WO2025150522A1 - サバイバーｔ細胞、サバイバーｔ細胞集団および医薬組成物 - Google Patents

サバイバーｔ細胞、サバイバーｔ細胞集団および医薬組成物

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WO2025150522A1
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cell
car
glucose
glut3
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博嘉 西川
慶介 渡邊
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Arc Therapies Inc
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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Arc Therapies
Arc Therapies Inc
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • Cancer cells reprogram their metabolic system to favor their own cell proliferation, actively utilizing the glycolytic pathway, which is less efficient at producing ATP even in the presence of oxygen, to increase glucose uptake and lactate production (Warburg effect).
  • T cells are stimulated by TCR, the intracellular concentration of Ca 2+ increases and calcineurin is activated.
  • the activation of calcineurin causes the dephosphorylated transcription factor NFAT to migrate into the nucleus, where it interacts with other transcription factors to promote the transcription of the IL-2 gene and other genes, activating them.
  • [Item 10] The cell population described in any one of the above items, wherein the T cells have been modified to express a glucose transporter and/or have enhanced expression of a glucose transporter.
  • [Item 11] The cell population described in any one of the above items, wherein the T cells have effector function.
  • [Item 12] The cell population described in any one of the above items, wherein the T cells comprise a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • TCR T cell receptor
  • [Item 12A] The cell population described in any one of the above items, wherein the T cells contain a chimeric antigen receptor (CAR).
  • [Item 13] The cell population according to any one of the preceding items, wherein the cell population comprises T eff .
  • the cell population (or precursor cells of T eff ) of any one of the above items comprises at least one type of cell selected from the group consisting of Tnv, Tscm, Tcm and Temra.
  • the cell population described in any one of the above items, wherein the CAR or TCR is expressed in the T cell.
  • the glucose transporters include GLUT1, GLUT2, GLUT3, and GLUT4.
  • [Item 18] The cell population described in any one of the above items, wherein the T cells are human T cells.
  • a pharmaceutical composition comprising a T cell described in any one of the above items or a cell population described in any one of the above items.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease in a subject comprising: (A) collecting a glucose uptake capacity or an index related thereto in the subject; (B) selecting a T cell having an appropriate expression characteristic according to the index and having enhanced glucose uptake ability, or a cell population containing the T cell; (C) administering the T cells with enhanced glucose uptake ability or a cell population containing the T cells to the subject in an appropriate manner and at an appropriate dose.
  • the T cells comprise a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).
  • T cells comprise a chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the disease includes cancer, an autoimmune disease, an allergy or an infectious disease.
  • the pharmaceutical composition according to any one of the above items, wherein the disease includes cancer.
  • the glucose transporter is GLUT3.
  • [Item 24] The cell or cell population described in any one of the above items, which is for the treatment or prevention of cancer, an autoimmune disease, an allergy or an infectious disease.
  • [Item 24A] The cell or cell population described in any one of the above items, which is for the treatment of cancer.
  • [Item 25] A cell or cell population for preventing or treating a disease in a subject, the cell or cell population comprising: (A) collecting a value of glucose uptake ability or an index related thereto in the subject; (B) selecting a T cell having an appropriate expression characteristic according to the index and having enhanced glucose uptake ability, or a cell population containing the T cell; (C) administering the T cells having enhanced glucose uptake ability or a cell population comprising the T cells to the subject in an appropriate manner and dosage.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • TCR T cell receptor
  • the glucose transporter is GLUT3.
  • [Item 27] A method for treating or preventing a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of a T cell described in any one of the above items or a cell population described in any one of the above items.
  • the subject treatment or prevention is for the treatment or prevention of cancer, an autoimmune disease, an allergy, or an infectious disease.
  • the treatment or prevention of the subject is for the purpose of curing cancer.
  • the medicament is the use according to any one of the above items for the prevention or treatment of a disease in a subject, wherein the medicament comprises: (A) collecting a glucose uptake capacity or an index related thereto in the subject; (B) selecting a T cell having an appropriate expression characteristic according to the index and having enhanced glucose uptake ability, or a cell population containing the T cell; (C) administering the T cells with enhanced glucose uptake ability or a cell population containing the T cells to the subject in an appropriate manner and dosage.
  • the T cells comprise a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).
  • a cell or cell population for preventing or treating a disease in a subject comprising: (A) collecting a glucose uptake capacity or an index related thereto in the subject; (B) selecting a T cell having an appropriate expression characteristic according to the index and having enhanced glucose uptake ability, or a cell population containing the T cell; (C) administering the T cells having enhanced glucose uptake ability or a cell population comprising the T cells to the subject in an appropriate manner and dosage.
  • the T cell comprises a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).
  • [Item B31] A method for treating or preventing a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of a T cell described in any one of the above items or a cell population described in any one of the above items.
  • the subject treatment or prevention is for the treatment or prevention of cancer, an autoimmune disease, an allergy, or an infectious disease.
  • the treatment or prevention of the subject is for the purpose of curing cancer.
  • a method for preventing or treating a disease in a subject comprising: (A) collecting a glucose uptake capacity or an index related thereto in the subject; (B) selecting a T cell having an appropriate expression characteristic according to the index and having enhanced glucose uptake ability, or a cell population containing the T cell; (C) administering the T cells having enhanced glucose uptake capability or a cell population comprising the T cells to the subject in an appropriate dosage regimen.
  • the T cell comprises a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).
  • the medicament is for the prevention or treatment of a disease in a subject, (A) collecting a glucose uptake capacity or an index related thereto in the subject; (B) selecting a T cell having an appropriate expression characteristic according to the index and having enhanced glucose uptake ability, or a cell population containing the T cell; (C) administering the T cells with enhanced glucose uptake ability or a cell population containing the T cells to the subject in an appropriate manner and dosage.
  • the T cells comprise a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).
  • T cells contain a chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the disease includes cancer, an autoimmune disease, an allergy or an infectious disease.
  • the disease includes cancer.
  • the glucose transporter is GLUT3.
  • the present disclosure makes it possible to provide T cells and/or related cell populations with enhanced glucose uptake capability, and by using such cells and/or related cell populations, it is possible to provide chimeric antigen receptor (CAR) T cells and/or related cell populations that function without starvation or exhaustion even in a tumor environment.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the cells disclosed herein can be said to be metabolically enhanced T cells (survivor T cells) or related cell populations that apply the mechanism by which tumor cells survive in the tumor environment to T cells.
  • the cells and related cell populations disclosed herein are capable of maintaining effective cytotoxic activity and cytokine production in a low glucose environment such as the tumor microenvironment, which could not be achieved with conventional immune checkpoint inhibitor therapy, and can exert a high antitumor effect in the body.
  • a transient glucose transporter expression system that expresses glucose transporters in response to increased glucose demand, it is possible to avoid hyperdifferentiation and exhaustion of T cells due to excessive activation, and induce memory phenotype T cells that can maintain their effects for a long period of time.
  • the figure shows an example of incorporating the same 3C10CAR_GLUT3 into a third-generation lentiviral vector plasmid having an EF-1a promoter.
  • Figure 2 shows the expression of GLUT3 on the surface of T cells and enhanced glucose uptake.
  • the upper panel shows the structures of the normal CAR (3C10 CAR) and metabolically modified CAR (GLUT3 CAR).
  • the lower left shows images of CAR and GLUT3 expression on T cells by fluorescence microscopy for 3C10 CAR and GLUT3 CAR.
  • the lower middle shows GLUT3 expression quantified by fluorescence intensity.
  • the lower right shows the quantitative results of glucose uptake into cells by the 2-NBDG method.
  • the normal CAR (3C10 CAR) and metabolically modified CAR (GLUT3 CAR) were transfected into T cells derived from healthy donors to obtain CAR-T cells. Fluorescence microscopy confirmed homogeneous GLUT3 expression on the membrane of GLUT3 CAR-T cells. Furthermore, glucose uptake was enhanced in GLUT3 CAR-T cells compared to T cells and conventional CAR-T cells (3C10 CAR-T cells).
  • Figure 3 shows the results showing the same T cell expansion efficiency as conventional CAR-T cells.
  • the X axis shows the number of days after transduction, and the Y axis shows LOG2 (FC).
  • the upper left shows intracellular IL-2, IFNg, and TNF-a analysis of mock-transfected T cells, 3C10 CAR-T cells, and GLUT3 CAR-T cells
  • the upper right shows the percentage of IFNg, IL-2, and TNFa positive cells from the left of 3C10 CAR-T cells and GLUT3 CAR-T cells under normal glucose conditions (10 mM)
  • the lower left shows the percentage of IFNg, IL-2, and TNFa positive cells from the left of 3C10 CAR-T cells and GLUT3 CAR-T cells under low glucose conditions (0.5 mM).
  • FIG. 16 shows a tumor rechallenge experiment (sudden death of mice in the GLUT3 CAR-T cell group). The tumor burden and survival after GLUT3 CAR-T cell therapy are shown (tumor imaging images on day 1 (after challenge), day 5 after rechallenge, and day 12 after rechallenge are shown).
  • FIG. 17 shows the time course of observation of each CAR T cell showing enhanced long-term survival after stimulation under the above conditions. This figure shows the in vitro (CAR) T cell stimulation and culture test plan.
  • GLUT3 CAR-T undergoes terminal differentiation into CCR7-negative effector memory T cells (Tem) or terminally differentiated RA-positive T cells (Temra) over time (day 3 or day 7) due to excessive glucose uptake, loses stemness, and falls into apoptosis.
  • CAR-T cells established with normal glucose
  • Temra terminally differentiated RA-positive T cells
  • Figure 18 shows the enhancement of long-term survival in vivo. The above-mentioned antitumor effect, survival, and adverse events are examined in a system similar to that of the aforementioned mouse.
  • U87d tumor cell line is transplanted into the skull of an immunodeficient NSG mouse, and five days later, mock-transduced T cells (UTD), 3C10 CAR-T cells, and GLUT3 CAR-T cells are administered via the tail vein, and the antitumor effect quantification and survival are analyzed by bioluminescence imaging.
  • the established CAR-T cells are used as is, in experiment 2, they are administered after exposure to a high glucose environment, in experiment 3, a tumor is transplanted into the liver, which has been reported to have a low glucose and high lactate environment, and in experiment 4, the engraftment of T cells and their infiltration into the tumor are evaluated.
  • GLUT3 CAR-T cells show dominant antitumor activity.
  • Representative contour plots (left) and a summary of the frequency of cytokine (IFN- ⁇ , IL-2, TNF ⁇ )-producing cells (right) are shown. Data are shown as mean ⁇ SEM.
  • T eff effector memory T cells
  • Tnv naive T cells
  • Tscm stem cell memory T cells
  • Tcm central memory T cells
  • Temra terminally differentiated RA-positive T cells
  • peripheral T cells refers to T cells present outside the thymus gland, and can be obtained from peripheral blood, lymph nodes, and other tissues.
  • peripheral T cells refers only to the cell population containing peripheral T cells, and it is not necessary for the T cells to be isolated.
  • cell fractions containing various lymphocytes such as peripheral blood mononuclear cells (PBMC), may also be used.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • a "cell population” refers to a population containing two or more cells, and may be, for example, a collection of cells in a planar state, or a cell mass formed by cells adhering to each other in a three-dimensional manner. Furthermore, a "cell population” may be formed by a single type of cell, or may contain multiple types of cells. In the case of a cell population of T cells disclosed herein, it is sufficient that the population contains at least one cell that can have an effector function in the place where it is to function (typically within the body), such as Tnv, Tscm, Tcm, or Temra.
  • cells labeled with fluorescence or luminescent enzymes are irradiated with laser light, and the fluorescence or luminescence signals emitted by the cells are detected by a detector such as a photodiode, thereby counting the number of target cells.
  • a detector such as a photodiode
  • the detection results from the detector can be input into a computer and a two-dimensional plot can be generated and displayed. This makes it easy to determine the presence or absence of target cells, as well as their number.
  • effector function refers to biological activities such as cytotoxic activity, cytokine production, and division/proliferation that are caused by signals mediated by TCR or CAR in T cells, and biological activities caused by the Fc region of an antibody in other immune cells. Effector functions include, for example, C1q binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC), Fc receptor binding, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), phagocytosis, downregulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptors), and activation of B cells.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • phagocytosis phagocytosis
  • downregulation of cell surface receptors e.g., B cell receptors
  • effector T cell (T eff ) precursor cells refers to cells that are not effector cells but that are transferred to a place where they should function (e.g., in the body) or that acquire effector function through other stimuli.
  • Such cells include lymphoid precursor cells, Tnv, Tscm, Tcm, Temra, and the like.
  • Effector T cell precursor cells are activated at the early stage of the immune response and mature into effector T cells through proliferation and differentiation, but some precursor cells have the ability to differentiate into memory T cells.
  • These precursor cells have specific gene expression patterns and metabolic states that contribute to the extension of memory function. Several molecular and metabolic properties are involved in this extension of memory function. First, effector T cell precursor cells have specific characteristics in their metabolic programs.
  • oxidative phosphorylation predominates rather than glycolysis, which is characteristic of effector T cells; this metabolic pathway is energy efficient and allows the cells to survive for a long time.
  • This metabolic characteristic is an important factor that supports the long-term maintenance of function as memory T cells.
  • transcription factors such as T-bet and Eomes are expressed, which promote differentiation into memory T cells and at the same time enable their long-term survival and function.
  • these precursor cells which express surface markers such as CD62L and CCR7, have the ability to migrate to secondary lymphoid tissues. This homing function allows the precursor cells to receive the necessary survival signals in the secondary lymphoid tissues, contributing to the maintenance of memory function.
  • the suppression of antigen stimulation is also involved in the extension of memory function.
  • Some precursor cells are suppressed from completely differentiating into effector T cells by being released from antigen stimulation, and instead retain the properties of memory T cells. This mechanism suppresses excessive effector responses while maintaining memory function.
  • the cytokine environment surrounding the cells also plays an important role.
  • cytokines such as IL-7 and IL-15 provide the survival signals necessary for the maintenance of memory T cells, which contribute greatly to the extension of memory function.
  • the maintenance of memory T cell phenotype in effector T cell precursors refers to the phenomenon in which some precursor cells exist while retaining the phenotype specific to memory T cells (e.g., surface markers, metabolic state, expression of transcription factors, etc.) during the process of differentiation into effector T cells. Such precursor cells have the ability to survive even after the end of the immune response and provide immunological memory for a long period of time. This phenomenon is considered to be an important mechanism for T cells to balance both the process in which they exert effector functions and the memory function that allows them to survive for a long period of time and enable a rapid secondary immune response. The characteristics of this phenomenon are explained below. First, effector T cell precursors maintain surface markers specific to memory T cells.
  • memory T cells e.g., surface markers, metabolic state, expression of transcription factors, etc.
  • a "chimeric antigen receptor (CAR)” refers to a modified receptor that can confer antigen specificity to a cell (e.g., an immune cell).
  • CARs are also known as artificial T cell receptors, chimeric T cell receptors, or chimeric immune receptors.
  • CARs are modified receptors that transfer antigen specificity to immune system cells (e.g., T cells, such as naive T cells, central memory T cells, effector memory T cells, or combinations thereof, NK cells, macrophages, etc.), and CARs may include, for example, an antigen-specific targeting region, an extracellular domain, a transmembrane domain, a costimulatory domain, and/or an intracellular signaling domain.
  • T cell receptor refers to a receptor present on T cells.
  • TCR is a heterodimer receptor molecule consisting of two TCR polypeptide chains, and there are ⁇ -type TCRs expressed by normal T cells and ⁇ -type TCRs with special functions.
  • the ⁇ and ⁇ chain TCR molecules form complexes with multiple CD3 molecules (CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain), transmit intracellular signals after antigen recognition, and initiate various immune responses.
  • Endogenous antigens such as viral antigens proliferated within cells following viral infection and cancer antigens derived from cancer cells are presented as antigen peptides on MHC class I molecules.
  • whether a subject has "immunological memory" of a certain component or substance can be evaluated by measuring whether the component or substance (i) enhances cytokine production in an antigen-dependent manner in memory CD4-positive T cells or has a proliferation-promoting effect in the subject or in a biological component (e.g., cells, etc.) derived from the subject, (ii) changes the expression of a surface antigen on memory regulatory T cells, (iii) changes the ratio of Treg and Th1, (iv) induces IFN- ⁇ production from T-bet-positive Th1 cells, (v) changes the IFN- ⁇ production ability, (vi) changes the IL-2 production ability, and (vii) changes the TNF- ⁇ production ability, or (viii) has an antibody specific to the component or substance in the blood, and confirming that at least one of these results is positive.
  • a biological component e.g., cells, etc.
  • infectious disease may be any infectious disease, including any type of infectious disease such as viral infections (including any viral form such as single-stranded or double-stranded DNA viruses and RNA viruses), bacterial infections, protozoan infections, and mycoplasma infections.
  • infectious disease may be tuberculosis, coronavirus, malaria, yellow fever virus, smallpox virus, vaccination, measles/rubella, polio, mumps/MUMPS, rotavirus infection, chickenpox, yellow fever, Ebola, West Nile fever, Hib infection, pneumococcal infection, whooping cough, Japanese encephalitis, meningococcal infection, salmonella infection, pathogenic E.
  • allergy refers to an excessive immune response to a specific non-self antigen, and is a disease in which an immune response occurs to an "allergen.”
  • An “allergen” refers to an antigen that can react with the antibodies of a subject with an allergic disease, and includes allergens derived from the pollen of trees (acacia, alder, velvet green, beech, birch, maple, mountain cedar, red cedar, cottonwood, cypress, American elm, autumn elm, Doga fir, rubber tree, eucalyptus tree, Chinese hackberry, hickory, American linden, sugar maple, mesquite, paper berry, and Japanese knotweed).
  • Allergens derived from pollen of plants (cotton, turfgrass, longhorn grass, bromegrass, corn, fescue, sorghum, oat, orchard grass, rice grass, morning glory, ryegrass, rice, morning glory, timothy grass, water hyacinth, gooseberry, oats, orchard grass, rice bran, timothy grass, water hyacinth, gooseberry, rice, morning glory, timothy grass, water hyacinth, gooseberry, oats, turmeric, rice, morning glory, timothy grass, gooseberry, gooseberry, oats ...
  • allergy include atopic dermatitis, allergic rhinitis (hay fever, etc.), allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis, bronchial asthma, childhood asthma, food allergies, drug allergies, and urticaria.
  • the present disclosure provides immune cells, such as T cells, with enhanced glucose uptake capability, cell populations containing such cells, and pharmaceutical compositions containing such cells or cell populations, and other related technologies.
  • T cells with enhanced glucose uptake ability are provided. It has been unexpectedly shown that T cells modified and/or enhanced to express glucose transporters are significantly effective against diseases such as cancer, autoimmune diseases, allergies, and infectious diseases when applied to CAR-T cells, TCR-T cells, and the like (see FIG. 16).
  • the cells of the present disclosure are advantageously those with enhanced glucose uptake ability.
  • the cells of the present disclosure are preferably those that have effector functions after being introduced into the place where they should function, particularly the body.
  • Such cells include, but are not limited to, T eff , and may be precursor cells of T eff , such as lymphocytic precursor cells, Tnv, Tscm, and Temra.
  • the present disclosure may be an effector T cell that includes a chimeric antigen receptor (CAR) and has been modified to express a glucose transporter and/or has enhanced expression of the glucose transporter.
  • the present disclosure may be a cell population that includes an effector T cell that includes a chimeric antigen receptor (CAR) and has been modified to express a glucose transporter and/or has enhanced expression of the glucose transporter.
  • the present disclosure provides an "effector T cell" that could not be provided by conventional techniques.
  • the effector T cell refers to an immune cell (e.g., a T cell) that exerts a cytotoxic effect on a target cell (described elsewhere in this specification).
  • the effector function includes cytotoxic activity, cytokine production, and division/proliferation due to signals mediated by TCR or CAR, but one of the important functions of an effector T cell is to exert a cytotoxic effect on a target cell.
  • CAR-T chimeric antigen receptor T
  • TME tumor microenvironment
  • Massive consumption of glucose by cancer cells reduces the glucose level in the TME of solid cancers, resulting in damage to CAR-T cells.
  • expressing GLUTs which are glucose transporters
  • CAR-T cells restores cytokine production and killing activity, or improves effector function.
  • the present disclosure provides a treatment method for various solid cancers that could not be cured even by combination therapy using chemotherapy agents and radiation.
  • Certain solid tumors possess metabolically harsh TMEs, impairing the function of effector T cells, including CD8 + T cells, and adoptively transferring CAR-T cells into the TME.
  • neural cells such as neurons and glial cells, require glucose as an energy source, the present disclosure is particularly effective.
  • CAR-T chimeric antigen receptor T
  • GBM glioblastoma
  • TEE tumor microenvironment
  • GBM Glioblastoma
  • GBM TME GBM TME
  • GLUT3 which is encoded by SLC2A3 and is physiologically expressed in neurons and glial cells, has a 5-fold higher affinity for glucose than GLUT1, the major glucose transporter expressed in T cells.
  • the cell population includes a cell population containing T cells as described above, and the cell population advantageously includes about 10% or more of the T cells having the characteristics of the present disclosure (e.g., enhanced or expressed GLUT, effector function, or both).
  • the cell population of the present disclosure can have a percentage of T cells having the characteristics of the present disclosure of about 5% or more, about 10% or more, about 15% or more, about 20% or more, about 25% or more, about 30% or more, about 35% or more, about 40% or more, about 45% or more, about 50% or more, about 55% or more, about 60% or more, about 65% or more, about 70% or more, about 75% or more, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about 95% or more, about 97% or more, or about 99% or more.
  • the cell population of the present disclosure comprises T cells that have the property of having effector function when introduced into the body.
  • the T cells are modified to express a glucose transporter and/or have enhanced expression of a glucose transporter.
  • the T cells have effector function.
  • the cell population of the present disclosure comprises T eff and/or progenitor cells of T eff .
  • the cell population (or progenitor cells of T eff ) comprises at least one of lymphoid progenitor cells, Tnv, Tscm, Tcm, and Temr cells.
  • the CAR is expressed in the T cells.
  • the glucose transporters include GLUT1, GLUT2, GLUT3, and GLUT4, preferably GLUT3.
  • the cell population of the present disclosure is provided as a medicament or pharmaceutical composition.
  • the use may be for the prevention or treatment of cancer, for the cure of cancer, or for the prevention of metastasis or recurrence of cancer.
  • the cell population of the present disclosure may be for the prevention or treatment of cancer so that it does not recur.
  • T cells and cell populations are provided that are genetically engineered to express glucose transporters to promote aerobic glycolysis and increase the competitiveness and/or fitness of immune cells in a glucose-depleted tumor microenvironment (TME).
  • TAE glucose-depleted tumor microenvironment
  • the glucose transporters include GLUT1, GLUT2, GLUT3, and GLUT4, and among them, the glucose transporter with the highest affinity for glucose is GLUT3.
  • the glucose transporter utilized in the cells and cell populations of the present disclosure is GLUT3.
