WO2025152803A1 - 一种靶向traf6的多肽及其用途 - Google Patents

一种靶向traf6的多肽及其用途

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Definitions

  • TDP-43 is a 414-amino acid protein encoded by the TARDBP gene. TDP-43 plays an important role in RNA transcription, splicing, transport, translation, and mRNA stability regulation in cells.
  • TDP-43 is a highly conserved, ubiquitously expressed protein with strictly self-regulated expression levels. It constantly shuttles between the nucleus and cytoplasm and is mainly localized in the nucleus under physiological conditions. In a variety of neurodegenerative diseases (such as ALS and FTLD), most TDP-43 proteins show abnormal aggregation and localization in the cytoplasm and neurons. It has been reported that TDP-43 aggregation is closely related to autonomous degenerative changes in neurons, and its aggregation in neurons and glial cells of the central nervous system has become a pathological hallmark of neurodegenerative diseases such as ALS and FTLD-TDP.
  • TDP-43 protein diseases such as ALS and FTLD.
  • TDP-43 protein diseases such as ALS and FTLD.
  • FTLD TDP-43 protein diseases
  • the TRAF6 inhibitor is used to treat and/or prevent a neurodegenerative disease.
  • the neurodegenerative disease comprises one or more of frontotemporal dementia, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and Parkinson's disease.
  • the neurodegenerative disease comprises a TDP43 proteinopathy.
  • the TRAF6 inhibitor is used to target TRAF6 to inhibit the interaction of TRAF6 with TDP43 and/or TDP43 mutants, thereby inhibiting the formation of aggregates of the TDP43 and/or TDP43 mutants.
  • the interaction region includes the zinc finger domain and/or coiled coil domain of TRAF6. It has been experimentally verified that the polypeptide provided by the present invention does not target the RING domain in TRAF6 that is more related to its ubiquitin ligase activity. In other words, the polypeptide provided by the present invention can not only effectively inhibit TRAF6, but also will not interfere with the ubiquitin ligase function of TRAF6.
  • the present invention provides a use of a polypeptide in the preparation of a drug for treating and/or preventing neurodegenerative diseases, characterized in that the polypeptide comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the neurodegenerative disease comprises one or more of frontotemporal dementia, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and Parkinson's disease. In some embodiments, the neurodegenerative disease comprises a TDP43 proteinopathy.
  • the TDP43 mutants include but are not limited to one or more of A90V, P112H, G295S, G298S, S379A and I383. It has been verified that the polypeptides provided by the present invention exhibit excellent inhibitory effects on the cytoplasmic aggregation of various TDP43 mutants.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the above polypeptide.
  • nucleotide sequence of the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 5 and/or SEQ ID NO: 6.
  • the present invention provides a gene expression vector, characterized in that the gene expression vector comprises the above-mentioned nucleic acid molecule.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition, characterized in that the pharmaceutical composition comprises a first polypeptide fragment, wherein the amino acid sequence of the first polypeptide fragment comprises SEQ ID NO: 1.
  • the first polypeptide fragment (SEQ ID NO: 1) provided by the present invention can inhibit the cytoplasmic aggregation of TDP43 and/or TDP43 mutants, thereby achieving the treatment of neurodegenerative diseases.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a method for treating and/or preventing a neurodegenerative disease in a subject, characterized in that the method comprises administering an effective amount of the above-mentioned polypeptide, the above-mentioned gene expression vector, or the above-mentioned pharmaceutical composition to a subject in need.
  • the neurodegenerative disease comprises a TDP43 proteinopathy. In some embodiments, the neurodegenerative disease comprises one or more of frontotemporal dementia, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and Parkinson's disease.
  • subject refers to any organism upon which the present invention can be used or applied. Typical subjects include mammals, such as mice, rats, rabbits, non-human primates, and humans.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of a therapeutic agent that is observed in a relevant population to achieve a specific therapeutic effect when the administration of the therapeutic agent is associated with or reasonably expected.
  • the therapeutically effective amount may be an amount that (a) inhibits the cytoplasmic aggregation of TDP43 and/or TDP43 mutants; (b) inhibits the cytoplasmic aggregation of insoluble TDP35; and/or (c) inhibits the abnormal aggregation of proteins associated with the neurodegenerative disease.
  • the present invention provides a method for reducing the cytoplasmic aggregation of TDP43 and/or TDP43 mutants in cells, characterized in that the method comprises administering an effective amount of the above-mentioned polypeptide, the above-mentioned gene expression vector, or the above-mentioned pharmaceutical composition to the cells.
  • the cell is a neuronal cell or a non-neuronal cell. In some embodiments, the cell expresses TDP43 and/or a TDP43 mutant. In some embodiments, the cell also expresses one or more of Tau protein, mutant SOD1 protein, ⁇ -synuclein, mutant DJ-1 protein, and Huntington protein.
  • the present invention provides a method for reducing the level of a protein associated with a neurodegenerative disease in a cell, characterized in that the method comprises administering an effective amount of the above-mentioned polypeptide, the above-mentioned gene expression vector, or the above-mentioned pharmaceutical composition to the cell.
  • the cell is a neuronal cell or a non-neuronal cell.
