WO2025005759A1 - Hydra ndi1가 탑재된 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 복합체 1 이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Hydra ndi1가 탑재된 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 복합체 1 이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating mitochondrial complex 1 abnormality disease, comprising a recombinant adeno-associated virus vector loaded with Hydra NDi1.
  • Mitochondrial genetic diseases caused by mutations in the mitochondrial genome were first reported about 30 years ago, and since then, there has been a rapid advance in understanding numerous diseases caused by mutations in the mitochondrial genome and mitochondrial genetics involved in the transmission of the mitochondrial genome.
  • the severity of the disease symptoms varies depending on the ratio of the mutated genome, and the higher the ratio of the mutated genome, the more severe the symptoms.
  • the heteroplasmy of the mitochondrial genome mutations induced in the same way varies greatly depending on the tissue of the human body or the individual, and much research is still needed to elucidate the mechanism that controls heteroplasmy.
  • LHON Leber's hereditary optic neuropathy
  • mtDNA mitochondrial DNA
  • Mitochondria are important intracellular bodies that produce energy (ATP) used for biological activities, and unlike nuclear genes, they have independent genes. Most genetic diseases are caused by defects in the genes in the nucleus, but some can be caused by abnormalities in the mitochondrial genes. A pair of genes in the nucleus are inherited from each parent, but mitochondrial genes are inherited only from the mother because the mitochondrial genes, including the paternal genes, are separated from the sperm tail during fertilization and cannot enter the egg. LHON accounts for 30-50% of unexplained optic neuropathy that occurs in both eyes and 2% of legal blindness.
  • vitamin C, vitamin B12 , or idebenone may alleviate damage to retinal ganglion cells in patients with the disease, but the effect is minimal, so it is not widely used in clinical practice, and it has the limitation of not being able to fundamentally prevent the disease. Therefore, there is currently no proper treatment, and gene therapy is the only fundamental treatment.
  • the inventors of the present invention constructed a recombinant viral vector containing hydra NDi1 to effectively treat mitochondrial abnormalities, and experimentally demonstrated that the vector can be used to prevent, improve, and treat mitochondrial abnormalities, thereby completing the present invention.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating mitochondrial abnormalities, comprising a recombinant viral vector loaded with the hydra NDi1 gene represented by sequence number 1.
  • an object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a mitochondrial disorder, comprising a step of administering to a subject a pharmaceutical composition for preventing or treating a mitochondrial disorder, which comprises a recombinant viral vector loaded with a hydra NDi1 gene represented by sequence number 1.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating mitochondrial abnormalities, comprising a recombinant viral vector loaded with the hydra NDi1 gene represented by sequence number 1.
  • the present invention provides a method for preventing or treating mitochondrial abnormalities, comprising a step of administering a pharmaceutical composition comprising the vector of the present invention as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of a pharmaceutical composition comprising the vector of the present invention as an active ingredient for preventing or treating mitochondrial abnormalities.
  • the present invention also provides a use of the vector of the present invention for producing a drug for preventing or treating mitochondrial abnormalities.
  • the present inventors have confirmed that the scAAV-hydra NDi1 of the present invention has the effect of restoring the decrease in cellular respiration caused by rotenone and the effect of inhibiting the death of cells derived from LHON patients caused by rotenone. Therefore, it is expected that this can be used for the prevention, improvement, or treatment of not only LHON but also diseases caused by abnormalities in mitochondrial complex 1.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the production of ssAAV-2/DJ-GFP, ssAAV-2/DJ-IRES-GFP, or scAAV-2/DJ-GFP recombinant adeno-associated virus.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the production of recombinant adeno-associated viruses: ssAAV-2/DJ-yeast NDi1, ssAAV-2/DJ-hydra NDi1, and scAAV-2/DJ-hydra NDi1.
  • Figure 3a shows the cleavage map of the recombinant adeno-associated virus vector used in the experiment to confirm the gene expression intensity and stability of ssAAV and scAAV.
  • Figure 3b shows the results of confirming the level of green fluorescence expression of ssAAV-GFP and scAAV-GFP.
  • Figure 4 shows the results of measuring the oxygen consumption rate (OCR) after adding rotenone to dermal fibroblasts derived from LHON patients infected with ssAAV-IRES-GFP, ssAAV-yeast NDi1, or scAAV-hydra NDi1.
  • OCR oxygen consumption rate
  • Figures 5a to 5d show the results of adding rotenone to dermal fibroblasts derived from LHON patients infected with ssAAV-IRES-GFP, ssAAV-yeast NDi1, ssAAV- hydra NDi1, and scAAV-hydra NDi1, and observing the degree of cell death 1 to 4 days after rotenone treatment.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating mitochondrial abnormalities, comprising a recombinant viral vector loaded with a hydra NDi1 gene represented by sequence number 1.
  • NDi1 NADH dehydrogenase or NADH-ubiquinone oxidoreductase
  • NDi1 is an NADH dehydrogenase present in the mitochondria of organisms that do not have a large enzyme complex such as mammalian mitochondrial complex 1, and performs the function of mitochondrial complex 1.
  • the NDi1 transfers electrons from NADH to ubiquinone.
  • NDi1 derived from Hydra vulgaris was used, and the Hydra vulgaris- derived NDi1 has a smaller molecular weight than the Saccharomyces cerevisiae -derived NDi1.
  • the hydra NDi1 gene represented by the following SEQ ID NO: 1 was used.
