WO2025075129A1 - コロナウイルススパイクタンパク質変異体 - Google Patents

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WO2025075129A1
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acid sequence
seq
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spike protein
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貴之 中川
莉奈 林田
公昭 佐藤
美帆 秋山
剛 大田
佑介 酒匂
舜 北畑
良太 二股
和男 山下
博弘 王
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Kotai Biotechnologies Inc
Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Kotai Biotechnologies Inc
Shionogi and Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • SARS-CoV-1 severe acute respiratory syndrome related coronavirus, sometimes written as "SARS-1"
  • SARS-CoV-2 is an RNA virus belonging to the Coronaviridae family of the Nidovirales, which causes severe acute respiratory syndrome (SARS). SARS first emerged in November 2002, causing SARS epidemics from 2002 to 2004.
  • SARS-CoV-2 is also an RNA virus belonging to the Coronaviridae family of the Nidovirales, which causes acute respiratory symptoms. Since its outbreak in 2019, SARS-CoV-2 infection (COVID-19) has spread to countries around the world, causing a global pandemic. The infection caused by SARS-CoV-2 has been named COVID-19.
  • Non-Patent Document 4 Variants (mutated strains) that evade coronavirus vaccines and immunity resulting from coronavirus infection have been reported since then (Non-Patent Document 4).
  • the objective of the present invention is to provide an antigen or the like that has immunogenicity against betacoronaviruses, including sarbecoviruses, and is suitable for use in vaccines to prevent coronavirus infections, including COVID-19.
  • the present invention relates to the following (1) to (25).
  • a receptor binding domain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1
  • an RBD consisting of an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and which has neutralizing antibody-inducing activity against SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 equivalent to that of an RBD consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; or (c) an RBD consisting of an amino acid sequence having 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:
  • (4) (a) an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; (b) an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; or (c) a spike protein mutant according to any of items (1) to (3) and (1-1) to (1-4), comprising an N-terminal domain (NTD) consisting of an amino acid sequence having 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • NTD N-terminal domain
  • SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence set forth in either SEQ ID NO: 8 or 9.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence set forth in either SEQ ID NO: 8 or 9.
  • an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence of a corresponding region of a spike protein NTD derived from a beta coronavirus (preferably derived from a sarbecovirus); or
  • 7-1) A spike protein mutant according to any one of items (1) to (6), (1-1) to (1-4), and (5-1) to (5-4), comprising a region consisting of SD1, SD2, and S2 subunits consisting of the amino acid sequence of positions 528 to 1209 of the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77 to 81, 83, 85, 86, 88, 90, 91, 95, 98, 99, 101, 105, and 111 to 122.
  • the spike protein variant according to item (8) having amino acid substitutions corresponding to the Q434C substitution and the S472C substitution in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16.
  • (17-1) The spike protein mutant according to item (17), wherein the trimerization domain is a Foldon sequence.
  • (19) A spike protein mutant according to any one of items (1) to (18), (1-1), (5-1), and (17-1), comprising an amino acid sequence from position 14 to the C-terminus of an amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 21 to 27.
  • (19-6) (a) an amino acid sequence in which one or several (preferably 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence of positions 14 to 1209 of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 21 to 27; or (b) The spike protein mutant according to any one of items (1) to (19), (1-1), (5-1) to (5-4), (7-1), and (17-1), comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) to the amino acid sequence of positions 14 to 1209 of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 21 to 27.
  • a coronavirus spike protein mutant comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added at positions 14 to 1236 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:26, the amino acid sequence comprising the amino acid sequences at positions 14 to 324 and 528 to 1236 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:26.
  • (20-2) The spike protein mutant according to item (20) or (20-1), which has a neutralizing antibody-inducing activity against SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 equivalent to that of a spike protein mutant comprising an amino acid sequence from positions 14 to 1236 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
  • a coronavirus spike protein mutant comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added at positions 14 to 1236 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:26, and comprising the amino acid sequence of positions 325 to 527 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:26.
  • the spike protein mutant according to item (22) or (22-1) which has a neutralizing antibody-inducing activity against SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 equivalent to that of a spike protein mutant comprising an amino acid sequence from positions 14 to 1236 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
  • the coronavirus spike protein mutant of the present invention has the excellent effect of being a monovalent antigen that exhibits broad-spectrum immunogenicity.
  • FIG. 1 shows the results of the neutralizing activity test against each pseudovirus of the serum of mice immunized with each antigen carried out in Example 5.
  • “Pseudvirus” indicates the name (strain) of the pseudovirus
  • “Immunization” indicates the type of antigen used for immunization.
  • the vertical axis in the figure is the neutralizing antibody titer (NT50), the vertical bars indicate the geometric mean value for each group of the combination of each antigen and each pseudovirus, the error bars indicate the 95% confidence interval, and the small circles indicate the neutralizing antibody titer for each individual in each group (the same applies to Figures 2 to 24).
  • FIG. 2 shows the results of the neutralizing activity test against each pseudovirus of the mouse sera immunized with each antigen performed in Example 6.
  • FIG. 9 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 13.
  • FIG. 10 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 14.
  • FIG. 11 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 15.
  • FIG. 12 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 16.
  • FIG. 13 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 17.
  • FIG. 14 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 18.
  • FIG. 15 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 19.
  • FIG. 16 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 19.
  • FIG. 17 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 19.
  • FIG. 18 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 19.
  • FIG. 19 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 19.
  • FIG. 20 shows the results of a neutralizing activity test against each pseudovirus of mouse sera immunized with each antigen performed in Example 19.
  • immunologicality refers to the property of stimulating the immune system of a subject individual to induce an immune response, such as the production of antibodies against a target pathogen.
  • an “immunogenic composition” refers to a composition that, when administered to a subject individual, induces an immune response in that subject individual.
  • the spike protein mutant of the present invention comprises: (a) a receptor binding domain (RBD) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1; (b) an RBD consisting of an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and which has neutralizing antibody-inducing activity against SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 equivalent to that of an RBD consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; or (c) an RBD consisting of an amino acid sequence having 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and having
  • the inventors created various hybrid RBDs based on the RDB sequences of SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1, discovered the RBD sequence of SEQ ID NO:3, and further obtained the RBD sequences of SEQ ID NOs:2, 4, and 5 below as variations of this sequence.
  • RBD which is composed of an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and has neutralizing antibody-inducing activity against SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 equivalent to the RBD consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, includes an RBD consisting of the amino acid sequence of positions 325 to 527 in any of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 65, 68, 71, 74, 76, 82, 84, 87, 89, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 102-104, and 106-110.
  • RBD that exhibits a neutralizing antibody titer of 12.5% or more (preferably 25%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% or 100% or more) and that exhibits a neutralizing antibody titer of 12.5% or more (preferably 25%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% or 100% or more) of the neutralizing antibody titer of an RBD consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 against SARS-CoV-1 (Genbank ID: AY278741.1).
  • the neutralizing antibody-inducing activity of an RBD can be confirmed, for example, by preparing the RBD to be measured, forming it into nanoparticles, immunizing a mouse, and measuring the neutralizing antibody titer of the serum obtained according to the method described in Example 6.
  • the definition of "RBD having equivalent neutralizing antibody-inducing activity against SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1" for sequences other than SEQ ID NO: 1 is the same as above.
  • SEQ ID NO:3 is a sequence contained in H-00149 in Example 5, H-00428 in Example 6, H-00557 in Example 8, and H-00657 in Example 14, and has been shown to have neutralizing antibody-inducing activity against both SARS-CoV-2 (D614G) and SARS-CoV-1.
  • SEQ ID NO:2 is a sequence contained in the amino acid sequence (SEQ ID NO:62) encoded by H-00646, H-00669, H-00672, and H-00675 in Example 14, and mRNA-001 in Example 16, and has been shown to have neutralizing antibody-inducing activity against both SARS-CoV-2 (D614G) and SARS-CoV-1.
  • the spike protein mutant of the present invention comprises: (a) an RBD consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32; (b) an RBD consisting of an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, and which has neutralizing antibody-inducing activity against SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 equivalent to that of an RBD consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32; or (c) an RBD consisting of an amino acid sequence having 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, and having neutral
  • amino acid residues at positions 0, 171, 173, and 175 are not substituted (i.e., the amino acid residues at positions 44, 45, 56, 65, 74, 75, 78, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 170, 171, 173, and 175 are maintained), and the amino acid residues at other positions are substituted, deleted, inserted, or added, resulting in a mutant sequence of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 32 that has a sequence identity of 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 32.
  • amino acid residues at positions 44, 45, 56, 65, 74, 75, 78, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 118, 170, 171, 173, and 175 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:32 are considered to be important amino acid residues for having neutralizing activity against both SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 based on the experimental results in Examples 5 and 6, etc.
  • the spike protein variant of the present invention comprises: It may contain an amino acid sequence that has 90% or more (preferably, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) sequence identity to the amino acid sequence consisting of positions 14 to 1211 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (full length spike of the Delta strain).
  • the spike protein mutant of the present invention comprises: (a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7; (b) an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; or (c) an N-terminal domain (NTD) consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • NTD N-terminal domain
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO:7 above is the amino acid sequence described in either SEQ ID NO:8 or 9.
  • NTD sequence 1 is contained in H-00646, H-00657, H-00669, H-00672, H-00739, and H-00740, and NTD sequence 2 is contained in H-00675.
  • the spike protein mutant of the present invention comprises: (a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10; (b) an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, or (c) a region consisting of SD1, SD2, and S2 subunits consisting of an amino acid sequence having 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO:10 is a generalized sequence of SEQ ID NOs:11 to 15, which have been identified as suitable regions consisting of SD1, SD2 and S2 subunits contained in the spike virus mutant of the present invention, and the amino acid sequences thereof are as follows:
  • X at position 264 is K or P
  • X at position 434 is Q or C
  • X at position 455 is P or K
  • X at position 472 is S or C
  • X at position 543 is N or Q
  • X at position 567 is N or T
  • X at position 642 is N or L.
  • the region consisting of SD1, SD2 and S2 subunits includes a region consisting of SD1, SD2 and S2 subunits consisting of the amino acid sequence of positions 528 to 1209 of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 77 to 81, 83, 85, 86, 88, 90, 91, 95, 98, 99, 101, 105, and 111 to 122.
  • the spike protein mutant of the present invention comprises: (a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; (b) an amino acid sequence in which one to several (preferably 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2) amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; or (c) a region consisting of SD1, SD2, and S2 subunits consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; may also include
  • SEQ ID NO:16 corresponds to the amino acid sequence consisting of positions 529 to 1211 of the amino acid sequence of the full-length spike protein of the Delta strain (SEQ ID NO:6), and is the following amino acid sequence:
  • the spike protein mutant of the present invention may contain an amino acid substitution corresponding to the K455P substitution and/or the V456P substitution in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16.
  • “An amino acid substitution corresponding to the K455P substitution and/or the V456P substitution in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16” means that when the amino acid sequence of the spike protein mutant of the present invention and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 are aligned after introducing gaps as necessary to increase sequence identity, one or both of the amino acid residues in the spike protein mutant of the present invention corresponding to K at position 455 and V at position 456 in SEQ ID NO: 16 are substituted with P.
  • Examples of spike protein mutants having such amino acid substitutions include H-00646, H-00657, H-00669, H-00672, H-00675, H-00739 and H-00740 in Example 14 or Example 15.
  • the spike protein mutant of the present invention may contain an amino acid substitution corresponding to one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of F286P substitution, A361P substitution, A368P substitution and A411P substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the spike protein mutant of the present invention may contain an amino acid substitution corresponding to one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N543Q substitution, N567Q substitution, and N642L substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • amino acid substitution corresponding to one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N543Q substitution, N567Q substitution, and N643L substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 means that when the amino acid sequence of the spike protein mutant of the present invention and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 are aligned after introducing gaps as necessary to increase sequence identity, one or more of the amino acid residues in the spike protein mutant of the present invention corresponding to N at position 543, N at position 567, and N at position 642 in SEQ ID NO: 16 are substituted with Q, Q, or L, respectively.
  • An example of a spike protein mutant having the above-mentioned N543Q substitution and N567Q substitution is H-00511 in Example 11, and
  • the "transmembrane domain and cytoplasmic end" in the above means the lipid transmembrane domain located on the C-terminus of the spike protein (positions 1211 to 1273 in conventional spike proteins) and the sequence corresponding to the cytoplasmic end of that C-terminus.
  • the spike protein mutant of the present invention may have a foldon sequence added as a trimerization domain.
  • the foldon sequence is added to the C-terminus of the S2 subunit.
