WO2025178367A1 - 항신생혈관용 다중 자극 반응성 색소상피유래인자-엘라스틴 멀티 블록 코폴리펩타이드, 다가성 자가조립 나노구조체 및 이의 약학적 조성물 - Google Patents

항신생혈관용 다중 자극 반응성 색소상피유래인자-엘라스틴 멀티 블록 코폴리펩타이드, 다가성 자가조립 나노구조체 및 이의 약학적 조성물

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WO2025178367A1
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pedf
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ebp
copolypeptide
pharmaceutical composition
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Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the above B block or C block are different EBPs
  • n and m are integers that are equal or different and represent the number of times each block is repeated.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a multi-block copolypeptide comprising a peptide derived from an epithelial-derived factor (PEDF); and an elastin-based polypeptide (EBP).
  • PEDF epithelial-derived factor
  • EBP elastin-based polypeptide
  • a pharmaceutical composition represented by the following formula 1 is provided.
  • the above A block is a PDEF-derived peptide
  • the above B block is a hydrophobic EBP
  • the above C block is a hydrophilic EBP
  • n and m are integers that are equal or different and represent the number of times each block is repeated.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis characterized in that it prevents or treats a disease caused by angiogenesis, including the pharmaceutical composition.
  • the present invention relates to a multi-stimulus responsive block copolypeptide comprising a histidine-containing EBP triblock copolypeptide comprising an anti-angiogenic peptide at both ends, which can self-assemble into a multivalent nanostructure of controlled size through His-Zn 2+ complexation to exhibit enhanced anti-angiogenic activity.
  • the above nanostructure can suppress the migration and tube formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in a concentration-dependent manner under angiogenic stimulation induced by vascular endothelial growth factor (VEGF), and since the nanostructure containing ZnCl2 exhibits a higher anti-angiogenic effect, it can be utilized as an anti-angiogenic therapeutic agent.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FIG. 1 shows the gene and amino acid sequences of PEDF 34-mer peptides, EBP[A14I1]1, and EBP[H3A2G1]1.
  • B is a block design schematic of PEDF 34-mer-EBP[H3A2G1]-EBP[A1G4I1]-EBP[H3A2G1]-PEDF 34-mer (PEDF-E n-6-n -PEDF).
  • C Self-assembled nanostructures of PEDF-E n-6-n -PEDF in the presence and absence of ZnCl2.
  • the amphiphilic PEDF-E n-6-n -PEDF self-assembles to form vesicular structures, which decrease in size upon addition of ZnCl2.
  • D Fluorescence microscopy images of HUVECs: (a) without VEGF, (b) with 50 ng/ml VEGF, (c) treated with 50 ng/ml VEGF and 1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF, and (d) treated with 50 ng/ml VEGF, 1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF, and 9000 nM ZnCl2 to evaluate the antiangiogenic effect. (Scale bar: 500 ⁇ m).
  • Figure 2 (A) is an agarose gel electrophoresis image of the PEDF-EBP triblock copolypeptide.
  • (B) is an SDS-PAGE image of the PEDF-EBP triblock copolypeptide. The gene fragment lengths are indicated below the corresponding fragments, and the expected molecular weights are shown below the bands. The SDS-PAGE gel was visualized by copper staining.
  • (C-F) Turbidity profiles of PEDF-E 6-6-6 -PEDF and PEDF-E 12-6-12 -PEDF at concentrations of 10-100 ⁇ M at pH 6.4-8.0.
  • Figure 3 shows the turbidity profiles of 10 ⁇ M E 6-6-6 , E 12-6-12 , PEDF-E 6-6-6 -PEDF, and PEDF-E 12-6-12 -PEDF in 10 mM HEPES.
  • B shows the turbidity profiles of PEDF-E 12-6-12 -PEDF as a function of ZnCl2 concentration (0, 45, 90, 180 ⁇ M) in 10 mM HEPES (measured at 350 nm with a heating rate of 1°C/min).
  • (C, D) show the results of hydrodynamic radius (R H ) measurements of 10 ⁇ M PEDF-E 12-6-12 -PEDF in the presence of 10 mM HEPES and ZnCl2: R H measured at (C) 20°C, (D) 37°C.
  • FIG. 4 shows CLSM images of the R H of PEDF-E 12-6-12 -PEDF nanostructures and FITC-conjugated PEDF-E 12-6-12 -PEDF nanostructures.
  • A-D are CLSM images taken after dialysis in deionized water (DW). Scale bar: 8 ⁇ m
  • (E-H) are CLSM images taken after dialysis in 10 mM PBS. Scale bar: 4 ⁇ m.
  • Figure 5 shows the in vitro antiangiogenic effect of PEDF-E 12-6-12 -PEDF in the presence or absence of ZnCl2.
  • A is a fluorescence microscopy image.
  • B shows the degree of tube formation in HUVECs quantified based on the image in (A).
  • HUVECs stained with Calcein-AM were cultured on Matrigel for 4 h, induced to migrate with 50 ng/ml VEGF, and treated with 0.01–1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF (with or without ZnCl2). The ZnCl2 concentration was adjusted to 9 times the polypeptide concentration. (Scale bar: 500 ⁇ m).
  • FIG. 6 shows the in vitro antiangiogenic effect according to the structure of PEDF-E 12-6-12 -PEDF.
  • A is a fluorescence microscope image.
  • B is the normalized tube length of HUVECs quantified based on the image in (A).
  • HUVECs stained with Calcein-AM were cultured on Matrigel for 4 h, and cell migration was induced with 50 ng/ml VEGF.
  • 0.001, 1, and 1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF and ZnCl2 containing groups were prepared in HEPES to induce coacervate formation, and 0.001 - 1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF was prepared in PBS to induce toroidal structure formation.
  • Scale bar 500 ⁇ m).
  • Figure 7 shows the in vitro antiangiogenic effect (same experiment as Figure 6) according to the structure of PEDF-E 12-6-12 -PEDF.
  • A is a fluorescence microscope image.
  • B is the normalized number of junctions of HUVECs quantified based on the image in (A).
  • HUVECs stained with Calcein-AM were cultured on Matrigel for 4 hours, and cell migration was induced with 50 ng/ml VEGF.
  • 0.001, 1, and 1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF and ZnCl2 containing groups were prepared in HEPES to induce aggregate formation, and 0.001 - 1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF was prepared in PBS to induce toroidal structure formation.
  • Scale bar 500 ⁇ m
  • Figure 8 shows the cytotoxicity evaluation of E 12-6-12 and PEDF-E 12-6-12 -PEDF. After treating HUVECs with 0.01 - 1000 nM E 12-6-12 and PEDF-E 12-6-12 -PEDF in the presence or absence of ZnCl2 for 4 and 12 hours, cell viability was quantified using the WST-1 assay. The ZnCl2 concentration was adjusted to 9 times the polypeptide concentration.
  • polypeptide refers to any polymer chain of amino acids.
  • peptide and protein may be used interchangeably with the term “polypeptide,” which also refers to a polymer chain of amino acids.
  • polypeptide encompasses natural or synthetic proteins, protein fragments, and polypeptide analogs of protein sequences. Polypeptides may be monomers or polymers.
  • the term 'copolypeptide' means a polypeptide that is a copolymer.
  • composition in the present invention refers to a composition manufactured for the purpose of preventing or treating a disease, and may be formulated and used in various forms according to conventional methods. For example, it may be formulated in oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, and syrups, and may be formulated and used in the form of topical preparations, suppositories, and sterile injectable solutions.
  • a multi-block copolypeptide represented by the following formula 1 A multi-block copolypeptide represented by the following formula 1.
  • n and m are integers that are equal or different and represent the number of times each block is repeated.
  • the above PEDF-derived peptide may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • an EBP triblock copolypeptide comprising an anti-angiogenic peptide at both ends thereof is provided, wherein the peptide can form size-controlled nanostructures through self-assembly to enhance anti-angiogenic activity.
  • the block copolypeptide comprises an anti-angiogenic 34-mer domain of pigment epithelium-derived factor (PEDF) and a thermosensitive elastin-based polypeptide (EBP) containing histidine, which can self-assemble into size-controlled nanostructures through histidine-Zn 2+ complexation.
  • PEDF pigment epithelium-derived factor
  • EBP thermosensitive elastin-based polypeptide
  • the hydrophilic EBP may continuously and repeatedly include a block consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the number of repetitions of the hydrophilic EBP block may be 1 to 36.
  • CMC critical micelle concentration
  • EBP triblock copolypeptides in the ABA or BAB form have been designed and studied for the development of hollow spheres, vesicles, or hydrogels.
  • EBP triblock copolypeptides in the ABC form composed of EBP diblock copolypeptides and other polypeptides such as coiled-coil proteins or cross-linking domains, have been utilized in the study of advanced nanostructures.
  • EBP block copolypeptides in the form of ABA, BAB, and ABC can be utilized as promising biomaterials for advanced drug delivery systems in combination with other functional proteins or amino acids.
  • the EBP according to the present invention may be a polypeptide in which a pentapeptide is repeated, and the repeated polypeptide may form a polypeptide block (EBP block).
  • EBPs undergo a reversible phase transition at their lower critical solution temperature (LCST), also called the transition temperature (Tt). They are highly soluble below Tt, but become insoluble above Tt.
  • LCST critical solution temperature
  • the X is referred to as a 'guest moiety'.
  • EBPs can be manufactured by introducing the X in various ways.
  • the physicochemical properties of the EBP can be controlled according to the critical solution temperature (LCST) of the X.
  • LCST critical solution temperature
  • Peptide derived from epithelial-derived factor PEDF
  • the multi-stimulus responsive block copolypeptide may comprise a PEDF-derived peptide, and the PEDF-derived peptide may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • PEDF Pigment epithelium-derived factor structurally belongs to the serpin superfamily, but it does not exhibit the structural changes seen in serpins while inhibiting serine proteases involved in various biological processes.
  • PEDF activates antiangiogenic signaling and acts as an angiogenesis inhibitor, and has additional properties such as neurotrophic and antitumor activity, but does not exhibit serine protease inhibitory activity.
  • PEDF 34-mer A 34-mer peptide (residues 44-77) with antiangiogenic properties has been identified from PEDF, and its associated mechanisms have been elucidated. While associations between PEDF 34-mer and intracellular signaling pathways related to apoptosis and antiangiogenesis have been established, some of the mechanisms remain to be fully elucidated. PEDF 34-mer can induce apoptosis by activating c-Jun-NH2 kinase (JNK) and exert antiangiogenic effects by inactivating nuclear factor of activated T cells (NFAT).
  • JNK c-Jun-NH2 kinase
  • Triblock copolymers and their self-assembled nanostructures have been extensively studied for biomedical applications due to their tunable properties and diverse structures.
  • Triblock copolymers consist of hydrophobic and hydrophilic polymers (represented by A and B), which impart amphiphilic properties. Additionally, a variable polymer (represented by C) is included to introduce additional functionality.
  • Each polymer can be systematically combined and arranged to design various triblock copolymers, such as ABA, BAB, and ABC, which can be used to fabricate diverse nanostructures, such as micelles and vesicles.