  • a "recombinant vector” is a genetic construct including essential regulatory elements operably linked to allow expression of a genetic insert, and may be a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, or a viral vector. According to one embodiment of the present invention, it may be a viral vector, specifically, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, or a retrovirus vector, and more specifically, an adeno-associated virus vector, but is not limited thereto.
  • the recombinant viral vector comprises a hydra NDi1 gene represented by sequence number 1. It is preferable that the hydra NDi1 gene sequence is present in a suitable expression construct. It is preferable that the hydra NDi1 gene sequence in the expression construct is operatively linked to a promoter.
  • operably linked means a functional linkage between a nucleic acid expression regulatory sequence (e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcription factor binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the regulatory sequence regulates transcription and/or translation of the other nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid expression regulatory sequence e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcription factor binding sites
  • the promoter linked to the hydra NDi1 gene sequence may be any promoter capable of initiating expression of hydra NDi1, but it is preferable to select a promoter that can operate in an animal cell, more specifically, a mammalian cell, to regulate transcription of the hydra NDi1 gene sequence.
  • the above promoters include promoters derived from mammalian viruses and promoters derived from the genome of mammalian cells, including but not limited to, the U6 promoter, the T7 promoter, the H1 promoter, the CMV (cytomegalo virus) promoter, the adenovirus late promoter, the vaccinia virus 7.5K promoter, the SV40 promoter, the tk promoter of HSV, the RSV promoter, the EF1 alpha promoter, the metallothionine promoter, the beta-actin promoter, the promoter of the human IL-2 gene, the promoter of the human IFN gene, the promoter of the human IL-4 gene, the promoter of the human lymphotoxin gene, the promoter of the human GM-CSF gene, an inducible promoter, or a tissue-specific promoter (e.g., the albumin promoter).
  • the above vector can be produced using a genetic recombination technique well known in the art, and site-
  • the adeno-associated virus is a single-stranded DNA virus belonging to parvovirus. It is a defective virus that cannot replicate on its own, but can replicate and proliferate when infected with a helper virus such as adenovirus, vaccinia, or herpesvirus.
  • the adeno-associated virus can infect both dividing and non-dividing cells.
  • the adeno-associated virus may be self-complementary AAV (scAAV), which has high expression stability and expression intensity, and low immunogenecity.
  • the recombinant viral vector can suppress, but is not limited to, a decrease in cellular respiration or apoptosis caused by mitochondrial complex 1 or more.
  • the mitochondrial complex 1 or more can be caused by a mutation in the ND1, ND4, or ND6 gene, but is not limited thereto.
  • mitochondrial abnormality refers to a disease caused by a mutation in mitochondrial DNA (mtDNA, mitochondrial gene), in which various symptoms are expressed due to changes in mitochondrial morphology or biochemical properties in various tissues.
  • the mitochondrial abnormality may be caused by an abnormality in mitochondrial complex 1, but is not limited thereto.
  • the mitochondrial abnormality may be caused by a mutation in one or more genes selected from the group consisting of ND1 (NADH dehydrogenase subunit 1), ND4 (NADH dehydrogenase subunit 4), and ND6 (NADH dehydrogenase subunit 6), but is not limited thereto.
  • the above mitochondrial abnormalities include Leber's hereditary optic neuropathy (LHON), MELAS (Mitochondrial Encephalopathy with Lactic acidosis and stroke-like episode) syndrome, neurogenic muscle weakness, MERRF (Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fiber) syndrome, mitochondrial encephalomyopathy, Leigh syndrome, Kearns-Sayre syndrome, multiple sclerosis, encephalomyelitis, cranial neuropathy, peripheral neuropathy, Friedreich's ataxia, Alpher's disease, stroke, migraine, psychosis, depression, seizure, dementia, apoplexy, optic atrophy, optic neuropathy, glaucoma, retinitis pigmentosa, cataract, hyperaldosteronism, hypoparathyroidism, myopathy, It may be selected from the group consisting of muscle atrophy, myoglobinuria, muscle tone impairment, myalgia, decreased exercise tolerance, renal tubulopathy, renal failure, liver failure, hepatomegaly
  • the Leber's hereditary optic neuropathy may be called Leber's optic atrophy, etc., and refers to a disease in which complex 1 in mitochondria does not function properly due to mutations in mitochondrial ND1, ND4, or ND6 mtDNA (mitochondria-DNA), causing abnormalities in the optic nerve system and leading to blindness.
  • the content of the vector of the present invention in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the condition of the patient, etc., and for example, it can be 0.0001 to 99.9 wt%, or 0.001 to 50 wt% based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the excipients may be, for example, at least one selected from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, lubricants, adsorbents, moisturizers, film-coating materials, and controlled-release additives.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated and used in the form of external preparations such as powders, granules, sustained-release granules, enteric-coated granules, liquids, eye drops, ellipses, emulsions, suspensions, alcohols, troches, aromatic waters, limonades, tablets, sustained-release tablets, enteric-coated tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, irrigants, ointments, pastes, sprays, inhalants, patches, sterile injection solutions, or aerosols, and the external preparations may have formulations such as creams, gels, patches, sprays, ointments, ointments, lotions, liniments, pastes, or cataplasmas.
