WO2025005226A1 - 植物由来抽出液から植物由来可溶性タンパク質を除去する方法 - Google Patents

植物由来抽出液から植物由来可溶性タンパク質を除去する方法 Download PDF

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freezing
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幸毅 松尾
全人 松嶋
尚子 西田
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Chiyoda Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for removing plant-derived soluble proteins from a plant-derived extract.
  • the objective of the present invention is to provide a method for removing plant-derived soluble proteins present in large quantities from a plant-derived extract.
  • the present inventors centrifuged crude extracts of wild-type Nicotiana benthamiana and N. benthamiana transfected with a green fluorescent protein (GFP) gene, and separated them into a supernatant (S1) and a precipitate (P1). Furthermore, S1 was subjected to a freeze-thaw treatment, centrifuged, and separated into a supernatant (S2) and a precipitate (P2). The soluble proteins contained in S1 and S2 were then separated by SDS-PAGE, and the polyacrylamide gel was stained with Coomassie blue.
  • GFP green fluorescent protein
  • the inventors found that a short freezing treatment of about 10 minutes can remove a small amount of plant-derived soluble proteins, and a freezing treatment of 60 minutes can remove a sufficient amount of RuBisCO, that the present invention can be carried out even when GUS protein or human FGF1 is used as an exogenous protein, and that various plant-derived soluble proteins other than RuBisCO can be removed by freezing and thawing. From the above, it was revealed that freezing and thawing treatment insolubilizes plant-derived soluble proteins including RuBisCO, while not affecting the solubility of exogenous proteins such as GFP, GUS, or FGF1, and as a result, the two can be separated. In addition, the freezing time did not affect the above-mentioned effects. The inventors further studied based on these findings and completed the present invention.
  • a method for removing plant-derived soluble proteins from a plant-derived extract comprising the steps of: (1) a step of insolubilizing plant-derived soluble proteins by freezing and thawing a plant-derived extract, and (2) a step of removing the insolubilized proteins from the extract.
  • the method according to [1], wherein the plant-derived soluble protein comprises RuBisCO.
  • the method according to [1] or [2], wherein the plant is a plant belonging to the Nicotiana genus.
  • the method according to [3], wherein the Nicotiana plant is N. benthamiana.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the plant expresses an exogenous soluble protein that is not insolubilized by freezing and thawing.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the freezing period is one day or more.
  • the freezing temperature is ⁇ 20° C. or lower.
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein removal of insolubilized proteins from the extract is carried out by centrifugation or filtration.
  • Figure 1 shows a flow chart of the extraction process and the freeze-thaw process of N. benthamiana leaf samples.
  • S1 indicates the supernatant obtained by centrifuging the unfrozen crude extract
  • S2 indicates the supernatant obtained by centrifuging S1 after thawing after freezing for 1 or 7 days
  • S3 indicates the supernatant obtained by centrifuging the crude extract after thawing after freezing for 1 day.
  • M molecular weight marker
  • RuBisCO L is RuBisCO large subunit
  • RuBisCO S is RuBisCO small subunit
  • S1 is unfrozen supernatant
  • S3 is supernatant of crude extract frozen at -30°C for 10 or 60 min.
  • TSP Total Soluble Proteins
  • Figure 6 shows the effect of short-term freeze-thaw treatment on GFP function.
  • Figure 9 shows the effect of freeze-thaw treatment on GUS ( ⁇ -glucuronidase) protein.
  • Crude extracts from wild-type and three independent GUS-expressing leaves were frozen at -30°C for 60 min and then thawed.
  • A Proteins were separated by SDS-PAGE and detected by Coomassie blue staining (top) or Western blot (middle). The results of GUS staining are also shown (bottom).
  • B TSP concentration in the corresponding supernatant.
  • FIG. 10 shows the effect of freeze-thaw treatment on human FGF1 protein. Crude extracts from wild-type and three independent FGF1-expressing leaves were frozen at -30°C for 1 day and then thawed. (A) Proteins were separated by SDS-PAGE and detected by Coomassie blue staining (top) or Western blot (bottom).
  • Negative controls are "WT,” an extract obtained from uninfected plants, and "GFP," an extract obtained from leaves infected with Agrobacterium encoding GFP.
  • the positive control was human collagen type II protein derived from human tissue (indicated as “human COL2 (1 ⁇ g)”). M indicates molecular weight marker.
  • the present invention provides a method for removing plant-derived soluble proteins from a plant-derived extract (hereinafter, the removal method of the present invention).
  • the removal method of the present invention includes a step of insolubilizing plant-derived soluble proteins by freezing and thawing the plant-derived extract (hereinafter, step (1)).
  • the plant from which the plant-derived extract is extracted is not particularly limited, but is assumed to be a model plant for which cultivation techniques, breeding techniques or gene introduction techniques have been established, and examples of such plants include plants belonging to the genus Arabidopsis (e.g., Arabidopsis thaliana), the genus Oryza (e.g., Oryza sativa), the genus Triticum (e.g., Triticum aestivum), the genus Brachypodium (e.g., Brachypodium distachyon) and the genus Nicotiana (e.g., N. benthamiana).
  • the above-mentioned plants may be of the wild type or of a genetically modified type capable of expressing an exogenous soluble protein that is not insolubilized by the freezing and thawing in step (1).
  • the exogenous soluble protein that is not insolubilized by freezing and thawing is not limited as long as it is a soluble protein and is not insolubilized by freezing and thawing in step (1) described below.
  • a soluble protein refers to a protein that has many basic amino acid residues that are positively charged near a neutral pH, acidic amino acid residues that are negatively charged, or polar amino acid residues at the site that corresponds to the surface of the soluble protein, and is highly soluble in water because water molecules bind to the dissociable groups of the basic or acidic amino acid residues (ionic hydration) or hydrogen bonds are formed between polar groups (OH groups, etc.) and water molecules, thereby increasing the affinity with water molecules.
  • a protein that is not insolubilized by freezing and thawing refers to a protein in which the higher-order structure of the soluble protein does not change and insolubilization due to aggregation does not occur due to freezing and thawing.
  • exogenous soluble proteins include antibodies, cytokines (IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF, etc.), various enzymes, antigen proteins from viruses, bacteria, and cancers, extracellular matrix proteins such as collagen, cell signaling-related proteins, and high-value-added proteins such as albumin.
  • a part of a viral protein as an antigen, it is possible to mass-produce antigens that are useful in developing vaccines and antibodies against viruses. Alternatively, it is also possible to mass-produce cancer antigens that are useful in developing anticancer drugs.
  • Exogenous soluble proteins may be expressed either transiently or constitutively.
  • Means for expressing an exogenous soluble protein in a plant include a method of introducing an expression vector containing DNA encoding the exogenous soluble protein into plant cells, and a method of introducing the protein using a viral vector having a nucleic acid sequence encoding the exogenous soluble protein. Any known method may be used as long as it allows the exogenous soluble protein to be expressed in the plant cells by culturing the plant cells.
  • the introduction of an expression vector containing DNA encoding an exogenous soluble protein into a plant cell can be carried out by a method known per se, for example, in the form of an expression vector containing DNA encoding an exogenous soluble protein.
  • the introduction of the expression vector can be carried out according to a known method (for example, the Agrobacterium method, the PEG method, the electroporation method, the particle gun method, the whisker direct introduction method, etc.) into an appropriate tissue (e.g., callus, root, leaf, seed, growing point, etc.) according to the type of plant.
  • the Agrobacterium method is particularly preferred because it is easy to scale up.
  • an expression vector containing DNA encoding an exogenous soluble protein into a plant cell can also be carried out by using a viral vector having a nucleic acid sequence encoding the exogenous soluble protein.
  • the introduction of the viral vector can be carried out according to the viral vector method into the above-mentioned tissue according to the type of plant.
