WO2025004524A1 - 微量物質の分析方法および微量物質分析用キット - Google Patents

微量物質の分析方法および微量物質分析用キット Download PDF

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伽奈子 伊波
朱音 佐藤
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing trace substances and a kit for analyzing trace substances.
  • Patent Document 1 it was considered to improve detection sensitivity by combining enzyme immunoassay or nucleic acid probe assay with enzyme cycling to exponentially amplify thioNAD(P)H as a signal substance.
  • Patent Document 1 discloses an enzyme measurement method using an antibody-enzyme complex, in which the amount of a reaction product by the enzyme of the antibody-enzyme complex is quantified by generating thioNADH and/or thioNADPH through an enzyme cycling reaction using NADH and/or NADPH, thioNAD and/or thioNADP, and dehydrogenase (DH), and measuring the amount of the generated thioNADH and/or thioNADPH, or by measuring a color change due to the generated thioNADH and/or thioNADPH.
  • DH dehydrogenase
  • Patent Document 1 also discloses a nucleic acid probe measurement method using an enzyme-labeled nucleic acid probe, in which the enzymatic reaction products of the enzyme-labeled nucleic acid probe are quantified by generating thioNADH and/or thioNADPH through an enzyme cycling reaction using NADH and/or NADPH, thioNAD and/or thioNADP, and dehydrogenase (DH), and measuring the amount of the generated thioNADH and/or thioNADPH, or by measuring the color change due to the generated thioNADH and/or thioNADPH.
  • DH dehydrogenase
  • the present invention provides an analytical method that can shorten the time required to detect thioNAD(P)H produced in an enzyme cycling reaction.
  • a method for analyzing a trace substance comprising: A step A of binding, to the trace substance, an enzyme-labeled antibody consisting of an antibody specific to the trace substance and an enzyme ⁇ , or an enzyme-labeled nucleic acid probe consisting of a nucleic acid probe specific to the trace substance and an enzyme ⁇ ; a step B of allowing the enzyme ⁇ of the enzyme-labeled antibody or the enzyme ⁇ of the enzyme-labeled nucleic acid probe to act on a compound ⁇ that is a substrate of the enzyme ⁇ to generate a compound ⁇ that is a substrate of a dehydrogenase; A step C of generating polymerized thioNAD(P)H by an enzyme cycling reaction using the generated compound ⁇ , dehydrogenase, NAD(P)H, and polymerized thioNAD(P); A step D of
  • the trace substance is an antigen, 2.
  • the method for analyzing a trace substance according to 1. wherein in the step A, the enzyme-labeled antibody is bound to the antigen. 3.
  • the method for analyzing a trace substance according to 2. wherein the analysis is carried out on a carrier carrying an antibody specific to the antigen.
  • the method for analyzing a trace substance according to 2. wherein the method is carried out on a biological tissue section in which the antigen is present.
  • the method for analyzing a trace substance according to 2. wherein the analysis is carried out on a membrane in which the antigen is present. 6.
  • the trace substance is a nucleic acid, 2.
  • the method for analyzing a trace substance according to 1. wherein in the step A, the enzyme-labeled nucleic acid probe is bound to the nucleic acid.
  • the produced polymerized thioNAD(P)H is quantitatively analyzed.
  • the produced polymerized thioNAD(P)H is quantitatively analyzed based on absorbance.
  • the method for analyzing a trace substance according to any one of 1. to 7., wherein in the step D, the produced polymerized thioNAD(P)H is qualitatively analyzed. 11.
  • the enzyme ⁇ comprises one or more enzymes selected from the group consisting of transferases represented by EC numbers 2.-, hydrolases represented by EC numbers 3.-, elimination-addition enzymes represented by EC numbers 4.-, and isomerases represented by EC numbers 5.-.
  • the method for analyzing a trace substance according to 14. wherein the enzyme ⁇ includes alkaline phosphatase.
  • the compound ⁇ includes a compound having an androsterone skeleton.
  • An enzyme-labeled antibody consisting of an antibody specific to a trace substance to be measured and an enzyme ⁇ , or an enzyme-labeled nucleic acid probe consisting of a nucleic acid probe specific to the trace substance and an enzyme ⁇ ;
  • a trace substance analysis kit comprising: 21.
  • the trace substance is an antigen; 21.
  • the trace substance analysis kit according to 20. comprising the enzyme-labeled antibody. 22.
  • the kit for analyzing a trace substance according to 21. which is used on a carrier carrying an antibody specific to the antigen. 23.
  • the kit for analyzing a trace substance according to 21. which is used on a biological tissue section in which the antigen is present.
  • 24. The kit for analyzing a trace substance according to 21., which is used on a membrane on which the antigen is present.
  • 25. The kit for analyzing a trace substance according to any one of 21. to 24., wherein the antigen is a protein antigen.
  • 26. The trace substance is a nucleic acid; 21.
  • 27. The kit for analyzing a trace substance according to any one of 20.
  • the polymerized thioNAD (P) contains a structure derived from N 6 -carboxymethyl-thioNAD.
  • the present invention provides an analytical method that can shorten the time required to detect thioNAD(P)H produced in an enzyme cycling reaction.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing step A when the trace substance to be analyzed is an antigen.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing step A when the trace substance to be analyzed is a nucleic acid.
  • FIG. FIG. 1 is a graph showing the change in absorbance over time in Example 1 and Comparative Example 1.
  • NAD(P) means NAD and/or NADP
  • NAD(P)H means NADH and/or NADPH.
  • thioNAD(P) means thioNAD and/or thioNADP
  • thioNAD(P)H means thioNADH and/or thioNADPH.
  • polymerized thioNAD(P) means a polymer containing a unit derived from thioNAD(P) represented by the following general formula (1) (hereinafter referred to as a thioNAD(P) unit), and polymerized thioNAD(P)H means a polymer containing a unit derived from thioNAD(P)H represented by the following general formula (2) (hereinafter referred to as a thioNAD(P)H unit).
  • R 1 is a hydroxy group or a phosphate group.
  • general formula (1) represents a thioNAD unit.
  • R 1 in general formula (1) is a phosphate group
  • general formula (1) represents a thio-NADP unit.
  • R 1 in general formula (2) is a hydroxy group
  • general formula (2) represents a thio-NADH unit.
  • R 1 in general formula (2) is a phosphate group
  • general formula (2) represents a thio-NADPH unit.
  • the method for analyzing a trace substance of this embodiment includes the steps of: Step A of binding an enzyme-labeled antibody consisting of an antibody specific to the trace substance and enzyme ⁇ , or an enzyme-labeled nucleic acid probe consisting of a nucleic acid probe specific to the trace substance and enzyme ⁇ , to the trace substance; Step B of allowing the enzyme ⁇ of the enzyme-labeled antibody or the enzyme ⁇ of the enzyme-labeled nucleic acid probe to act on compound ⁇ , which is a substrate for enzyme ⁇ , to generate compound ⁇ , which is a substrate for dehydrogenase; Step C of generating polymerized thioNAD(P)H by an enzyme cycling reaction using the generated compound ⁇ , dehydrogenase, NAD(P)H, and polymerized thioNAD(P); and Step D of detecting the trace substance using the generated polymerized thioNAD(P)H.
  • Step A will be described separately for the case where the trace substance to be analyzed is an antigen and the case where the trace substance to be analyzed is a nucleic acid.
  • an enzyme-labeled antibody consisting of an antibody that specifically binds to the antigen to be analyzed and an enzyme ⁇ is prepared, and the antibody of the enzyme-labeled antibody is allowed to bind to the antigen to be analyzed, as shown in Figure 1.
  • an enzyme-labeled nucleic acid probe consisting of a nucleic acid probe that specifically binds to the nucleic acid to be analyzed and enzyme ⁇ is prepared, and the nucleic acid probe of the enzyme-labeled nucleic acid probe is allowed to bind to the nucleic acid to be analyzed, as shown in Figure 2.
  • step B as shown in Figure 3, enzyme ⁇ of the enzyme-labeled antibody or enzyme ⁇ of the enzyme-labeled nucleic acid probe is allowed to act on compound ⁇ , which is the substrate of enzyme ⁇ , to produce compound ⁇ , which is the substrate of dehydrogenase.
  • step C polymerized thioNAD(P)H is produced by an enzyme cycling reaction using the produced compound ⁇ , dehydrogenase, NAD(P)H, and polymerized thioNAD(P).
  • reduced compound ⁇ is the starting point of the enzyme cycling reaction
  • reduced compound ⁇ is oxidized to generate oxidized compound ⁇ .
  • polymerized thioNAD(P)H is generated from polymerized thioNAD(P).
  • oxidized compound ⁇ is reduced by dehydrogenase to generate reduced compound ⁇ .
  • NAD(P) is generated from NAD(P)H.
  • step D trace amounts of the target substance are detected using the polymerized thioNAD(P)H amplified in step C. Because the polymerized thioNAD(P)H is amplified in step C, highly sensitive analysis can be performed even if the target substance is in a trace amount.
  • the time required for detecting thio-NAD(P)H produced in the enzyme cycling reaction can be shortened.
  • the mechanism by which the time is shortened is not clear, it is presumed that the time shortening is possible due to the following mechanism.
  • the detection of a trace substance by thio-NAD(P)H will be explained.
  • the detection cannot be performed unless the concentration of thio-NAD(P)H reaches a certain level.
  • thio-NAD(P)H is easily diffused on a plate or in a living tissue, it takes time for the concentration of thio-NAD(P)H to reach a certain level at the detection point.
  • polymerized thio-NAD(P) is used. Therefore, it is considered that diffusion on a plate or in a biological tissue is suppressed, and the time required for the concentration of thio-NAD(P)H to reach a certain level or higher is shortened. This is considered to shorten the time required for the trace substances to be detected.