  • GLUT3 was first identified in the murine brain and was initially defined as a neuronal glucose transporter. It was subsequently shown to be expressed in other cells that require glucose, such as murine spermatozoa, which secure the energy they need to move, and blastocysts, which are important for post-implantation development. In addition, GLUT3 is expressed in immune cells, such as lymphocytes, monocytes, macrophages, and platelets, where it is normally stored in intracellular vesicles and migrates to the cell surface upon activation to maintain metabolic switch. More recently, it has been suggested that T cells, especially CD8 + T cells, rely not only on GLUT1 but also on GLUT3 for glucose uptake, as GLUT3 is highly expressed during differentiation and activation.
  • glucose transporters such as GLUT3
  • effector functions such as cytotoxic activity and cytokine production ability are enhanced due to glucose uptake.
  • the T cells or T cells contained in the cell population of the present disclosure may include effector cells.
  • the T cells and T cells included in the cell populations of the present disclosure may advantageously be human T cells.
  • a T cell or a cell population containing such a cell with enhanced glucose uptake ability wherein the T cell contains a chimeric antigen receptor (CAR), and the T cell is modified to express a glucose transporter and/or the expression of the glucose transporter is enhanced.
  • the CAR contained in the T cell or T cell contained in the cell population of the present disclosure may be contained as a protein, or may contain a nucleic acid molecule expressing the CAR, as long as it can function as a CAR.
  • the CAR of the present disclosure may be expressed in a T cell.
  • the CAR disclosed herein comprises at least one extracellular domain capable of binding to an antigen, at least one transmembrane domain, and at least one intracellular domain.
  • Chimeric antigen receptors are artificially constructed hybrid proteins or polypeptides that contain the antigen-binding domain of an antibody (e.g., single-chain variable fragment (scFv)) linked to a T cell signaling domain via a transmembrane domain.
  • CARs feature MHC-independent antigen binding properties that exploit the antigen-binding properties of monoclonal antibodies to redirect T cell specificity and reactivity toward selected targets.
  • MHC-independent antigen recognition can provide T cells in CAR-expressing T cells or cell populations with the ability to recognize antigens independent of antigen processing, thus circumventing tumor immune escape.
  • the intracellular T cell signaling domain of the CAR can include, for example, a T cell receptor signaling domain, a T cell costimulatory signaling domain, or both.
  • the T cell receptor signaling domain refers to the portion of the CAR that includes the intracellular domain of a T cell receptor, such as the intracellular portion of the CD3 zeta protein.
  • the costimulatory signaling domain refers to the portion of the CAR that includes the intracellular domain of a costimulatory molecule, which is a cell surface molecule other than antigen receptors or their ligands, that is required for an efficient response of lymphocytes to antigens.
  • TCR T cell receptor
  • a T cell or a cell population comprising such a cell with enhanced glucose uptake capability, wherein the T cell comprises a T cell receptor (TCR) and the T cell has been modified to express a glucose transporter and/or has enhanced expression of the glucose transporter.
  • TCR T cell receptor
  • the TCR contained in the T cell or T cells included in the cell population of the present disclosure may be contained as a protein, or may comprise a nucleic acid molecule expressing the TCR, so long as it is capable of exerting the function of a TCR.
  • the TCR of the present disclosure may be expressed in a T cell.
  • TCR is a heterodimer receptor molecule consisting of two TCR polypeptide chains, and there are ⁇ type TCR expressed by normal T cells and ⁇ type TCR with special functions.
  • ⁇ and ⁇ chain TCR molecules form complexes with multiple CD3 molecules (CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain), transmit intracellular signals after antigen recognition, and initiate various immune responses.
  • Endogenous antigens such as viral antigens proliferated in cells due to viral infection and cancer antigens derived from cancer cells are presented as antigen peptides on MHC class I molecules.
  • antigens derived from foreign microorganisms are taken up by antigen-presenting cells by endocytosis, and after processing are presented on MHC class II molecules. These antigens are recognized by TCRs expressed by CD8+ T cells or CD4+ T cells, respectively. It is also known that costimulatory molecules such as CD28, ICOS, and OX40 molecules are important for stimulation via TCR molecules. In the case of ⁇ -type TCRs, the gene products of ⁇ and ⁇ can each express specificity through a unique combination.
  • the TCR can be appropriately modified and can include a T cell receptor signaling domain, a T cell costimulatory signaling domain, or both.
  • the T cell receptor signaling domain includes the intracellular domain of the T cell receptor, such as the intracellular portion of the CD3 zeta protein.
  • the costimulatory signaling domain includes the intracellular domain of a costimulatory molecule, which is a cell surface molecule other than the antigen receptor or its ligand, that is required for an efficient response of lymphocytes to antigens.
  • the CAR used in the T cells or T cells contained in the cell population disclosed herein comprises an antigen-binding domain or a portion thereof.
  • the antigen-binding domain or a portion thereof can be appropriately selected according to the type and number of ligands on the surface of the target cell, for example, the antigen-binding domain can be selected to recognize a ligand that acts as a cell surface marker on the target cell associated with a specific disease state.
  • examples of cell surface markers that can act as ligands for the antigen-binding domain in the CAR of the present disclosure can include tissue-specific markers, tumor-specific markers, those associated with virus, bacteria and parasite infections, autoimmune diseases, and cancer cells.
  • the extracellular binding domain of the CAR can be composed of a single chain variable fragment (scFv) obtained by fusing the variable heavy and light regions of a murine or humanized monoclonal antibody.
  • scFv single chain variable fragment
  • Fab fragment-binding protein
  • the scFv can be fused to a transmembrane domain and then to an intracellular signaling domain.
  • the CAR of the present disclosure can be modified to include an antigen binding domain specific for the desired antigen target.
  • an antibody to a cancer antigen such as CD19 can be used as the antigen binding domain in the CAR.
  • the CAR used in the T cells or T cells included in the cell populations disclosed herein can comprise one or more transmembrane domains fused to an extracellular domain.
  • a linker domain derived from the extracellular domain may be linked to the transmembrane domain.
  • the transmembrane domain may be natural or synthetic, and natural transmembrane domains may be derived from any membrane-bound or transmembrane protein.
  • Transmembrane regions of particular use in the present disclosure may be derived from the alpha, beta or zeta chains of the T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, CD271, TNFRSF19, and the like.
  • examples of intracellular signaling domains used in CARs include cytoplasmic signaling sequences of T cell receptors (TCRs) and co-receptors that initiate signal transduction following antigen receptor binding.
  • TCRs T cell receptors
  • co-receptors that initiate signal transduction following antigen receptor binding.
  • the cells, cell populations, etc. disclosed herein can be used in immunotherapy. Immunotherapy is believed to be effective against diseases in which antigenic lesions occur (e.g., cancer, autoimmune diseases, allergies, infectious diseases, etc.) and diseases in which an abnormal immune response to a specific antigen is involved in the onset or progression of the pathology.
  • diseases in which antigenic lesions occur e.g., cancer, autoimmune diseases, allergies, infectious diseases, etc.
  • diseases in which an abnormal immune response to a specific antigen is involved in the onset or progression of the pathology.
  • the cells, etc. disclosed herein can be used in the treatment, therapy, or prevention of autoimmune diseases, allergic diseases, or graft-versus-host disease (GVHD), rejection reactions, or graft failure during transplantation.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • allergic diseases include, but are not limited to, hay fever, allergic rhinitis, bronchial asthma, and atopic dermatitis.
  • the cells, cell populations, and the like disclosed herein can be used for treatment or prevention of diseases in which an abnormal immune response to a specific antigen is involved in the onset or progression of the pathology.
  • the disclosure provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising any of the immune cells described herein (e.g., T cells, such as effector T cells) or cell populations comprising such cells and a pharma- ceutically acceptable carrier.
  • the immune cells express a polypeptide, such as a CAR or TCR
  • the pharmaceutical composition may further comprise an Fc-containing therapeutic agent, such as a therapeutic antibody or an Fc-fusion protein.
  • the Fc-containing therapeutic agent may bind to a target antigen, such as an immune cell specific for a tumor antigen, a pathogen antigen, or a self-antigen.
  • the pathogen antigen may be a bacterial antigen, a viral antigen, or a fungal antigen.
  • the therapeutic antibody may be, but is not limited to, momab, infliximab, ipilimumab, labetuzumab, muromonab, natalizumab, obinutuzumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ramucirumab, ranibizumab, rituximab, tocilizumab, trastuzumab, tositumomab, ustekinumab, mogamulizumab, and vedolizumab.
  • the present disclosure provides (i) a first pharmaceutical composition comprising any of the T cells described herein or a cell population comprising such T cells and a pharma- ceutically acceptable carrier, and (ii) a kit comprising an Fc-containing therapeutic agent described herein and a pharma- ceutically acceptable carrier.
  • T cells or cell populations disclosed herein are also within the scope of the disclosure.
  • a pharmaceutical composition comprising effector T cells comprising the chimeric antigen receptor (CAR) of the present disclosure can be used in cell therapy.
  • T cells comprising the chimeric antigen receptor (CAR) or T cell receptor (TCR) of the present disclosure, or a cell population comprising such T cells can be infused into a subject in need thereof as a pharmaceutical composition or as a formulation of a therapeutically effective cell population expressing the CAR or T cell receptor (TCR) of the present disclosure.
  • the infused T cells or a cell population comprising such T cells in the subject can treat a target disease or disorder, such as cancer or an infectious disorder, in the subject.
  • the subject can be the same subject from which the cells were obtained (autologous cell therapy) or the cells can be derived from another subject of the same species (allogeneic cell therapy).
  • T cells comprising the CAR or (TCR) of the present disclosure or a cell population comprising such T cells may be formulated for administration to a subject using techniques known to those skilled in the art.
  • a formulation comprising a therapeutically effective T cell comprising the CAR or (TCR) of the present disclosure or a cell population comprising such T cells may include a pharma- ceutically acceptable excipient (carrier or diluent).
  • the excipients included in the formulation have different purposes depending, for example, on the nature of the antigen-binding domain of the CAR of the present disclosure.
  • T cells with enhanced glucose uptake were investigated.
  • the specific reagents used were those listed in the examples, but equivalent products from other manufacturers (Sigma-Aldrich, Wako Pure Chemical Industries, Nakarai, R&D Systems, USCN Life Science INC, etc.) can also be used.
  • Example 1 Methods and Materials Preparation of GLUT3 3C10-CAR Construct and Preparation of Viral Vector
  • the lentivirus vector was transfected into 293T cells together with packaging vectors psPAX2 (Addgene #12260) and pMD2.G (Addgene #12259), and lentivirus was obtained from the supernatant.
  • the cells were cultured in the presence of 30 U/ml of IL-2, and frozen and stored on days 8 to 12, or directly subjected to each evaluation.
  • CAR-T cell survival and functional analysis ( Figure 17) The long-term survival, memory formation, and maintenance of function of each CAR-T cell are evaluated.
  • CAR-T cells are stimulated with stimulatory factors (medium as a negative control, EGFRvIII stimulatory beads, U87d cell line) at a ratio of 1:1. After 24 hours, the stimulatory factors are removed using magnetic beads or sorting, and CAR-T cells are divided into 0 mM, 0.5 mM, and 10 mM and continuously cultured.
  • stimulatory factors medium as a negative control, EGFRvIII stimulatory beads, U87d cell line
  • Target cells luciferase-expressing U87 ⁇ cells
  • CAR-T cells E:T ratios of 3:1, 1:1, 0.3:1, and 0.1:1.
  • live cells were made to emit light using VivoGlo Luciferin (Promega), and luciferase activity was measured using Cytation (Promega), to calculate cytotoxicity.
  • Metabolic analysis The metabolic capacity of cells was measured using an XFe24 cell flux analyzer (Bioscience) and an XF glycolysis stress kit (Agilent Technologies) according to the product protocol.
  • the 24-well flat-bottom plate for analysis was coated with poly-D-lysine (0.1 mg/ml) and the sensor cartridge was hydrated in a CO 2 -free incubator.
  • the cells for analysis were washed with analysis medium (Seahorse XF RPMI medium, L-glutamine 2 mM), and then 2 x 10 5 cells were seeded on the analysis plate coated with poly-D-lysine and left to stand at CO 2 -free 37°C for 60 minutes.
  • GLUT3 CAR-T cells have a competitive advantage under low glucose (Figure 5).
  • Figure 5 3C10 CAR-T cells and GLUT3 CAR-T cells were co-cultured under normal glucose and low glucose. Under normal glucose, both cells survived to the same extent, but under low glucose, GLUT3 CAR-T cells survived significantly, suggesting that they have an advantage in glucose uptake.
  • cytotoxic activity was analyzed by targeting an EGFRvIII-expressing cell line. Cytotoxic activity was analyzed under low glucose and high glucose conditions, and GLUT3 CAR-T cells showed higher cytotoxic activity than 3C10 CAR-T cells under both conditions.
  • GLUT3 CAR-T cells evaluation of metabolism, exhaustion, activation, and differentiation
  • Figure 11 3C10 CART and GLUT3 CAR-T cells were analyzed in detail using mRNA expression.
  • GLUT3 CAR-T cells showed a decrease in exhaustion-related molecules and an increase in lactate metabolism and glycolysis-related factors.
  • the data indicates an increase in T cell effector functions such as activation and cytokine production.
  • Figure 12 shows that the same effect can be obtained not only by loading GLUT3 onto the 3C10 CAR but also onto the CD19 CAR, proving universality.
  • GLUT3 was loaded onto the CD19 CAR, and it was confirmed that the same effect as that of the 3C10 CAR could be obtained.
  • CD19 was expressed in a pancreatic cancer cell line, demonstrating its effectiveness against pancreatic cancer.
  • Example 2 Enhancement of glucose transporter expression
  • Figure 15 shows the results of evaluating the antitumor effect of GLUT3 CAR-T cells in a similar mouse model. While no CR was obtained with mock T cells or 3C10 CAR-T cells, GLUT3 CAR-T cells produced CR in four mice.
  • Figure 16 shows the results of tumor challenge. Specifically, it shows the sudden death of mice in the GLUT3 CAR-T cell group. Tumors (U87d) were re-implanted into the cured mice from the previous experiment, and rejection ability was evaluated ("surrogate for memory formation").
  • Figure 19 shows data (in vitro data) indicating enhanced long-term survival after stimulation.
  • staining data for 7-AAD and Annexin V which reflect cell death and apoptosis, are shown at each time point.
  • Cell death in each CAR-T cell was examined using Annexin V and 7-AAD. In a non-stimulated state, differences in glucose concentration were observed, but no significant differences were observed in CAR-T cells.
  • Hematoxylin and eosin (HE) staining was performed according to standard protocols. Deparaffinized and hydrated slides were added to hematoxylin solution and incubated for 4 min. After washing, slides were incubated in eosin solution for 2 min. Stained slides were scanned at 40x and 400x magnifications using a BZ-X710 (Keyence). Two pathologists independently evaluated the stained slides.
  • CAR-T cells conv EGFRvIII CAR-T cells, GLUT3 EGFRvIII CAR-T cells, On-d GLUT3 EGFRvIII CAR-T cells
  • stimulated with EGFRvIII beads ACRO Biosystems, Beijing, China
  • EGFRvIII beads ACRO Biosystems, Beijing, China
  • CAR-T cells (conv EGFRvIII CAR-T cells, GLUT3 EGFRvIII CAR-T cells, and On-d GLUT3 EGFRvIII CAR-T cells) sorted with a BD FACSymphony S6 (BD Biosciences) were stimulated with EGFRvIII beads at a ratio of 1:1 under low glucose (0.5 mM) or high glucose (10 mM) conditions and supplemented with 30 U/ml IL-2.
  • CAR-T cells were harvested on days 3 and 7, and RNA was extracted using an RNeasy kit (QIAGEN, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • RNA-seq libraries were subjected to next-generation sequencing (paired-end reads) of 150 bp from both ends using Novaseq X plus (Illumina, San Diego, CA).
  • paired-end reads were aligned to the hg38 human genome assembly by STAR (Dobin A, Gingeras TR (2015) Mapping RNA-seq Reads with STAR. Curr Protoc Bioinformatics; 51:11.4.1-.4.9).
  • CAR-T cells targeting the GBM-associated antigen EGFRvIII were co-cultured with a human GBM cell line (U-87 MG ⁇ ) expressing EGFRvIII under low glucose conditions (0.5 mM) that reproduce the TME of GBM.
  • U-87 MG ⁇ human GBM cell line
  • cytokine production IFN- ⁇ , IL-2, TNF ⁇
  • Fig. 20d, e cytokine production
  • CAR-T cells were stimulated under low glucose (0.5 mM) or high glucose (10 mM) conditions for 16 hours, and gene expression profiles were analyzed.
  • the gene expression profile was significantly altered by exposure to low glucose conditions (Fig. 22a).
  • Gene sets related to cell cycle, differentiation, and cytokine production were significantly decreased, whereas gene sets related to cellular response to glucose starvation and intrinsic apoptosis were increased under low glucose conditions (Fig. 20f, g).
  • the effector function of CAR-T cells is immediately impaired when exposed to low glucose conditions such as the TME of GBM.
  • Enhancing the antitumor effect by enhancing the metabolic fitness of CAR-T cells in the TME is a novel concept to accelerate the clinical application of CAR-T cell therapy for refractory solid cancers.
  • CAR-T cells for GBM have failed to show clinical benefit
  • immunological monitoring of these clinical trials revealed that abundant CAR-T cells were detected in the TME.
  • nervous system cells such as neurons and glial cells, and GBM, especially GBM expressing EGFRvIII
  • GBM especially GBM expressing EGFRvIII
  • Glia 21(1): 2-21.
  • GLUT3 high affinity glucose transporter GLUT3
  • Glucose transporter proteins in brain delivery of glucose to neurons and glia.
  • Glia 21(1): 2-21.
  • Choen S, Yang L Li Z, et al (2021)
  • EGFR/EGFRvIII partially regulate s the tumorigenesis of glioblastoma through the SOX9-GLUT3 axis.
  • CAR constitutively expressed GLUT3 CAR
  • CAR-T cells enriched in any T cell memory fraction are induced under culture conditions.
  • CAR-T cells introduced into precursor cells of T eff such as Tnv Tscm Tcm, which is a precursor cell, or in which Tnv Tscm Tcm is predominantly amplified, have high division and proliferation ability and are observed to divide for a long period of time.
  • Tnv Tscm Tcm which is a precursor cell, or in which Tnv Tscm Tcm is predominantly amplified
  • PD1, TIM3, LAG3 expression is low and they are resistant to exhaustion.
  • Example 4 Example of TCR Similar experiments are carried out in the case where TCR is introduced instead of CAR.
  • TCR can be introduced into fractions such as Teff , Tnv, Tcm, Tem, and Temra.
  • TCR (constitutively expressed GLUT3TCR) is introduced into any purified and concentrated T cell memory fraction.
  • TCR-T cells enriched in any T cell memory fraction are induced under culture conditions.
  • Example 5 Prevention of bacterial infection, prevention of reinfection, and treatment This example examines the prevention, reinfection prevention, and/or treatment of bacterial infection.
  • T cells of the present disclosure modified with an infectious agent of the bacterial infection are administered to a subject who does not have a bacterial infection.
  • the subjects are monitored for prognosis of bacterial infection using techniques commonly used in this field.
  • T cells of the present disclosure modified with an infectious antigen of the parasitic infection are administered to a subject who does not have the parasitic infection.
  • the T cells of the present disclosure are administered to a subject who has had and/or has a parasitic infection.
  • a parasitic infection e.g., Acanthamoeba keratitis
  • (method) For prevention of viral infections e.g., which may include, but are not limited to, tuberculosis, malaria, yellow fever virus, smallpox virus, vaccination, measles/rubella, polio, mumps/MUMPS, rotavirus infection, chickenpox, yellow fever, Ebola, West Nile fever, Hib infection, pneumococcal infection, pertussis, Japanese encephalitis, meningococcal infection, Salmonella infection, pathogenic E.
  • viral infections e.g., which may include, but are not limited to, tuberculosis, malaria, yellow fever virus, smallpox virus, vaccination, measles/rubella, polio, mumps/MUMPS, rotavirus infection, chickenpox, yellow fever, Ebola, West Nile fever, Hib infection, pneumococcal infection, pertussis, Japanese encephalitis, meningococcal infection, Salmonella infection, pathogenic E.