  • H-00646, H-00657, H-00669, H-00672, H-00675, H-00739 and H-00740 in Example 14 or Example 15 contain the foldon sequence GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 19).
  • spike protein mutants of the present invention include spike protein mutants that contain the amino acid sequence from position 14 to the C-terminus of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 21 to 27. Note that the amino acid sequence (HHHHHH) contained at the C-terminus is used for purifying the protein and is not an essential element for use as an antigen.
  • the immunogenic composition of the present invention can be used to prevent infections caused by SARS-CoV-2 and other coronaviruses (preferably betacoronaviruses, and more preferably sarbecoviruses).
  • SARS-CoV-2 and other coronaviruses preferably betacoronaviruses, and more preferably sarbecoviruses.
  • Preferred adjuvants include an adjuvant that is a mixture of Alum, an aluminum salt, and ODN2006, an oligodeoxynucleotide, or an adjuvant that is a mixture of Alum, an aluminum salt, and CpG1018, an oligodeoxynucleotide.
  • the present invention includes an expression vector comprising a nucleic acid encoding the spike protein mutant of the present invention.
  • Expression vectors include viral vectors (e.g., adenoviral vectors).
  • the formulation of the immunogenic composition can be selected as appropriate. It may be a liquid formulation, a powder formulation, or a freeze-dried formulation.
  • the administration route of the immunogenic composition of the present invention can be selected appropriately, and it can be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration include, but are not limited to, nasal administration, aspiration, intranasal administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, transdermal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, sublingual administration, intravenous administration, enteral administration, and transmucosal administration.
  • Expi293F cells were used as a production system for coronavirus spike protein mutants.
  • the expression vector encoding the spike protein mutant (a mammalian expression plasmid consisting of a cytomegalovirus immediate early enhancer-chicken ⁇ -actin hybrid (CAG) promoter, a woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE) sequence, and a rabbit ⁇ -globin polyadenylation signal sequence) plasmid was transfected into Expi293F cells using ExpiFectamine TM 293 Transfection Kit (Thermo Fisher Scientific).
  • CAG cytomegalovirus immediate early enhancer-chicken ⁇ -actin hybrid
  • WPRE woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element
  • rabbit ⁇ -globin polyadenylation signal sequence was transfected into Expi293F cells using ExpiFectamine TM 293 Transfection Kit (Thermo Fisher Scientific).
  • coronavirus spike protein mutants using baculovirus expression system (BEVS)
  • mice Spike proteins derived from Expi293F cells prepared by the method of Example 1 or 2 or from BEVS (Baculovirus Expression Vector System) prepared by the method of Example 3 were mixed with squalene-based emulsion adjuvant A-910823 (Reference 1) at a ratio of 1:1 to prepare a 20 ⁇ g/ml antigen solution, and 50 ⁇ l was administered intramuscularly to female BALB/c mice (5 mice per group) to give 1 ⁇ g/mouse.
  • the immunogen was administered in the same manner as described above 2 weeks after the first vaccination.
  • mRNA antigen described in Example 16 50 ⁇ l was administered intramuscularly to female BALB/c mice (five mice per group) at 0.3 ⁇ g/mouse or 3 ⁇ g/mouse without the addition of an adjuvant. The same immunogen was administered in the same manner as above three weeks after the first vaccination.
  • the graphs in Figures 1 to 24 show the neutralizing antibody titer for each individual, and the geometric mean value and 95% confidence interval for each group.
  • the method for producing the pseudovirus is described in Vaccine. 2022 Jul 29; 40(31): 4231-4241 (Reference 2).
  • the accession numbers of the spike proteins of each virus strain used in the pseudovirus are as shown in the table below.
  • Neutralizing antibody induction test of spike protein carrying RBD chimera In order to design an RBD sequence that can provide neutralizing activity to both SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2, hybrid sequences of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 (Delta strain) were designed. Spike protein mutants were created by inserting each of the designed hybrid sequences (designs 1 to 5) into the RBD of the spike protein (ectodomain, i.e., a deletion of the transmembrane domain and cytoplasmic end) of SARS-CoV-2 Delta strain, and neutralizing activity tests against SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 were performed.
  • spike proteins listed in the table below were prepared using Expi293F cells by the method described in Example 1. Note that positions 1 to 13 of each full-length amino acid sequence are signal sequences and are not included in the prepared antigens.
  • mice were immunized with the prepared spike protein by the method described in Example 4, and the neutralizing antibody titer in the serum was measured.
  • the administration groups are as follows: Groups 1 to 6.
  • Groups 5 and 6 are coronavirus spike protein mutants of the present invention, Groups 2 to 4 are reference examples, and Group 1 is a comparative example. (Group 1) H-00120, (Group 2) H-00145, (Group 3) H-00146, (Group 4) H-00147, (Group 5) H-00148, (Group 6) H-00149.
  • H-00148 group 5
  • H-00149 group 6
  • induced neutralizing antibodies against SARS-CoV-1 in addition to wild-type D614G ( Figure 1).
  • the antigen H-00149 in group 6 had high neutralizing antibody-inducing activity against each pseudovirus strain tested.
  • mice were immunized with the spike protein prepared above by the method described in Example 4, and the neutralizing antibody titer in the serum was measured.
  • the administration groups are as follows: Groups 1 to 3.
  • Groups 2 and 3 are reference examples for investigating the effect of NTD substitution on neutralizing antibody-inducing activity, and Group 1 is a comparative example.
  • H-00545 had increased neutralizing antibody titers against BA.5, while H-00632 had increased neutralizing antibody titers against SARS-CoV-1 ( Figure 3). This result indicates that the NTD of the spike protein contributes to neutralizing antibody-inducing activity.
  • mice were immunized with the prepared spike protein by the method described in Example 4, and the neutralizing antibody titer in the serum was measured.
  • the administration groups are as follows: Groups 1 to 5.
  • Groups 3 and 4 are coronavirus spike protein mutants of the present invention,
  • Group 2 is a reference example, and
  • Groups 1 and 5 are comparative examples.
  • H-00120 (Group 2) SARS-CoV-2 Delta strain spike protein NTD and S2 are replaced with the sequence of the BA.5 strain ectodomain (H-00445); (Group 3) H-00149 NTD and SD1/2-S2 replaced with the sequence of the BA.5 strain (H-00557); (Group 4) H-00148 NTD and SD1/2-S2 replaced with the sequence of the BA.5 strain (H-00556); (Group 5) Original strain S-full antigen prepared using BEVS.
  • position 1173 refers to the amino acid residue corresponding to position 1173 in the amino acid sequence of the conventional spike protein.
  • Mice were immunized with the prepared spike protein by the method described in Example 4, and the neutralizing antibody titer in the serum was measured.
  • the administration groups are as follows: Groups 1 and 2.
  • Group 2 is a reference example for investigating the effect of the N1173L mutation
  • Group 1 is a comparative example.
  • SARS-CoV-2 Delta strain spike ectodomain H-00120
  • Group 2 SARS-CoV-2 Delta strain spike ectodomain (H-00189) into which the N1173L mutation was introduced.
  • SARS-CoV-2 Delta strain spike ectodomain H-00120
  • SARS-CoV-2 Delta strain spike ectodomain H-00346
  • Q965C and S1003C mutations introduced
  • SARS-CoV-2 Delta strain spike ectodomain H-00399
  • H-00391 showed higher neutralizing antibody-inducing activity against BA.4/5 ( Figure 9).
  • the above results indicate that the neutralizing antibody-inducing activity can be improved by substituting the above amino acid residues in the spike protein.
  • Antigen neutralizing antibody induction test 2 designed by combining the above results Based on the findings from Examples 5 to 13, the spike protein mutants shown in the table below were designed, and antigen proteins were prepared according to Example 1. Note that positions 1 to 13 of each amino acid sequence are signal sequences and are not included in the prepared antigens.
  • mice were immunized with the spike protein prepared above or each antigen prepared by the method described in Example 3 by the method described in Example 4, and the neutralizing antibody titer in the serum was measured.
  • the administration groups are as follows: Groups 1 to 3.
  • Groups 2 and 3 are the coronavirus spike protein mutants of the present invention, and Group 1 is a comparative example.
  • SEQ ID NO: 64 Source strain S-full antigen
  • Group 2 Source strain S-full antigen
  • the residue obtained was dissolved in Nuclease-free water, and a part of the obtained solution (285 ⁇ L, 450 ⁇ g in terms of UV) was mixed with Nuclease-free water (254 ⁇ L), 10 mM GTP (90 ⁇ L New England Biolab catalog #M2080), 20 mM SAM (90 ⁇ L New England Biolab catalog #M2080), 10X Capping Buffer (90 ⁇ L New England Biolab catalog #M2080), Vaccinia Capping Enzyme (10 U/ ⁇ L, 45 ⁇ L New England Biolab catalog #M2080), and 10 mM ATP (100 ⁇ L, 45 ⁇ L New England Biolab catalog #M2080).
  • the nucleic acid-lipid particle dispersion was dialyzed (Slide-A-Lyzer TM Dialysis Cassette G2, MWCO: 10 kD, Spectra/Por) for 12-18 hours against about 300 times the amount of 4 mM phosphate buffered saline (pH 7.4) to remove ethanol, and a dispersion of purified mRNA-encapsulated nucleic acid-lipid particles was obtained, which was then subjected to the following neutralizing antibody induction experiment.
  • H-00672 antigen was used to compare A-910823 (Group 1 below), which was described in Example 4 and used in Examples 5 to 17 above for purposes other than mRNA, with the following two types of alternative adjuvants (Groups 2 and 3 below). Mice were immunized and serum neutralizing antibody titers were measured in the same manner as in Example 4, except for the type of adjuvant.
  • the administration groups were as follows: Groups 1 to 3.
  • Group 1 Squalene-based emulsion adjuvant A-910823, (Group 2) an adjuvant containing aluminum salt Alum and oligodeoxynucleotide ODN2006; (Group 3) An adjuvant containing aluminum salt Alum and oligodeoxynucleotide CpG1018. All of Groups 1 to 3 are immunogenic compositions containing the coronavirus spike protein mutant of the present invention.
  • each spike protein was prepared according to Example 1. Note that positions 1 to 13 of each amino acid sequence are signal sequences and are not included in the prepared antigen.
  • the spike protein mutant of the present invention or an immunogenic composition containing the spike protein mutant has the excellent effect of exhibiting broad-spectrum neutralizing antibody-inducing activity with a monovalent antigen.

