WO2025003545A1 - Derivados de imidazo[1,2-a]piridina con actividad antiinflamatoria - Google Patents

Derivados de imidazo[1,2-a]piridina con actividad antiinflamatoria Download PDF

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WO2025003545A1
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Jesús DEL POZO LOSADA
Antonio MARCILLA DÍAZ
Carlos Del Pozo Losada
Christian Miquel SÁNCHEZ LÓPEZ
Francisco Antonio SÁNCHEZ SANCHO
Aurelio GARCÍA CSÁKY
Eduardo OLIVER PÉREZ
CABEZA. Borja IBÁÑEZ
María Gracia BAQUERO GÁLVEZ
Silvia ROSCALES GARCÍA
José María CUMELLA MONTÁNCHEZ
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Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii FSP
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad Complutense de Madrid
Universitat de Valencia
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad Complutense de Madrid
Universitat de Valencia
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Definitions

  • the present invention is related to the obtaining of synthetic chemical products with cosmetic, nutraceutical and therapeutic applications (Biomedical sector).
  • Inflammation is a normal response of the immune system to infection. However, when it is allowed to continue unchecked, it can result in autoimmune or autoinflammatory disorders, neurodegenerative diseases, or even cancer. The growing understanding that chronic inflammation is crucial in many diseases opens up new avenues for treatment.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • An effective anti-inflammatory drug should be able to inhibit the development of inflammation without interfering with normal homeostasis.
  • Anti-inflammatory drugs typically inhibit cyclooxygenases (COX), which are involved in the biosynthesis of prostaglandins that promote inflammation.
  • COX cyclooxygenases
  • Conventional NSAIDs are associated with gastric and renal side effects, as they inhibit both constitutive COX-1 and inducible COX-2.
  • Most selective COX-2 inhibitors (COXIBs) lack gastric side effects, but are associated with cardiac side effects on long-term use.
  • ROS reactive oxygen species
  • Transforming growth factor-beta is a crucial player in immune system homeostasis, involved among others in inflammatory cell migration, growth inhibition, invasion, epithelial-mesenchymal transition (EMT), extracellular matrix (ECM) remodeling, and immunosuppression.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • ECM extracellular matrix
  • TGFp is often chronically overexpressed in different pathologies, such as cancer, fibrosis, and inflammation.
  • the TGFp signaling pathway has become a popular target for drug development.
  • TGFp is the most potent profibrogenic cytokine and its expression is increased in almost all fibrotic diseases.
  • ROS reactive oxygen species
  • TGFp inhibition is able to reduce perivascular inflammation, thus delaying disease progress.
  • deficiency of its receptor ALK5 is able to inhibit macrophage-mediated inflammation.
  • the TGFp/ALK5 pathway has been proposed as a therapeutic target capable of restoring sensitivity to the anti-inflammatory activity of corticosteroids in inflammations caused by respiratory viral infections. In most cells, TGFp signals through the combination of TGFpR-II and ALK5.
  • ALK5 is a tyrosine kinase that is the type I receptor for tumor growth factor beta (TGFp-l), and has been described as a mediator in the inflammatory response, inducer of fibrosis of various origins, as well as promoter of cell survival, migration, differentiation and proliferation, related to various pathologies, including tumor processes.
  • TGFp-l tumor growth factor beta
  • the inhibition of Alk5 has a clear inhibitory effect on the inflammatory response by promoting the anti-inflammatory response in human macrophages.
  • the inhibition of Alk5 is referred to by Ling LE, Lee WC. Tgf-beta type I receptor (Alk5) kinase inhibitors in oncology. Curr Pharm Biotechnol. 2011 Dec;12(12):2190-202. https://doi.org/10.2174/138920111798808257.
  • TGFp/Smad signaling pathway targeting the TGFp/Smad signaling pathway has recently been described to attenuate keloid and hypertrophic scar formation.
  • the TGFp/Smad signaling pathway is the most canonical pathway through which collagen formation is regulated in fibroblasts and myofibroblasts.
  • several therapeutic strategies have been developed that target the TGF-p/Smad signaling pathway to attenuate abnormal scar formation in the skin.