  • a foreign soluble protein is constitutively expressed in a plant
  • a part of tobacco tissue (e.g., tobacco leaf) or hypocotyl is cut off and infected with Agrobacterium, and the tissue or hypocotyl into which the expression vector has been introduced is cultured to select a genetically modified plant cell in which DNA encoding the foreign soluble protein has been introduced into the genome. Then, callus is induced from the cell, and roots are induced from the callus to obtain a genetically modified plant that stably expresses the foreign soluble protein.
  • Agrobacterium may be infected into the callus.
  • such Agrobacterium is one in which DNA encoding the foreign soluble protein has been introduced into the T-DNA fragment of an Agrobacterium expression vector.
  • PEG method or electroporation method protoplasts are prepared from appropriate cells or tissues according to standard methods, and the expression vector is introduced into the protoplast.
  • particle gun method an expression vector adsorbed to gold particles can be introduced into callus, immature embryos, shoot tips, axillary buds, or the like, using a particle gun.
  • the plants into which genes are introduced often become chimeras, so it is necessary to use sample cells for gene introduction that will introduce the above DNA into germ line cells at a high frequency. Examples include embryos, hypocotyl segments, embryogenic callus, and isolated meristems.
  • Plant cells or tissues into which an expression vector has been introduced can be cultured according to a known method depending on the type of plant cells or tissues.
  • the medium used for culture is preferably a solid medium (e.g., agar medium, agarose medium, gellan gum medium, etc.).
  • the medium also preferably contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances, etc. necessary for the growth of genetically modified cells.
  • N6 medium, MS medium, MSR medium, LS medium, B5 medium, etc. are used as basal media.
  • Plant growth substances e.g., auxins, cytokinins, etc.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to about 8.
  • the culture temperature can be selected appropriately within the range of usually about 20°C to about 35°C depending on the type of plant cells.
  • a person skilled in the art can select genetically modified plant cells by using a known method appropriate to the type of marker gene used. For example, when a drug resistance gene (e.g., a kanamycin resistance gene (nptII), a hygromycin resistance gene (hpt), or other drug resistance gene) is used, genetically modified plant cells can be selected by culturing in the presence of the corresponding drug.
  • a drug resistance gene e.g., a kanamycin resistance gene (nptII), a hygromycin resistance gene (hpt), or other drug resistance gene
  • Examples of methods for transiently expressing an exogenous soluble protein in a plant include immersing whole tobacco plants in a suspension of Agrobacterium, sealing them, and applying a reduced pressure (e.g., 0.09 MPa) (vacuum infiltration method), or infiltrating the Agrobacterium suspension into the intercellular spaces of leaves with a needleless syringe (syringe infiltration method). After treatment, tobacco tissue or whole tobacco plants are cultured for several days, making it possible to obtain plants that transiently express an exogenous soluble protein in the tobacco tissue infiltrated with Agrobacterium.
  • a reduced pressure e.g. 0.09 MPa
  • syringe infiltration method infiltrating the Agrobacterium suspension into the intercellular spaces of leaves with a needleless syringe
  • the plant-derived extract may be obtained by a known method.
  • the plant-derived extract refers to a suspension obtained by adding water or a buffer to a crushed plant tissue.
  • a plant extract can be prepared by crushing all or a part of a plant (roots, leaves, stems, or flowers) and suspending it in water or a buffer (e.g., Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, etc.).
  • the extract may further contain a surfactant (e.g., Triton X-100 TM , Tween 20 TM , etc.) or a proteolytic inhibitor.
  • the plant-derived extract obtained as described above contains soluble substances such as endogenous and exogenous soluble proteins, as well as insoluble substances such as debris. Therefore, the removal method of the present invention may further include a step of removing insoluble substances from the plant-derived extract before step (1).
  • the step of removing insoluble substances from the plant-derived extract is not particularly limited as long as it can remove the insoluble substances, but a preferred example is a step of removing insoluble substances from the plant-derived extract by centrifugation.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited as long as the conditions are such that the insoluble substances precipitate, but examples include about 10,000 to about 30,000 x g, about 2 to about 20 minutes, and about 0 to about 4°C.
  • Centrifugation is a simple and rapid method in that it has a good recovery rate of soluble substances, the centrifuge is a general-purpose device, the processing time is short, and the precipitate can be determined simply based on the molecular weight.
  • Another step of removing insoluble substances from the plant-derived extract is a step of removing insoluble substances by filtering the plant-derived extract.
  • the filtration membrane used for filtration is not particularly limited as long as it can filter insoluble substances, but examples include gauze, filter paper, etc.
  • the pore size of the filtration membrane is not particularly limited as long as it can filter insoluble substances, but examples include 10 ⁇ m to 700 ⁇ m.
  • the plant-derived extract is frozen.
  • the freezing conditions are not particularly limited as long as the extract is frozen, and examples of the freezing conditions include, but are not limited to, a range of -30°C to -20°C.
  • the freezing period is not limited as long as the plant-derived extract is frozen, and examples of the freezing period include, but are not limited to, a range of 10 minutes to 14 days.
  • the extract may be frozen instantaneously using liquid nitrogen.
  • the loss of biological activity may be avoided by shortening the freezing period.
  • the freezing period of the plant-derived extract may be, but is not limited to, usually 10 minutes to 12 hours, preferably 10 minutes to 11 hours, 10 minutes to 10 hours, 10 minutes to 9 hours, 10 minutes to 8 hours, 10 minutes to 7 hours, 10 minutes to 6 hours, 10 minutes to 5 hours, 10 minutes to 4 hours, 10 minutes to 3 hours, 10 minutes to 2 hours, or 10 minutes to 1 hour.
  • the frozen plant-derived extract is thawed.
  • the thawing conditions are not particularly limited as long as the frozen extract is thawed.
  • the thawing temperature can be, for example, 4°C.
  • RuBisCO is the only enzyme involved in the carbon dioxide fixation reaction in the Calvin cycle in the photosynthetic reaction of plants, and catalyzes the reaction of fixing carbon dioxide to ribulose 1,5-bisphosphate to produce two molecules of 3-phosphoglyceric acid.
  • RuBisCO is the protein most abundant in plants, and is the protein that is most removed in the process of purifying proteins other than RuBisCO from plants.
  • RuBisCO usually exists as a heterohexadecameric complex consisting of eight large subunits and eight small subunits, and exists as a soluble protein in the plant-derived extract. It is believed that the freezing and thawing treatment in step (1) changes the higher-order structure of the large subunits and small subunits of RuBisCO, or the heterohexadecameric complex composed of them, causing insolubilization.
  • the plant expresses an exogenous soluble protein that is not insolubilized by freezing and thawing
  • the exogenous soluble protein contained in the plant-derived extract is not insolubilized by the above-mentioned freezing and thawing, and the plant-derived soluble protein can be separated from the exogenous soluble protein.
  • the separation method of the present invention includes a step of removing insoluble proteins from the frozen and thawed plant-derived extract (hereinafter, step (2)).
  • the process for removing insoluble proteins from frozen and thawed plant-derived extracts is not particularly limited as long as it can remove insoluble proteins, but a preferred example is a process for removing insoluble proteins by centrifuging frozen and thawed plant-derived extracts.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they are conditions under which insoluble proteins are precipitated, but examples include about 10,000 to about 30,000 ⁇ g, about 2 to about 20 minutes, and about 0 to about 4 ° C. By removing the resulting precipitate, it is possible to separate the insoluble proteins from the plant-derived extracts.
  • Another process for removing insoluble proteins from frozen and thawed plant-derived extracts is a process for removing insoluble proteins by filtering frozen and thawed plant-derived extracts.
  • the filter membrane used for filtration is not particularly limited as long as it can filter insoluble proteins, but examples include gauze, filter paper, and the like.