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Abstract

コロナウイルス感染症のワクチン用の抗原に用いるためのコロナウイルススパイクタンパク質変異体を提供する。　（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、　（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は　（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、 を含むコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。

Description

コロナウイルススパイクタンパク質変異体
　本発明は、新規のコロナウイルスワクチンの抗原に適したコロナウイルススパイクタンパク質変異体（「本発明の（コロナウイルス）スパイクタンパク質変異体」とも称する。）又はそのスパイクタンパク質変異体を含有する免疫原性組成物（「本発明の免疫原性組成物」とも称する。）に関する。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（Ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、「ＳＡＲＳ－１」と表記することもある。）は、ニドウイルス目コロナウイルス科に属するＲＮＡウイルスであり、重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ；　ＳＡＲＳ）を引き起こす。ＳＡＲＳは、２００２年１１月に初めて発生し、２００２年から２００４年にかけてＳＡＲＳの流行を引き起こした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２も、ニドウイルス目コロナウイルス科に属するＲＮＡウイルスであり、急性の呼吸器症状等を引き起こす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）は、２０１９年に発生して以来、世界各国で感染が広がり、世界的なパンデミックを引き起こした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症はＣＯＶＩＤ－１９と命名されている。
　ＢＮＴ１６２ｂ２（ビオンテック及びファイザー）とｍＲＮＡ－１２７３（モデルナ）は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防のためのｍＲＮＡワクチンであり、ＣＯＶＩＤ－１９の予防において高い有効性が実証されている（非特許文献１及び２）。
　上記、当初のｍＲＮＡワクチンはいずれも起源株のスパイクタンパク質をコードするものであったが、高い免疫回避能を有するオミクロン株が出現し、オミクロン株に対応するためにオミクロン株のスパイクタンパク質を追加した二価のワクチンが開発された（非特許文献３）。
　コロナウイルスワクチン及びコロナウイルスの感染による免疫を回避するバリアント（変異株）がその後も報告されている（非特許文献４）。
　また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１やＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は動物起源の人獣共通感染症であると考えられており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の近縁のコロナウイルスがコウモリなどで分離されている（非特許文献５）。今後も新たなコロナウイルスによるパンデミックが起こることが懸念される。
　非特許文献６には、スパイクタンパク質のＲＢＤ、ＮＴＤ及びＳ２をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１やＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等の配列とする各種のキメラスパイクをコードするｍＲＮＡワクチンが広い交差性を有することが示されている。非特許文献７には、種々の懸念される変異株（ＶＯＣ；ｖａｒｉａｎｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｒｎ）に対して広範な交差反応性を持つワクチン抗原を指向して、オミクロン株（ＢＡ．１株）のスパイクタンパク質のＲＢＤのＮ端側にデルタ株のＲＢＤを挿入したスパイクタンパク質が開示されている。非特許文献８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対するユニバーサルワクチンに関する総説であり、当該文献中の図３において様々な設計のスパイクタンパク質が開示されている。非特許文献９は、広域性を狙って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２やＷＩＶ－１など計８種類のサルベコウイルスのＲＢＤを担持させたナノパーティクルが開示されている。しかし、各ＲＢＤの異なる配列のエピトープには抗体を誘導させず、保存された領域に対して抗体を誘導させるアプローチで、保存領域に対する抗体誘導による広域性を獲得しようとしている。非特許文献１０は、ＲＢＤのうち、ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ（ＲＢＭ）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＲＢＭ領域以外の部分をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＷＩＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの他の株の配列とした３種類の抗原を開示している。
　しかし、上記いずれの文献にも本発明にかかるコロナウイルススパイクタンパク質変異体は記載されていない。
Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．　２０２１　Ｎｏｖ　４；３８５（１９）：１７６１－１７７３． Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．　２０２１　Ｆｅｂ　４；３８４（５）：４０３－４１６． Ｌａｎｃｅｔ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ．　２０２３　Ａｕｇ　２；Ｓ１４７３－３０９９（２３）００３７３－０． Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２０２３　Ｍａｒ；２１（３）：１６２－１７７． Ｃｅｌｌ．　２０２１　Ａｕｇ　１９；１８４（１７）：４３８０－４３９１． Ｓｃｉｅｎｃｅ　．　２０２１　Ａｕｇ　２７；３７３（６５５８）：９９１－９９８． ＮＰＪ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ．　２０２２　Ｄｅｃ　１９；７（１）：１６７． Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．　２０２２　Ｄｅｃ　１３；３０：４６５－４７６． Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２０２２　Ａｕｇ　５；３７７（６６０６）：ｅａｂｑ０８３９． Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．　２０２２　Ｍａｒ　２２；３８（１２）：１１０５６１．
　本発明の課題は、サルベコウイルスを含むベータコロナウイルスに対する免疫原性を有し、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を含めたコロナウイルス感染症を予防するためワクチンに適した抗原等を提供することにある。
　本発明者らは、前記課題を解決するために検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下の（１）～（２５）に関する。
（１）（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、
　（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
　（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、
を含むコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（１－１）（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位以外のアミノ酸残基において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
　（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位以外のアミノ酸残基において置換、欠失、挿入若しくは付加を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ
を含む項目１記載のコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（１－２）（ａ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤ、
　（ｂ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
　（ｃ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、
を含むコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（１－３）（ｂ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位以外のアミノ酸残基において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
　（ｃ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位以外のアミノ酸残基において置換、欠失、挿入若しくは付加を有し、配列番号３２に記載のアミノ酸配列と９５％（好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、
を含む項目１－２に記載のコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（１－４）配列番号６５、６８、７１、７４、７６、８２、８４、８７、８９、９２、９３、９４、９６、９７、１００、１０２～１０４、１０６～１１０のいずれかに記載のアミノ酸配列の３２５位～５２７位のアミノ酸配列からなるＲＢＤを含む、コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列が、配列番号２～５のいずれかに記載のアミノ酸配列である、項目（１）又は（１－１）記載のスパイクタンパク質変異体。
（３）配列番号６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２１１位のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目（１）、（２）、（１－１）～（１－４）のいずれか記載のスパイクタンパク質変異体。
（４）（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列、
　（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｃ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなるＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む、項目（１）～（３）、（１－１）～（１－４）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（５）配列番号７に記載のアミノ酸配列が、配列番号８又は９のいずれかに記載のアミノ酸配列である、項目（４）記載のスパイクタンパク質変異体。
（５－１）（ａ）ベータコロナウイルス由来（好ましくはサルベコウイルス由来）のスパイクタンパク質ＮＴＤの相当する領域のアミノ酸配列、
　（ｂ）ベータコロナウイルス由来（好ましくはサルベコウイルス由来）のスパイクタンパク質ＮＴＤの相当する領域のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｃ）ベータコロナウイルス由来（好ましくはサルベコウイルス由来）のスパイクタンパク質ＮＴＤの相当する領域のアミノ酸配列と９０％（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなるＮＴＤを含む、項目（１）～（３）、（１－１）～（１－４）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（５－２）前記ベータコロナウイルスが、下記の表に記載のウイルスから選択されるサルベコウイルスである、項目（５－１）記載のスパイクタンパク質変異体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001


（５－３）前記ベータコロナウイルスが、ＭＥＲＳコロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ　Ｅａｓｔ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，　ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）である、項目（５－１）記載のスパイクタンパク質変異体。
（５－４）配列番号６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７７～８１、８３、８５、８６、８８、９０、９１、９５、９８、９９、１０１、１０５、１１１～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～３０１位のアミノ酸配列からなるＮＴＤを含む、項目（１）～（５）、（１－１）～（１－４）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（６）（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列、
　（ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｃ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域を含む、項目（１）～（５）、（１－１）～（１－４）、（５－１）～（５－４）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（７）配列番号１０に記載のアミノ酸配列が、配列番号１１～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列である、項目（６）記載のスパイクタンパク質変異体。
（７－１）配列番号６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７７～８１、８３、８５、８６、８８、９０、９１、９５、９８、９９、１０１、１０５、１１１～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の５２８位～１２０９位のアミノ酸配列からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域を含む、項目（１）～（６）、（１－１）～（１－４）、（５－１）～（５－４）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（８）（ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列、
　（ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列、又は
　（ｃ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域を含む、項目（１）～（７）、（１－１）～（１－４）、（５－１）～（５－４）、（７－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（９）配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＱ４３４Ｃ置換及びＳ４７２Ｃ置換に対応するアミノ酸置換を有する、項目（８）記載のスパイクタンパク質変異体。
（１０）配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＫ４５５Ｐ置換及び／又はＶ４５６Ｐ置換に対応するアミノ酸置換を有する、項目（８）又は（９）記載のスパイクタンパク質変異体。
（１１）配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＦ２８６Ｐ置換、Ａ３６１Ｐ置換、Ａ３６８Ｐ置換及びＡ４１１Ｐ置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を有する、項目（８）～（１０）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１２）配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＴ２０１Ｐ置換及び／又はＫ２６４Ｐ置換に対応するアミノ酸置換を有する、項目（８）～（１１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１３）配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１５１～１５４位のＲＲＡＲ（配列番号１７）に対応する１以上のアミノ酸残基がアミノ酸変異を有し、フリンプロテアーゼにより切断されない、項目（８）～（１２）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１４）配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１５１～１５４位のＲＲＡＲに対応するアミノ酸残基がＧＳＡＳ（配列番号１８）に置換されている、項目（１３）記載のスパイクタンパク質変異体。
（１５）配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＮ５４３Ｑ置換，Ｎ５６７Ｑ置換及びＮ６４２Ｌ置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を有する、項目（８）～（１４）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１６）膜貫通ドメイン及び細胞質側末端が欠失している、項目（１）～（１５）、（１－１）～（１－４）、（５－１）～（５－４）、（７－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１７）Ｃ末端に三量体化ドメインが付加されている、項目（１６）記載のスパイクタンパク質変異体。
（１７－１）前記の三量体化ドメインがフォルドン配列である、項目（１７）記載のスパイクタンパク質変異体。
（１８）Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されている、項目（１）～（１７）、（１－１）～（１－４）、（５－１）～（５－４）、（７－１）、（１７－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～Ｃ末端のアミノ酸配列を含む、項目（１）～（１８）、（１－１）、（５－１）、（１７－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９－１）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、項目（１）～（１９）、（１７－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９－２）（ａ）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｂ）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、項目（１）～（１９）、（１－１）、（５－１）～（５－４）、（７－１）、（１７－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９－３）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体と同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有する、項目（１９－２）記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９－４）配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、項目（１９－２）又は（１９－３）記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９－５）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２０９位のアミノ酸配列を含む、項目（１）～（１９）、（１－１）、（１－４）、（５－１）、（５－４）、（７－１）、（１７－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９－６）（ａ）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２０９位のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｂ）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２０９位のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、項目（１）～（１９）、（１－１）、（５－１）～（５－４）、（７－１）、（１７－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９－７）配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２０９位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体と同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有する、項目（１９－６）記載のスパイクタンパク質変異体。