  • the cell expresses one or more of Tau protein, mutant SOD1 protein, ⁇ -synuclein, mutant DJ-1 protein and Huntington protein.
  • the cell also expresses TDP43 and/or TDP43 mutant.
  • FIG1a is a graph showing experimental results showing that TRAF6 specifically immunoprecipitates endogenous TDP43;
  • FIG1b is a diagram showing experimental results showing that TRAF6 promotes abnormal aggregation of TDP43 in cells
  • FIG1e is a graph showing experimental results showing that TRAF6 significantly increases the accumulation of TDP43 in the insoluble fraction
  • FIG2e is a graph showing experimental results that TRAF6 ZC promotes the aggregation of TDP43;
  • FIG4b is a graph showing the experimental results of the first polypeptide fragment alleviating the aggregation of TDP35 in cells
  • FIG5 is a graph showing the experimental results of the inhibitory effects of the first polypeptide fragment, the second polypeptide fragment and the third polypeptide fragment;
  • FIG6a is a diagram showing the results of an immunoblotting experiment showing the inhibitory effect of the first polypeptide fragment on the aggregation of TDP43 mutants;
  • FIG6 b is a graph showing the results of an immunofluorescence experiment showing the inhibitory effect of the first polypeptide fragment on the aggregation of TDP43 mutants;
  • FIG6c is a diagram showing the results of an immunoblotting experiment showing the inhibitory effect of the first polypeptide fragment on the aggregation of TAU protein
  • plural means two or more than two, ie, it includes two, three, four, five, etc.
  • the term "about” typically means +/- 5% of the stated value, more typically +/- 4% of the stated value, more typically +/- 3% of the stated value, more typically +/- 2% of the stated value, even more typically +/- 1% of the stated value, and even more typically +/- 0.5% of the stated value.
  • TDP-43 (Gene ID: 23435), TRAF6 (Gene ID: 7189), and TAU (Gene ID: 4137) genes were amplified from a cDNA library of HEK 293T cells. For protein expression in mammalian cells, these genes were inserted into pcDNA3.1 or pCMV plasmids. For expression in E. coli, these genes were placed into pET28a plasmid. TDP43 and its N-terminally fused EGFP mutants were cloned into pLKO.1-CMV plasmid. pMD2.G and psPAX2 plasmids were used for lentivirus production.
  • pX330 and PUC19 plasmids were used to construct knockout cell lines. The DNA sequences of all plasmids were verified.
  • Strep II antibody (ABT2230) was purchased from Abbkine. Strep II antibody (HA500061) was purchased from Huabio. Ubiquitin antibody (sc-8017) and GFP antibody (sc-9996) were purchased from Santa Cruz.
  • Anti-HA (M20003), anti-Flag (M20008), and HRP-conjugated anti-His (M20020S) antibodies were purchased from Abmart. Immunofluorescence secondary antibodies (A32732, A32733, A32742) were purchased from Thermo Fisher.
  • HEK 293T cells (catalog number #GNHu17) and SH-SY5Y cells (catalog number #SCSP-5014) were obtained from the National Model and Specialty Experimental Cell Resource Bank.
  • HEK 293T cells were cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 in a humidified environment.
  • SH-SY5Y cells were cultured in basal medium (MEM) supplemented with 44.5% Ham's F-12 medium, 10% FBS, and 1% NEAA. Transient transfection was performed using Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's instructions.
  • Immunofluorescence Wash cells three times with PBS and fix with methanol (precooled at -20°C) for five minutes. Then, block with 10% goat serum (dissolved in PBS, supplemented with 0.3% Triton X-100) at room temperature for one hour. Incubate with primary antibody overnight at 4°C. After incubation with fluorescent secondary antibody for one hour at room temperature, wash the membrane three times with PBS. Mount with mounting medium containing DAPI. Image the samples using a fluorescence microscope. Quantify the immunofluorescence data using ImageJ.
  • Immunoprecipitation and pulldown experiments For immunoprecipitation, cells were collected and lysed on ice with lysis buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5% glycerol, and 1% protease inhibitor cocktail) for 30 min. After centrifugation at 15,000 rpm/min for 30 min at 4°C, Flag or Strep II affinity gel was added to the samples and Flag beads were bound overnight at 4°C and Strep II beads were bound for 3 h at room temperature. The beads were washed with lysis buffer and denatured with loading buffer for immunoblot analysis.
  • lysis buffer 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5% glycerol, and 1% protease inhibitor cocktail
  • purified proteins were incubated with nickel beads in binding buffer (25 mM HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, and 1 mM DTT) for 2 h at 4°C.
  • binding buffer 25 mM HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, and 1 mM DTT
  • the nickel beads were washed three times with binding buffer and denatured with loading buffer for immunoblot analysis.
  • TRAF6 interacts with TDP43 in living cells and promotes its aggregation
  • the confocal image of Figure 4b shows that in HEK293T cells expressing the first polypeptide fragment, the incidence of EGFP-TDP35 aggregation is significantly reduced, that is, the first polypeptide fragment provided by the present invention reduces the aggregation of TDP35 in cells.
  • immunoblotting experiments have shown that the first polypeptide fragment reduces insoluble TDP35, that is, the first polypeptide fragment provided by the present invention reduces the insolubility of TDP35 dependent on TRAF6 in cells.