  • the antibody of the enzyme-labeled antibody is bound to an antigen, which is a trace substance to be analyzed, as shown in Figure 1.
  • the location where the analysis of a trace substance is carried out is not particularly limited, and for example, the analysis is carried out on a carrier carrying an antibody specific to an antigen.
  • An example of an analytical method performed on a carrier carrying an antibody specific to an antigen is the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • the ELISA method is a technique in which a sample solution is assayed on a carrier carrying an antibody, and the antigen in the sample solution is captured by the antibody, thereby detecting and quantifying the antigen.
  • the carrier for carrying the antibody is not particularly limited, and for example, a microplate, a plastic tube, or magnetic beads can be used.
  • the location where the analysis of the trace substance is carried out is not particularly limited, and for example, the analysis is carried out on a section of a biological tissue in which an antigen is present.
  • An example of an analysis method performed on a biological tissue section in which an antigen exists is the immunohistochemical staining method (IHC method).
  • the IHC method is a method for visualizing an antigen in situ on a biological tissue section.
  • the IHC method has the advantage that it can analyze the biological tissue while retaining its anatomical and structural information, and can analyze in which compartment of the biological tissue the antigen is localized.
  • the location where the analysis of the trace substance is carried out is not particularly limited, and for example, the analysis is carried out on a membrane where an antigen is present.
  • An example of an analytical method performed on a membrane in the presence of an antigen is the Western blot method, in which proteins separated by electrophoresis are transferred onto a membrane and the proteins are detected and quantified using antibodies specific to the proteins to be analyzed.
  • the type of antigen is not particularly limited, and may be any that can bind to an enzyme-labeled antibody, such as a protein, sugar, lipid, peptide, or low molecular weight compound that induces an immune response in the body, preferably a protein.
  • proteins and sugars include proteins and sugars bound to lipids and/or nucleic acids.
  • nucleic acid probe of the enzyme-labeled nucleic acid probe is bound to the nucleic acid, which is the trace substance to be analyzed.
  • Examples of analytical methods in which an enzyme-labeled nucleic acid probe binds to a nucleic acid, which is a trace substance to be analyzed include the Southern blot method and the Northern blot method.
  • the Southern blot method and the Northern blot method are techniques in which nucleic acids separated by electrophoresis are transferred to a membrane, and the nucleic acid to be analyzed is detected and quantified using a nucleic acid probe specific to the nucleic acid to be analyzed.
  • the subject of analysis in the Southern blot method is DNA
  • the subject of analysis in the Northern blot method is RNA.
  • step D the polymerized thioNAD(P)H produced is detected.
  • the detection method is not particularly limited, and for example, the polymerized thioNAD(P)H produced may be quantitatively analyzed.
  • the method for qualitative analysis of polymerized thioNAD(P)H is not particularly limited, and for example, the generated polymerized thioNAD(P)H can be qualitatively analyzed visually. As mentioned above, polymerized thioNAD(P)H absorbs in the visible range, so visual qualitative analysis is possible.
  • the structure of the polymerized thioNAD (P) is not particularly limited, but it is preferable that the polymerized thioNAD (P) contains a structure derived from N 6 -carboxymethyl-thioNAD represented by the following general formula (3), and it is more preferable that the polymerized thioNAD (P) contains a structure derived from thioNAD-N 6 -[N-(N-acryloyl-1-methoxycarbonyl-5-aminopentyl)-propioamide] represented by the following general formula (4).
  • R 1 is a hydroxy group or a phosphate group.
  • polymerized thioNAD(P) is not particularly limited, but it is preferable that polymerized thioNAD(P) contains a structure derived from acrylamide.
  • the method for preparing polymerized thioNAD(P) is not particularly limited, but it can be prepared by referring to the methods described in Non-Patent Documents 1 and 2.
  • the enzyme ⁇ of the enzyme-labeled antibody or enzyme-labeled nucleic acid probe is not particularly limited, but preferably contains one or more enzymes selected from the group consisting of the transferase group represented by EC number 2.-, the hydrolase group represented by EC number 3.-, the elimination-addition enzyme group represented by EC number 4.-, and the isomerase group represented by EC number 5.-, and more preferably contains alkaline phosphatase (ALP).
  • ALP alkaline phosphatase
  • compound ⁇ there are no particular limitations on compound ⁇ as long as it can be a substrate for enzyme ⁇ , but from the perspective of combination with dehydrogenase, which will be described later, it is preferable for it to contain a compound having an androsterone skeleton, and more preferably, it contains androsterone 3-phosphate (A3P).
  • A3P androsterone 3-phosphate
  • the dehydrogenase used in the enzyme cycling reaction of step C is not particularly limited, and may include, for example, one or more selected from group X consisting of malate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, galactose dehydrogenase, 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (abbreviated as 3 ⁇ -HSD), galactose dehydrogenase, glucose dehydrogenase, testosterone-17 ⁇ -dehydrogenase, and glycerol-3-phosphate dehydrogenase. From the viewpoint of improving the reaction rate, it is preferable to include hydroxysteroid dehydrogenase, and more preferably to include 3 ⁇ -HSD.
  • group X consisting of malate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, galactose dehydrogenase, 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (abbreviated as 3 ⁇ -
  • the combination of dehydrogenase and compound ⁇ is not particularly limited, but from the viewpoint of improving the reaction rate, a combination of 3 ⁇ -HSD and a compound having an androsterone skeleton as its substrate is preferred.
  • the reaction rate when thioNAD is used as a coenzyme is within a few percent of that when NAD is used, whereas in the dehydrogenation reaction of androsterone by 3 ⁇ -HSD, the reaction rate with thioNAD is approximately 59% of the reaction rate with NAD, which has favorable properties as an enzyme for the cycling reaction in this embodiment.
  • compounds having an androsterone skeleton include androsterone 3-phosphate (A3P), androsterone, 11 ⁇ -hydroxyandrosterone, 11-oxoandrosterone, 11 ⁇ -hydroxyandrosterone, etiocholanolone, tetrahydrocortisol, pregnanediol, lithocholic acid, deoxycholate, chenodeoxycholic acid, and cholic acid.
  • A3P and 3 ⁇ -HSD is preferred from the viewpoint that it can be combined with ALP, which is a versatile enzyme for an enzyme-labeled antibody or enzyme-labeled nucleic acid probe.
  • Compound ⁇ is not particularly limited as long as it can be a substrate for an enzyme cycling reaction using dehydrogenase. Therefore, it may be either a reduced substrate or an oxidized substrate.
  • the properties of the enzyme ⁇ , compound ⁇ , and dehydrogenase are not particularly limited, but it is preferable that they have the following properties.
  • the turnover rate of the labeling enzyme is high. Commercially available and widely used labeling enzymes can be used. The turnover number of the enzyme cycling is large.
  • the dehydrogenase used in the enzyme cycling reaction is not contaminated with the labeled enzyme or does not have the same activity as the labeled enzyme.
  • the substrate for the labeling enzyme is a commercially available compound or can be easily synthesized and is highly stable.
  • the concentration of the enzyme-labeled antibody or enzyme-labeled nucleic acid probe in the reaction system is not particularly limited, but is, for example, 1 nM or more, preferably 10 nM or more, more preferably 20 nM or more, and is, for example, 100 nM or less, preferably 50 nM or less, more preferably 40 nM or less.
  • the concentration of compound ⁇ in the reaction system is not particularly limited, but is, for example, 0.001 mM or more, preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.05 mM or more, and even more preferably 0.1 mM or more, and is, for example, 500 mM or less, preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, even more preferably 10 mM or less, even more preferably 5 mM or less, even more preferably 1 mM or less, and even more preferably 0.5 mM or less.
  • the concentration of NAD(P)H in the reaction system is not particularly limited, but is, for example, 0.001 mM or more, preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.05 mM or more, even more preferably 0.1 mM or more, even more preferably 0.5 mM or more, even more preferably 1.0 mM or more, and is, for example, 500 mM or less, preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, even more preferably 10 mM or less, even more preferably 5 mM or less.
  • the concentration of dehydrogenase in the reaction system is not particularly limited, but is, for example, 0.01 U/mL or more and 5000 U/mL or less, and from the viewpoint of improving the S/N ratio (signal/noise ratio), is preferably 0.1 U/mL or more and 500 U/mL or less, more preferably 1 U/mL or more and 100 U/mL or less, even more preferably 2 U/mL or more and 80 U/mL or less, even more preferably 5 U/mL or more and 60 U/mL or less, even more preferably 10 U/mL or more and 50 U/mL or less, and even more preferably 20 U/mL or more and 40 U/mL or less.
  • the amount of thioNAD(P) units in the reaction system is not particularly limited, but from the viewpoint of improving the S/N ratio (signal/noise ratio), for 100 ⁇ L of a 30 U/mL dehydrogenase solution, i.e., 3 U of dehydrogenase, the amount is, for example, 1.00 ⁇ 10 3 mer to 1.00 ⁇ 10 5 mer, preferably 2.00 ⁇ 10 3 mer to 8.00 ⁇ 10 4 mer, more preferably 5.00 ⁇ 10 3 mer to 5.00 ⁇ 10 4 mer, even more preferably 7.00 ⁇ 10 3 mer to 3.00 ⁇ 10 4 mer, even more preferably 1.50 ⁇ 10 4 mer to 2.80 ⁇ 10 4 mer, and even more preferably 2.00 ⁇ 10 4 mer to 2.40 ⁇ 10 4 mer.
  • the amount of thioNAD(P) units in the reaction system is represented by mer.
  • Mer is a unit representing the number of thioNAD(P) units in the reaction system.
  • the amount of thioNAD(P) units in the reaction system being 100mer means that the number of thioNAD(P) units in the reaction system is 100.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is, for example, 0°C or higher, preferably 10°C or higher, more preferably 20°C or higher, and is, for example, 100°C or lower, preferably 80°C or lower, more preferably 60°C or lower, and even more preferably 40°C or lower.