  • the properties and functions of the A and B polymers are tailored for self-assembly of nanostructures and biomedical applications.
  • polymers A and B can be tailored to self-assemble into nanostructures and be applied as biomedical materials.
  • stimuli-responsive polymers are used as advanced drug delivery carriers, controlling drug loading and release by altering their structure in low-pH environments, such as tumors.
  • polymers containing metal or drug-binding ligands are incorporated into the hydrophobic portion of self-assembled nanostructures through binding or coordination with metals and drugs.
  • composition and length of biopolymer polypeptides can be more precisely and precisely controlled through genetic synthesis than with synthetic polymers, enabling the creation of monodisperse nanostructures.
  • Matrigel was purchased from BD Biosciences, San Diego, CA.
  • Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were purchased from Lonza, Basel, Switzerland, and cultured using the Endothelial growth medium-2 (EGM-2) Bullet Kit containing Endothelial basal medium-2 (EBM-2).
  • the hydrophobic EBP block was designed to have a Tt below 37°C and to have metal ion reactivity to control the size of self-assembled nanostructures through interaction with Zn 2+ .
  • Images are shown for (a) no VEGF, (b) with 50 ng/mL VEGF, (c) with 50 ng/mL VEGF and 1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF, and (d) with 50 ng/mL VEGF, 1000 nM PEDF-E 12-6-12 -PEDF, and 9000 nM ZnCl2.
  • VEGF-stimulated HUVECs migrated and formed tube-like structures. VEGF-induced HUVEC migration and tube formation were evaluated using PEDF-E 12-6-12 -PEDF nanostructures in the absence and presence of ZnCl2, respectively.
  • E n-6-n and PEDF-E n-6-n -PEDF genes for expression in E. coli were constructed by sequential insertion of the EBP and PEDF 34-mer genes into the mpET21 vector. Gene cloning through this sequential insertion was confirmed by digestion with XbaI and HindIII restriction enzymes, agarose gel electrophoresis, and DNA sequencing.
  • the size of the restricted DNA in the agarose gel was 82 base pairs (bp) longer than the sequence encoding the E n-6-n and PEDF-E n-6-n -PEDF genes because the XbaI and HindIII restriction enzyme cleavage sites were located outside the gene region.
  • the length of the PEDF-E n-6-n -PEDF gene was 105 bp longer than that of E n-6-n , which was due to the 102 bp long PEDF 34-mer gene and the additional 3 bp sticky ends at the restriction enzyme cleavage and ligation sites.
  • E n-6-n and PEDF-E n-6-n -PEDF proteins were expressed in E. coli and purified using the same reverse phase transfer (ITC) method as the temperature-sensitive EBP purification method reported in a previous study. The purity and molecular weight of the purified proteins were confirmed by SDS-PAGE with copper staining, and the results are shown in Fig. 2(B). The expected molecular weights of E n-6-n and PEDF-E n-6-n -PEDF are indicated below each protein band.
  • Fig. 2(CF) The results of analyzing the thermal sensitivity of PEDF-E n-6-n -PEDF and the effects of protein concentration and pH are shown in Fig. 2(CF).
  • the absorbance in protein solutions (350 nm) was measured at a heating rate of 1°C/min from 10°C to 70°C, and the turbidity profile was analyzed.
  • the transition temperature (Tt) at each condition was defined as the inflection point of the absorbance profile.
  • the Tt of PEDF-E 6-6-6 -PEDF in 10 mM PBS was measured to be 32.44, 30.47, 29.27, and 28.27°C at concentrations of 10, 25, 50, and 100 ⁇ M, respectively.
  • the Tt of 25 ⁇ M PEDF-E 6-6-6 -PEDF according to pH change was confirmed to be 34.07, 32.32, 30.42, and 28.52°C at pH 6.4, 6.8, 7.4, and 8.0, respectively.
  • the Tt of PEDF-E 12-6-12 -PEDF in 10 mM PBS was 23.17, 21.17, 20.37, and 19.48°C at concentrations of 10, 25, 50, and 100 ⁇ M, respectively.
  • the Tt of 25 ⁇ M PEDF-E 12-6-12 -PEDF according to pH change was measured to be 25.06, 23.21, 20.37, and 20.46°C at pH 6.4, 6.8, 7.4, and 8.0, respectively.
  • single E 12-6-12 and PEDF-E 12-6-12 -PEDF contain 720 histidines (His), and therefore the [His]:[Zn 2+ ] ratio for 10 ⁇ M protein was calculated to be 16:1, 8:1, and 4:1 at 45, 90, and 180 ⁇ M ZnCl2, respectively.
  • the R H of 10 ⁇ M PEDF-E 12-6-12 -PEDF was a soluble monomer of 7.85 ⁇ 0.65 nm in the absence of ZnCl2 at 20°C, and increased to 46.55 ⁇ 5.89 and 62.60 ⁇ 7.66 nm with the addition of 45 and 90 ⁇ M ZnCl2, respectively.
  • PEDF-E 12-6-12 -PEDF aggregated to a size greater than 1 ⁇ m.
  • PEDF-E 12-6-12 -PEDF existed as a soluble monomer with a radius of less than 10 nm at 20°C and formed nanostructures with a radius of more than 1000 nm through self-assembly at 37°C.
  • the radius of self-assembled structures increases as the volume fraction of lipids increases.
  • the volume of the hydrophilic EBP block remains constant at 20°C and 37°C regardless of the presence of ZnCl2, the hydrophobic core containing Zn 2+ is likely to be more densely packed than that in the absence of Zn 2+ .
  • PEDF-E 12-6-12 -PEDF self-assembled structures were prepared in deionized water (DW) and phosphate-buffered saline (PBS) and imaged.
  • PEDF-E 12-6-12 -PEDF was completely dissolved in 4 M urea solution to increase the transition temperature (Tt), and then dialyzed against DW or PBS for self-assembly.
  • PEDF-E 12-6-12 -PEDF self-assembled into fully filled nanostructures or toroidal structures with radii of 2700 nm or 2400 nm, respectively, as shown in Figures 4(AD) and 4(EH).
  • the ratio of PEDF-E 12-6-12 -PEDF and ZnCl2 was set to 1:9.
  • TEM imaging (Fig. 4(K, L) was performed on 10 ⁇ M PEDF-E 12-6-12 -PEDF prepared by drying in 10 mM HEPES containing 90 ⁇ M ZnCl2 at 37°C.
  • the spherical nanostructures observed in the TEM images showed fully packed nanostructures with a radius of less than 200 nm, which was smaller than the hydrated radius measured by DLS (221.73 ⁇ 58.33 nm) due to the drying process.
  • Fig. 5(A) After treating calcein-AM-stained HUVECs for 4 hours, fluorescence microscopic images of the cells were taken, and the results are presented in Fig. 5(A). In addition, a graph showing the degree of tube formation based on the normalized tube length of HUVECs is shown in Fig. 5(B).
  • HUVECs treated with rhVEGF165 migrated more actively than HUVECs not treated with rhVEGF165 and formed a tube-shaped network.
  • the tube lengths of migrated HUVECs were set to 0% and 100%, respectively, depending on whether rhVEGF165 was treated or not, and the migrated tube lengths of HUVECs treated with and without ZnCl2 were normalized.
  • tube formation in the PEDF-E 12-6-12 -PEDF treatment group with or without ZnCl2 showed a concentration-dependent decrease in the range of 10 to 1000 nM.
  • Vesicles or coacervate structures of PEDF-E 12-6-12 -PEDF were formed in the presence or absence of ZnCl2 in HEPES at concentrations ranging from 0.001 to 1000 nM, and toroidal structures of PEDF-E 12-6-12 -PEDF were prepared in PBS at concentrations ranging from 0.001 to 1000 nM.
  • Migration and tube formation of HUVECs treated with each structure were stimulated by rhVEGF165 (50 ng/mL) in Matrigel.
  • FIGs. 6(A) and 7(A) Cell fluorescence microscopy images of HUVECs stained with Calcein-AM for 4 hours are presented in Figs. 6(A) and 7(A), a graph showing the degree of tube formation calculated based on the normalized tube length of HUVECs is presented in Fig. 6(B), and a graph showing the degree of tube formation based on the number of normalized junctions is presented in Fig. 7(B).
  • the tube length or number of junction points of migrated HUVECs in the presence or absence of rhVEGF165 was set to 0 or 100%, respectively, and the tube length or number of junction points of migrated HUVECs treated with PEDF-E12-6-12-PEDF was normalized.

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Abstract

본 출원의 실시예에 따라, 색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드를 포함하는 자극 반응성 다중 블록 코폴리펩타이드, 약물 전달체 및 이의 약학적 조성물이 제공된다. 상기 약물 전달체는 His-Zn2+착화를 통해 크기가 조절된 다가(multivalent) 나노구조체를 형성하여 향상된 항혈관신생 활성을 나타낼 수 있다.

Description

항신생혈관용 다중 자극 반응성 색소상피유래인자-엘라스틴 멀티 블록 코폴리펩타이드, 다가성 자가조립 나노구조체 및 이의 약학적 조성물
본 출원은 항신생혈관용 다중 자극 반응성 색소상피유래인자-엘라스틴 멀티 블록 코폴리펩타이드, 다가성 자가조립 나노구조체 및 이의 약학적 조성물에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)은 조직이나 장기에 신규의 혈관을 제공하는 생물학적 과정으로, 구체적으로는 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 생성되는 것을 의미하며 성장 후 체내에서 혈관이 생성되는 근본적인 과정이다. 인체에서 정상적으로 관찰되는 생리적 혈관신생은 배아 및 태아의 발달, 자궁의 성숙, 태반의 증식, 황체의 형성 및 상처의 치유와 같은 매우 제한된 상황에서만 일어나며, 이 시기에도 매우 엄격히 조절되어 필요한 기능이 달성되면 혈관신생은 중단된다. 신규한 혈관신생은 신생혈관생성 조절인자에 의해 엄격하게 조절되며, 신생혈관생성의 표현형은 신생혈관생성 자극인자의 상향조절(up-regulation) 및 신생혈관생성 억제인자의 하향조절(down-regulation) 사이의 전체적인 균형에 의하여 바뀐다고 보고되어 왔다.
최근에는 동물의 암 모델과 인간의 임상실험에서 종양의 혈관신생 저해는 종양의 성장과 발달을 효과적으로 저해할 수 있고 환자의 생명을 연장할 수 있다는 사실이 증명되면서 혈관신생 억제제 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
이러한 혈관신생 억제제는 항암 치료법에 있어서 특히 각광을 받고 있는데 이러한 이유로는 첫째, 혈관신생 억제제는 모든 고형성 종양에서 공통적으로 사용할 수 있는 가능성이 있고, 둘째, 기존의 항암 화학요법은 암 세포가 빠르게 성장하는 특징을 이용하여 치료하기 때문에 비교적 세포주기가 빠른 골수세포 및 위장관계 세포에 독성 작용을 나타내는 반면, 혈관신생 억제제는 장기 투여하여도 비교적 부작용이 적다는 장점이 있고, 셋째, 하나의 혈관세포는 수백 개의 암세포에 영양분과 산소를 공급하기 때문에 하나의 혈관세포 억제를 통해 많은 암세포를 억제할 수 있으며, 넷째, 기존의 항암 요법의 경우에는 항암제가 혈관 밖으로 유출되어 암세포에 영향을 나타내는 반면, 혈관신생 억제제는 직접적으로 혈관 내피세포에 접촉하여 작용함으로써 약물 전달을 용이하게 할 수 있다는 장점을 가지고 있기 때문이다.