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Abstract

本開示は、グルコースが枯渇した環境においても飢餓・疲弊せずに、がん細胞に対して競合性を有する細胞を提供する。詳細には、本開示は、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞であって、該Ｔ細胞が、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強した、サバイバーＴ細胞を提供する。このような細胞を含む細胞集団、医薬組成物、治療方法なども提供される。

Description

サバイバーＴ細胞、サバイバーＴ細胞集団および医薬組成物
　本開示は、グルコース取り込み能が強化されたサバイバーＴ細胞、サバイバーＴ細胞集団およびそのような細胞または細胞集団を含む医薬組成物に関する。
　がん細胞は、自らの細胞増殖に有利になるよう代謝系をリプログラミングして、酸素の存在下でもＡＴＰの産生の効率の低い解糖系を積極的に利用し、グルコースの取り込みと乳酸産生を高めている（Ｗａｒｂｕｒｇ効果）。
　腫瘍内微小環境では、抗腫瘍Ｔ細胞の代謝活性や機能を抑制する因子が多く存在し、免疫抑制性の因子に加えて、腫瘍とＴ細胞の代謝面の競合が免疫抑制性環境の形成に関与している。Ｔ細胞はＴＣＲに刺激を受けると、Ｃａ２＋の細胞内濃度が上昇し、カルシニューリンが活性化される。カルシニューリンの活性化により脱リン酸化された転写因子ＮＦＡＴが核内への移行し、他の転写因子との相互作用によりＩＬ－２遺伝子などの転写を促進して活性化する。
　一方で、がん細胞が大量にグルコースを消費して枯渇させるため、グルコースをエネルギー源として必要とするＴｅｆｆ型の腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍に浸潤するとＴＣＲにシグナルを受けても、細胞のＣａ２＋濃度が低下し、ＮＦＡＴの核内への移行が減少する。このためＴ細胞は、機能不全に陥り、細胞増殖とサイトカイン産生が抑制される。
　またグルコースに加えて、アミノ酸や脂肪酸などの栄養素もがん細胞に大量に消費されると、それを競合するＴ細胞が機能不全に陥る。このように、腫瘍内微小環境では、がん細胞の活発な増殖を支える代謝の仕組みにより、腫瘍特異的Ｔ細胞の抗腫瘍エフェクター作用を阻害している。
　そのため、そのような環境下においても飢餓・疲弊せずに、がん細胞に対して競合性を有する細胞が望まれている。
　本開示は、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞あって、腫瘍環境中でも飢餓・疲弊せずに機能する細胞、それを含む細胞集団およびそのような細胞を含む医薬組成物を提供する。
　したがって、本開示は以下を提供する。
［項目１］グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞。
［項目２］前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、項目１に記載の細胞。
［項目２Ａ］前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目３］前記Ｔ細胞はエフェクター機能を有する、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目４］前記Ｔ細胞はエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の前駆細胞である、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目５］前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目６］前記グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含む、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目７］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目８］ヒトＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目９］グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞を含む細胞集団であって、前記Ｔ細胞は、体内に導入されたときに、エフェクター機能を有する性質を有する細胞を含む、細胞集団。
［項目１０］前記Ｔ細胞は、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したものである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１１］前記Ｔ細胞はエフェクター機能を有する、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１２］前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１２Ａ］前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１３］前記細胞集団は、Ｔｅｆｆを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１４］前記細胞集団は、Ｔｅｆｆの前駆細胞を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１４Ａ］前記細胞集団（またはＴｅｆｆの前駆細胞）は、Ｔｎｖ、Ｔｓｃｍ、ＴｃｍおよびＴｅｍｒａからなる群より選択される少なくとも１種の細胞を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１５］前記ＣＡＲまたはＴＣＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１６］前記グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１７］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１８］前記Ｔ細胞はヒトＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目１９］上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
［項目２０］がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症の処置または予防のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目２０Ａ］がんの治癒のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目２１］対象における疾患の予防または治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
（Ａ）前記対象におけるグルコース取り込み能またはそれに関連する指標の値を採取することと、
（Ｂ）前記指標に応じて適切な発現特性を有する、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を選択することと、
（Ｃ）前記グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を適切な用法および用量で、前記対象に投与することと
を特徴とする医薬組成物。
［項目２１Ａ］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目２１Ｂ］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目２１Ｃ］前記疾患は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目２１Ｄ］前記疾患は、がんを含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目２２］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
［項目２３］医薬として使用するための上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目２４］がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症の処置または予防のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目２４Ａ］がんの治癒のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目２５］対象における疾患の予防または治療のための細胞または細胞集団であって、前記細胞または細胞集団は、
（Ａ）前記対象におけるグルコース取り込み能またはそれに関連する指標の値を採取することと、
（Ｂ）前記指標に応じて適切な発現特性を有する、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を選択することと、
（Ｃ）前記グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を適切な用法および用量で、前記対象に投与することと
を特徴とする、細胞または細胞集団。
［項目２５Ａ］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目２５Ｂ］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目２５Ｃ］前記疾患は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目２５Ｄ］前記疾患は、がんを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目２６］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目２７］上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、前記対象を治療または予防する方法。
［項目２８］前記対象の治療または予防は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症の処置または予防のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目２８Ａ］前記対象の治療または予防は、がんの治癒のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目２９］対象における疾患の予防または治療のための方法であって、前記方法は、（Ａ）前記対象におけるグルコース取り込み能またはそれに関連する指標の値を採取することと、
（Ｂ）前記指標に応じて適切な発現特性を有する、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を選択することと、
（Ｃ）前記グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を適切な用法および用量で、前記対象に投与することと
を含む、方法。
［項目２９Ａ］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目２９Ｂ］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目２９Ｃ］前記疾患は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目２９Ｄ］前記疾患は、がんを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目３０］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目３１］上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、前記細胞または細胞集団を含む医薬を製造するための使用。
［項目３２］前記医薬は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症の処置または予防のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目３２Ａ］前記医薬は、がんの治癒のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目３３］前記医薬は、対象における疾患の予防または治療のための、上記項目のいずれか一項に記載の使用であって、前記医薬は、
（Ａ）前記対象におけるグルコース取り込み能またはそれに関連する指標の値を採取することと、
（Ｂ）前記指標に応じて適切な発現特性を有する、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を選択することと、
（Ｃ）前記グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を適切な用法および用量で、前記対象に投与することと
を特徴とする、使用。
［項目３３Ａ］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目３３Ｂ］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目３３Ｃ］前記疾患は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目３３Ｄ］前記疾患は、がんを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目３４］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
　本開示は以下をも提供する。
［項目Ｂ０］グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞であって、前記Ｔ細胞は、低グルコース条件［０．５ｍＭ］下で、通常グルコース条件［１０ｍＭ］下と少なくとも同等のエフェクター機能を示す、エフェクターＴ細胞。
［項目Ｂ１］キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞であって、前記Ｔ細胞は、低グルコース条件［０．５ｍＭ］下で、通常グルコース条件［１０ｍＭ］下と少なくとも同等のエフェクター機能を示す、エフェクターＴ細胞。
［項目Ｂ２］前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目に記載のＴ細胞。
［項目Ｂ３］前記グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含む、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目Ｂ４］キメラ抗原受容体［ＣＡＲ］を含む、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞であって、前記Ｔ細胞は、低グルコース条件［０．５ｍＭ］下で、通常グルコース条件［１０ｍＭ］下と少なくとも同等のエフェクター機能を示し、前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、Ｔ細胞。
［項目Ｂ５］ＧＬＵＴ３遺伝子が導入されたエフェクターＴ細胞。
［項目Ｂ６］ヒトＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞。
［項目Ｂ７Ａ］グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞を含む細胞集団であって、前記Ｔ細胞は、低グルコース条件［０．５ｍＭ］下で、通常グルコース条件［１０ｍＭ］下と少なくとも同等のエフェクター機能を示す、細胞集団。
［項目Ｂ８］前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目Ｂ７］キメラ抗原受容体［ＣＡＲ］を含む、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞を含む細胞集団であって、前記Ｔ細胞は、低グルコース条件［０．５ｍＭ］下で、通常グルコース条件［１０ｍＭ］下と少なくとも同等のエフェクター機能を示す、細胞集団。
［項目Ｂ８］前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目Ｂ９］前記グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目Ｂ１０］キメラ抗原受容体［ＣＡＲ］を含む、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞を含む細胞集団であって、前記Ｔ細胞は、低グルコース条件［０．５ｍＭ］下で、通常グルコース条件［１０ｍＭ］下と少なくとも同等のエフェクター機能を示し、前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、細胞集団。
［項目Ｂ１１］ＧＬＵＴ３遺伝子が導入されたエフェクターＴ細胞を含む細胞集団。
［項目Ｂ１２］前記Ｔ細胞はヒトＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目Ｂ１３］上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
［項目Ｂ１４］がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症の処置または予防のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目Ｂ１５］がんの治癒のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目Ｂ１６］対象における疾患の予防または治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
（Ａ）前記対象におけるグルコース取り込み能またはそれに関連する指標の値を採取することと、
（Ｂ）前記指標に応じて適切な発現特性を有する、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を選択することと、
（Ｃ）前記グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を適切な用法および用量で、前記対象に投与することと
を特徴とする医薬組成物。
［項目Ｂ１７］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目Ｂ１８］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目Ｂ１９］前記疾患は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目Ｂ２０］前記疾患は、がんを含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項目Ｂ２１］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
［項目Ｂ２２］医薬として使用するための上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項目Ｂ２３］がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症の処置または予防のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目Ｂ２４］がんの治癒のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目Ｂ２５］対象における疾患の予防または治療のための細胞または細胞集団であって、前記細胞または細胞集団は、
（Ａ）前記対象におけるグルコース取り込み能またはそれに関連する指標の値を採取することと、
（Ｂ）前記指標に応じて適切な発現特性を有する、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を選択することと、
（Ｃ）前記グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を適切な用法および用量で、前記対象に投与することと
を特徴とする、細胞または細胞集団。
［項目Ｂ２６］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目Ｂ２７］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目Ｂ２８］前記疾患は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目Ｂ２９］前記疾患は、がんを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目Ｂ３０］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
［項目Ｂ３１］上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、前記対象を治療または予防する方法。
［項目Ｂ３２］前記対象の治療または予防は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症の処置または予防のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目Ｂ３３］前記対象の治療または予防は、がんの治癒のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目Ｂ３４］対象における疾患の予防または治療のための方法であって、前記方法は、
（Ａ）前記対象におけるグルコース取り込み能またはそれに関連する指標の値を採取することと、
（Ｂ）前記指標に応じて適切な発現特性を有する、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を選択することと、
（Ｃ）前記グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を適切な用法および用量で、前記対象に投与することと
を含む、方法。
［項目Ｂ３５］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目Ｂ３６］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目Ｂ３７］前記疾患は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目Ｂ３８］前記疾患は、がんを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目Ｂ３９］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［項目Ｂ４０］上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団の、前記細胞または細胞集団を含む医薬を製造するための使用。
［項目Ｂ４１］前記医薬は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症の処置または予防のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目Ｂ４２］前記医薬は、がんの治癒のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目Ｂ４３］前記医薬は、対象における疾患の予防または治療のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用であって、前記医薬は、
（Ａ）前記対象におけるグルコース取り込み能またはそれに関連する指標の値を採取することと、
（Ｂ）前記指標に応じて適切な発現特性を有する、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を選択することと、
（Ｃ）前記グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞または前記Ｔ細胞を含む細胞集団を適切な用法および用量で、前記対象に投与することと
を特徴とする、使用。
［項目Ｂ４４］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目Ｂ４５］前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目Ｂ４６］前記疾患は、がん、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目Ｂ４７］前記疾患は、がんを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
［項目Ｂ４８］前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
　本開示により、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞および／または関連する細胞集団を提供することができ、このような細胞および／または関連する細胞集団を用いることで、腫瘍環境中でも飢餓・疲弊せずに機能するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞および／または関連する細胞集団を提供することができる。
　本開示の細胞は、腫瘍細胞が腫瘍環境内で生き延びる機序をＴ細胞に応用した、代謝強化型Ｔ細胞（サバイバーＴ細胞）または関連する細胞集団ということができる。本開示の細胞および関連する細胞集団によれば、従来の免疫チェックポイント阻害療法では達成し得なかった、腫瘍微小環境など低いグルコース環境下にて効果的な細胞傷害活性、サイトカイン産生能を維持することが可能であり、体内での高い抗腫瘍効果が発揮され得る。また、グルコース需要の高まりに合わせグルコース輸送体が発現する一過性グルコース輸送体発現システムを用いることで、過度な活性化によるＴ細胞の過分化、疲弊を回避し、効果の長期維持が可能なメモリーフェノタイプ型Ｔ細胞が誘導され得る。
図１は、代謝改変抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲ（３Ｃ１０ＣＡＲ＿ＧＬＵＴ３）レンチウイルスベクタープラスミドの構造例を示す。膠芽腫（ＧＢＭ）等に発現するＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするマウス由来抗体（クローン３Ｃ１０）由来の単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を構築、ＣＤ８ｈｉｎｇｅ、ＣＤ２８膜貫通部分（ＣＤ２８ＴＭ）、ＣＤ２８細胞内ドメイン（ＣＤ２８ＩＣＤ）、４－１ＢＢＩＣＤ、ＣＤ３ｚと結合しＣＡＲを構築した。ＣＡＲ下にＰ２Ａ配列を介し高親和性グルコース輸送体（ＧＬＵＴ３）をコードした。図は、同３Ｃ１０ＣＡＲ＿ＧＬＵＴ３をＥＦ－１ａ　ｐｒｏｍｏｔｅｒを有する第三世代レンチウイルスベクタープラスミドに組み込んだ際の例を示す。 図２は、Ｔ細胞表面ＧＬＵＴ３発現とグルコース取り込みの強化を示す。上パネルに、通常型ＣＡＲ（３Ｃ１０　ＣＡＲ）と代謝改変ＣＡＲ（ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ）の構造を示す。左下に３Ｃ１０　ＣＡＲとＧＬＵＴ３　ＣＡＲの蛍光顕微鏡におけるＴ細胞上のＣＡＲ、ＧＬＵＴ３発現像を示す。中下に蛍光強度にて定量したＧＬＵＴ３発現を示す。右下に、２－ＮＢＤＧ法による細胞内へのグルコース取り込み量の定量結果を示す。通常型ＣＡＲ（３Ｃ１０　ＣＡＲ）と代謝改変ＣＡＲ（ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ）を健常ドナー由来Ｔ細胞に遺伝子導入しＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。蛍光顕微鏡にて、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞膜への均質なＧＬＵＴ３発現を認めた。また、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞では、Ｔ細胞、通常型ＣＡＲ－Ｔ細胞（３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞）に比しグルコース取り込みが亢進していた。 図３は、通常ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等のＴ細胞増幅効率を示す結果である。Ｘ軸に導入後の日数、Ｙ軸にＬＯＧ２（ＦＣ）を示す。Ｔ細胞を含む末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ３／２８ビーズ刺激後ＣＡＲを遺伝子導入しＴ細胞増殖効率を解析した。通常グルコース条件下（１０ｍＭ）、低グルコース条件下（０．５ｍＭ）下いずでにおいても、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞は通常型ＣＡＲ－Ｔ細胞（３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞）と同等の樹立効率を有していた。 図４は、ＧＬＵＴ３発現によるＴ細胞解糖能の強化を示す結果である。左のグラフは、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の、通常グルコース条件下（Ｇｌｕ　ｃｏｎｃ　１０ｍＭ）および低グルコース条件下（Ｇｌｕ　ｃｏｎｃ　０．５ｍＭ）での解糖能を示す。下は３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の、通常グルコース条件下（Ｇｌｕ　ｃｏｎｃ　１０ｍＭ）での解糖能を示す。右パネルの左はグルコース添加後に観察される解糖（Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）値を、右は、Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎｅ添加後に観察される解糖能（Ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ　ｃａｐａｃｉｔｙ）値を示す。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞と３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝をＦｌｕｘａｎａｌｙｚｅｒにて解析した。低グルコース環境、通常グルコース環境いずれにおいてもＧＬＵＴ３　ＣＡＲは３Ｃ１０　ＣＡＲより解糖能が強化されていた。 図５は、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、低グルコース下の競合優位性をもつことを示す結果である。左パネルに実験手順を示す。中のパネルには、０日目および３日目の３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞数割合を示す。右パネルには、３日目における、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の比を示す。３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞（無標識）とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＳＦＥ標識）を通常グルコース下、および、低グルコース下にて共培養した。通常グルコース下では両者同程度の生存を認めたが、低グルコース下では、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の有意な生存を認めた。 図６は、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の強化されたサイトカイン産生能を示す結果である。左パネルには上にＣＤ８陽性細胞についての細胞内ＩＦＮｇおよびＩＬ－２解析を、下にＣＤ４陽性細胞についての細胞内ＩＦＮｇおよびＩＬ－２量を示す。右パネルには、ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－αのそれぞれの陽性細胞割合を示す。３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞を抗原刺激後、サイトカイン産生細胞割合をＦＣＭにて解析した。Ｔ細胞維持・活性化と抗腫瘍活性発揮に重要であるサイトカイン群（ＩＦＮ－ｇ，ＩＬ－２，ＴＮＦ－ａ）の有意な発現上昇を認めた。 図７は、低グルコース下でも保たれるＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を示す結果である。左パネルから順に、ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－αのそれぞれの通常グルコース条件下（１０ｍＭ）と低グルコース条件下（０．５ｍＭ）での産生細胞割合を示す。通常グルコース下、低グルコース下でのサイトカイン産生能を比較した。通常型ＣＡＲ－Ｔ細胞（３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞）においては、低グルコース下での極端な機能低下が認められた。一方、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞では、通常グルコース下で高いサイトカイン産生能を認め、また、低グルコース下においても、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞の通常グルコース下サイトカイン産生能と遜色ない機能を発揮した。 図８は、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の強化された細胞傷害活性を示す結果である。左パネルに、グルコース濃度１０ｍＭでのＵ８７ｄ細胞株に対する３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性の結果を、右パネルには、グルコース濃度０．５ｍＭでのＵ８７ｄ細胞株に対する３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性の結果を示す。ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株を標的とし細胞傷害活性を解析した。低グルコース下、通常グルコース下にて細胞傷害活性を解析し、両環境下にてＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞は３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞に比し高い細胞傷害活性を示した。 