（１９－８）配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２０９位のアミノ酸配列を含む、項目（１９－６）又は（１９－７）記載のスパイクタンパク質変異体。
（２０）配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列と９９％以上（好ましくは、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．９％以上又は９９．９％以上）の配列同一性を有し、配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～３２４位及び５２８位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（２０－１）配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であって、配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～３２４位及び５２８位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（２０－２）配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体と同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有する、項目（２０）又は（２０－１）記載のスパイクタンパク質変異体。
（２１）配列番号６５、６８、７１、７４、７６、８２、８４、８７、８９、９２、９３、９４、９６、９７、１００、１０２～１０４、１０６～１１０のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、項目（２０）又は（２０－１）に記載のスパイクタンパク質変異体。
（２２）配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列と９９％以上（好ましくは、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．９％以上又は９９．９％以上）の配列同一性を有し、配列番号２６に記載のアミノ酸配列の３２５位～５２７位のアミノ酸配列を含む、コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（２２－１）配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であって、配列番号２６に記載のアミノ酸配列の３２５位～５２７位のアミノ酸配列を含む、コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（２２－２）配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体と同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有する、項目（２２）又は（２２－１）記載のスパイクタンパク質変異体。
（２３）配列番号６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７７～８１、８３、８５、８６、８８、９０、９１、９５、９８、９９、１０１、１０５、１１１～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、項目（２２）又は（２２－１）に記載のスパイクタンパク質変異体。
（２３－１）下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるＲＢＤ、
（ａ）配列番号１～５に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６５、６８、７１、７４、７６、８２、８４、８７、８９、９２、９３、９４、９６、９７、１００、１０２～１０４、１０６～１１０のいずれかに記載のアミノ酸配列の３２５位～５２７位のアミノ酸配列、
下記（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列からなるＮＴＤ、及び
（ｃ）配列番号７～９に記載のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７７～８１、８３、８５、８６、８８、９０、９１、９５、９８、９９、１０１、１０５、１１１～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～３０１位のアミノ酸配列、
下記（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域、
（ｅ）配列番号７～９に記載のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７７～８１、８３、８５、８６、８８、９０、９１、９５、９８、９９、１０１、１０５、１１１～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の５２８位～１２０９位のアミノ酸配列、
を含むコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
（２４）項目（１）～（２３）、（１－１）～（１－４）、（５－１）～（５－４）、（７－１）、（１７－１）、（１９－１）～（１９－８）、（２０－１）、（２０－２）、（２２－１）、（２２－２）、（２３－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体を含有する、免疫原性組成物。
（２５）コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の抗原として、項目（１）～（２３）、（１－１）～（１－４）、（５－１）～（５－４）、（７－１）、（１７－１）、（１９－１）～（１９－８）、（２０－１）、（２０－２）、（２２－１）、（２２－２）、（２３－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体を一種類のみを含有し、それ以外のコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の抗原を含まない、項目（２４）記載の免疫原性組成物。
（２６）アジュバントを含有する、項目（２４）又は（２５）記載の免疫原性組成物。
（２７）前記アジュバントが、スクワレン、トコフェロール及びポリソルベート８０を含有するアジュバントである、項目（２６）記載の免疫原性組成物。
（２８）項目（１）～（２３）、（１－１）～（１－４）、（５－１）～（５－４）、（７－１）、（１７－１）、（１９－１）～（１９－８）、（２０－１）、（２０－２）、（２２－１）、（２２－２）、（２３－１）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体をコードする核酸。
（２９）項目（２８）に記載の核酸を含む発現ベクター。
（３０）項目（２４）～（２７）のいずれかに記載の免疫原性組成物、項目（２８）記載の核酸又は項目（２９）に記載の発現ベクターの有効量を個体に投与することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び／又はその他のコロナウイルス（好ましくは、ベータコロナウイルス、さらに好ましくはサルベコウイルス）による感染症を予防する方法。
（３１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び／又はその他のコロナウイルス（好ましくは、ベータコロナウイルス、さらに好ましくはサルベコウイルス）による感染症を予防するための、項目（２４）～（２７）のいずれかに記載の免疫原性組成物、項目（２８）記載の核酸又は項目（２９）に記載の発現ベクター。
（３２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び／又はその他のコロナウイルス（好ましくは、ベータコロナウイルス、さらに好ましくはサルベコウイルス）による感染症を予防する医薬品の製造のための、項目（２４）～（２７）のいずれかに記載の免疫原性組成物、項目（２８）記載の核酸又は項目（２９）に記載の発現ベクターの使用。
（３３）配列番号２１～２７及び配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２０９位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体。
（３４）配列番号２１～２７、配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含む項目（３３）記載のスパイクタンパク質変異体。
（３５）配列番号２１～２７及び配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～Ｃ末端のアミノ酸配列を含む項目（３４）記載のスパイクタンパク質変異体。
（３６）項目（３３）～（３５）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体を含有する、免疫原性組成物。
（３７）コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の抗原として、項目（３３）～（３５）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体を一種類のみを含有し、それ以外のコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の抗原を含まない、項目（３６）記載の免疫原性組成物。
（３８）アジュバントを含有する、項目（３６）又は（３７）記載の免疫原性組成物。
（３９）前記アジュバントが、スクワレン、トコフェロール及びポリソルベート８０を含有するアジュバントである、項目（３７）記載の免疫原性組成物。
（４０）項目（３３）～（３５）のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体をコードする核酸。
（４１）項目（４０）に記載の核酸を含む発現ベクター。
（４２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び／又はその他のコロナウイルス（好ましくは、ベータコロナウイルス、さらに好ましくはサルベコウイルス）による感染症を予防するための、項目（３６）～（３９）のいずれかに記載の免疫原性組成物、項目（４０）記載の核酸又は項目（４１）に記載の発現ベクター。
　本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体は、１価の抗原で広域な免疫原性を示すという優れた効果を奏するものである。
図１は、実施例５で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。図中のＰｓｅｕｄｖｉｒｕｓ（シュードウイルス）の表示はシュードウイルスのウイルス名（系統）を示しており、Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ（免疫）の表示は、免疫した抗原の種類を示している。図中の縦軸は中和抗体価（ＮＴ５０）であり、垂直バーは、各抗原及び各シュードウイルスの組合せの群毎の幾何平均値を示し、エラーバーは、９５％信頼区間を示し、小丸は、各群の個体ごとの中和抗体価を示している（図２～２４も同様である。）。 図２は、実施例６で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図３は、実施例７で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図４は、実施例８で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図５は、実施例９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図６は、実施例１０で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図７は、実施例１１で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図８は、実施例１２で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図９は、実施例１３で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１０は、実施例１４で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１１は、実施例１５で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１２は、実施例１６で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１３は、実施例１７で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１４は、実施例１８で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１５は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１６は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１７は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１８は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図１９は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図２０は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図２１は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図２２は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図２３は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。 図２４は、実施例１９で実施した各抗原で免疫したマウス血清の各シュードウイルスに対する中和活性試験の結果を示す。
　「からなる」という用語は、構成要件のみを有することを意味する。「含む」という用語は、構成要件に限定されず、記載されていない要素を排除しないことを意味する。
　以下、本発明について実施形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語及び科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　参照ポリペプチド配列に関する「配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成可能である。
　本明細書において、「従来株スパイクタンパク質」とは、ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿００９７２４３９０．１に記載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を意味する。
　本発明において、「免疫原性」とは、投与対象個体の免疫系を刺激して目的とする病原体に対する抗体の産生等の免疫反応を誘発する性質をいう。また、「免疫原性組成物」とは、投与対象個体に投与した場合に、その投与個体に免疫応答を引き起こす組成物をいう。
　本明細書において、「中和抗体誘導活性」とは、抗原タンパク質の中和抗体を誘導できる能力をいい、抗原タンパク質を被検動物に接種することで得られる免疫血清中の中和抗体価で評価できる。被検ウイルスの感染数を５０％減少させるのに必要な血清の希釈倍数、すなわち、中和抗体価（ＮＴ５０）により、その血清の中和活性の強さを評価できる。
　本明細書において、スパイクタンパク質変異体が「同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有する」とは、スパイクタンパク質変異体が、比較されるスパイクタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ系統（ＧＩＳＡＩＤ　ＩＤ：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿５２９１３５、以下、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）と表記することもある。）に対する中和抗体価の１２．５％以上（好ましくは、２５％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以上）の中和抗体価、及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＡＹ２７８７４１．１）に対する中和抗体価の１２．５％以上（好ましくは、２５％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以上）の中和抗体価の両方を有することを意味する。スパイクタンパク質変異体の中和抗体誘導活性は、例えば、実施例１に記載の方法に従い、測定対象のスパイクタンパク質変異体を作製し、実施例４に記載の方法でマウスに免疫して得られた血清の中和抗体価を測定することにより、確認することができる。
　本発明はコロナウイルススパイクタンパク質変異体に関するものである。「コロナウイルススパイクタンパク質変異体」とは、天然のコロナウイルスのスパイクタンパク質のアミノ酸配列に何らかのアミノ酸変異を有するものを意味し、単に「スパイクタンパク質変異体」と表記することもある。本明細書において、「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加、又はそれらの組み合わせをいう。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、
　（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、
　（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
　（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ
を含む。
　受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とは、細胞上の受容体との結合に寄与するコロナウイルススパイクタンパク質の領域を意味するが、本発明における「受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）」は、スパイクタンパク質中の領域を特定するために用語であり、細胞上の受容体との結合活性を有することは要しない。従来株スパイクタンパク質であれば、その３２９位～５３１位のアミノ酸配列が、ＲＢＤに相当する。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列には、配列番号２～５のいずれかに記載のアミノ酸配列が含まれる。
　本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に中和抗体誘導活性を有するＲＤＢ配列をデザインするために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＲＤＢ配列をもとに、種々のハイブリッドＲＢＤを作成し、配列番号３のＲＢＤ配列を見出し、さらにそのバリエーションとして下記配列番号２、４、５のＲＢＤ配列を得た。
　配列番号１は、後述する本発明のスパイクウイルス変異体に含まれるＲＢＤのアミノ酸配列（配列番号２～５）を一般化したアミノ酸配列（ＲＢＤコンセンサス配列）であり、そのアミノ酸配列は、それぞれ、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記配列番号１のアミノ酸配列における３位のＸはＱ又はＮ、１３２位のＸはＮ又はＫ、１４９位のＸはＳ又はＹ、１７３位のＸはＮ又はＹである。
　上記における配列番号１に記載のアミノ酸配列の例には、配列番号２～５のいずれかに記載のアミノ酸配列が含まれる。
　上記（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤには、配列番号６５、６８、７１、７４、７６、８２、８４、８７、８９、９２、９３、９４、９６、９７、１００、１０２～１０４、１０６～１１０のいずれかに記載のアミノ酸配列の３２５位～５２７位のアミノ酸配列からなるＲＢＤが含まれる。
　本発明における、「配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ系統（ＧＩＳＡＩＤ　ＩＤ：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿５２９１３５、以下、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）と表記することもある。）に対する中和抗体価の１２．５％以上（好ましくは、２５％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以上）の中和抗体価を示し、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＡＹ２７８７４１．１）に対する中和抗体価の、１２．５％以上（好ましくは、２５％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以上）の中和抗体価を示す、ＲＢＤを意味する。ＲＢＤの中和抗体誘導活性は、例えば、実施例６に記載の方法に従い、測定対象のＲＢＤを作製し、ナノパーティクル化し、マウスに免疫して得られた血清の中和抗体価を測定することにより、確認することができる。配列番号１以外についての「同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ」の定義も上記と同様である。