  • the pore size of the filter membrane is not particularly limited as long as it can filter insoluble proteins, but examples include 10 ⁇ m to 700 ⁇ m. If the plant expresses an exogenous soluble protein that is not insolubilized by the freezing and thawing in step (1), it is possible to separate the insolubilized protein from the plant-derived extract and increase the proportion of the exogenous soluble protein in the soluble proteins contained in the plant-derived extract.
  • the recovered Agrobacterium was suspended in approximately 5-10 ml of suspension buffer (10 mM MES-KOH (pH 5.7), 10 mM MgCl 2 , 150 ⁇ M acetosyringone (added immediately before use)) and further diluted with the same suspension buffer to an OD 600 of 0.5.
  • the suspension was left to stand for about 2 hours, and then infiltrated into the underside of N. benthamiana leaves using a 1 mL syringe without a needle (syringe infiltration method). After roughly removing the suspension from the leaves, the leaves were left to stand for about 2 to 3 hours, and then grown in a chamber for 4 days (23°C, 16 hours light, 8 hours dark).
  • Leaves (100 mg) of wild-type N. benthamiana and leaves (100 mg) of N. benthamiana transfected with the GFP gene as described above were each disrupted using a multi-beads shocker (1,700 rpm, 30 sec), and the disrupted material was suspended in 500 ⁇ l of pH 7.2 phosphate buffer (0.1% (v/v) Tween 20, 1% (v/v) protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich #P9599)) to obtain crude extracts of each plant body.
  • the resulting crude extracts were centrifuged (23,000 ⁇ g, 10 min, 2°C) to obtain supernatants (S1) and precipitates (P1).
  • the results of Western blot analysis allowed a relative comparison of the amounts of GFP contained in the GFP gene-introduced S1 to S3.
  • the amount of GFP in S1 was set to 1, the amount of GFP remaining in S2 was more than 0.9 (Fig. 3A).
  • the results of Coomassie blue staining allowed a relative comparison of the amounts of RuBisCO contained in the GFP gene-introduced S1 to S3.
  • the amount of RuBisCO in S1 was set to 1, the amount in S2 was less than 0.1 (Fig. 3B).
  • the freeze-thaw treatment can simply and quickly insolubilize plant-derived soluble proteins from crude plant extracts, which can be easily precipitated and removed by centrifugation.
  • the freeze-thaw treatment can easily and dramatically improve the purification rate of the target soluble protein.
  • the same results were obtained without the need to previously centrifuge the crude plant extract and remove the insoluble fraction before carrying out the freeze-thaw treatment.
  • Example 2 Verification of the effect of freezing period on the separation of plant-derived soluble proteins and exogenous soluble proteins 1
  • wild-type N. benthamiana leaves (100 mg) and GFP-transfected N. benthamiana leaves (100 mg) were ground using a multi-beads shocker (1,700 rpm, 30 sec), and the ground material was suspended in 500 ⁇ l of phosphate buffer (containing 0.1% (v/v) Tween 20 and protease inhibitors) to obtain crude extracts of each plant.
  • the crude extracts were immediately centrifuged (23,000 ⁇ g, 10 min, 2°C) to obtain supernatant S1 and precipitate P1.
  • supernatant S1 was allowed to stand at -30°C (for 1 or 7 days), thawed in a refrigerator (4°C), and centrifuged (23,000 ⁇ g, 10 min, 2°C) to obtain supernatant S2 (frozen for 1 day), supernatant S2 (frozen for 7 days), and precipitate P2 (frozen for 1 day) and precipitate P2 (frozen for 7 days).
  • freezing treatment can insolubilize proteins, including RuBisCO, from crude plant extracts, allowing them to be easily removed by centrifugation, etc. It was also shown that when an exogenous soluble protein is expressed, freezing treatment can easily and dramatically improve the purification rate of the target soluble protein.
  • Example 3 Verification of the effect of freezing period on the separation of plant-derived soluble proteins and exogenous soluble proteins 2
  • the same experiment as in Example 2 was carried out, except that the crude extract was frozen for 10 or 60 minutes, to evaluate the effect of short-term freezing.
  • the results are shown in Figure 5.
  • Example 4 Verification of the effect of freezing temperature on the separation effect between plant-derived soluble proteins and exogenous soluble proteins The same experiment as in Example 3 was carried out except that the crude extract was frozen for 1 day at a freezing temperature of -20°C, and the effect of using a freezing temperature of -20°C was evaluated. The results are shown in Figures 7 and 8.
  • Example 5 Examination of the effect of freeze-thaw treatment on proteins other than GFP 1 (GUS) The effect of freeze-thaw treatment on transiently expressed GUS ( ⁇ -glucuronidase) was evaluated. Crude extracts from GUS-expressing leaves were frozen at -30°C for 60 min and thawed at 4°C. Western blot analysis confirmed GUS expression in all samples from S1 and S3, and GUS activity was detected in the supernatant (Fig. 9(a)). TSP was sufficiently reduced even after 60 min of freezing (Fig. 9(b)). This suggests that RuBisCO can be removed by a shorter freezing time without inactivating freeze-sensitive proteins.
  • GUS GFP 1
  • Example 6 Examination of the effect of freeze-thaw treatment on proteins other than GFP 2 (human FGF1) The effect of freeze-thaw treatment on transiently expressed human FGF1 was evaluated. Crude extracts from FGF1-expressing leaves were frozen at -30°C for 1 day and thawed at 4°C. FGF1 was detected by SDS-PAGE and Western blot analysis ( Figure 10(A)). ELISA analysis showed little change in the amount of FGF1 after freeze-thaw treatment ( Figure 10(B)).
  • Example 7 Examination of the effect of freeze-thaw treatment on proteins other than GFP 3 (Human Collagen II) The effect of freeze-thaw treatment on transiently expressed human Collagen II was evaluated. Crude extracts from leaves expressing human Collagen II were detected by Western blot analysis ( Figure 11). As a result, a band specific to human Collagen II was detected.
  • the separation and purification of exogenous soluble proteins expressed in plants required multiple reagents and multiple steps, but according to the present invention, by undergoing a freeze-thaw process, it is possible to remove plant-derived soluble proteins, including RuBisCO, a dominant protein in plants, by insolubilizing them, and it is possible to increase the proportion of exogenous soluble proteins upstream in the process of purifying them. As a result, it is possible to shorten the purification process of exogenous soluble proteins, and the present invention may be useful in the bioindustry field.