図９は、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲのＴ細胞メモリーフェノタイプへ与える特性を示す結果である。左パネルには、Ｕ８７ｄ腫瘍細胞株と共培養前（Ｐｒｅｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）と共培養後（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）のＣＤ４５とＣＤ２７の発現を、右パネルには左から共培養前および共培養後のＣＤ４５ＲＡ陽性、ＣＤ２７陰性分画割合を示す。３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞のメモリーフェノタイプを比較した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞において、３Ｃ１０　ＣＡＲと比し強いエフェクターＴ細胞への分化傾向を認めた。 図１０は、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の抑制分子発現の抑制を示す。左から、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３のデータを示す。ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原陽性細胞刺激下の抑制分子の発現を比較した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞において、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３の発現抑制を認めた。 図１１は、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞のｍＲＮＡ解析（代謝、疲弊、活性化、分化の評価）を示す。上段左パネルは、左から順にＰＤＣＤ１発現、ＬＡＧ３発現、ＴＩＭ３発現を示し、上段右パネルは、左から乳酸代謝に関連するエンリッチメントプロット、糖代謝に関連するエンリッチメントプロットを示す。下段は、遺伝オントロジーを基にした発現上昇因子を示す。３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の詳細をｍＲＮＡ発現にて解析した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞にて、ＦＣＭと同じく疲弊関連分子の低下、乳酸代謝、解糖関連因子の上昇を認めた。これらの因子は、活性化、サイトカイン産生等Ｔ細胞エフェクター機能の高まりに関連する因子である。 図１２は、普遍性の証明、すなわち、３Ｃ１０　ＣＡＲのみでなく、ＣＤ１９　ＣＡＲに搭載しても同様の効果が得られることを示す。左パネルには、３Ｃ１０　ＣＡＲを用いた実験を、右パネルにはＣＤ１９　ＣＡＲを用いた実験を示す。各パネルにおいて左上はＭｏｃｋ導入Ｔ細胞、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞内ＩＬ－２、ＩＦＮｇ、ＴＮＦ－ａ解析を、右上は通常グルコース条件（１０ｍＭ）下での３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の左からＩＦＮｇ、ＩＬ－２、ＴＮＦａの陽性細胞割合を、左下は、低グルコース条件（０．５ｍＭ）下での３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の左からＩＦＮｇ、ＩＬ－２、ＴＮＦａの陽性細胞割合を示す。右下は左からＵ８７ｄ細胞株、Ｕ２５１ＭＧｄ細胞株に対する、低グルコース条件下（０．５ｍＭ）での３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す。ＧＬＵＴ３をＣＤ１９　ＣＡＲに搭載した場合にも、３Ｃ１０　ＣＡＲと同様の効果が得られることを確認した。また、膵臓がん細胞株にＣＤ１９を発現させた膵臓がん細胞に対しても効果があることが示された。 図１３は、頭蓋内ゼノグラフトモデルですみやかな腫瘍根絶を実現することを示す。左上パネルに実験の簡単なスキームを示す。簡単には免疫不全マウスであるＮＳＧマウスの頭蓋内に２．５ｘ１０４細胞のＵ８７ｄ腫瘍細胞株を移植、５日後に１ｘ１０６細胞のＣＡＲＴ細胞を経尾静脈投与し、生体発光イメージング（ＢＬＩ）にて経時的に腫瘍量を定量するモデルである。左中には０日目及び１１日目の腫瘍イメージング像を示す。左下のグラフは経時的な発光強度（腫瘍量を反映）を示す。中－中パネルには各治療群のカプランマイヤー曲線を示す。中パネルの下には、腫瘍リチャレンジマウスにおける、３４日目、３８日目および４２日目の腫瘍イメージング像を示す。右欄には、経時的な末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞数を示す。Ｕ８７Δ頭蓋内ゼノグラフトモデルにて抗腫瘍活性を観察した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞治療群において、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞治療群より速やかな腫瘍根絶と生存の改善、優位なＴ細胞増幅を認めた。また、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞群治癒マウスにおける腫瘍ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅにて、腫瘍拒絶を確認した。 図１４は、ＧＬＵＴ３発現システムのデザインを示す。模式図中の記号はそれぞれＥＦ－１プロモーター（ＥＦ－１ａ）、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ）、Ｐ２Ａシーケンス（Ｐ２Ａ）、高親和性グルコース輸送体（ＧＬＵＴ３）を示す。Ｓｔｂｌ－ＧＬＵＴ３はＧＬＵＴ３　ＣＡＲと同一のものである。 図１５は、マウスモデルでＭｏｃｋＴ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を評価を示す。上に実験模式図を示す。左上に治療後のカプランマイヤー曲線を示す。下に、生体発光イメージング（ＢＬＩ）にて定量した経時的な腫瘍量の推移を示す。ＭｏｃｋＴ細胞では腫瘍は抑制せれず、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔでは４頭の完全寛解（ＣＲ）が得られた。 図１６は、腫瘍Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ実験（ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞群でのマウス頓死）を示す。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞治療後の腫瘍量、および、生存を示す（１日目（チャレンジ後）、リチャレンジ５日目、リチャレンジ１２日目の腫瘍イメージング像を示す）。前図実験の治癒マウスに腫瘍（Ｕ８７ｄ）を再移植し拒絶能を評価（“メモリー化のサロゲート”）。１ｘ１０５細胞の腫瘍細胞を再移植、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ群において４匹中１匹のマウスがＣＲとなった。しかし、４匹中３匹のマウスが死亡した（非腫瘍増幅死）。 図１７は、刺激後長期生存の増強を示す各ＣＡＲＴ細胞を上記条件にて経時観察する。この図ではｉｎ　ｖｉｔｒｏ（ＣＡＲ）Ｔ細胞刺激・培養試験計画が示される。非ＣＡＲ導入Ｔ細胞　ＵＴＤ、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞評価対象とし、刺激なし群と刺激あり（Ｕ８７ｄ細胞株による刺激、もしくは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ　磁気ビーズによる刺激）を設ける。さらに、各郡無グルコース条件（０ｍＭ）、低グルコース条件（０．５ｍＭ）、通常グルコース条件（１０ｍＭ）を設け培養を行う（計２７群）。各群に対し、右スケジュールに示した解析を経時的に行う。低グルコース条件下において通常ＣＡＲ－Ｔ　３Ｃ１０は有効なサイトカイン産生が示されない一方、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔは有効なサイトカイン産生能を発揮する。ただし、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔはグルコース過剰取り込みによりにより経時的に（ｄａｙ３やｄａｙ７）にＣＣＲ７陰性のエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）や終末分化ＲＡ陽性Ｔ細胞（Ｔｅｍｒａ）へと終末分化、ｓｔｅｍｎｅｓｓの消失、アポトーシスに陥る。ＣＡＲ－Ｔ細胞（通常グルコースで樹立）が急激（ｄａｙ０）に０ｍＭや０．５ｍＭの低グルコース下に置かれた場合、グルコース依存性の高いＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔはアポトーシスに陥りやすい。 図１８は、体内での長期生存の増強を示す。前述マウスと同様の系で上記抗腫瘍効果、生存、有害事象を検討する。この図では免疫不全マウスであるＮＳＧマウスの頭蓋内にＵ８７ｄ腫瘍細胞株を移植、５日後にＭｏｃｋ　導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞を経尾静脈投与し、生体発光イメージングによる抗腫瘍効果定量と生存を解析する。実験１では樹立ＣＡＲ－Ｔ細胞をそのまま使用、実験２では、高グルコース環境に暴露後投与、実験３では低グルコース高乳酸環境が報告されている肝臓に腫瘍を移植し実験、実験４にて、Ｔ細胞の生着、腫瘍への浸潤を評価する。実験１においては、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞が優位な抗腫瘍活性を示す。実験２においては、グルコース暴露によるＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ過活性化からアポトーシス、過分化がおこり抗腫瘍活性が減弱する。Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅにおいては、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞にて腫瘍を拒絶する。実験４においては、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞において優位なＣＡＲ－Ｔ細胞生着と腫瘍Ｔ細胞浸潤が観察される。実験３は、低グルコース　高乳酸環境による免疫抑制が示唆されている肝腫瘍モデルでの実験で、実験２と同様の結果が得られること期待する探索的実験である。 図１９は、刺激後長期生存の増強を示すデータ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄａｔａ）を示す。左からＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の０ｍＭ、０．５ｍＭおよび１０ｍＭ条件下での細胞死の結果を示す。各ＣＡＲ－Ｔ細胞における細胞死を、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ、７－ＡＡＤで検討した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞では、非刺激状態において、無および低グルコース条件下（０ｍＭ，０．５ｍＭ）においても、通常グルコース条件下（１０ｍＭ）と同等のアポトーシス、および、細胞死率であった。 図２０は、低グルコース状態はＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を損なうことを示す図である。（ａ－ｃ）膠芽腫（ＧＢＭ）、非小細胞肺癌（Ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（Ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ）の患者（ｎ＝５ずつ）の手術検体または生検検体から間質液を低速遠心法により採取し、グルコース濃度を調べた。（ａ）実験スキーマ。（ｂ）ＧＢＭ検体の間質液および対になった血清検体中のグルコース濃度。データは平均値±ＳＥＭで示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による統計解析；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。（ｃ）ＧＢＭ、非小細胞肺がん（肺がん）、大腸がん（大腸がん）検体の間質液中のグルコース濃度。データは平均値±ＳＥＭで示した。一元配置分散分析による統計解析；＊，Ｐ＜０．０５。（ｄ，ｅ）健常人（ｎ＝５）のＰＢＭＣからモック導入Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ）と従来型ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ　ｃｅｌｌｓ）を調製した。（ｄ）低グルコース（０．５ｍＭ）または高グルコース（１０ｍＭ）条件下で、ＥＧＦＲｖＩＩＩ　発現腫瘍細胞（Ｕ－８７　ＭＧΔ）で刺激した際の、模擬形質転換Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ　Ｔ）およびｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＣＡＲ－Ｔ）のサイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色により調べた。代表的な等高線図（左）とサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）産生細胞の頻度の要約（右）を示す。データは平均値±ＳＥＭで示した。スチューデントのｔ検定による統計解析；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１。（ｅ）低グルコース（０．５ｍＭ）または高グルコース（１０ｍＭ）条件下でＵ－８７　ＭＧΔ細胞と１６時間共培養したｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）産生をＥＬＩＳＡで測定した。データは平均値±ＳＥＭで示した。スチューデントのｔ検定による統計解析；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。（ｆ）低グルコース（０．５ｍＭ）または高グルコース（１０ｍＭ）条件下でのＥＧＦＲｖＩＩＩビーズ刺激後２４時間のＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞の遺伝子発現。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ　Ｄａｔａｂａｓｅに従って、高グルコース条件下と比較して低グルコース条件下で濃縮された経路を示す。（ｇ）選択した遺伝子の遺伝子発現をヒートマップで示す。遺伝子発現はｒｏｗで正規化した。すべての実験は少なくとも２回行った。 図２１は、ＧＬＵＴ３の過剰発現は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝適性を高め、低グルコース条件下での細胞毒性とサイトカイン産生を増加させることを示す図である。（ａ）従来の　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ（ｃｏｎｖ　ＣＡＲ、上）とＧＬＵＴ３を安定発現させたＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ（ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ、下）の構築物。（ｂ）ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＣＡＲ－Ｔ）とＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ）の免疫蛍光染色。白点線の円は、ＣＡＲで形質導入されなかったＴ細胞を示す。カチューシャ（赤）、４，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ：青）、ＧＬＵＴ３（緑）。（ｃ）ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＧＬＵＴ１（左）とＧＬＵＴ３（右）の発現レベル。平均蛍光強度（ＭＦＩ）のサマリーを示す。データは平均値±ＳＥＭで示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による統計解析；ｎｓ，有意ではない；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。（ｄ）グルコースアナログ２－ＮＢＤＧ取り込みアッセイで測定したＣＡＲ－Ｔ細胞によるグルコース取り込み。代表的なヒストグラム（左）と平均蛍光強度（ＭＦＩ）サマリー（右）を示す。データは平均値±ＳＥＭで示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定による；＊＊，Ｐ＜０．０１。（ｅ，ｆ）フラックスアナライザーによる低グルコース（０．５ｍＭ）条件下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の解糖能（ｅ）と代謝表現型（ｆ）。データは平均値±ＳＤで示す。（ｇ，ｈ）ＣＡＲ－Ｔ細胞は健常人（ｎ＝５）のＰＢＭＣから調製した。（ｇ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下でＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍細胞（Ｕ－８７　ＭＧΔ）を刺激した際のサイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色で調べた。代表的な等高線図（左）とサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）産生細胞の頻度の要約（右）を示す。データは平均値±ＳＥＭで示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定による；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。（ｈ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下で１６時間Ｕ－８７　ＭＧΔ細胞と共培養したＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）産生をＥＬＩＳＡで測定した。データは平均値±ＳＥＭで示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定による；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。（ｉ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を、ルシフェラーゼベースのアッセイで測定。ＣＡＲ－Ｔ細胞とルシフェラーゼ発現標的細胞（Ｕ－８７　ＭＧΔ－Ｌｕｃ）を、指示したエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間共培養し、ルシフェラーゼ活性に基づいて特異的溶解を算出した。データは平均値±ＳＥＭで示した。スチューデントのｔ検定による統計解析；＊＊，Ｐ＜０．０１。（ｊ，ｋ）ＣＡＲ－Ｔ細胞による消耗マーカー（ＰＤ－１とＴｉｍ－３）の発現。ＰＤ－１＋ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｊ）およびＰＤ－１＋Ｔｉｍ－３＋ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｋ）集団の頻度の要約を示す。データは平均値±ＳＥＭで示した。スチューデントのｔ検定による統計解析；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。 図２２は、低グルコース状態はＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を損なうことを示す図である。（ａ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下で培養したｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞において、高グルコース（１０ｍＭ）条件下と比較して差次的に発現した遺伝子を示すボルケーノプロット。Ｘ軸はｌｏｇ２（ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）（ｌｏｇ２　ＦＣ）を表し、Ｙ軸は－ｌｏｇ１０（ａｄｊｕｓｔｅｄ　ｐ　ｖａｌｕｅ）［（－ｌｏｇ１０（ｐａｄｊ））］を表す。点線はｌｏｇ２（ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）のカットオフ値、ｘ＝±１．４と－ｌｏｇ１０（ａｄｊｕｓｔｅｄ　ｐ　ｖａｌｕｅ）のカットオフ値、ｙ＝０．１を表す。上位５遺伝子と下位５遺伝子はそれぞれ緑と紫でハイライトされている。 図２３は、ＧＬＵＴ３の過剰発現は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝適性を高めることを示す図である。（ａ）ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＣＡＲ－Ｔ）、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ）、Ｕ－８７　ＭＧΔ細胞、Ｕ－２５１　ＭＧΔ細胞におけるＧＬＵＴ１（左）とＧＬＵＴ３（右）の発現。代表的なヒストグラムを示す。（ｂ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下で培養したＣＡＲ－Ｔ細胞の解糖パラメータを解糖ストレス試験で測定。データは平均値±ＳＤで示す。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定による；ｎｓ，有意ではない；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。（ｃ，ｄ）低グルコース（０．５ｍＭ）または高グルコース（１０ｍＭ）条件下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の競合アッセイ（７２時間培養）。（ｃ）実験スキーマ（ｎ＝３）。（ｄ）代表的な等高線図（左）と各ＣＡＲ－Ｔ細胞集団の割合の要約（右）。データは平均値±ＳＥＭで示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による統計解析；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。 図２４は、ＧＬＵＴ３の安定発現は、低グルコース条件下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を改善することを示す図である。（ａ－ｃ）高グルコース（１０ｍＭ）条件下でＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍細胞（Ｕ－８７　ＭＧΔ）で刺激した際の、モックＴ細胞（Ｍｏｃｋ　Ｔ）、ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＣＡＲ－Ｔ）、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ）（ｎ＝５）によるサイトカイン産生を細胞内染色で調べた。（ａ）ＣＤ３＋　ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）の頻度の要約。データは平均値±ＳＥＭで示す。スチューデントのｔ検定による統計解析；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。（ｂ）代表的な等高線図（左）およびサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）産生ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の頻度の要約（右）。データは平均値±ＳＥＭで示した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による統計解析；ｎｓ、有意ではない；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。（ｃ）代表的な等高線図（左）とサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）産生ＣＤ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の頻度の要約（右）。データは平均値±ＳＥＭで示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定による；＊＊，Ｐ＜０．０１。（ｄ，ｅ）低グルコース（０．５ｍＭ）または高グルコース（１０ｍＭ）条件下での、Ｕ－８７　ＭＧΔ細胞およびＵ－２５１　ＭＧΔ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を、ルシフェラーゼベースのアッセイにより決定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞とルシフェラーゼ発現標的細胞（Ｕ－８７　ＭＧΔ－ＬｕｃおよびＵ－２５１　ＭＧΔ－Ｌｕｃ）を、指示したエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間共培養し、特異的溶解をルシフェラーゼ活性に基づいて算出した。（ｄ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下でのＵ－２５１　ＭＧΔ－Ｌｕｃ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性。データは平均値±ＳＥＭで示した。スチューデントのｔ検定による統計解析；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１。（ｅ）高グルコース（１０ｍＭ）条件下でのＵ－８７　ＭＧΔ－Ｌｕｃ細胞またはＵ－２５１　ＭＧΔ－Ｌｕｃ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性。データは平均値±ＳＥＭで示した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による統計解析；ｎｓ，有意でない；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１．（Ｆ，Ｇ）示したＣＡＲ－Ｔ細胞集団による消耗マーカー（ＰＤ－１、　ｆ、ＰＤ－１とＴｉｍ－３、　ｇ）の発現。代表的な等高線プロットを示す。 図２５は、ＧＬＵＴ３の安定発現によるＣＡＲ－Ｔ細胞の機能向上は、ｓｃＦｖの種類に依存しないことを示す図である。（ａ，ｂ）モックＴ細胞（Ｍｏｃｋ　Ｔ）、ｃｏｎｖ　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ）、およびＧＬＵＴ３　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＬＵＴ３　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ）は、健常人（ｎ＝５）のＰＢＭＣから調製した。（ａ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下でＣＤ１９発現腫瘍細胞（ＮＡＬＭ６）と刺激した際の、細胞内サイトカイン染色による、標記ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン産生。代表的な等高線図（左）とサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）産生細胞の頻度の要約（右）を示す。データは平均値±ＳＥＭで示した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による統計解析；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１．（ｂ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下でＮＡＬＭ６と１６時間共培養したｃｏｎｖ　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＧＬＵＴ３　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）産生をＥＬＩＳＡで測定した。データは平均値±ＳＥＭで示した。スチューデントのｔ検定による統計解析；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１．（ｃ）低グルコース（０．５ｍＭ）条件下でのＮＡＬＭ６およびＣＤ１９発現ＡｓＰＣ－１細胞に対するｃｏｎｖ　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＧＬＵＴ３　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を、ルシフェラーゼベースのアッセイにより決定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞とルシフェラーゼ発現標的細胞（ＮＡＬＭ６－ＬｕｃおよびＣＤ１９発現ＡｓＰＣ－１－Ｌｕｃ）を、指示したエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間共培養し、特異的溶解率をルシフェラーゼ活性に基づいて評価した。データは平均値±ＳＥＭで示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定による；ｎｓ，有意でない；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。したがって、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　本明細書において「Ｔ細胞」は、当該分野で用いられる広義の意味で用いられ、骨髄で生成されたリンパ球が胸腺に移動し成熟したものをいう。Ｔ細胞は、末梢血および骨髄由来単核球の正常分画のうち、ＣＤ４５陽性かつＣＤ３陽性細胞であり得る。使用されるＴ細胞は、ドナー、特にヒトドナーから単離されたＴ細胞が利用され得るがこれに限定されない。Ｔ細胞及びそれに由来する細胞としては、培養で継代されていない単離されたＴ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代及び維持されたＴ細胞、並びに不死化されて無期限に細胞培養条件下で維持され得るＴ細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、その機能により複数種類存在することが知られており、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、ナイーブＴ細胞(Ｔｎｖ)、ステムセルメモリーＴ細胞(Ｔｓｃｍ)、セントラルメモリーＴ細胞 (Ｔｃｍ)、終末分化ＲＡ陽性Ｔ細胞(Ｔｅｍｒａ)、などを挙げることができる。本明細書において、「末梢Ｔ細胞」とは、胸腺外に存在するＴ細胞をいい、末梢血液、リンパ節、その他組織から取得することができる。本明細書において「末梢Ｔ細胞」というとき、細胞群に末梢Ｔ細胞が含まれていればよく、Ｔ細胞が単離されている必要はない。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などＴ細胞の他にも種々のリンパ球を含む細胞画分を用いてもよい。
　本明細書において、「細胞集団」とは、２以上の細胞を含む集団であり、例えば、平面的に細胞同士が集まった状態のものであってもよく、３次元的に細胞同士が接着して構成された細胞塊であってもよい。また、「細胞集団」は、単一種の細胞により形成されていてもよいし、複数種の細胞が含まれていてもよい。本開示のＴ細胞の細胞集団をいう場合は、Ｔｎｖ、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍｒａなどの、機能すべき場所（代表的に体内）において、エフェクター機能を有し得る細胞が少なくとも１つ含まれていればよい。
　本明細書において「フローサイトメトリー」とは、液体中に懸濁する細胞、個体およびその他の生物粒子の粒子数、個々の物理的・化学的・生物学的性状を計測する技術をいう。この技術を用いた装置は、「フローサイトメーター」という。本開示において、細胞マーカー（例えば、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＤ１０３など）の「陽性」「陰性」は、当該分野において通常使用されるように、フローサイトメトリーによって定められる。より詳細には、フローサイトメトリーでは、細胞を一列に並べて流し、分光学的手法により細胞の数をカウントする。例えば、蛍光や発光酵素によって標識された細胞にレーザー光を照射し、これによって細胞から発せられる蛍光又は発光信号をフォトダイオード等の検出器で検出することで、標的細胞の数をカウントする。また、検出器での検出結果をコンピュータに取り込んで、二次元プロットを生成して表示することもできる。これにより、標的細胞の有無、及びその数等を容易に把握できる。
　本明細書において、「エフェクター機能」とは、Ｔ細胞においては、ＴＣＲやＣＡＲを介したシグナルに起因する、細胞傷害活性、サイトカイン産生、分裂・増殖など生物学的活性を差し、他の免疫細胞においては、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、エフェクター機能としては、例えば、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、およびＢ細胞の活性化などが含まれる。本開示においてＴ細胞がエフェクター機能を有するかどうかは、実施例などに例示される手法を用いて細胞傷害活性、サイトカイン産生および分裂・増殖を有することを確認して判定することができる。
　本明細書において、「エフェクター細胞」または「エフェクターＴ細胞」とは、エフェクター機能を有するＴ細胞であって、標的細胞に対して細胞傷害作用を及ぼす免疫細胞を意味し、Ｔｅｆｆと呼称することもある。本明細書で「エフェクター」（細胞）であるかどうかは、細胞傷害アッセイ、フローサイトメトリーによる表面抗原解析、細胞内サイトカイン染色などの判定方法で判断することができる。エフェクターＴ細胞はエフェクター機能を実行する免疫細胞であり、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などを媒介する。エフェクターＴ細胞は、例えば、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、マクロファージ、細胞障害性Ｔ細胞、および好中球などを含み、例えば血液などの天然の組織から単離することができる。