  • external preparations may have formulations such as creams, gels, patches, sprays
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives for tablets, powders, granules, capsules, pills and troches according to the present invention include excipients such as corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, sucrose, glucose, fructose, D-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, calcium hydrogen phosphate, calcium sulfate, sodium chloride, sodium bicarbonate, purified lanolin, microcrystalline cellulose, dextrin, sodium alginate, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, kaolin, urea, colloidal silica gel, hydroxypropyl starch, hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose acetate phthalate,
  • Carboxymethylcellulose carboxymethylcellulose calcium, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin, stearic acid, sodium carboxymethylcellulose, sodium methylcellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, dextrin, hydroxycellulose, hydroxypropyl starch, hydroxymethylcellulose, refined shellac, starch starch, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, and other binders can be used, and hydroxypropyl methylcellulose, corn starch, agar powder, methylcellulose, bentonite, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethylcellulose, sodium alginate, calcium carboxymethylcellulose, calcium citrate, sodium lauryl sulfate, Disintegrants such as anhydrous silicic acid, 1-hydroxypropyl cellulose, dextran, ion exchange resin, polyvinyl acetate, formaldehyde-treated casein and gelatin, alginic acid, am
  • Additives that can be used in the liquid formulation according to the present invention include water, diluted hydrochloric acid, diluted sulfuric acid, sodium citrate, monostearate sucrose, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, ammonia water, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, etc.
  • the syrup according to the present invention may use a solution of white sugar, other sugars or sweeteners, and may also use a flavoring agent, a coloring agent, a preservative, a stabilizer, a suspending agent, an emulsifier, a viscosity increasing agent, etc., as needed.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and an emulsifier, preservative, stabilizer, fragrance, etc. may be used as needed.
  • the suspension according to the present invention may use suspending agents such as acacia, tragacanth, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, and the like.
  • suspending agents such as acacia, tragacanth, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, and the like.
  • Surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may also be used as needed.
  • the injection according to the present invention includes: solvents such as distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, Ringer's injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated Ringer's injection, ethanol, propylene glycol, nonvolatile oils such as sesame oil, cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; solubilizers such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethyl acetamide, butazolidine, propylene glycol, Tween, nitrile acid amide, hexamine, and dimethyl acetamide; buffers such as weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and gums
  • the suppository according to the present invention comprises cocoa butter, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cocoa butter + cholesterol, lecithin, ranette wax, glycerol monostearate, Tween or Span, Imhausen, monolene (propylene glycol monostearate), glycerin, Adeps solidus, Buytyrum Tego-G, Cebes Pharma 16, hexalide base 95, Cotomar, Hydroxocote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Mechanisms such as Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations are prepared by mixing the extract with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, flavoring agents, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dosage level can be determined according to the type and severity of the patient's disease, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the excretion rate, the treatment period, the concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses. It is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects by taking all of the above factors into consideration, and this can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, for example, oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, intrathecal injection, sublingual administration, buccal mucosa administration, rectal insertion, vaginal insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, skin administration, transdermal administration, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient along with various related factors such as the disease to be treated, route of administration, age, sex, weight of the patient, and severity of the disease.
  • the term "subject” means a subject requiring treatment for a disease, and more specifically, a mammal such as a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, and cow.
  • “administration” means providing a composition of the present invention to a subject by any appropriate method.
  • prevention means any act of suppressing or delaying the onset of a target disease
  • treatment means any act of improving or beneficially changing a target disease and its resulting metabolic abnormality symptoms by administering a pharmaceutical composition according to the present invention
  • improvement means any act of reducing a parameter related to a target disease, for example, the degree of symptoms, by administering a composition according to the present invention.
  • AAV Adeno-associated virus
  • pHelper vector the first vector
  • pRC vector the subtype
  • ssAAV single-stranded AAV
  • scAAV self-complementary AAV
  • GOI gene of interest
  • pAAV-DJ was used as the pRC vector, and the genes of interest were GFP (Green fluorescent protein), IRES (internal ribosome entry site)-GFP, yeast NDi1 (GenBank: X61590.1), and hydra NDi1 (NCBI Reference Sequence: XM_002156815.3). Individual maps of the vectors used in the experiment are shown in Figures 1 and 2.
  • All of the vectors for the above AAV production were purchased from Cell Biolabs (San Diego, CA), and AAV-293 (Agilent, Santa Clara, CA) was used for 293 cells. After culturing 293 cells in a 150 mm dish to about 90% confluence, the first vector, the second vector, and the third vector were well mixed at a ratio of 20 ug, 10 ug, and 10 ug, respectively, and then mixed with CaCl2 solution and evenly spread on the 293 cells. After 3 days, the 293 cells were scraped with a cell scraper, purified with an AAVpro Purificatin Kit (Takara, San Jose CA), and the titer was measured with the company's AAVpro Titration Kit. They were then stored at -80°C until use.
  • scAAV-GFP and ssAAV-GFP were infected into fibroblasts, and the degree of green fluorescence expression was confirmed.
  • the experiment was conducted using the recombinant AAV shown in Fig. 3a. Specifically, skin fibroblast cells derived from LHON patients were cultured in a 12-well plate to about 70% confluence, and then about 10 9 viral genomes (vg) of ssAAV-2/DJ-GFP or scAAV-2/DJ-GFP were added per well to infect the cells. After 3 days, the degree of GFP expression by each recombinant AAV in the infected cells was observed under an FITC filter with an inverted fluorescence microscope. The results are shown in Fig. 3b.
  • scAAV-GFP expresses green fluorescence more strongly within cells than ssAAV-GFP. This means that scAAV stably expresses genes (stability) and has high gene expression intensity.