  • Acute respiratory distress syndrome is a form of non-cardiogenic pulmonary edema, due to alveolar damage secondary to an intense inflammatory process in the lungs. Despite its high incidence, ARDS has no specific treatment, beyond attacking the origin (antibiotics in case of bacterial infection), minimizing potentially life-threatening ventilation and avoiding a positive fluid balance. Fibrosis in the lung may be mainly due to transforming growth factor beta (TGFP). In addition, TGFp is also involved in fluid homeostasis in the lung. It has been proposed that cytokine storm and COVID-19 pathogenesis are a consequence of the imbalanced cytokine network, resulting from the increased biological activity of transforming growth factor-p (TGFP) (Shen et al., 2021).
  • TGFP transforming growth factor-p
  • TGF-p transforming growth factor beta
  • Galunisertib and Vactosertib are inhibitors of the TGFp and/or ALK5 pathway that have shown a good safety profile in Phase I trials, and are being considered as potential antitumor agents due to the involvement of the aforementioned pathway in cell proliferation and migration.
  • WO 2013147711 relates to compounds including certain imidazo-pyridines that act as inhibitors of the kinases MNK2a, MNK2b, MNK1a and MNK1 b, which interact with MAP kinase, to pharmaceutical compositions comprising these compounds and to the use of the compounds for the preparation of a medicament for the prophylaxis and treatment of diseases, such as proliferative diseases, for example, cancer, inflammatory diseases, Alzheimer's disease.
  • the compounds disclosed by WO2013147711 are distinct from those prepared in the present invention. Furthermore, there is no evidence in WO2013147711 showing that said compounds have inhibitory capacity of the tyrosine kinase Alk5, which is the tyrosine kinase inhibitor. transforming growth factor receptor I or TGFp, which is the basis for the activity of the compounds of the present invention.
  • W02008014219 discloses a method for inhibiting the activity/function of PB kinases using thiozolidinedione derivatives.
  • the disclosed compounds include certain imidazo-pyridines that act as inhibitors. They are said to be useful for treating selected pathological states such as autoimmune disorders, inflammatory diseases or lung injuries.
  • the compounds disclosed by W02008014219 are distinct from those prepared in the present invention. Furthermore, there is no evidence in W02008014219 showing that said compounds have inhibitory capacity of tyrosine kinase Alk5, which is the receptor I of transforming growth factor or TGFp, which is the basis of the activity of the compounds of the present invention.
  • US2004122044 discloses pharmaceutical formulations with compounds having an imidazo[1,2-a]-pyridin-3-yl-amide skeleton or amine compounds as active ingredients for inhibiting nitric oxide synthase. Some treatments of diseases that can be treated with said compounds are also mentioned. However, the compounds disclosed by US2004122044 are different from those prepared in the present invention. In addition, it only shows examples of anti-NO synthase activity, but there is no evidence in US2004122044 showing that said compounds have activity for the specific diseases or problems for which the compounds of the present invention are intended.
  • WO2019099336 refers to indole-derived compounds among which are certain imidazo-pyridines, useful in the treatment of autoimmune and inflammatory diseases.
  • the disclosed imidazo-pyridines do not in any case coincide with compounds of the present invention, since according to formula (I) of the main claim, when the substituent in positions 6 or 7 of the imidazo-pyridine skeleton is a heterocycle, said heterocycle is never substituted with a piperidine. Therefore, the activity in the field of medicine does not have to be the same, or even similar to that of the compounds of the present invention.
  • the compounds of the invention use the inhibition of ALK5, belonging to the TGFp receptor family, as an anti-inflammatory strategy, capable of preventing fibrotic events among others (Nolte and Margadant, 2020). These compounds are useful in the treatment of cancer, lung diseases, fibrotic diseases, prevention of the formation of keloid and hypertrophic scars and as a treatment for severe COVID-19.
  • the compounds of the invention have the chemical structure of a planar aromatic imidazo[1,2-a]pyridine skeleton functionalized in different positions of this heterocyclic skeleton, especially highlighting those derivatives substituted at C-7 with an aromatic heterocyclic system. Some of them were prepared from 7- bromoimidazo[1,2-a]pyridine and (hetero)arylboronic acids by Suzuki couplings.