　配列番号３については、実施例５のＨ－００１４９、実施例６のＨ－００４２８、実施例８のＨ－００５５７、実施例１４のＨ－００６５７に含まれる配列であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に対して中和抗体誘導活性を有することがそれぞれ示されている。
　配列番号２については、実施例１４のＨ－００６４６、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００６７５、実施例１６のｍＲＮＡ－００１がコードするアミノ配列配列（配列番号６２）に含まれる配列であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に対して中和抗体誘導活性を有することがそれぞれ示されている。
　配列番号４については、実施例１５のＨ－００７３９、配列番号５については、実施例１５のＨ－００７４０に含まれる配列であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に対して中和抗体誘導活性を有することがそれぞれ示されている。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、別の態様として、
　（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位以外のアミノ酸残基において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
　（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位以外のアミノ酸残基において置換、欠失、挿入若しくは付加を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、
を含む。
　上記において、「配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位以外のアミノ酸残基において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位は置換等されず（すなわち、１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位のアミノ酸残基は維持されており）、それ以外の位置のアミノ酸残基において、１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されている、配列番号１に記載のアミノ酸配列の変異配列を意味する。
　上記において、「配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位以外のアミノ酸残基において置換、欠失、挿入若しくは付加を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位は置換等されず（すなわち、１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位のアミノ酸残基は維持されており）、それ以外の位置のアミノ酸残基において、置換、欠失、挿入若しくは付加がされた結果、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有する、配列番号１に記載のアミノ酸配列の変異配列を意味する。配列番号２～５についても上記と同様である。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列の１８位、２０位、２６位、２９位、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位及び７８位のアミノ酸残基は、実施例５及び実施例６等の実験結果により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に対して中和誘導活性を有するために重要なアミノ酸残基であると考えられる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、別の態様として、
　（ａ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤ、
　（ｂ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
　（ｃ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、
を含んでいてもよい。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、別の態様として、
（ｂ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位以外のアミノ酸残基において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
　（ｃ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位以外のアミノ酸残基において置換、欠失、挿入若しくは付加を有し、配列番号３２に記載のアミノ酸配列と９５％（好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、
を含んでいてもよい。
　上記において、「配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位以外のアミノ酸残基において１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位は置換等されず（すなわち、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位のアミノ酸残基は維持されており）、それ以外の位置のアミノ酸残基において、１～数個（好ましくは、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されている、配列番号３２に記載のアミノ酸配列の変異配列を意味する。
　上記において、「配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位以外のアミノ酸残基において置換、欠失、挿入若しくは付加を有し、配列番号３２に記載のアミノ酸配列と９５％（好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位は置換等されず（すなわち、４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位のアミノ酸残基は維持されており）、それ以外の位置のアミノ酸残基において、置換、欠失、挿入若しくは付加がされた結果、配列番号３２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有する、配列番号３２に記載のアミノ酸配列の変異配列を意味する。
　配列番号３２に記載のアミノ酸配列の４４位、４５位、５６位、６５位、７４位、７５位、７８位、１１０位、１１１位、１１３位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１７０位、１７１位、１７３位及び１７５位のアミノ酸残基は、実施例５及び実施例６等の実験結果により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に対して中和誘導活性を有するために重要なアミノ酸残基であると考えられる。
　配列番号３２については、実施例５のＨ－０００１４８、実施例６のＨ－０００８１、実施例８のＨ－００５５６に含まれる配列であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に対して中和抗体誘導活性を有することがそれぞれ示されている。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、さらなる態様として、
　配列番号６（デルタ株のスパイク全長）に示されるアミノ酸配列の１４位～１２１１位からなるアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
　配列番号６は、デルタ株のスパイクタンパク質全長のアミノ酸配列であり、その配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本願実施例に記載の抗原（例えば、Ｈ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００６７５、Ｈ－００７３９、Ｈ－００７４０）は、配列番号６の１４位～１２１１位のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、Ｈ－００６５７（配列番号２２）は配列番号６の１４位～１２１１位のアミノ酸配列と９６％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、
　（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列、
　（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｃ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなるＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含んでいてもよい。
　上記配列番号７に記載のアミノ酸配列の例として、配列番号８又は９のいずれかに記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　上記（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＮＴＤには、配列番号６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７７～８１、８３、８５、８６、８８、９０、９１、９５、９８、９９、１０１、１０５、１１１～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～３０１位のアミノ酸配列からなるＮＴＤが含まれる。
　Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）とは、コロナウイルススパイクタンパク質のＮ末側の領域を意味する。従来株スパイクタンパク質であれば、その１４位～３０５位のアミノ酸配列の領域が、ＮＴＤに相当する。
　配列番号８及び９は本発明のスパイクウイルス変異体に含まれるＮＴＤ配列に含まれ、配列番号７は配列番号８及び９を一般化したアミノ酸配列（ＮＴＤコンセンサス配列）であり、それぞれのアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記配列番号７のアミノ酸配列における１５０位のＸはＴ又はＬである。
　上記のＮＴＤ配列１は、Ｈ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００７３９、Ｈ－００７４０に含まれ、ＮＴＤ配列２は、Ｈ－００６７５に含まれる配列である。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、別の態様として、
　（ａ）ベータコロナウイルス由来（好ましくはサルベコウイルス由来）のスパイクタンパク質ＮＴＤの相当する領域のアミノ酸配列、
　（ｂ）ベータコロナウイルス由来（好ましくはサルベコウイルス由来）のスパイクタンパク質ＮＴＤの相当する領域のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｃ）ベータコロナウイルス由来（好ましくはサルベコウイルス由来）のスパイクタンパク質ＮＴＤの相当する領域のアミノ酸配列と９０％（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなるＮＴＤを含んでいてもよい。
　前記のベータコロナウイルスは、好ましくはサルベコウイルスである。好ましいサルベコウイルスとしては、以下のものを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　好ましいサルベコウイルス以外のベータウイルスの例には、ＭＥＲＳコロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ　Ｅａｓｔ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，　ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）が含まれる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、
　（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列、
　（ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　（ｃ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域を含んでいてもよい。
　上記配列番号１０に記載のアミノ酸配列の例としては、配列番号１１～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域とは、コロナウイルスのスパイクタンパク質における、サブドメイン１（ＳＤ１）、サブドメイン２（ＳＤ２）及びＳ２サブユニットまでの領域を意味する。従来株スパイクタンパク質であれば、その５３２位～１２１１位のアミノ酸配列の領域が、ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域に相当する。なお、本明細書においては、ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域は、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ）及び細胞質側末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｔａｉｌ）は含まない。ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域を「ＳＤ１／２－Ｓ２」と表記することもある。
　配列番号１０は、本発明のスパイクウイルス変異体に含まれるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域として好適なものとして同定した配列番号１１～１５を一般化した配列であり、そのアミノ酸配列は、それぞれ以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上記配列番号１０のアミノ酸配列における２６４位のＸはＫ又はＰ、４３４位のＸはＱ又はＣ、４５５位のＸはＰ又はＫ、４７２位のＸはＳ又はＣ、５４３位のＸはＮ又はＱ、５６７位のＸはＮ又はＴ、６４２位のＸ位はＮ又はＬである。
　ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域１（配列番号１１）は実施例１４におけるＨ－００６４６に含まれるアミノ酸配列であり、ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域２（配列番号１２）は、実施例１４におけるＨ－００６５７に含まれるアミノ酸配列であり、ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域３（配列番号１３）は、実施例１４におけるＨ－００６６９に含まれるアミノ酸配列であり、ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域４（配列番号１４）は、実施例１４又は１５におけるＨ－００６７２、Ｈ－００７３９及びＨ－００７４０に含まれるアミノ酸配列であり、ＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域５（配列番号１５）は、実施例１４におけるＨ－００６７５に含まれる配列である。これらの抗原は実施例１４及び１５に示すように広域な免疫原性を示す。
　上記（ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域には、配列番号６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７７～８１、８３、８５、８６、８８、９０、９１、９５、９８、９９、１０１、１０５、１１１～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の５２８位～１２０９位のアミノ酸配列からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域が含まれる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、別の態様として、
　（ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列、
　（ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列、又は
　（ｃ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域、
を含んでいてもよい。
　配列番号１６はデルタ株のスパイク質全長のアミノ酸配列（配列番号６）の５２９位～１２１１位からなるアミノ酸配列に相当し、以下のアミノ酸配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　上記「配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１～数個（好ましくは１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列」における、そのアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加の例として、以下が挙げられる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＱ４３４Ｃ置換及びＳ４７２Ｃ置換に対応するアミノ酸置換を含んでいてもよい。「配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＱ４３４Ｃ置換及びＳ４７２Ｃ置換に対応するアミノ酸置換」とは、以下のアミノ酸置換を意味する。すなわち、本発明のスパイクタンパク質変異体のアミノ酸配列と配列番号１６に記載のアミノ酸配列とを、配列同一性を高めるために必要に応じてギャップを導入した上で並べた場合、配列番号１６の４３４位のＱ及び４７２位のＳに対応する本発明のスパイクタンパク質変異体上の各アミノ酸残基が、いずれもＣに置換されることを意味する。当該アミノ酸置換を有するスパイクタンパク質変異体の例には、実施例１２のＨ－００３４６が含まれる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＫ４５５Ｐ置換及び／又はＶ４５６Ｐ置換に対応するアミノ酸置換を含んでいてもよい。「配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＫ４５５Ｐ置換及び／又はＶ４５６Ｐ置換に対応するアミノ酸置換」とは、本発明のスパイクタンパク質変異体のアミノ酸配列と配列番号１６に記載のアミノ酸配列とを、配列同一性を高めるために必要に応じてギャップを導入した上で並べた場合、配列番号１６の４５５位のＫ及び４５６位のＶに対応する本発明のスパイクタンパク質変異体上の各アミノ酸残基のいずれか一方又は両方がＰに置換されることを意味する。当該アミノ酸置換を有するスパイクタンパク質変異体の例には、実施例１４又は実施例１５のＨ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００６７５、Ｈ－００７３９及びＨ－００７４０が含まれる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＦ２８６Ｐ置換、Ａ３６１Ｐ置換、Ａ３６８Ｐ置換及びＡ４１１Ｐ置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含んでいてもよい。「配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＦ２８６Ｐ置換、Ａ３６１Ｐ置換、Ａ３６８Ｐ置換及びＡ４１１Ｐ置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換」とは、本発明のスパイクタンパク質変異体のアミノ酸配列と配列番号１６に記載のアミノ酸配列とを、配列同一性を高めるために必要に応じてギャップを導入した上で並べた場合、配列番号１６の２８６位のＦ、３６１位のＡ、３６８位のＡ及び４１１位のＡに対応する本発明のスパイクタンパク質変異体上の各アミノ酸残基の１以上がＰに置換されることを意味する。上記対応するアミノ酸残基のすべてがＰで置換されているスパイクタンパク質変異体が好ましい。当該アミノ酸置換を有するスパイクタンパク質変異体の例には、実施例１４又は実施例１５のＨ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２，Ｈ－００６７５、Ｈ－００７３９及びＨ－００７４０が含まれる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＴ２０１Ｐ置換及び／又はＫ２６４Ｐ置換に対応するアミノ酸置換を含んでいてもよい。「配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＴ２０１Ｐ置換及び／又はＫ２６４Ｐ置換に対応するアミノ酸置換」とは、本発明のスパイクタンパク質変異体のアミノ酸配列と配列番号１６に記載のアミノ酸配列とを、配列同一性を高めるために必要に応じてギャップを導入した上で並べた場合、配列番号１６の２０１位のＴ及び２６４位のＫに対応する本発明のスパイクタンパク質変異体上の各アミノ酸残基のいずれか一方又は両方がＰに置換されることを意味する。上記のＴ２０１Ｐ置換体の例として実施例１３のＨ－００３９１が挙げられ、Ｋ２６４Ｐ置換体の例として、実施例１２のＨ－００３９９が挙げられる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、配列番号１６のアミノ酸配列の１５１～１５４位のＲＲＡＲ（配列番号１７）に対応する１以上のアミノ酸残基がアミノ酸変異を有し、フリンプロテアーゼにより切断されないスパイクタンパク変異体であってもよい。「配列番号１６のアミノ酸配列の１５１～１５４位のＲＲＡＲ（配列番号１７）に対応する１以上のアミノ酸残基がアミノ酸変異を有する」とは、本発明のスパイクタンパク質変異体のアミノ酸配列と配列番号１６に記載のアミノ酸配列とを、配列同一性を高めるために必要に応じてギャップを導入した上で並べた場合、配列番号１６の１５１～１５４位のＲＲＡＲ（配列番号１７）に対応する本発明のスパイクタンパク質変異体上の各アミノ酸残基の全て又はいずれか１以上にアミノ酸変異（置換、欠失、挿入若しくは付加）が導入されていることを意味する。「フリンプロテアーゼにより切断されない」とは、上記のアミノ酸変異の導入により当該部位がフリンプロテアーゼにより切断されなくなることを意味する。