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Abstract

本発明は、以下の工程を含む、植物由来抽出液から植物由来可溶性タンパク質を除去する方法を提供する： （１）植物由来抽出液を凍結および融解することによって植物由来可溶性タンパク質を不溶化させる工程、および （２）該抽出液から不溶化タンパク質を除去する工程。

Description

植物由来抽出液から植物由来可溶性タンパク質を除去する方法
　本発明は、植物由来抽出液から植物由来可溶性タンパク質を除去する方法などに関する。
　植物、動物又は微生物等の生物を利用して物を生産する技術は、原料を化石資源に依存しないバイオマスからの物質生産が可能であるため、炭素循環型社会の実現や持続的経済成長を導くものづくりへの変革が期待されている。その中でも、遺伝子組換え技術を用いた植物による物質生産は、複雑な構造や高分子量のため生産が困難なタンパク質を発現できる可能性があり、医薬品分野、食品分野、ヘルスケア分野等での活用が有望視されているが、商業的な実績が未だ少なく、大量生産するための技術は確立されていない。特に、発現した目的タンパク質の分離精製においては、複数の試薬や多段階の操作が必要であり（特許文献１）、効率的な精製手法の需要は大きい。特に、植物由来抽出液中に大量に含まれるRuBisCOなどの植物由来可溶性タンパク質を効率的に除去できる精製手法の需要は大きい。
特許第6560495号公報
　本発明の課題は、植物由来抽出液からその中に大量に存在する植物由来可溶性タンパク質を除去するための方法を提供することである。
　本発明者らは、野生型Nicotiana benthamianaおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を導入したN. benthamianaの粗抽出物を遠心分離し、上清(S1)および沈殿(P1)に分けた。さらに、S1を凍結融解処理し、遠心分離し、上清(S2)および沈殿(P2)に分けた。その後、S1とS2に含まれる可溶性タンパク質をSDS-PAGEで分離し、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブルーで染色した。その結果、S1に大量に含まれていることが確認された植物由来可溶性タンパク質であるリブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（RuBisCO）が、S2においてほぼ消失していることが確認できた。同時に、遠心分離によって既にP1として沈殿物が除去されたS1を凍結融解処理および遠心分離することによって、新たに沈殿P2が生じたことから、これらがRuBisCOを含む新たな不溶性画分と考えられた。さらに、S1とS2に含まれるGFPの量をウェスタンブロットで解析したところ、凍結融解処理はGFPの可溶性に影響を与えず、上清に残り続けたことが明らかになった。
　加えて、発明者らは、10分間程度の短時間の凍結処理でも植物由来可溶性タンパク質を若干ながら除去可能であり、60分間の凍結処理であれば十分な量のRuBisCOの除去が可能となること、外来性タンパク質としてGUSタンパク質やヒトFGF1を用いた場合でも本発明を実施できること、RuBisCO以外にも多種の植物由来可溶性タンパク質が凍結融解処理により除去できることを見出した。以上より、凍結融解処理は、RuBisCOを含む植物由来可溶性タンパク質を不溶化させ、一方でGFP、GUS、又はFGF1等の外来性タンパク質の可溶性には影響を与えず、結果として両者を分離可能であることが明らかになった。また、凍結時間は上記の効果に影響を与えなかった。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］以下の工程を含む、植物由来抽出液から植物由来可溶性タンパク質を除去する方法：
（１）植物由来抽出液を凍結および融解することによって植物由来可溶性タンパク質を不溶化させる工程、および
（２）該抽出液から不溶化タンパク質を除去する工程。
［２］植物由来可溶性タンパク質がRuBisCOを含む、［１］に記載の方法。
［３］植物がタバコ属に属する植物である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］タバコ属植物がN. benthamianaである、［３］に記載の方法。
［５］植物が凍結および融解によって不溶化しない外来性の可溶性タンパク質を発現している、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］凍結期間が1日以上である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］凍結温度が-20℃以下である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］抽出液から不溶化タンパク質の除去が遠心分離または濾過によって行われる、［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］工程（１）の前に、植物由来抽出液から不溶性物質を除去する工程をさらに含む、［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］植物由来抽出液から不溶性物質の除去が遠心分離または濾過によって行われる、［９］に記載の方法。
　本明細書において説明される、植物由来抽出液からRuBisCOを含む植物由来可溶性タンパク質を分離する方法によれば、従来は植物で発現した外来性の可溶性タンパク質の分離精製においては、複数の試薬や多段階の操作が必要であったところ、凍結融解処理を経ることによって、植物においてドミナントなタンパク質であるRuBisCOを含む植物由来可溶性タンパク質を不溶化させることによって除去することが可能となり、外来性の可溶性タンパク質を精製する過程の上流においてその存在割合を高めることができる。結果として、外来性の可溶性タンパク質の精製工程を短縮化することが可能となり、本発明はバイオインダストリー分野において有用になりうる。
図１は、N. benthamianaの葉試料の抽出処理および凍結融解処理のフローチャートを示す。S1は未凍結の粗抽出物を遠心分離して得られる上清、S2はS1を1日または7日凍結後に融解したものを遠心分離して得られる上清、S3は1日凍結後に融解した粗抽出物を遠心分離して得られる上清をそれぞれ示す。 図２は、野生型N. benthamianaの葉およびGFP遺伝子が導入されたN. benthamianaの葉（n=3）の粗抽出物および上清を凍結融解処理に供した結果を示す。野生型およびGFP遺伝子導入型のS1～S3およびP1～P3を、可視光下（A）および青色LED下（B）で写真撮影した。(C) S1～S3中のタンパク質をSDS-PAGEで分離後、クマシーブルーで染色（上）またはウェスタンブロット解析（下）した。Mは分子量マーカー、RuBisCO LはRuBisCOラージサブユニット、RuBisCO SはRuBisCOスモールサブユニットをそれぞれ示す。 図３は、それぞれの上清に含まれるタンパク質の相対量を示す。(A)ウェスタンブロット解析から推定した組換えGFPの相対量を示す。p値（有意確率）はそれぞれ、S2について2.96×10-3、S3について2.42×10-3である。(B)RuBisCOの相対量は、クマシーブルー染色したポリアクリルアミドゲルのバンド強度から推定した。p値はそれぞれ、S2について3.01×10-4、S3について6.46×10-3であった。(C)クマシーブルー染色したポリアクリルアミドゲルのバンド強度から、総タンパク質の相対量を推定した。エラーバーは標準偏差を表す（n=3）。 図４は、野生型N. benthamianaの葉およびGFP遺伝子導入型N. benthamianaの葉（n=3）の抽出物の上清それぞれを凍結融解処理に供した結果を示す。野生型およびGFP遺伝子導入型のS1およびS2を、可視光線下（A）および青色LED下（B）で写真撮影した。(C)S1およびS2中のタンパク質をSDS-PAGEで分離後、クマシーブルーで染色（上）、またはウェスタンブロット解析（下）した。(D)S1、S2(凍結1日)およびS2(凍結7日)におけるGFPの相対量を示す。p値（有意確率）はそれぞれ、S2(凍結1日)について0.294、S2(凍結7日)について0.456であり有意差は無かった。Mは分子量マーカー、RuBisCO LはRuBisCOラージサブユニット、RuBisCO SはRuBisCOスモールサブユニットをそれぞれ示す。 図５は、短時間の凍結融解処理の効果を示す図である。