　本明細書において「エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の前駆細胞」とは、エフェクター細胞ではないが、機能すべき場所 （例えば体内）に移動されあるいは他の刺激によって、エフェクター機能を備えるものをいう。そのような細胞としてリンパ球系前駆細胞、Ｔｎｖ、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍｒａなどが含まれる。エフェクターＴ細胞の前駆細胞は、免疫応答の初期段階で活性化され、増殖や分化を経てエフェクターＴ細胞に成熟するが、一部の前駆細胞はメモリーＴ細胞へと分化する能力を持つ。これらの前駆細胞には、特定の遺伝子発現パターンや代謝状態があり、それがメモリー機能の延長に寄与する。このメモリー機能の延長には、いくつかの分子的および代謝的な特性が関与している。まず、エフェクターＴ細胞の前駆細胞は、代謝プログラムにおいて特異的な特徴を持つ。これらの細胞では、エフェクターＴ細胞に特徴的な解糖系（グリコリシス）ではなく、酸化的リン酸化（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）が優勢であり、この代謝経路はエネルギー効率が高く、細胞の長期生存を可能にする。この代謝的特性は、メモリーＴ細胞としての長期間の機能維持を支える重要な要素である。次に、転写因子の役割も重要である。エフェクターＴ細胞の前駆細胞では、Ｔ－ｂｅｔやＥｏｍｅｓといった転写因子が発現しており、これらがメモリーＴ細胞への分化を促進すると同時に、その長期的な生存と機能を可能にする。また、ＣＤ６２ＬやＣＣＲ７などの表面マーカーを発現するこれらの前駆細胞は、二次リンパ組織への移動能力を持つ。このホーミング機能により、前駆細胞は二次リンパ組織で必要な生存シグナルを受け取り、メモリー機能の維持に寄与する。さらに、抗原刺激の抑制もメモリー機能の延長に関与している。一部の前駆細胞は、抗原刺激から解放されることでエフェクターＴ細胞への完全な分化が抑制され、代わりにメモリーＴ細胞としての性質を保持する。このメカニズムにより、過剰なエフェクター応答が抑制されると同時に、メモリー機能が保持される。加えて、細胞周囲のサイトカイン環境も重要な役割を果たす。特に、ＩＬ－７やＩＬ－１５などのサイトカインは、メモリーＴ細胞の維持に必要な生存シグナルを提供し、これがメモリー機能の延長に大きく寄与している。これらの要因により、エフェクターＴ細胞の前駆細胞は、通常のエフェクターＴ細胞と比較して長期間生存し、迅速かつ強力な二次免疫応答を可能にするメモリー機能を保持する。この特性は、感染症に対する免疫防御だけでなく、がん免疫療法やワクチン開発においても重要な役割を果たすと考えられる。このように、エフェクターＴ細胞の前駆細胞の特性を理解することは、免疫学の基礎研究および臨床応用の両方において大きな意義を持つ。
　エフェクターＴ細胞の前駆細胞において、メモリーＴ細胞の表現型が維持されるとは、エフェクターＴ細胞へと分化する過程において、一部の前駆細胞がメモリーＴ細胞特有の表現型（例：表面マーカー、代謝状態、転写因子の発現など）を保持しながら存在する現象を指す。このような前駆細胞は、免疫応答の終了後も生存し、長期間にわたって免疫記憶を提供する能力を持つ。この現象は、Ｔ細胞がエフェクター機能を発揮する過程と、長期間生存して迅速な二次免疫応答を可能にするメモリー機能の両方を両立させるための重要なメカニズムと考えられている。この現象が持つ特性について説明する。まず、エフェクターＴ細胞の前駆細胞は、メモリーＴ細胞特有の表面マーカーを維持している。これには、ＣＤ６２ＬやＣＣＲ７といったホーミング分子が含まれ、これらの分子の発現により、前駆細胞は二次リンパ組織への移動能力を保持している。次に、これらの前駆細胞は、代謝状態の維持も特徴的である。具体的には、解糖系よりも酸化的リン酸化が優勢であり、エネルギー効率が高い代謝プログラムを維持することで、長期間にわたる生存が可能となる。この代謝特性は、メモリーＴ細胞としての機能を維持するために重要な要素である。また、前駆細胞は、転写因子の発現においても特徴的なバランスを保持している。Ｔ－ｂｅｔやＥｏｍｅｓといった転写因子の適切な発現が、エフェクターＴ細胞への分化とメモリーＴ細胞の表現型維持を両立させる役割を果たしている。さらに、前駆細胞は、サイトカインシグナルへの応答性を持ち、ＩＬ－７やＩＬ－１５などの生存シグナルを受け取ることができる。この応答性により、前駆細胞はメモリーＴ細胞の特性を保持しつつ、長期間の生存が可能となる。最後に、これらの前駆細胞は、抗原非依存的な維持が可能である。つまり、メモリーＴ細胞の前駆細胞は、抗原の存在がなくてもその表現型を保持し、迅速な免疫応答の準備状態を維持する能力を持つ。以上の特性により、エフェクターＴ細胞の前駆細胞がメモリーＴ細胞の表現型を維持することは、免疫システムの柔軟性と長期的な記憶免疫の確立において極めて重要な役割を果たしている。これらの特性は、感染症防御やがん免疫療法、さらにはワクチン設計において大きな意義を持つと考えられる。
　本明細書において、「抗原受容体」とは、標的とする抗原に特異的に結合し、当該受容体を発現する細胞内にシグナルを伝達する任意の分子を指す。本開示において、抗原受容体は、Ｔ細胞に導入され得るものであり、天然のものであっても、人工的な分子であってもよく、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）・Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）に加えて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も包含される。
　本明細書において、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、抗原特異性を細胞（例えば免疫細胞）に付与できる改変された受容体をいう。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体として知られている。抗原特異性を免疫系細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせ等のＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージなど）に移植する改変受容体であり、ＣＡＲは、例えば、抗原特異的標的指向領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。また、複数（多くは２種類）の抗原特異標的指向領域を用いるもの（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＣＡＲ）も含み得る。好ましくは、本開示のＣＡＲは、抗原に結合することが可能な少なくとも１つの細胞外ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。
　本明細書において「Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）」とは、Ｔ細胞に存在するレセプターをいう。ＴＣＲは、２つのＴＣＲポリペプチド鎖からなるヘテロダイマー受容体分子であり、通常のＴ細胞が発現するαβ型ＴＣＲと特殊な機能をもつγδ型ＴＣＲが存在する。αおよびβ鎖ＴＣＲ分子は複数のＣＤ３分子（ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖）と複合体を形成し、抗原認識後の細胞内シグナルを伝達し、様々な免疫応答を開始させる。ウイルス感染に伴い細胞内で増殖したウイルス抗原やがん細胞由来のがん抗原などの内因性抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原ペプチドとして提示される。また、外来微生物由来の抗原はエンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、プロセシングを受けたのちにＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。これらの抗原は、それぞれＣＤ８＋　Ｔ細胞あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞の発現するＴＣＲにより認識される。ＴＣＲ分子を介した刺激には、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０分子などの共刺激分子が重要であることも知られている。αβ型ＴＣＲについてみると、αおよびβの各々の遺伝子産物は、ユニークな組み合わせにより、特異性を発現するとされる。
　本明細書において、「グルコース取り込み能」とは、単位時間あたりの細胞へのグルコースを取り込む能力をいう。グルコースの細胞への取り込みは、例えば２－ＮＢＤＧ　ｕｐｔａｋｅアッセイなどの手法によって評価することができる。
　本明細書において、「グルコース取り込み能の強化」とは、任意の手法によってグルコース取り込み能が向上することをいい、グルコース取り込み能の向上は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）において、１種または複数種のグルコーストランスポーターなどを発現するように改変し、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強するように改変することによって達成され得る。このような遺伝子改変免疫細胞は、例えば、低グルコース環境において（例えば、腫瘍微小環境において）、高いグルコース取り込みを示すと予測される。それゆえ、１種または複数種のグルコーストランスポーター及びキメラ受容体ポリペプチドを共発現する免疫細胞は、優れた生理活性（例えば、任意選択的に治療抗体の存在下、低グルコース条件などの腫瘍微小環境下で）、例えば、細胞増殖、活性化（例えば、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ－２またはＩＦＮγの産生の増加）、細胞傷害性、及び／またはｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍活性などを示し得る。
　本明細書において、「グルコーストランスポーター」（ＧＬＵＴ）とは、グルコース（ブドウ糖）の促進拡散型輸送を行うトランスポーターをいう。ＧＬＵＴには、ＧＬＵＴ１～ＧＬＵＴ１４の分子種が報告されており、その中で例えば、ＧＬＵＴ１は広範組織に発現し、恒常的なベースラインのグルコース輸送を担い、ＧＬＵＴ２は糖濃度が高まった際に作動し、グルコース取り込みを亢進し、ＧＬＵＴ３は中枢神経で中心的な役割を果たし、グルコース低濃度下でも輸送機能を発揮し、ＧＬＵＴ４はインスリン刺激を受けて作動するなどの特徴がある。
　本明細書において「腫瘍微小環境」は、「腫瘍環境」とも交換可能に用いられ、腫瘍微小環境（Ｔｕｍｏｒ　Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＴＭＥ）とは、腫瘍組織を取り囲む局所的な生物学的環境を指し、腫瘍の進展、増殖、転移、薬剤耐性などに関与する多様な要因を含む概念である。この環境には、腫瘍細胞のみならず、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞やマクロファージ）、線維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞などの非腫瘍性細胞が含まれる。また、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、サイトカイン、ケモカイン、成長因子などの液性因子も重要な構成要素である。さらに、腫瘍微小環境は酸素濃度、ｐＨ、栄養状態などの物理的要因の影響も受ける。腫瘍微小環境における細胞間相互作用や物理的要因の変化は、腫瘍の悪性化や治療反応性に重要な役割を果たすとされている。特に、免疫抑制的な微小環境は、免疫療法の効果を減少させる要因として注目されている。本発明において「腫瘍微小環境」とは、これらの要素およびその相互作用を含む生物学的・物理的要因の集合体を指し、腫瘍治療や診断における重要な対象である。
　本明細書において「腫瘍微小環境条件」とは、腫瘍微小環境またはそれと同等の条件を意味する。したがって、「腫瘍微小環境条件」は、腫瘍微小環境を構成する条件に加え、腫瘍が体内において置かれる類似または同等の環境条件を含む広義の概念を意味する。具体的には、腫瘍組織を取り囲む局所的な生物学的環境のみならず、腫瘍が体内に存在する際に影響を受ける内因性および外因性の要素を含むものである。この環境には、腫瘍細胞と非腫瘍性細胞（例えば、免疫細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞など）間の相互作用、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）やサイトカイン、ケモカイン、成長因子などの液性因子、および酸素濃度、ｐＨ、栄養状態、物理的圧力などの物理的要因が含まれる。また、「腫瘍微小環境条件」には、腫瘍が体内の広範囲な生理学的環境と相互作用する状況も含まれるため、腫瘍周辺の局所環境に限定されない。本発明において「腫瘍微小環境条件」とは、腫瘍が体内で遭遇する広範な環境条件を包括的に表し、これには腫瘍進展や治療反応性に影響を与える要因全般が含まれる。
　本明細書において「改変」とは、遺伝子（核酸やそれに対応するタンパク質を含む）に対して行われる構造的、機能的、または発現に関連するあらゆる変更を広く指し、自然発生的または人工的な変更が含まれる。具体的には、塩基配列の置換、欠失、挿入、付加、またはその組み合わせによる配列の変化、コードされるタンパク質のアミノ酸配列や特性の変更、または機能性の付加や向上を目的とした化学修飾（例：糖鎖付加、リン酸化、アセチル化など）を含む。また、「改変」には、外部からの遺伝子導入（例：トランスフェクションやウイルスベクターを介した遺伝子導入）、形質転換（トランスフォーメーション）、あるいはゲノム編集技術を用いた特定遺伝子のノックアウトやノックイン、遺伝子発現の抑制（例：RNA干渉やCRISPR技術による抑制）なども含まれる。さらに、エピジェネティックな修飾（例：DNAメチル化、ヒストン修飾など）や発現調節要素の改変も対象となる。本明細書における「改変」とは、遺伝子の構造、発現、機能、または生物学的挙動に影響を及ぼす、あらゆる形態の変更を包括的に指すものであり、これには内因的な変更だけでなく、外的な導入または操作による変更も含まれる。
　本明細書において「疾患」は、再広義に解釈され、人間や動物の心や体に不調または不都合が生じた状態をいい、病気、障害、種々の症状等、具体的に定義されていない健康な状態とは言えない任意の状態を指す。本開示が対象としうる疾患には、免疫応答が関連し得る疾患、例えば、がん、自己免疫疾患、アレルギー、感染症などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
　本明細書において、ある成分または物質について、ある被験者が「免疫応答」を有するとは、当該成分または物質に対して、何らかの免疫反応が生じることをいう。その被験者または当該被験者由来の生体成分（例えば、細胞など）において、その成分または物質が、種々の免疫細胞の変化、または免疫に関連する物質（例えば、サイトカイン等）の増減をみることによって特定することができ、客観的な指標で判断することもでき、医師などの経験による主観的な判断を行うこともできる。
　本明細書において、ある成分または物質について、ある被験者が「免疫記憶を有する」かどうかは、その被験者または当該被験者由来の生体成分（例えば、細胞など）において、その成分または物質が、（ｉ）メモリーＣＤ４陽性Ｔ細胞に対し抗原依存的にサイトカイン産生を亢進させるかどうか、または増殖促進作用を有するかどうか、（ｉｉ）メモリー型制御性Ｔ細胞の表面抗原の発現を変動させるか、（ｉｉｉ）ＴｒｅｇとＴｈ１の比率を変化させるかどうか、（ｉｖ）Ｔ－ｂｅｔ陽性Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ－γ産生を誘導するかどうか、（ｖ）ＩＦＮ－γ産生能を変動させるか、（ｖｉ）ＩＬ－２産生能を変動させるかおよび（ｖｉｉ）ＴＮＦ－α産生能を変動させるか、（ｖｉｉｉ）血液中にある成分または物質に対して特異的な抗体を有しているかどうかを測定し、これらの少なくとも一つが陽性である結果を生じることを確認することで、評価することができる。
　本明細書において「感染症」は任意の感染症であり得、ウイルス感染症（一本鎖又は二本鎖のＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス等任意のウイルス形態を含む）、細菌感染症、原虫感染症、マイコプラズマ感染症など任意の感染症の種類が包含され、例えば、結核、コロナウイルス、マラリア、黄熱ウイルス、天然痘ウイルス、種痘、麻疹／風疹、ポリオ、流行性耳下腺炎（おたふく）／ＭＵＭＰＳ、ロタウイルス感染、水痘（みずぼうそう）、黄熱病、エボラ、西ナイル熱、ヒブ感染症、肺炎球菌感染症、百日せき、日本脳炎、髄膜炎菌感染症、サルモネラ感染症、病原性大腸菌、トキソプラズマ、ジカウイルス、ヘルペスウイルス１型、ＥＢＶ／エプスタイン－バーウイルス（ヘルペスウイルス４型）、ＣＭＶ／サイトメガロウイルス（ヘルペスウイルス５型）、インフルエンザ、ＭＡＲＳ、狂犬病およびジフテリアなどであり得る。
　本明細書において「免疫異常」とは、少なくとも部分的に免疫系の異常によって生じるまたは生じることが疑われる任意の疾患、障害または状態をさす。免疫に何らかの原因によって異常が起こり、感染症にかかりやすくなったりアレルギー反応を起こしたりする状態をいう。免疫異常には、アレルギー、自己免疫疾患等が挙げられるがそれらに限定されない。自己の抗原に対する場合は概して自己免疫疾患といい、外的な抗原に対してはアレルギーという。免疫応答が強い場合は、自己の抗原に対しては自己免疫疾患状態となり、非自己の抗原に対してはアレルギー状態となる一方で、免疫応答が弱い場合は、自己の抗原に対してはがん状態となり、非自己の抗原に対しては感染症となるということができる。
　本明細書において「自己免疫疾患」とは、免疫反応が特定の自己の抗原に対して過剰に起こることをいう。自己免疫疾患は、異物を認識し排除するための役割を持つ免疫系が、自分自身の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応し攻撃を加えてしまうことで症状を起こす、免疫寛容の破綻による疾患といえる。自己免疫疾患または障害の例は、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：乾癬および皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患などの炎症性反応；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患に関連する反応（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群；ａｄｕｌｔ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｔｒｅｓｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；例えば湿疹および喘息ならびにＴ細胞の浸潤および慢性炎症反応を伴う他の状態などのアレルギー性状態；アテローム硬化；白血球接着不全症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｌｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ（ループス腎炎、皮膚ループスを含むがこれらに限定されない））；糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；ならびに典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症、および血管炎において見られるサイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫反応；悪性貧血（アジソン病）；白血球の漏出を伴う疾患；中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ：ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（クリオグロブリン血症またはクームス陽性貧血を含むがこれらに限定されない）；重症筋無力症；抗原‐抗体複合体介在性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート‐イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病；スティフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体性腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性ニューロパシー；免疫性血小板減少性紫斑病（ｉｍｍｕｎｅ　ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａ：ＩＴＰ）、自己免疫性ぶどう膜炎または自己免疫性血小板減少症。
　本明細書において「アレルギー」とは、免疫反応が特定の非自己の抗原に対して過剰に起こることをいい、「アレルゲン」に対して免疫反応が生じる疾患である。「アレルゲン」は、アレルギー疾患を有する被験者の抗体と反応し得る抗原をいい、樹木類の花粉に由来するアレルゲン（アカシア、ハンノキ、ビロードアオダイモ、セイヨウブナ、白樺、カエデ、山スギ、赤スギ、ハコヤナギ、ヒノキ、アメリカニレ、アキニレ、トガサワラ、ゴムの木、ユーカリの木、エノキ、ヒッコリー、アメリカシナノキ、サトウカエデ、メスキート、カジノキ、コナラ属、オリーブ、ペカン、コショウ、マツ、イボタツキ、ロシアオリーブ、アメリカスズカケ、ニワウルシ、クロクルミ、クロヤナギ等）、草木類の花粉に由来するアレルゲン（ワタ、ギョウギシバ、ナガハグサ、スズメノチャヒキ、トウモロコシ、ヒロハウシノケグサ、セイバンモロコシ、カラスムギ、カモガヤ、コヌカグサ、ホソムギ、コメ、ハルガヤ、オオアワガエリ、ヒユ、アカザ、オナモミ、ギシギシ、セイタカアワダチソウ、イソホウキ、シロザ、キンセンカ、イラクサ、アオビエ、ヘラオオバコ、オオブタクサ、ブタクサ、ブタクサモドキ、ノハラヒジキ、ヤマヨモギ、エニシダ、ヒメスイバ等）、虫由来のアレルゲン（カイコ、ダニ、ミツバチ、スズメバチ、アリ、ゴキブリ等）、菌由来のアレルゲン（アルテルナリア、アスペルギルス、ボツリヌス、カンジダ、セファロスポリウム、カーブラリア属、エピコッカム菌、表皮菌、フザリウム属、ヘルミントスポリウム属、連鎖クラドスポリウム、ケカビ、ペニシュリウム、ファーマ属、プルラリアプルランス、クモノスカビ等）、動物の体毛由来のアレルゲン（犬、猫、鳥等）、ハウスダスト由来のアレルゲンタンパク質、食物由来のアレルゲン（ＯＶＡ等）等が例として挙げられるが、これらに限定されない。「アレルギー」の代表的な疾患としては、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症等）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー又は蕁麻疹などが挙げられる。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
　一つの局面において、本開示は、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞などの免疫細胞、そのような細胞を含む細胞集団、ならびにそのような細胞または細胞集団を含む医薬組成物、およびその他関連技術を提供する。
　本開示の一つの局面において、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞が提供される。Ｔ細胞において、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／または増強したものにより、予想外に、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ－Ｔ細胞などに応用される際にがん、自己免疫疾患、アレルギー、感染症などの疾患に対する効果が顕著に奏功することが示された（図１６参照）。本開示の細胞は、グルコース取り込み能が強化されたものであることが有利である。また、本開示の細胞は、好ましくは、機能すべき場所、特に体内に導入されたのち、エフェクター機能を有するものであることが好ましい。そのような細胞としては、Ｔｅｆｆが挙げられるがそれに限定されず、Ｔｅｆｆの前駆細胞、例えば、リンパ球系前駆細胞、Ｔｎｖ、Ｔｓｃｍ、Ｔｅｍｒａなどでもよい。
　一つの実施形態では、本開示はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞であり得る。別の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞を含む細胞集団であり得る。本開示は、従来技術では提供できていなかった「エフェクターＴ細胞」を提供するものである。この実施形態で言うエフェクターＴ細胞は、標的細胞に対して細胞傷害作用を及ぼす免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を意味する（本明細書の他の個所に記載される。）。本明細書の他の個所に記載されるように、エフェクター機能とは、ＴＣＲやＣＡＲを介したシグナルに起因する、細胞傷害活性、サイトカイン産生および分裂・増殖を具備するが、エフェクターＴ細胞として重要な機能の一つは標的細胞に対して細胞傷害作用を及ぼすことである。
　他方、従来エフェクターＴ細胞として標的細胞に対して細胞傷害作用を及ぼすことができることは提供されていない。示唆がされていないというより、むしろ、従来技術ではリチャレンジ等の実験により治癒を確認した例がなく、例えば、結節が残存している例もあり、治癒していないことが示される例も多い。ここで、がんの治療薬としては種々知られているが、従来ほとんどの治療薬は、腫瘍を減らすだけで、根絶することができなかった。本開示のように標的細胞に対して細胞傷害作用を及ぼす機能がないからである。従来技術では腫瘍の抑制効果はサイトカイン等の効果により観察されることがあり、ほとんどの抗がん剤はこのような間接的な効果に過ぎない。従来技術では、Ｉｎ　ｖｉｖｏのモデルで、本開示とは異なり、腫瘍が抑制されたとはいっても標的細胞に対して細胞傷害作用を及ぼすものではなく、むしろ、腫瘍が残存しており、標的細胞に対して細胞傷害作用を及ぼす機能がないと言えるものであり、本開示はこの点でこれらの従来技術とは異なる効果を発揮するというものである。
　詳細に説明すると、本開示の実施形態において、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞療法では固形がんに対しては、有効性を示すことができないでいたが、本開示はこの課題も解決するものである。ここで本発明者らは、固形がんにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞の機能不全が腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるグルコース欠乏に起因すること、およびその代謝補充がＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を有意に改善することを見出した。がん細胞によるグルコースの大量消費は、固形がんのＴＭＥにおけるグルコースレベルを低下させ、結果としてＣＡＲ－Ｔ細胞を障害する。本開示では特定の実施形態において、グルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ類をＣＡＲ－Ｔ細胞に発現させると、サイトカイン産生と殺傷活性が回復すること、またはエフェクター機能が改善されることを見出した。化学療法剤および放射線などを駆使した併用療法などでも根治できなかった各種固形がんに対する治療法を提供するものである。ある種の固形がんでは代謝的に過酷なＴＭＥを保有しており、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むエフェクターＴ細胞の機能を損ない、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＴＭＥに養子移入する。神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞がエネルギー源としてグルコースを必要とするような例では、本開示では特に有効である。さらに、ある種の侵攻性のがん細胞は、がん細胞の特徴的な代謝である好気的解糖（Ｗａｒｂｕｒｇ効果として知られる）のために、正常な細胞よりも多くのグルコースを消費しＴＭＥにおけるグルコースの枯渇につながる。一方、ナイーブＴ細胞は、エネルギー需要の増加を確保するため、活性化時にエネルギー産生を酸化的リン酸化や脂肪酸酸化から好気性解糖系に移行させる。したがって、活性化Ｔ細胞とがん細胞との間では、グルコースを介した激しい代謝競争がＴＭＥで起こっている。がん細胞は、ＴＭＥ内で十分なグルコースを取り込みながら生存し、継続的に増殖することができるが、活性化されたＴ細胞は、代謝競争の失敗によりその機能を損なう。ＧＬＵＴを外的に発現するあるいは内的な発現を強化したＣＡＲ－Ｔ細胞によるＧＬＵＴの同等以上の発現は、がん細胞との完全な競合を可能にし得る。
　詳細に説明すると、本開示の好ましい非限定的な実施形態として以下が観察される。すなわち、血液悪性腫瘍におけるキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞療法の臨床的成功があるにもかかわらず、膠芽腫（ＧＢＭ）を含む難治性固形腫瘍への応用はまだ成功しておらず、固形がんに対するＣＡＲ－Ｔ細胞の臨床試験は、これまで有効性を示すことができないでいたが、本開示はこの課題も解決するものである。ここで本発明者らは、ＧＢＭにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の機能不全が腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるグルコース欠乏に起因すること、その代謝補充がＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を有意に改善することを見出した。がん細胞によるグルコースの大量消費は、ＧＢＭのＴＭＥにおけるグルコースレベルを低下させ、結果としてＣＡＲ－Ｔ細胞を障害する。本開示では好ましい実施形態において、高親和性グルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ３をＣＡＲ－Ｔ細胞に安定発現させると、サイトカイン産生と殺傷活性が回復した。膠芽腫（ＧＢＭ）は壊滅的な悪性脳腫瘍であり、年間発生率は１０万人当たり３．１９人である。２００５年にテモゾロミドと放射線からなる併用療法が登場したことで、原発性ＧＢＭに対する腫瘍治療野療法（Ｎｏｖｏ　ＴＴＦ）が開発され、臨床現場におけるＧＢＭ患者の予後が改善された。しかし、ＧＢＭの５年全生存率は依然として２０％を下回っている。血液悪性腫瘍におけるキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法の臨床的成功を踏まえ、ＧＢＭに対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法のいくつかの前臨床試験および臨床試験が熱心に検討されている。臨床試験で治療された患者の中には、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）へのＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤や腫瘍量の減少など、有望な結果を示す者もいるが、ほとんどの患者はＣＡＲ－Ｔ細胞療法に反応しない。ＧＢＭは代謝的に過酷なＴＭＥを保有しており、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むエフェクターＴ細胞の機能を損ない、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＴＭＥに養子移入する。脳では、神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞がエネルギー源としてグルコースを必要とし、脳は全身のグルコース由来エネルギーの２５％を消費する。さらに、侵攻性のＧＢＭ細胞は、がん細胞の特徴的な代謝である好気的解糖（ワールブルグ効果として知られる）のために、正常な神経細胞よりも３倍多くのグルコースを消費する。これは、ＧＢＭのＴＭＥにおけるグルコースの枯渇につながる。一方、ナイーブＴ細胞は、エネルギー需要の増加を確保するため、活性化時にエネルギー産生を酸化的リン酸化や脂肪酸酸化から好気性解糖系に移行させる。したがって、活性化Ｔ細胞とがん細胞との間では、グルコースを介した激しい代謝競争がＧＢＭのＴＭＥで起こっている。好ましい実施形態において、ＳＬＣ２Ａ３によってコードされ、神経細胞やグリア細胞で生理的に発現するＧＬＵＴ３は、グルコースに対する親和性が、Ｔ細胞で発現する主要なグルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ１よりも５倍高い。その結果、ＧＬＵＴ３を発現するＧＢＭ細胞は、ＴＭＥ内で十分なグルコースを取り込みながら生存し、継続的に増殖することができるが、活性化されたＴ細胞は、代謝競争の失敗によりその機能を損なう。この好ましい実施形態では、ＧＢＭ細胞による高親和性ＧＬＵＴ３を介したかなりのグルコース取り込みを考えると、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＧＬＵＴ３の同等以上の発現は、ＧＢＭ細胞との完全な競合を可能にする可能性がある。本開示の一つの好ましい実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞でＧＬＵＴ３の発現を誘導するために、ＳＬＣ２Ａ３をＣＡＲに連結したコンストラクトを提供する。
　（細胞集団）
　本開示の一つの局面において、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞などの免疫細胞を含む細胞集団が提供される。この細胞集団に含まれるＴ細胞の少なくとも一部において、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／または増強したものにより、予想外に、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ－Ｔ細胞などに応用される際にがん、自己免疫疾患、アレルギー、感染症などの疾患に対する効果が顕著に奏功することが示された（図１６等参照）。本開示の細胞集団は、グルコース取り込み能が強化されたものであることが有利である。また、本開示の細胞集団は、好ましくは、機能すべき場所、特に体内に導入されたのち、エフェクター機能を有するものである細胞を含むことが好ましい。そのような細胞としては、Ｔｅｆｆが挙げられるがそれに限定されず、Ｔｅｆｆの前駆細胞、例えば、リンパ球系前駆細胞、Ｔｎｖ、Ｔｓｃｍ、Ｔｅｍｒａなどでもよい。