  • a 24-well plate dedicated to measuring cellular respiration skin fibroblasts derived from LHON patients were cultured to about 50% confluence and then infected with ssAAV-IRES-GFP, ssAAV-yeast NDi1, ssAAV-hydra NDi1, and scAAV-hydra NDi1 at a titer of about 10 8 vg per well, respectively.
  • OCR oxygen consumption rate
  • rotenone was added to the cells to confirm the inhibitory effect on the decrease in cellular respiration by yeast NDi1 and hydra NDi1.
  • Cellular respiration was confirmed by measuring the oxygen consumption rate (OCR) using Agilent's Seahorse XF-24. The results are shown in Fig. 4.
  • scAAV-hydra NDi1 inhibited the reduction of cellular respiration induced by rotenone more efficiently than ssAAV-yeast NDi1.
  • LHON patient dermal fibroblasts were cultured to about 70% confluence in 24-well plates and then infected with ssAAV-IRES-GFP, ssAAV-yeast NDi1, ssAAV-hydra NDi1, and scAAV-hydra NDi1 at a titer of about 10 9 vg per well, respectively.
  • Rotenone was treated 6 days later, and cell death was observed 1 day after rotenone treatment. The results are shown in Figs. 5a to 5d. Cell death was determined comprehensively by considering the shape and form of individual cells, the degree of attachment to the bottom, and the strength of contact with adjacent cells.
  • ssAAV-IRES-GFP 3 days after rotenone treatment, untransduced cells or cells infected with ssAAV-IRES-GFP were completely killed at 5 nM rotenone, and cells infected with ssAAV-yeast NDi1 or ssAAV-hydra NDi1 began to die significantly even at 10 nM rotenone. In contrast, cells infected with scAAV-hydra NDi1 under the same conditions were hardly killed even at 20 nM rotenone.
  • cells infected with ssAAV-yeast NDi1 or ssAAV-hydra NDi1 also showed some death at 5 nM rotenone and almost no death at 10 nM.
  • cells infected with scAAV-hydra NDi1 showed almost no death even at 20 nM.
  • scAAV-hydra NDi1 is significantly more effective in inhibiting apoptosis of LHON patient-derived cells mediated by mitochondrial complex 1 or higher than ssAAV-hydra NDi1 and ssAAV-yeast NDi1.
  • the scAAV-hydra NDi1 of the present invention has an effect of restoring the decrease in cellular respiration caused by rotenone and an effect of inhibiting the death of cells derived from LHON patients caused by rotenone. Therefore, it is expected that this can be used for the prevention, improvement, or treatment of diseases caused by abnormalities in mitochondrial complex 1 as well as LHON.

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Abstract

본 발명은 Hydra NDi1가 탑재된 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 복합체 1 이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명자들은 본 발명의 scAAV-hydra NDi1이 로테논에 의한 세포호흡 감소를 복구하는 효과, 및 로테논에 의한 LHON 환자 유래 세포의 사멸을 억제하는 효과가 있음을 확인하였는바, 이를 LHON 뿐만 아니라 미토콘드리아 복합체 1에 이상으로 인해 발병하는 질병의 예방, 개선, 또는 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

HYDRA NDI1가 탑재된 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 복합체 1 이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 Hydra NDi1가 탑재된 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 복합체 1 이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.
미토콘드리아 유전체의 변이로 인하여 발생하는 미토콘드리아 유전병은 약 30년 전 처음으로 보고되었으며, 이후 미토콘드리아 유전체의 변이로 발생하는 수많은 질병과 미토콘드리아 유전체의 전달에 관여하는 미토콘드리아 유전학에 대한 이해가 비약적으로 이루어졌다. 세포 내에는 대략 수천 개의 미토콘드리아 유전체가 존재하고, 변이된 미토콘드리아 유전체는 대부분 세포 내에서 정상 유전체와 섞여 존재하며 이를 헤테로플라스미(heteroplasmy)라 한다. 질병의 증상은 변이된 유전체의 비율에 따라 그 심각도가 다르게 나타나는데, 변이된 유전체의 비율이 높을수록 즉, 헤테로플라스미가 높을수록 더욱 심한 증상이 나타난다. 동일하게 유발된 미토콘드리아 유전체 변이는 인체의 각 조직에 따라 또는 개체에 따라 그 헤테로플라스미가 매우 다양한데, 헤테로플라스미를 조절하는 기작을 밝히기 위해서는 아직도 많은 연구가 필요하다.
LHON(Leber's hereditary optic neuropathy)은 젊은 시기에 특징적인 시신경의 손상으로 인해 통증이 동반되지 않으면서 갑자기 양쪽 시력을 잃게 되는 사립체성 유전질환으로, 1871년 독일의 안과의사 Theodore Leber에 의해 처음으로 기술되었다. 여자보다 주로 남자에게(약 80%) 발현되며, 여자의 경우는 좀 더 늦게 발현되고 더 심하게 영향을 받는다. 발현되는 시기는 보통 18세에서 30세 사이이지만, 모든 연령에서 예고없이 나타나며, 급성이나 아급성으로 양쪽 눈의 시력을 동시에, 또는 연속적으로 잃게 될 수 있다. 발생빈도는 아직까지 정확하게 알려져 있지 않다. LHON은 사립체 유전자(미토콘드리아 DNA, mtDNA)의 돌연변이에 의해 유전되는 유전질환 중 가장 먼저 발견된 질환으로, 모계로만 유전되는 질환이다. 대부분의 환자가 모계로부터 가족력을 가지지만 40%가 자연발생적이다.