野生型および3つの独立したGFP発現葉からの粗抽出物を-30℃で10分間または60分間凍結し、その後解凍した。(A)タンパク質SDS-PAGEで分離し、クマシーブルー染色（上）またはウェスタンブロット（下）で検出した。Mは分子量マーカー、RuBisCO LはRuBisCOラージサブユニット、RuBisCO SはRuBisCOスモールサブユニット、S1は未凍結上清、S3は-30℃で10分または60分間凍結した粗抽出液の上清を示す。(B)対応する上清中の全可溶性タンパク質（Total Soluble Proteins；「TSP」と称することがある）とGFPの濃度。 図６は、短時間の凍結融解処理のGFPの機能に対する影響を示す図である。GFP発現植物からのS1(未凍結)とS3(-30℃で10分または60分間凍結した粗汁液の上清)の相対GFP蛍光強度を示す。 図７は、凍結温度として-20℃を用いたときの凍結融解処理の効果を示す図である。野生型および3つの独立したGFP発現葉からの粗抽出物を-20℃で1日間凍結し、その後融解させた。(A）タンパク質をSDS-PAGEで分離し、クマシーブルー染色（上）またはウェスタンブロット（下）で検出した。Mは分子量マーカー、RuBisCO LはRuBisCOラージサブユニット、RuBisCO SはRuBisCOスモールサブユニット、S1は凍結していない上清、S3は、-20℃で1日間凍結した粗抽出物の上清をそれぞれ示す。(B）対応する上清中のTSPとGFPの濃度。 図８は、凍結温度として-20℃を用いたときの凍結融解処理のGFPの機能に対する影響を示す図である。GFP発現植物からのS1とS3の相対GFP蛍光強度を示す。S1は未凍結上清、S3は-20℃で1日凍結した粗抽出液の上清である。 図９は、GUS(β-glucuronidase)タンパク質に対する凍結融解処理の影響を示す図である。野生型および3つの独立したGUS発現葉の粗抽出物を-30℃で60分間凍結し、その後融解した。 (A）タンパク質はSDS-PAGEで分離し、クマシーブルー染色（上）またはウェスタンブロット（中）で検出した。GUS染色の結果も示す（下段）。(B）対応する上清中のTSP濃度。Mは分子量マーカー、RuBisCO LはRuBisCOラージサブユニット、RuBisCO SはRuBisCOスモールサブユニット、S1は未凍結上清、S3は-30℃で60分間凍結した粗抽出液の上清をそれぞれ示す。 図１０は、ヒトFGF1タンパク質に対する凍結融解処理の影響を示す図である。野生型および3つの独立したFGF1発現葉からの粗抽出物を-30℃で1日間凍結し、その後融解した。(A）タンパク質をSDS-PAGEで分離し、クマシーブルー染色（上）またはウェスタンブロット（下）で検出した。Mは分子量マーカー、RuBisCO LはRuBisCOラージサブユニット、RuBisCO Sは、RuBisCOスモールサブユニット、S1は凍結していない上清、S3は-30℃で1日間凍結した粗抽出液の上清をそれぞれ示す。(B)対応する上清中のTSPとFGF1の濃度。 図１１は、N. benthamianaによる一過性発現システムにより発現させたヒトII型Collagenタンパク質を抽出し、発現を確認した図である。各種設計したヒトII型Collagenをコードしたアグロバクテリウム（D, D2, F, F2, H, H2株；n=3）感染させた葉から得た粗抽出物を、非還元方式のSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットにてヒトII型Collagenを検出した。ネガティブコントロールは、未感染の植物から得た抽出物である「WT」と、GFPをコードしたアグロバクテリウムを感染させた葉から得た抽出物である「GFP」を示す。ポジティブコントロールは、ヒト組織由来のヒトII型Collagenタンパク質とした（「ヒトCOL2(1μg)」で示す）。Mは分子量マーカーを示す。 図１２は、ヒトII型Collagenタンパク質の凍結融解処理の適応を示した結果である。試料は、粗汁液を-30℃で2週間凍結し、その後融解後に遠心分離し得られた上清を分析した。図は、非還元方式のSDS-PAGEにより分離後、ウェスタンブロットにてヒトII型Collagenを検出した分析結果である。（図１１と同一条件にて準備した試料を凍結融解処理した；n=2）
　本発明は、植物由来抽出液から植物由来可溶性タンパク質を除去する方法（以下、本発明の除去方法）を提供する。
　本発明の除去方法は、植物由来抽出液を凍結および融解することによって植物由来可溶性タンパク質を不溶化させる工程（以下、工程（１））を含む。
　工程（１）において、植物由来抽出液が抽出される植物は、特に制限されるものではないが、栽培技術、育種技術または遺伝子導入技術が確立しているモデル植物が想定され、そのような植物としては、シロイヌナズナ属（例、Arabidopsis thaliana）、イネ属（例、Oryza sativa）、コムギ属（例、Triticum aestivum）、ヤマカモジグサ属（例、Brachypodium distachyon）、タバコ属（例、N. benthamiana）などに属する植物が挙げられる。また、上記の植物は野生型であってもよいし、工程（１）の凍結および融解によって不溶化しない外来性の可溶性タンパク質を発現できる遺伝子組換え型であってもよい。
　前記の凍結および融解によって不溶化しない外来性の可溶性タンパク質としては、可溶性タンパク質であって、かつ後述する工程（１）の凍結および融解によって不溶化しないタンパク質である限り制限されない。ここで、可溶性タンパク質とは、中性のpH付近において正電荷をもつ塩基性アミノ酸残基、負電荷をもつ酸性アミノ酸残基または極性アミノ酸残基を可溶性タンパク質の表面に当たる箇所に多く有し、塩基性または酸性アミノ酸残基の解離基に水分子が結合（イオン水和）すること、または極性基（OH基など）と水分子間に水素結合が形成されること、によって水分子との親和性が増し、水によく溶けるタンパク質をいう。塩基性アミノ酸としてはLys、Arg、Hisが挙げられる。酸性アミノ酸としてはGlu、Aspが挙げられる。極性アミノ酸としてはセリンやスレオニンなどが挙げられる。また、凍結および融解によって不溶化しないタンパク質とは、凍結および融解によって、可溶性タンパク質の高次構造が変化せず、凝集による不溶化が生じないタンパク質をいう。そのような外来性の可溶性タンパク質としては、例えば、抗体、サイトカイン（IFN-α、IFN-β、FGF等）、各種酵素、ウイルスや細菌・がんの抗原タンパク質、コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、細胞シグナル関連タンパク質、アルブミンなどの高付加価値のタンパク質が挙げられる。抗原として、例えばウイルスタンパク質の一部を用いることで、ウイルスに対するワクチンや抗体の開発の際に有用な抗原を大量生産することが可能となる。あるいは、抗がん剤の開発の際に有用ながん抗原を大量生産することもできる。
　外来性の可溶性タンパク質の発現は一過性発現であっても恒常的発現であってもよい。植物に外来性の可溶性タンパク質を発現させるための手段としては、外来性の可溶性タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを植物細胞に導入する方法、外来性の可溶性タンパク質コードする核酸配列を有するウイルスベクターを用いて導入する方法などが挙げられる。当該植物細胞を培養することによって、外来性の可溶性タンパク質を植物細胞内で発現させることができるものであれば、公知の方法に従ってよい。
　外来性の可溶性タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターの植物細胞への導入には、自体公知の方法によって行うことができるが、例えば、外来性の可溶性タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターの形態で導入することができる。発現ベクターの導入は、植物の種類に応じ、適当な組織（例、カルス、根、葉、種子、生長点等）に対し、公知の方法（例えば、アグロバクテリウム法、PEG法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイスカー直接導入法等）に従って実施することが可能である。その中でも、アグロバクテリウム法はスケールアップがしやすいことから特に好ましい。また、外来性の可溶性タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターの植物細胞への導入は、外来性の可溶性タンパク質コードする核酸配列を有するウイルスベクターを用いて導入することによっても可能である。ウイルスベクターの導入は、植物の種類に応じ、上記の組織に対し、ウイルスベクター法に従って実施することが可能である。