　本開示の一実施形態において、上記のようなＴ細胞を含む細胞集団を含む細胞集団であって、該細胞集団は、本開示の特徴（例えば、ＧＬＵＴの強化または発現、エフェクター機能、それらの両方、を有するＴ細胞が細胞集団中約１０％以上であることが有利である。一実施形態において、本開示の細胞集団は、本開示の特徴を有するＴ細胞の割合が、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上とすることができる。
　一つの実施形態では、本開示の細胞集団は、体内に導入されたときに、エフェクター機能を有する性質を有するＴ細胞を含む。
　一つの実施形態では、本開示の細胞集団は、前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と含み、好ましくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
　一つの実施形態では、本開示の細胞集団において、Ｔ細胞は、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したものである。
　一つの実施形態では、本開示の細胞集団において、Ｔ細胞はエフェクター機能を有する。
　一つの実施形態では、本開示の細前記細胞集団は、Ｔｅｆｆ、および／またはＴｅｆｆの前駆細胞を含む。好ましくは、前記細胞集団（またはＴｅｆｆの前駆細胞）は、リンパ球系前駆細胞、Ｔｎｖ、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍｒなどの少なくとも1種の細胞を含む。
　一つの実施形態では、本開示の細胞集団において、前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである。
　一つの実施形態では、本開示の細胞集団において、グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含み、好ましくは、ＧＬＵＴ３である。
　一つの実施形態では、本開示の細胞集団において、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。
　一つの実施形態では、本開示の細胞集団は、医薬または医薬組成物として提供される。その用途は、がんの予防または治療のため、がんの治癒のため、がんの転移予防または再発予防のためのものであり得る。特定の実施形態では、本開示の細胞集団は、再発しないようにがんを予防または治療するためのものであり得る。
　＜グルコーストランスポーター＞
　がん細胞は、自らの細胞増殖に有利になるよう代謝系をリプログラミングして、酸素の存在下でもＡＴＰの産生の効率の低い解糖系を積極的に利用し、グルコースの取り込みと乳酸産生を高めている（Ｗａｒｂｕｒｇ効果）。そのため、がん細胞が大量にグルコースを消費して枯渇させるため、グルコースをエネルギー源として必要とするＴｅｆｆ型の腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍に浸潤するとＴＣＲにシグナルを受けても、細胞のＣａ２＋濃度が低下し、飢餓・疲弊してしまう。
　したがって、本開示の一実施形態において、好気性解糖を促進し、グルコースが枯渇した腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫細胞の競合性および／または適合性を高めるために、グルコーストランスポーターを発現するように遺伝子工学的に操作されたＴ細胞および細胞集団が提供される。
　一実施形態において、グルコーストランスポーターとしては、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を挙げることができ、中でもグルコースに高親和性のグルコーストランスポーターは、ＧＬＵＴ３である。したがって、好ましい実施形態において、本開示の細胞および細胞集団において利用されるグルコーストランスポーターはＧＬＵＴ３である。
　ＧＬＵＴ３は、ネズミの脳で最初に同定され、当初は神経グルコーストランスポーターとして定義されていた。その後、ＧＬＵＴ３は、運動するために必要なエネルギーを確保するネズミの精子や、着床後の発達に重要な胚盤胞など、グルコースを必要とする他の細胞でも発現することが示された。さらに、ＧＬＵＴ３はリンパ球、単球、マクロファージ、血小板などの免疫細胞で発現しており、通常は細胞内小胞に貯蔵され、活性化すると細胞表面に移動して代謝のスイッチを維持する。さらに最近では、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＧＬＵＴ３が分化および活性化時に高発現するため、グルコースの取り込みにＧＬＵＴ１だけでなく、ＧＬＵＴ３にも依存していることが示唆されている。
　ＴｅｆｆにおいてＧＬＵＴ３などのグルコーストランスポーターを活性化させると、グルコースの取り込みにより、細胞傷害活性、サイトカイン産生能などエフェクター機能の強化を認める。
　本開示の一実施形態において、本開示のＴ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞は、エフェクター細胞を含み得る。
　本開示の一実施形態において、本開示のＴ細胞および細胞集団に含まれるT細胞は、ヒトＴ細胞であることが有利であり得る。
　＜キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）＞
　本開示の他の局面において、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞またはこのような細胞を含む細胞集団であって、該Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、該Ｔ細胞が、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強した、Ｔ細胞、または細胞集団が提供される。本開示のＴ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞が含むＣＡＲは、ＣＡＲとしての機能を発揮し得る限り、タンパク質として含んでいてもよく、あるいはＣＡＲを発現する核酸分子を含むこともできる。代表的な実施形態において、本開示のＣＡＲは、Ｔ細胞に発現されたものとすることができる。
　本明細書に開示されるＣＡＲは、抗原に結合することが可能な少なくとも１つの細胞外ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合性ドメイン（例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲの特徴として、ＭＨＣによらず、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、選択された標的に向かってＴ細胞の特異性および反応性を再指向させることが挙げられる。ＭＨＣによらない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞または細胞集団におけるＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与えることができ、腫瘍の免疫エスケープを回避することができる。
　ＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む、ＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部分を指す。
　＜Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）＞
　本開示の他の局面において、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞またはこのような細胞を含む細胞集団であって、該Ｔ細胞がＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を含み、該Ｔ細胞が、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強した、Ｔ細胞、または細胞集団が提供される。本開示のＴ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞が含むＴＣＲは、ＴＣＲとしての機能を発揮し得る限り、タンパク質として含んでいてもよく、あるいはＴＣＲを発現する核酸分子を含むこともできる。代表的な実施形態において、本開示のＴＣＲは、Ｔ細胞に発現されたものとすることができる。
　本明細書においてＴＣＲは、２つのＴＣＲポリペプチド鎖からなるヘテロダイマー受容体分子であり、通常のＴ細胞が発現するαβ型ＴＣＲと特殊な機能をもつγδ型ＴＣＲが存在する。αおよびβ鎖ＴＣＲ分子は複数のＣＤ３分子（ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖）と複合体を形成し、抗原認識後の細胞内シグナルを伝達し、様々な免疫応答を開始させる。ウイルス感染に伴い細胞内で増殖したウイルス抗原やがん細胞由来のがん抗原などの内因性抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原ペプチドとして提示される。また、外来微生物由来の抗原はエンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、プロセシングを受けたのちにＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。これらの抗原は、それぞれＣＤ８＋　Ｔ細胞あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞の発現するＴＣＲにより認識される。ＴＣＲ分子を介した刺激には、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０分子などの共刺激分子が重要であることも知られている。αβ型ＴＣＲについてみると、αおよびβの各々の遺伝子産物は、ユニークな組み合わせにより、特異性を発現させることができる。ＴＣＲは適宜改変することができ、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む。
　（細胞外ドメイン）
　一実施形態では、本明細書に開示されるＴ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞において使用されるＣＡＲは、抗原結合性ドメインまたはその部分を含む。抗原結合性ドメインまたはその部分は、標的細胞の表面のリガンドの型および数に応じて適宜選択することができ、例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、本開示のＣＡＲ中の抗原結合性ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例として、組織特異的マーカー、細胞腫特異的マーカー、ウイルス、細菌および寄生生物感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞と関連するものを挙げることができる。
　ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化モノクローナル抗体の可変重および軽領域を融合して得られる単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）で構成され得る。あるいは、（抗体からではなく、例えばＦａｂライブラリから得られた）Ｆａｂに由来するｓｃＦｖが使用されてもよい。ｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに、次いで細胞内シグナル伝達ドメインに融合させることができる。
　一実施形態において、本開示のＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、（１）ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉ、およびＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩなどを含むアロ抗原；（２）ＴＳＨＲ（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＤＳＧ３（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ　３）、およびＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ８などを含む細胞外自己抗原；（３）Ｇｌｉａｄｉｎ、およびＡｒａ　ｈ２などを含む外来抗原；（４）ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ６８、ＭＳＬＮ（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、およびＭａｄＣａｍ１（ｍｕｃｏｓａｌ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ａｄｄｒｅｓｓｉｎ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）などを含むターゲティング分子を含む抗原を標的化することができるが、本開示のＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分が標的化し得る抗原はこれらに限定されない。
　一実施形態において、標的化される所望の抗原に応じて、本開示のＣＡＲは、所望の抗原標的に対して特異的な抗原結合ドメインを含むように改変することができる。例えば、ＣＤ１９が標的抗原である場合、ＣＤ１９などのがん抗原に対する抗体が、ＣＡＲ中への抗原結合ドメインとして使用され得る。がん抗原の限定的ではない例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３３、ＢＣＭＡ、ＴＥＭ８、ＥｐＣＡＭ、ＲＯＲ１、葉酸レセプター、ＣＤ７０、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ　Ａ－１０、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＣＥＡ、チロシナーゼ、ミドキン・ＢＡＧＥ、ＣＡＳＰ－８、Ｐカテニン、ＣＡ－１２５、ＣＤＫ－１、ＥＳＯ－１、ｇｐ７５、ＭＡＲＴ－１、ＭＵＣ－１、ＭＵＭ－１、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ｒａｓ、ｔｒｐ－１、ＨＥＲ－２、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、ＡＩＭ－２、ＡＩＭ－３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｃ９ｏｒｆｌ　ｌ２、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ２、ＳＡＲＴ３、ＢＲＡＰ、ＲＴＮ４、ＧＬＥＡ２、ＴＮＫＳ２、ＫＩＡＡ０３７６、ＩＮＧ４、ＨＳＰＨ１、Ｃ１３ｏｒｆ２４、ＲＢＰＳＵＨ、Ｃ６ｏｒｆｌ５３、ＮＫＴＲ、ＮＳＥＰ１、Ｕ２ＡＦ１Ｌ、ＣＹＮＬ２、ＴＰＲ　ＧＯＬＧＡ、ＢＭＩ１、ＣＯＸ－２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＺＨ２、ＬＩＣＡＭ、Ｌｉｖｉｎ、ＬｉｖｉｎＰ、ＭＲＰ－３、Ｎｅｓｔｉｎ、ＯＬＩＧ２、ＡＲＴ１、ＡＲＴ４、Ｂサイクリング、Ｇｒｉｌｌ、Ｃａｖ－１、カテプシンＢ、ＣＤ７４、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐｈＡ２／Ｅｃｋ、Ｆｒａ－１／Ｆｏｓｌ　１、ＧＡＧＥ－１、ガングリオシド／ＧＤ２、ＧｎＴ－Ｖ、ｐｌ、６－Ｎ、Ｋｉ６７、Ｋｕ７０／８０、ＰＲＯＸＩ、ＰＳＣＡ、ＳＯＸＩＯ、ＳＯＸ１１、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｐｈＣＧ、ＷＴ１、メソセリン、メランＡ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＣＯ－５８、ＭＮ（ｇｐ２５０）、テロメラーゼ、ＳＳＸ－２、ＰＲＡＭＥ、ＰＬＫ１、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ２、およびＴｉｅ－２などを挙げることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるエフェクターＴ細胞は、１つ以上の抗原を認識するために、１つ以上のＣＡＲを発現するように操作される。
　（膜貫通ドメイン）
　本明細書に開示されるＴ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞において使用されるＣＡＲは、細胞外ドメインに融合された１または複数の膜貫通ドメインを含むことができる。
　一実施形態では、細胞外ドメインに由来するリンカードメインが膜貫通ドメインに連結していてもよい。膜貫通ドメインは、天然または合成のものであってもよく、天然の膜貫通ドメインとしては、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９などに由来し得る。
　一実施形態において、本明細書に開示されるＴ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞において使用されるＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを配置することもできる。スペーサードメインは、好ましくは、抗原とのＣＡＲの結合を促進し、細胞中へのシグナル伝達を増強する配列を有することができる。
　（細胞内ドメイン）
　ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメイン（または細胞内シグナル伝達ドメイン）は、ＣＡＲが発現している免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、そして、ＣＡＲを発現する細胞に、特殊化された機能を実施するように指示する、タンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞エフェクター機能を惹起または遮断するシグナルを伝達するのに十分な所定のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全な、変異型の、または切断型の部分を含み得る。
　一実施形態において、ＣＡＲに用いられる細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体結合後のシグナル伝達を惹起する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質シグナル伝達配列が挙げられる。
　（拒絶反応に関連するアロ抗原、アレルゲンおよびハプテン）
　本明細書に開示されるＴ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞において使用されるＣＡＲは、拒絶反応に関連するアロ抗原、アレルゲンおよびハプテンに関連するものを挙げることができる。
　＜Ｔ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞の医薬用途＞
　本開示の一局面において、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞またはそのようなＴ細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物であって、該Ｔ細胞が、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強した、組成物が提供される。本開示の他の局面において、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞またはそのようなＴ細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物であって、該Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等を含み、該Ｔ細胞が、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強した、組成物が提供される。本開示の一実施形態において、本開示におけるＴ細胞または細胞集団に含まれるＴ細胞は、上述したＴ細胞の１または複数の特徴を備えることができる。
　本開示の細胞、細胞集団等は、免疫療法において使用可能である。免疫療法は、抗原性を有する病変が生じる疾患（例えば、がん、自己免疫疾患、アレルギー、感染症など）や、特定の抗原への異常な免疫応答が発症や病態の進展に関与する疾患に対して有効と考えられる。例えば、本開示の細胞等は、自己免疫疾患、アレルギー疾患、または移植の際の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、拒絶反応もしくは生着不全の処置、治療または予防に用いることができる。自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質症候群、多発性筋炎・皮膚筋炎、全身性硬化症、混合結合組織病、血管炎症候群、Ｉ型糖尿病、グレーブス病、橋本病、特発性アジソン病、自己免疫性肝炎、グッドパスチャー症候群、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、重症筋無力症、天疱瘡、白斑、特発性無精子症、などが挙げられるが、これらに限定されない。アレルギー疾患としては、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などが挙げられるが、これらに限定されない。その他、特定の抗原への異常な免疫応答が発症や病態の進展に関与する疾患に対して、本開示の細胞、細胞集団等による処置や予防を用いることが可能である。
　特定の実施形態では、本開示は、このような免疫療法を提供し、この免疫療法は、ＴＣＲ－Ｔ療法またはＣＡＲ－Ｔ療法を含む。本明細書において、「ＴＣＲ－Ｔ療法」とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を改変することを利用した細胞療法であって、例えば、がん治療に用いられるものを指す。本明細書において、「ＣＡＲ－Ｔ療法」とは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、腫瘍免疫回避機構を克服するための遺伝子操作を加えたもの）を患者Ｔ細胞に遺伝子導入し、そのＴ細胞を体外で増幅培養した後に患者に輸注するという遺伝子・細胞治療法をいう。
　本開示の細胞、細胞集団等は、適宜他のがん治療と組み合わせ得、併用療法として用いられ得る。代表的には、１または複数のさらなる薬剤と組み合わせて投与され得る。あるいは、併用療法は、放射線治療との組み合わせであってもよい。１または複数のさらなる薬剤は、任意の化学療法薬であってもよく、または、免疫チェックポイント阻害剤を含んでもよい。あるいは、併用療法において使用される他のがん治療としては、他のがん免疫療法（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）、温熱療法、外科的手順などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また一局面において、本開示のＴ細胞または細胞集団を含む治療薬であって、対象の疾患に関して診断を行い、該診断に基づいて前記Ｔ細胞または前記細胞集団に含まれる適切なＣＡＲまたはＴＣＲ等を選択する、治療薬が提供される。
　別の態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫細胞（例えばエフェクターＴ細胞などのＴ細胞）またはそのような細胞を含む細胞集団のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。免疫細胞がＣＡＲまたはＴＣＲ等のポリペプチドを発現する場合、医薬組成物は、治療抗体やＦｃ融合タンパク質などのＦｃ含有治療薬を更に含んでいてもよい。Ｆｃ含有治療薬は、腫瘍抗原、病原体抗原、または自己抗原に特異的な免疫細胞などの標的抗原に結合することができる。病原体抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原であってもよい。
　一実施形態において、Ｆｃ含有治療薬は、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、ウステキヌマブ、モガムリズマブ、及びベドリズマブ、を含むがこれらに限定されない治療抗体であってもよい。
　さらに、本開示は、（ｉ）本明細書に記載のいずれかのＴ細胞またはそのようなＴ細胞を含む細胞集団および薬学的に許容される担体を含む第１の医薬組成物、ならびに（ｉｉ）本明細書に記載のＦｃ含有治療薬及び薬学的に許容される担体、を含むキットを提供する。
　本開示の他の局面において、対象における標的抗原を発現する細胞を阻害する（例えば、このような細胞の数を減少させる、細胞増殖を阻害する、及び／または細胞の活性を抑制する）ための方法を提供し、本開示の細胞、細胞集団、および／または医薬組成物を、対象にそれを投与することを含む。一実施形態において、標的抗原を発現する細胞のうちの少なくとも一部は、低グルコース環境に置かれていてもよい。
　一実施形態において、本開示の方法によって治療される対象は、がん、例えば、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病を患うヒト患者であってもよい。例示的な標的となるがんとしては、Ｂ細胞由来の癌、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓癌、及び甲状腺癌などが挙げられるがこれらに限定されない。例示的なＢ細胞由来の癌は、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、及びＢ細胞性非ホジキンリンパ腫などを挙げることができる。
　癌または感染性障害などの標的疾患または障害を治療することに加えて、目的の医学的治療用の医薬品を製造するための、本開示のＴ細胞または細胞集団の使用もまた本開示の範囲内である。
　一実施形態において、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むエフェクターＴ細胞を含む医薬組成物は細胞治療に用いることができる。細胞治療において、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等を含むＴ細胞またはそのようなＴ細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として、または本開示のＣＡＲまたはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等を発現する治療的に有効な細胞集団の製剤として、それを必要としている対象に注入され得る。対象における注入されたＴ細胞またはそのようなＴ細胞を含む細胞集団は、その対象の癌または感染性障害などの標的疾患または障害を治療することができ得る。対象は、その細胞が取得された同じ対象であってもよいし（自家細胞治療）、またはその細胞が、同じ種の別の対象由来であってもよい（同種細胞治療）。
　一実施形態において、本開示のＣＡＲまたは（ＴＣＲ）等を含むＴ細胞またはまたはそのようなＴ細胞を含む細胞集団は、当業者に公知の技術を用いて、対象への投与のために製剤化され得る。一実施形態において、本開示のＣＡＲまたは（ＴＣＲ）等を含む治療的に有効なＴ細胞またはまたはそのようなＴ細胞を含む細胞集団を含む製剤は、薬学的に許容される賦形剤（担体または希釈剤）を含み得る。製剤に含まれる賦形剤は、例えば、本開示のＣＡＲの抗原結合ドメインの性質に依存して、異なる目的をもつ。一般的に用いられる賦形剤の例には、非限定的に、以下：食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、等張化剤、増量剤、ならびに潤滑剤が挙げられる。
　本明細書において、遺伝子名およびその産物を表記する際には、通常の用法とは異なり、すべて大文字で表記する場合には、遺伝子とタンパク質の両方を指すことがある。例えば、ＦＯＸＰ３遺伝子、ＦＯＸＰ３タンパク質と使い分けすることもあり、ＦｏｘＰ３と表記する場合には、当該遺伝子またはタンパク質の概念と実体の両方（全体）を指す。
　本開示のＣＡＲを含む治療的に有効なＴ細胞またはまたはそのようなＴ細胞を含む細胞集団を含む製剤は、当業者に公知の様式および技術を用いて、対象に投与され得る。例示的には、静脈内注射が挙げられるが、それに限定されない。他の様式には、非限定的に、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液区域）、頭蓋内、脊髄内、および髄腔内（髄液）などが挙げられる。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　本実施例では、グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞の各種機能を調べた。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
　（実施例１）
　方法および材料
　ＧＬＵＴ３　３Ｃ１０－ＣＡＲコンストラクトの作成とウイルスベクター作成
　ＣＤ８　ｌｅａｄｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８膜貫通部（ＴＭ）－ＣＤ２８　ｉｎｔｒａ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｏｍａｉｎ（ＩＣＤ）－４－１ＢＢ　ＩＣＤ－ＣＤ３ｚ－Ｐ２Ａ－Ｋａｔｕｓｈｋａ２Ｓ構造をもつ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲバックボーンプラスミド（３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｋａｔｕｓｈｋａ２Ｓ）へ、Ｐ２Ａ　ｓｅｑｕｅｎｃｅを直上に配したＳＬＣ２Ａ３配列（ＧＬＵＴ３）を挿入し、３Ｃ１０　ＣＡＲ－ＧＬＵＴ３－Ｋａｔｕｓｈｋａ２Ｓレンチウイルスベクターを構築した（図１）。レンチウイルスベクターを、パッケージングベクターであるｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２６０）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９）とともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、その上清よりレンチウイルスを得た。
　遺伝子導入
　健常者末梢血単核球をヘパリン加全血よりフィコール法にて分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ，ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）後、抗ＣＤ３／２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８，Ｖｅｒｉｔａｓ）にて刺激し、刺激後ｄａｙ１にＭＯＩ＝４にて、ＣＡＲ遺伝子導入を行った。ＩＬ－２　３０Ｕ／ｍｌの存在下に培養を行い、ｄａｙ８～１２に冷凍保存、もしくは直接各評価に供した。
　免疫染色
　１×１０６細胞数のＧＬＵＴ３　３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞を、４％　ＰＦＡで固定処理しメタノールで透過処理をおこなった。３％　ＢＳＡで１時間のブロッキングを行い、抗ＧＬＵＴ３抗体（ａｂ１５３１１）で２時間インキュベートした。０．０５％　ＰＢＳＴで洗浄し、抗ウサギＩｇ　Ｇ抗体（Ａｌｅｘａ　ｆｌｏｕｒ　４８８）と１時間インキュベートした。０．０５％　ＰＢＳＴで洗浄し、ＤＡＰＩで核染色を行いた。染色後の細胞をＣｙｔｏｓｐｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でスライドグラス上に接着させＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）封入し、Ｋｅｙｅｎｃｅ　ＸＺ－８００で観察をおこなった。
　フェノタイプ解析　（ＦＣＭ）
　ＦＣＭ解析に用いた抗体を表１に示す。
　細胞の洗浄は４％ＦＢＳ－ＰＢＳを用いた。死細胞染色と表面染色を行い、洗浄後、ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ　Ａ３を用いてデータを取得し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（ｖ８．０．１，ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアを用いて解析した。
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＣＡＲ－Ｔ細胞生存・機能解析（図１７）
　各ＣＡＲ－Ｔ細胞の長期生存・メモリー化、機能の維持を評価する。ＣＡＲ－Ｔ細胞と刺激因子（陰性コントロールとしてのメディウム、ＥＧＦＲｖＩＩＩ刺激ビーズ、Ｕ８７ｄ細胞株）を１：１にて刺激する。２４時間後刺激因子を磁器ビーズ、もしくは、ソーティングで除去し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を０ｍＭ、０．５ｍＭ、１０ｍＭに分け継続培養する。刺激前、刺激後ｄａｙ１、ｄａｙ３、ｄａｙ７において細胞数カウントともに、細胞生存・細胞死を評価するＡｎｎｅｘｉｎＶ／７ＡＡＤ、ＣＤ２７、ＣＣＲ４　ＣＤ４５ＲＡ等のメモリーフェノタイプ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３等の抑制因子（図１９）、その他（転写因子、活性化・セネッセンスマーカー）を解析した。また、各検体からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅなど詳細解析も行う。一連の解析後、ｄａｙ７細胞の一部を再度同じ群にて刺激し、繰り返し刺激後の細胞生存・機能解析を同様に行う。
　サイトカイン解析（ＦＣＭ）
　ＣＡＲＴ細胞　１×１０５細胞とＥＧＦＲｖＩＩＩ発現Ｕ８７細胞株（Ｕ８７Δ）５×１０５細胞を１ｍｌの培地で１２時間共培養を行った後、５μｇ／ｍｌ　Ｍｏｎｅｎｓｉｎ（ＢＤ　５５４７２４　ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）存在下で６時間培養し、ＣＡＲ　Ｔ細胞に刺激をおこなった。培地はグルコース不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ）に１０％透析済ＦＢＳ（Ｃｙｔｉｖａ）を添加し、グルコース溶液（Ｇｉｂｃｏ）でグルコース濃度が１０ｍＭと０．５ｍＭに調整したものを使用した。Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で固定処理を行い、細胞内サイトカインを表１に示す抗体で染色し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　Ｘ２０を用いてデータを取得し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（ｖ８．０．１，ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアを用いて解析した。