  • the imidazo[1,2-a]pyridine skeleton is known as a privileged structure since it is present in many commercial drugs such as Zolpidem, Olprinone, Soraprazan and many other compounds that are currently in different stages of biological testing and preclinical evaluation, showing multiple therapeutic applications.
  • the compounds of the invention are compounds based on structures with inhibitory activity of the tyrosine kinase Alk5, which is the receptor I of the transforming growth factor or TGFp.
  • Ferreira-Gomes et al., 2021 Ferreira-Gomes M, Kruglov A, Durek P, Heinrich F, Tizian C, Heinz GA, Pascual-Reguant A, Du W, Mothes R, Fan C, Frischbutter S, Habenicht K, Budzinski L, Ninnemann J, Jani PK, Guerra GM, Lehmann K, Matz M, Ostendorf L, Heiberger L, Chang HD, Bauherr S, Maurer M, Schónrich G, Raftery M, Kallinich T, Mall MA, Angermair S, Treskatsch S, Dórner T, Corman VM, Diefenbach A, Volk HD, Elezkurtaj S, Winkler TH, Dong J, Hauser AE, Radbruch H, Witkowski M, Melchers F, Radbruch A, Mashreghi MF.
  • SARS-CoV-2 in severe COVID-19 induces a TGF-p- dominated chronic immune response that does not target itself. Nat Commun. 2021 Mar 30; 12(1): 1961. https://doi.Org/10.1038/s41467-021 -22210-3.
  • ALK activin-like kinase
  • the present invention relates to a compound of formula I:
  • R 2 represents H; aryl, where the aryl group may be unsubstituted or may be substituted with alkyl groups of 1 to 5 carbon atoms, or substituted with haloalkyl (such as -CF3), or substituted with an alkoxy group of 1 to 5 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, propyl, butanyl,
  • R 3 represents H, halogen (F, Cl, Br, I); haloalkyl; alkoxycarbonyl of 2 to 5 carbon atoms; amino; aryl or heteroaryl, where the aryl and heteroaryl groups may be unsubstituted or may be substituted with alkyl groups of 1 to 5 carbon atoms or with one or more alkoxycarbonyl groups of 2 to 5 carbon atoms (such as ethoxycarbonyl),
  • R 5 represents H; alkenyl of 2 to 10 carbon atoms; alkoxycarbonyl of 2 to 5 carbon atoms; nitro; carboxyl; alkyl of 1 to 5 carbon atoms unsubstituted or substituted with one or more hydroxy groups, preferably substituted with a hydroxy group; by a N-(3-methylene-2-oxo ⁇ ndolin-5- ⁇ l)-3-(piperidine-1- ⁇ l)propanamide) or carbaldehyde group,
  • W represents O or S or NH, such as benzothiophenyl, benzofuranyl, benzopyrrolyl,
  • R 7 represents a hydrogen atom (H); an unsubstituted aryl group or an aryl group substituted with one or more hydroxy groups, such as hydroxyphenyl (for example substituted by a hydroxyl), or substituted with one or more methoxy groups; halogen (F, Cl, Br, I); alkenyl of 2 to 10 atoms, such as 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms - preferably 3 to 10 carbon atoms unsubstituted or substituted by an aryl group such as phenyl; alkenyl of 2 carbon atoms substituted with phenyl (styryl); alkoxycarbonyl of 2 to 5 carbon atoms; a heteroaryl group, such as furanyl, thiophenyl, pyrrolyl or pyridinyl; or heteroaryl where the heteroaryl group is selected from benzothiophenyl, benzofuranyl, benzopyrrolyl; dibenzothiophenyl
  • R 5 when R 5 is carbaldehyde, at least one of R 2 , R 3 , R 6 or R 7 is other than H,
  • R 2 represents unsubstituted aryl, or aryl substituted with a methyl or methoxy group, at least one of the substituents R 2 , R 3 , R 5 , R 6 and R 7 is not H
  • R 3 , R 5 , R 6 , R 7 is other than H, when R 2 is unsubstituted aryl, or is an aryl substituted by halogen, methyl or methoxy. or is a compound of formula (I) in which
  • R 2 represents aryl substituted with alkoxy of 1 to 5 carbon atoms and simultaneously R 6 is an aryl group substituted with a halogen (F, Cl, Br, I), and the other substituents have the meanings indicated above.