　外来性の可溶性タンパク質を植物に恒常的発現させる場合、例えば、タバコ組織（例：タバコ葉）や胚軸の一部を切り取ってアグロバクテリウムに感染させ、発現ベクターが導入された組織や胚軸を培養することによって外来性の可溶性タンパク質をコードするDNAがゲノムに導入された遺伝子組換え植物細胞を選別する。その後、該細胞からカルスを誘導し、カルスから発根を誘導することで、外来性の可溶性タンパク質を安定発現する遺伝子組換え植物を得ることができる。あるいは、カルスにアグロバクテリウムを感染させてもよい。かかるアグロバクテリウムとしては、典型的には、アグロバクテリウム発現用ベクターのT-DNA断片中に外来性の可溶性タンパク質をコードするDNAを導入したものを用いる。PEG法やエレクトロポレーション法を用いる場合は、適当な細胞や組織から常法に従ってプロトプラストを調製し、これに発現ベクターを導入する。パーティクルガン法の場合は、カルスや、未熟胚、茎頂や腋芽に存在する生長点等に、金微粒子に吸着させた発現ベクターを、パーティクルガンを用いて導入することができる。パーティクルガン法やアグロバクテリウム法では、遺伝子導入された植物がキメラとなる場合が多いので、生殖系列（germ line）の細胞に高頻度に上記DNAが導入されるような試料細胞を、遺伝子導入のために使用する必要がある。例えば、胚、胚軸切片、胚形成カルス（embryogenic callus）、単離した生長点等が挙げられる。
　発現ベクターが導入された植物細胞や組織の培養は、その種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。培養に使用される培地としては固形培地（例、寒天培地、アガロース培地、ゲランガム培地等）が好ましい。また、培地は、遺伝子組換え細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。例えば、基礎培地としてN6培地、MS培地、MSR培地、LS培地、B5培地などが用いられる。培地には、適宜、植物生長物質（例、オーキシン類、サイトカイニン類等）などを添加してもよい。培地のpHは好ましくは約5～約8である。培養温度は、植物細胞の種類に応じて、通常約20℃～約35℃の範囲内で適宜選択することが可能である。
　遺伝子組換え植物細胞の選抜は、当業者であれば用いるマーカー遺伝子の種類に合わせて適宜公知の手法により選択して行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子（例：カナマイシン耐性遺伝子（nptII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hpt）等の薬剤耐性遺伝子）を用いた場合には、対応する薬剤存在下にて培養することにより、遺伝子組換え植物細胞を選択することが可能である。
　外来性の可溶性タンパク質を植物に一過性発現させる場合、例えば、アグロバクテリウムが懸濁された懸濁液にタバコ全体を浸漬、密閉、減圧（例：0.09 MPa）処理する方法（バキュームインフィルトレーション法）、またはアグロバクテリウム懸濁液を針無しシリンジにより葉の細胞間隙に浸潤させる方法（シリンジインフィルトレーション法）が挙げられる。処理後、数日間タバコ組織やタバコ全体を培養することによって、アグロバクテリウムが浸潤したタバコ組織において外来性の可溶性タンパク質を一過性発現する植物を得ることが可能である。
　工程（１）において、植物由来抽出液の取得は、公知の手段に従って実施してよい。本発明において植物由来抽出液とは、「植物組織破砕物に水や緩衝液を加えて得られる懸濁液」をいう。例えば、植物の全部または一部（根、葉、茎または花）を破砕し、水または緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液など）に懸濁することによって植物抽出液を調製することができる。さらに抽出液には界面活性剤（例えば、トリトンX-100TM、ツイーン20TMなど）やタンパク質分解阻害剤が含まれていてもよい。
　以上の通りにして得られる植物由来抽出液は、内在性および外来性の可溶性タンパク質などの可溶性物質の他、破砕片などの不溶性物質を含む。従って、本発明の除去方法は、工程（１）の前に、植物由来抽出液から不溶性物質を除去する工程をさらに含んでもよい。植物由来抽出液から不溶性物質を除去する工程としては、不溶性物質を除去することができれば特に制限されないが、例えば、遠心分離によって、植物由来抽出液から不溶性物質を除去する工程が好ましく挙げられる。遠心分離の条件は、不溶性物質が沈殿する条件であれば特に制限されないが、例えば、約10,000～約30,000×g、約2～約20分、約0～約4℃などが挙げられる。遠心分離は、可溶性物質の回収率が良いこと、遠心分離機は汎用機器であること、処理時間が短いこと、単純に分子量に基づいて沈殿物を決定できることなど、簡便で迅速な方法である。また、植物由来抽出液から不溶性物質を除去する別の工程としては、植物由来抽出液を濾過することによって不溶性物質を除去する工程が挙げられる。濾過に使用する濾過膜としては、不溶性物質を濾過可能なものであれば特に制限されないが、例えば、ガーゼ、ろ紙などが挙げられる。濾過膜のポアサイズとしては、不溶性物質を濾過可能なサイズであれば特に制限されないが、例えば、10μｍ～700μｍなどが挙げられる。得られた沈殿を除去することによって、植物由来抽出液から不溶性物質を予め除去することが可能である。
　工程（１）において、植物由来抽出液は凍結処理される。凍結条件は、抽出液が凍結される限り特に制限されないが、例えば、-30℃～-20℃の範囲が挙げられるがこれらに限定されない。また、凍結期間は、植物由来抽出液が凍結する時間であれば制限されないが、例えば、10分間～14日間の範囲が挙げられる。あるいは、液体窒素を用いて瞬間的に抽出液を凍結させてもよい。
　一態様において、外来性の可溶性タンパク質が凍結によりその生物学的活性を一部または全部喪失する場合は、凍結期間を短くすることで生物学的活性の喪失を回避できる場合がある。かかる特性を有する外来性の可溶性タンパク質を用いる場合の植物由来抽出液の凍結期間は、通常10分間～12時間、好ましくは10分間～11時間、10分間～10時間、10分間～9時間、10分間～8時間、10分間～7時間、10分間～6時間、10分間～5時間、10分間～4時間、10分間～3時間、10分間～2時間または10分間～1時間とすることができるが、これに限定されない。
　工程（１）において、凍結処理された植物由来抽出液は融解される。融解条件は、凍結処理された抽出液が融解される限り特に制限されない。融解温度は、例えば4℃が挙げられる。
　以上のとおり、植物由来抽出液を凍結および融解させることによって、植物由来抽出液に含まれる植物由来可溶性タンパク質を不溶化させることが可能である。植物由来可溶性タンパク質としては、例えば、RuBisCO等が挙げられる。RuBisCOは、植物の光合成反応におけるカルビン回路において炭酸固定反応に関与する唯一の酵素であり、リブロース1,5-ビスリン酸に二酸化炭素を固定し2分子の3-ホスホグリセリン酸を生成する反応を触媒する。RuBisCOは植物に最も多く含有されるタンパク質であり、植物からRuBisCO以外のタンパク質を精製する過程において最も除去されるタンパク質である。RuBisCOは通常、8つのラージサブユニットと8つのスモールサブユニットからなるヘテロ16量体として存在し、植物由来抽出液に可溶性タンパク質として存在する。工程（１）の凍結および融解処理は、RuBisCOのラージサブユニット、スモールサブユニットまたはそれらから構成されるヘテロ16量体の高次構造を変化させ、不溶化させていると考えられる。なお、植物が凍結および融解によって不溶化しない外来性の可溶性タンパク質を発現する場合、上記の凍結および融解によっては、植物由来抽出液に含まれる該外来性の可溶性タンパク質は不溶化しないため、植物由来可溶性タンパク質と前記外来性の可溶性タンパクを分離することができる。
　本発明の分離方法は、上記の凍結および融解された植物由来抽出液から不溶化タンパク質を除去する工程（以下、工程（２））を含む。