암, 안과질환, 관절염, 및 건선 등과 같은 과도한 혈관신생과 관련된 질환은 혈관신생을 억제하는 것이 근원적인 치료방법이 될 것이나, 현재 사용되고 있는 혈관신생 억제제는 일반적으로 유기합성의 방법으로 제조된 것이어서 그 효과가 만족스럽지 못하고 부작용 또한 심한 문제가 있다. 이에 따라, 약학적 특성이 높고 부작용이 적은 혈관신생 억제제 개발에 대한 연구가 필요한 실정이었다.
한편, 혈관신생 억제의 전략으로는 두 가지가 있다. 혈관신생을 유도하는 신호를 방해하는 전략과, 색소상피유래인자(pigment epithelial-derived factor, PEDF)와 같은 혈관신생 저해제를 사용하여 항-혈관신생 신호를 활성화하는 전략이다.
그 중 PEDF 34-mer는 펩타이드 약물로서 반감기가 짧다는 한계가 있어 현재까지, PEDF 34-mer 또는 PEDF 34-mer에서 유래한 짧은 펩타이드 기반 나노구조체를 이용한 약물 전달체로 활용하여 전달하는 연구는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 PEDF 34-mer 의 항-혈관신생 기작의 활성화 기능을 포함한 복합적 작용과 EBP의 자가조립(self-assembly) 기능을 이용한 신혈관 생성 억제용 약물 전달체로서의 융합단백질 및 이로 이루어진 나노 구조체를 제공하고자 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 온도와 금속이온 자극에 민감하게 반응하는 다중 자극 반응성 블록 코폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 다중 자극 반응성 블록 코폴리펩타이드의 자가조립으로 형성된 나노구조체를 약물 전달체로 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드에 혈관신생 억제 기능의 펩타이드를 융합시켜 혈관신생에 기인한 질환의 치료용 약학적 조성물 제공을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명의 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재들로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 색소상피유래인자(Pigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드; 및 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드로서, 하기 식 1 로 표시되는 다중 블록 코폴리펩타이드를 제공한다.
[식 1]
[A]-[B]n-[C]m-[B]n-[A]
상기 식 1에서,
상기 A 블록은 PDEF 유래 펩타이드이고,
상기 B 블록 또는 C 블록은 서로 다른 EBP이며,
n 및 m는 같거나 서로 다른 정수이고, 각 블록이 반복되는 횟수임.
또한, 본 발명은 상기 어느 한 항의 다중 블록 코폴리펩타이드를 포함하고, 자극 반응성을 나타내는, 다중 자극 반응성 약물전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드; 및 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물로서,
하기 식 1 로 표시되는 약학적 조성물을 제공한다.
[식 1]
[A]-[B]n-[C]m-[B]n-[A]
상기 식 1에서,
상기 A 블록은 PDEF 유래 펩타이드이고,
상기 B 블록은 소수성 EBP이고,
상기 C 블록은 친수성 EBP이며,
n 및 m는 같거나 서로 다른 정수이고, 각 블록이 반복되는 횟수임.
또한, 상기 약학적 조성물을 포함하는 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 다중 자극 반응성 블록 코폴리펩타이드는 양말단에 항혈관신생 펩타이드를 포함하는 히스티딘 함유 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드를 포함하는 것으로, 이는 His-Zn2+ 착화를 통해 크기가 조절된 다가(multivalent) 나노구조체로 자가조립되어 향상된 항혈관신생 활성을 나타낼 수 있다.
상기 나노구조체는 혈관내피세포 성장인자(VEGF)에 의해 유도된 혈관신생 자극 하에서 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)의 이동 및 튜브 형성을 농도 의존적으로 억제할 수 있고, ZnCl₂가 포함된 나노구조체에서 더 높은 항혈관신생 효과가 나타내므로, 항혈관신생 치료제로 활용될 수 있다.
본 출원의 상세한 설명에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1의 (A)는 PEDF 34-mer 펩타이드, EBP[A₁₄I₁]₁, EBP[H₃A₂G₁]₁의 유전자 및 아미노산 서열이다. (B)는 PEDF 34-mer-EBP[H₃A₂G₁]-EBP[A₁G₄I₁]-EBP[H₃A₂G₁]-PEDF 34-mer(PEDF-En-6-n-PEDF)의 블록 설계 개략도이다. (C)는 ZnCl₂존재 및 부재 시 PEDF-En-6-n-PEDF의 자가조립 나노구조체이다. 전이온도 (Tt, Transition temperature) 이상에서 양쪽성 PEDF-En-6-n-PEDF는 자가조립되어 소포형 구조체를 형성하며, ZnCl₂가 첨가되면 크기가 감소한다. (D)는 HUVEC의 형광 현미경 이미지이다.: (a) VEGF 없음, (b) 50 ng/ml VEGF 존재, (c) 50 ng/ml VEGF 및 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF 처리, (d) 50 ng/ml VEGF, 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF 및 9000 nM ZnCl₂처리하여 항혈관신생 효과 평가. (스케일 바: 500 μm).
도 2의 (A)는 PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드의 아가로스 젤 전기영동 이미지이다. (B)는 PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드의 SDS-PAGE 이미지. 유전자 단편 길이는 해당 단편 아래에 표시되었으며, 예상 분자량은 밴드 아래에 나타남. SDS-PAGE 젤은 구리 염색법으로 시각화됨. (C-F)는 PEDF-E6-6-6-PEDF 및 PEDF-E12-6-12-PEDF의 pH 6.4 - 8.0에서 10 - 100 μM 농도에서의 탁도 프로파일이다. (C) 10 mM PBS에서 10 - 100 μM 농도의 PEDF-E6-6-6-PEDF, (E) PEDF-E12-6-12-PEDF의 탁도 프로파일. (D) pH 6.4 - 8.0에서 PEDF-E6-6-6-PEDF, (F) PEDF-E12-6-12-PEDF의 탁도 프로파일.
도 3의 (A)는 10 mM HEPES에서 10 μM E6-6-6, E12-6-12, PEDF-E6-6-6-PEDF 및 PEDF-E12-6-12-PEDF의 탁도 프로파일이다. (B)는 10 mM HEPES에서 ZnCl₂농도(0, 45, 90, 180 μM)에 따른 PEDF-E12-6-12-PEDF의 탁도 프로파일(350 nm에서 1°C/min 가열 속도로 측정)이다. (C, D)는 10 mM HEPES 및 ZnCl₂존재 시 10 μM PEDF-E12-6-12-PEDF의 수화 반경(RH, Hydrodynamic radius) 측정 결과이다: (C) 20°C, (D) 37°C에서 측정된 RH.
도 4의 (A, B)는 PEDF-E12-6-12-PEDF 나노구조체의 RH 및 FITC 융합된 PEDF-E12-6-12-PEDF 나노구조체의 CLSM 이미지이다. (A-D)는 탈이온수(DW)에서 투석 후 촬영한 CLSM 이미지이다. 스케일 바: 8 μm, (E-H) 10 mM PBS에서 투석 후 촬영한 CLSM 이미지이다. 스케일 바: 4 μm. (I 및 J) ZnCl₂유무에 따른 10 μM PEDF-E12-6-12-PEDF의 CLSM 이미지이다: (I) ZnCl₂없음. 스케일 바: 5 μm 및 확대 이미지의 스케일 바: 2 μm. (J) 90 μM ZnCl₂존재. (K 및 L) ZnCl₂없을 때 10 μM PEDF-E12-6-12-PEDF의 TEM 이미지: TEM 샘플은 37°C에서 건조됨. (스케일 바: 1 μm 와 200 nm).
도 5는 ZnCl₂유무에 따른 PEDF-E12-6-12-PEDF의 시험관 내 항혈관신생 효과를 나타낸 것이다. (A)는 형광 현미경 이미지이다. (B)는 (A)의 이미지를 기반으로 정량화한 HUVEC의 튜브 형성 정도이다. Calcein-AM으로 염색한 HUVEC를 Matrigel 위에서 4시간 동안 배양하여 50 ng/ml VEGF로 세포 이동을 유도하고, 0.01 - 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF(ZnCl₂유무 포함)를 처리함. ZnCl₂농도는 폴리펩타이드 농도의 9배로 조정됨. (스케일 바: 500 μm ).
도 6은 PEDF-E12-6-12-PEDF의 구조체에 따른 시험관 내 항혈관신생 효과를 나타낸 것이다. (A)는 형광 현미경 이미지이다. (B)는 (A)의 이미지를 기반으로 정량화한 HUVEC의 정규화된 튜브 길이이다. Calcein-AM으로 염색한 HUVEC를 Matrigel 위에서 4시간 동안 배양하여 50 ng/ml VEGF로 세포 이동을 유도하였다. 0.001, 1, 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF 및 ZnCl₂포함군을 HEPES에서 준비하여 응집체(coacervate) 형성을 유도하고, 0.001 - 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF를 PBS에서 준비하여 토로이드 구조체 (toroidal structure) 형성을 유도하였다. (스케일 바: 500 μm ).
도 7은 PEDF-E12-6-12-PEDF의 구조체에 따른 시험관 내 항혈관신생 효과(도 6과 동일한 실험)를 나타낸 것이다. (A)는 형광 현미경 이미지이다. (B)는 (A)의 이미지를 기반으로 정량화한 HUVEC의 정규화된 결합점(junction) 갯수이다. Calcein-AM으로 염색한 HUVEC를 Matrigel 위에서 4시간 동안 배양하여 50 ng/ml VEGF로 세포 이동을 유도하였다. 0.001, 1, 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF 및 ZnCl₂포함군을 HEPES에서 준비하여 응집체 형성을 유도하고, 0.001 - 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF를 PBS에서 준비하여 토로이드 구조체 형성을 유도함. (스케일 바: 500 μm) .
도 8은 E12-6-12 및 PEDF-E12-6-12-PEDF의 세포 독성 평가를 나타낸 것이다. ZnCl₂유무에 따른 0.01 - 1000 nM E12-6-12 및 PEDF-E12-6-12-PEDF를 4시간 및 12시간 동안 HUVEC에 처리한 후, WST-1 분석을 통해 세포 생존율을 정량화하였다. ZnCl₂농도는 폴리펩타이드 농도의 9배로 조정됨.
본 명세서에서 사용하는 용어는 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 출원을 제한 및/또는 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서 용어 '아미노산'은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연 아미노산을 의미한다. 예를 들어, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소루신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다. 상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로, 친수성(음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타내고, 지방족 또는 방향족의 성질도 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 Gly(G), His(H) 등의 약어는 아미노산 약어이다. Gly는 글리신의, His는 히스티딘의 약어이다. 또한 글리신은 G, 히스티딘은 H라고도 표현한다. 상기 약어는 이 기술분야에서 널리 사용되는 표현이다.