　細胞傷害活性解析
　９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２×１０５細胞の標的細胞（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現Ｕ８７Δ細胞）を播種し、ＣＡＲ－Ｔ細胞と、Ｅ：Ｔ比として３：１、１：１、０．３：１、および０．１：１にて共培養を行った。１６時間後、ＶｉｖｏＧｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で生細胞を発光させ、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定し、細胞傷害活性を算出した。
　代謝解析
　細胞の代謝能を、ＸＦｅ２４細胞フラックスアナライザー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦ解糖ストレスキット（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製品プロトコルに従い測定した。解析日の前日に、解析用２４ウェル平底プレートのポリＤリジン（０．１ｍｇ／ｍｌ）によるコーティングと、センサーカートリッジの水和をＣＯ２　ｆｒｅｅインキュベーター内で行った。解析日に、解析培地（Ｓｅａｈｏｒｓｅ　ＸＦ　ＲＰＭＩ培地、Ｌ－グルタミン　２ｍＭ）を用いて解析用の細胞を洗浄後、ポリＤリジンでコーティングした解析用プレートに２×１０５細胞数ずつ播種し、ＣＯ２　ｆｒｅｅ　３７℃で６０分間静置した。オリゴマイシンを最終濃度２０μＭ、ＦＣＣＰを最終濃度１０μＭとなるように、センサーカートリッジポートへグルコースを終濃度１０ｍＭまたは０．５ｍＭ、オリゴマイシンを最終濃度１μＭ、２－ＤＧを終濃度５０ｍＭ充填した後、フラックスアナライザーにて解析を行い、ＯＣＲ・ＥＣＡＲから代謝機能を評価した。
　グルコース取り込み能力評価
　２×１０４細胞のＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、グルコース不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ）２００μｌで５時間培養をおこなった。解析の５分前に各ウェルに２－ＮＤＢＧ（ａｂｃａｍ）を１μｌ添加し、洗浄した後にＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　Ｘ２０を用いてデータを取得し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（ｖ８．０．１，ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアを用いて解析した。
　頭蓋腫瘍ゼノグラフトモデル
　ＮＳＧマウス頭蓋内（右大脳基底部）にルシフェラーゼ発現Ｕ８７Δ腫瘍細胞株（Ｕ８７Δ－ｌｕｃ）２．５×１０４を輸注し、生着後、Ｍｏｃｋ、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞２×１０６細胞を尾静脈から投与した。経時的に生体イメージングで腫瘍量をモニタリングし、生存を観察した。
　（方法）
　図１に代謝改変したＣＡＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ＿ＣＡＲ＿ＧＬＵＴ３）の構造を示す。膠芽腫（ＧＢＭ）に発現するＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするマウス由来抗体（クローン３Ｃ１０）由来の単鎖抗体（ａｓＦｖ）を構築、ＣＤ８　ｈｉｎｇｅ、ＣＤ２８膜貫通部分（ＣＤ２８ＴＭ）、ＣＤ２８細胞内ドメイン（ＣＤ２８ＩＣＤ）、４－１ＢＢ　ＩＣＤ、ＣＤ３ｚと結合しＣＡＲを構築した。ＣＡＲ下にＰ２Ａ配列を介し高親和性グルコース輸送体（ＧＬＵＴ３）をコードした。
　（結果）
　結果を図２以下に示す。図２に示すように、Ｔ細胞表面ＧＬＵＴ３発現とグルコース取り込みの強化が示される。通常型ＣＡＲ（３Ｃ１０　ＣＡＲ）と代謝改変ＣＡＲ（ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ）を健常ドナー由来Ｔ細胞に遺伝子導入しＣＡＲＴ細胞を得た。蛍光顕微鏡にて、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞膜への均質なＧＬＵＴ３発現を認めた。また、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞では、Ｔ細胞、通常型ＣＡＲ－Ｔ細胞（３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞）に比しグルコース取り込みが亢進していた。
　次に、通常ＣＡＲＴ細胞と同等のＴ細胞増幅効率を図３に示す。図３に示されるように、抗ＣＤ３／２８ビーズ刺激後ＣＡＲを遺伝子導入しＴ細胞増殖効率を解析した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、通常型ＣＡＲ－Ｔ細胞（３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞）と遜色ない樹立効率を有していた。
　次に、ＧＬＵＴ３発現によるＴ細胞解糖能の強化を図４に示す。示されるように、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞と３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝をＦｌａｘ　ａｎａｌｙｚｅｒにて解析した。低グルコース環境、通常グルコース環境いずれにおいてもＧＬＵＴ３　ＣＡＲは解糖能を強化していた。
　次に、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、低グルコース下の競合優位性をもつことが示された（図５）。図５に示されているように、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞とＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞を通常グルコース下、および、低グルコース下にて共培養した。通常グルコース下では両者同程度の生存を認めたが、低いグルコース下では、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の有意な生存を認め、有利にグルコースの取り込みが可能であることが示唆された。
　次に、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン産生能が強化されていることを図６に示す。図６に示されるように、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞を抗原刺激後、サイトカイン産生細胞割合をＦＣＭにて解析した。Ｔ細胞維持・活性化と抗腫瘍活性発揮に重要であるサイトカイン群（ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－ａ）の有意な発現上昇を認めた。
　次に、低グルコース下でも保たれるＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を図７に示す。示されるように、通常グルコース下、低グルコース下でのサイトカイン産生能を比較した。通常型ＣＡＲ－Ｔ細胞（３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞）においては、低グルコース下での極端な機能低下が認められた。一方、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞では、通常グルコース下で高いサイトカイン産生能を認め、また、低グルコース下においても、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞の通常グルコース下サイトカイン産生能と遜色ない機能を発揮した。
　次に、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の強化された細胞傷害活性を図８に示す。示されるように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株を標的とし細胞傷害活性を解析した。低グルコース下、高グルコース下にて細胞傷害活性を解析し、両環境下にてＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞は３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞に比し高い細胞傷害活性を示した。
　次に、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲのメモリーフェノタイムへ与える特性を図９に示す。示されるように、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞のメモリーフェノタイプを比較した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞において、エフェクターＴ細胞への分化傾向を認めた。
　次に、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の抑制分子発現の抑制を図１０に示す。非刺激下、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原陽性細胞刺激下の抑制分子の発現を比較した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞において、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３の発現抑制を認めた。
　次に、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞のｍＲＮＡ解析（代謝、疲弊、活性化、分化の評価）を図１１に示す。３Ｃ１０　ＣＡＲＴ、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の詳細をｍＲＮＡ発現にて解析した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞にて、ＦＣＭと同じく疲弊関連分子の低下、乳酸代謝、解糖関連因子の上昇を認めた。全体として、活性化、サイトカイン産生等Ｔ細胞エフェクター機能の高まりを示すデータである。
　次に、３Ｃ１０ＣＡＲのみでなく、ＣＤ１９　ＣＡＲに搭載しても同様の効果が得られること、すなわち、普遍性が証明されることを図１２に示す。ＧＬＵＴ３をＣＤ１９ＣＡＲに搭載。３Ｃ１０　ＣＡＲと同様の効果が得られることを確認した。また、膵臓がん細胞株にＣＤ１９を発現させ、膵臓がんに対しても効果があること示した。
　図１３に示すように、頭蓋内ゼノグラフトモデルですみやかな腫瘍根絶を実現することが示された。Ｕ８７Δ頭蓋内ゼノグラフトモデルにて抗腫瘍活性を観察した。ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞において、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞より速やかな腫瘍根絶を認めた。また、腫瘍ｃｈａｌｌｅｎｇｅにて拒絶を確認した。
　（実施例２：グルコーストランスポーターの発現増強）
　グルコーストランスポーターの発現増強を実現するため、恒常的にＧＬＵＴ３を発現するＣＡＲコンストラクトをデザインした（図１２のｓｔｂｌ－ＧＬＵＴ３＝ＧＬＵＴ３　ＣＡＲと同じ）。
　図１２のＣＡＲを導入した細胞を用いて、その機能、抗腫瘍効果について解析する。
　図１５に、同様のマウスモデルでＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を評価した結果を示す。Ｍｏｃｋ　Ｔ細胞、３Ｃ１０　ＣＡＲ－Ｔ細胞ではＣＲが得られなかった一方、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔで４頭のＣＲが得られた。
　図１６に、腫瘍チャレンジの結果を示す。すなわち、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞群でのマウス頓死の状況を示す。前図実験の治癒マウスに腫瘍（Ｕ８７ｄ）を再移植し拒絶能を評価（“メモリー化のサロゲート”）。
　図１７に、各種刺激後長期生存が増強されることを示す。各ＣＡＲ－Ｔ細胞を各条件にて経時観察する。その結果、低ｇｌｕｃｏｓｅ下において通常ＣＡＲ－Ｔ（３Ｃ１０）は有効なサイトカイン産生が示されない一方、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔは有効なサイトカイン産生能を発揮する。ただし、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔはグルコース過剰取り込みによる活性化により経時的に（ｄａｙ３やｄａｙ７）にＣＣＲ７陰性のＴｅｍやＴｅｍｒａへと分化（終末分化、ｓｔｅｍｎｅｓｓの消失）、アポトーシスに陥る。
　また、ＣＡＲ－Ｔ細胞（通常グルコースで樹立）が急激（ｄａｙ０）に０ｍＭや０．５ｍＭの低グルコース下に置かれた場合、活性化状態が高く、Ｇｌｕｃｏｓｅ依存性の高いＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔは容易にアポトーシスに陥りやすい。
　図１８に、刺激後長期生存が増強されることを示す。前述マウスと同様の系で上記抗腫瘍効果、生存、有害事象を検討する。実験１においては、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ、同等の抗腫瘍活性を示す。実験２においては、糖暴露によるＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ過活性化からアポトーシス、過分化がおこり抗腫瘍活性が消失する。Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅにおいては、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍を拒絶する。実験４においては、腫瘍効果に比例し、ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ－Ｔにおいて優位なＣＡＲ－Ｔ細胞生着と腫瘍Ｔ細胞浸潤が観察される。また、実験３は、低ｇｌｕｃｏｓｅ　高乳酸環境による免疫抑制が示唆されている肝腫瘍モデルでの実験で、実験２と同様の結果が得られることが期待される。
　図１９に、刺激後長期生存の増強を示すデータ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄａｔａ）を示す。左各タイムポイントにて、細胞死およびアポトーシスを反映する７－ＡＡＤ、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖの染色データを示す。各ＣＡＲ－Ｔ細胞における細胞死を、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ、７－ＡＡＤで検討した。非刺激状態において、グルコース濃度での差は認めたがＣＡＲ－Ｔ細胞で大きな差は認めなかった。
　（実施例３：ＣＡＲ－Ｔの実施例）
　以下、ＣＡＲ－Ｔでのさらなる実証例を示す。
　（材料と方法）
　（細胞株）
　Ｕ－８７　ＭＧおよびＵ－２５１　ＭＧ　ＧＢＭ細胞株は、それぞれＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）およびＪａｐａｎｅｓｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋから購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤ－ＭＥＭ（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）中で培養した。ＥＧＦＲｖＩＩＩパッケージ化レンチウイルスベクターをＵ－８７　ＭＧおよびＵ－２５１　ＭＧ細胞に誘導し、形質導入細胞株をそれぞれＵ－８７　ＭＧΔおよびＵ－２５１　ＭＧΔと命名した。ＳＵＰ－Ｔ１、ＮＡＬＭ６およびＡｓＰＣ－１細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（富士フイルム和光純薬株式会社）で培養した。ＮＡＬＭ６細胞にＣＤ１９切断型ベクターを導入し、ＣＤ１９発現ＡｓＰＣ１細胞株を得た。
　（フローサイトメトリーアッセイ）
　フローサイトメトリーアッセイは、以前に記載されたとおりに行った（４０．　Ｋｕｍａｇａｉ　Ｓ，　Ｔｏｇａｓｈｉ　Ｙ，　Ｋａｍａｄａ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ　（２０２０）　Ｔｈｅ　ＰＤ－１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂａｌａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｓ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ＰＤ－１　ｂｌｏｃｋａｄｅ　ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．　Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ；２１（１１）：１３４６－５８．；４１．　Ｋｕｍａｇａｉ　Ｓ，　Ｋｏｙａｍａ　Ｓ，　Ｉｔａｈａｓｈｉ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ　（２０２２）　Ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ＰＤ－１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈｌｙ　ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ　ｔｕｍｏｒ　ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ；４０（２）：２０１－１８．ｅ９．；４２．　Ｔａｄａ　Ｙ，　Ｔｏｇａｓｈｉ　Ｙ，　Ｋｏｔａｎｉ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ　（２０１８）　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＶＥＧＦＲ２　ｗｉｔｈ　Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ　ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｉｍｐａｃｔｓ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ／　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ＣＤ８＋　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ；６（１）：１０６．ｌおよび４３．　Ｔａｎｅｇａｓｈｉｍａ　Ｔ，　Ｔｏｇａｓｈｉ　Ｙ，　Ａｚｕｍａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ　（２０１９）　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ＰＤ－Ｌ２　ａｇａｉｎｓｔ　Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－Ｒｅｌａｔｅｄ　Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ；２５（１５）：４８０８－１９．）。簡単に説明すると、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、Ｆｃレセプターブロッキング溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、暗所４℃で１０分間Ｆｃブロッキングを行った。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、細胞表面分子を標的とする抗体を加え、暗所４℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。細胞内抗原染色では、細胞を固定／透過液（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中で室温で１時間インキュベートした後、製造元の指示に従って洗浄バッファー（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄した。細胞内抗原をターゲットとする抗体を加え、暗所４℃で２０分間インキュベートした後、２回洗浄した。アポトーシスアッセイのために、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回、Ａｎｎｅｘｉｎ結合バッファーで１回洗浄した。その後、細胞をアネキシンＶと７－ＡＡＤで室温で１５分間染色した。洗浄後、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　Ｘ－２０　サイトメーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析を行い、ＦｌｏｗＪｏ　ｖｅｒ．１０　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。染色液の調製はメーカーの説明書に従って行った。
　（サイトカイン染色）
　細胞内サイトカイン染色は、以前に記載されたとおりに行った（４０．　Ｋｕｍａｇａｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ　（２０２０）　ａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ；２１（１１）：１３４６－５８．；４１．　Ｋｕｍａｇａｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ　（２０２２）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ；４０（２）：２０１－１８．ｅ９．；４２．　Ｔａｄａ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ　（２０１８）　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ；６（１）：１０６．ｌおよび４３．　Ｔａｎｅｇａｓｈｉｍａ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ　（２０１９）　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ；２５（１５）：４８０８－１９．）。６時間のＴ細胞刺激の最後の５時間は、細胞内にサイトカインを保持するため、培地にモネンシンを添加した。細胞表面マーカーを染色した後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ試薬（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加え、暗所４℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄液で２回洗浄し、サイトカインを標的とする抗体を加えた。暗所、４℃で２０分間インキュベートした。洗浄後、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　Ｘ－２０　サイトメーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＦＣＭ解析を行い、ＦｌｏｗＪｏ　ｖｅｒ．１０　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。細胞染色に用いた抗体を表２にまとめた。染色用抗体の調製は、メーカーの説明書に従って行った。
　（殺傷アッセイ）
　合計１×１０５のルシフェラーゼ発現細胞（Ｕ－８７　ＭＧΔ、Ｕ－２５１　ＭＧΔ、ＡｓＰＣ－１、およびＮＡＬＭ６）を、低グルコース（０．５ｍＭ）または高グルコース（１０ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地（富士フイルム和光純薬株式会社製）２００μＬ中、平底９６ウェルホワイトプレートでＣＡＲ－Ｔ細胞と指示された比率で共培養した。培養２４時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに添加し、マルチプレートリーダーＣｙｔａｔｉｏｎ５（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で発光を測定した。％　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｙｓｉｓは以下の式で計算した：％　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｙｓｉｓ　＝［（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｌｙｓｉｓ－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｌｙｓｉｓ）／（ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｙｓｉｓ－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｌｙｓｉｓ）］×１００。
　（免疫蛍光染色）
　洗浄後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定し、－２０℃で１０分間クールメタノールで透過処理した。細胞を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで６０分間室温でブロッキングした。ブロッキング後、細胞を一次抗体と４℃で２時間、二次抗体と４℃で１時間インキュベートした。次にＤＡＰＩを加え、室温で５分間インキュベートした。洗浄後、染色した細胞をＣｙｔｏｓｐｉｎでスライドに固定し、ＢＺ－Ｘ７１０（ＫＥＹＥＮＣＥ、大阪、日本）で解析した。
　（免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色）
　ＩＨＣ染色は、ホルマリン固定パラフィン包埋標本の５μｍ厚切片に対して行った。抗原除去はクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて蒸し器で行い、続いて脱パラフィン、再水和を行った。スライドを一次抗体で１６時間、ＨＲＰ標識二次抗体で１時間インキュベートした後、ジアミノベンジジン基質で発色させた。一次染色には抗ＣＤ３ε抗体（クローン：ＳＰ７、カタログ番号：ａｂ１６６６９）（Ａｂｃａｍ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いた。染色したスライドをヘマトキシリンで対比染色した。
　ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色は標準プロトコールに従って行った。脱パラフィンし、水和したスライドをヘマトキシリン溶液に加え、４分間インキュベートした。洗浄後、スライドをエオシン溶液で２分間インキュベートした。染色したスライドをＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて４０倍および４００倍の倍率でスキャンした。２人の病理医が独立して染色スライドを評価した。
　（ＥＬＩＳＡ法）
　合計２．０×１０５　Ｕ－８７　ＭＧΔ細胞と２．０×１０５　ＣＡＲ－Ｔ細胞を２４ウェルプレートで共培養した。２４時間培養後、上清を回収し、サイトカイン濃度を測定するためにＥＬＩＳＡに供した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびＴＮＦαのＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、製造業者の説明書に従って使用した。マウス血清中のサイトカインは、製造業者の説明書に従って、高感度ＬＵＭＩＮＥＸアッセイにより分析した（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，　ＭＡ）。
　（ＣＡＲ－Ｔ細胞生産）
　末梢血は健常人から採取し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）はＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いた密度勾配遠心分離により単離した。Ｔ細胞は、ＭｏｊｏＳｏｒｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によるネガティブセレクションによってＰＢＭＣから分離した。単離したＴ細胞を抗ＣＤ３／２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でＴ細胞：ビーズ＝１：１で刺激した（０日目）。刺激２４時間後（１日目）、Ｔ細胞はＣＡＲレンチウイルスをＭＯＩ　３で導入し、３０Ｕ／ｍｌ　ＩＬ－２中で培養した。培地の半分は２４時間後に交換した。５日後、ＣＤ３／２８ビーズを除去した。培養中、４日目と１０日目に培地の半分を交換し、Ｔ細胞の濃度を０．７×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。開発されたＣＡＲ－Ｔ細胞は１０日目に採取され、その後の解析に供された。
　（動物モデル）
　雌のＮＳＧマウス（６週齢）をＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。痛みを伴う処置の前には、痛みを防ぐために麻酔薬を腹腔内に注射した。定位フレームを用い、腫瘍細胞を脳の表面からブレグマの右２ｍｍ、後３ｍｍ、深さ３ｍｍの位置に接種した。５ｍＬのＰＢＳに合計２．０×１０４個の細胞を１分間かけて注入した後、１ｍｍの針を抜き、さらに１分間放置してから針を抜いた。腫瘍植え付け４日後、腫瘍の成長を生物発光イメージング（ＢＬＩ）で確認し、各治療群への無作為割付けを行った。５日目に１．０×１０６　ＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈から注入した。ＣＡＲ－Ｔ細胞注入後の腫瘍増殖は、週２回ＢＬＩでモニターした。動物の飼育および実験は、国立がん研究センター動物実験倫理審査委員会の承認後、国立がん研究センター動物委員会のガイドラインに従って行われた。
　（グルコース濃度測定）
　　組織サンプル（５×５ｍｍ）を洗浄し、付着血液を除去した。サンプルをミンチにして４℃で１０分間遠心し、腫瘍の間質液を回収した。間質液のグルコース濃度は、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＧＯ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造元のプロトコールに従って測定した。
　（代謝分析）
　ＯＣＲ（単位：ｐｍｏｌ／分）およびＥＣＡＲ（単位：ｍｐＨ／分）は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ　ＸＦ－２４代謝細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって評価した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ビーズ（ＡＣＲＯ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、中国・北京）で２４時間刺激した　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞、Ｏｎ－ｄ　ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞）を、グルコースを含まない非緩衝ＲＰＭＩ－１６４０　培地（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、ポリ－Ｌ－リジン（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でコートしたＳｅａｈｏｒｓｅ　細胞プレート（１ウェルあたり２．０×１０５細胞）にプレーティングした。ＣＡＲ－Ｔ細胞による代謝経路の利用による摂動プロファイリングは、グルコース（１０ｍＭまたは０．５ｍＭ）、オリゴマイシン（１μＭ）、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（５０ｍＭ）（すべてＡｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）の添加によって達成された。Ｓｅａｈｏｒｓｅシステムを用いた実験は、以下のアッセイ条件で行った：３分間の混合、２分間の待機、３分間の測定。その後、代謝パラメータの値を算出した。
　（ＲＮＡ配列決定とその後の分析）
　ＢＤ　ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ　Ｓ６（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別したＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞、Ｏｎ－ｄ　ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞）を、低グルコース（０．５ｍＭ）または高グルコース（１０ｍＭ）条件下、３０Ｕ／ｍｌ　ＩＬ－２補充で、ＥＧＦＲｖＩＩＩビーズで１：１の割合で刺激した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は３日目と７日目に回収し、ＲＮＡは　ＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、ドイツ、ヒルデン）を用いて製造者の指示に従って抽出した。単離したＲＮＡから、ＮＥＢＮｅｘｔ　Ｕｌｔｒａ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、Ｎｏｖａｓｅｑ　Ｘ　ｐｌｕｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、両端から１５０ｂｐの次世代シーケンシング（ペアエンドリード）を行った。ＲＮＡ－ｓｅｑデータによる発現プロファイリングのために、ペアエンドリードはＳＴＡＲによってｈｇ３８ヒトゲノムアセンブリにアライメントされた（Ｄｏｂｉｎ　Ａ，Ｇｉｎｇｅｒａｓ　ＴＲ（２０１５）Ｍａｐｐｉｎｇ　ＲＮＡ－ｓｅｑ　Ｒｅａｄｓ　ｗｉｔｈ　ＳＴＡＲ．Ｃｕｒｒ　Ｐｒｏｔｏｃ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；５１：１１．４．１－．４．９）。ＲＮＡｓｅｑＣｈｅｆは、系統的なトランスクリプトーム解析、遺伝子発現解析、主成分解析、パスウェイ解析のためのウェブベースのプラットフォームである（Ｅｔｏｈ　Ｋ，Ｎａｋａｏ　Ｍ（２０２３）Ａ　ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＮＡｓｅｑＣｈｅｆ，ｕｎｃｏｖｅｒｓ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ／ｔｉｓｓｕｅ　ｔｙｐｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ；２９９（６）：１０４８１０．）。