  • the number average molecular weight of the polymerized thioNAD(P) is not particularly limited, but from the viewpoint of further shortening the time required for detecting thioNAD(P)H produced in the enzyme cycling reaction, the number average molecular weight is preferably 1.0 ⁇ 10 4 or more and 1.0 ⁇ 10 9 or less, more preferably 5.0 ⁇ 10 4 or more and 5.0 ⁇ 10 8 or less, even more preferably 1.0 ⁇ 10 5 or more and 1.0 ⁇ 10 8 or less, even more preferably 6.5 ⁇ 10 5 or more and 7.0 ⁇ 10 7 or less, even more preferably 1.0 ⁇ 10 6 or more and 5.0 ⁇ 10 7 or less, even more preferably 5.0 ⁇ 10 6 or more and 3.0 ⁇ 10 7 or less, and even more preferably 1.0 ⁇ 10 7 or more and 2.0 ⁇ 10 7 or less.
  • the number average molecular weight of the polymerized thioNAD(P) can be analyzed, for example, by gel permeation chromatography (GPC).
  • the trace substance analysis kit of this embodiment includes an enzyme-labeled antibody consisting of an antibody specific to the trace substance to be measured and an enzyme ⁇ , or an enzyme-labeled nucleic acid probe consisting of a nucleic acid probe specific to the trace substance and an enzyme ⁇ , compound ⁇ which is a substrate for the enzyme ⁇ , a dehydrogenase, NAD(P)H, and polymerized thioNAD(P).
  • the trace substance analysis kit of this embodiment includes an enzyme-labeled antibody.
  • the trace substance to be analyzed is an antigen.
  • the use of the trace substance analysis kit of this embodiment is not particularly limited, and it is used, for example, on a carrier carrying an antibody specific to an antigen. Specifically, it is used in the ELISA method, etc.
  • the ELISA method is as described above.
  • the application of the trace substance analysis kit of this embodiment is not particularly limited, and it is used, for example, on a biological tissue section in which an antigen is present. Specifically, it is used in the IHC method, etc.
  • the IHC method is as described above.
  • the application of the trace substance analysis kit of this embodiment is not particularly limited, and it is used, for example, on a membrane where an antigen is present. Specifically, it is used in the Western blotting method, etc.
  • the Western blotting method is as described above.
  • the type of antigen is not particularly limited, and may be any that can bind to an enzyme-labeled antibody, such as a protein, sugar, lipid, peptide, or low molecular weight compound that induces an immune response in the body, preferably a protein.
  • proteins and sugars include proteins and sugars bound to lipids and/or nucleic acids.
  • the trace substance analysis kit of this embodiment includes an enzyme-labeled nucleic acid probe.
  • the trace substance to be analyzed is a nucleic acid.
  • the use of the trace substance analysis kit is not particularly limited, and it is used, for example, in the Southern blot method and the Northern blot method. The Southern blot method and the Northern blot method are as described above.
  • the structure of the polymerized thioNAD (P) is not particularly limited, but it is preferable that the polymerized thioNAD (P) contains a structure derived from N 6 -carboxymethyl-thioNAD represented by the above general formula (3), and it is more preferable that the polymerized thioNAD (P) contains a structure derived from thioNAD-N 6 -[N-(N-acryloyl-1-methoxycarbonyl-5-aminopentyl)-propioamide] represented by the above general formula (4).
  • polymerized thioNAD(P) is not particularly limited, but it is preferable that polymerized thioNAD(P) contains a structure derived from acrylamide.
  • the enzyme ⁇ of the enzyme-labeled antibody or enzyme-labeled nucleic acid probe is not particularly limited, but preferably contains one or more enzymes selected from the group consisting of the transferase group represented by EC number 2.-, the hydrolase group represented by EC number 3.-, the elimination-addition enzyme group represented by EC number 4.-, and the isomerase group represented by EC number 5.-, and more preferably contains alkaline phosphatase (ALP).
  • ALP alkaline phosphatase
  • compound ⁇ there are no particular limitations on compound ⁇ as long as it can be a substrate for enzyme ⁇ , but from the perspective of combination with the aforementioned dehydrogenase, it is preferable for it to contain a compound having an androsterone skeleton, and more preferably, it contains androsterone 3-phosphate (A3P).
  • A3P androsterone 3-phosphate
  • the dehydrogenase contained in the trace substance analysis kit of this embodiment is not particularly limited, and may, for example, include one or more types selected from the above-mentioned group X. From the viewpoint of improving the reaction rate as described above, it is preferable that it includes hydroxysteroid dehydrogenase, and more preferably that it includes 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ -HSD).
  • N 6 -carboxymethyl-thio NAD aqueous solution of iodoacetic acid (2.0 g) neutralized with 2 M LiOH, and the pH was adjusted to 6.5.
  • the amount of thioNAD and compounds synthesized from thioNAD are expressed in mer.
  • Mer is a unit representing the number of compounds synthesized from thioNAD and thioNAD.
  • adding 1.8 ⁇ 10 15 mer of thioNAD to the aqueous solution of iodoacetic acid means that the number of thioNAD added to the aqueous solution of iodoacetic acid is 1.8 ⁇ 10 15 .
  • the solution obtained in (1) above was diluted with the aqueous iodoacetic acid solution so that the amount of thio-NAD in the solution became 2.16 ⁇ 10 4 mer. To obtain 2.16 ⁇ 10 4 mer, the solution was diluted 1000-fold twice, 100-fold once, and 833-fold once. (3) The resulting solution was left to stand in the dark at room temperature for 10 days. The pH of the solution was appropriately checked and adjusted with 2 M LiOH.
  • the polymerized thioNAD obtained by the above method was analyzed by gel permeation chromatography (GPC) and found to have a number average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 7 .
  • the GPC measurement conditions are as follows. Measurement device: 1260 Infinity II Bio-SEC system (Agilent) Column: PLgel 20 ⁇ m MIXED-A (size: 300 mm ⁇ 7.5 mm ID, Agilent) ⁇ 4 Column temperature: 25 ° C. Mobile phase: dimethylformamide Flow rate: 1.0 mL/min Detector: RI (Differential Refractive Index Detector) Standard substance: Polystyrene D-H2-10 kit (Agilent)
  • Example 1 The following analysis subjects were analyzed using the following solution A by the following analytical method.
  • GRP78 solution Glucose-Regulated Protein 78 kDa solution (hereinafter referred to as GRP78 solution) (BSA: 0.1%, Tween 20: 0.02% in PBS) (Solution A) 100 ⁇ L of solution A containing the following components and having a pH of 9.0 was obtained.
  • Tris-HCl 100mM Polymerized thioNAD (total amount obtained in (30) above, amount of thioNAD unit: 2.16 ⁇ 10 4 mer) (Note that the amount of thioNAD unit was determined in Preliminary Experiment 2 below.) NADH (1.0mM) Androsterone 3-phosphate (A3P) (0.1mM) 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ -HSD) (30 U/mL) (The concentration of 3 ⁇ -HSD was determined in the preliminary experiment 1 described below.) (Analysis Method) A GRP78 solution was added to the microplate on which the anti-GRP78 antibody was immobilized, and the plate was incubated at 37° C. for 120 minutes.
  • the solution in the wells was removed by suction, the inside of the wells was washed with saline, and 100 ⁇ L of an anti-GRP78 antibody solution labeled with alkaline phosphatase (ALP) (BSA: 0.1%, Tween 20: 0.02% in PBS) was added and incubated at 37° C. for 60 minutes.
  • ALP alkaline phosphatase
  • the solution in the wells was removed by suction, the inside of the wells was washed with physiological saline, and then the entire amount of solution A (100 ⁇ L) was added to the wells.
  • Example 1 was 2.8, and the S/N ratio of Comparative Example 1 was 2.2. This shows that the analysis method of this embodiment can improve the S/N ratio.
  • Solution B 100 ⁇ L of solution B containing the following components and having a pH of 9.0 was obtained.
  • the entire amount of solution B (100 ⁇ L) was added to the wells, and while heating at 37° C., the absorbance was measured 5 minutes after the addition of solution B using a microplate reader (manufactured by Corona Electric Co., Ltd., model name: SH-1000, equipped with a 405 nm filter) to obtain a measured value A. If there was a significant difference between the measured value A and the blank value B, it was judged to be detectable, and the ALP concentration at the lowest ALP concentration among the detectable values was taken as the detection limit. The presence or absence of a significant difference was judged by the following method. First, the average value B AVE and standard deviation B SD of the blank value B were calculated.
  • the reference value B X was calculated by the following formula (1).
  • the reference value B X was compared with the measured value A, and if the values were different, it was judged that there was a significant difference.
  • B X B AVE + B SD ⁇ 3 (1)
  • the detection limit thus obtained was 2.24 ⁇ 10 ⁇ 20 mol/100 ⁇ L.
  • the detection limit was obtained by the following method using the following solution C.
  • Solution C 100 ⁇ L of TMB substrate solution (Thermodix) was prepared.
  • method 100 ⁇ L of an HRP solution at pH 9.0 (HRP: 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 , 0.5 ⁇ 10 ⁇ 8 , 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or 0.5 ⁇ 10 ⁇ 9 /100 ⁇ L, Tris-HCl: 100 mM) was added to the microplate.
  • the entire amount of solution C (100 ⁇ L) was added to the wells, and while heating at 37° C., the absorbance was measured 10 minutes after the addition of solution C using a microplate reader (manufactured by Corona Electric Co., Ltd., model name: SH-1000, equipped with a 405 nm filter) to obtain a measurement value A. If there was a significant difference between the measured value A and the blank value B, it was judged to be detectable, and the HRP concentration at the lowest among the detectable values was taken as the detection limit. The presence or absence of a significant difference was judged by the method described above. The detection limit thus obtained was 4.31 ⁇ 10 ⁇ 12 mol/100 ⁇ L.