  • the first polypeptide fragment can also inhibit the aggregation of TDP35 in SHY5Y cells. The above results show that the first polypeptide fragment provided by the present invention can inhibit the aggregation of TDP35 in living cells.

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Abstract

一种靶向TRAF6的多肽及其用途。提供了一种多肽在制备TRAF6抑制剂中的用途，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。提供的多肽能够有效地抑制TRAF6，进而实现对神经退行性疾病相关聚集体的抑制，在改善、缓解和/或治疗神经退行性疾病中展现出巨大的潜力。

Description

一种靶向TRAF6的多肽及其用途
本申请要求2024年1月17日提交的中国发明专利申请202410068760X“一种靶向TRAF6的多肽及其用途”的优先权，该优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明涉及神经退行性疾病领域，具体涉及一种靶向TRAF6的多肽及其用途。
背景技术
反式激活应答(TAR)DNA/RNA结合蛋白43(TDP-43)是TARDBP基因编码的具有414个氨基酸的蛋白质。TDP-43在细胞内的RNA转录、剪接、转运、翻译以及mRNA稳定性调节等过程中均发挥重要功能。
TDP-43是高度保守、普遍表达且表达水平严格自调节的蛋白质，其不断在细胞核与细胞质之间穿梭，在生理状态下，主要定位于细胞核。在多种神经退行性疾病(例如ALS和FTLD)中，大多数TDP-43蛋白表现为在细胞质和神经元的异常聚集和定位。据报道，TDP-43聚集与神经元发生自主性退行性改变密切相关，其在中枢神经系统的神经元和胶质细胞的聚集已经成为ALS和FTLD-TDP等神经退行性疾病的病理学标志。
目前，TDP-43蛋白病(例如ALS和FTLD)缺少有效的治疗手段。过去的几十年间，约有40多项针对ALS患者的临床实验没有显示出良好的治疗前景，而且这些临床实验对病程进展或患者生存率没有明显改善。利鲁唑是目前唯一公认对缓解ALS进展有效的药物，其可以改善患者的生存状态，但却无法阻止ALS病情的发展。据报道，利鲁唑仅能够延长患者平均生存期3-6个月，却会带来较多的副作用，包括恶心、呕吐、腹泻和肝毒性。此外，临床上针对FTLD的治疗，主要是针对FTLD患者的行为、运动、认知障碍等来对症治疗，这些治疗手段仅可以缓解FTLD患者的一些症状，但并不能遏制病情的发展。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种多肽在制备TRAF6抑制剂中的用途，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。据报道，TRAF6能够促进突变型SOD1、α-突触核蛋白、突变型DJ-1、亨廷顿蛋白等多种神经退行性疾病相关蛋白的聚集，以影响多种神经退行性疾病。本发明提供的多肽能够竞争性地与TRAF6相互作用，以特异性且有效地靶向TRAF6，进而实现对神经退行性疾病的改善、缓解和/或治疗。
在一些实施例中，所述TRAF6抑制剂用于治疗和/或预防神经退行性疾病。在一些实施例中，所述神经退行性疾病包含额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病和帕金森病中的一种或多种。
在一些实施例中，所述神经退行性疾病包含TDP43蛋白质病。
需要强调的是，本发明实验证明，TRAF6可以与活细胞中的TDP43相互作用并促进其在细胞质的聚集。而神经退行性疾病还普遍存在TDP43在细胞质(例如神经元和胶质细胞)异常聚集的病理特征。本发明提供的多肽不仅可以通过竞争性地与TRAF6相互作用，而且还可以特异性且有效地减轻TRAF6与TDP43和/或TDP43突变体的结合，进而实现对神经退行性疾病相关聚集体的抑制，例如包含：(a)抑制TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集；(b)抑制不溶性TDP35的细胞质聚集；和/或(c)抑制与神经退行性疾病相关的蛋白的异常聚集。综上所述，本发明提供的多肽能够抑制多种神经退行性疾病相关的细胞质不溶物(特别是神经元不溶物)的形成，一定程度上保护了神经元免受细胞质聚集体的影响，能够更好地治疗多种神经退行性疾病，特别是TDP43蛋白质病。
在一些实施例中，所述多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
经验证，不仅本发明提供的第一多肽片段(SEQ ID NO:1，第二多肽片段和第三多肽片段形成的融合蛋白)能够实现对TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的抑制，单独的第二多肽片段(SEQ ID NO:2)或第三多肽片段(SEQ ID NO:3)也能够一定程度上实现对TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的抑制。也就是说，可以预期的是，包含第一多肽片段的部分片段且完整包含第二多肽片段的融合蛋白，以及包含第一多肽片段的部分片段且完整包含第三多肽片段的融合蛋白，应具有对TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的抑制活性。
在一些实施例中，所述TRAF6抑制剂用于靶向TRAF6来抑制TRAF6与TDP43和/或TDP43突变体的相互作用，进而抑制所述TDP43和/或TDP43突变体聚集体的形成。
在一些实施例中，所述相互作用的区域包括所述TRAF6的锌指结构域和/或卷曲螺旋结构域。经实验验证，本发明提供的多肽并非靶向TRAF6中与其泛素连接酶活性较为相关的RING结构域。也就是说，本发明提供的多肽不仅能够有效地抑制TRAF6，而且不会干扰TRAF6的泛素连接酶功能。
