WO2025183115A1 - 乳酸産生菌及び酪酸産生菌を含む整腸用組成物 - Google Patents

乳酸産生菌及び酪酸産生菌を含む整腸用組成物

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WO2025183115A1
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WO
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producing bacteria
composition
butyric acid
lactic acid
bacteria
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PCT/JP2025/006968
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悠太 野田
貴行 前田
良一 山田
知也 新谷
大介 佐々木
昭彦 近藤
潤 井上
裕三 児玉
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Mitsubishi Chemical Corp
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corp
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    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a composition containing lactic acid-producing bacteria and butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes.
  • Butyric acid is a type of short-chain fatty acid that plays an important role in regulating intestinal function in humans and animals, including strengthening intestinal barrier function and providing anti-inflammatory effects. For this reason, attempts have been made to administer or ingest butyric acid for the purpose of intestinal regulation; however, butyric acid has a very strong, unpleasant odor, making it difficult to administer or ingest itself.
  • butyric acid-producing bacteria exist in the intestines of humans and animals, and these bacteria can produce butyric acid within the intestines. For this reason, efforts have been made to increase intestinal butyric acid concentrations using butyric acid-producing bacteria.
  • Patent Document 1 discloses an agent for increasing intestinal butyric acid-producing bacteria that uses spore-forming bacteria (Bacillus subtilis) to increase butyric acid bacteria (Feacalibacterium prausnitzii).
  • Patent Document 2 discloses a food composition containing D-mannitol or D-sorbitol as an active ingredient and having the effect of increasing intestinal butyric acid concentrations, and describes its administration or ingestion to humans and animals.
  • Non-Patent Document 1 discloses that lactic acid-producing bacteria (Bacillus coagulans SANK70258) increased bacteria related to the Lachnospiraceae family in a microbiome model of healthy individuals, thereby promoting butyric acid production.
  • Anaerostipes caccae a butyrate-producing bacterium of the genus Anaerostipes, was isolated from human feces as a bacterium capable of producing butyrate using lactic acid (Non-Patent Document 2).
  • JP 2013-147469 A Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-49093
  • the present invention aims to provide a new means for increasing the concentration of butyric acid in the intestine.
  • the inventors discovered that by administering or ingesting a combination of lactic acid-producing bacteria and Anaerostipes butyric acid-producing bacteria, the amount of butyric acid produced by Anaerostipes butyric acid-producing bacteria in the intestines can be increased.
  • a composition comprising lactic acid-producing bacteria and butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes.
  • [11a] A method for increasing butyric acid concentration in the intestine of a subject, comprising administering to the subject lactic acid-producing bacteria and butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes.
  • [11b] The method according to [11a], wherein the butyric acid-producing bacterium is Anaerostipes caccae.
  • [11c] The method according to [11a] or [11b], wherein the lactic acid-producing bacteria are spore-forming bacteria.
  • [11d] The method according to any one of [11a] to [11c], wherein the lactic acid-producing bacterium is Weizmannia coagulans.
  • [11e] The method according to any one of [11a] to [11d], wherein the administration is oral administration.
  • [11f] The method according to any one of [11a] to [11e], wherein the subject is a non-human animal.
  • [11g] The method according to any one of [11a] to [11e], wherein the subject is a human.
  • [11i] Any of the methods [11a] to [11g], which is a method for immunomodulation.
  • [11j] Any of the methods [11a] to [11g], which is a method for improving allergies.
  • [12a] A method for increasing butyric acid concentration in the intestine of a subject, comprising having the subject ingest lactic acid-producing bacteria and Anaerostipes butyric acid-producing bacteria.
  • [12b] The method according to [12a], wherein the butyric acid-producing bacterium is Anaerostipes caccae.
  • [12c] The method according to [12a] or [12b], wherein the lactic acid-producing bacteria are spore-forming bacteria.
  • [12d] The method according to any one of [12a] to [12c], wherein the lactic acid-producing bacterium is Weizmannia coagulans.
  • [12e] The method according to any one of [12a] to [12d], wherein the ingestion is oral administration.
  • the present invention provides a new means for increasing the concentration of butyric acid in the intestine.
  • Figure 1 is a graph showing the results of analyzing the butyrate concentration in the culture medium after co-administration of lactic acid-producing bacteria (Weizmannia coagulans) and butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes (Anaerostipes caccae) or butyric acid-producing bacteria (Clostridium butyricum) to an in vitro fecal culture system using feces from patients with ulcerative colitis. Controls included either no bacteria (Control) or one of the bacteria added alone.
  • Figure 2 is a graph showing the results of analyzing the occupancy rate of lactic acid-producing bacteria in the bacterial flora after co-administration and cultivation of lactic acid-producing bacteria (Weizmannia coagulans) and butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes (Anaerostipes caccae) or butyric acid-producing bacteria (Clostridium butyricum) in an in vitro fecal culture system using feces from patients with ulcerative colitis. As controls, either no bacteria was added (Control) or either bacteria was added alone.
  • lactic acid-producing bacteria Weizmannia coagulans
  • butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes Anaerostipes
  • butyric acid-producing bacteria Clostridium butyricum
  • Figure 3 is a graph showing the results of analyzing the occupancy rate of Bifidobacterium bacteria in the bacterial flora after co-administration and cultivation of lactic acid-producing bacteria (Weizmannia coagulans) and butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes (Anaerostipes caccae) or butyric acid-producing bacteria (Clostridium butyricum) in an in vitro fecal culture system using feces from patients with ulcerative colitis. As controls, either no bacteria was added (Control) or either bacteria was added alone.
  • the present invention relates to a composition containing lactic acid-producing bacteria and butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes.
  • lactic acid-producing bacteria refers to intestinal bacteria capable of assimilating sugars to produce lactic acid.
  • Lactic acid-producing bacteria that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they are capable of producing lactic acid in the intestine, but are preferably spore-forming bacteria (sometimes also called “spore-forming bacteria”).
  • Spore-forming lactic acid-producing bacteria are bacteria that form spores (sometimes called "spores"), and are highly resistant to dryness, heat, and acid. When administered orally, they are preferred because they reach the intestine without being killed by gastric acid or bile acid, germinate, become vegetative cells, and further grow to produce lactic acid.
  • bacteria belonging to the Weizmannia (Bacillus) genus include, but are not limited to, Weizmannia coagulans (sometimes referred to as "Bacillus coagulans"), Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, and Bacillus cereus.
  • bacteria belonging to the genus Lactobacillus include, but are not limited to, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus gaseli, and Lactobacillus plantrum.
  • bacteria belonging to the genus Bifidobacterium include, but are not limited to, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, and Bifidobacterium pseudocatenulatum.
  • bacteria belonging to the genus Enterococcus include, but are not limited to, Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium.