  • the group is N-(3-methyl-2-oxo ⁇ ndolin-5- ⁇ l)-3-(p ⁇ per ⁇ d ⁇ n-1- ⁇ l)propanamide) in the position
  • Aryl means a phenyl group; fused aromatic carbocycle, such as naphthyl or anthranyl; or indanyl, without heteroatoms.
  • Alkyl unless otherwise indicated, means alkyl of 1 to 5 carbon atoms, in particular methyl, ethyl, propyl or butyl.
  • Alkenyl unless otherwise indicated, means alkenyl of 2 to 10 carbon atoms.
  • Heteroaryl unless otherwise indicated, means a monocyclic or fused bicyclic group consisting of 5 to 10 ring members, having at least one moiety aromatic and containing 1 to 3 heteroatoms selected from oxygen, sulfur, and nitrogen.
  • Haloalkyl unless otherwise indicated, means an alkyl group of 1 to 3 carbon atoms substituted with one or more halogen atoms selected from fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • Cycloalkyl has the usual meaning, that is, a univalent substituent derived from a cycloalkane without side chains.
  • R 2 represents aryl substituted with a CF 3 group or with an alkoxy group of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with methoxy; and preferably for these embodiments, R 3 and R 5 are simultaneously H.
  • R 2 represents aryl substituted with a para-methoxy-phenyl group, and preferably, in addition, R 3 and R 5 are simultaneously H.
  • R 2 represents aryl substituted with alkoxy of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with methoxy
  • R 6 is an alkyl of one to 5 carbon atoms, for example methyl
  • R 6 is an aryl group substituted with a hydroxyl, or with halogen (F, Cl, Br, I); and preferably for these embodiments, R 3 and R 5 are simultaneously H.
  • R 2 represents a group selected from aryl substituted with alkoxy of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with methoxy; and simultaneously R 6 is alkyl of one to 5 carbon atoms, for example methyl, or simultaneously R 6 is an aryl group substituted with a hydroxyl, or with halogen; and preferably for these embodiments, R 3 and R 5 are simultaneously H.
  • R 2 represents a phenyl substituted with alkoxy of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with p-methoxy, or R 2 represents phenyl substituted with trihalomethyl, such as a p-trifluoromethylphenyl group; and simultaneously R 7 is a heteroaryl group, for example, 2-benzo[b]furyl; and preferably, for these embodiments, R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are simultaneously H.
  • R 2 represents aryl substituted with alkoxy of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with methoxy
  • R 7 is aryl substituted with hydroxyl or with an alkoxy group of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with methoxy, or
  • R 2 represents aryl substituted with alkoxy of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with methoxy
  • R 7 represents alkenyl substituted with an aryl group, for example, substituted with a phenyl; and preferably for these embodiments, R 3 and R 5 are simultaneously H.
  • R 2 represents aryl substituted with alkoxy of 1 to 5 carbon atoms, for example substituted with methoxy
  • R 7 is aryl substituted with hydroxyl or with an alkoxy group of 1 to 5 carbon atoms, for example substituted with methoxy, or alkenyl substituted with an aryl group, for example substituted with a phenyl; and preferably for these embodiments, R 3 and R 5 are simultaneously H.
  • R 2 represents aryl substituted with alkoxy of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with methoxy
  • R 3 is H
  • R 6 is H, alkyl group or aryl group
  • R 7 is H or aryl substituted with hydroxyl or with an alkoxy group of 1 to 5 carbon atoms, for example, substituted with methoxy; and preferably, for these embodiments, R 3 and R 5 are simultaneously H.
  • R 3 is an unsubstituted aryl; and preferably for these embodiments, R 2 , R 5 and R 6 are simultaneously H; and more preferably for these embodiments, R 2 , R 5 , R 6 and R 7 are simultaneously H.
