を起点とした第１方向であり、
    　前記顕微鏡装置が前記（２）を備える場合、前記所定方向は、前記ＬＥＤアレイの中心の近傍を起点とした前記第１方向である、請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
  4. 　前記顕微鏡装置が前記（１）を備える場合、前記光軸の近傍は、前記光軸を起点として前記瞳の面の半径の３０％分前記第１方向に進んだ位置から、前記光軸を起点として前記瞳の面の半径の３０％分前記第１方向とは反対の方向に進んだ位置までの範囲であり、
    　前記顕微鏡装置が前記（２）を備える場合、前記中心の近傍は、前記中心を起点として前記ＬＥＤアレイの面の半径の３０％分前記第１方向に進んだ位置から、前記中心を起点として前記ＬＥＤアレイの面の半径の３０％分前記第１方向とは反対の方向に進んだ位置までの範囲である、請求項３に記載の顕微鏡装置。
  5. 　前記上に凸な関数は、正弦関数、余弦関数、その他の周期関数のうちいずれかである、請求項１から４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  6. 　前記上に凸な関数は周期関数であり、
    前記光の強度は、前記周期関数の１／２周期以下の範囲で変化する、請求項５に記載の顕微鏡装置。
  7. 　前記上に凸な関数は周期関数であり、
    　前記光の強度は、前記周期関数の１／４周期以下の範囲で変化する、請求項５に記載の顕微鏡装置。
  8. 　前記上に凸な関数は、対数関数、誤差関数、その他の高次関数のうちいずれかである、請求項１から４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  9. 　切替制御部を更に備え、
    　前記切替制御部は、
    　　前記顕微鏡装置が前記（１）を備える場合、前記光学素子を制御することで前記光学素子が与える前記強度分布を変化させ、
    　　前記顕微鏡装置が前記（２）を備える場合、前記ＬＥＤアレイを制御することで前記ＬＥＤアレイが発する前記強度分布を変化させる、請求項１から８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  10. 　前記光学素子は、異なる前記強度分布を与える複数の光学素子を含み、
    　前記複数の光学素子のうちいずれかに切り替えて前記瞳若しくは前記瞳近傍の面内または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な面内に配置する制御を行う切替制御部を更に有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  11. 　前記顕微鏡装置が前記（１）を備える場合、前記切替制御部により前記光学素子が与える前記強度分布を変化させることで、前記顕微鏡装置が前記（２）を備える場合、前記切替制御部により前記ＬＥＤアレイが発する前記強度分布を変化させることで、前記検出光学系を介して前記光を検出して複数の検出信号を出力する検出部と、
    　前記検出部により出力された前記複数の検出信号により形成された複数の画像に基づいて、差分画像を生成する画像処理部と、を更に有する請求項９または１０に記載の顕微鏡装置。
  12. 　前記顕微鏡装置が前記（１）を備える場合、前記切替制御部により前記光学素子が与える前記強度分布を変化させることで、前記顕微鏡装置が前記（２）を備える場合、前記切替制御部により前記ＬＥＤアレイが発する前記強度分布を変化させることで、前記検出光学系を介して前記光を検出して複数の検出信号を出力する検出部と、
    　前記検出部により出力された前記複数の検出信号により形成された複数の画像に基づいて、和画像を生成する画像処理部と、を更に有する請求項９または１０に記載の顕微鏡装置。
  13. 　前記切替制御部は、前記第１領域と前記第２領域とが入れ替わるように、前記強度分布を変化させる、請求項１１または１２に記載の顕微鏡装置。
  14. 　前記画像処理部は、前記差分画像に基づいて、前記試料の屈折率分布を表す画像を生成する、請求項１１に記載の顕微鏡装置。
  15. 　前記画像処理部は、前記和画像に基づいて、前記試料の吸収分布を表す画像を生成する、請求項１２に記載の顕微鏡装置。
  16. 　前記検出光学系は、前記光および前記光とは異なる第２光を受け又は形成し、
    　前記瞳若しくは前記瞳近傍の面内または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な面内における前記光学素子の前記第２光の強度分布及び前記ＬＥＤアレイにおける前記第２光の強度分布それぞれは、
    　　前記第２光の強度が単調増加関数または上に凸な関数に従って前記第１方向とは反対の方向に沿って変化する第３領域と、
    　　前記第３領域以外の領域であって前記第２光の強度が略ゼロである第４領域と、を含む、請求項３に記載の顕微鏡装置。
  17. 　前記第１領域と前記第３領域は、前記第１方向に垂直な方向に対して対称であり、
    　前記第２領域と前記第４領域は、前記第１方向に垂直な方向に対して対称である、請求項１６に記載の顕微鏡装置。
  18. 　前記照明光学系は、前記光と、前記第２光とを前記試料に照射する、請求項１６または１７に記載の顕微鏡装置。
  19. 　前記光学素子は、前記光および前記第２光の強度を変調する強度変調素子であり、
    　前記光および前記第２光が前記強度変調素子に入射する前または後に前記光および前記第２光をそれぞれ異なる偏光状態にする偏光子を更に有する、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  20. 　前記光と前記第２光とは、互いに異なる偏光状態を有する、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  21. 　前記光と前記第２光とは、互いに異なる波長帯域を有する、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  22. 　前記光学素子は、第２のＬＥＤアレイであり、
    　前記第２のＬＥＤアレイは、前記顕微鏡装置における光源として機能する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  23. 　前記光学素子は、前記光の強度を変調する強度変調素子であり、
    　前記強度変調素子は、前記照明光学系内に配置されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  24. 　前記照明光学系の開口数は、前記検出光学系の開口数の０．９倍以上である、請求項２２から２３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  25. 　前記瞳若しくは前記瞳近傍の面内または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な面内において、前記上に凸な関数に従って変化する前記強度分布は、前記検出光学系の瞳の最外周近傍において最大値をとる、請求項２４に記載の顕微鏡装置。
  26. 　前記照明光学系は、前記試料に集光する前記光を前記試料の少なくとも一部に亘って走査する走査部を含み、
    　前記光学素子は、前記光の強度を変調する強度変調素子であり、
    　前記強度変調素子は、前記検出光学系内に配置されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  27. 　前記照明光学系は、前記光および前記第２光とは異なる第３光を前記試料の少なくとも一部に亘って走査する走査部を含み、
    　前記光学素子は、前記光および前記第２光の強度を変調する強度変調素子であり、
    　前記強度変調素子は、前記検出光学系内に配置されている、請求項１６、１７、１９及び２０のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  28. 　前記照明光学系は、前記試料を照明する前記光を前記試料に集光する対物レンズを含む、請求項２６に記載の顕微鏡装置。
  29. 　前記照明光学系の開口数は、前記検出光学系の開口数の０．９倍以下である、請求項２６に記載の顕微鏡装置。
  30. 　前記瞳若しくは前記瞳近傍の面内または前記瞳若しくは前記瞳近傍と共役な面内において、前記上に凸な関数に従って変化する前記強度分布は、前記照明光学系の瞳の最外周近傍において最大値をとる、請求項２９に記載の顕微鏡装置。
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