综上所述，本发明提供的多肽能够作为一种TRAF6抑制剂，有效地抑制TRAF6(特别是抑制TRAF6与TDP43和/或TDP43突变体的结合)，进而从不同维度(例如抑制TRAF6和/或TDP43)实现对神经退行性疾病相关聚集体的抑制，在改善、缓解和/或治疗神经退行性疾病中展现出巨大的潜力，有望提高神经退行性疾病患者的生存率。此外，本发明提供的多肽为人源，免疫原性较低、副作用较少。
第二方面，本发明提供了一种多肽在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
如本文所使用，“氨基酸序列中的部分”指的是所提及的氨基酸序列中的至少一个氨基酸。
在一些实施例中，所述神经退行性疾病包含额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病和帕金森病中的一种或多种。在一些实施例中，所述神经退行性疾病包含TDP43蛋白质病。
在一些实施例中，所述用途包含以下中的一种或多种：(a)抑制TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集；(b)抑制不溶性TDP35的细胞质聚集；(c)抑制与所述神经退行性疾病相关的蛋白的异常聚集。
在一些实施例中，所述TDP43突变体包括但不限于A90V、P112H、G295S、G298S、S379A和I383中的一种或多种。经验证，本发明提供的多肽在多种TDP43突变体的细胞质聚集中都展现了优秀的抑制效果。
在一些实施例中，所述神经退行性疾病相关的蛋白包含Tau蛋白、突变型SOD1蛋白、α-突触核蛋白、突变型DJ-1蛋白和亨廷顿蛋白中的一种或多种。经验证，本发明提供的多肽还可以有效地抑制与神经退行性疾病相关的蛋白的不溶性细胞内聚集体。
第三方面，本发明提供了一种靶向TRAF6的多肽，其特征在于，所述多肽包含：
(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
(2)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
(3)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施例，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。
第四方面，本发明提供了编码上述多肽的核酸分子。
在一些实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6。
第五方面，本发明提供了一种基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体包含上述核酸分子。
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含第一多肽片段，其中所述第一多肽片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1。如上所述，经验证，本发明提供的第一多肽片段(SEQ ID NO:1)能够实现对TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的抑制，进而实现对神经退行性疾病的治疗。
在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含第二多肽片段和/或第三多肽片段，所述第二多肽片段包含SEQ ID NO:2，所述第三多肽片段包含SEQ ID NO:3。经验证，单独的第二多肽片段(SEQ ID NO:2)或第三多肽片段(SEQ ID NO:3)也能够一定程度上实现对TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的抑制，进而实现对神经退行性疾病的治疗。因此，本发明提供的药物组合物能够实现对TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的抑制，进而实现对神经退行性疾病的治疗。
在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。
第七方面，本发明提供了一种治疗和/或预防受试者的神经退行性疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的上述多肽、上述基因表达载体、或者上述药物组合物。
在一些实施例中，所述神经退行性疾病包含TDP43蛋白质病。在一些实施例中，所述神经退行性疾病包含额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病和帕金森病中的一种或多种。
如本文所使用，“受试者”、“个体”或“患者”是指可以在其上使用或施用本发明的任何有机体。典型的受试者包括哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人。
如本文所使用，“治疗有效量”是指在相关群体中观察到治疗剂的施用能够达到特定治疗效果相关或合理预期时的治疗剂的量。在一些实施例中，所述治疗有效量可以是(a)抑制TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的量；(b)抑制不溶性TDP35的细胞质聚集的量；和/或(c)抑制与所述神经退行性疾病相关的蛋白的异常聚集的量。
第八方面，本发明提供了一种降低细胞中TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的方法，其特征在于，所述方法包括向所述细胞施用有效量的上述多肽、上述基因表达载体、或者上述药物组合物。
在一些实施例中，所述细胞为神经元细胞或非神经元细胞。在一些实施例中，所述细胞表达TDP43和/或TDP43突变体。在一些实施例中，所述细胞还表达Tau蛋白、突变型SOD1蛋白、α-突触核蛋白、突变型DJ-1蛋白和亨廷顿蛋白中的一种或多种。
第九方面，本发明提供了一种降低细胞中神经退行性疾病相关的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括向所述细胞施用有效量的上述多肽、上述基因表达载体、或者上述药物组合物。