  • Weizmannia coagulans is a particularly preferred lactic acid-producing bacterium that can be used in the present invention.
  • Weizmannia coagulans include Weizmannia coagulans strains SANK70258, P-22, lilac-01, SIM-7 DSM14043, C101, NBRC12583, GBI-1, GBI-20, GBI-30, and GBI-40, with Weizmannia coagulans strain SANK70258 being preferred in terms of stable supply and ease of acquisition.
  • mutant strains derived from these strains may also be used as long as they have the effect of promoting butyric acid production in butyric acid-producing bacteria of the genus Anaerostipes.
  • Weizmannia coagulans isolated from animal (preferably human) feces or commercially available products can be used.
  • Commercially available Weizmannia coagulans products include, for example, Mitsubishi Chemical Corporation's "Lacris (registered trademark)-S,” “Lacris (registered trademark)-S Granules,” “Lacris (registered trademark)-15,” and “Feed Lacris (registered trademark)-10,” as well as products from Kerry Inc., SABINSA, Aterio Bio, UNIQUEBIOTECH, Asahi Biocycle, and others.
  • the "lactic acid-producing bacteria” may be in the form of spores, vegetative cells, mixtures thereof, cultures containing them, culture solutions, and extracts thereof. Furthermore, in the present invention, the “lactic acid-producing bacteria” may be in any form, such as powder, granules, or liquid.
  • butyric acid-producing bacteria refers to intestinal bacteria capable of assimilating lactic acid to produce butyric acid.
  • the butyric acid-producing bacteria that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they are capable of producing butyric acid in the intestine, but preferably include those belonging to the genus Anaerostipes.
  • Butyric acid-producing bacteria belonging to the genus Anaerostipes are preferred because they can improve butyric acid production when combined with the above-mentioned lactic acid-producing bacteria and do not inhibit the growth of other intestinal bacteria (such as the above-mentioned lactic acid-producing bacteria and bifidobacteria).
  • butyric acid-producing bacteria belonging to the genus Anaerostipes are spore-forming bacteria that are highly resistant to desiccation, heat, and acid. When orally administered, they are preferred because they reach the intestine, germinate, become vegetative cells, and further grow to produce butyric acid without being killed by gastric acid or bile acid.
  • examples of butyric acid-producing bacteria belonging to the genus Anaerostipes include, but are not limited to, Anaerostipes caccae, Anaerostipes hadrus, Anaerostipes butyraticus, Anaerostipes hominis, Anaerostipes rhamnosivorans, and Anaerostipes amylophilus.
  • Anaerostipes caccae is particularly preferred as a butyric acid-producing bacterium that can be used in the present invention.
  • Examples of Anaerostipes caccae include DSM14662 strain, L1-92 strain, P127-A10a strain, 3_2_56FAA strain, and mgYG-HGUT-00080 strain. Mutant strains derived from these strains may also be used, as long as they have the effect of improving butyric acid production when combined with the above-mentioned lactic acid-producing bacteria.
  • Anaerostipes caccae may be commercially available or may be isolated from animal (preferably human) feces.
  • the butyric acid-producing bacteria can be used in the form of spores, vegetative cells, mixtures thereof, as well as cultures containing them, culture solutions, and extracts thereof.
  • the butyric acid-producing bacteria can be in any form, such as powder, granules, or liquid.
  • the content of lactic acid-producing bacteria in the composition of the present invention is preferably as high as possible, for example, 1 x 103 cfu/g or more, preferably 1 x 104 cfu/g or more, more preferably 1 x 105 cfu/g or more, even more preferably 1 x 106 cfu/g or more, and particularly preferably 1 x 107 cfu /g or more.
  • the content can be, for example, 1 x 1010 cfu/g or less, preferably 1 x 109 cfu/g or less, and more preferably 1 x 108 cfu/g or less.
  • the content of butyric acid-producing bacteria in the composition of the present invention is preferably as high as possible, for example, 1 x 103 cfu/g or more, preferably 1 x 104 cfu/g or more, more preferably 1 x 105 cfu/g or more, even more preferably 1 x 106 cfu/g or more, and particularly preferably 1 x 107 cfu/g or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but can be 1 x 1010 cfu/g or less, preferably 1 x 109 cfu/g or less, and more preferably 1 x 108 cfu/g or less.
  • composition of the present invention may be in any form that allows the lactic acid-producing bacteria and butyric acid-producing bacteria to be delivered to the intestine, and is not particularly limited. However, from the standpoint of ease of administration or ingestion, an oral composition is preferred.
  • oral compositions include, but are not limited to, foods, beverages, food and beverage additives, supplements, feed, feed additives, and pharmaceuticals (including quasi-drugs).
  • Food includes health foods, functional foods, health foods (foods for specified health uses, foods with nutrient functions, foods with functional claims, etc.), health supplements, nutritional supplements, etc.
  • the form of the food can be selected appropriately, such as solid, liquid, or paste.
  • the "supplement” may be in any form, including, but not limited to, tablets, granules, powders, sugar-coated tablets, capsules, syrups, suspensions, liquids, emulsions, etc. Furthermore, to protect the lactic acid-producing bacteria and butyric acid-producing bacteria from stomach acid and bile acid and allow them to act in the intestines, they may be in the form of an enteric-coated formulation with a coating that differs in solubility at different pH levels.
  • Fee includes feed for livestock or pets, and its form can be selected appropriately, such as solid, liquid, or paste.
  • Food and beverage additives can be used as additives for food and beverages.
  • Food additives can be used as additives for livestock or pet feed. These may be in any form, including tablets, granules, powders, sugar-coated tablets, capsules, syrups, suspensions, liquids, emulsions, etc.
  • “Pharmaceuticals (including quasi-drugs)” may be in any form, including, but not limited to, tablets, granules, powders, sugar-coated tablets, capsules, syrups, suspensions, liquids, emulsions, etc.
  • Liquid preparations such as liquid preparations and suspensions may be provided in a freeze-dried and storable state, and may be dissolved in a buffer solution containing water or saline solution at the time of use to adjust to an appropriate concentration before use.
  • Solid dosage forms such as tablets may be coated as needed (e.g., sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, etc.), or may be formulated into controlled-release formulations such as sustained-release, delayed-release, or immediate-release formulations using known technology.
  • enteric-coated formulations may be coated with a coating that differs in solubility at different pH levels to protect lactic acid-producing bacteria and butyric acid-producing bacteria from gastric acid and bile acid and allow them to act in the intestine.