본 발명에서 용어 '폴리펩타이드'란 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. '펩타이드' 및 '단백질'이라는 용어는 '폴리펩타이드'란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한다. '폴리펩타이드'라는 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
본 발명에서 용어 '코폴리펩타이드(copolypeptide)'란 공중합체(copolymer)인 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명의 코폴리펩타이드는 기본적으로 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)를 포함하며, 상기 '엘라스틴계 폴리펩타이드'는 '엘라스틴 유사 폴리펩타이드(elastin-like polypeptieds: ELP)'라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.
본 발명에서 용어, "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
다중 자극 반응성 블록 코폴리펩타이드
본 발명의 일 양태는 색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드; 및 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드를 제공한다.
하기 식 1 로 표시되는 다중 블록 코폴리펩타이드.
[식 1]
[A]-[B]n-[C]m-[B]n-[A]
상기 식 1에서,
상기 A 블록은 PDEF 유래 펩타이드이고,
상기 B 블록 또는 C 블록은 서로 다른 EBP이며,
n 및 m는 같거나 서로 다른 정수이고, 각 블록이 반복되는 횟수임.
상기 다중 블록 코폴리펩타이드는 양말단에 항혈관신생 펩타이드를 포함하는 히스티딘 함유 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드를 포함하며, 이는 His-Zn2+ 착화를 통해 크기가 조절된 다가성(multivalent) 나노구조체로 자가조립되어 향상된 항혈관신생 활성을 나타낼 수 있다.
상기 EBP 삼중블록은 체온보다 높은 전이 온도(Tt)를 가지는 친수성 EBP와 히스티딘을 포함하는 소수성 EBP로 구성되며, His-Zn2+ 착화를 통해 크기 조절이 가능한 ABA 형태의 나노구조체로 자가조립된다. 색소 상피 유래 인자(PEDF)의 항혈관신생 34-머(34-mer) 영역인 PEDF 34-mer가 다가성을 부여하기 위해 EBP 삼중블록의 양말단에 도입될 수 있다.
상기 PEDF 유래 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
서열번호 3: DPFFK VPVNK LAAAV SNFGYDLYR VRSST SPTTN
본 발명의 일 실시예에서, 양 말단에 항혈관신생 펩타이드를 포함한 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드를 포함하며, 이 펩타이드는 자가조립을 통해 크기가 조절된 나노구조체를 형성하여 항혈관신생 활성을 향상시킬 수 있다. 상기 블록 코폴리펩타이드는 색소 상피 유래 인자(PEDF)의 항혈관신생 34-머(34-mer) 영역과 히스티딘을 포함한 열 민감성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP)로 구성되며, 이는 히스티딘-Zn2+착화를 통해 크기 조절이 가능한 나노구조체로 자가조립될 수 있다.
상기 나노구조체는 혈관내피세포 성장인자(VEGF)에 의해 유도된 혈관신생 자극 하에서 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)의 이동 및 튜브 형성을 농도 의존적으로 억제할 수 있고, ZnCl₂가 포함되지 않은 큰 나노구조체보다, ZnCl₂가 포함된 작은 나노구조체에서 더 높은 항혈관신생 효과가 나타낼 수 있다.
엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin based polypeptide: EBP)
본 발명의 일 양태는 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드의 양 말단에 상기 PEDF 유래 펩타이드가 연결되는 것일 수 있다. 상기 소수성 EBP는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적이고 반복적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 소수성 EBP 블록의 반복 횟수는 1 내지 36인 것일 수 있다.
서열번호 1 : IPAHGIPAAGIPAHGIPAIGIPAHGIPAAG
친수성 EBP는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적이고 반복적으로 포함할 수 있다. 상기 친수성 EBP 블록의 반복 횟수는 1 내지 36인 것일 수 있다.
서열번호 2 : VPAGG VPAAG VPAGG VPAGG VPAI
EBP 블록 코폴리펩타이드는 각 EBP 블록이 서로 다른 전이 온도(Tt)를 가지며, 각 블록의 Tt 사이 온도 범위에서 양쪽성(amphiphilic) 특성을 나타내고 미셀(micelle) 및 소포(vesicle)와 같은 나노구조체로 자가조립된다. EBP의 자가조립 나노구조체는 Xaa 위치의 아미노산을 활용하여 추가적인 기능이나 감응성을 가질 수 있다. 고급 약물 전달을 위해, 히스티딘을 게스트 잔기로 도입하여 추가 기능을 부여하였으며, 히스티딘의 이미다졸 측쇄는 pKa가 6으로, Cu2+, Zn2+, Mg2+², Ni2+, Co2+, Cd2+ 등의 금속 이온과 착화할 수 있다.
히스티딘이 풍부한 EBP는 이미다졸 측쇄의 가역적인 전하 변화로 인해 pH 감응성을 가지며, 이는 낮은 pH에서 양전하, 높은 pH에서 중성으로 변하면서 Tt의 변화를 유도한다. 소수성 코어에 히스티딘을 포함한 자가조립 EBP 나노구조체는 pH-민감성 해체를 통해 종양 표적 약물 전달에 적용되었다. 또한, 소수성 코어에 히스티딘이 포함된 자가조립은 pH뿐만 아니라 금속 이온에도 영향을 받는다. EBP 내 히스티딘에 금속 이온을 도입하면 자가조립된 구조체의 임계 미셀 농도(CMC)가 감소하고, EBP 코어가 더 치밀해지며, 결과적으로 금속 이온을 포함한 히스티딘에 의해 EBP 나노구조체의 안정성이 향상됨을 나타낸다.
ABA 또는 BAB 형태의 다양한 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드는 공동구(hollow sphere), 소포(vesicle) 또는 하이드로젤(hydrogel) 개발을 위해 설계 및 연구되었다. 또한, ABC 형태의 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드는 EBP 이중블록 코폴리펩타이드와 코일드코일 단백질 또는 가교 도메인과 같은 다른 폴리펩타이드로 구성되어 고급 나노구조체 연구에 활용되었다.
뿐만 아니라, 치료 단백질 C가 친수성 말단에 도입되어 다가(multivalent) 형태로 쉘(shell)에서 발현되었다. 기존 연구에서는 리간드-수용체 또는 항원-항체 결합 친화도를 활용한 다가 C를 포함하는 나노구조체가 단일 치료 단백질보다 향상된 효능을 보였다. 따라서, ABA, BAB, ABC 형태의 EBP 블록 코폴리펩타이드는 다른 기능성 단백질이나 아미노산과 함께 고급 약물 전달 시스템을 위한 유망한 생체재료로 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 상기 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블록(EBP 블록)을 형성할 수 있다.
EBP는 전이 온도(transition temperature: Tt)라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은 Tt 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 Tt를 초과하면 불용성으로 된다.
본 발명에서 상기 X는 '게스트 잔기'라고 칭한다. 상기 X를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다. 특히, 상기 X의 임계 용액 온도(LCST)에 따라 상기 EBP의 물리화학적 특성들이 제어될 수 있다.
색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드
본 발명의 일 양태에서 다중 자극 반응성 블록 코폴리펩타이드는 PEDF 유래 펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 PEDF 유래 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
색소 상피 유래 인자(PEDF)는 구조적으로 세르핀(serpin) 초계(superfamily)에 속하지만, 다양한 생물학적 과정과 관련된 세린 프로테아제를 억제하는 동안 세르핀에서 나타나는 구조적 변화를 보이지 않는다. PEDF는 항혈관신생 신호를 활성화하고 혈관신생 억제제로서 균형을 유지하며, 신경영양(neurotrophic) 및 항종양(antitumorigenic)과 같은 추가적인 특성을 가지고 있지만 세린 프로테아제 억제 활성을 나타내지는 않는다.
PEDF에서 항혈관신생 기능을 하는 34-머(34-mer) 펩타이드(잔기 44-77)가 확인되었으며, 그와 관련된 기전이 밝혀졌다. PEDF 34-mer와 세포 사멸(apoptosis) 및 항혈관신생과 관련된 세포내 신호 전달 경로 간의 연관성이 확인되었지만, 일부 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. PEDF 34-mer는 c-Jun-NH2 키나제(JNK)를 활성화하여 세포 사멸을 유도하고, 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)를 비활성화하여 항혈관신생 효과를 나타낼 수 있다.
PEDF 34-mer는 내피세포 및 종양세포 표면의 F1-ATP 합성효소의 촉매 베타-소단위와 결합 친화도를 가지며, 이와의 결합을 통해 ATP 합성효소 활성을 억제하고 종양 성장과 침윤을 방해한다. 또한, PEDF 34-mer는 내피세포막의 라미닌 수용체와 결합하여 내피세포 사멸과 이동 억제를 유도한다.
이러한 기전 연구 외에도, PEDF 34-mer 내에서 더욱 좁은 항혈관신생 펩타이드 영역이 확인되었으며, 이들의 항혈관신생 활성 및 기전이 PEDF 34-mer와 비교하여 분석되었다.
자가 나노 조립 구조체 및 약물전달체
삼중블록 공중합체와 이들의 자가조립 나노구조체는 조절 가능한 특성과 다양한 구조체 덕분에 생의학적 응용을 목적으로 광범위하게 연구되었다. 삼중블록 공중합체는 소수성 및 친수성 중합체(A와 B로 표현됨)로 구성되며, 이는 양쪽성(amphiphilicity) 특성을 부여한다. 또한, 추가적인 기능을 도입하기 위해 가변 중합체(C로 표기됨)가 포함된다. 각각의 중합체는 체계적으로 결합 및 배열되어 ABA, BAB, ABC 등의 다양한 삼중블록 공중합체를 설계할 수 있으며, 이를 통해 미셀, 소포 등 다양한 나노구조체를 제조할 수 있다. A와 B 중합체의 특성과 기능은 나노구조체의 자가조립 및 생의학적 응용을 위해 조정된다.
A와 B 고분자의 특성과 기능은 나노구조체로 자가조립되고 생물의학적 재료로 응용되도록 조정된다. 예를 들어, 자극 반응성 고분자는 종양과 같은 낮은 pH 환경에서 구조체를 변화시켜 약물 적재 및 방출을 제어하는 고급 약물 전달 캐리어로 사용된다. 또한, 금속 또는 약물 결합 리간드를 포함한 고분자는 금속 및 약물과의 결합 또는 조정을 통해 자가조립 나노구조체의 소수성 부분으로 채택된다.
약물 전달 캐리어뿐만 아니라 치료제로서의 응용을 위해, 치료 도메인 또는 수용체 타겟팅 리간드가 A와 B 고분자에 도입된다. 생체고분자인 폴리펩타이드의 조성과 길이는 유전자 합성을 통해 합성 고분자보다 더 세밀하고 정밀하게 조정될 수 있어 단분산 나노구조체를 가능하게 한다.