在一些实施例中，所述细胞为神经元细胞或非神经元细胞。在一些实施例中，所述细胞表达Tau蛋白、突变型SOD1蛋白、α-突触核蛋白、突变型DJ-1蛋白和亨廷顿蛋白中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞还表达TDP43和/或TDP43突变体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为显示TRAF6特异性地免疫沉淀内源性TDP43的实验结果图；
图1b为显示TRAF6促进TDP43在细胞中异常聚集的实验结果图；
图1c为图1b所示实验的定量结果图(左：动态液滴；右：聚集体)；
图1d为显示FRAP分析进一步证实TRAF6促进TDP43在细胞中聚集和积累的实验结果图；
图1e为显示TRAF6明显增加TDP43在不溶组分中的积累的实验结果图；
图1f为显示TRAF6促进活细胞中细胞质TDP43的相变的实验结果图；
图2a为显示TDP43泛素化水平不受TRAF6影响的实验结果图；
图2b为显示TRAF6并非依赖其E3连接酶活性来调节TDP43的实验结果图；
图2c为TRAF6相关构建体的结构示意图；
图2d为显示TRAF6ZC和TRAF6WT与TDP43相互作用的实验结果图；
图2e为显示TRAF6ZC促进TDP43的聚集的实验结果图；
图3a为TDP43相关构建体的结构示意图；
图3b为验证RRM1-RRM2结构域对相互作用影响的实验结果图；
图3c为验证K102-G277区域对相互作用影响的实验结果图；
图3d为验证删除L区域和FR2区域对相互作用影响的实验结果图；
图3e为验证本发明提供的第一多肽片段对相互作用影响的实验结果图；
图3f为本发明提供的第一多肽片段的预测结构图；
图4a为显示第一多肽片段与TRAF6的相互作用强度的实验结果图；
图4b为显示第一多肽片段减轻细胞中TDP35的聚集的实验结果图；
图5为显示第一多肽片段、第二多肽片段和第三多肽片段的抑制效果的实验结果图；
图6a为显示第一多肽片段对TDP43突变体的聚集的抑制效果的免疫印迹实验结果图；
图6b为显示第一多肽片段对TDP43突变体的聚集的抑制效果的免疫荧光实验结果图；
图6c为显示第一多肽片段对TAU蛋白的聚集的抑制效果的免疫印迹实验结果图；
图6d为显示第一多肽片段对TAU蛋白的聚集的抑制效果的免疫荧光实验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1-6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
实施例一：材料与方法
质粒和抗体：TDP-43(Gene ID:23435)、TRAF6(Gene ID:7189)和TAU(Gene ID:4137)基因是从HEK 293T细胞的cDNA文库中扩增出来的。为了在哺乳动物细胞中表达蛋白质，将这些基因插入pcDNA3.1或pCMV质粒中。为了在大肠杆菌中表达，将这些基因放入pET28a质粒中。TDP43及其N端融合EGFP的突变体克隆到pLKO.1-CMV质粒中。pMD2.G和psPAX2质粒用于慢病毒的产生。pX330和PUC19质粒用于构建基因敲除细胞系。对所有质粒的DNA序列都进行了验证。Strep II抗体(ABT2230)购自Abbkine。Strep II抗体(HA500061)购自Huabio。泛素抗体(sc-8017)和GFP抗体(sc-9996)购自Santa Cruz。抗-HA(M20003)、抗-Flag(M20008)和HRP偶联的抗-His(M20020S)抗体购自Abmart。免疫荧光二抗(A32732、A32733、A32742)购自Thermo Fisher。
细胞培养：HEK 293T细胞(货号#GNHu17)和SH-SY5Y细胞(货号#SCSP-5014)均来自国家模式与特色实验细胞资源库。HEK 293T细胞在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中于37℃、5％CO2的湿润条件下培养。SH-SY5Y细胞在添加44.5％Ham's F-12培养基、10％FBS和1％NEAA的基础培养基(MEM)中培养。根据生产商提供的说明，使用Lipofectamine 2000进行瞬时转染。
免疫印迹：样品在上样缓冲液中变性，并在适当浓度的SDS-PAGE凝胶上分离。转移到PVDF膜上后，在室温下用5％脱脂牛奶封闭膜一小时，然后用一抗在4℃下孵育过夜。在室温下用HRP偶联的二抗孵育1-2小时后进行曝光。
免疫荧光：用PBS清洗细胞三次，然后用甲醇(-20℃预冷)固定五分钟。然后，用10％山羊血清(溶于PBS，添加0.3％ Triton X-100)在室温下封闭一小时。在4℃下用一抗孵育过夜。室温下用荧光二抗孵育一小时后，用PBS洗膜三次。使用含DAPI的封片剂封片。用荧光显微镜对样品成像。使用ImageJ对免疫荧光数据进行量化。
免疫沉淀和pulldown实验：免疫沉淀时，收集细胞并在冰上用裂解缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、1％ Triton X-100、5％甘油和1％蛋白酶抑制剂混合物)裂解30分钟。在4℃下以15,000rpm/min离心30分钟后，将Flag或Strep II亲和凝胶加入样品中，Flag微珠在4℃下结合过夜，Strep II微珠在室温下结合3小时。用裂解缓冲液清洗珠子，并用上样缓冲液变性，以进行免疫印迹分析。在pulldown实验中，将纯化的蛋白质与镍珠在结合缓冲液(25mM HEPES pH 8.0、500mM NaCl、10％甘油和1mM DTT)中于4℃孵育2小时。用结合缓冲液清洗镍珠三次，并用上样缓冲液变性，以进行免疫印迹分析。
蛋白质表达、纯化和荧光标记：从BL21(DE3)菌株中纯化TRAF6和TDP43蛋白。添加终浓度为0.5mM的IPTG以诱导蛋白在16℃下表达过夜。将收集的细菌重悬于pH为8.0、含10mM咪唑、10％甘油和1mM DTT的25mM HEPES缓冲液中(纯化TDP43时使用1M NaCl，纯化TRAF6时使用150mM NaCl)，然后超声处理。以13000rpm/min离心30分钟后收集上清液，并与镍珠或GST微珠一起孵育。用含有300mM咪唑或10mM还原型谷胱甘肽(GSH)的缓冲液分别洗脱TDP43蛋白和TRAF6。洗脱的TDP43样品使用淀粉树脂(NEB)进一步纯化，然后用25mM HEPES pH 8.0、1M NaCl、10％甘油、10mM麦芽糖和1mM DTT洗脱。纯化的蛋白质分装后保存在-80℃下。荧光标记使用AF647 succinimidyl ester(D10157，Duofluor Inc.)标记TDP43-MBP-His。按照提供的说明进行标记实验。