  • composition of the present invention may optionally contain other components commonly used in the production of the intended form of use in amounts appropriate to the desired form of use, as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • Such other components include, but are not limited to, sugars, excipients, disintegrants, lubricants, binders, diluents, buffers, suspending agents, thickeners, preservatives, antibacterial agents, antiseptics, antioxidants, UV absorbers, colorants, pigments, dyes, pigments, lubricants, plasticizers, solvents, solubilizers, isotonicity agents, seasonings, flavorings, vitamins, pH adjusters, and chelating agents.
  • compositions of the present invention are administered or ingested include humans and non-human animals (mammals (e.g., primates (monkeys, chimpanzees, etc.), livestock (cows, horses, pigs, sheep, etc.), pets (dogs, cats, etc.), laboratory animals (mice, rats, etc.)), birds, reptiles, etc.), but humans and non-human mammals are preferred, and humans are particularly preferred.
  • mammals e.g., primates (monkeys, chimpanzees, etc.)
  • livestock cows, horses, pigs, sheep, etc.
  • pets dogs, cats, etc.
  • laboratory animals mice, rats, etc.
  • the dosage or intake of the composition of the present invention is not particularly limited and can be set appropriately depending on the type, age, and daily age of the subject. For example, it can be administered or ingested at least once per day, preferably 1 to 5 times per day.
  • the composition of the present invention can be effective in small amounts and for a short period of time, but can also be administered or ingested continuously or over a long period of time.
  • the composition of the present invention can be administered or ingested for two or more consecutive days, preferably ten or more days, and more preferably thirty or more days, and can also be administered or ingested continuously for one month or more, two or more months, six or more months, one year or more, or longer.
  • composition of the present invention has an intestinal regulating effect and can be used as an intestinal regulator.
  • composition of the present invention has the above-mentioned effects, it can be used in a method for increasing butyric acid concentration in the intestines of a subject and/or in a method for regulating the intestines of a subject.
  • the composition of the present invention can also be used for immunomodulation and/or allergy improvement.
  • administering or ingesting the composition of the present invention to a subject, it is possible to increase the amount of butyrate produced by butyric acid bacteria in the intestine and increase the butyric acid concentration in the intestine, compared to when the composition of the present invention is not administered or ingested, or when lactic acid-producing bacteria or Anaerostipes butyric acid-producing bacteria are administered or ingested alone.
  • Butyric acid produced in the intestines is taken up by the body and acts on immune system cells, promoting effects such as immunomodulation and/or allergy improvement (Siddiqui MT et al., "The Immunomodulatory Functions of Butyrate.” J Inflamm Res. 2021 Nov 18;14:6025-6041; Theiler A et al., "Butyrate ameliorates allergic airway inflammation by limiting eosinophil trafficking and survival.” J Allergy Clin Immunol. 2019 Sep;144(3):764-776).
  • the composition of the present invention has an effect of immunomodulating and/or allergy improvement, and can be used as an immunomodulator and/or allergy improvement agent.
  • Form immunomodulation refers to the function of activating stable or suppressed immune function (immunostimulating activity), or the function of suppressing excessive or over-reactive immune function to an appropriate level (immunosuppressive activity), and includes, for example, those that aim to stabilize the overall balance of the immune response by controlling immune cells such as T cells, B cells, and macrophages.
  • Allergy amelioration refers to the suppression of immune responses harmful to the host due to the physiological state of protective immunity. Common allergies are caused by, for example, IgE-mediated immediate-type hypersensitivity and T cell-mediated delayed-type hypersensitivity. Allergic activities include allergic rhinitis, allergic asthma, food allergies, allergic dermatitis, allergic eye disease, and anaphylaxis. Allergy amelioration refers to the stimulation of immune activity that reverses the above-mentioned allergic symptoms.
  • Th-2-mediated immunity examples include blocking Th-2-mediated immunity, reducing Th-2-mediated cytokine (IL-4, IL-5, IL-13) production, increasing Th-1-mediated cytokine (IFN- ⁇ ), and inhibiting the activation or differentiation of IgE + memory B cells and eosinophils.
  • Feces serving as the inoculum for the intestinal microbiota were collected from seven patients with ulcerative colitis on the day of culture. After collection, the fecal samples were stored in anaerobic culture swabs (212550 BD BBL Culture Swab; Becton, Tickinson & Company) and transported to the laboratory.
  • anaerobic culture swabs 212550 BD BBL Culture Swab; Becton, Tickinson & Company
  • feces 0.5 g was added to 2 mL of 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS) buffer (pH 6.5, consisting of a 68.5:31.5 (molar ratio) mixture of 0.1 M NaH2PO4 and 0.1 M Na2HPO4 ) supplemented with 1.0% L-ascorbic acid (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • jar medium GAM medium [Code 05422] (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.): 59 g/L and antifoaming agent: 50 ⁇ L/L were mixed to prepare a medium. 100 mL of the medium was added to a jar fermentor (manufactured by Able Co., Ltd., BJR-25NAIS-8M, hereinafter sometimes abbreviated as jar) with a capacity of approximately 250 mL, and sterilized in an autoclave at 115°C for 15 minutes.
  • jar fermentor manufactured by Able Co., Ltd., BJR-25NAIS-8M, hereinafter sometimes abbreviated as jar
  • Clostridium butyricum and bacterial cell collection RCM medium were placed in a glass vial with a butyl rubber stopper, which was then sealed and sterilized. Filter-sterilized anaerobic gas was bubbled through the medium to create an anaerobic condition.
  • Clostridium butyricum ATCC19398, was inoculated into the vial. The culture temperature was maintained at 37°C, and the culture was allowed to stand anaerobically for 18 hours to collect bacterial cells.
  • the culture medium harvested 48 hours after the start of cultivation was used to measure the concentrations of organic acids (short-chain fatty acids: acetic acid, propionic acid, and butyric acid).
  • the filtrate obtained by filtering the culture medium was subjected to high-performance liquid chromatography (HPLC) (Shimadzu Corporation) equipped with an Aminex HPX-87H column (Bio-Rad Laboratories) and a RID-10A refractive index detector (Shimadzu Corporation) to measure the amounts of butyric acid, propionic acid, and acetic acid.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • the HPLC was operated at 65°C with a flow rate of 0.6 mL/min using 5 mM H2SO4 as the mobile phase.
  • Genomic DNA of the bacterial flora was extracted from the culture medium collected at various times before and after the start of cultivation.
  • the V3-V4 region of the bacterial 16S rRNA gene was amplified from the extracted genomic DNA and sequenced using a next-generation sequencer to perform bacterial diversity and bacterial composition analyses. The procedure is as follows:
  • the bacterial 16S rRNA gene was amplified using the extracted genomic DNA as a template with the primer pair S-D-Bact-0341-b-S-17 (SEQ ID NO: 1) and S-D-Bact-0785-a-A-21 (SEQ ID NO: 2).