약물 전달체로서, 자극 반응성 중합체(stimuli-responsive polymer)는 종양의 낮은 pH와 같은 표적 환경에서 구조체를 변화시켜 약물 적재 및 방출을 조절하는 데 사용된다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 자극은 온도, 단백질 농도, pH 또는 Zn 2+이온 중 1 이상일 수 있다. 상기 코폴리펩타이드는 상기 자극에 의해 크기가 조절된 나노 구조를 형성하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 나노 구조는 코아세르베이트 또는 토로이드 구조일 수 있다.
또한, 금속 또는 약물 결합 리간드를 포함하는 중합체는 자가조립된 나노구조체의 소수성 부분으로 채택되어 금속 또는 약물과의 결합을 통해 조립된다. 치료제로서뿐만 아니라 약물 전달체로도 활용하기 위해, 치료 도메인 또는 수용체 표적화 리간드가 A 및 B 중합체에 도입되었다. 생체고분자인 폴리펩타이드는 합성 중합체보다 유전적 합성을 통해 조성 및 길이를 보다 정밀하게 조정할 수 있어 단분산 나노구조체를 구현할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드; 및 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
하기 식 1 로 표시되는 약학적 조성물.
[식 1]
[A]-[B]n-[C]m-[B]n-[A]
상기 식 1에서,
상기 A 블록은 PDEF 유래 펩타이드이고,
상기 B 블록은 소수성 EBP이고,
상기 C 블록은 친수성 EBP이며,
n 및 m는 같거나 서로 다른 정수이고, 각 블록이 반복되는 횟수임.
본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 상기 약학적 조성물을 포함하는 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "혈관신생 관련 질환" 또는 "혈관신생에 의해 유발되는 질환"은 신생혈관 형성이 비정상적으로 진행되어 야기되는 질환을 의미한다. 본 명세서 내에서 "혈관신생 관련 질환"과 "혈관신생에 의해 유발되는 질환"은 상호 호환적으로 기재할 수 있다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 혈관신생 관련 질환은 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 류마티스 관절염, 당뇨병성 망막증, 조숙아 망막증, 신생혈관 녹내장, 증식성 망막증, 홍색증, 건선, 오슬러-웨버증후군, 심근 혈관형성, 플라크 신혈관화, 모세혈관확장증, 혈우병 관절증, 혈관섬유종, 외상 과립화, 장 유착증, 투석 이식 혈관 통로 협착증, 동맥경화증, 경피증, 비후성 반흔, 캣스크래치 질환, 헬리코박터 파일로리(Helicobactor pylori) 궤양, 비만, 또는 염증 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 혈관신생 또는 맥관형성을 억제함으로써 상기 혈관신생 관련 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
이하, 첨부된 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 출원에 따른 예시적 실시예를 상세하게 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 내용으로 인해 한정되는 것은 아니다.
재료
BL21 (DE3) 대장균(E. Coli) 세포와 pET-21a (+) 벡터는 미국 위스콘신주 매디슨에 위치한 Novagen Inc.에서 제공받았다. Top10 competent 세포는 미국 캘리포니아주 칼스배드의 Invitrogen에서 구매하였다.
모든 맞춤형 올리고뉴클레오타이드는 대한민국 서울에 위치한 Cosmo Gene Tech에서 합성되었다. 송아지 장 알칼리 포스파타제(CIP), BamHI, XbaI는 미국 매사추세츠주 월섬의 Thermo Fisher Scientific에서 제공받았으며, AcuI와 BseRI는 미국 매사추세츠주 입스위치의 New England Biolabs에서 구매하였다. T4 DNA 라이게이스는 대한민국 대전에 위치한 Elpis Bio-tech에서 제공받았다.
DNA 미니프렙, 젤 추출, PCR 정제 키트는 대한민국 서울의 Geneall Biotechnology에서 제공받았으며, Dyne Agarose High는 대한민국 성남의 DYNE BIO, Inc.에서 구매하였다.
Top10 세포 및 BL21(DE3) 세포는 미국 오하이오주 솔론에 위치한 MP Biomedicals에서 제공한 Circle Grow 배지에서 배양되었다. Isopropyl--D-thiogalactoside (IPTG)는 미국 미주리주 세인트루이스의 Goldbio에서 공급받았다.
암피실린, 폴리에틸렌이민(PEI), 인산완충생리식염수(PBS, pH 7.4), 인산텅스텐산(PTA), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)는 미국 미주리주 세인트루이스의 Sigma-Aldrich에서 구매하였다.
Matrigel은 미국 캘리포니아주 샌디에이고의 BD Biosciences에서 구매하였다. 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)는 스위스 바젤의 Lonza에서 구매하였으며, Endothelial basal medium-2 (EBM-2)가 포함된 Endothelial growth medium-2 (EGM-2) Bullet Kit를 사용하여 배양하였다.
Calcein-AM은 미국 캘리포니아주 칼스배드의 Invitrogen에서 구매하였으며, 재조합 인간 혈관내피세포 성장인자-165 (rhVEGF165)는 미국 미네소타주 미니애폴리스의 R&D SYSTEMS에서 제공받았다.
세포 계수 키트-8 (CCK-8)은 일본 구마모토의 Dojindo Laboratories에서 공급받았다.
제조예 : 유전자 구성 및 단백질 발현 및 정제
PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드를 포함하는 플라스미드는 PEDF 34-mer 유전자를 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드 유전자에 삽입하여 구성되었다. 간략히 설명하면, 각 EBP[A₁G₄I₁]₁및 EBP[H₃A₂G₁]₁을 인코딩하는 올리고뉴클레오타이드 쌍이 어닐링(annealing)되었고, 어닐링된 유전자는 이전에 보고된 방법에 따라 제작된 변형 pET21a(mpET21a)에 반복적으로 삽입되었다. 플라스미드 내 EBP[H₃A₂G₁] 유전자는 수정된 반복적 방향성 연결법(RDL)을 사용하여 구성되었다.
PEDF 34-mer 유전자는 인간 PEDF cDNA 서열의 130-231 영역을 PCR 증폭한 후, 해당 영역을 XbaI 및 NheI로 제한효소 처리하여 pET21a에 삽입함으로써 제작되었다. PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드 유전자는 XbaI 및 AcuI로 제한효소 처리된 EBP 유전자 조각과 AcuI로 제한효소 처리된 PEDF 34-mer 유전자 조각을, XbaI, BseRI 및 CIP로 절단 및 탈인산화된 mpET21a에 연속적으로 삽입하여 구성되었다. 모든 클로닝 과정은 XbaI 및 BamHI 제한효소 처리 후 아가로스 젤 전기영동과 DNA 서열 분석을 통해 확인되었다.
PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드는 대장균(E. coli)에서 발현되었으며, 역상 상전이법(ITC)을 이용하여 정제되었다. 단백질 유전자가 포함된 플라스미드는 BL21(DE3) 균주 대장균에 형질전환되었으며, 형질전환된 대장균은 50 μg/mL의 암피실린이 포함된 CircleGrow 배지에서 배양되었다. 배양액의 600 nm 흡광도가 1.0에 도달했을 때, 최종 농도 1 mM의 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 발현된 단백질은 37°C에서 200 rpm으로 밤새 과발현되었으며, 원심분리(4500 rpm, 10분, 4°C)를 통해 수확되었다.
수확된 세포는 0.01 M PBS에 재현탁된 후, 초음파 분해(총 5분, 10초 간격으로 20초 정지)하여 용해되었다. 이후, 0.5% w/v의 PEI를 첨가하고 원심분리(13000 rpm, 15분, 4°C)를 수행하여 핵산을 제거하였다.
단백질 용액의 상전이는 3 M 염화나트륨(NaCl)을 첨가하고 40°C까지 가열하여 유도되었으며, 응집된 EBP는 원심분리(13000 rpm, 15분, 40°C)를 통해 펠렛으로 분리되었다. 분리된 응집체는 4°C의 0.01 M PBS에 재현탁되었으며, 원심분리(13000 rpm, 15분, 4°C)를 통해 불용성 단백질 오염물을 제거하였다. 이 응집 및 재현탁 과정을 단백질이 정제될 때까지 반복하였다.
실험예 1 : 열 감응성 및 자가조립 특성 분석
열 감응성을 분석하기 위해, Cary 100 Bio UV/Vis 분광광도계(Varian Instruments, Walnut Creek, CA)를 사용하여 0.01 M HEPES 및 ZnCl₂가 포함된 용액에서 PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드의 350 nm에서의 흡광도를 20~60°C 범위에서 1°C/분의 가열 속도로 측정하였다. 전이 온도(Tt)는 열 프로파일의 변곡점으로 정의하였다.
열 유발 자가조립 특성은 Nano ZS90 (ZEN3690) 동적 광산란(DLS) 장비(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)를 사용하여 0.01 M HEPES 및 ZnCl₂가 포함된 용액에서 10 μM 농도의 단백질의 수화 반경(RH)을 20°C 및 37°C에서 측정함으로써 분석하였다.
실험예 2 : 팽윤 및 건조 상태에서의 이미징
100 μM 단백질을 탈이온수에서 100 μM FITC와 함께 4°C에서 4시간 동안 반응시켜 결합을 유도한 후, 투석을 통해 결합되지 않은 FITC를 제거하였다. 팽윤 상태에서의 자가조립 단백질 구조체는 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 이용하여 이미징하였다. 단백질은 탈이온수, 10 mM PBS 또는 10 mM HEPES에서 준비되었으며, ZnCl₂가 없는 경우와 있는 경우 각각 37°C에서 Zeiss LSM800 (Leica, Wetzlar, Germany) 및 CU302 온도 컨트롤러(LCI, 남양주, 대한민국)를 사용하여 촬영하였다.
건조 상태에서의 자가조립 단백질 구조체는 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 분석하였다. 단백질은 0.01 M 용액에서 ZnCl₂가 없는 경우와 있는 경우 각각 준비되었으며, 탄소 코팅된 그리드 위에서 37°C에서 건조된 후 TEM 샘플을 제작하였다. 건조된 상태의 이미지는 200 kV에서 작동하는 JEM-2100F FE-STEM (JEOL, Freising, Germany) 장비를 사용하여 획득하였다.
실험예 3 : 시험관 내에서 PEDF-E12-6-12-PEDF 자가조립 구조체의 종류에 따른 HUVEC 튜브 형성 억제 효과 분석
자가조립 구조체의 종류에 따른 PEDF-E12-6-12-PEDF의 HUVEC 튜브 형성 억제 효과를 시험관 내에서 평가하였다.
ZnCl₂가 없는 경우 PEDF-E12-6-12-PEDF는 베시클 구조체를 형성하고, ZnCl₂가 있는 경우 PEDF-E12-6-12-PEDF는 응집체(coacervate)를 형성한다. Calcein으로 염색된 HUVECs(2 Х 10⁴cells/well)는 Matrigel 위에서rhVEGF165 50 ng/mL 및 ZnCl₂가 없는 경우와 있는 경우(단백질 농도의 9배당량) 각각 0.01 - 1,000 nM 농도의 PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드와 함께 37°C에서 4시간 동안 배양되었다.
Matrigel 위의 HUVECs 튜브 구조는 Axio Observer A1 현미경(ZEISS, Oberkochen, Germany)을 사용하여 이미징하였으며, 튜브의 길이는 Image J Lab 소프트웨어의 혈관신생 분석기(angiogenesis analyzer)를 이용하여 측정하였다.