　（統計分析）
　統計解析にはＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　９（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた。群間の関係はｔ検定または一元配置分散分析により比較した。生存率はＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で解析し、ｌｏｇ－ｒａｎｋ検定で統計学的に比較した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
　（結果）
　（ＧＢＭはＴＭＥ内のグルコース濃度が低く、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を損なう。）
　ＴＭＥ内の低グルコースレベルが固形がんにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞治療の潜在的な障壁であることを示すエビデンスが蓄積されているが、ＴＭＥ内の実際のグルコース濃度や低グルコース状態がＣＡＲ－Ｔ細胞の機能にどのような影響を与えるかは、まだ明らかにされていない［Ｐｅｎｇ　ＪＪ，Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｌｉ　Ｚ，ｅｔ　ａｌ（２０２３）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＣＡＲ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉ　Ｉｍｍｕｎｏｌ；８（８２）：ｅａｂｑ３０１６］．我々は、手術検体および血清の間質液中のグルコース濃度を調べた（図２０ａ）。ＧＢＭ検体の間質液中のグルコース濃度は、血清中のそれよりも約１０倍低い［０．５ｍＭ未満（平均０．２１７ｍＭ）］（図２０ｂ）。非小細胞肺がんや大腸がんなど、さまざまな種類のがんでは一般にグルコース濃度が低いが、ＧＢＭではＴＭＥ中のグルコース濃度が最も低い。このことは、ＴＭＥ中のグルコース濃度の低さがＧＢＭの特徴であることを示している（図２０ｃ）。
　次に、低グルコース環境がサイトカイン産生などのＣＡＲ－Ｔ細胞の機能にどのような影響を与えるかを検討した。ＧＢＭ関連抗原であるＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞）を、ＧＢＭのＴＭＥを再現した低グルコース条件下（０．５ｍＭ）で、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するヒトＧＢＭ細胞株（Ｕ－８７　ＭＧΔ）と共培養した。Ｕ－８７　ＭＧΔで刺激すると、サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）の産生は、短期間（１６時間）曝露した後でも、低グルコース環境下で有意に低下した（図２０ｄ、ｅ）。低グルコース条件下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的変化をさらに調べるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞を低グルコース（０．５ｍＭ）または高グルコース（１０ｍＭ）条件下で１６時間刺激し、遺伝子発現プロファイルを解析した。遺伝子発現プロファイルは、低グルコース条件への曝露によって有意に変化した（図２２ａ）。細胞周期、分化、サイトカイン産生に関連する遺伝子セットは有意に減少したが、グルコース飢餓に対する細胞応答や内在性アポトーシスに関連する遺伝子セットは低グルコース条件下で増加した（図２０ｆ、ｇ）。このように、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能は、ＧＢＭのＴＭＥのような低グルコース条件にさらされると、直ちに損なわれる。
　（ＧＬＵＴ３の過剰発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝適性を高める。）
　グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ）のＳＬＣ２ファミリーの中で、ＳＬＣ２Ａ３によってコードされるＧＬＵＴ３は、最も親和性が高く、グルコースに対する要求が高い神経細胞やグリア細胞で優位に発現するという特徴を持つ［Ｆｌａｖａｈａｎ　ＷＡ，　Ｗｕ　Ｑ，　Ｈｉｔｏｍｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ　（２０１３）　Ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ａｄａｐｔ　ｔｏ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｕｐｔａｋｅ．　Ｎａｔ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；１６（１０）：１３７３－８２．］。そこで我々は、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＧＬＵＴ３の発現が、ＧＢＭの低グルコースＴＭＥにおけるグルコース取り込みを促進することで、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を促進できるかどうかを検討した。ＳＬＣ２Ａ３を、自己切断型Ｐ２Ａ配列を介して従来の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲコンストラクトに融合させ、ＣＡＲとＧＬＵＴ３の同時安定発現を可能にした（ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ）（図２１ａ）。ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲを導入したＴ細胞（ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞）の膜（図２１ｂ）にはＧＬＵＴ３が発現しており、その発現量は親株の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞）の約２倍で、ＧＢＭ細胞株であるＵ－８７　ＭＧΔの発現量と同程度であったが、ＧＬＵＴ１の発現量には変化が認められなかった（図２１ｃおよび図２３ａ）。グルコースアナログである２－ＮＢＤＧを用いたグルコース取り込みアッセイで測定したグルコース取り込み量は、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞で、ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも大きかった（図２１ｄ）。従って、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞の解糖および解糖能は有意に改善された（図２１ｅおよび図２３ｂ）。代謝解析ではさらに、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞はｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも酸素消費速度（ＯＣＲ）ｈｉｇｈ、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）ｈｉｇｈ状態でよりエネルギッシュにシフトすることが確認された（図２１ｆ）。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識したＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞をｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞と１：１の割合で共培養したグルコース競合アッセイでは、従来のものに対するＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、低グルコースレベル（０．５ｍＭ）グルコースレベルでは増加したが、高グルコース（１０ｍＭ）条件下では同程度であったことから、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、特に低グルコース環境において、グルコース取り込みの点で実質的に競合的であることが示唆された（図２３ｃ，ｄ）。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞による安定したＧＬＵＴ３発現は、グルコース取り込みを促進し、グルコース取り込みの点でＣＡＲ－Ｔ細胞を競争的にし、限られたグルコース環境におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝適性を高める。
　ＧＬＵＴ３の発現によりＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝適性が向上することから、そのエフェクター機能と安全性プロファイルを検討することになった。そこで我々は、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能をｉｎ　ｖｉｔｒｏとｉｎ　ｖｉｖｏの両方のアッセイで調べた。コンボＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、低グルコースレベル（０．５ｍＭ）と高グルコースレベル（１０ｍＭ）の両方で、サイトカイン産生（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦα）を有意に増加させた（図２１ｇ、ｈおよび図２４ａ）。サイトカイン産生は、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットとＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの両方で増強された（図２４ｂ、ｃ）。ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞はまた、低グルコースおよび高グルコースの両条件下で、Ｕ－８７　ＭＧΔ細胞および別のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現ＧＢＭ細胞株であるＵ－２５１　ＭＧΔ細胞に対する細胞傷害性の増大を示した（図２１ｉ、図２４ｄ、ｅ）。抗原刺激後のＰＤ－１やＴｉｍ－３を含む排出関連分子の発現は、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞ではｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高かった（図２１ｊ、ｋおよび図２４ｆ、ｇ）。加えて、安定したＧＬＵＴ３発現によるエフェクター機能の増強は、異なる抗原であるＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＬＵＴ３　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞）でも同様に観察された。このことは、ＧＬＵＴ３発現による代謝適性の増強が、使用する一本鎖可変　フラグメント（ｓｃＦｖ）や標的とする抗原に関わらず、全てのＣＡＲで普遍的であることを示している（図２５ａ－ｃ）。したがって、安定したＧＬＵＴ３発現により、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、疲弊した表現型は存在するものの、低グルコースレベルのＴＭＥで活性化することができる。
　（考察）
　ＴＭＥにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝適性を高めることによって抗腫瘍効果を増強することは、難治性固形がんに対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の臨床応用を加速するための新たな概念である。ＧＢＭに対するＣＡＲ－Ｔ細胞の臨床試験の中には、臨床的有用性を示せなかったものもあるが、これらの臨床試験の免疫学的モニタリングにより、ＴＭＥにおいて豊富なＣＡＲ－Ｔ細胞が検出されることが明らかになった。［Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ　ＤＭ，　Ｎａｓｒａｌｌａｈ　ＭＰ，　Ｄｅｓａｉ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ　（２０１７）　Ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙ　ｉｎｆｕｓｅｄ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ＣＡＲ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｌｏｓｓ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．　Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ；９（３９９）．；Ｂａｇｌｅｙ　ＳＪ，　Ｌｏｇｕｎ　Ｍ，　Ｆｒａｉｅｔｔａ　ＪＡ，　ｅｔ　ａｌ　（２０２４）　Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ　ｂｉｖａｌｅｎｔ　ＣＡＲ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＥＧＦＲ　ａｎｄ　ＩＬ１３Ｒα２　ｉｎ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ：　ｐｈａｓｅ　１　ｔｒｉａｌ　ｉｎｔｅｒｉｍ　ｒｅｓｕｌｔｓ．　Ｎａｔ　Ｍｅｄ；３０（５）：１３２０－９．；Ｂｒｏｗｎ　ＣＥ，　Ｈｉｂｂａｒｄ　ＪＣ，　Ａｌｉｚａｄｅｈ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ　（２０２４）　Ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ＩＬ－１３Ｒα２－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＣＡＲ－Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ　ｇｌｉｏｍａ：　ａ　ｐｈａｓｅ　１　ｔｒｉａｌ．　Ｎａｔ　Ｍｅｄ；３０（４）：１００１－１２．］．ＴＭＥにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の存在を考慮すると、失敗の原因から抗原の消失や遊走障害が除外され、ＧＢＭのＴＭＥにおける特異的な条件がＣＡＲ－Ｔ細胞の機能不全の誘発に関与していることが想定できる。エフェクターＴ細胞は生存と活性化のために解糖を行うため、グルコースは不可欠な栄養素である［　Ｈｏ　ＰＣ，　Ｂｉｈｕｎｉａｋ　ＪＤ，　Ｍａｃｉｎｔｙｒｅ　ＡＮ，　ｅｔ　ａｌ　（２０１５）　Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　Ｉｓ　ａ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ　ｏｆ　Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．　Ｃｅｌｌ；１６２（６）：１２１７－２８．］。したがって、著しい低グルコース環境がＧＢＭのＴＭＥで検出されることを考えると、ＧＢＭのＴＭＥにおける低グルコースレベルは、ＣＡＲ－Ｔ細胞にとって主要な代謝ストレスであるに違いない。実際、ｃｏｎｖ　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞は機能不全状態にある（サイトカイン産生が少なく、疲弊マーカーの発現が高い）。さらに、ＰＤ－１シグナルはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルを破壊し、解糖経路はさらに障害されるため、エフェクターＴ細胞は負の代謝サイクルに入る可能性がある［Ｃｈａｎｇ　ＣＨ，　Ｑｉｕ　Ｊ，　Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ　（２０１５）　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｔｕｍｏｒ　Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｉｓ　ａ　Ｄｒｉｖｅｒ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．　Ｃｅｌｌ；１６２（６）：１２２９－４１］。
　神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞、およびＧＢＭ、特にＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＧＢＭは、高親和性グルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ３を用いて高いグルコース要求量を満たしていることを考えると［Ｖａｎｎｕｃｃｉ　ＳＪ，　Ｍａｈｅｒ　Ｆ，　Ｓｉｍｐｓｏｎ　ＩＡ　（１９９７）　Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｂｒａｉｎ：　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｏ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｎｄ　ｇｌｉａ．　Ｇｌｉａ；２１（１）：２－２１．；Ｃｈｅｎ　Ｓ，　Ｙａｎｇ　Ｌ，　Ｌｉ　Ｚ，　ｅｔ　ａｌ　（２０２１）　ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ｐａｒｔｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｕｒｉｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ＳＯＸ９－ＧＬＵＴ３　ａｘｉｓ．　Ａｍ　Ｊ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｒｅｓ；１３（６）：６０５５－６５．；Ｓｃｈｍｉｄｔ　Ｓ，　Ｈｏｍｍｅｌ　Ａ，　Ｇａｗｌｉｋ　Ｖ，　ｅｔ　ａｌ　（２００９）　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ＧＬＵＴ３　ｆｏｒ　ｐｏｓｔ－ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｊ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ；２００（１）：２３－３３．］、ＣＡＲ－Ｔ細胞にＧＬＵＴ３を高発現させれば、栄養競合を圧倒できる可能性が高い。実際、本発明者らが開発したＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲコンストラクトは、ＧＬＵＴ３　ＥＧＦＲｖＩＩＩ　ＣＡＲ－Ｔ細胞においてグルコースの取り込みと、サイトカイン産生や細胞毒性などのエフェクター機能を増強したことが実証された。
　（実施例３：他のエフェクターＴ細胞の前駆細胞での例）
　同様の実験を他のＴ細胞で実施する。例えば、純化しない抹消Ｔ細胞には、Ｔｎｖ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、Ｔｅｍｒａなどが含まれており、いずれの分画にもＣＡＲ（例えば、恒常発現ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ）をすることができる。
　本実施例では、純化・濃縮された任意のＴ細胞メモリー分画に、ＣＡＲ（ＣＡＲ、恒常発現ＧＬＵＴ３　ＣＡＲ）を導入する。別の実験において、培養条件にて、任意のＴ細胞メモリー分画が濃縮されたＣＡＲ－Ｔ細胞を誘導する。
　実験手順：
・末梢血、骨髄、臍帯血等のＴ細胞源より、より長期の生存とステムネスの維持が期待できるＴｅｆｆの前駆細胞であるＴｎｖやＴｓｃｍ、Ｔｃｍまたは既に分化し主にエフェクター機能を発揮するＴｅｆｆやＴｅｍｒａ分画を、それぞれ、Ｔ細胞メモリー関連表面抗原発現パターンであるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ９５－、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ９５＋、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７、および、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－を基にＦＡＣＳソーティング、もしくは、磁気ビーズで純化・濃縮する。・各分画をＣＤ３／２８ビーズ等で刺激、レンチウイルスベクターを用いてＣＡＲを導入する。
・また、別の方法として、バルクＴ細胞に遺伝子導入した後、サイトカインの種類や添加量を調整し（ＩＬ－７やＩＬ－１５の使用やｐｌａｔｅｌｅｔ　ｌｙｓａｔｅの使用）にて、Ｔｅｆｆ分化の抑制とＴｎｖ、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍの優位な増殖を誘導し、前駆細胞優位なＣＡＲ－Ｔ細胞とする。
・Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価；これらの細胞がＵ８７ｄ腫瘍細胞株もしくはＥＧＦＲｖＩＩＩビーズと共培養され、１日後、３日後、７日後に、ＣＦＳＥ染色、および、細胞カウントによる分裂増殖、フローサイトメトリーによる活性化・疲弊状態を評価する。
・Ｉｎ　ｖｉｖｏ評価：これらの細胞が前述のＵ８７ｄ頭蓋内製薬マウスに投与、ＢＬＩによる抗腫瘍活性と生存にて抗腫瘍効果が評価される。
　結果：
・バルクＴ細胞に導入された場合や分化の進んだＴｅｆｆ、Ｔｅｍｒａに導入場合に比し、前駆細胞であるＴｎｖ　Ｔｓｃｍ　ＴｃｍなどＴｅｆｆの前駆細胞に導入された、もしくは、Ｔｎｖ　Ｔｓｃｍ　Ｔｃｍが優位に増幅されたＣＡＲ－Ｔ細胞では、分裂・増殖能が高く、長期の分裂が観察されると期待される。また、ＰＤ１　ＴＩＭ３　ＬＡＧ３発現が低く、疲弊に耐性であると期待される。
　（実施例４：ＴＣＲの例）
　同様の実験をＣＡＲに代えてＴＣＲを導入する例で実施する。例えば、Ｔｅｆｆ、Ｔｎｖ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、Ｔｅｍｒａなどの分画にもＴＣＲを導入することができる。
　本実施例では、純化・濃縮された任意のＴ細胞メモリー分画に、ＴＣＲ（恒常発現ＧＬＵＴ３ＴＣＲ）を導入する。別の実験において、培養条件にて、任意のＴ細胞メモリー分画が濃縮されたＴＣＲ－Ｔ細胞を誘導する。
　実施例１～３で示した各種ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏでの評価を行う。
　（実施例５：細菌感染症の予防、再感染予防、および治療）
　本実施例では、細菌感染症の予防、再感染予防、および／または治療を検証する。
　（方法）
　細菌感染症（例えば、細菌性結膜炎など）に対する予防においては、細菌感染症を有さない被験者に対し、細菌感染症の感染原因抗原で改変された本開示のＴ細胞を投与する。
　細菌感染症（例えば、細菌性結膜炎など）に対する再発予防および／または治療においては、細菌感染症を有していた、および／または細菌感染症を有している被験者に対し、本開示のＴ細胞を投与する。
　投与後に、本技術分野で慣用される技術によって、被験者における細菌感染症の予後観察を実施する。
　（実施例６：寄生虫感染症の予防、再感染予防、および治療）
　本実施例では、寄生虫感染症の予防、再感染予防、および／または治療を検証する。
　（方法）
　寄生虫感染症（例えば、アカントアメーバ角膜炎など）に対する予防においては、寄生虫感染症を有さない被験者に対し、寄生虫感染症の感染原因抗原で改変された本開示のＴ細胞を投与する。
　寄生虫感染症（例えば、アカントアメーバ角膜炎など）に対する再発予防および／または治療においては、寄生虫感染症を有していた、および／または寄生虫感染症を有している被験者に対し、本開示のＴ細胞を投与する。
　投与後に、本技術分野で慣用される技術によって、被験者における寄生虫感染症の予後観察を実施する。
　（実施例７：ウイルス感染症の感染予防、発症予防、再感染予防、および治療）
　本実施例では、ウイルス感染症の感染予防、発症予防、再感染予防、および／または治療の検証を行う。
　（方法）
　ウイルス感染症（例えば、結核、マラリア、黄熱ウイルス、天然痘ウイルス、種痘、麻疹／風疹、ポリオ、流行性耳下腺炎（おたふく）／ＭＵＭＰＳ、ロタウイルス感染、水痘（みずぼうそう）、黄熱病、エボラ、西ナイル熱、ヒブ感染症、肺炎球菌感染症、百日せき、日本脳炎、髄膜炎菌感染症、サルモネラ感染症、病原性大腸菌、トキソプラズマ、ジカウイルス、ヘルペスウイルス１型、ＥＢＶ／エプスタイン－バーウイルス（ヘルペスウイルス４型）、ＣＭＶ／サイトメガロウイルス（ヘルペスウイルス５型）、インフルエンザ（ウイルス）、ＭＡＲＳ、狂犬病、ジフテリア、等を含みうるがこれに限定されないなど）に対する予防においては、ウイルス感染症を有さない被験者に対し、ウイルス感染症の感染原因抗原で改変された本開示のＴ細胞を投与する。
　上記ウイルス感染症に対する再発予防および／または治療においては、ウイルス感染症を有していた、および／またはウイルス感染症を有している被験者に対し、本開示のＴ細胞を投与する。
　投与後に、本技術分野で慣用される技術によって、被験者におけるウイルス感染症の予後観察を実施する。
　（実施例８：アレルギーの予防、再発予防、および治療）
　本実施例では、アレルギーの予防、再発予防、および／または治療を検証する。
　（方法）
　アレルギー（例えば、アレルギー性結膜炎）に対する予防においては、アレルギーの原因因子抗原を有さない被験者に対し、アレルギー感染原因抗原で改変された本開示のＴ細胞を投与する。
　アレルギー（例えば、アレルギー性結膜炎）に対する再発予防および／または治療においては、アレルギーの原因因子抗原を有していた、および／またはアレルギーの原因因子抗原を有している被験者に対し、本開示のＴ細胞を投与する。
　投与後に、本技術分野で慣用される技術によって、被験者におけるアレルギーの予後観察を実施する。
　（実施例９：自己免疫疾患の予防、再発予防、および治療）
　本実施例では、自己免疫疾患の予防、再発予防、および／または治療を検証する。
　（方法）
　自己免疫疾患（例えば、自己免疫性ぶどう膜炎）に対する予防においては、アレルギーの原因因子抗原を有さない被験者に対し、自己免疫疾患感染原因抗原で改変された本開示のＴ細胞を投与する。
　自己免疫疾患（例えば、自己免疫性ぶどう膜炎）に対する再発予防および／または治療においては、自己免疫疾患の原因因子抗原を有していた、および／または自己免疫疾患の原因因子抗原を有している被験者に対し、本開示のＴ細胞を投与する。
　投与後に、本技術分野で慣用される技術によって、被験者における自己免疫疾患の予後観察を実施する。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は日本国特許庁に２０２４年１月９日に出願した特願２０２４－００１５３２に対して優先権を主張するものであり、その内容はその全体が本明細書において参考として援用される。
　本開示によれば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）などのグルコースが枯渇した環境においても、飢餓・疲弊せずに、がん細胞に対して競合性を有する細胞を提供することができ、そのため、細胞ベース免疫療法の効果を向上させるための戦略を開発することができ、医療分野において応用が期待される。

Claims (35)

  1. 　グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞。
  2. 　前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１に記載のＴ細胞。
  3. 　前記Ｔ細胞はエフェクター機能を有する、請求項１または２に記載のＴ細胞。
  4. 　前記Ｔ細胞はエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の前駆細胞である、請求項１または２に記載のＴ細胞。
  5. 　前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  6. 　前記グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  7. 　前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  8. 　ヒトＴ細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  9. 　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞であって、前記Ｔ細胞は、低グルコース条件（０．５ｍＭ）下で、通常グルコース条件（１０ｍＭ）下と少なくとも同等のエフェクター機能を示す、エフェクターＴ細胞。
  10. 　前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、請求項９に記載のＴ細胞。
  11. 　前記グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含む、請求項９または１０に記載のＴ細胞。
  12. 　ＧＬＵＴ３遺伝子が導入されたエフェクターＴ細胞。
  13. 　ヒトＴ細胞である、請求項９～１２のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  14. 　グルコース取り込み能が強化されたＴ細胞を含む細胞集団であって、前記Ｔ細胞は、体内に導入されたときに、エフェクター機能を有する性質を有する細胞を含む、細胞集団。
  15. 　前記Ｔ細胞は、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したものである、請求項１４に記載の細胞集団。
  16. 　前記Ｔ細胞はエフェクター機能を有する、請求項１４または１５に記載の細胞集団。
  17. 　前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の細胞集団。
  18. 　前記細胞集団は、Ｔｅｆｆを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の細胞集団。
  19. 　前記細胞集団は、Ｔｅｆｆの前駆細胞を含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の細胞集団。
  20. 　前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の細胞集団。
  21. 　前記グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の細胞集団。
  22. 　前記グルコーストランスポーターがＧＬＵＴ３である、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の細胞集団。
  23. 　前記Ｔ細胞はヒトＴ細胞である、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の細胞集団。
  24. 　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、グルコーストランスポーターを発現するように改変され、および／またはグルコーストランスポーターの発現が増強したエフェクターＴ細胞を含む細胞集団であって、前記Ｔ細胞は、低グルコース条件（０．５ｍＭ）下で、通常グルコース条件（１０ｍＭ）下と少なくとも同等のエフェクター機能を示す、細胞集団。
  25. 　前記ＣＡＲは前記Ｔ細胞に発現されたものである、請求項２４に記載の細胞集団。
  26. 　前記グルコーストランスポーターが、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４を含む、請求項２４または２５に記載の細胞集団。
  27. 　ＧＬＵＴ３遺伝子が導入されたエフェクターＴ細胞を含む細胞集団。
  28. 　前記Ｔ細胞はヒトＴ細胞である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の細胞集団。
  29. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のＴ細胞または請求項１４～２８のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
  30. 　がんを処置または予防するためのものである、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 　がんの治癒のためのものである、請求項２９または３０に記載の医薬組成物。
  32. 　前記がんの治癒は、腫瘍根絶により確認される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  33. 　がんに対して長期作用させるためのものである、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  34. 　がんの転移予防または再発予防のためのものである、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  35. 　がんの再発予防のためのものである、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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