  • the detection limit value of Reference Example 1 was approximately 1/108 of the detection limit value of Reference Comparative Example 1, which is an analysis method using HRP that is common in conventional IHC methods. From this, it is considered that the detection sensitivity can be improved by applying the analysis method according to this embodiment to the IHC method.

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Abstract

微量物質の分析方法であって、前記微量物質に、前記微量物質に特異的な抗体と酵素αとからなる酵素標識抗体、または、前記微量物質に特異的な核酸プローブと酵素αとからなる酵素標識核酸プローブを結合させる工程Ａと、前記酵素標識抗体の前記酵素α、または、前記酵素標識核酸プローブの前記酵素αを、前記酵素αの基質である化合物βに作用させ、デヒドロゲナーゼの基質である化合物γを生成させる工程Ｂと、生成した前記化合物γと、デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）と、を用いて、酵素サイクリング反応により、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる工程Ｃと、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより、前記微量物質を検知する工程Ｄと、を含む、微量物質の分析方法。

Description

微量物質の分析方法および微量物質分析用キット
　本発明は、微量物質の分析方法および微量物質分析用キットに関する。
　タンパク質や核酸などの生体高分子を高感度に分析する方法として、酵素免疫測定法、ならびに、サザンブロット法、ノーザンブロット法およびウエスタンブロット法などの核酸プローブ測定法などが挙げられる。これらの分析方法においては、検出感度の向上が求められており、様々な検討がおこなわれてきた。
　特許文献１では、酵素免疫測定法または核酸プローブ測定法と酵素サイクリング法を組み合わせ、シグナル物質としてのチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを幾何級数的に増幅することで、検出感度を向上させることが検討された。
　特許文献１には、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量は、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤおよび／またはチオＮＡＤＰ、並びにデヒドロゲナーゼ（ＤＨ）を用いて、酵素サイクリング反応によりチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨを生成させ、生成したチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨの量を測定するか、または生成したチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨによる色の変化を計測することで行う、前記方法が開示されている。
　また、特許文献１には、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤおよび／またはチオＮＡＤＰ、並びにデヒドロゲナーゼ（ＤＨ）を用いて、酵素サイクリング反応によりチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨを生成させ、生成したチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨの量を測定するか、または生成したチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨによる色の変化を計測することで行う、前記方法が開示されている。
国際公開第２００８／１１７８１６号
Lindberg M, Larsson PO, Mosbach K. A new immobilized NAD+ analogue, its application in affinity chromatography and as a functioning coenzyme. Eur J Biochem. 1973 Dec 3;40(1):187-93. Muramatsu M, Urabe I, Yamada Y, Okada H. Synthesis and kinetic properties of a new NAD+ derivative carrying a vinyl group. Eur J Biochem. 1977 Oct 17;80(1):111-7.
　特許文献１に記載された測定方法においては、酵素サイクリング反応で生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが検知されるまでに要する時間の短縮が求められている。
　本発明は、酵素サイクリング反応で生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが検知されるまでに要する時間を短縮することが可能な分析方法を提供する。
　すなわち、本発明によれば、以下に示す微量物質の分析方法および微量物質分析用キットが提供される。
１．　微量物質の分析方法であって、
　前記微量物質に、前記微量物質に特異的な抗体と酵素αとからなる酵素標識抗体、または、前記微量物質に特異的な核酸プローブと酵素αとからなる酵素標識核酸プローブを結合させる工程Ａと、
　前記酵素標識抗体の前記酵素α、または、前記酵素標識核酸プローブの前記酵素αを、前記酵素αの基質である化合物βに作用させ、デヒドロゲナーゼの基質である化合物γを生成させる工程Ｂと、
　生成した前記化合物γと、デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）と、を用いて、酵素サイクリング反応により、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる工程Ｃと、
　生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより、前記微量物質を検知する工程Ｄと、
を含む、微量物質の分析方法。
２．　前記微量物質が抗原であり、
　前記工程Ａにおいて、前記抗原に、前記酵素標識抗体を結合させる、１．に記載の微量物質の分析方法。
３．　前記抗原に特異的な抗体を担持させた担体上でおこなわれる、２．に記載の微量物質の分析方法。
４．　前記抗原が存在する生体組織切片上でおこなわれる、２．に記載の微量物質の分析方法。
５．　前記抗原が存在する膜上でおこなわれる、２．に記載の微量物質の分析方法。
６．　前記抗原がタンパク質抗原である、２．～５．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
７．　前記微量物質が核酸であり、
　前記工程Ａにおいて、前記核酸に、前記酵素標識核酸プローブを結合させる、１．に記載の微量物質の分析方法。
８．　前記工程Ｄにおいて、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量分析する、１．～７．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
９．　前記工程Ｄにおいて、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを吸光度により定量分析する、８．に記載の微量物質の分析方法。
１０．　前記工程Ｄにおいて、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定性分析する、１．～７．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
１１．　前記工程Ｄにおいて、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを目視により定性分析する、１０．に記載の微量物質の分析方法。
１２．　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が、Ｎ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤ由来の構造を含む、１．～１１．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
１３．　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が、アクリルアミド由来の構造を含む、１．～１２．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
１４．　前記酵素αが、ＥＣ番号２．－で表される転移酵素群、ＥＣ番号３．－で表される加水分解酵素群、ＥＣ番号４．－で表される除去付加酵素群およびＥＣ番号５．－で表される異性化酵素群からなる群から選択される一種又は二種以上を含む、１．～１３．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
１５．　前記酵素αがアルカリホスファターゼを含む、１４．に記載の微量物質の分析方法。
１６．　前記化合物βがアンドロステロン骨格を有する化合物を含む、１．～１５．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
１７．　前記デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含む、１．～１６．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
１８．　前記化合物γがアンドロステロン骨格を有する化合物を含む、１．～１７．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
１９．　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の数平均分子量が１．０×１０４以上１．０×１０９以下である、１．～１８．のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
２０．　測定対象の微量物質に特異的な抗体と酵素αとからなる酵素標識抗体、または、前記微量物質に特異的な核酸プローブと酵素αとからなる酵素標識核酸プローブと、
　前記酵素αの基質である化合物βと、
　デヒドロゲナーゼと、
　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）と、
を含む微量物質分析用キット。
２１．　前記微量物質が抗原であり、
　前記酵素標識抗体を含む、２０．に記載の微量物質分析用キット。
２２．　前記抗原に特異的な抗体を担持させた担体上で用いられる、２１．に記載の微量物質分析用キット。
２３．　前記抗原が存在する生体組織切片上で用いられる、２１．に記載の微量物質分析用キット。
２４．　前記抗原が存在する膜上で用いられる、２１．に記載の微量物質分析用キット。
２５．　前記抗原がタンパク質抗原である、２１．～２４．のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
２６．　前記微量物質が核酸であり、
　前記酵素標識核酸プローブを含む、２０．に記載の微量物質分析用キット。
２７．　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が、Ｎ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤ由来の構造を含む、２０．～２６．のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
２８．　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が、アクリルアミド由来の構造を含む、２０．～２７．のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
２９．　前記酵素αが、ＥＣ番号２．－で表される転移酵素群、ＥＣ番号３．－で表される加水分解酵素群、ＥＣ番号４．－で表される除去付加酵素群およびＥＣ番号５．－で表される異性化酵素群からなる群から選択される一種又は二種以上を含む、２０．～２８．のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
３０．　前記酵素αがアルカリホスファターゼを含む、２９．に記載の微量物質分析用キット。
３１．　前記化合物βがアンドロステロン骨格を有する化合物を含む、２０．～３０．のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