  • R 3 represents an aromatic heterocycle, which may be unsubstituted, or may be substituted with an alkoxycarbonyl group of 2 to 5 carbon atoms, such as an ethoxycarbonyl group; and preferably for these embodiments, R 2 , R 5 and R 6 are simultaneously H; and more preferably for these embodiments, R 2 , R 5 , R 6 and R 7 are simultaneously H.
  • R 3 is a group selected from benzofuranyl, benzothiophenyl and indole, which may be unsubstituted or may be substituted with an alkoxycarbonyl group of 2 to 5 carbon atoms, such as an ethoxycarbonyl group; and preferably for these embodiments, R 2 , R 5 and R 6 are simultaneously H; and more preferably, for these embodiments, R 2 , R 5 , R 6 and R 7 are simultaneously H.
  • R 3 is a group selected from benzofuranyl, benzothiophenyl and indole, which may be unsubstituted or may be substituted. substituted with an alkoxycarbonyl group of 2 to 5 carbon atoms, such as an ethoxycarbonyl group; and simultaneously and R 7 is a group selected from benzofuranyl, benzothiophenyl and indole; preferably for these embodiments, R 2 , R 5 and R 6 are simultaneously H.
  • R 5 represents H, ethoxycarbonyl, nitro, carboxyl, hydroxymethyl, carbaldehyde, or ethoxyl, and preferably, for these embodiments R 2 , R 3 , R 6 and R 7 are simultaneously H.
  • R 7 and R 6 independently represent a fragment
  • D, B, E, G independently represent CH or C-R, where R can be unsubstituted alkyl of one to three carbon atoms, unsubstituted aryl or unsubstituted cycloalkyl, Z represents CH and W represents O.
  • R 7 or R 6 represents a fragment
  • R 7 represents an unsubstituted aryl group, such as phenyl, and preferably, for these embodiments R 2 , R 3 , R 5 and R 7 are simultaneously H.
  • R 7 represents a benzofuranyl group, and preferably, for these embodiments R 2 , R 3 , R 5 and R 6 are simultaneously H.
  • the compound of formula I is selected from:
  • the compound of formula I is 7-(benzofuran-2-yl)imidazo[1,2-a]pyridine. (26), PS1906.
  • the compound of formula I is ethyl 5-(imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)-1H-indole-2-carboxylate, compound (31).
  • the present invention also relates to a process for preparing a compound of formula I comprising:
  • the reaction in step 1) can be carried out in the presence of a Pd(0) catalyst and an inorganic base such as potassium carbonate.
  • the temperature for the reaction of step 1) can be between 80 and 150 °CT
  • the reaction in step 1) can be carried out conventionally (18-24 h) or with microwaves (1-5 h).
  • the solvent for the reaction in step 1) may be, for example, a polar solvent, such as 1,2-dimethoxyethane, 1,4-dioxane, DMF, DMSO.
  • step 2) can be carried out in the presence of a solvent, such as those mentioned for step 1) and an organic or inorganic base, such as sodium or potassium bicarbonate, sodium or potassium phosphate, potassium acetate, potassium methoxide.
  • a solvent such as those mentioned for step 1)
  • an organic or inorganic base such as sodium or potassium bicarbonate, sodium or potassium phosphate, potassium acetate, potassium methoxide.
  • the reaction in step 2) can be carried out at a temperature between 25 and 120 °C, preferably under reflux.
  • An additional alternative process for preparing a compound of formula I comprises:
  • the process comprises reacting 7-bromoimidazo[1,2-a]pyridine and (hetero)arylboronic acids by Suzuki couplings.
  • a third alternative to the process for preparing the compounds of formula I, when they carry a heteroaryl as a substituent on the C3 carbon, is to use the Heck reaction, which comprises reacting an imidazopyridine with a haloheteroaryl, in the presence of a Pd(0) catalyst that is generated in situ.
  • a further object of the invention relates to a compound of formula I, as described above, for use as a medicament.
  • said use comprises the treatment of an inflammatory disease in a subject.
  • treatment refers to the medical treatment of a subject with the intent to cure, ameliorate, stabilize, or prevent a disease, pathological condition, or disorder.