  • An Illumina adapter overhang nucleotide sequence (Illumina, Inc.) was added to the gene-specific sequence. PCR cycling reactions were performed according to the manufacturer's instructions.
  • the confirmed amplicons were purified using AMPure XP DNA purification beads (Beckman Coulter, Inc.) and eluted in 25 ⁇ l of 10 mM Tris (pH 8.5).
  • the amplicons were quantified using an Agilent Bioanalyzer 2100 DNA 1000 chip (Agilent Technologies, Inc.) and pooled at equimolar concentrations.
  • the 16S rRNA gene product (along with an internal control (PhiX control V3; Illumina)) was subjected to paired-end sequencing using a MiSeq sequencer (Illumina) with a 600-cycle MiSeq reagent kit (Illumina).
  • Paired-end reads with a Q score of 20 or higher were extracted from PhiX sequences using Basespace Sequence Hub (https://basespace.illumina.com/) and merged using QIIME 2 version 2022.11.
  • Basespace Sequence Hub https://basespace.illumina.com/
  • QIIME 2 version 2022.11 After quality control and correction using the DADA2 pipeline, OTUs were inferred. Alpha diversity was estimated using the resulting OTUs, and the Shannon index was calculated. The resulting OTUs were then classified using a naive Bayes classifier trained on the Silva 138_99% OTU full-length sequence database for bacterial species assignment. Using Excel (Microsoft Japan Co., Ltd.), the relative occupancy rate of each bacterial group was calculated from the bacterial species classification data.

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Abstract

本発明は、本発明は、腸内の酪酸濃度を増加させることが可能な新たな手段を提供することを目的とするものであり、乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を含む組成物を提供する。

Description

乳酸産生菌及び酪酸産生菌を含む整腸用組成物
　本発明は、乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を含む組成物に関する。
　酪酸は短鎖脂肪酸の一種であり、ヒトや動物の生体内においては、腸管バリア機能の強化や抗炎症作用等をはじめ、腸内の調子を整えるのに重要な役割を果たしている。このため、整腸を目的として酪酸を投与又は摂取することが試みられているが、酪酸は非常に強い不快臭を有することから、酪酸自体を投与又は摂取することは容易ではない。一方、ヒトや動物の腸内には酪酸産生菌が存在し、この菌は腸内において酪酸を生成することができる。このため、酪酸産生菌を利用して、腸内の酪酸濃度を増加させる取り組みがなされており、例えば、特許文献１には、芽胞菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を利用して酪酸菌（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を増加させる腸内酪酸産生菌増加剤が開示され、また、特許文献２には、Ｄ－マンニトールまたはＤ－ソルビトールを有効成分とする腸内酪酸濃度上昇作用を有する食品組成物が開示され、ヒトや動物に投与又は摂取させることが記載されている。また、非特許文献１には、乳酸産生菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ　ＳＡＮＫ７０２５８）は、健常人の微生物叢モデルにおいて、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科に関連する細菌を増加させ、それによって酪酸産生を促進したことが開示されている。
　しかしながら、腸内の酪酸濃度を増加させる取り組みは未だ十分ではなく、当該分野においては、腸内の酪酸濃度を増加させることが可能な新たな手法が切望されている。
　Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌である、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅは、乳酸を利用して酪酸を産生できる菌としてヒト糞便中より単離された菌である（非特許文献２）。
特開２０１３－１４７４６９号公報 特開２００４－４９０９３号公報
Ｋ．Ｓａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２０　Ｍａｙ；１０４（９）：３８５９－３８６７． Ｓ．Ｈ．Ｄｕｎｃａｎら、Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４　Ｏｃｔ；７０（１０）：５８１０－７．
　本発明は、腸内の酪酸濃度を増加させることが可能な新たな手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、乳酸産生菌とＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌とを組み合わせて投与又は摂取することによって、腸内においてＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌による酪酸生成量を高められることを見出した。
　本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］　乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を含む組成物。
［２］　前記酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅである、［１］の組成物。
［３］　前記乳酸産生菌が、芽胞形成菌である、［１］又は［２］の組成物。
［４］　前記乳酸産生菌が、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓである、［１］～［３］のいずれかの組成物。
［５］　経口組成物である、［１］～［４］のいずれかの組成物。
［６］　食品、飲料、サプリメント、飼料、飼料添加物、又は医薬である、［１］～［５］のいずれかの組成物。
［７］　腸内における酪酸濃度を増大させるために用いられる、［１］～［６］のいずれかの組成物。
［８］　整腸用である、［１］～［７］のいずれかの組成物。
［９］　免疫調節のために用いられる、［１］～［７］のいずれかの組成物。
［１０］　アレルギー改善のために用いられる、［１］～［７］のいずれかの組成物。
［１１ａ］　乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を、対象に投与することを含む、前記対象の腸内における酪酸濃度を増大させるための方法。
［１１ｂ］　前記酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅである、［１１ａ］の方法。
［１１ｃ］　前記乳酸産生菌が、芽胞形成菌である、［１１ａ］又は［１１ｂ］の方法。
［１１ｄ］　前記乳酸産生菌が、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓである、［１１ａ］～［１１ｃ］のいずれかの方法。
［１１ｅ］　前記投与が経口投与である、［１１ａ］～［１１ｄ］のいずれかの方法。
［１１ｆ］　前記対象が非ヒト動物である、［１１ａ］～［１１ｅ］のいずれかの方法。
［１１ｇ］　前記対象がヒトである、［１１ａ］～［１１ｅ］のいずれかの方法。
［１１ｈ］　整腸方法である、［１１ａ］～［１１ｇ］のいずれかの方法。
［１１ｉ］　免疫調節のための方法である、［１１ａ］～［１１ｇ］のいずれかの方法。
［１１ｊ］　アレルギー改善のための方法である、［１１ａ］～［１１ｇ］のいずれかの方法。
［１２ａ］　乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を、対象に摂取させることを含む、前記対象の腸内における酪酸濃度を増大させるための方法。
［１２ｂ］　前記酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅである、［１２ａ］の方法。
［１２ｃ］　前記乳酸産生菌が、芽胞形成菌である、［１２ａ］又は［１２ｂ］の方法。