３２．　前記デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含む、２０．～３１．のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
３３．　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の数平均分子量が１．０×１０４以上１．０×１０９以下である、２０．～３２．のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
　本発明によれば、酵素サイクリング反応で生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが検知されるまでに要する時間を短縮することが可能な分析方法を提供することができる。
分析対象の微量物質が抗原である場合の工程Ａを示す模式図である。 分析対象の微量物質が核酸である場合の工程Ａを示す模式図である。 工程Ｂを示す模式図である。 工程Ｃを示す模式図である。 実施例１と比較例１の経時の吸光度変化を示すグラフである。
　以下、本発明を実施形態に基づいて説明する。
　本実施形態において、数値範囲が段階的に記載されている場合、各数値範囲の上限及び下限は任意に組み合わせることができる。
　本実施形態において、ＮＡＤ（Ｐ）はＮＡＤおよび／またはＮＡＤＰを意味し、ＮＡＤ（Ｐ）ＨはＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを意味する。
　本実施形態において、チオＮＡＤ（Ｐ）はチオＮＡＤおよび／またはチオＮＡＤＰを意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）ＨはチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨを意味する。
　本実施形態において、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）は、下記の一般式（１）で表されるチオＮＡＤ（Ｐ）由来のユニット（以下、チオＮＡＤ（Ｐ）ユニットと呼ぶ）を含むポリマーを意味し、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、下記の一般式（２）で表されるチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来のユニット（以下、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈユニットと呼ぶ）を含むポリマーを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　一般式（１）および（２）において、Ｒ１はヒドロキシ基またはリン酸基である。
　一般式（１）においてＲ１がヒドロキシ基である場合、一般式（１）はチオＮＡＤユニットを表す。
　一般式（１）においてＲ１がリン酸基である場合、一般式（１）はチオＮＡＤＰユニットを表す。
　一般式（２）においてＲ１がヒドロキシ基である場合、一般式（２）はチオＮＡＤＨユニットを表す。
　一般式（２）においてＲ１がリン酸基である場合、一般式（２）はチオＮＡＤＰＨユニットを表す。
［微量物質の分析方法］
　以下、本実施形態の微量物質の分析方法について説明する。
　本実施形態の微量物質の分析方法は、前記微量物質に、前記微量物質に特異的な抗体と酵素αとからなる酵素標識抗体、または、前記微量物質に特異的な核酸プローブと酵素αとからなる酵素標識核酸プローブを結合させる工程Ａと、前記酵素標識抗体の前記酵素α、または、前記酵素標識核酸プローブの前記酵素αを、前記酵素αの基質である化合物βに作用させ、デヒドロゲナーゼの基質である化合物γを生成させる工程Ｂと、生成した前記化合物γと、デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）と、を用いて、酵素サイクリング反応により、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる工程Ｃと、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより、前記微量物質を検知する工程Ｄと、を含む。
　まず、本実施形態の微量物質の分析方法の各工程について説明する。
　工程Ａについて、分析対象の微量物質が抗原である場合と分析対象の微量物質が核酸である場合に分けて説明する。
　分析対象の微量物質が抗原である場合、分析対象である抗原に特異的に結合する抗体と酵素αからなる酵素標識抗体を用意し、図１に示すように、当該酵素標識抗体の抗体を分析対象である抗原に結合させる。
　分析対象の微量物質が核酸である場合、分析対象である核酸に特異的に結合する核酸プローブと酵素αからなる酵素標識核酸プローブを用意し、図２に示すように、当該酵素標識核酸プローブの核酸プローブを分析対象である核酸に結合させる。
　工程Ｂでは、図３に示すように、酵素標識抗体の酵素α、または、酵素標識核酸プローブの酵素αを酵素αの基質である化合物βに作用させ、デヒドロゲナーゼの基質である化合物γを生成させる。
　工程Ｃでは、図４に示すように、生成した化合物γと、デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）と、を用いて、酵素サイクリング反応により、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる。
　具体的には、還元型の化合物γが酵素サイクリング反応の起点となる場合、まず、還元型の化合物γが酸化され酸化型の化合物γが生成する。この際、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）からポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される。そして、酸化型の化合物γがデヒドロゲナーゼにより還元され還元型の化合物γが生成する。この際、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）が生成される。これで酵素サイクリングの１サイクルが完結する。ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈが供給される限り、このサイクルが繰り返され、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが増幅される。
　工程Ｄでは、工程Ｃで増幅されたポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより分析対象の微量物質を検知する。工程Ｃでポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが増幅されるため、分析対象が微量であっても高感度の分析をおこなうことができる。
　本実施形態の微量物質の分析方法によると、酵素サイクリング反応で生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが検知されるまでに要する時間を短縮できる。時間短縮のメカニズムは明らかではないが、以下のメカニズムにより時間短縮が可能になると推測される。
　まず、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈによる微量物質の検知について説明すると、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより微量物質を検知する場合、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが一定以上の濃度にならないと検知をおこなうことができない。そのため、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈがプレート上や生体組織上で拡散しやすいと、検知をおこなう地点においてチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度が一定以上になるまでに時間がかかってしまう。
　本実施形態の微量物質の分析方法においては、ポリマー化したチオＮＡＤ（Ｐ）を用いる。そのため、プレート上や生体組織上における拡散が抑制されると考えられ、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度が一定以上になるまでに要する時間が短縮されると考えられる。これにより、微量物質が検知されるまでに要する時間が短縮されると考えられる。
　以下、本実施形態の微量物質の分析方法のうち、酵素標識抗体を用いる場合について説明する。
　酵素標識抗体を用いる場合、図１に示すように、酵素標識抗体の抗体を分析対象の微量物質である抗原に結合させる。
　微量物質の分析をおこなう場所は特に限定されず、例えば、抗原に特異的な抗体を担持させた担体上でおこなわれる。
　抗原に特異的な抗体を担持させた担体上でおこなわれる分析方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を挙げることができる。ＥＬＩＳＡ法は、抗体を担持させた担体に試料溶液をアッセイし、試料溶液中の抗原を抗体で捕捉することにより、抗原の検出および定量をおこなう手法である。
　抗体を担持させる担体は特に限定されず、例えば、マイクロプレート、プラスチックチューブまたは磁気ビーズ等を用いることができる。
　微量物質の分析をおこなう場所は特に限定されず、例えば、抗原が存在する生体組織切片上でおこなわれる。
　抗原が存在する生体組織切片上でおこなわれる分析方法としては、例えば、免疫組織化学染色法（ＩＨＣ法）を挙げることができる。ＩＨＣ法は、生体切片上で生体内原位置（ｉｎ　ｓｉｔｕ）の抗原を視覚化する手法である。ＩＨＣ法には、生体組織の解剖学的、構造的情報を保持したまま解析できるという特長があり、生体組織のどの区画に抗原が局在するかを解析できる。
　微量物質の分析をおこなう場所は特に限定されず、例えば、抗原が存在する膜上でおこなわれる。
　抗原が存在する膜上でおこなわれる分析方法としては、例えば、ウエスタンブロット法を挙げることができる。ウエスタンブロット法は、電気泳動によって分離したタンパク質を膜に転写し、分析対象のタンパク質に特異的な抗体によりそのタンパク質の検出および定量をおこなう手法である。
　抗原の種類は特に限定されず、酵素標識抗体と結合できるものであればよく、例えば、タンパク質、糖、脂質、ペプチドまたは生体に免疫応答を引き起こす低分子化合物であり、好ましくはタンパク質である。ここで、タンパク質および糖には、脂質および／または核酸が結合した、タンパク質および糖も含まれる。
　以下、本実施形態の微量物質の分析方法のうち、酵素標識核酸プローブを用いる場合について説明する。
　酵素標識核酸プローブを用いる場合、図２に示すように、酵素標識核酸プローブの核酸プローブを分析対象の微量物質である核酸に結合させる。
　分析対象の微量物質である核酸に酵素標識核酸プローブの核酸プローブが結合する分析方法としては、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法およびノーザンブロット法は、電気泳動によって分離した核酸を膜に転写し、分析対象の核酸に特異的な核酸プローブによりその核酸の検出および定量をおこなう手法である。サザンブロット法の分析対象はＤＮＡであり、ノーザンブロット法の分析対象はＲＮＡである。
　工程Ｄでは生成したポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検知する。検知方法は特に限定されず、例えば、生成したポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量分析してもよい。
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量分析の方法は特に限定されず、例えば、吸光度により定量分析することができる。なお、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈは可視域に吸収を示すため（極大吸収波長：４００ｎｍ、モル吸光係数＝１１，９００）、例えば、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できる。
　工程Ｄでは生成したポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検知する。検知方法は特に限定されず、例えば、生成したポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定性分析してもよい。
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定性分析の方法は特に限定されず、例えば、生成したポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを目視により定性分析することができる。前述の通り、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈは可視域に吸収を示すため、目視による定性分析が可能である。