　凍結および融解された植物由来抽出液から不溶化タンパク質を除去する工程としては、不溶化タンパク質を除去することができれば特に制限されないが、例えば、凍結および融解された植物由来抽出液を遠心分離することによって不溶化タンパク質を除去する工程が好ましく挙げられる。遠心分離の条件は、不溶化タンパク質が沈殿する条件であれば特に制限されないが、例えば、約10,000～約30,000×g、約2～約20分、約0～約4℃などが挙げられる。得られた沈殿を除去することによって、植物由来抽出液から不溶化タンパク質を分離することが可能である。また、凍結および融解された植物由来抽出液から不溶化タンパク質を除去する別の工程としては、凍結および融解された植物由来抽出液を濾過することによって不溶化タンパク質を除去する工程が挙げられる。濾過に使用する濾過膜としては、不溶化タンパク質を濾過可能なものであれば特に制限されないが、例えば、ガーゼ、ろ紙などが挙げられる。濾過膜のポアサイズとしては、不溶化タンパク質を濾過可能なサイズであれば特に制限されないが、例えば、10μｍ～700μｍが挙げられる。植物が工程（１）の凍結および融解によって不溶化しない外来性の可溶性タンパク質を発現している場合、植物由来抽出液から不溶化したタンパク質を分離し、植物由来抽出液中に含まれる可溶性タンパク質における外来性の可溶性タンパク質の存在割合を上昇させることが可能である。
　以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
　凍結融解処理による植物由来可溶性タンパク質と外来性可溶性タンパク質の分離効果の検証
　GFPを発現する植物発現用ベクター（GFP_pBE2113）を導入したアグロバクテリウムを、YEP培地（カナマイシン(50 μg/mL)、ストレプトマイシン(300 μg/mL)、リファンピシン(100 μg/mL)を含む）3 ml中で28℃、一晩、220 rpmで振盪培養した。培養液を5,000×g、10分、室温23℃で遠心することでアグロバクテリウムを回収した。回収したアグロバクテリウムを懸濁用バッファー（10 mM MES-KOH（pH 5.7）、10 mM MgCl2、150 μM アセトシリンゴン(使用直前に加える)）5～10 mL程度に懸濁し、さらにOD600＝0.5となるように同懸濁用バッファーで希釈した。懸濁液を2時間ほど静置し、針無し1 mLシリンジによってN. benthamianaの葉の裏側から浸潤させた（シリンジインフィルトレーション法）。おおまかに懸濁液を葉から除いた後、2～3時間程度静置し、チャンバー内で4日間育成（23℃、16時間明期、8時間暗期）した。
　野生型N.benthamianaの葉(100 mg)および上記の通りGFP遺伝子を導入したN. benthamianaの葉(100 mg)をそれぞれ、マルチビーズショッカーにより破砕(1,700 rpm, 30 sec)し、破砕物を500 μl、pH 7.2のリン酸緩衝液（0.1% (v/v) Tween 20, １％ (v/v) プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマアルドリッチ＃P9599））に懸濁し、それぞれの植物体の粗抽出物とした。得られた粗抽出物を遠心分離(23,000×g, 10 min, 2℃)し、上清(S1)および沈殿(P1)を得た。さらに、別途調製した上清(S1)を-30℃で静置(1日間)後に冷蔵庫内(4℃)で融解させ、遠心分離(23,000×g, 10 min, 2℃)し、上清(S2)および沈殿(P2)を得た。また、別途調製した粗抽出物を-30℃で静置(1日間)後に冷蔵庫内(4℃)で融解させ、遠心分離(23,000×g, 10 min, 2℃)し、上清(S3)および沈殿(P3)を得た。具体的には図１のフローチャートに従った。
　野生型およびGFP遺伝子を導入した植物体共に、粗抽出物を遠心分離することによって不溶性画分P1を除去したS1を凍結融解処理し、遠心分離した結果、新たな沈殿物P2が生じた（図２A）。このことから、凍結融解処理前に上清に残された可溶性物質の一部が、凍結融解処理によって不溶化したことが示唆された。
　また、青色LED下で上清の色の比較を行ったところ、野生型のS1～S3はいずれも蛍光を示さなかったが、GFP遺伝子を導入した植物体より得られたS1～S3は全てにGFP蛍光が観察され、S1（凍結融解処理前）とS2（凍結融解処理後）の蛍光強度は同程度であった（図２B）。このことから、凍結融解処理前には遠心分離によって沈殿せずに上清に残されたGFPは凍結融解処理によっても不溶化せずに上清に残り続けたこと、およびその結果、凍結融解処理によって不溶化した物質とGFPは分離できたことが示された。
　野生型およびGFP遺伝子を導入した植物体より得られたS1～S3に含まれるタンパク質をSDS-PAGEで分離後、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブルーで染色した。その結果、S1では、植物由来可溶性タンパク質であるRuBisCO（L/S）のバンド（約十数kDa（RuBisCO S）及び50 kDa(RuBisCO L））が検出されたが、S2およびS3では同バンドが検出されなかった（図２C）。また、GFPを含むS1～S3に含まれるGFPの量をウェスタンブロットで解析したところ、野生型のS1～S3からはいずれもGFPのバンドを検出することはできなかったが、GFP遺伝子導入型のS1～S3からは全てにGFPのバンドを検出し、そのバンド強度もS1～S3間で差が見られなかった。このことからも、凍結融解前には上清に残されたRuBisCO（L/S）が、凍結融解処理によって不溶化した一方、GFPは凍結融解処理によっても不溶化せずに上清に残り続け、結果として、凍結融解処理によってRuBisCO（L/S）とGFPは分離できたことが示された。
　さらに、ウェスタンブロット解析の結果から、GFP遺伝子導入型のS1～S3に含まれる各GFP量を相対的に比較した。その結果、S1におけるGFP量を１とした場合、S2におけるGFP量は0.9を超える量が残されていた（図３A）。一方、クマシーブルー染色の結果から、GFP遺伝子導入型のS1～S3に含まれる各RuBisCO量を相対的に比較した結果、S1におけるRuBisCO量を１とした場合、S2においては0.1未満となった（図３B）。さらにクマシーブルー染色の結果から、GFP遺伝子導入型のS1～S3に含まれる各総タンパク質量を相対的に比較した。その結果、S1における総タンパク質量を１とした場合、S2においては0.3未満となった（図３C）。これらの結果から、凍結融解処理を経ることによって、N. benthamianaの葉由来の粗抽出物からは総タンパク質の70％超が除去され、そのうちRuBisCOに限れば90％超が除去されていることが判明した。さらに、一過性に発現させた可溶性タンパク質であるGFPは、凍結融解処理の影響をほとんど受けず、上清に残ることも分かった。従って、凍結融解処理は、簡便かつ迅速に植物の粗抽出物から植物由来可溶性タンパク質を不溶化させ、遠心分離によって容易に沈殿させ、除去可能である。また、外来性の可溶性タンパク質を発現させている場合は、凍結融解処理は容易に目的の可溶性タンパク質の精製率を劇的に向上させることができる。また、凍結融解処理を実施する前に予め植物体の粗抽出物を遠心分離し、不溶性画分を除去するという操作を経ずとも同様の結果が得られた。
実施例２
　植物由来可溶性タンパク質と外来性可溶性タンパク質の分離効果に与える凍結期間の検証1
　実施例１と同様に、野生型N. benthamianaの葉(100 mg)およびGFP遺伝子を導入したN. benthamianaより得られた葉(100 mg)をそれぞれ、マルチビーズショッカーにより磨砕(1,700 rpm, 30 sec)し、破砕物を500 μlのリン酸緩衝液（0.1% (v/v) Tween 20, プロテアーゼ阻害剤入り）に懸濁し、それぞれの植物体の粗抽出物とした。得られた粗抽出物を間を置かず遠心分離(23,000×g, 10 min, 2℃)し、上清S1および沈殿P1を得た。また、上清S1を-30℃で静置(1また7日間)し、冷蔵庫内(4℃)で融解させ、遠心分離(23,000×g, 10 min, 2℃)し、上清S2（凍結１日）、上清S2（凍結７日）および沈殿P2（凍結１日）、沈殿P2（凍結７日）を得た。
　可視光下で沈殿の色の比較を行ったところ、野生型およびGFP遺伝子導入型共に、粗抽出物を遠心分離して得られるP1は緑色であるが、S1を遠心分離して得られるP2（凍結１日）、P2（凍結７日）は共に白色であり、差はみられなかった（図４A）。このことから、凍結期間は沈殿に影響を与えないことが示唆された。
　また、青色LED下で上清の色の比較を行ったところ、野生型のS1、S2（凍結１日）、S2（凍結７日）はいずれもGFP蛍光を示さなかったが、GFP遺伝子を導入した植物体より得たS1、S2（凍結１日）、S2（凍結７日）は全てに蛍光が観察され、それらの蛍光強度は同程度であった（図４B）。このことから、凍結期間はGFPの状態に影響を与えないことが示唆された。