　上記のアミノ酸変異として、例えば、配列番号１６のアミノ酸配列の１５１～１５４位のＲＲＡＲ（配列番号１７）に対応するアミノ酸残基がＧＳＡＳ（配列番号１８）、ＱＱＡＱ（配列番号３９）等に置換されていてもよい。ＧＳＡＳ（配列番号１８）への置換が好ましい。
　上記のＧＳＡＳ（配列番号１８）への置換体の例には、実施例１４又は実施例１５のＨ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００６７５、Ｈ－００７３９及びＨ－００７４０が含まれる。
　配列番号１６のアミノ酸配列の１５１～１５４位のＲＲＡＲは、従来株スパイクタンパク質において６８２～６８５位に位置するフリンプロテアーゼ切断部位ＲＲＡＲであり、この部位に変異を加えることでフリンプロテアーゼにより切断されなくすることができ、これにより、培養細胞などで発現させた場合に安定性、タンパク質の収率などの向上が期待できる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＮ５４３Ｑ置換、Ｎ５６７Ｑ置換及びＮ６４２Ｌ置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含んでいてもよい。「配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＮ５４３Ｑ置換、Ｎ５６７Ｑ置換及びＮ６４３Ｌ置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換」とは、本発明のスパイクタンパク質変異体のアミノ酸配列と配列番号１６に記載のアミノ酸配列とを配列同一性を高めるために必要に応じてギャップを導入した上で並べた場合に、配列番号１６の５４３位のＮ、５６７位のＮ及び６４２位のＮに対応する本発明のスパイクタンパク質変異体上の各アミノ酸残基の１以上がそれぞれＱ、Ｑ又はＬへ置換されることを意味する。上記のＮ５４３Ｑ置換及びＮ５６７Ｑ置換を有するスパイクタンパク質変異体の例として実施例１１のＨ－００５１１が挙げられ、Ｎ６４２Ｌ置換を有するスパイクタンパク質変異体の例として実施例１０のＨ－００１８０が挙げられる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、膜貫通ドメイン及び細胞質側末端が欠失していてもよい。
　上記における「膜貫通ドメイン及び細胞質側末端」とは、スパイクタンパク質のＣ末側（従来株スパイクタンパク質で１２１１位～１２７３位）に位置する、脂質膜貫通ドメインとそのＣ末側の細胞質側末端に相当する配列を意味する。スパイクタンパク質においてこの領域を欠失させることにより、動物細胞や昆虫細胞などで発現させた場合に細胞外へ効率よく分泌させることができ、効率よく発現させたタンパク質を回収できることなどから、ワクチンに用いる抗原として好適である。
　たとえば、実施例１４又は実施例１５のＨ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００６７５、Ｈ－００７３９及びＨ－００７４０は膜貫通ドメイン及び細胞質側末端が欠失している。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、三量体化ドメイン、すなわち、ポリペプチドの三量体形成に寄与するアミノ酸配列が付加されていてもよい。好ましくはＳ２サブユニットのＣ末端に三量体化ドメインが付加されている。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、三量体化ドメインとしてフォルドン配列が付加されていてもよい。好ましくはＳ２サブユニットのＣ末端にフォルドン配列が付加されている。
　フォルドン配列とは、バクテリオファージＴ４フィブリチン由来のフォルドンドメインと呼ばれる２７アミノ酸程度のアミノ酸配列であり、三量体形成に寄与し、フォルドン配列との融合タンパク質として発現させることにより、タンパク質を安定化させることができる。
　好ましいフォルドン配列としては、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１９）を挙げることができるが、上記に限定されない。フォルドン配列については、ＷＯ２００８／０２５５１６やＷＯ２０１８／０８１３１８に記載のフォルドン配列を利用することも可能である。
　たとえば、実施例１４又は実施例１５のＨ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００６７５、Ｈ－００７３９及びＨ－００７４０はフォルドン配列としては、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１９）を含んでいる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体は、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されていてもよい。Ｈｉｓタグとしては、たとえば、配列番号２０のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨ）を挙げることができる。
　Ｈｉｓタグを付加することにより、ニッケル（Ｎｉ）を有する担体を用いて精製することができる。
　たとえば、実施例１４又は実施例１５のＨ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００６７５、Ｈ－００７３９及びＨ－００７４０はＣ末端に配列番号２０のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨ）を含んでいる。
　本発明のスパイクタンパク質変異体の例には、配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～Ｃ末端のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体が含まれる。なお、Ｃ端に含まれるアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨ）はタンパク質の精製に用いるものであり、抗原として用いるために必須の要素ではい。
　従って、本発明のスパイクタンパク質変異体の例には、配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体も含まれる。また、本発明のスパイクタンパク質変異体は三量体化ドメインを含まないことがあるため、本発明のスパイクタンパク質変異体の例には、配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２０９位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体も含まれる。
　配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列は以下に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列のＮ末側の１～１３位は分泌シグナル配列であり、哺乳類動物由来培養細胞や昆虫由来培養細胞などで産生する場合に、細胞外へ分泌させるために必要な配列であるが、分泌の際に切断される。
　本発明のスパイクタンパク質変異体の例には、配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～Ｃ末端のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体が含まれる。なお、Ｃ端に含まれるアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨ）はタンパク質の精製に用いるものであり、抗原として用いるために必須の要素ではい。
　従って、本発明のスパイクタンパク質変異体の例には、配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体も含まれる。また、本発明のスパイクタンパク質変異体は三量体化ドメインを含まないことがあるため、本発明のスパイクタンパク質変異体の例には、配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２０９位のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質変異体も含まれる。
　配列番号６５～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列は以下に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　本発明の免疫原性組成物は、本発明のスパイクタンパク質変異体を含有する。
　好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の抗原として、本発明のスパイクタンパク質変異体を一種類のみを含有し、それ以外のコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の抗原を含まない。すなわち、本発明のスパイクタンパク質変異体は、一価抗原により広域性な免疫原性し、広域指向ワクチンとして有効である。
　本発明の免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の予防、その他のコロナウイルス（好ましくは、ベータコロナウイルス、さらに好ましくはサルベコウイルス）による感染症の予防のために用いることができる。
　本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含んでいてもよい。
　好ましいアジュバントとしては、スクワレン、トコフェロール及びポリソルベート８０を含有するアジュバントを挙げることができる。具体的にスクワレンベースのアジュバントであるＡ－９１０８２３を挙げることができる。Ａ－９１０８２３の詳細は、例えば、Ｆｒｏｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２０２３　Ｆｅｂ　２０；１４：１１１６２３８（参考文献１）に記載されている。
　好ましいアジュバントとして、アルミニウム塩であるＡｌｕｍとオリゴデオキシヌクレオチドであるＯＤＮ２００６を混合したアジュバント、又は、アルミニウム塩であるＡｌｕｍとオリゴデオキシヌクレオチドであるＣｐＧ１０１８を混合したアジュバントを挙げることができる。
　本発明は、本発明のスパイクタンパク質変異体をコードする核酸を含む。具体的にはＤＮＡプラスミド発現ベクターやｍＲＮＡなどに本発明にかかるコロナウイルススパイクタンパク質変異体をコードさせて、生体内で発現させてもよい。なお、前記の本発明のスパイクタンパク質変異体をコードする核酸がコードする本発明のスパイクタンパク質変異体は、Ｃ末端の三量体化ドメイン及び／又はＨｉｓタグを含んでいなくてもよく、膜貫通ドメイン及び細胞質側末端を含んでいてもよい。
　本発明は、本発明のスパイクタンパク質変異体をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。発現ベクターとしては、ウイルスベクター（たとえばアデノウイルスベクター）などが含まれる。
　本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体は、公知の遺伝子工学的手法によって作製することができる。例えば、哺乳類由来の培養細胞、昆虫由来の培養細胞等の宿主を用いて発現させてもよいし、当業者に周知の方法を用いることができる。また、プラスミド発現ベクター、ウイルスベクター（たとえばアデノウイルスベクター）やｍＲＮＡなどに本発明にかかるコロナウイルススパイクタンパク質変異体をコードさせて、生体内で発現させてもよい。
　免疫原性組成物の剤型は適時選択し得る。液状製剤であっても良く、粉末製剤であってもよく、凍結乾燥製剤であっても良い。
　本発明の免疫原性組成物の投与経路は適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。非経口投与としては、例えば経鼻投与、吸引、鼻腔内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与、皮内投与、舌下投与、静脈内投与、経腸投与、経粘膜投与などが挙げられるが、それらに限定されない
　本発明の免疫原性組成物は、目的・用途などに応じて、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗菌剤、抗酸化剤、pH調節剤、分散剤、芳香剤、着色剤、消泡剤などが適宜添加されていてもよい。
　本発明の免疫原性組成物の投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択される。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を用いたコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体の作製方法
　コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体の産生系としてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を用いた。スパイクタンパク質変異体をコードする発現ベクター（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｃｈｉｃｋｅｎ　β－ａｃｔｉｎ　ｈｙｂｒｉｄ（ＣＡＧ）プロモーター、ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ（ＷＰＲＥ）配列及びｒａｂｂｉｔ　β－ｇｌｏｂｉｎ　ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ配列から構成される哺乳類発現プラスミド）プラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２９３　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。基本的には当該Ｋｉｔに添付のプロトコールに従って実験を行ったが、トランスフェクションと同時にＫｉｆｕｎｅｎｅｓｉｎｅ（終濃度１０μＭ）を同時添加した。トランスフェクションから１日後にキット付属エンハンサー１及び２を、直前に混合して添加し、トランスフェクションから４～５日後に培養上清を回収し、培養上清中に各スパイクタンパク質変異体を得た。
　得られた各スパイクタンパク質変異体を含む培養上清は、Ｔａｌｏｎ（登録商標）　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ）又はＮＧＬ　ＣＯＶＩＤ－１９　Ｓｐｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（ＲＥＰＬＩＧＥＮ）を用いて精製し、精製スパイクタンパク質変異体を得た。また、精製抗原タンパク質はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）　Ｕｌｔｒａ－２　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ　１００ｋＤａ　ＮＷＭＣＯ（メルクミリポア）により、タンパク濃縮及びＰＢＳバッファー（ＧＩＢＣＯ）へ置換した。得られた精製スパイクタンパク質変異体は、ゲル電気泳動、ＣＢＢ染色にて、目的のスパイクタンパクの純度を確認した。また、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いたタンパク質定量法にて精製スパイクタンパクの濃度を測定した。
　ＲＢＤのみの抗原のナノパーティクル化の方法
　６ｘＨｉｓ－Ａｖｉ－ｔａｇを付けた各ＲＢＤタンパク質は実施例１と同じ方法でトランスフェクションを行い、トランスフェクション後、１００　μＭ　ｂｉｏｔｉｎ存在下で培養し、各スパイクタンパク質変異体を含む培養上清は、Ｔａｌｏｎ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ）を用いてビオチン化ＲＢＤタンパク質を精製した。ビオチン化ＲＢＤはストレプトアビジンコートナノ粒子（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合することで、ビオチン化ＲＢＤ結合ナノ粒子を調製した。ナノ粒子に結合しなかった過剰量のビオチン化ＲＢＤ及び非ビオチン化ＲＢＤはナノセップ遠心ろ過デバイス　３００　ｋＤａ　ＮＷＭＣＯ（日本ポール）により除去し、ＰＢＳバッファー（ＧＩＢＣＯ）へ置換した。
　バキュロウイルス発現システム（ＢＥＶＳ）を用いたコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体の作製方法
　コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体製造宿主として、昆虫細胞であるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞（Ｓｆ９細胞等）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ（Ｔｎ）細胞（Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞等）を用いた。スパイクタンパク質変異体をコードするバキュロウイルスベクター（ｐＶＬ１３９２等）をバキュロウイルスゲノム（オックスフォードエクスプレッションテクノロジーズ社ｆｌａｓｈＢＡＣ等）とコトランスフェクションし、昆虫細胞内で相同組換えさせることでバキュロウイルスを作製した。バイオリアクター、スピナーフラスコ等で細胞培養を行い、バキュロウイルスを感染させることで各スパイクタンパク質変異体を発現させ、感染３日後に細胞もしくは培養上清を回収した。膜貫通領域を含むスパイクタンパク質全長体は、界面活性剤を用いて抽出することで宿主細胞から回収した。細胞外ドメインであるエクトドメインは培養上清から回収することができ、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）で濃縮、バッファー交換を行った。スパイクタンパク質全長体、エクトドメインそれぞれについて、Ｈｉｓタグアフィニティー樹脂もしくはスパイクタンパク質レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）アフィニティ―樹脂（レプリジェン社ＮＧＬ　ＣＯＶＩＤ－１９　Ｓｐｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ等）により、一段目の精製をおこなった。二段目としては、疎水性相互作用樹脂もしくはイオン交換樹脂を用いて精製した。その後、陰イオン交換メンブレンで核酸を除去した後に、ＴＦＦシステムもしくは限外濾過と透析を組み合わせて濃縮、バッファー交換を行い、０．２２μｍフィルターを通すことで抗原原薬とした。得られた抗原原薬は、ビシコニン酸法（ＢＣＡ）でタンパク質含量を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離したタンパク質を染色することで純度を測定した。
　変異体スパイクタンパク質の中和活性試験（薬効試験方法）
（１）マウスへの免疫
　実施例１又は２の方法で調製したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞由来あるいは実施例３の方法で調製したＢＥＶＳ(Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ)由来のスパイクタンパク質と、スクワレンベースのエマルジョンアジュバントＡ－９１０８２３（参考文献１）を１：１で混合し、２０μｇ／ｍｌの抗原溶液を調製し、１μｇ／匹となるよう５０μｌを雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの筋肉内へ接種した（各群５匹ずつ）。初回接種日から２週目に同免疫原を上記と同様に接種した。
　実施例１６に記載のｍＲＮＡ抗原については、アジュバントを含めず、０．３μｇ／匹、あるいは３μｇ／匹となるよう５０μｌを雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの筋肉内へ接種した（各群５匹ずつ）。初回接種日から３週目に同免疫原を上記と同様に接種した。
（２）血清採取
　最終接種日から２週目にマウスをイソフルラン麻酔下で下大静脈より採血し、凝固促進剤入りの分離管で血清分離した。血清を５６℃で３０分間処置し、非働化した。
（３）中和活性試験
　上記（２）で得られた非働化血清を用いてシュードウイルス中和試験を行った。具体的には、９６又は３８４ウェルプレートに播種した２９３Ｔ－ＡＴ細胞に、段階希釈した血清とシュードウイルスを混和した溶液を添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で２日間培養した。その後、細胞にＯＮＥ－Ｇｌｏ　Ｒｅａｇｅｎｔを加え、プレートリーダーで発光を測定した。中和抗体価（ＮＴ５０）は、シュードウイルスアッセイにおいて、５０％の感染を阻害する血清希釈倍率のことである。中和抗体価（ＮＴ５０）は、ＸＬｆｉｔを用いて算出した。なお、最低希釈倍率の阻害率％が５０％を下回る場合、ＮＴ５０値を最低希釈倍率の二分の一の数値とし、最高希釈倍率の阻害率％が５０％を上回る場合、ＮＴ５０値を最高希釈倍率とした。図１～２４におけるグラフは個体ごとの中和抗体価、及び群ごとの幾何平均値と９５％信頼区間を示している。シュードウイルスの作成方法は、Ｖａｃｃｉｎｅ．　２０２２　Ｊｕｌ　２９；４０（３１）：４２３１－４２４１（参考文献２）に記載されている。シュードウイルスに用いた各ウイルス株のスパイクタンパク質のアクセッション番号は以下の表の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　ＲＢＤキメラを搭載したスパイクタンパクの中和抗体誘導試験