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の構造は特に限定されないが、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が下記の一般式（３）で表されるＮ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤ由来の構造を含むことが好ましく、下記の一般式（４）で表されるチオＮＡＤ－Ｎ６－［Ｎ－（Ｎ－アクリロイル－１－メトシキカルボニル－５－アミノペンチル）－プロピオアミド］由来の構造を含むことがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　一般式（３）および（４）において、Ｒ１はヒドロキシ基またはリン酸基である。
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の構造は特に限定されないが、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）がアクリルアミド由来の構造を含むことが好ましい。
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の調製方法は特に限定されないが、非特許文献１および２に記載の方法を参考に調製することができる。
　酵素標識抗体または酵素標識核酸プローブの酵素αは特に限定されないが、ＥＣ番号２．－で表される転移酵素群、ＥＣ番号３．－で表される加水分解酵素群、ＥＣ番号４．－で表される除去付加酵素群およびＥＣ番号５．－で表される異性化酵素群からなる群から選択される一種又は二種以上を含むことが好ましく、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を含むことがより好ましい。
　化合物βは酵素αの基質となり得るものであれば特に限定されないが、後述するデヒドロゲナーゼとの組み合わせの観点から、アンドロステロン骨格を有する化合物を含むことが好ましく、Ａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ａ３Ｐ）を含むことがより好ましい。
　工程Ｃの酵素サイクリング反応で用いるデヒドロゲナーゼは特に限定されず、例えば、マレートデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、３α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、略称：３α－ＨＳＤ）、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、テストステロン－１７β－デヒドロゲナーゼおよびグリセロール－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼからなる群Ｘから選択される一種または二種以上を含み、反応速度向上の観点から、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含むことが好ましく、３α－ＨＳＤを含むことがより好ましい。
　デヒドロゲナーゼと化合物βの組み合わせは特に限定されないが、反応速度向上の観点から、３α－ＨＳＤとその基質となるアンドロステロン骨格を有する化合物の組み合わせが好ましい。
　反応速度向上について具体例を挙げて説明すると、多くの脱水素酵素では、補酵素としてチオＮＡＤを用いた場合の反応速度がＮＡＤを用いた場合の数％以内であるのに対し、３α－ＨＳＤによるアンドロステロンの脱水素反応では、チオＮＡＤでの反応速度がＮＡＤでの反応速度の約５９％もあり、本実施形態に係るサイクリング反応の酵素として好ましい性質を有している。
　アンドロステロン骨格を有する化合物の具体例としては、例えば、Ａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ａ３Ｐ）、アンドロステロン、１１β－ヒドロキシアンドロステロン、１１－オキソアンドロステロン、１１α－ヒドロキシアンドロステロン、エチオコラノロン、テトラハイドロコルチゾール、プレグナンジオール、リトコール酸、デオキシコレート、ケノデオキシコール酸およびコール酸などが挙げられる。
　３α－ＨＳＤとアンドロステロン骨格を有する化合物の組み合わせの中でも、酵素標識抗体または酵素標識核酸プローブの酵素として汎用的なＡＬＰとの組み合わせが可能であるという観点から、Ａ３Ｐと３α－ＨＳＤの組み合わせが好ましい。
　化合物γはデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応の基質となり得るものであれば特に限定されない。そのため、還元型基質でも酸化型基質でもよい。
　本実施形態の微量物質の分析方法において、酵素α、化合物β、デヒドロゲナーゼの性質は特に限定されないが、以下の性質を持つことが好ましい。
　標識酵素のターンオーバー数が大きい。
　市販および汎用されている標識酵素が使用できる。
　酵素サイクリングのターンオーバー数が大きい。
　酵素サイクリング反応に使用する脱水素酵素に標識酵素のコンタミや標識酵素と同様の活性がない。
　標識酵素の基質が市販の化合物であるか、または容易に合成ができ、かつ安定性が高い。
　本実施形態の微量物質の分析方法において、反応系中における酵素標識抗体または酵素標識核酸プローブの濃度は特に限定されないが、例えば１ｎＭ以上、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは２０ｎＭ以上であり、そして、例えば１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは４０ｎＭ以下である。
　本実施形態の微量物質の分析方法において、反応系中における化合物βの濃度は特に限定されないが、例えば０．００１ｍＭ以上、好ましくは０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．０５ｍＭ以上、さらに好ましくは０．１ｍＭ以上であり、そして、例えば５００ｍＭ以下、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下、さらに好ましくは１ｍＭ以下、さらに好ましくは０．５ｍＭ以下である。
　本実施形態の微量物質の分析方法において、反応系中におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は特に限定されないが、例えば０．００１ｍＭ以上、好ましくは０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．０５ｍＭ以上、さらに好ましくは０．１ｍＭ以上、さらに好ましくは０．５ｍＭ以上、さらに好ましくは１．０ｍＭ以上であり、そして、例えば５００ｍＭ以下、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下である。
　本実施形態の微量物質の分析方法において、反応系中におけるデヒドロゲナーゼの濃度は特に限定されないが、例えば０．０１Ｕ／ｍＬ以上５０００Ｕ／ｍＬ以下であり、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）向上の観点から、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ以上５００Ｕ／ｍＬ以下、より好ましくは１Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ以下、さらに好ましくは２Ｕ／ｍＬ以上８０Ｕ／ｍＬ以下、さらに好ましくは５Ｕ／ｍＬ以上６０Ｕ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以上５０Ｕ／ｍＬ以下、さらに好ましくは２０Ｕ／ｍＬ以上４０Ｕ／ｍＬ以下である。
　本実施形態の微量物質の分析方法において、反応系中におけるチオＮＡＤ（Ｐ）ユニットの量は特に限定されないが、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）向上の観点から、３０Ｕ／ｍＬのデヒドロゲナーゼ溶液１００μＬ、つまり３Ｕのデヒドロゲナーゼに対して、例えば１．００×１０３ｍｅｒ以上１．００×１０５ｍｅｒ以下、好ましくは２．００×１０３ｍｅｒ以上８．００×１０４ｍｅｒ以下、より好ましくは５．００×１０３ｍｅｒ以上５．００×１０４ｍｅｒ以下、さらに好ましくは７．００×１０３ｍｅｒ以上３．００×１０４ｍｅｒ以下、さらに好ましくは１．５０×１０４ｍｅｒ以上２．８０×１０４ｍｅｒ以下、さらに好ましくは２．００×１０４ｍｅｒ以上２．４０×１０４ｍｅｒ以下である。
　なお、本実施形態において、反応系中におけるチオＮＡＤ（Ｐ）ユニットの量はｍｅｒで表す。ｍｅｒは反応系中におけるチオＮＡＤ（Ｐ）ユニットの個数を表す単位であり、例えば、反応系中におけるチオＮＡＤ（Ｐ）ユニットの量が１００ｍｅｒであるということは、反応系中におけるチオＮＡＤ（Ｐ）ユニットの個数が１００であるということを意味する。
　本実施形態の微量物質の分析方法において、反応温度は特に限定されないが、例えば０℃以上、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、そして、例えば１００℃以下、好ましくは８０℃以下、より好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下である。
　本実施形態の微量物質の分析方法において、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の数平均分子量は特に限定されないが、酵素サイクリング反応で生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが検知されるまでに要する時間をより一層短縮できる観点から、好ましくは１．０×１０４以上１．０×１０９以下、より好ましくは５．０×１０４以上５．０×１０８以下、さらに好ましくは１．０×１０５以上１．０×１０８以下、さらに好ましくは６．５×１０５以上７．０×１０７以下、さらに好ましくは１．０×１０６以上５．０×１０７以下、さらに好ましくは５．０×１０６以上３．０×１０７以下、さらに好ましくは１．０×１０７以上２．０×１０７以下である。
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の数平均分子量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析することができる。
［微量物質分析用キット］
　以下、本実施形態の微量物質の分析用キットについて説明する。
　本実施形態の微量物質分析用キットは、測定対象の微量物質に特異的な抗体と酵素αとからなる酵素標識抗体、または、前記微量物質に特異的な核酸プローブと酵素αとからなる酵素標識核酸プローブと、前記酵素αの基質である化合物βと、デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）と、を含む。
　以下、本実施形態の微量物質分析用キットが酵素標識抗体を含む場合について説明する。
　本実施形態の微量物質分析用キットが酵素標識抗体を含む場合、分析対象の微量物質は抗原である。
　本実施形態の微量物質分析用キットの用途は特に限定されず、例えば、抗原に特異的な抗体を担持させた担体上で用いられる。具体的には、ＥＬＩＳＡ法などに用いられる。ＥＬＩＳＡ法については前述の通りである。
　本実施形態の微量物質分析用キットの用途は特に限定されず、例えば、抗原が存在する生体組織切片上で用いられる。具体的には、ＩＨＣ法などに用いられる。ＩＨＣ法については前述の通りである。
　本実施形態の微量物質分析用キットの用途は特に限定されず、例えば、抗原が存在する膜上で用いられる。具体的には、ウエスタンブロット法などに用いられる。ウエスタンブロット法については前述の通りである。
　抗原の種類は特に限定されず、酵素標識抗体と結合できるものであればよく、例えば、タンパク質、糖、脂質、ペプチドまたは生体に免疫応答を引き起こす低分子化合物であり、好ましくはタンパク質である。ここで、タンパク質および糖には、脂質および／または核酸が結合した、タンパク質および糖も含まれる。
　以下、本実施形態の微量物質分析用キットが酵素標識核酸プローブを含む場合について説明する。
　本実施形態の微量物質分析用キットが酵素標識核酸プローブを含む場合、分析対象の微量物質は核酸である。微量物質分析用キットの用途は特に限定されず、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法などに用いられる。サザンブロット法およびノーザンブロット法については前述の通りである。
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の構造は特に限定されないが、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が上記の一般式（３）で表されるＮ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤ由来の構造を含むことが好ましく、上記の一般式（４）で表されるチオＮＡＤ－Ｎ６－［Ｎ－（Ｎ－アクリロイル－１－メトシキカルボニル－５－アミノペンチル）－プロピオアミド］由来の構造を含むことがより好ましい。