FRAP分析：为了进行FRAP分析，将表达GFP标记蛋白的细胞培养在玻璃底培养皿中。使用Zeiss LSM880共聚焦显微镜。将每个时间点的强度归一化为漂白前的初始强度。使用Zen软件和GraphPad分析FRAP数据。
细胞不溶组分分离：经过三次PBS清洗后，在冰上使用预冷的裂解缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、1％ Triton X-100、5％甘油和1％蛋白酶抑制剂)中裂解细胞20分钟，然后超声处理。裂解液在4℃下以15,000rpm/min离心30分钟，收集上清液作为可溶组分。用裂解缓冲液清洗沉淀并超声三次。在60℃下使用含8M尿素的裂解缓冲液溶解沉淀物2小时。然后将裂解液以15000rpm/min的转速离心30分钟，收集上清液作为不溶组分。
微分干涉相衬(DIC)显微镜：DIC图像在奥林巴斯BX53显微镜上获取。
此外，本发明中第一多肽片段、第二多肽片段和第三多肽片段相关的实验可以参照上面的通用方法进行(例如参照与TDP43蛋白相关的实验方法)。
本发明使用的材料的具体信息参见表1。
表1：

第一多肽片段的氨基酸序列：LPNSKQSQDEPLRSAQSLCGEDLIIKGISVHISNAEPKHNSNRQLERSGRFG(SEQ ID NO:1)。第二多肽片段的氨基酸序列：LPNSKQSQDEPLRS(SEQ ID NO:2)。第三多肽片段的氨基酸序列：AQSLCGEDLIIKGISVHISNAEPKHNSNRQLERSGRFG(SEQ ID NO:3)。
第一多肽片段的核苷酸序列：cttcctaattctaagcaaagccaagatgagcctttgagaagcgcgcagtctctttgtggagaggacttgatcattaaaggaatcagcgttcatatatccaatgccgaacctaagcacaatagcaatagacagttagaaagaagtggaagatttggt(SEQ ID NO:4)。第二多肽片段的核苷酸序列：cttcctaattctaagcaaagccaagatgagcctttgagaagc(SEQ ID NO:5)。第三多肽片段的核苷酸序列：gcgcagtctctttgtggagaggacttgatcattaaaggaatcagcgttcatatatccaatgccgaacctaagcacaatagcaatagacagttagaaagaagtggaagatttggt(SEQ ID NO:6)。
实施例二：TRAF6与活细胞中的TDP43相互作用并促进其聚集
为了评估TRAF6(肿瘤坏死因子受体相关因子6)是否会与TDP43结合，本实施例用编码Flag-TRAF6的质粒转染HEK293T细胞，对细胞中内源的TDP43进行免疫沉淀。图1a显示，TRAF6可以特异性地免疫沉淀TDP43，这表明TRAF6可以与活细胞中的TDP43相互作用。据报道，TRAF6在ALS和PD患者中的表达水平升高，与多种年龄相关的神经退行性疾病有关。此外，本实施例还通过pulldown实验进一步验证，纯化的TDP43在体外可以直接与TRAF6相互作用。基于此，本实施例证明，TRAF6可以在活细胞中与TDP43相互作用。
为了研究TRAF6在调控TDP43中的潜在作用，本实施例在HEK293T细胞中共表达了EGFP-TDP43和TRAF6。结果如图1b所示，EGFP-TDP43在活细胞中形成一些微小的点，但不聚集，这说明TDP43本身在细胞中不会形成聚集体(图1b第一排)。然而，共转染TRAF6后24小时的实验结果显示，TRAF6的表达会使得EGFP-TDP43在21％的细胞中形成动态液滴(其容易向固态形式转变)，在25％的细胞中会形成聚集体(图1b第三排、图1c(Ctr：对照))。图1b第二排显示共转染后12小时的实验结果。本实施例使用神经细胞进一步验证，TRAF6也会类似地促进TDP43在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中的聚集。
光漂白后荧光恢复(FRAP)显示(图1d)，TDP43液滴在8秒内恢复到40％，而TDP43聚集体在HEK293T细胞中几乎没有恢复，这进一步证实了TRAF6会促进TDP43在细胞中的聚集和积累。
接着，本实施例将共表达EGFP-TDP43和TRAF6的HEK293T细胞的细胞裂解液，分为Triton X-100可溶组分(soluble)和不溶组分(insoluble)。图1e的免疫印迹结果显示，TRAF6能够明显增加TDP43在不溶组分中的积累。综上所述，本实施例证明，TRAF6能够增强TDP43在活细胞中的聚集。
实施例三：TRAF6诱导活细胞中细胞质TDP43相变
TDP43在细胞质中的错定位和聚集是额颞叶痴呆-TDP(FTLD-TDP)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)的病理特征。据报道，在高达97％的ALS患者中观察到TDP43包涵体在细胞质中的聚集。
本实施例将TRAF6与EGFP-cTDP43ΔNLS突变体(缺乏核定位信号，定位在细胞质中的TDP43(cTDP43)突变体)共表达。实验结果与实施例二类似，如图1f所示，EGFP-TDP43ΔNLS本身会形成点，但不会在细胞质聚集(图1f左图第一排)；TRAF6表达24小时后，14％的细胞会产生TDP43ΔNLS的空心环(其容易向固态形式转变)，26％的细胞形成聚集体(其中，空心环的流动性略高于聚集体)。图1f左图第二排和第三排分别显示共表达后12小时和24小时的实验结果。上面结果表明，TRAF6能够促进活细胞中细胞质TDP43的相变。此外，经免疫印迹验证，TRAF6的过表达能够明显增加不溶于去垢剂Triton X-100的细胞质TDP43的数量。综上所述，本实施例证明TRAF6可以调控细胞质TDP43。
实施例四：TRAF6调控TDP43的相变，独立于其E3连接酶活性