4시간 동안 Calcein-AM으로 염색된 HUVEC의 형광 현미경 이미지는 도 5(A)에 나타나 있으며, 튜브 형성 정도는 HUVEC의 정규화된 튜브 길이를 기반으로 도 5(B)에 그래프로 나타냈다.
0.001, 1 및 1000 nM의 PEDF-E12-6-12-PEDF (ZnCl₂유무 포함)를 HEPES에서 준비하여 베시클 혹은 응집체(coacervate)를 형성하였고, 0.001 - 1000 nM 범위의 PEDF-E12-6-12-PEDF를 PBS에서 준비하여 토로이드 구조체 (toroidal structure)를 형성하였다.
이들 구조체는 50 ng/mL rhVEGF165로 이동 및 튜브 형성이 유도된 HUVEC에 처리되었다.
4시간 동안 Calcein-AM으로 염색된 HUVEC의 형광 현미경 이미지는 도 6(A) 및 7(A)에 나타나 있으며, 튜브 형성 정도는 HUVEC의 정규화된 튜브 길이 또는 결합점(junction) 개수를 기반으로 도 6(B) 및 7(B)에 그래프로 나타냈다.
도 6 (A) 및 도 7(A)에서, rhVEGF165로 처리된 HUVEC는 rhVEGF165가 없는 경우보다 더 많이 이동하고 네트워크를 형성하였다.
VEGF가 없는 경우와 있는 경우 각각 튜브 길이 또는 결합점 개수를 0% 및 100%로 설정한 후, PEDF-E12-6-12-PEDF 처리군을 정규화하여 비교하였다.
실험예 4 : PEDF-E12-6-12-PEDF 구조체의 세포 독성 평가
이전 연구에 따르면, PEDF 34-mer는 ATP 합성효소 억제를 통해 세포 생존율을 감소시키며, 여러 가지 세포사멸(apoptosis) 과정에 관여하는 것으로 보고되었다.
이에 따라, PEDF-E12-6-12-PEDF의 ZnCl₂유무에 따른 구조체 별 세포 독성을 평가하기 위해 WST-8 시약을 사용하여 HUVEC 생존율을 정량화 하였으며, 결과는 도 8에 나타나 있다.
3 Х 10³ cells/well의 HUVEC를 96-웰 플레이트에 분주한 후, 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 부착을 유도하였다. 이후, 100 μL의 0.01 - 1000 nM 범위의 PEDF-E12-6-12-PEDF(ZnCl₂유무 포함, ZnCl₂농도: 단백질 농도의 9배당량)를 HUVEC에 처리한 후, 4시간 및 12시간 동안 배양하여 세포 생존율 변화를 확인하였다.
대조군으로 ZnCl₂단독, E12-6-12 (ZnCl₂유무 포함, ZnCl₂농도: 단백질 농도의 9배당량)을 사용하였다.
배양 후, 단백질이 포함된 배지를 제거하고, EBM-2 배지에 10% 수용성 테트라졸륨 염(WST-8) 100 μL를 첨가한 후 37°C에서 1~4시간 동안 추가 배양하였다.
세포 생존율에 따른 배지의 색 변화는 Synergy MX Microplate Reader(BioTek, Winooski, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.
HUVEC를 배양 배지에서 유지한 경우 생존율을 100%로 설정하고, 다른 실험군의 생존율을 정규화하여 도 8로 그래프화하였다.
결과 및 논의
Zn2+히스티딘 상호작용을 통해 크기를 조절할 수 있는 다가성 항혈관신생 펩타이드를 포함한 자가조립 나노구조체를 설계하여 항혈관신생 기능을 향상시키고자 하였다.
설계된 항혈관신생 나노구조체는 항혈관신생 PEDF 34-mer와 친수성 EBP 블록 및 소수성 히스티딘-풍부 EBP 블록으로 구성된 열 감응성 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드로 이루어져 있으며, 이는 체온에서 자극 반응성 자가조립 및 His-Zn² 착화를 통한 구조체 크기 조절이 가능하도록 설계되었다. PEDF 34-mer를 포함하는 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드(PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드)는 PEDF cDNA에서 PCR 증폭된 PEDF 34-mer 유전자 단편과 설계된 EBP 유전자를 융합하여 제작되었다.
도 1(A)는 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드 내 PEDF 34-mer, 친수성 EBP 블록(EBP[A₁G₄I₁]₁), 소수성 EBP 블록(EBP[H₃A₂G₁]₁)의 유전자 및 아미노산 서열을 나타낸다. EBP의 전이 온도(Tt)는 반복되는 펜타펩타이드 서열, 게스트 잔기, 그들의 비율 및 블록 길이에 따라 조정되었다. 친수성 EBP 블록은 37°C 이상의 Tt를 가지도록 설계되었으며, PEDF 34-mer에 미치는 영향을 최소화하기 위해 전하를 띠는 아미노산이 포함되지 않았다. 친수성 EBP 블록 EBP[A₁G₄I₁]n은 여섯 개의 펜타펩타이드(VPAXG)가 반복된 구조로, 게스트 잔기 및 그들의 비율(A:G:I = 1:4:1)로 구성되었다.
소수성 EBP 블록은 37°C 이하의 Tt를 가지도록 설계되었으며, Zn2+과의 상호작용을 통해 자가조립 나노구조체의 크기를 조절할 수 있도록 금속 이온 반응성을 갖도록 하였다. 소수성 EBP 블록 EBP[H₃A₂G₁]n은 여섯 개의 펜타펩타이드(IPAXG)로 구성되었으며, 게스트 잔기의 비율은 H:A:G = 3:2:1로 조정되었다.
도 1(B)는 PEDF-EBP 삼중블록 코폴리펩타이드, 즉 PEDF 34-mer-EBP[H₃A₂G₁]n-EBP[A₁G₄I₁]6-EBP[H₃A₂G₁]n-PEDF 34-mer(PEDF-En-6-n-PEDF)의 개략도를 나타낸다. PEDF 34-mer는 자가조립된 나노구조체의 표면에서 다가성 노출을 위해 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드의 양끝에 도입되었다.
ZnCl₂가 없는 경우와 있는 경우 각각의 PEDF-En-6-n-PEDF 자가조립 과정 및 형성된 구조체는 도 1(C) 에 이미지와 함께 제시되었다. Tt 이상에서 소수성 EBP, EBP[H₃A₂G₁]n은 소수성을 띠는 반면, EBP[A₁G₄I₁]n은 여전히 친수성을 유지하였다. 이에 따라 양쪽성(amphiphilicity) 특성을 갖는 PEDF-En-6-n-PEDF는 2 μm 이상의 다가성 PEDF 34-mer를 포함하는 소포형(vesicular) 구조체로 자가조립되었다.
Zn2+이 포함된 PEDF-En-6-n-PEDF는 Tt 이하에서는 가용성 단량체에서 다량체(multimer)로 변화하였고, Tt 이상에서는 불안정한 양쪽성 구조가 1 μm 이하의 응집체(coacervate) 형태로 자가조립되었다.
Zn2+ 착화에 따른 PEDF-En-6-n-PEDF 구조체의 항혈관신생 활성은 시험관 내(in vitro) HUVEC 튜브 형성 실험을 통해 평가되었다. 도 1(D) 는 Matrigel 위에서 HUVEC의 형광 현미경 이미지를 보여준다.
(a) VEGF가 없는 경우, (b) 50 ng/mL VEGF가 포함된 경우, (c) 50 ng/mL VEGF와 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF가 포함된 경우, (d) 50 ng/mL VEGF, 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF 및 9000 nM ZnCl₂가 포함된 경우의 이미지를 나타낸다.
VEGF 자극을 받은 HUVEC는 이동 및 튜브와 유사한 구조를 형성하였다. VEGF에 의해 유도된 HUVEC의 이동 및 튜브 형성은 ZnCl₂가 없는 경우와 있는 경우 각각 PEDF-E12-6-12-PEDF 나노구조체에 의해 평가되었다.
En-6-n 및 PEDF-En-6-n-PEDF(n = 6 및 12) 유전자 구성 및 발현
E. coli에서 발현하기 위한 En-6-n 및 PEDF-En-6-n-PEDF 유전자는 mpET21 벡터에 EBP 및 PEDF 34-mer 유전자를 연속적으로 삽입하여 제작되었다. 이러한 연속 삽입을 통한 유전자 클로닝은 XbaI 및 HindIII 제한효소 처리, 아가로스 젤 전기영동 및 DNA 염기서열 분석을 통해 확인되었다.
XbaI 및 HindIII로 제한효소 처리된 En-6-n 및 PEDF-En-6-n-PEDF 유전자의 아가로스 젤 전기영동 결과는 도 2(A) 에 나타나 있다. 제한된 DNA 단편의 크기는 젤 하단에 표시되었으며, DNA 표준 마커는 좌측에 제시되었다.
아가로스 젤에서 제한된 DNA의 크기는 En-6-n 및 PEDF-En-6-n-PEDF 유전자를 인코딩하는 서열보다 82 염기쌍(bp) 길었는데, 이는 XbaI 및 HindIII 제한효소 절단 부위가 해당 유전자 영역 외부에 위치하기 때문이다. 또한, PEDF-En-6-n-PEDF 유전자의 길이는 En-6-n보다 105 bp 더 길었으며, 이는 102 bp 길이의 PEDF 34-mer 유전자와 제한효소 절단 및 연결 부위에서 추가된 3 bp의 스티키엔드(sticky end)에 기인한 것이다.
En-6-n 및 PEDF-En-6-n-PEDF 단백질은 E. coli에서 발현되었으며, 이전 연구에서 보고된 온도 감응성 EBP 정제 방법과 동일한 역상 상전이법(ITC)을 이용하여 정제되었다. 정제된 단백질의 순도 및 분자량은 구리 염색을 이용한 SDS-PAGE를 통해 확인되었으며, 결과는 도 2(B) 에 나타나 있다. 예상된 En-6-n 및 PEDF-En-6-n-PEDF의 분자량은 각각의 단백질 밴드 하단에 표시되었다.
PEDF-En-6-n-PEDF의 분자량은 En-6-n보다 3763.21 Da PEDF 34-mer의 크기만큼 증가하였으며, 이는 SDS-PAGE 이미지에서 확인할 수 있다.
PEDF-En-6-n-PEDF의 열 감응성 및 농도, pH에 따른 변화
PEDF-En-6-n-PEDF의 열 감응성 및 단백질 농도, pH의 영향을 분석한 결과는 도 2(C-F)에 나타나 있다. 단백질 용액(350 nm)에서의 흡광도를 10°C에서 70°C까지 1°C/분의 가열 속도로 측정하여 탁도 프로파일을 분석하였다. 각 조건에서의 전이 온도(Tt)는 흡광도 프로파일의 변곡점으로 정의되었다.
도 2(C, D)에서 10 mM PBS에서 PEDF-E6-6-6-PEDF의 Tt는 10, 25, 50 및 100 μM 농도에서 각각 32.44, 30.47, 29.27 및 28.27°C로 측정되었다. 또한, 25 μM PEDF-E6-6-6-PEDF의 pH 변화에 따른 Tt는 pH 6.4, 6.8, 7.4 및 8.0에서 각각 34.07, 32.32, 30.42 및 28.52°C로 확인되었다.