사립체는 생체활동에 사용되는 에너지(ATP)를 생산하는 중요한 세포내 소체로서, 핵 유전자와는 달리 독립적인 유전자를 가지고 있다. 대부분의 유전질환은 핵 내의 유전자에 생긴 결함으로 발생하지만 일부는 사립체 유전자의 이상으로 나타날 수 있다. 세포핵 안에 있는 한 쌍의 유전자는 부모에서 각각 물려받지만, 사립체 유전자는 수정 시 정자의 꼬리 안에 있는 부계의 유전자를 포함한 사립체가 떨어져 나가면서 난자 내로 들어가지 못하기 때문에 단지 모계에서만 유전된다. 　LHON은 양쪽 눈에서 발생되는 원인 불명의 시신경병증의 30~50%을 차지하고, 법적 실명의 2%를 차지한다. LHON의 90% 정도가　G11778A(전 세계적으로 70% 정도), G3460A, T14484C(프랑스와 캐나다인의 혼혈에게 가장 많음)의 세 가지 점 돌연변이 중 한 가지를 보유하고 있으며, 그 밖에도 여러 점 돌연변이 유전자가 밝혀져 있다. 대부분은 한 개의 돌연변이 유전자(homoplasic)를 가지지만 두 개 이상의 돌연변이 유전자(heteroplasic)를 가진 경우도 드물게 있다. 질환의 확실한 발생기전은 밝혀지지 않았지만, 정상적인 세포의 분열과 세포의 성장과정에 결함이 있는 사립체 유전자가 관여되어, 시신경 세포에서의 에너지 생산과정에 문제가 발생하게 되고, 그로 인해 세포가 파괴된다고 여겨진다.
약물치료로 비타민 C, 비타민 B12, 또는 이데베논(idebenone)의 투여는 질병이 발생한 환자에서 망막신경절 세포의 손상을 완화시키는 작용은 할 수는 있지만, 그 효과가 미미하기에 임상에서 잘 사용이 되지 않으며 근본적인 예방도 할 수 없다는 한계를 지니고 있다, 따라서, 현재까지 마땅한 치료법이 없는 실정이고, 유전자 치료만이 근본적인 치료가 될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 미토콘드리아 이상질환을 효과적으로 치료하기 위하여, hydra NDi1를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제작하였고, 이를 이용하여 미토콘드리아 이상질환을 예방, 개선, 및 치료할 수 있음을 실험적으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 hydra NDi1 유전자가 탑재된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 hydra NDi1 유전자가 탑재된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 미토콘드리아 이상질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 hydra NDi1 유전자가 탑재된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 미토콘드리아 이상질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 미토콘드리아 이상질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료 약제를 생산하기 위한 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 본 발명의 scAAV-hydra NDi1이 로테논에 의한 세포호흡 감소를 복구하는 효과, 및 로테논에 의한 LHON 환자 유래 세포의 사멸을 억제하는 효과가 있음을 확인하였는 바, 이를 LHON 뿐만 아니라 미토콘드리아 복합체 1에 이상으로 인해 발병하는 질병의 예방, 개선, 또는 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 ssAAV-2/DJ-GFP, ssAAV-2/DJ-IRES-GFP, 또는 scAAV-2/DJ-GFP 재조합 아데노부속바이러스 제작을 도식도로 나타낸 것이다.
도 2는 ssAAV-2/DJ-yeast NDi1, ssAAV-2/DJ-hydra NDi1, scAAV-2/DJ-hydra NDi1 재조합 아데노부속바이러스 제작을 도식도로 나타낸 것이다.
도 3a는 ssAAV 및 scAAV의 유전자 발현 강도 및 안정성 확인 실험에 사용한 재조합 아데노부속바이러스 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3b는 ssAAV-GFP 및 scAAV-GFP의 녹색 형광 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 ssAAV-IRES-GFP, ssAAV-yeast NDi1, 또는 scAAV-hydra NDi1로 감염된 LHON 환자에서 유래한 피부섬유아세포에 로테논을 첨가하고 산소 소모율(oxygen consumption rate, OCR)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5d는 ssAAV-IRES-GFP, ssAAV-yeast NDi1, ssAAV- hydra NDi1, 및 scAAV-hydra NDi1로 감염된 LHON 환자에서 유래한 피부섬유아세포에 로테논을 첨가하고, 로테논 처리 1일 내지 4일 후의 세포사멸 정도를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 hydra NDi1 유전자가 탑재된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "NDi1(NADH dehydrogenase 또는 NADH-ubiquinone oxidoreductase)"은 포유동물의 미토콘드리아 복합체 1(mammalian complex 1)과 같은 거대효소복합체가 없는 생물의 미토콘드리아 내에 존재하는 NADH 탈수소효소로서, 미토콘드리아 복합체 1의 기능을 수행한다. 상기 NDi1은 NADH에서 유비퀴논(ubiquinone)으로 전자를 전달한다. 본 발명의 일 실시예에서는 Hydra vulgaris 유래 NDi1을 사용하였으며, 상기 Hydra vulgaris 유래 NDi1은 Saccharomyces cerevisiae 유래 NDi1 보다 분자량이 작다. 본 발명의 일 실시예에서는 하기 서열번호 1로 표시되는 hydra NDi1 유전자를 사용하였다.