TRAF6是一种E3泛素连接酶。据报道，TDP43的泛素化与其聚集密切相关。在细胞中同时过表达His-TDP43和TRAF6(TRAF6WT，野生型TRAF6)或者TRAF6C70A(TRAF6 E3泛素连接酶失活突变体)，再变性纯化His-TDP43后，本实施例发现TRAF6 E3泛素连接酶失活后，TDP43泛素化水平没有明显变化(图2a)。此外，本实施例还发现，缺乏E3连接酶活性的TRAF6C70A突变体仍能促进TDP43的不溶性。免疫荧光结果同样证实，TRAF6泛素连接酶活性并非TRAF6介导的TDP43聚集所必需的(图2b)。综上所述，本实施例发现，TRAF6并非依赖其E3连接酶活性来调节TDP43。
TRAF6包含一个RING结构域、四个锌指结构域(ZnF1-ZnF4)、一个卷曲螺旋(CC)结构域和一个MATH结构域(图2c)，TRAF6的E3泛素连接酶活性位点位于RING结构域。然而，本实施例发现，TRAF6ZC(删除了RING结构域和MATH结构域，仅保留锌指结构域和卷曲螺旋结构域)却显示出与TDP43相似的结合能力(图2d)，能够显著诱导TDP43在细胞和体外的聚集(图2e)。上面实验结果揭示，在TRAF6诱导的TDP43聚集中，RING结构域不是必需的，TRAF6可能通过其锌指结构域和/或卷曲螺旋结构域来促进TDP43在细胞中的聚集(即TRAF6和TDP43的相互作用结构域可能是锌指结构域和/或卷曲螺旋结构域)。
实施例五：TDP43与TRAF6的相互作用取决于其TDP6片段
本实施例将TDP43的RNA结合区的不同区域(K102-G277，KG)移除(图3a)，该区域主要包含RRM1-RRM2结构域和侧翼序列，其中RNA识别域RRM1和RRM2常被认为在TDP43致病过程中发挥着至关重要的作用。图3a中红叉表示核定位信号(NLS)的突变；L表示RRM1和RRM2之间的接头(L177-R189)；FR2表示RRM2之后的A240-G277序列；虚线表示删除的区域。图3b显示，删除RRM1(cTDP32ΔRRM1)、RRM2结构域(cTDP32ΔRRM2)或两者(cTDP32ΔRRM1-2)对cTDP43与TRAF6的相互作用没有明显影响。然而，将TDP43的K102-G277区域删除后，细胞质TDP32ΔK102-G277(cTDP43ΔKG)与TRAF6之间的相互作用显著降低(图3c)。删除RRM1和RRM2结构域之间的接头(L，L177-R189)以及RRM2结构域之后的序列(FR2，A240-G277)(TDP32ΔL+ΔFR2)都会消除其与TRAF6的相互作用(图3d)。也就是说，本实施例发现，TDP6(也可以理解为第一多肽片段，本发明将TDP43的接头(第二多肽片段)和FR2(第三多肽片段)融合形成的多肽)反而在TDP43与TRAF6的相互作用中起关键作用(图3e)。
本发明构建的第一多肽片段在预测的结构中形成了碱性的口袋(pocket)，如图3f所示(其中第二多肽片段为紫色，第三多肽片段为蓝色，红色标记的氨基酸为较为关键的荷正电的氨基酸)。
实施例六：本发明构建的第一多肽片段可以减轻多种病理TDP43突变体
本实施例发现，TRAF6-TDP6的相互作用强度远大于TRAF6-TDP43/TDP35的相互作用(图4a)，也就是说，本发明构建的第一多肽片段会对TRAF6与TDP43/TDP35的结合产生竞争性抑制。
图4b的共聚焦图像显示，在表达第一多肽片段的HEK293T细胞中，EGFP-TDP35聚集的发生率明显降低，也就是说，本发明提供的第一多肽片段减轻了细胞中TDP35的聚集。类似地，免疫印迹实验证明，第一多肽片段减轻了不溶性TDP35，也就是说，本发明提供的第一多肽片段减轻了细胞中依赖TRAF6的TDP35的不溶性。此外，经验证，第一多肽片段可以同样抑制SHY5Y细胞中的TDP35聚集。上面结果表明，本发明提供的第一多肽片段能够抑制TDP35在活细胞中的聚集。
接下来，本实施例进一步研究了第一多肽片段中第二多肽片段和第三多肽片段对TDP43的抑制作用的贡献。如图5所示，通过图5“+”和“-”两部分的条带的深浅程度对比可以看出，单独的第二多肽片段(图5a)和第三多肽片段(图5b)都可以对TDP43(以TDP43的突变体之一的TDP35为例)的不溶组分产生一定程度的抑制作用，其中第三多肽片段的抑制作用优于第二多肽片段，且两个片段单独的抑制效果不如第一多肽片段(即第二多肽片段和第三多肽片段融合形成的多肽片段)(图5c)。接下来，本发明的实施例基于第一多肽片段，进行进一步的抑制效果研究。
TDP43的病理突变已在ALS和FTLD患者中被广泛发现。本实施例进一步评估了第一多肽片段对不同致病性TDP43的影响。图6a和图6b显示，有G295S、G298S、S379A或I383V突变的TDP43突变体在细胞中聚集，而这被第一多肽片段明显减轻。也就是说，本发明提供的第一多肽片段可以有效抑制病理性TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集。
本实施例进一步评估了第一多肽片段对神经退行性疾病相关的蛋白的影响。据报道，含有与神经退行性疾病相关的各种蛋白质(例如Tau)的不溶性细胞内聚集体已在多种神经退行性疾病患者的神经元中发现。图6c和图6d显示，第一多肽片段能够减轻细胞中Tau聚集，也就是说，本发明提供的第一多肽片段可以减轻神经退行性疾病相关的多种蛋白质的不可溶性。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (30)

  1. 一种多肽在制备TRAF6抑制剂中的用途，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述TRAF6抑制剂用于治疗和/或预防神经退行性疾病。
  3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病包含TDP43蛋白质病。
  4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多肽：
    (1)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或者
    (2)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述TRAF6抑制剂用于靶向TRAF6来抑制TRAF6与TDP43和/或TDP43突变体的相互作用，进而抑制所述TDP43和/或TDP43突变体聚集体的形成。
  6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包含以下中的一种或多种：