　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の構造は特に限定されないが、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）がアクリルアミド由来の構造を含むことが好ましい。
　酵素標識抗体または酵素標識核酸プローブの酵素αは特に限定されないが、ＥＣ番号２．－で表される転移酵素群、ＥＣ番号３．－で表される加水分解酵素群、ＥＣ番号４．－で表される除去付加酵素群およびＥＣ番号５．－で表される異性化酵素群からなる群から選択される一種又は二種以上を含むことが好ましく、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を含むことがより好ましい。
　化合物βは酵素αの基質となり得るものであれば特に限定されないが、前述したデヒドロゲナーゼとの組み合わせの観点から、アンドロステロン骨格を有する化合物を含むことが好ましく、Ａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ａ３Ｐ）を含むことがより好ましい。
　本実施形態の微量物質分析用キットが含むデヒドロゲナーゼは特に限定されず、例えば、前述した群Ｘから選択される一種または二種以上を含み、前述した反応速度向上の観点から、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含むことが好ましく、３α－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（３α－ＨＳＤ）を含むことがより好ましい。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、本発明は前述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。
　以下、実施例により本発明の有用性を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるのもではない。
［ポリマー化チオＮＡＤの調製］
　以下の手順によりポリマー化チオＮＡＤを得た。
＜Ｎ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤの調製＞
（１）２ＭのＬｉＯＨで中和したヨード酢酸（２．０ｇ）水溶液にオリエンタル酵母工業株式会社製のチオＮＡＤ（２．０μｇ、１．８×１０１５ｍｅｒ）を加え、ｐＨを６．５に調整した。なお、本実施例において、チオＮＡＤおよびチオＮＡＤから合成される化合物の量はｍｅｒで表す。ｍｅｒはチオＮＡＤおよびチオＮＡＤから合成される化合物の個数を表す単位であり、つまり、ヨード酢酸水溶液に１．８×１０１５ｍｅｒのチオＮＡＤを加えたということは、ヨード酢酸水溶液に加えたチオＮＡＤの個数が１．８×１０１５であるということを意味する。
（２）上記（１）で得られた溶液を上記のヨード酢酸水溶液で希釈し、溶液中のチオＮＡＤの量が２．１６×１０４ｍｅｒになるようにした。２．１６×１０４ｍｅｒとする場合、１０００倍希釈を２回、１００倍希釈を１回、８３３倍希釈を１回おこなった。
（３）得られた溶液を暗所・室温で１０日間静置した。溶液のｐＨは適宜確認し、２ＭのＬｉＯＨで調整した。
（４）３ＭのＨＣｌで溶液のｐＨを３．５に調節し、氷上で冷却した。
（５）冷却した溶液を１０倍量のアセトン（温度：－５℃）に注いだ。
（６）沈殿物を回収し、エーテルで洗浄し、５０ｍＬの水に溶解した。
（７）得られた溶液を亜ジチオン酸ナトリウム溶液（１ｇ／１００ｍＬ、１％ＮａＨＣＯ３）と混合し、１００℃で５分間静置した。
（８）溶液を室温まで冷まし、１５分間酸素を供給した。
（９）１ＭのＮａＯＨで溶液のｐＨを１１．３に調節し、７５℃で１時間静置した。
（１０）得られた溶液をアルコール脱水素酵素と反応させるため、まず、溶液の温度を室温まで下げ、Ｔｒｉｓの濃度が０．１ＭとなるようにＴｒｉｓ緩衝液を加えた。
（１１）３ＭのＨＣｌで溶液のｐＨを７．５に調整し、１ｍＬのアセトアルデヒドと１０００Ｕのアルコール脱水素酵素を添加した。
（１２）３４０ｎｍの吸光度の変動がなくなったとき、脱水素（酸化）が完了したとみなし、得られた溶液を、溶液の１０倍過剰の冷エーテル（－５℃）に注いだ。
（１３）３℃で一晩静置した後、油状沈殿物を回収し、アセトンとエーテルを用いて洗浄し、１Ｌの水に溶解させ、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。
（１４）得られた溶液をカラムで洗浄し、Ｎ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤの溶液を得た。なお、上記したＮ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤの調製においては未反応物、副反応物および精製によるロスが殆ど残存しなかった。このことから、チオＮＡＤの仕込み量（２．１６×１０４ｍｅｒ）と同量のＮ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤが得られたとみなした。
＜Ｎ（ε）－アクリロイル－Ｌ－リジンメチルエステル塩酸塩の調製＞
（１５）Ｌ－リジン－塩酸塩（２７．６ｇ）を熱水（７０ｍＬ）に溶解させ、ＣｕＣＯ３・Ｃｕ（ＯＨ）２（１５ｇ）を添加した。
（１６）得られた溶液に４ＭのＮａＯＨ（３７．５ｍＬ）を加え、さらにジブチルヒドロキシトルエン（５０ｍｇ）を加え、－５℃に冷却した。
（１７）得られた溶液と塩化アクリロイル（１３．７ｇ）、４ＭのＮａＯＨ（３７．５ｍＬ）を－５℃条件下で１．５時間かけて攪拌しながら混合した。
（１８）混合後、５ＭのＨＣｌを用いて溶液のｐＨを６．０に調整した。
（１９）得られた沈殿物をろ過により回収し、超純水を用いて洗浄した。
（２０）洗浄した沈殿物を超純水（１５０ｍＬ）に懸濁させ、ｐＨを１．５まで下げ沈殿物を溶解させた。
（２１）溶け残った沈殿物をろ過によって取り除き、Ｎａ２ＣＯ３で溶液のｐＨを６．０に戻し再度沈殿させた。
（２２）沈殿物を回収し、超純水（１５０ｍＬ）で懸濁し、５ＭのＨＣｌを添加し溶解させた。
（２３）硫化水素を溶液に導入し、生成した硫化銅をろ過除去した。
（２４）ろ液を減圧下３０℃で蒸発させた後、得られた残渣にエタノールを加え、蒸発させ、結晶を得た。
（２５）得られた結晶を２１％メタノール塩化水素（２００ｍＬ）により、室温、４８時間処理し、Ｎ（ε）－アクリロイル－Ｌ－リジンメチルエステル塩酸塩を得た。
＜チオＮＡＤ－Ｎ６－［Ｎ－（Ｎ－アクリロイル－１－メトシキカルボニル－５－アミノペンチル）－プロピオアミド］の調製＞
（２６）上記（２５）で得られたＮ（ε）－アクリロイル－Ｌ－リジンメチルエステル塩酸塩（５．０ｇ）を超純水（１０ｍＬ）に溶解し、５ＭのＮａＯＨを用いて、ｐＨを４．５に調整し、さらに、上記（１４）で得られたＮ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤの溶液の全量（２．１６×１０４ｍｅｒ）と、ヒドロキノン（１０ｍｇ）と、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩１．３４ｇを溶解させた水溶液（１ｍＬ）と、を加え、混合した。
（２７）１ＭのＨＣｌを用いて溶液のｐＨを保ちながら、室温で２０時間攪拌を続けた後、溶液を冷アセトン・エタノール（１：１）中に注いだ。
（２８）遠心分離により沈殿物を集め、集めた沈殿物をアセトンで洗浄し、水（５ｍＬ）に溶解し、カラムを通して脱塩し、チオＮＡＤ－Ｎ６－［Ｎ－（Ｎ－アクリロイル－１－メトシキカルボニル－５－アミノペンチル）－プロピオアミド］を得た。なお、上記したチオＮＡＤ－Ｎ６－［Ｎ－（Ｎ－アクリロイル－１－メトシキカルボニル－５－アミノペンチル）－プロピオアミド］の調製においては未反応物、副反応物および精製によるロスが殆ど残存しなかった。このことから、Ｎ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤの仕込み量（２．１６×１０４ｍｅｒ）と同量のチオＮＡＤ－Ｎ６－［Ｎ－（Ｎ－アクリロイル－１－メトシキカルボニル－５－アミノペンチル）－プロピオアミド］が得られたとみなした。
＜ポリマー化チオＮＡＤの調製＞
（２９）上記（２８）で得られたチオＮＡＤ－Ｎ６－［Ｎ－（Ｎ－アクリロイル－１－メトシキカルボニル－５－アミノペンチル）－プロピオアミド］の全量（２．１６×１０４ｍｅｒ）と、３００ｍＭのアクリルアミドと、５０ｍＭの３－（ジメチルアミノ）プロピオニトリルと、４．４ｍＭの過硫酸アンモニウムと、を混合した溶液を調製した。
（３０）調製した溶液に窒素ガスを１分間バブリングし、氷中で１時間静置した後、水を用いて透析し、ポリマー化チオＮＡＤを得た。なお、上記したポリマー化チオＮＡＤの調製においては未反応物、副反応物および精製によるロスが殆ど残存しなかった。このことから、チオＮＡＤ－Ｎ６－［Ｎ－（Ｎ－アクリロイル－１－メトシキカルボニル－５－アミノペンチル）－プロピオアミド］の仕込み量（２．１６×１０４ｍｅｒ）と同量のチオＮＡＤを含有するポリマー化チオＮＡＤが得られたとみなした。
＜ポリマー化チオＮＡＤの分析＞
　上記の方法により得られたポリマー化チオＮＡＤをゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で分析した結果、その数平均分子量は１．５×１０７であった。
　ＧＰＣ測定条件は以下のとおりである。
　測定装置：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＩＩ　Ｂｉｏ－ＳＥＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
　カラム：ＰＬｇｅｌ　２０μｍ　ＭＩＸＥＤ－Ａ（サイズ：３００ｍｍ×７．５ｍｍＩ．Ｄ．、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）×４本
　カラム温度：２５℃
　移動相：ジメチルホルムアミド
　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　検出器：ＲＩ（示差屈折率検出器）
　標準物質：Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　Ｄ－Ｈ２－１０キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）］
＜実施例１＞
　下記の分析対象を、下記の溶液Ａを用いて、下記の分析方法により分析した。
（分析対象）
　Ｇｌｕｃｏｓｅ－Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　７８　ｋＤａ溶液（以下、ＧＲＰ７８溶液と呼ぶ）（ＢＳＡ：０．１％、Ｔｗｅｅｎ　２０：０．０２％　ｉｎ　ＰＢＳ）
（溶液Ａ）
　以下の成分を含むｐＨ９．０の溶液Ａを１００μＬ得た。
　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１００ｍＭ）
　ポリマー化チオＮＡＤ（上記（３０）により得られた全量、チオＮＡＤユニットの量：２．１６×１０４ｍｅｒ）（なお、チオＮＡＤユニットの量は下記の予備実験２により決定した。）
　ＮＡＤＨ（１．０ｍＭ）
　Ａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ａ３Ｐ）（０．１ｍＭ）
　３α－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（３α－ＨＳＤ）（３０Ｕ／ｍＬ）（なお、３α－ＨＳＤの濃度は下記の予備実験１により決定した。）
（分析方法）
　抗ＧＲＰ７８抗体を固定化したマイクロプレートにＧＲＰ７８溶液を加え、３７℃で１２０分間インキュベートした。
　次いで、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識した抗ＧＲＰ７８抗体溶液（ＢＳＡ：０．１％、Ｔｗｅｅｎ　２０：０．０２％　ｉｎ　ＰＢＳ）を１００μＬ加え、３７℃で６０分間インキュベートした。
　次いで、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、ウェルに溶液Ａの全量（１００μＬ）を加え、３７℃で加温しながら、マイクロプレートリーダー（コロナ電気株式会社製、機種名：ＳＨ－１０００、４０５ｎｍのフィルターを装着）を用いて、溶液Ａを加えてからの吸光度を５分ごとに測定した。結果を図５に示す。
（予備実験１）
　３α－ＨＳＤの濃度を１、１０、３０、５０または１００Ｕ／ｍＬにして、上記の測定方法により溶液Ａを加えてから５分後の吸光度を測定し、各濃度でのＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を比較した。その結果、３０Ｕ／ｍＬのときのＳ／Ｎ比が最も大きかったことから、３α－ＨＳＤの濃度は３０Ｕ／ｍＬとした。
（予備実験２）
　ポリマー化チオＮＡＤのチオＮＡＤユニットの量を７．２０×１０３、１．４４×１０４、２．１６×１０４または２．８８×１０４ｍｅｒにして、上記の測定方法により溶液Ａを加えてから５分後の吸光度を測定し、各濃度でのＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を比較した。その結果、２．１６×１０４ｍｅｒのときのＳ／Ｎ比が最も大きかったことから、チオＮＡＤユニットの量を２．１６×１０４ｍｅｒとした。