［１２ｄ］　前記乳酸産生菌が、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓである、［１２ａ］～［１２ｃ］のいずれかの方法。
［１２ｅ］　前記摂取が経口投与である、［１２ａ］～［１２ｄ］のいずれかの方法。
［１２ｆ］　前記対象が非ヒト動物である、［１２ａ］～［１２ｅ］のいずれかの方法。
［１２ｇ］　前記対象がヒトである、［１２ａ］～［１２ｅ］のいずれかの方法。
［１２ｈ］　整腸方法である、［１２ａ］～［１２ｇ］のいずれかの方法。
［１２ｉ］　免疫調節のための方法である、［１２ａ］～［１２ｇ］のいずれかの方法。
［１２ｊ］　アレルギー改善のための方法である、［１２ａ］～［１２ｇ］のいずれかの方法。
［１３ａ］　腸内における酪酸濃度を増大させるための組成物の製造における乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌の使用。
［１３ｂ］　前記酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅである、［１３ａ］の使用。
［１３ｃ］　前記乳酸産生菌が、芽胞形成菌である、［１３ａ］又は［１３ｂ］の使用。
［１３ｄ］　前記乳酸産生菌が、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓである、［１３ａ］～［１３ｃ］の使用。
［１３ｅ］　前記組成物が経口剤である、［１３ａ］～［１３ｄ］のいずれかの使用。
［１３ｆ］　前記組成物が整腸剤である、［１３ａ］～［１３ｅ］のいずれかの使用。
［１３ｇ］　前記組成物が免疫調節剤である、［１３ａ］～［１３ｅ］のいずれかの使用。
［１３ｈ］　前記組成物がアレルギー改善剤である、［１３ａ］～［１３ｅ］のいずれかの使用。
　本明細書は本願の優先権の基礎である２０２４年２月２８日に出願された日本国特許出願２０２４－０２８５８１号の明細書等に記載される内容を包含する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
　本発明によれば、腸内の酪酸濃度を増加させることが可能な新たな手段を提供することができる。
図１は、潰瘍性大腸炎患者の糞便を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ糞便培養系に、乳酸産生菌（Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）とＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ）又は酪酸産生菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）とを共投与し培養した後の、培地中の酪酸濃度を解析した結果を示すグラフ図である。対照には、いずれの菌も添加しない（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、又はいずれかの菌を単独で添加したものを用いた。 図２は、潰瘍性大腸炎患者の糞便を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ糞便培養系に、乳酸産生菌（Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）とＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ）又は酪酸産生菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）とを共投与し培養した後の、菌叢における乳酸産生菌の占有率を解析した結果を示すグラフ図である。対照には、いずれの菌も添加しない（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、又はいずれかの菌を単独で添加したものを用いた。 図３は、潰瘍性大腸炎患者の糞便を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ糞便培養系に、乳酸産生菌（Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）とＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ）又は酪酸産生菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）とを共投与し培養した後の、菌叢におけるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の占有率を解析した結果を示すグラフ図である。対照には、いずれの菌も添加しない（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、又はいずれかの菌を単独で添加したものを用いた。
　本発明は、乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を含む組成物に関する。
　本発明において「乳酸産生菌」とは、糖類を資化して乳酸を生成することが可能な腸内細菌を意味する。本発明において利用可能な乳酸産生菌としては、腸内において乳酸を生成することが可能であればよく、特に限定されるものではないが、好ましくは芽胞形成菌（「有胞子性菌」とも称される場合がある）である。芽胞形成菌である乳酸産生菌は、芽胞（「胞子」とも称される場合がある）を形成する菌であり、乾燥、熱、及び酸に対する耐性が強く、経口投与された場合に、胃酸や胆汁酸で死滅することなく腸に到達して発芽し、栄養細胞となり、さらに増殖して乳酸を生成することができ好ましい。
　本発明において利用可能な乳酸産生菌としてより好ましくは、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属等に属するものが挙げられるが、これらに限定はされない。Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）に属する菌の例としては、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ（「Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ」と称される場合もある）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ等が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する菌の例としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｉｌｌｕｓ　ｇａｃｅｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔｒｕｍ等が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌の例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ等が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する菌の例としては、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　本発明において利用可能な乳酸産生菌として特に好ましくは、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓである。Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓとしては、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓのＳＡＮＫ７０２５８株、Ｐ－２２株、ｌｉｌａｃ－０１株、ＳＩＭ－７　ＤＳＭ１４０４３株、Ｃ１０１株、ＮＢＲＣ１２５８３株、ＧＢＩ－１株、ＧＢＩ－２０株、ＧＢＩ－３０株、ＧＢＩ－４０株等が挙げられ、中でもＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓのＳＡＮＫ７０２５８株が供給の安定性、入手の容易性の点から好ましい。また、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌における酪酸産生を促進する効果を有するものであれば、これらの菌株由来の変異株であってよい。また、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓは、動物（好ましくはヒト）の糞便より単離したものや、市販のものを用いることができる。Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓの市販品としては、例えば、三菱ケミカル株式会社「ラクリス（登録商標）－Ｓ」、「ラクリス（登録商標）－Ｓ顆粒」、「ラクリス（登録商標）－１５」、及び「飼料用ラクリス（登録商標）－１０」、並びにＫｅｒｒｙ　Ｉｎｃ．社、ＳＡＢＩＮＳＡ社、アテリオバイオ社、ＵＮＩＱＵＥＢＩＯＴＥＣＨ社、アサヒバイオサイクル社等の製品が挙げられる。
　本発明において「乳酸産生菌」の状態は、芽胞、栄養細胞、およびそれらの混合物、ならびにそれらを含む培養物、培養液、およびそれらの抽出物の状態で用いることができる。また、本発明において「乳酸産生菌」の形態は、粉末状、顆粒状又は液状等のいずれの形態であってもよい。
　本発明において「酪酸産生菌」とは、乳酸を資化して酪酸を生成することが可能な腸内細菌を意味する。本発明において利用可能な酪酸産生菌としては、腸内において酪酸を生成することが可能であればよく、特に限定されるものではないが、好ましくはＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属に属するものが挙げられる。Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属に属する酪酸産生菌は、上記乳酸産生菌との組み合わせにおいて酪酸産生を向上させることが可能であり、かつ他の腸内細菌（例えば上記乳酸産生菌やビフィズス菌等）の生育を抑制しないことから好ましい。また、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属に属する酪酸産生菌は芽胞形成菌であり、乾燥、熱、及び酸に対する耐性が強く、経口投与された場合に、胃酸や胆汁酸で死滅することなく腸に到達して発芽し、栄養細胞となり、さらに増殖して酪酸を生成することができ好ましい。