    (a)抑制TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集；
    (b)抑制不溶性TDP35的细胞质聚集；
    (c)抑制与所述神经退行性疾病相关的蛋白的异常聚集。
  7. 一种多肽在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述多肽：
    (1)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或者
    (2)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  9. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病包含额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病和帕金森病中的一种或多种。
  10. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病包含TDP43蛋白质病。
  11. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述用途包含以下中的一种或多种：
    (a)抑制TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集；
    (b)抑制不溶性TDP35的细胞质聚集；
    (c)抑制与所述神经退行性疾病相关的蛋白的异常聚集。
  12. 如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病相关的蛋白包含Tau蛋白、突变型SOD1蛋白、α-突触核蛋白、突变型DJ-1蛋白和亨廷顿蛋白中的一种或多种。
  13. 如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述TDP43突变体包括A90V、P112H、G295S、G298S、S379A和I383中的一种或多种。
  14. 一种靶向TRAF6的多肽，其特征在于，所述多肽包含：
    (1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
    (2)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
    (3)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的部分且完整包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  15. 如权利要求14所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。
  16. 编码权利要求14或15所述的多肽的核酸分子。
  17. 如权利要求16所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4。
  18. 如权利要求16所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6。
  19. 一种基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体包含权利要求16-18任一项所述的核酸分子。
  20. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含第一多肽片段，其中所述第一多肽片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1。
  21. 如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包含第二多肽片段和/或第三多肽片段，所述第二多肽片段包含SEQ ID NO:2，所述第三多肽片段包含SEQ ID NO:3。
  22. 一种治疗和/或预防受试者的神经退行性疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求14或15所述的多肽、权利要求19所述的基因表达载体、或者权利要求20或21所述的药物组合物。
  23. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病包含TDP43蛋白质病。
  24. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病包含额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病和帕金森病中的一种或多种。
  25. 一种降低细胞中TDP43和/或TDP43突变体的细胞质聚集的方法，其特征在于，所述方法包括向所述细胞施用有效量的权利要求14或15所述的多肽、权利要求19所述的基因表达载体、或者权利要求20或21所述的药物组合物。
  26. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述细胞为神经元细胞或非神经元细胞。
  27. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述细胞表达TDP43和/或TDP43突变体。
  28. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述细胞还表达Tau蛋白、突变型SOD1蛋白、α-突触核蛋白、突变型DJ-1蛋白和亨廷顿蛋白中的一种或多种。
  29. 一种降低细胞中神经退行性疾病相关的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括向所述细胞施用有效量的权利要求16或17所述的多肽、权利要求21所述的基因表达载体、或者权利要求22或23所述的药物组合物。
  30. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述细胞为神经元细胞或非神经元细胞。
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