서열번호 1:
agttttagaa tttataccag cagctagtta taagcgcaaa atgccattct ctttatcatc 60
tgttctgtat cggaaaagac ttgttttatt aggaacagga tggggatgtt atagtgtgtt 120
aaaaaatatt aacaagaagc tttatgatgt gattgttgtt agtccacgaa atcattttct 180
ttttacaccc ttgttaaata gcacaactgt tgggacttta gaatttcgaa gcataattga 240
accgattcga aacactaagt ttcgggatga tcatcatttt caattggctg aagcaattca 300
cttaaatcca catgataaat tagttgtttg taaagcagtc tcatctgata aagaatatac 360
tttatcatac gataaagttg taattggtgt tggagctgtt agtaatactt ttggaattcc 420
tggtgtccca aagtatgcat attttttgaa agaaatagca gatgctagaa aaatacgtaa 480
tcaaatcata tctaattttg agcaaagttt gtttccatat gtaaatgaag aggaaaggtt 540
atcactgttg cattttgtca ttgttggtgg tggtccaact ggtattgaat ttggagctga 600
gttgtatgac tttataacac atgatgttgc aagacttttt ccaggagaga agaatgatgt 660
tcatgtaaca ttagttgaag gagattcaat attaccttca tttgaccagc gattacgtaa 720
atttgctgag agaaaaatta cacaaagaga aaatttccac ttaatcaaag attttgttgt 780
ggaagttggt gaaaactatg tgaagttgaa atcaggaaaa gttcttttaa ctaagcttgt 840
agtgtggtca accggtcttg gtcccagaaa gtttatagaa agtttagacc tacctaaagg 900
taaatcaaaa caactcaagg tagatgatca tcttcgtgta gttggttatg acagtatatt 960
tgcaattggt gattgttcat acatagatgg atctccttta ccaagcacgg ctcaagtggc 1020
tgaaagacaa ggtcgatatg ttgcacagta cttatcctta ttagaaacaa attctaaaac 1080
agacagtaaa ccatttatgt ggtccaatgc tggtatgctt gcatatattg gtggatataa 1140
agctgttgca gatcttccaa caaaagctgg gaagataact ggatttaaaa gttggttaat 1200
atggcgatcg gtttatctta ctcgcttagg gagctggaga aatcgaatgc aagttccatt 1260
tgactgggct aggacttttt tttttggcag ggatatatct aggttttaaa ttacaaactt 1320
tatttaatat ttagtatttt ttgtatctta ttaatttgtt tttaa
본 발명에 있어서, "재조합 벡터(recombinant vector)"는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 또는 바이러스 벡터일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 바이러스 벡터일 수 있으며, 구체적으로는 아데노바이러스(adenovirus) 백터, 아데노부속바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 또는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터일 수 있으며, 더 구체적으로는 아데노부속바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 서열번호 1로 표시되는 hydra NDi1 유전자를 포함한다. 상기 hydra NDi1 유전자 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서 hydra NDi1 유전자 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는(operatively linked) 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서, hydra NDi1 유전자 서열에 결합된 프로모터는 hydra NDi1의 발현을 개시할 수 있는 어떤 프로모터도 가능하나, 구체적으로 동물세포, 더 구체적으로는 포유동물 세포에서 작동하여 hydra NDi1 유전자 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로 선택하는 것이 좋다. 상기 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예를 들어, U6 프로모터, T7 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로 모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 유도성 (inducible) 프로모터, 또는 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아데노부속바이러스(adeno-associated virus, AAV)는 파르보바이러스(parvovirus)에 속하는 단일 가닥의 DNA 바이러스이다. 단독으로 복제를 할 수 없으며, 아데노바이러스나 백시니아(vaccinia), 혹은 헤르페스바이러스(herpesvirus) 등의 헬퍼(helper) 바이러스와 함께 감염되었을 때 복제, 증식할 수 있는 결함 바이러스이다. 상기 아데노부속바이러스는 분열 혹은 미분열 세포 모두 감염이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 아데노부속바이러스는 자가 상보적인 AAV(Self-complementary AAV, scAAV)일 수 있으며, 이는 발현의 안정성 및 발현 강도가 높으며, 면역원성(immunogenecity) 낮다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 미토콘드리아 복합체 1 이상에 의한 세포호흡 감소 또는 세포사멸을 억제시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 미토콘드리아 복합체 1 이상은 ND1, ND4, 또는 ND6 유전자 돌연변이에 의해 생길 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "미토콘드리아 이상질환"이란, 미토콘드리아 DNA(mtDNA, 사립체 유전자)의 돌연변이에 의한 질환으로, 다양한 조직에서 미토콘드리아 형태나 생화학적인 변화가 원인이 되어 여러 증상이 발현된다. 상기 미토콘드리아 이상질환은 미토콘드리아 복합체 1의 이상으로 인해서 발생할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 미토콘드리아 이상질환은 ND1(NADH dehydrogenase subunit 1), ND4(NADH dehydrogenase subunit 4), 및 ND6(NADH dehydrogenase subunit 6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 돌연변이로 발생할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 미토콘드리아 이상질환은 레버 유전성 시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy, LHON), MELAS(Mitochondrial Encephalopathy with Lactic acidosis and stroke-like episode)　증후군, 신경성 근육 위축(neurogenic muscle weakness), MERRF(Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fiber) 증후군, 미토콘드리아 뇌근병증(mitochondrial encephalomyopathy), 리 증후군(Leigh syndrome), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome), 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 프리드리히 보행실조, 알퍼 질환, 뇌졸중, 편두통, 정신병, 우울증, 발작, 치매, 중풍, 시신경위축, 시신경병증, 녹내장, 망막색소변성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근육병증, 근육위축, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신장기능부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구 빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경 난청, 정신지체, 간질, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 및 헌팅턴 질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 레버 유전성 시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy, LHON), MELAS(Mitochondrial Encephalopathy with Lactic acidosis and stroke-like episode)　증후군, 신경성 근육 위축(neurogenic muscle weakness), MERRF(Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fiber) 증후군, 미토콘드리아 뇌근병증(mitochondrial encephalomyopathy), 리 증후군(Leigh syndrome), 및 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 레버 유전성 시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy, LHON) 이었으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 레버 유전성 시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy, LHON)은 레버씨 시신경 위축증 등으로 불릴 수 있으며, 미토콘드리아의 ND1, ND4, 또는 ND6 mtDNA(mitochondria-DNA) 돌연변이로 인하여 미토콘드리아 내의 복합체 1(complex1)이 제대로 작동하지 않아 시신경계에 이상이 초래되어 실명하게 되는 질환을 의미한다.