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の両方に中和活性をもたらすことができるＲＢＤ配列を設計するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（デルタ株）のハイブリッド配列を設計した。設計した各ハイブリッド配列（デザイン１～５）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のスパイクタンパク質（エクトドメイン、すなわち膜貫通ドメイン及び細胞質側末端の欠失体）のＲＢＤに挿入したスパイクタンパク質変異体を作製し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する中和活性試験を実施した。
　Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を用い、実施例１に記載の方法で、下記表に記載のスパイクタンパク質を調製した。なお、各全長アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　上記作製したスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～６の通りである。なお、群５及び群６が本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体であり、群２～群４は参考例であり、群１は比較例である。
（群１）Ｈ－００１２０、
（群２）Ｈ－００１４５、
（群３）Ｈ－００１４６、
（群４）Ｈ－００１４７、
（群５）Ｈ－００１４８、
（群６）Ｈ－００１４９。
　その結果、Ｈ－００１４８（群５）とＨ－００１４９（群６）は野生型Ｄ６１４Ｇに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する中和抗体を誘導した（図１）。特に、群６の抗原Ｈ－００１４９は試験の供した各株のシュードウイルスに対して高い中和抗体誘導活性を有することが分かった。
　ＲＢＤキメラの中和抗体誘導試験
　デザイン５及びデザイン４のＲＢＤがＲＢＤのみでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に対する中和抗体を誘導できるのか確認するために、ＲＢＤのみの抗原での中和活性試験を実施した。ＲＢＤのデザイン１、２、４、５のＲＢＤ配列、コントロールとして、デルタ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＲＢＤ配列を作製した。具体的には実施例１の方法で下記表の各ＲＢＤを作製し、実施例２の方法でナノパーティクル化を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　上記作製したスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～８の通りである。なお、群６及び群７が本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体であり、群４及び群５は参考例であり、群１～群３及び群８は比較例である。
（群１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のＲＢＤ抗原（Ｈ－０００３３）、
（群２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＲＢＤ抗原（Ｈ－０００８２、図中の記載はＳＡＲＳ－１）、
（群３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のＲＢＤ抗原（Ｈ－０００３３）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（Ｈ－０００８２）を半量ずつ混合した抗原、
（群４）Ｈ－０００７８、
（群５）Ｈ－０００７９、
（群６）Ｈ－０００８１、
（群７）Ｈ－００４２８、
（群８）起源株Ｓ－ｆｕｌｌ抗原（配列番号６４、実施例３に記載の方法で調製）
　その結果、単価ワクチンの中で、Ｈ－０００７９（デザイン２）、Ｈ－０００８１（デザイン４）、Ｈ－００４２８（デザイン５）は、野生型Ｄ６１４Ｇに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する中和抗体を誘導し、特にＨ－００４２８（デザイン５）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に対する中和抗体をバランスよく誘導した（図２）。上記より、デザイン５及びデザイン４のＲＢＤは全長スパイクタンパク質、ＲＢＤのみの抗原として投与したいずれの場合でも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に対する中和抗体誘導活性を有する優れた抗原配列であることが分かった。
　ＮＴＤ置換の中和抗体誘導活性への影響１
　スパイクタンパク質のＮＴＤの中和活性誘導に与える影響を調べるために、Ｄｅｌｔａ株のスパイクタンパク質（エクトドメイン）のＮＴＤを入れ替えた下記の表の抗原を実施例１に従って作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　上記作製したスパイクタンパク質を、実施例4に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群1～３の通りである。なお、群２、群３はＮＴＤ置換の中和抗体誘導活性への影響を調べるための参考例であり、群１は比較例である。
（群１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のスパイクエクトドメイン（Ｈ－００１２０）、
（群２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株スパイクタンパクのＮＴＤをＢＡ．５株のＮＴＤ配列に置き換えたエクトドメイン（Ｈ－００５４５、配列番号４６）、
（群３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株スパイクタンパクのＮＴＤ配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＮＴＤ配列に置き換えたエクトドメイン（Ｈ－００６３２、配列番号４７）。
　その結果、Ｈ－００１２０と比較して、Ｈ－００５４５はＢＡ．５に対する中和抗体価が上昇し、一方、Ｈ－００６３２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する中和抗体価が上昇した（図３）。この結果は、スパイクタンパク質のＮＴＤが中和抗体誘導活性に寄与することを示すものである。
　ＮＴＤ置換の中和抗体誘導活性への影響２
　スパイクタンパク質のＮＴＤを入れ替えたときに、ＲＢＤの中和活性指向性への影響を調べるために、下記の表の抗原を実施例１に従って作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　上記作製したスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～５の通りである。なお、群３、群４が本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体であり、群２は参考例であり、群１及び群５は比較例である。
（群１）Ｈ－００１２０、
（群２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株スパイクタンパクのＮＴＤとＳ２をＢＡ．５株の配列に置き換えたエクトドメイン（Ｈ－００４４５）、
（群３）Ｈ－００１４９のＮＴＤとＳＤ１／２－Ｓ２をＢＡ．５株の配列に置き換えたエクトドメイン（Ｈ－００５５７）、
（群４）Ｈ－００１４８のＮＴＤとＳＤ１／２－Ｓ２をＢＡ．５株の配列に置き換えたエクトドメイン（Ｈ－００５５６）、
（５群）ＢＥＶＳで調製した起源株Ｓ－ｆｕｌｌ抗原。
　その結果、ＲＢＤにデザイン５を有するＨ－００５５７はＤ６１４Ｇだけでなく、ＢＡ．４／５とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に対する中和抗体誘導活性を有し、いずれのウイルス株に対してもバランスよく中和活性を誘導した（図４）。以上の結果より、ＮＴＤに導入した配列はその株に対する中和抗体を誘導することに加えて、実施例５及び６で見出したＲＢＤのキメラ配列と組み合わせることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体も同時に誘導することが示された。
　アミノ酸変異の導入による中和抗体誘導活性への影響１
　スパイクタンパク質の糖鎖結合部位のアミノ酸残基の削除による中和活性指向性への影響を調べるために、下記の表の抗原を実施例１に従って作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　上記表における１６７位、３３１位とは、従来株スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１６７位、３３１位に対応するアミノ酸残基を意味する。上記作製したスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～３の通りである。なお、群２、群３は１６７位、３３１位におけるアミノ酸変異の影響を調べるための参考例であり、群１は比較例である。
（群１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のスパイクエクトドメイン（Ｈ－００１２０）、
（群２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株に対して、Ｔ１６７Ｌ変異を導入したスパイクエクトドメイン（Ｈ－００１６１）、あるいは、
（群３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株に対して、Ｎ３３１Ｑ変異を導入したスパイクエクトドメイン。
　その結果、Ｈ－００１２０と比較して、Ｈ－００１６１とＨ－００１６８はＢＡ．４／５に対して高い中和抗体誘導活性を有することが分かった（図５）。
　アミノ酸変異の導入による中和抗体誘導活性への影響２
　スパイクタンパク質の糖鎖結合部位のアミノ酸残基の削除による中和活性指向性への影響を調べるために、下記の表の抗原を実施例１に従って作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　なお、上記表における１１７３位とは、従来株スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１１７３位に対応するアミノ酸残基を意味する。上記作製したスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～２の通りである。なお、群２はＮ１１７３Ｌ変異の影響を調べるための参考例であり、群１は比較例である。
（群１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のスパイクエクトドメイン（Ｈ－００１２０）、
（群２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株に対して、Ｎ１１７３Ｌ変異を導入したスパイクエクトドメイン（Ｈ－００１８９）。
　その結果、Ｈ－００１２０と比較して、Ｈ－００１８９はＢＡ．４／５に対して高い中和抗体誘導活性を示した（図６）。
　アミノ酸変異の導入による中和抗体誘導への影響３
　スパイクタンパク質の糖鎖結合部位のアミノ酸残基の削除による中和活性指向性への影響を調べるために、下記の表の抗原を実施例１の方法に従って作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　上記表における１０７４位、１０９８位とは、従来株スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１０７４位、１０９８位に対応するアミノ酸残基を意味する。上記作製したスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～２の通りである。なお、群２はＮ１０７４Ｑ変異及びＮ１０７４Ｔ変異の影響を調べるための参考例であり、群１は比較例である。
（群１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のスパイクエクトドメイン（Ｈ－００１２０）、
（群２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株に対して、Ｎ１０７４Ｑ変異とＮ１０７４Ｔ変異を導入したスパイクエクトドメイン（Ｈ－００５１１）。
　その結果、Ｈ－００１２０と比較して、Ｈ－００５１１はＢＡ．４／５に対して高い中和抗体誘導活性を示した（図７）。上記の結果は、糖鎖結合部位を削除するアミノ酸置換により、中和抗体誘導例活性を向上させることができることを示すものである。
　構造安定化変異の中和抗体誘導活性への影響１
　スパイクタンパク質の構造安定化に寄与する可能性がある下記の各アミノ酸残基置換による中和活性指向性への影響を調べるために、下記の表の抗原を実施例１に従って作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　上記表における７９５位、９６５位、１００３位とは、従来株スパイクタンパク質のアミノ酸配列の７９５位、９６５位、１００３位に対応するアミノ酸残基を意味する。上記作製したスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～３の通りである。なお、群２、群３は構造安定化変異の影響を調べるための参考例であり、群１は比較例である。
（群１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のスパイクエクトドメイン（Ｈ－００１２０）、
（群２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株に対して、Ｑ９６５Ｃ変異とＳ１００３Ｃ変異を導入したスパイクエクトドメイン（Ｈ－００３４６）、
（群３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株に対して、Ｋ７９５Ｐ変異を導入したスパイクエクトドメイン（Ｈ－００３９９）。
　その結果、Ｈ－００１２０と比較して、Ｈ－００３４６とＨ－００３９９はＢＡ．４／５に対して高い中和抗体誘導活性を示した（図８）。
　構造安定化変異の中和抗体誘導活性への影響２
　スパイクタンパク質の構造安定化に寄与する可能性がある下記のアミノ酸残基置換による中和活性指向性への影響を調べるために、下記の表の抗原を実施例１に従って作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　上記表における７３２位とは、従来株スパイクタンパク質のアミノ酸配列の７３２位に対応するアミノ酸残基を意味する。上記作製したスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～３の通りである。なお、群２は構造安定化変異の影響を調べるための参考例であり、群１は比較例である。
（群１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株のスパイクエクトドメイン（Ｈ－００１２０）、
（群２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｌｔａ株に対して、Ｔ７３２Ｐ変異を導入したスパイクエクトドメイン（Ｈ－００３９１）。
　その結果、Ｈ－００１２０と比較して、Ｈ－００３９１はＢＡ．４／５に対して高い中和抗体誘導活性を示した（図９）。上記の結果は、スパイクタンパク質の上記の各アミノ酸残基の置換により、中和抗体誘導活性を向上させることができることを示すものである。
　上記の結果を組み合わせてデザインした抗原の中和抗体誘導試験１
　実施例５～１３で得られた知見に基づき、下記の表に記載のスパイクタンパク質変異体を設計し、実施例１に従って、抗原タンパク質を作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　上記作製したスパイクタンパク質又は実施例３に記載の方法で作成した各抗原を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～７の通りである。なお、群３～群７が本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体であり、群１及び群２は比較例である。
（群１）起源株Ｓ－ｆｕｌｌ抗原（配列番号６４、実施例３に記載の方法で調製）、
（群２）起源株Ｓ－ｆｕｌｌ抗原（群１と同じ）及びＢＡ．５株Ｓ－ｆｕｌｌ抗原（配列番号６３、実施例３に記載の方法で調製）を同量混合した２価ワクチン、
（群３）Ｈ－００６４６、
（群４）Ｈ－００６５７、
（群５）Ｈ－００６６９、
（群６）Ｈ－００６７２、
（群７）Ｈ－００６７５。
　その結果、群１の起源株ワクチンは限られた株への中和抗体を誘導し、群２の２価ワクチンもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各株やその他のサルベコウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＷＩＶ－１）に対する中和活性の誘導は十分ではなかった。一方で、Ｈ－００６４６、Ｈ－００６５７、Ｈ－００６６９、Ｈ－００６７２、Ｈ－００６７５はサルベコウイルス全般に対して高い中和抗体誘導活性を示した（図１０）。
　上記の結果を組み合わせてデザインした抗原の中和抗体誘導試験２
　実施例５～１３で得られた知見に基づき、下記の表に記載のスパイクタンパク質変異体を設計し、実施例１に従って、抗原タンパク質を作製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　上記作製したスパイクタンパク質又は実施例３に記載の方法で作成した各抗原を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～３の通りである。なお、群２及び群３が本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体であり、群１は比較例である。
（群１）起源株Ｓ－ｆｕｌｌ抗原（配列番号６４、実施例３に記載の方法で調製）、
（群２）Ｈ－００７３９、
（群３）Ｈ－００７４０。
　その結果、起源株ワクチンは限られた株への中和抗体を誘導した一方で、Ｈ－００７３９、Ｈ－００７４０はサルベコウイルス全般に対して高い中和抗体誘導活性を示した（図１１）。
　ｍＲＮＡで生体内投与した抗原の中和抗体誘導試験
　上記デザインした抗原が、ｍＲＮＡで生体内に投与した場合の中和抗体誘導活性を調べるために以下の実験を行った。
（１）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）に用いる鋳型ＤＮＡを作製するために、プラスミドＤＮＡをＰＣＲにより増幅後精製した。Ｔ７プロモーター配列、５’－ＵＴＲ配列、ＫＯＺＡＫ配列、ＯＲＦ、３’－ＵＴＲ配列が順に連結した配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドに導入した。当該プラスミド１．８ｎｇを溶解したＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（２０７μＬ）に２×Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｐｒｅｍｉｘ　（１２０μＬ、Ｔａｋａｒａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｒ０４５）、１０μＭ　センスプライマー（９μＬ、配列番号６０）、１０μＭ　アンチセンスプライマー（９μＬ、配列番号６１）を加え、９８℃で２分インキュベーション後、９８℃、１０秒、５５℃、５秒、７２℃、１０秒を３５サイクル実施し、Ｈ－００６７２のＳ　ｆｕｌｌ（配列番号６２、Ｈ－００６７２のＣ末端のフォルドン配列及びＨｉｓタグ配列が欠失し、膜貫通ドメイン及び細胞質側末端が付加された配列。）をコードするＤＮＡを増幅した。反応後ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ　（Ｔａｋａｒａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃７４０６０９．２５０）にて鋳型ＤＮＡを精製した。
（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎよるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ－ｆｕｌｌ　ｍＲＮＡ－００１（配列番号５９）の調製