도 2(E, F)에서 10 mM PBS에서 PEDF-E12-6-12-PEDF의 Tt는 10, 25, 50 및 100 μM 농도에서 각각 23.17, 21.17, 20.37 및 19.48°C로 나타났다. 또한, 25 μM PEDF-E12-6-12-PEDF의 pH 변화에 따른 Tt는 pH 6.4, 6.8, 7.4 및 8.0에서 각각 25.06, 23.21, 20.37 및 20.46°C로 측정되었다.
두 라이브러리에서 단백질 농도 및 pH가 증가할수록 Tt가 감소하는 경향을 보였으며, 이는 기존 보고와 일치하였다.
PEDF-En-6-n-PEDF의 열 감응성과 ZnCl₂의 영향
PEDF-En-6-n-PEDF의 열 감응성 및 ZnCl₂의 영향을 분석한 결과는 도 3 에 나타나 있다. 단백질 용액(350 nm)에서의 흡광도를 10°C에서 60°C까지 1°C/분의 가열 속도로 측정하여 탁도 프로파일을 분석하였다. 각 조건에서의 Tt는 흡광도 프로파일의 변곡점으로 정의되었다.
도 3(A)에서 10 mM HEPES에서 10 μM 농도 E6-6-6, E12-6-12, PEDF-E6-6-6-PEDF 및 PEDF-E12-6-12-PEDF의 Tt는 각각 41.62, 31.22, 43.12 및 35.12°C로 측정되었다.
E12-6-12 및 PEDF-E12-6-12-PEDF의 Tt는 각각 E6-6-6 및 PEDF-E6-6-6-PEDF보다 10.04°C 및 7.90°C 낮았으며, 이는 EBP 블록의 길이가 길수록 Tt가 감소하는 기존 보고와 일치하였다. PEDF-E6-6-6-PEDF 및 PEDF-E12-6-12-PEDF의 Tt는 E6-6-6 및 E12-6-12보다 각각 1.50°C 및 4.00°C 높게 나타났으며, 이는 PEDF 34-mer의 전하가 인접한 소수성 EBP 블록의 응집을 방해했기 때문으로 추정된다.
도 3(B)에서는 PEDF-E12-6-12-PEDF의 열 감응성에 대한 ZnCl₂의 영향을 분석하였다. 이 단백질은 37°C 이하에서 전이 온도를 가지므로, Tt가 40°C 이상인 E6-6-6 및 PEDF-E6-6-6-PEDF와 비교하여 추가적인 실험이 진행되었다.
이론적으로, 단일 E12-6-12 및 PEDF-E12-6-12-PEDF는 720개의 히스티딘(His)을 포함하며, 따라서 10 μM 단백질에 대한 [His] : [Zn2+] 비율은 45, 90 및 180 μM ZnCl₂에서 각각 16:1, 8:1 및 4:1로 계산되었다.
도 3(B)에서 10 μM PEDF-E12-6-12-PEDF의 Tt는 ZnCl₂가 없는 경우 35.22°C에서 45 및 90 μM ZnCl₂에서 각각 32.42°C 및 29.62°C로 감소하였다. 180 μM ZnCl₂가 포함된 경우, 단백질이 20°C에서 응집되어 상전이가 관찰되지 않았다.
ZnCl₂ 농도가 증가할수록 히스티딘을 포함하는 EBP의 Tt가 감소하고, 특정 농도 이상에서는 LCST(lower critical solution temperature) 현상이 관찰되지 않는다는 결과는 기존 연구와 일치하였다. 히스티딘이 풍부한 EBP 블록은 Zn2+과의 킬레이션을 통해 다량체(multimer)로 전환되며, 이에 따라 Tt가 감소하였다.
PEDF-E12-6-12-PEDF의 열 유발 자가조립 및 ZnCl₂의 영향
ZnCl₂ 농도 변화에 따른 PEDF-E12-6-12-PEDF의 자가조립을 분석하기 위해, 다양한 ZnCl₂ 농도에서 전이 온도 이하 및 이상에서의 수화 반경(RH)을 측정하였다.
도 3(C, D)에서 10 μM PEDF-E12-6-12-PEDF의 RH는 20°C에서 ZnCl₂가 없는 경우 7.85 ± 0.65 nm의 가용성 단량체였으며, 45 및 90 μM ZnCl₂를 첨가한 경우 각각 46.55 ± 5.89 및 62.60 ± 7.66 nm로 증가하였다. 180 μM ZnCl₂를 첨가한 경우, PEDF-E12-6-12-PEDF는 1 μm 이상의 크기로 응집되었다.
ZnCl₂의 존재 유무에 따른 PEDF-E12-6-12-PEDF의 자가조립 및 구조체 분석
ZnCl₂가 없는 경우, PEDF-E12-6-12-PEDF는 20°C에서 반경 10 nm 미만의 가용성 단량체(unimer)로 존재했으며, 37°C에서 자가조립을 통해 반경 1000 nm 이상의 나노구조체를 형성하였다.
ZnCl₂가 존재하는 경우, 20°C에서도 가용성 상태를 유지했지만, 히스티딘이 풍부한 EBP 블록이 Zn2+과 상호작용하여 분자 간 His-Zn2+ 결합이 형성되었고, 이에 따라 수화 반경(RH)이 100 nm 이하로 증가하였다. 37°C에서 Zn2+을 포함한 히스티딘이 풍부한 EBP는 소수성을 띠게 되었으며, 결과적으로 Zn2+이 포함된 소수성 블록이 결합하여 형성된 자가조립된 다가성(multivalent) 구조체는 Zn2+가 없는 경우보다 작은 크기의 나노구조체로 자가조립되었다.
ZnCl₂ 45 또는 90 μM이 첨가된 PEDF-E12-6-12-PEDF의 RH는 ZnCl₂가 없는 경우보다 500 nm 이하로 유의미하게 감소하였다. 일반적으로 자가조립 구조체의 반경은 지질의 부피 분율이 증가할수록 커진다. ZnCl₂의 존재 여부와 관계없이 친수성 EBP 블록의 부피는 20°C 및 37°C에서 일정하게 유지되지만, Zn2+이 포함된 소수성 코어는 Zn2+이 없는 경우보다 더욱 조밀하게 패킹될 가능성이 높다. 따라서, Zn2+이 포함된 PEDF-E12-6-12-PEDF의 소수성 코어의 부피 분율값은 Zn2+이 없는 경우보다 낮아지며, 결과적으로 ZnCl₂가 존재할 때 더 작은 구조체로 자가조립되었다.
PEDF-E12-6-12-PEDF의 자가조립 구조체 및 이미징
PEDF-E12-6-12-PEDF 자가조립 구조체는 탈이온수(DW) 및 PBS에서 준비되어 이미징되었다. PEDF-E12-6-12-PEDF는 4 M 요소(urea) 용액에서 완전히 용해되어 전이 온도(Tt)를 증가시킨 후, 자가조립을 위해 DW 또는 PBS로 투석되었다.
그 결과, PEDF-E12-6-12-PEDF는 2700 nm 또는 2400 nm 반경을 가지는 완전 충전된 나노구조체 (fully filled nanostructure) 또는 토로이드형 나노구조체 (toroidal structure)로 자가조립되었으며, 도 4(A-D) 및 4(E-H) 에 각각 제시되었다.
추가적인 시험관 내(in vitro) HUVEC 항혈관신생 실험 및 이미징을 위해 PEDF-E12-6-12-PEDF와 ZnCl₂의 비율을 1:9로 설정하였다.
ZnCl₂의 존재 유무에 따른 PEDF-E12-6-12-PEDF 자가조립 구조체를 확인하기 위해 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 및 투과전자현미경(TEM) 이미징을 수행하였다.
ZnCl₂유무에 따른, CLSM을 이용한 팽윤 상태(swollen state) 이미징은 10 mM HEPES에서 37°C에서 촬영되었으며, 결과는 도 4(I, J)에 각각 나타나 있다. ZnCl2 가 없는 경우 (도4(I)), 해당 구조체는 2 μm 이하의 균일한 구형 구조체를 보였으며, 이는 ZnCl₂가 없는 경우 37°C에서 PEDF-E12-6-12-PEDF가 반경 1445.33 ± 82.04 nm 크기의 나노구조체로 자가조립되었음을 보여주는 DLS 결과와 일치하였다.
TEM 이미징(도 4(K, L) )은 90 μM ZnCl₂를 포함한 10 mM HEPES에서 10 μM PEDF-E12-6-12-PEDF 를 37°C에서 건조시켜 준비되었다. TEM 이미지에서 관찰된 구형 나노구조체는 반경 200 nm 이하의 완전 충전된 나노구조체를 나타내었으며, 이는 건조 과정으로 인해 DLS에서 측정된 수화 반경(221.73 ± 58.33 nm)보다 작게 나타났다.
Zn2+과의 착화로 인해 단백질 나노구조체는 인산텅스텐산(PTA) 염색 없이도 관찰될 수 있었다.
PEDF-E12-6-12-PEDF 자가조립 나노구조체의 HUVEC 튜브 형성 억제 효과
ZnCl₂ 첨가 여부에 따라 PEDF-E12-6-12-PEDF 자가조립 구조체가 HUVEC의 튜브 형성에 미치는 억제 효과를 시험관 내에서 추가로 평가하였다. 그 결과를 도 5에 도시하였다.
0.01 - 1000 nM 범위의 PEDF-E12-6-12-PEDF(ZnCl₂ 유무 포함)를 HUVEC에 처리하였으며, HUVEC는 rhVEGF165(50 ng/mL)에 의해 이동 및 튜브 형성이 유도되었다. 0.01 및 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF(ZnCl₂ 유무 포함)를 rhVEGF165와 함께 처리하여 대조군으로 사용하였다.
Calcein-AM 염색한 HUVEC 에 4시간 동안 처리 후, 세포의 형광 현미경 이미지를 촬영하였으며, 결과는 도 5(A) 에 제시되었다. 또한, HUVEC의 정규화된 튜브 길이를 기반으로 튜브 형성 정도를 나타낸 그래프는 도 5(B) 에 나타나 있다.
도 5(A)와 같이, rhVEGF165를 처리한 HUVEC는 rhVEGF165를 처리하지 않은 HUVEC보다 더 활발하게 이동하여 튜브 모양의 네트워크를 형성하였다.
rhVEGF165 처리 유무에 따라 이동된 HUVEC의 튜브 길이를 각각 0% 및 100%로 설정하였고, ZnCl₂를 함께 처리한 HUVEC와 처리하지 않은 HUVEC의 이동된 튜브 길이를 정규화하였다.
rhVEGF165 하에서 ZnCl₂유무에 따른 E12-6-12, E12-6-12 + ZnCl₂를 처리한 HUVEC의 튜브 형성 정도는 농도에 관계없이 rhVEGF165 단독 처리군과 유의미한 차이를 보이지 않았다.