＜比較例１＞
　ポリマー化チオＮＡＤの代わりに２．１６×１０４ｍｅｒのチオＮＡＤを用いたこと以外は実施例１と同様にしてＥＬＩＳＡ法をおこなった。結果を図５に示す。
　図５に示すように、実施例１は比較例１よりも吸光度の上昇速度が速かった。このことから、本実施形態の分析方法によると、酵素サイクリング反応で生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが検知可能な濃度に到達するまでに要する時間、つまり検知されるまでに要する時間を短縮できることがわかる。
　また、実施例１のＳ／Ｎ比は２．８であり、比較例１のＳ／Ｎ比は２．２であった。このことから、本実施形態の分析方法によると、Ｓ／Ｎ比を向上できることがわかる。
［免疫組織化学染色法（ＩＨＣ法）への適用のための予備実験］
　本実施形態に係る分析方法をＩＨＣ法へ適用するための予備実験をおこなった。具体的には、本実施形態に係る分析方法と、従来のＩＨＣ法において一般的な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）による分析方法との検出限界を比較した。
＜参考例１＞
　下記の溶液Ｂを用いて、下記の方法により検出限界の値を得た。
（溶液Ｂ）
　以下の成分を含むｐＨ９．０の溶液Ｂを１００μＬ得た。
　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１００ｍＭ）
　ポリマー化チオＮＡＤ（上記（３０）により得られた全量、チオＮＡＤユニットの量：２．１６×１０４ｍｅｒ）
　ＮＡＤＨ（１．０ｍＭ）
　Ａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ａ３Ｐ）（０．１ｍＭ）
　３α－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（３α－ＨＳＤ）（３０Ｕ／ｍＬ）
（方法）
　マイクロプレートにｐＨ９．０のＡＬＰ溶液（ＡＬＰ：５．０×１０－１７，１．０×１０－１７，５．０×１０－１８または１．０×１０－１８／１００μＬ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ：１００ｍＭ）を１００μＬ加えた。
　次いで、ウェルに溶液Ｂの全量（１００μＬ）を加え、３７℃で加温しながら、マイクロプレートリーダー（コロナ電気株式会社製、機種名：ＳＨ－１０００、４０５ｎｍのフィルターを装着）を用いて、溶液Ｂを加えてから５分後の吸光度を測定し、測定値Ａを得た。
　そして、測定値Ａとブランク値Ｂの間に有意差があった場合、検出可能と判断し、検出可能となった場合のうちＡＬＰ濃度が最も小さかった場合のＡＬＰ濃度を検出限界の値とした。
　なお、有意差の有無の判断は、以下の方法によりおこなった。まず、ブランク値Ｂの平均値ＢＡＶＥおよび標準偏差ＢＳＤを求めた。次いで、下記式（１）により基準値ＢＸを求めた。次いで、基準値ＢＸと測定値Ａを比較し、異なる値であれば、有意差があると判断した。
　　　ＢＸ＝ＢＡＶＥ＋ＢＳＤ×３　　　（１）
　このようにして得られた検出限界の値は２．２４×１０－２０ｍｏｌ／１００μＬであった。
＜参考比較例１＞
　下記の溶液Ｃを用いて、下記の方法により検出限界の値を得た。
（溶液Ｃ）
　ＴＭＢ基質液（サーモディクス社製）を１００μＬ用意した。
（方法）
　マイクロプレートにｐＨ９．０のＨＲＰ溶液（ＨＲＰ：１．０×１０－８，０．５×１０－８，１．０×１０－９または０．５×１０－９／１００μＬ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ：１００ｍＭ）を１００μＬ加えた。
　次いで、ウェルに溶液Ｃの全量（１００μＬ）を加え、３７℃で加温しながら、マイクロプレートリーダー（コロナ電気株式会社製、機種名：ＳＨ－１０００、４０５ｎｍのフィルターを装着）を用いて、溶液Ｃを加えてから１０分後の吸光度を測定し、測定値Ａを得た。
　そして、測定値Ａとブランク値Ｂの間に有意差があった場合、検出可能と判断し、検出可能となった場合のうちＨＲＰ濃度が最も小さかった場合のＨＲＰを検出限界の値とした。
　なお、有意差の有無の判断は、上記の方法によりおこなった。
　このようにして得られた検出限界の値は４．３１×１０－１２ｍｏｌ／１００μＬであった。
　参考例１の検出限界の値は、従来のＩＨＣ法において一般的なＨＲＰによる分析方法である参考比較例１の検出限界の値の約１０８分の１であった。このことから、本実施形態に係る分析方法をＩＨＣ法に適用すると、検出感度を向上できると考えられる。
　この出願は、２０２３年６月３０日に出願された日本出願特願２０２３－１０８４４７号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (33)

  1. 　微量物質の分析方法であって、
    　前記微量物質に、前記微量物質に特異的な抗体と酵素αとからなる酵素標識抗体、または、前記微量物質に特異的な核酸プローブと酵素αとからなる酵素標識核酸プローブを結合させる工程Ａと、
    　前記酵素標識抗体の前記酵素α、または、前記酵素標識核酸プローブの前記酵素αを、前記酵素αの基質である化合物βに作用させ、デヒドロゲナーゼの基質である化合物γを生成させる工程Ｂと、
    　生成した前記化合物γと、デヒドロゲナーゼと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）と、を用いて、酵素サイクリング反応により、ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる工程Ｃと、
    　生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより、前記微量物質を検知する工程Ｄと、
    を含む、微量物質の分析方法。
  2. 　前記微量物質が抗原であり、
    　前記工程Ａにおいて、前記抗原に、前記酵素標識抗体を結合させる、請求項１に記載の微量物質の分析方法。
  3. 　前記抗原に特異的な抗体を担持させた担体上でおこなわれる、請求項２に記載の微量物質の分析方法。
  4. 　前記抗原が存在する生体組織切片上でおこなわれる、請求項２に記載の微量物質の分析方法。
  5. 　前記抗原が存在する膜上でおこなわれる、請求項２に記載の微量物質の分析方法。
  6. 　前記抗原がタンパク質抗原である、請求項２～５のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  7. 　前記微量物質が核酸であり、
    　前記工程Ａにおいて、前記核酸に、前記酵素標識核酸プローブを結合させる、請求項１に記載の微量物質の分析方法。
  8. 　前記工程Ｄにおいて、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量分析する、請求項１～７のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  9. 　前記工程Ｄにおいて、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを吸光度により定量分析する、請求項８に記載の微量物質の分析方法。
  10. 　前記工程Ｄにおいて、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定性分析する、請求項１～７のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  11. 　前記工程Ｄにおいて、生成した前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを目視により定性分析する、請求項１０に記載の微量物質の分析方法。
  12. 　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が、Ｎ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤ由来の構造を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  13. 　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が、アクリルアミド由来の構造を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  14. 　前記酵素αが、ＥＣ番号２．－で表される転移酵素群、ＥＣ番号３．－で表される加水分解酵素群、ＥＣ番号４．－で表される除去付加酵素群およびＥＣ番号５．－で表される異性化酵素群からなる群から選択される一種又は二種以上を含む、請求項１～１３のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  15. 　前記酵素αがアルカリホスファターゼを含む、請求項１４に記載の微量物質の分析方法。
  16. 　前記化合物βがアンドロステロン骨格を有する化合物を含む、請求項１～１５のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  17. 　前記デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含む、請求項１～１６のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  18. 　前記化合物γがアンドロステロン骨格を有する化合物を含む、請求項１～１７のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  19. 　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の数平均分子量が１．０×１０４以上１．０×１０９以下である、請求項１～１８のいずれかに記載の微量物質の分析方法。
  20. 　測定対象の微量物質に特異的な抗体と酵素αとからなる酵素標識抗体、または、前記微量物質に特異的な核酸プローブと酵素αとからなる酵素標識核酸プローブと、
    　前記酵素αの基質である化合物βと、
    　デヒドロゲナーゼと、
    　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、
    　ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）と、
    を含む微量物質分析用キット。
  21. 　前記微量物質が抗原であり、
    　前記酵素標識抗体を含む、請求項２０に記載の微量物質分析用キット。
  22. 　前記抗原に特異的な抗体を担持させた担体上で用いられる、請求項２１に記載の微量物質分析用キット。
  23. 　前記抗原が存在する生体組織切片上で用いられる、請求項２１に記載の微量物質分析用キット。
  24. 　前記抗原が存在する膜上で用いられる、請求項２１に記載の微量物質分析用キット。
  25. 　前記抗原がタンパク質抗原である、請求項２１～２４のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
  26. 　前記微量物質が核酸であり、
    　前記酵素標識核酸プローブを含む、請求項２０に記載の微量物質分析用キット。
  27. 　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が、Ｎ６－カルボキシメチル－チオＮＡＤ由来の構造を含む、請求項２０～２６のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
  28. 　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）が、アクリルアミド由来の構造を含む、請求項２０～２７のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
  29. 　前記酵素αが、ＥＣ番号２．－で表される転移酵素群、ＥＣ番号３．－で表される加水分解酵素群、ＥＣ番号４．－で表される除去付加酵素群およびＥＣ番号５．－で表される異性化酵素群からなる群から選択される一種又は二種以上を含む、請求項２０～２８のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
  30. 　前記酵素αがアルカリホスファターゼを含む、請求項２９に記載の微量物質分析用キット。
  31. 　前記化合物βがアンドロステロン骨格を有する化合物を含む、請求項２０～３０のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
  32. 　前記デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含む、請求項２０～３１のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
  33. 　前記ポリマー化チオＮＡＤ（Ｐ）の数平均分子量が１．０×１０４以上１．０×１０９以下である、請求項２０～３２のいずれかに記載の微量物質分析用キット。
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