　本発明において、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属に属する酪酸産生菌の例としては、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｂｕｔｙｒａｔｉｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈｏｍｉｎｉｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｒｈａｍｎｏｓｉｖｏｒａｎｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　本発明において利用可能な酪酸産生菌として特に好ましくは、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅである。Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅとしては、ＤＳＭ１４６６２株、Ｌ１－９２株、Ｐ１２７－Ａ１０ａ株、３＿２＿５６ＦＡＡ株、ｍｇＹＧ－ＨＧＵＴ－０００８０株等が挙げられる。また、上記乳酸産生菌との組み合わせにおいて酪酸産生を向上させる効果を有するものであれば、これらの菌株由来の変異株であってよい。また、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅは、市販のものや、動物（好ましくはヒト）の糞便より単離したもの用いることができる。
　本発明において酪酸産生菌の状態は、芽胞、栄養細胞、およびそれらの混合物、ならびにそれらを含む培養物、培養液、およびそれらの抽出物の状態で用いることができる。また、本発明において酪酸産生菌の形態は、粉末状、顆粒状又は液状等のいずれの形態であってもよい。
　本発明の組成物における乳酸産生菌の含有量は、酪酸産生菌の酪酸産生を向上させる観点から、本発明の組成物における乳酸産生菌の含有量は多い程好ましく、例えば、１×１０３ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは１×１０４ｃｆｕ／ｇ以上、より好ましくは１×１０５ｃｆｕ／ｇ以上、さらに好ましくは１×１０６ｃｆｕ／ｇ以上、特に好ましくは１×１０７ｃｆｕ／ｇ以上であり、その上限は特に限定されないが、例えば、１×１０１０ｃｆｕ／ｇ以下、好ましくは１×１０９ｃｆｕ／ｇ以下、より好ましくは１×１０８ｃｆｕ／ｇ以下とすることができる。
　本発明の組成物における酪酸産生菌の含有量は、酪酸産生を高める観点から、本発明の組成物における酪酸産生菌の含有量は多い程好ましく、例えば、１×１０３ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは１×１０４ｃｆｕ／ｇ以上、より好ましくは１×１０５ｃｆｕ／ｇ以上、さらに好ましくは１×１０６ｃｆｕ／ｇ以上、特に好ましくは１×１０７ｃｆｕ／ｇ以上であり、その上限は特に限定されないが、１×１０１０ｃｆｕ／ｇ以下、好ましくは１×１０９ｃｆｕ／ｇ以下、より好ましくは１×１０８ｃｆｕ／ｇ以下とすることができる。
　本発明の組成物において、乳酸産生菌とＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌とは、同一の組成物中に含まれた形態としてもよいし、あるいは各菌がそれぞれ別々に準備された別個の組成物中に含まれ併用投与又は併用摂取に適した単一のパッケージとして製造・包装・流通される形態としてもよい。各菌がそれぞれ別個の組成物中に含まれる場合、「併用投与」又は「併用摂取」とは、各菌を同時に投与又は摂取する場合だけではなく、腸内において両菌が存在し、酪酸産生菌の酪酸産生を向上させることができる限り、各菌をそれぞれ所定の間隔で、順次投与又は摂取する場合（投与又は摂取の順序は限定されない）も含まれる。
　本発明の組成物の形態は、乳酸産生菌及び酪酸産生菌を腸内へ送達することが可能な任意の形態とすることができ、特に限定されるものではないが、投与又は摂取の容易性の観点から経口組成物の形態が好ましい。
　本発明において経口組成物は、具体的には食品、飲料、飲食品用添加剤、サプリメント、飼料、飼料用添加剤、医薬品（医薬部外品を含む）等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　「食品」には、健康食品、機能性食品、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）、健康補助食品、栄養補助食品等が含まれる。また、食品の形状は固形、液状又はペースト状等、適宜選択することができる。
　「飲料」には、清涼飲料水、乳飲料、アルコール飲料等が含まれる。
　「サプリメント」はどのような形状であってもよく、錠剤、顆粒剤、散剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁剤、液剤、乳剤等が挙げられるがこれらに限定されない。また、乳酸産生菌及び酪酸産生菌を胃酸や胆汁酸から保護し、腸において作用させるため、異なるｐＨに対して溶解性に差異のあるコーティングが施された腸溶剤としてもよい。
　「飼料」は、家畜用、又はペット用の飼料を含み、その形状は固形、液状又はペースト状等、適宜選択することができる。
　「飲食品用添加剤」は、飲食品の添加剤として使用することができる。また、「飼料用添加剤」は家畜用、又はペット用の飼料の添加剤として使用できる。またこれらは、どのような形状であってもよく、錠剤、顆粒剤、散剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁剤、液剤、乳剤等であってよい。
　「医薬品（医薬部外品を含む）」はどのような形状であってもよく、錠剤、顆粒剤、散剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁剤、液剤、乳剤等が挙げられるがこれらに限定されない。液剤、懸濁剤などの液体製剤は、凍結乾燥化し保存し得る状態で提供され、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用されるものであってもよい。また錠剤等の固形の剤形を有するものは、必要に応じてコーティングを施されていてもよいし（例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠等）、公知の技術を使用して、徐放性製剤、遅延放出製剤又は即時放出製剤などの放出が制御された製剤としてもよい。また、乳酸産生菌及び酪酸産生菌を胃酸や胆汁酸から保護し、腸において作用させるため、異なるｐＨに対して溶解性に差異のあるコーティングが施された腸溶剤としてもよい。
　本発明の組成物には、上記乳酸産生菌及び酪酸産生菌に加えて、必要に応じてさらに、目的とする利用形態の製造において通常用いられている成分を、本発明の効果を損なわない範囲で、所望の利用形態に応じた量にて適宜配合することができる。このようなその他の成分としては、例えば、糖類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、懸濁化剤、増粘剤、保存剤、抗菌剤、防腐剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、着色剤、顔料、染料、色素、潤滑剤、可塑剤、溶剤、溶解補助剤、等張化剤、調味料、矯味矯臭剤、ビタミン類、ｐＨ調整剤、キレート剤等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　本発明の組成物を投与又は摂取する対象は、ヒトならびに非ヒト動物（哺乳動物（例えば霊長類（サル、チンパンジー等）、家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等）、ペット（イヌ、ネコ等）、実験動物（マウス、ラット等））、鳥類、爬虫類等）が挙げられるが、好ましくはヒトならびに非ヒト動物の哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。
　本発明の組成物の投与量又は摂取量は、特に限定されず、対象の種類、年齢、日齢等に応じて適宜設定することができ、例えば、少なくとも１回／日、好ましくは１～５回／日の回数で投与又は摂取することができる。本発明の組成物は、微量かつ短期間で効果を奏することができるが、連続的又は長期間にわたって投与又は摂取することができる。例えば、本発明の組成物を、連続して２日以上、好ましくは１０日以上、より好ましくは３０日以上投与又は摂取することができ、また、１か月以上、２か月以上、６ヶ月以上、１年以上、又はそれ以上の期間にわたって継続して投与又は摂取することができる。
　本発明の組成物は、対象に投与又は摂取させることにより、本発明の組成物を投与又は摂取されない場合、あるいは、乳酸産生菌又はＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を単独で投与又は摂取した場合と比べて、腸内における酪酸菌の酪酸生成量を高め、腸内の酪酸濃度を増加させることができる。腸内において生成された酪酸は、腸内を弱酸性にすることで腸内環境を整え、乳酸菌やビフィズス菌等の所謂、善玉菌が住みやすい環境を作るとともに、悪玉菌が発育することを抑制することができ、また、腸管バリア機能の強化、カルシウムやマグネシウム等のミネラル吸収の向上、抗炎症作用等の生理的効果を促すことができ、対象の腸の調子を整えることができる。すなわち、本発明の組成物は、整腸作用を有し、整腸剤として利用することができる。
　本発明の組成物は、上述の効果を有することから、対象の腸内における酪酸濃度を増大させる方法、ならびに／あるいは、対象における整腸方法に用いることができる。