　野生型およびGFP遺伝子導入型のS1、S2（凍結１日）、S2（凍結７日）に含まれるタンパク質をSDS-PAGEで分離後、クマシーブルー染色およびウェスタンブロット解析に供した。その結果、S1では、RuBisCO（L/S）のバンドが検出されたが、S2（凍結１日）およびS2（凍結７日）では同バンドが検出されなかった（図４C）。また、野生型のS1、S2（凍結１日）、S2（凍結７日）からはいずれもGFPのバンドを検出することはできなかったが、GFP遺伝子を導入した植物体より得たS1、S2（凍結１日）、S2（凍結７日）からは全てにGFPのバンドを検出し、そのバンド強度もS1、S2（凍結１日）、S2（凍結７日）の間で差が認められなかった。事実、ウェスタンブロット解析の結果から、GFP遺伝子導入型のS1、S2（凍結１日）、S2（凍結７日）に含まれる各GFP量を相対的に比較した結果、各GFP量に差は認められなかった。これらのことからも、凍結期間は沈殿やGFPの状態に影響を与えないことが示唆された。凍結処理によって、植物の粗抽出物からRuBisCOを含むタンパク質を不溶化させ、遠心分離等によって容易に除去できることが示された。また、外来性の可溶性タンパク質を発現させている場合は、凍結処理によって、容易に目的の可溶性タンパク質の精製率を劇的に向上させることが可能であることが示された。
実施例３
　植物由来可溶性タンパク質と外来性可溶性タンパク質の分離効果に与える凍結期間の検証2
　粗抽出物の凍結期間を10分間または60分間とする以外は実施例２と同様の実験を行い、短時間凍結の効果を評価した。結果を図５に示す。
　図５に示される通り、10分間の凍結は弱いながらもRuBisCOの除去効果を示した。また、60分間の凍結では、十分なRuBisCOの除去効果を示した。尚、この条件での凍結融解処理において、GFPには影響は見られなかった（図５（B）および図６）。
実施例４
　植物由来可溶性タンパク質と外来性可溶性タンパク質の分離効果に与える凍結温度の検証
　粗抽出物の凍結期間を1日、凍結温度を-20℃とする以外は実施例３と同様の実験を行い、凍結温度として-20℃を採用した場合の効果を評価した。結果を図７および図８に示す。
　図７および図８に示される通り、凍結温度を-20℃とした場合でも、凍結温度を-30℃とした場合と同様の結果が得られた。具体的には、上清中の全可溶性タンパク質（Total Soluble Proteins；「TSP」と称することがある）とRuBisCOの量は減少したが、GFPには影響は見られなかった。
実施例５
　GFP以外のタンパク質に対する凍結融解処理の影響の検討1(GUS)
　一過性に発現させたGUS(β-glucuronidase)に対する凍結融解処理の影響を評価した。GUS発現葉の粗抽出物を-30℃で60分間凍結し、4℃で解凍した。ウェスタンブロット分析の結果、S1とS3の全サンプルでGUSの発現が認められ、また、上清にGUS活性が検出された（図９(a)）。凍結60分間であってもTSPは十分に減少した（図９(b)）。これは、より短い凍結時間で、凍結感受性タンパク質を不活性化することなくRuBisCOを除去できることを示唆する。
実施例６
　GFP以外のタンパク質に対する凍結融解処理の影響の検討2(ヒトFGF1)
　一過性に発現させたヒトFGF1に対する凍結融解処理の影響を評価した。FGF1発現葉の粗抽出物を-30℃で1日間凍結し、4℃で解凍した。FGF1はSDS-PAGEとウェスタンブロット分析で検出した（図１０(A)）。ELISA分析では、凍結融解処理後のFGF1量にはほとんど変化が見られなかった（図１０(B)）。
実施例７
　GFP以外のタンパク質に対する凍結融解処理の影響の検討3(ヒトCollagen II)
　一過性に発現させたヒトCollagen IIに対する凍結融解処理の影響を評価した。ヒトCollagen II発現葉の粗抽出物をウェスタンブロット分析で検出した（図１１）。その結果、ヒトCollagen II特異的なバンドが検出された。
　ヒトCollagen II発現葉の粗抽出物を-30℃で2週間凍結後4℃で融解し、ヒトCollagen IIをウェスタンブロット分析で検出した（図１２）。その結果、凍結融解後でも凍結前の試料と同様にヒトCollagen II特異的なバンドが検出された。
実施例８
　プロテオーム解析
　凍結融解処理の影響を調べるため、野生型植物の凍結融解前後の上清のプロテオーム解析を行った。その結果、試験上清中に695個のタンパク質が同定された。3つのタンパク質の平均存在比は1以上であり、692のタンパク質の存在比は1未満であった。表1に、凍結融解後に量が減少した上位20位までのタンパク質を示す。表1に示すように、凍結融解処理後の上清液中の多くの内在性タンパク質量は、未凍結の上清液に比べて減少していた。特に、リボソームタンパク質は凍結融解処理後の上清液から効果的に除去された。尚、表中、Abundance Ratioは(abundance after freeze-thaw treatment)/(abundance before freeze-thaw treatment)を意味する。
　SDS-PAGE解析の結果、凍結融解後の上清液に含まれるRuBisCOの大サブユニットおよび小サブユニットの量は、未凍結の上清液と比較して著しく減少していた。凍結試料では、RuBisCOの大サブユニットと小サブユニットの平均存在比は、それぞれ未凍結上清溶液の約10%と20%に減少した（表2）。
　これらの値は、SDS-PAGEで観察されたバンド強度から推定された値よりも高かった。対照的に、凍結融解処理による影響がほとんどないタンパク質は15種類だけであった（それらの平均存在比は90％以上）（表3）。興味深いことに、同定されたタンパク質のほとんどは葉緑体型であった：A0A1U7YAD0（不活性型紫酸ホスファターゼ29アイソフォームX2）とA0A1S3XW44（GDSLエステラーゼ/リパーゼAPG-like）である（表3）。
　従来は植物で発現した外来性の可溶性タンパク質の分離精製においては、複数の試薬や多段階の操作が必要であったところ、本発明によれば、凍結融解処理を経ることによって、植物においてドミナントなタンパク質であるRuBisCOを含む植物由来可溶性タンパク質を不溶化させることによって除去することが可能となり、外来性の可溶性タンパク質を精製する過程の上流においてその存在割合を高めることができる。結果として、外来性の可溶性タンパク質の精製工程を短縮化することが可能となり、本発明はバイオインダストリー分野において有用になりうる。
　本出願は、日本で出願された特願２０２３－１０６９９５（出願日：２０２３年６月２９日）および特願２０２３－２００２１４（出願日：２０２３年１１月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (10)

  1. 　以下の工程を含む、植物由来抽出液から植物由来可溶性タンパク質を除去する方法：
    （１）植物由来抽出液を凍結および融解することによって植物由来可溶性タンパク質を不溶化させる工程、および
    （２）該抽出液から不溶化タンパク質を除去する工程。
  2. 　植物由来可溶性タンパク質がRuBisCOを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　植物がタバコ属に属する植物である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　タバコ属植物がNicotiana benthamianaである、請求項３に記載の方法。
  5. 　植物が凍結および融解によって不溶化しない外来性の可溶性タンパク質を発現している、請求項１または２に記載の方法。
  6. 　凍結期間が1日以上である、請求項１または２に記載の方法。
  7. 　凍結温度が-20℃以下である、請求項１または２に記載の方法。
  8. 　抽出液から不溶化タンパク質の除去が遠心分離または濾過によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
  9. 　工程（１）の前に、植物由来抽出液から不溶性物質を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 　植物由来抽出液から不溶性物質の除去が遠心分離または濾過によって行われる、請求項９に記載の方法。
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