　上記で得られた３５８μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（８．４μＬ）、７５ｍＭ　ＡＴＰ（３０μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＡＭＢ１３３４５）、７５ｍＭ　ＧＴＰ（３０μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＡＭＢ１３３４５）、７５ｍＭ　ＣＴＰ（３０μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＡＭＢ１３３４５）、１００ｍＭ　Ｎ１－ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（２２．５μＬ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（１１９μＬ）、１０Ｘ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　（３０μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＡＭＢ１３３４５）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ　Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（３０μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＡＭＢ１３３４５）を混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。ＴＵＲＢＯ（登録商標）　ＤＮａｓｅ（１５μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＡＭ２２３９）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。７．５Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（１５０μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＡＭ９４８０）を混合し、－２０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、１５０００×ｇ、１５分）後、上澄みを廃棄、７０％　エタノールを加え、遠心分離（４℃、１５０００×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒに溶解後、得られた溶液の一部（２８５μＬ、ＵＶ換算で４５０μｇ）とＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（２５４μＬ）、１０ｍＭ　ＧＴＰ（９０μＬ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｍ２０８０）、２０ｍＭ　ＳＡＭ（９０μＬ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｍ２０８０）、１０Ｘ　Ｃａｐｐｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（９０μＬ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｍ２０８０）、Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｃａｐｐｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ（１０Ｕ／μＬ、４５μＬ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｍ２０８０）、ｍＲＮＡ　Ｃａｐ２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（５０Ｕ／μＬ、４５μＬ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｍ０３６６）を混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。７．５Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（４５０μＬ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＡＭ９４８０）を混合し、－２０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、１５０００×ｇ、１５分）後、上澄みを廃棄、７０％　エタノールを加え、遠心分離（４℃、１５０００×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒに溶解後、得られた溶液（４５０μＬ、ＵＶ換算で４２１μｇ）と１０Ｘ　Ａｎｔａｒｃｔｉｃ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（５１μＬ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｂ０２８９）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１０μＬ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｍ０２８９）を混合し、３７℃で３０分インキュベーションした後、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）　ＲＮＡ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ　ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｔ２０５０）を用いて付属のマニュアル通りに生成することで目的とするｍＲＮＡ－００１を得た。得られたｍＲＮＡをＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により分析し、目的の長さであることを確認した。
（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ　ｆｕｌｌ　ｍＲΝＡを用いたｍＲΝＡ封入核酸脂質粒子の調製
　ＳＭ－１０２（Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ，　ＨＹ－１３４５４１）及びＷＯ２０２２１６８８８４に記載のカチオン性脂質（以下Ｌｉｐｉｄと表記）、ジステアロイルホスファチジルコリン（１，２－Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ：以下ＤＳＰＣと表記、ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：以下Ｃｈｏｌと表記、ＮＩＰＰＯＮ　ＦＩＮＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＣＯ．，ＬＴＤ．）、及びポリエチレングリコール分子量が約２０００の１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール（１，２－Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－Ｇｌｙｃｅｒｏ－３－Ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧ－ＤＭＧと表記，ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を、ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｌｉｐｉｄ：ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７．９：３０．２：６０．４：１．５のモル比にて、総脂質濃度１３ｍＭになるようにエタノールに溶解した。
　一方、上記のｍＲＮＡ－００１の調製で得たｍＲＮＡを、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて３５μｇ／ｍＬに調製した。
　上記の脂質溶液とｍＲＮＡ溶液を、その体積比が１：３となるようにＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）　ＩＧＮＩＴＥＴＭ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）を用いてマイクロ流路内で混合し、核酸脂質粒子の粗分散液を得た。核酸脂質粒子の分散液を約３００倍量の４ｍＭ　リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にて１２－１８時間透析（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－ＬｙｚｅｒＴＭ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ　Ｇ２，ＭＷＣＯ：１０ｋＤ，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）することにより、エタノール除去を行い、精製されたｍＲＮＡ封入核酸脂質粒子の分散液を得て、以下の中和抗体誘導実験に供した。
（４）ｍＲＮＡの中和抗体誘導試験
　上記方法で作製したｍＲＮＡ、又は、実施例１に記載の方法で作製したＨ－００６７２抗原、実施例３に記載の方法で作成した起源株抗原を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～４の通りである。
（群１）起源株Ｓ－ｆｕｌｌ抗原（配列番号６４、実施例３に記載の方法で調製）、
（群２）Ｈ－００６７２タンパク抗原（配列番号２４、実施例１に記載の方法で調製したものであり、そのアミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。）、
（群３）ｍＲＮＡ抗原０．３μｇ（核酸配列：配列番号５９、アミノ酸配列：配列番号６２、上記で調製した分散液）
（群４）ｍＲＮＡ抗原３μｇ（核酸配列：配列番号５９、アミノ酸配列：配列番号６２、上記で調製した分散液）。
　なお、群２が本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体であり、群３及び群４が本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体をコードする核酸であり、群１は比較例である。
　本試験では（群３）と（群４）について、初回免疫から３週間後に追加免疫を実施し、さらにその２週間後に血清を採取し中和抗体価を測定した。
　その結果、タンパク抗原とｍＲＮＡ抗原いずれにおいても、評価したサルベコウイルス全般に対して高い中和抗体誘導活性を誘導した（図１２）。
　Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させた抗原と、ＢＥＶＳで調製した抗原の中和抗体誘導活性の比較
　Ｈ－００６７２に関して、実施例１記載のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させた抗原と、実施例３記載のＢＥＶＳで調製した抗原の中和抗体誘導活性を比較した。実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～３の通りである。なお、群２及び群３が本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体であり、群１は比較例である。
（群１）起源株Ｓ－ｆｕｌｌ抗原（配列番号６４、実施例３に記載の方法で調製）、
（群２）Ｈ－００６７２（配列番号２４、実施例１に記載の方法で調製したものであり、そのアミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。）、
（群３）Ｈ－００６７２（配列番号２４、実施例３に記載の方法で調製、したものであり、そのアミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。）。
　その結果、いずれの製造方法の抗原も、評価したシュードウイルスに対する高い中和抗体誘導活性を示した（図１３）。
　アジュバントの検討
　アジュバントの検討を行うため、Ｈ－００６７２抗原を用いて、実施例４に記載され、上記実施例５～１７でｍＲＮＡ以外について用いたＡ－９１０８２３（下記群１）及びそれに代わる下記の２種類のアジュバント（下記群２、３）を比較した。アジュバントの種類以外は、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。各投与群は下記群１～３の通りである。
（群１）スクワレンベースのエマルジョンアジュバントＡ－９１０８２３、
（群２）アルミニウム塩ＡｌｕｍとオリゴデオキシヌクレオチドＯＤＮ２００６を混合したアジュバント、
（群３）アルミニウム塩ＡｌｕｍとオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ１０１８を混合したアジュバント。
　なお、群１～群３はいずれも本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体を含有する免疫原性組成物である。
　その結果、いずれのアジュバントでも、シュードウイルスに対する中和抗体誘導活性は同程度であった（図１４）。
　実施例５～１５で得られた知見に基づき、下記の表に記載の本発明のコロナウイルススパイクタンパク質変異体計５８種を設計し、実施例１に従って、各スパイクタンパク質を調製した。なお、各アミノ酸配列の１～１３位はシグナル配列であり、調製した抗原には含まれていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　上記作製した各々のスパイクタンパク質を、実施例４に記載の方法で、マウスに免疫し、血清中の中和抗体価を測定した。なお、シュードウイルス中和試験に用いた各ウイルス株のスパイクタンパク質は、表１８のＤ６１４Ｇ、ＸＢＢ．１、ＳＡＲＳ－１の３種類とした。
　その結果、上記表のスパイクタンパク質はいずれも試験の供した３種のサルベコウイルスのシュードウイルスに対して高い中和抗体誘導活性を示した（図１５～図２４）。
　本発明のスパイクタンパク質変異体又はそのスパイクタンパク質変異体を含有する免疫原性組成物は、１価の抗原で広域な中和抗体誘導活性を示すという優れた効果を奏するものである。

Claims (29)

  1. 　（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、
    　（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、又は
    　（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＲＢＤと同等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して中和抗体誘導活性を有するＲＢＤ、
    を含むコロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
  2. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列が、配列番号２～５のいずれかに記載のアミノ酸配列である、請求項１記載のスパイクタンパク質変異体。
  3. 　配列番号６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２１１位のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載のスパイクタンパク質変異体。
  4. 　（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列、
    　（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
    　（ｃ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
    からなるＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む、請求項１～３のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  5. 配列番号７に記載のアミノ酸配列が、配列番号８又は９のいずれかに記載のアミノ酸配列である、請求項４記載のスパイクタンパク質変異体。
  6. 　（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列、
    　（ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
    　（ｃ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
    からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域を含む、請求項１～５のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  7. 　配列番号１０に記載のアミノ酸配列が、配列番号１１～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列である、請求項６記載のスパイクタンパク質変異体。
  8. 　（ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列、
    　（ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列、又は
    　（ｃ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
    からなるＳＤ１、ＳＤ２及びＳ２サブユニットからなる領域を含む、請求項１～５のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  9. 　配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＱ４３４Ｃ置換及びＳ４７２Ｃ置換に対応するアミノ酸置換を有する、請求項８記載のスパイクタンパク質変異体。
  10. 　配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＫ４５５Ｐ置換及び／又はＶ４５６Ｐ置換に対応するアミノ酸置換を有する、請求項８又は９記載のスパイクタンパク質変異体。
  11. 　配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＦ２８６Ｐ置換、Ａ３６１Ｐ置換、Ａ３６８Ｐ置換及びＡ４１１Ｐ置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を有する、請求項８～１０のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  12. 　配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＴ２０１Ｐ置換及び／又はＫ２６４Ｐ置換に対応するアミノ酸置換を有する、請求項８～１１のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  13. 　配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１５１～１５４位のＲＲＡＲ（配列番号１７）に対応する１以上のアミノ酸残基がアミノ酸変異を有し、フリンプロテアーゼにより切断されない、請求項８～１２のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  14. 　配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１５１～１５４位のＲＲＡＲに対応するアミノ酸残基がＧＳＡＳ（配列番号１８）に置換されている、請求項１３記載のスパイクタンパク質変異体。
  15. 　配列番号１６に記載のアミノ酸配列におけるＮ５４３Ｑ置換，Ｎ５６７Ｑ置換及びＮ６４２Ｌ置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を有する、請求項８～１４のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  16. 　膜貫通ドメイン及び細胞質側末端が欠失している、請求項１～１５のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  17. 　Ｃ末端に三量体化ドメインが付加されている、請求項１６記載のスパイクタンパク質変異体。
  18. 　Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されている、請求項１～１７のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  19. 　配列番号２１～２７のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体。
  20. 　配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を有し、配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～３２４位及び５２８位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
  21. 　配列番号６５、６８、７１、７４、７６、８２、８４、８７、８９、９２、９３、９４、９６、９７、１００、１０２～１０４、１０６～１１０のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のスパイクタンパク質変異体。
  22. 　配列番号２６に記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を有し、配列番号２６に記載のアミノ酸配列の３２５位～５２７位のアミノ酸配列を含む、コロナウイルスのスパイクタンパク質変異体。
  23. 　配列番号６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７７～８１、８３、８５、８６、８８、９０、９１、９５、９８、９９、１０１、１０５、１１１～１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列の１４位～１２３６位のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のスパイクタンパク質変異体。
  24. 　請求項１～２３のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体を含有する、免疫原性組成物。
  25. 　コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の抗原として、請求項１～２３のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体を一種類のみを含有し、それ以外のコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の抗原を含まない、請求項２４記載の免疫原性組成物。
  26. 　アジュバントを含有する、請求項２４又は２５記載の免疫原性組成物。
  27. 　前記アジュバントが、スクワレン、トコフェロール及びポリソルベート８０を含有するアジュバントである、請求項２６記載の免疫原性組成物。
  28. 　請求項１～２３のいずれかに記載のスパイクタンパク質変異体をコードする核酸。
  29. 　請求項２８に記載の核酸を含む発現ベクター。
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