　また、本発明の組成物は、免疫調節のため及び／またはアレルギー改善のために用いることができる。本発明の組成物は、対象に投与又は摂取させることにより、本発明の組成物を投与又は摂取されない場合、あるいは、乳酸産生菌又はＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を単独で投与又は摂取した場合と比べて、腸内における酪酸菌の酪酸生成量を高め、腸内の酪酸濃度を増加させることができる。腸内において生成された酪酸は体内に取り込まれて免疫系の細胞に作用し、免疫調節及び／またはアレルギー改善等の効果を促すことができる（Siddiqui MTら、「The Immunomodulatory Functions of Butyrate.」 J Inflamm Res. 2021 Nov 18;14:6025-6041.; Theiler Aら、「Butyrate ameliorates allergic airway inflammation by limiting eosinophil trafficking and survival.」 J Allergy Clin Immunol. 2019 Sep;144(3):764-776.）。すなわち、本発明の組成物は、免疫調節のため及び／またはアレルギー改善のための作用を有し、免疫調節剤及び／またはアレルギー改善剤として利用することができる。
　「免疫調節のため」とは、安定的または抑制された免疫機能を活性化する機能（免疫賦活活性）、または免疫機能の超過または過剰反応を適切なレベルにまで抑制する機能（免疫抑制活性）を指し、例えば免疫細胞であるＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等を制御して免疫応答の全体的バランスを安定化することを目的とするものを含む。
　「アレルギー改善のため」とは、防御免疫の生理状態による宿主に有害な免疫応答抑制するものを指し、一般的なアレルギーは、例えばＩｇＥ媒介性即時型過敏症とＴ細胞媒介性遅延型過敏症によって引き起こされるものである。アレルギー活性はアレルギー性鼻炎、アレルギー性ぜんそく、食品アレルギー、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性眼疾患、およびアナフィラキシーなどが挙げられる。アレルギー改善とは、上記のアレルギー性症状を逆行させる免疫活性を刺激することを指す。例えば、Ｔｈ－２媒介性免疫のブロック、Ｔｈ－２媒介性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）産生の減少、Ｔｈ－１媒介性サイトカイン（ＩＮＦ－γ）の増加、およびＩｇＥ＋メモリーＢ細胞と好酸球の活性化または分化の阻止などが含まれる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．糞便懸濁液の調製
　７名の潰瘍性大腸炎患者から腸内細菌叢の接種源となる糞便を培養当日に採取した。糞便試料は採取後、嫌気性培養スワブ（２１２５５０　ＢＤ　ＢＢＬ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｗａｂ；ベクトン・ティッキンソンアンドカンパニー製）内に保管し、実験室に輸送した。接種物の調製のため、糞便０．５ｇに、１．０％のＬ－アスコルビン酸（富士フイルム和光純薬株式会社製）を添加した０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファー（ｐＨ６．５，０．１Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４および０．１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４の６８．５：３１．５（モル比）混合物からなる）を合計２ｍＬとなるように加え、糞便懸濁液を調製した。
２．ジャー培地の調製
　ＧＡＭ培地［Ｃｏｄｅ　０５４２２］（日水製薬株式会社製）：５９ｇ／Ｌ、および消泡剤：５０μＬ／Ｌを混合して培地とした。容量約２５０ｍＬのジャーファメンター（エイブル株式会社製、ＢＪＲ－２５ＮＡＩＳ－８Ｍ、以降ジャーと略称することがある）に１００ｍＬの培地を添加し、１１５℃にて１５分オートクレーブにて滅菌した。
３．ジャー培養条件
　減菌後、培養前に３７℃にて１時間、０．２μｍ　ＰＴＦＥ膜（ポール・コーポレーション製）を通して濾過減菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ2：ＣＯ2＝８０：２０（体積比））に曝気（１５ｍＬ／分）することにより、培養容器の嫌気性条件を構築した。
４．ジャー培養開始
　１００μＬの上記糞便懸濁液を培地含有容器内に接種し、嫌気培養を開始した（培養０時間）。培養の間、濾過減菌した二酸化炭素混合ガス（Ｎ2：ＣＯ２＝８０：２０（体積比））にて培地を常時バブリングし、培養槽内の嫌気状態を維持した。また培養温度は３７℃に維持し、約３００ｒｐｍで連続的に攪拌してインキュベーションを行った。
５．Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓの単菌培養と菌体取得
　ミネラルを添加したＧＡＭ培地をフラスコに入れて滅菌した。Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓを接種して培養を開始した。培養温度は３７℃に維持し、約１６０ｒｐｍで連続的に攪拌して好気的に１８時間培養を行って、菌体を取得した。
６．Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅの単菌培養と菌体取得
　ブチルゴム栓をしたガラスバイアルに、ＧＡＭ培地を入れて密栓して滅菌した。濾過減菌した嫌気ガスで培地をバブリングし、嫌気状態を構築した。そのバイアルにＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ（ＮＢＲＣ１１４４１２）を接種した。培養温度は３７℃に維持し、嫌気的に静置で１８時間培養を行って、菌体を取得した。
７．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍの単菌培養と菌体取得
　ブチルゴム栓をしたガラスバイアルに、ＲＣＭ培地を入れて密栓して滅菌した。濾過減菌した嫌気ガスで培地をバブリングし、嫌気状態を構築した。そのバイアルにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１９３９８）を接種した。培養温度は３７℃に維持し、嫌気的に静置で１８時間培養を行って、菌体を取得した。
８．ジャーへの培養０時間時点でのプレバイオ菌の添加
　培養０時間時点でそれぞれのジャーに、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍをそれぞれ添加して培養を開始した。また別のジャーでＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓにＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅを追加して培養を開始し、さらに別のジャーでＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍを追加して培養を開始した。なお添加したプレバイオ菌はそれぞれの菌種が全て４×１０７セル／ｍＬになるように添加した。
９．ジャー培養液の取得
　培養開始後４８時間の培養液を回収し、この培養液の一部（１ｍＬ）を取り出したものを試験サンプルとした。試験サンプルにて有機酸分析および細菌叢解析を行った。
１０．有機酸分析
　培養開始後４８時間にて回収した培養液を、有機酸（短鎖脂肪酸：酢酸、プロピオン酸および酪酸）の濃度の測定のために使用した。培養液を濾過して得た濾液を、Ａｍｉｎｅｘ　ＨＰＸ-８７Ｈカラム（バイオ-ラッドラボラトリーズ社製）およびＲＩＤ-１０Ａ示差屈折率検出器（株式会社島津製作所製）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（株式会社島津製作所製）に供して酪酸、プロピオン酸、および酢酸の量を測定した。ＨＰＬＣを、０．６ｍＬ／分の流速にて移動相として５ｍＭ　Ｈ２ＳＯ４を用いて６５℃にて操作した。
１１．細菌叢分析
　培養開始前および培養開始後の各時間にて回収した培養液から細菌叢の菌のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡから細菌１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域を増幅して次世代シーケンサーにより配列解析を行い、細菌多様性分析および細菌構成分析を行った。手順を以下に示す。
　プライマー対Ｓ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０３４１－ｂ－Ｓ－１７（配列番号１）およびＳ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０７８５－ａ－Ａ－２１（配列番号２）を用いて、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に細菌１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を増幅に供した。イルミナアダプターオーバーハングヌクレオチド配列（イルミナ株式会社製）を遺伝子特異的配列に付加した。製造者の指示に従ってＰＣＲサイクリング反応を行った。確認したアンプリコンＡＭＰｕｒｅ　ＸＰＤＮＡ精製ビーズ（ベックマン・コールター株式会社製）を用いて精製し、２５μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に溶出した。アンプリコンをＡｇｉｌｅｎｔ　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ　２１００　ＤＮＡ　１０００チップ（アジレント・テクノロジー株式会社製）において定量し、等モル濃度でプールした。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子産物（内部コントロール（ＰｈｉＸコントロールＶ３；イルミナ株式会社製）と共に）を、６００サイクルＭｉＳｅｑ試薬キット（イルミナ株式会社製）と共にＭｉＳｅｑシーケンサー（イルミナ株式会社製）を用いて、ペアエンドシーケンスに供した。
　Ｂａｓｅｓｐａｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｈｕｂ　（ｈｔｔｐｓ：／／ｂａｓｅｓｐａｃｅ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／）を用いてＰｈｉＸ配列を切り出して得られたＱスコアが２０以上のペアエンドリードについて、ＱＩＩＭＥ　２バージョン２０２２．１１を用いて結合してＤＡＤＡ２パイプラインで品質管理と補正を行ったあと、ＯＴＵを推測した。得られたＯＴＵを用いてα多様性を推定してＳｈａｎｎｏｎ指数を算出した。また、得られたＯＴＵはＳｉｌvａ　１３８＿９９％　ＯＴＵ　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａｂａｓｅで学習させたｎａｉｖｅ　ｂａｙｅｓ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いて分類して、菌種帰属をおこなった。Ｅｘｃｅｌ（日本マイクロソフト株式会社）を用いて、菌種帰属の分類データから各菌群の相対占有率を計算した。
１２．有機酸分析の結果
　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ単独の場合とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍとＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓを組み合わせた場合との間で酪酸の産生に差は見られなかったが、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ単独の場合より、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅとＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓを組み合わせた場合で、酪酸の産生の増加がみられた（中央値、図１参照）。
１３．細菌叢分析における培養後のＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓの結果
　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ単独の場合に比べて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍとＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓを組み合わせた場合は、培養後のＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓの相対存在量に差は見られなかった。しかし、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ単独の場合に比べて、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅとＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓを組み合わせた場合では、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓの相対存在量は高値であった（中央値、図２参照）。
１４．細菌叢分析における培養後のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の結果
　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ単独の場合とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍとＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓを組み合わせた場合において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の相対存在量は低値であった一方で、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ単独の場合と、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅとＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓを組み合わせた場合で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の相対存在量は高値であった（中央値、図３参照）。
　以上の結果より、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅとＷｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓを組み合わせることにより、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅによる酪酸の生成量を高めることが可能であり、また、当該組み合わせにおいては、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓの増殖は抑制されず、また、その他の腸内細菌の増殖も抑制されず、腸内環境を効率的に整えることに寄与することが確認された。

Claims (29)

  1. 　乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を含む組成物。
  2. 　前記酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅである、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記乳酸産生菌が、芽胞形成菌である、請求項１に記載の組成物。
  4. 　前記乳酸産生菌が、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓである、請求項１に記載の組成物。
  5. 　経口組成物である、請求項１に記載の組成物。
  6. 　食品、飲料、サプリメント、飼料、飼料添加物、又は医薬である、請求項１に記載の組成物。
  7. 　腸内における酪酸濃度を増大させるために用いられる、請求項１に記載の組成物。
  8. 　整腸用である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 　免疫調節のために用いられる請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 　アレルギー改善のために用いられる請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 　乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を、非ヒト動物に投与することを含む、前記非ヒト動物の腸内における酪酸濃度を増大させるため方法。
  12. 　乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を、対象に摂取させることを含む、前記対象の腸内における酪酸濃度を増大させるため方法（医療行為を除く）。
  13. 　乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌を、対象に投与することを含む、前記対象の腸内における酪酸濃度を増大させるため方法。
  14. 　前記酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅである、請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記乳酸産生菌が、芽胞形成菌である、請求項１３に記載の方法。
  16. 　前記乳酸産生菌が、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓである、請求項１３に記載の方法。
  17. 　前記投与が経口投与である、請求項１３に記載の方法。
  18. 　前記対象が非ヒト動物又はヒトである、請求項１３に記載の方法。
  19. 　整腸方法である、請求項１３に記載の方法。
  20. 　免疫調節のための方法である、請求項１３に記載の方法。
  21. 　アレルギー改善のための方法である、請求項１３に記載の方法。
  22. 　腸内における酪酸濃度を増大させるための組成物の製造における乳酸産生菌及びＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属酪酸産生菌の使用。
  23. 　前記酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅである、請求項２２に記載の使用。
  24. 　前記乳酸産生菌が、芽胞形成菌である、請求項２２に記載の使用。
  25. 　前記乳酸産生菌が、Ｗｅｉｚｍａｎｎｉａ　ｃｏａｇｕｌａｎｓである、請求項２２に記載の使用。
  26. 　前記組成物が免疫調節剤である、請求項２２に記載の使用。
  27. 　前記組成物が整腸剤である、請求項２２に記載の使用。
  28. 　前記組成物が免疫調節剤である、請求項２２に記載の使用。
  29. 　前記組成物がアレルギー改善剤である、請求項２２に記載の使用。

     
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