그러나 VEGF 자극 하에서 ZnCl₂유무에 따른 PEDF-E12-6-12-PEDF 처리군의 튜브 형성은 10 내지 1000 nM 범위에서 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다.
ZnCl₂가 없는 경우, PEDF-E12-6-12-PEDF는 10nM 이상에서 HUVEC의 튜브 형성을 억제하였으며, 1000 nM에서 단백질로 처리한 HUVEC의 억제 효과는 VEGF 자극이 없는 HUVEC보다 더 낮은 튜브 형성도를 보였다.
ZnCl₂를 포함하는 경우, PEDF-E12-6-12-PEDF는 0.01 nM에서 HUVEC의 튜브 형성을 억제하였고, 100 nM 이상의 단백질을 처리한 농도에서는 VEGF 자극이 없는 HUVEC보다 더 낮은 튜브 형성도를 보였다.
ZnCl₂를 포함하는 경우, PEDF-E12-6-12-PEDF는 ZnCl₂를 첨가하지 않은 경우보다 낮은 농도에서 HUVEC의 튜브 형성을 억제하였다. 나아가, ZnCl₂를 포함한 PEDF-E12-6-12-PEDF는 해당 농도에서 ZnCl₂를 첨가하지 않은 경우보다 더 높은 억제 효과를 나타내었다.
추가적으로, ZnCl₂가 없는 1000 nM PEDF-E12-6-12-PEDF로 처리된 HUVEC는 ZnCl₂를 처리한 경우 보다 더 낮은 튜브 형성도를 나타내었다(도 5(B) 참조).
PEDF-E12-6-12-PEDF 자가 조립 나노구조체의 종류에 따른 튜브 형성 억제 효과
PEDF-E12-6-12-PEDF의 자가 조립 나노구조체의 종류에 따라 HUVEC의 튜브 형성 억제 효과를 시험관 내에서 추가로 평가하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 도시하였다.
ZnCl₂유무에 따라 HEPES에서 0.001 - 1000 nM 농도의 PEDF-E12-6-12-PEDF의 소포 구조체 혹은 코아세르베이트 구조를 형성하였고, PBS에서 0.001 - 1000 nM 농도 범위의 PEDF-E12-6-12-PEDF 토로이드 구조체를 준비하였다. 각 구조들을 처리한 HUVEC의 이동과 튜브 형성은 Matrigel에서 rhVEGF165(50 ng/mL)에 의해 자극되었다.
4시간 동안 Calcein-AM 염색한 HUVEC의 세포 형광 현미경 이미지는 도 6(A) 및 도 7(A)에 제시되었고, HUVEC의 정규화된 튜브 길이를 기반으로 계산된 튜브 형성 정도를 나타낸 그래프는 도 6(B), 정규화된 결합점(junction)의 개수를 기반으로 튜브 형성 정도를 나타낸 그래프는 도 7(B)에 나타나 있다.
도 6(A) 및 도 7(A)과 같이, rhVEGF165를 처리한 HUVEC은 rhVEGF165를 처리하지 않은 HUVEC보다 더 많이 이동하여 네트워크를 형성했습니다.
rhVEGF165 유무에 따라 이동한 HUVEC의 튜브 길이 또는 결합점 수는 각각 0 또는 100%로 설정되었고, PEDF-E12-6-12-PEDF로 처리한 이동한 HUVEC의 튜브 길이 또는 결합점 수는 정규화되었다.
rhVEGF165 자극 하에서 ZnCl2 유무에 따라 PEDF-E12-6-12-PEDF로 배양한 HUVEC의 튜브 형성은 용량 의존적으로 0.001 - 1000 nM 범위에서 감소했다. ZnCl2 없거나 있을 때 PEDF-E12-6-12-PEDF는 각각 1 및 0.001 nM 이상에서 HUVEC의 튜브 형성을 억제했으며, 1000 nm에서 단백질로 처리한 HUVEC의 정도는 ZnCl2와 관계없이 rhVEGF165 자극이 없는 HUVEC보다 낮았다. 농도 범위와 억제 정도는 도 5의 결과와 일치했다. PBS에서 PEDF-E12-6-12-PEDF의 토로이드 구조는 0.001 nM에서 용량 의존적 방식으로 HUVEC의 튜브 형성을 억제하고 rhVEGF165 자극을 완전히 억제하여 rhVEGF165를 처리하지 않은 HUVEC보다 튜브 형성 정도가 낮았다.
토로이드 구조의 억제 정도와 패턴은 ZnCl2가 없는 소포 구조체와 유사했고, 이는 아마도 크기에 따라 HEPES와 PBS에서 ZnCl2가 없는 PEDF-E12-6-12-PEDF와 ZnCl2가 있는 PEDF의 각 반경이 1,445.33, 221.73 및 2,400nm였기 때문일 수 있다.
PEDF-E12-6-12-PEDF 구조체의 세포 독성
세포 생존력과 관련된 항혈관신생에 대한 PEDF 34-mer의 메커니즘을 고려하여, ZnCl2 유무에 따른 PEDF-E12-6-12-PEDF 구조의 세포독성을 WST-8 시약을 사용하여 HUVEC 생존력(viability)을 정량화하여 도 8에 도시하였다.
PEDF 34-mer는 ATP 합성효소를 억제하여 세포의 생존력을 감소시키고 여러 세포 사멸 과정에 관여한다고 보고되어 있다.
ZnCl2 유무에 따라 0.01~1000 nM 범위의 PEDF-E12-6-12-PEDF를 HUVEC에 처리하고 4시간, 12시간 동안 배양하여 HUVEC 튜브 형성을 억제하는 동안 생존력에 미치는 효과를 확인하였다. ZnCl2 유무에 따라 E12-6-12를 대조군으로 HUVEC에 처리했다. 배지에서 배양한 HUVEC의 생존율은 100%로 설정하고 다른 값은 정규화하였다.
ZnCl2와 E12-6-12로 처리한 HUVEC는 농도에 관계없이 배지에서 배양한 HUVEC와 비교하여 생존율이 유의하게 감소하지 않았다. ZnCl2를 사용하거나 사용하지 않고 PEDF-E12-6-12-PEDF로 처리한 HUVEC의 생존율도 농도에 관계없이 유의하게 감소하지 않았다. 이는 PEDF-E12-6-12-PEDF의 구조가 HUVEC에 대해 세포독성이 없고 세포 생존율의 감소 없이 HUVEC의 이동과 튜브 형성을 억제한다는 것을 나타낸다.
결론
유전적으로 설계된 PEDF 34-mer 및 히스티딘을 포함하는 EBP 삼중블록 코폴리펩타이드(PEDF-EBP)는 박테리아에서 발현되었으며, 크로마토그래피를 사용하지 않는 정제 방법을 통해 정제되었고, 다가성 항혈관신생 펩타이드인 PEDF 34-mer를 포함하는 나노구조체로 자가조립되었다.
자가조립된 구조체의 변화 및 완충 용액과 히스티딘-Zn2+착화에 따른 크기 변화는 수화 반경(RH) 측정 및 이미징을 통해 확인되었다.
PEDF-EBP는 전이 온도(Tt) 이하에서 가용성 단량체(unimer)로 존재했으며, Tt 이상에서는 2 μm 이상의 나노구조체로 자가조립되었다. ZnCl₂가 존재할 경우, 나노구조체의 크기는 1 μm 이하로 감소하였다.
나노구조체의 형성과 크기 감소는 DLS 측정 및 TEM 이미지를 통해 명확하게 확인되었다. ZnCl₂가 없는 경우 2 μm 이상의 구조체와 ZnCl₂가 포함된 경우 1 μm 이하의 구조체는 각각 소포형(vesicular structure) 및 응집체(coacervate)로 이미지 분석을 통해 규명되었다.
ZnCl₂가 없는 2 μm 이상의 구조체와 ZnCl₂가 포함된 1 μm 이하의 구조체는 VEGF 자극 하에서 HUVEC의 튜브 형성을 농도 의존적으로 억제하였다. 또한, 두 구조체 모두 VEGF 자극 하에서 rhVEGF165가 없는 조건만큼 튜브 형성을 억제하였다.
특히, ZnCl₂가 포함된 응집체(coacervate)가 ZnCl₂ 없는 소포형 구조체보다 더 높은 HUVEC 튜브 형성 억제 효과를 보였다.
즉, 본 발명의 다중 자극 반응성 블록 코폴리펩타이드로 형성된 자가조립 구조체는 크기를 조절할 수 있는 다가성(multivalent) 나노구조체가 향상된 항혈관신생 치료제로 활용될 수 있다.
이상으로 본 출원의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

  1. 색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드; 및 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드로서,
    하기 식 1 로 표시되는 다중 블록 코폴리펩타이드.
    [식 1]
    [A]-[B]n-[C]m-[B]n-[A]
    상기 식 1에서,
    상기 A 블록은 PDEF 유래 펩타이드이고,
    상기 B 블록 또는 C 블록은 서로 다른 EBP이며,
    n 및 m는 같거나 서로 다른 정수이고, 각 블록이 반복되는 횟수임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 B 블록은 소수성 EBP인, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 소수성 EBP는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적이고 반복적으로 포함하는, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 소수성 EBP 블록의 반복 횟수는 1 내지 36인 것인, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 C 블록은 친수성 EBP인, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 친수성 EBP는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적이고 반복적으로 포함하는, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 친수성 EBP 블록의 반복 횟수는 1 내지 36인 것인, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 PEDF 유래 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  9. 제1항의 다중 블록 코폴리펩타이드를 포함하고, 자극 반응성을 나타내는, 다중 자극 반응성 약물전달체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 자극은 온도, 단백질 농도, pH 또는 Zn 이온 중 1 이상인 것을 특징으로 하는, 다중 자극 반응성 약물전달체.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 코폴리펩타이드는 상기 자극에 의해 크기가 조절된 나노 구조를 형성하는 것인, 다중 자극 반응성 약물전달체.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 나노 구조는 소포형, 코아세르베이트 또는 토로이드 구조인, 다중 자극 반응성 약물전달체.
  13. 색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드; 및 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물로서,
    하기 식 1 로 표시되는 약학적 조성물.
    [식 1]
    [A]-[B]n-[C]m-[B]n-[A]
    상기 식 1에서,
    상기 A 블록은 PDEF 유래 펩타이드이고,
    상기 B 블록은 소수성 EBP이고,
    상기 C 블록은 친수성 EBP이며,
    n 및 m는 같거나 서로 다른 정수이고, 각 블록이 반복되는 횟수임.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 소수성 EBP는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적이고 반복적으로 포함하는, 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 친수성 EBP는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적이고 반복적으로 포함하는, 약학적 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 친수성 EBP 블록의 반복 횟수는 1 내지 36인 것인, 약학적 조성물.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 PEDF 유래 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  18. 제13항의 약학적 조성물을 포함하는 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
PCT/KR2025/002385 2024-02-20 2025-02-19 항신생혈관용 다중 자극 반응성 색소상피유래인자-엘라스틴 멀티 블록 코폴리펩타이드, 다가성 자가조립 나노구조체 및 이의 약학적 조성물 Pending WO2025178367A1 (ko)

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