본 발명의 조성물 내의 상기 본 발명의 벡터의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스,
카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 폴리에칠렌글리콜 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에칠렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 하기 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 재조합 AAV(Adeno-associated virus)의 제작
재조합 AAV(Adeno-associated virus)는 HEK293 세포에 벡터를 삼중 트랜스펙션(triple transfection)하여 제작한다. 구체적으로, 제1 벡터(pHelper 벡터)는 공통으로 포함되며, 제2 벡터(pRC 벡터)에 의해 서브타입(subtype)이 결정되며, 제3 벡터에 의해 단일 가닥 AAV(single-stranded AAV, ssAAV)와 자가 상보적인 AAV(Self-complementary AAV, scAAV)가 결정된다. 또한, 제3 벡터에 관심 유전자(gene of interest, GOI)를 포함하였다. 상기 pRC 벡터는 pAAV-DJ를 사용하였으며, 상기 관심 유전자는 GFP(Green fluorescent protein), IRES(internal ribosome entry site)-GFP, yeast NDi1(GenBank: X61590.1), 및 hydra NDi1(NCBI Reference Sequence: XM_002156815.3)을 사용하였다. 실험에 사용된 벡터의 개별지도는 도 1 및 2에 나타내었다.
상기 AAV 제작용 벡터는 모두 Cell Biolabs (San Diego, CA)에서 구입하였고 293 세포는 AAV-293(Agilent, Santa Clara, CA)을 사용하였다. 150 mm 디쉬(dish)에 293 세포를 약 90% 컨플루언스(confluence)로 배양한 후, 제1 벡터, 제2 벡터, 및 제3 벡터를 각각 20 ug, 10 ug, 및 10 ug의 비율로 잘 혼합한 뒤 CaCl2 용액과 섞은 다음 293 세포에 골고루 뿌려 주었다. 3일 후, 293 세포를 셀 스크래퍼(cell scraper)로 긁어모은 다음, AAVpro Purificatin Kit (Takara, San Jose CA)로 정제한 후 동 회사의 AAVpro Titration Kit로 역가 (titer)를 측정하였다. 그 후, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 2. scAAV의 유전자 발현 강도 및 안정성 확인
scAAV 및 ssAAV에 의한 유전자 발현의 강도 및 안정성을 확인하기 위해, scAAV-GFP 및 ssAAV-GFP를 섬유아세포에 감염시켜서 녹색 형광 발현 정도를 확인하였다. 이 때 도 3a에 나타낸 재조합 AAV를 사용하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, 12-웰 플레이트에 LHON 환자에서 유래한 피부섬유아세포(skin fibroblast cells)를 약 70% 컨플루언스(confluence)로 배양한 후, ssAAV-2/DJ-GFP 또는 scAAV-2/DJ-GFP를 각각 웰 당 약 109 viral genome(vg)씩 가하여 세포를 감염시켰다. 3일 후, 감염된 세포에서 각각의 재조합 AAV에 의한 GFP의 발현 정도를 도립 형광현미경으로 FITC filter하에서 관찰하였다. 그 결과는 도 3b에 나타내었다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, scAAV-GFP가 ssAAV-GFP보다 더 강하게 녹색 형광을 세포 내에서 발현시키는 것을 관찰할 수 있다. 이는 scAAV가 유전자를 안정적으로 발현시키고(stability), 유전자 발현 강도가 높다는 것을 의미한다.
실시예 3. scAAV-hydra NDi1의 세포호흡 복구 효과 확인
세포호흡 측정 전용 24-웰 플레이트에서 LHON 환자에서 유래한 피부섬유아세포를 약 50% 컨플루언스(confluence)로 배양한 후, ssAAV-IRES-GFP, ssAAV-yeast NDi1, ssAAV-hydra NDi1, 및 scAAV-hydra NDi1을 각각 웰 당 약 108 vg의 역가로 감염시켰다. 배양액 상태에서 OCR (oxygen consumption rate)은 복합체 1 특이적 억제제(complex I-specific inhibitor)인 로테논(rotenone)을 첨가함에 따라 급격히 감소하게 된다. 따라서, AAV 감염 6일 후, 세포에 로테논을 첨가하여 yeast NDi1, 및 hydra NDi1에 의한 세포호흡 감소 억제효과를 확인하였다. 세포호흡은 Agilent 社의 Seahorse XF-24를 이용하여 산소 소모율(oxygen consumption rate, OCR)의 측정을 통해 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, scAAV-hydra NDi1이 ssAAV-yeast NDi1에 비해 로테논에 의한 세포호흡의 감소를 보다 효율적으로 억제하였다.
실시예 4. scAAV-hydra Ndi1의 세포사멸 억제 효과 확인
24-웰 플레이트에서 LHON 환자의 피부섬유아 세포를 약 70% 컨플루언스로 배양한 후 ssAAV-IRES-GFP, ssAAV-yeast NDi1, ssAAV-hydra NDi1, 및 scAAV-hydra NDi1을 각각 웰 당 약 109 vg의 역가로 감염시켰다. 6일 후에 로테논을 처리하였고, 로테논 처리 1일 후부터 세포사멸을 관찰하기 시작하였다. 그 결과는 도 5a 내지 5d에 나타내었다. 세포의 사멸 여부는 개개 세포의 모양과 형태, 바닥에 부착한 정도, 및 인접 세포와의 접촉 강도 등을 종합적으로 고려하여 판단하였다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 로테논 처리 1일 후, 대조군인 untransduced 세포군 또는 ssAAV-IRES-GFP로 감염된 세포군은 5 nM의 로테논에서 일부 세포가 사멸하기 시작하였으나, ssAAV-yeast NDi1 또는 ssAAV-hydra NDi1으로 감염된 세포는 20 nM의 로테논에서 약간의 사멸을 보였다. 반면에, 같은 조건에서 scAAV-hydra NDi1으로 감염된 세포군은 사멸이 거의 관찰되지 않았다.
도 5b에 나타난 바와 같이, 로테논 처리 2일 후, untransduced 세포군 또는 ssAAV-IRES-GFP로 감염된 세포군은 5 nM의 로테논에서도 거의 모든 세포가 사멸하였으나, ssAAV-yeast NDi1 또는 ssAAV-hydra NDi1으로 감염된 세포는 20 nM의 로테논에서 약간의 사멸을 보였다. 반면에, 같은 조건에서 scAAV-hydra NDi1으로 감염된 세포군은 사멸이 거의 관찰되지 않았다.
도 5c에 나타난 바와 같이, 로테논 처리 3일 후, untransduced 세포군 또는 ssAAV-IRES-GFP로 감염된 세포군은 5 nM의 로테논에서 완전 사멸하였고, ssAAV-yeast NDi1 또는 ssAAV-hydra NDi1으로 감염된 세포는 10 nM의 로테논에서도 많이 사멸되기 시작하였다. 반면에, 같은 조건에서 scAAV-hydra NDi1으로 감염된 세포군은 20 nM의 로테논에서도 거의 사멸되지 않았다.
도 5d에 나타난 바와 같이, 로테논 처리 4일 후, ssAAV-yeast NDi1 또는 ssAAV-hydra NDi1으로 감염된 세포도 5 nM의 로테논에서 일부 사멸을 보였고, 10 nM에서는 거의 사멸하였다. 반면에, scAAV-hydra NDi1으로 감염된 세포군은 20 nM에서도 거의 사멸하지 않았다.
이는 scAAV-hydra NDi1이 ssAAV-hydra NDi1 및 ssAAV-yeast NDi1에 비해 미토콘드리아 복합체 1 이상에 의한 LHON 환자 유래 세포사멸 억제 효과가 현저히 우수하다는 것을 의미한다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 scAAV-hydra NDi1이 로테논에 의한 세포호흡 감소를 복구하는 효과, 및 로테논에 의한 LHON 환자 유래 세포의 사멸 억제 효과가 있음을 확인하였는바, 이를 LHON 뿐만 아니라 미토콘드리아 복합체 1에 이상으로 인해 발병하는 질병의 예방, 개선, 또는 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 hydra NDi1 유전자가 탑재된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 바이러스는 아데노부속바이러스(Adeno-associated virus)인, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 아데노부속바이러스는 자가 상보적인 AAV(Self-complementary AAV, scAAV)인, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 바이러스 벡터는 세포호흡 감소를 억제시키는, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 바이러스 벡터는 세포사멸을 억제시키는, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 이상질환은 ND1(NADH dehydrogenase subunit 1), ND4(NADH dehydrogenase subunit 4), 및 ND6(NADH dehydrogenase subunit 6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에 돌연변이가 있는 것인, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 이상질환은 레버 유전성 시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy, LHON), MELAS(Mitochondrial Encephalopathy with Lactic acidosis and stroke-like episode)　증후군, 신경성 근육 위축(neurogenic muscle weakness), MERRF(Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fiber) 증후군, 미토콘드리아 뇌근병증(mitochondrial encephalomyopathy), 리 증후군(Leigh syndrome), 및 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome)으로 이루어지는 군으로부터 선택된, 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 서열번호 1로 표시되는 hydra NDi1 유전자가 탑재된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 미토콘드리아 이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 미토콘드리아 이상질환을 예방 또는 치료하는 방법.
PCT/KR2024/009163 2023-06-30 2024-07-01 Hydra ndi1가 탑재된 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 포함하는, 미토콘드리아 복합체 1 이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Ceased WO2025005759A1 (ko)

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