  • This term includes active treatment, i.e., treatment specifically directed at the amelioration of a disease, pathological condition, or disorder, and also includes causal treatment, i.e., treatment directed at the elimination of the cause of the associated disease, pathological condition, or disorder.
  • this term includes palliative treatment, i.e., treatment designed to alleviate symptoms rather than cure the disease, pathological condition, or disorder; preventative treatment, i.e., treatment directed at partially or completely minimizing or inhibiting the development of the associated disease, pathological condition, or disorder; and supportive treatment, i.e., treatment employed to supplement other specific therapy directed at the amelioration of the associated disease, pathological condition, or disorder.
  • palliative treatment i.e., treatment designed to alleviate symptoms rather than cure the disease, pathological condition, or disorder
  • preventative treatment i.e., treatment directed at partially or completely minimizing or inhibiting the development of the associated disease, pathological condition, or disorder
  • supportive treatment i.e., treatment employed to supplement other specific therapy directed at the amelioration of the associated disease, pathological condition, or disorder.
  • treatment although intended to cure, ameliorate, stabilize, or prevent a disease, pathological condition, or disorder, need not actually result in cure, amelioration, stabilization, or prevention.
  • the effects of treatment may be measured
  • Such measurements and evaluations may be made in qualitative and/or quantitative terms.
  • the characteristics or features of a disease, pathological condition, or disorder and/or the symptoms of a disease, pathological condition, or disorder may be reduced to any effect or any amount.
  • treatment and “treating” refer to the medical management of a subject with the intent to cure, ameliorate, or stabilize such inflammatory disease.
  • the term "subject” includes, but is not limited to, animals, plants, and any other organism or entity.
  • the subject may be a vertebrate, more particularly a mammal (e.g., a human, horse, pig, rabbit, dog, sheep, goat, non-human primate, cow, cat, guinea pig, or rodent), fish, bird, or reptile or amphibian.
  • the term does not denote a particular age or sex. Thus, adult and newborn subjects, as well as fetuses, whether male or female, are covered by the definition of subject.
  • a patient is a subject afflicted with a disease or disorder.
  • patient includes human and veterinary subjects.
  • one or more compounds of Formula I for use in treating an inflammatory disease may be administered to a subject comprising a human or an animal, including but not limited to a mouse, dog, cat, horse, bovine or ovine and the like.
  • the compounds of formula I are capable of inhibiting the phosphorylating activity of the Alk5 kinase, which inhibits the activation of macrophages and thus inhibits the inflammatory response.
  • inhibitor means to reduce or decrease the phosphorlinate activity of Alk5 kinase. This may be a complete inhibition of kinase activity or expression, or a partial inhibition. The inhibition may be compared to a control or a standard level. The inhibition may be 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
  • the inflammatory disease is selected from the group consisting of diseases that have an inflammatory and/or pro-fibrotic component.
  • the inflammatory disease is an inflammatory lung disease selected from the group consisting of acute respiratory distress syndrome, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary fibrosis, pulmonary hypertension, pulmonary inflammation, preferably acute respiratory distress syndrome and pulmonary fibrosis.
  • the inflammatory disease is an inflammatory bowel disease that has a strong inflammatory component, such as Crohn's disease and ulcerative colitis,
  • the inflammatory disease is a cardiovascular inflammatory disease that has a strong inflammatory component such as acute myocardial infarction, myocarditis, or atherosclerosis.
  • the inflammatory disease is any inflammatory disease that has a strong inflammatory component, such as type 2 diabetes, multiple sclerosis or cancer.
  • the compound of formula I is ethyl 5-( ⁇ midazo[1,2-a]p ⁇ r ⁇ d ⁇ n-3- ⁇ l)-1 H-indole-2-carboxylate (31) (PS1801).
  • the compound of formula I is ethyl 5-( ⁇ midazo[1,2-a]p ⁇ r ⁇ d ⁇ n-3- ⁇ l)-1/7-indole-2-carboxylate (31) (PS1906).
  • the concentration of PS1801 or PS1906 administered to a subject is between 1000 mg/kg and 1 pg/kg of body weight, preferably between 500 mg/kg and 2 pg/kg, more preferably between 100 mg/kg and 3 pg/kg, even more preferably between 50 mg/kg and 4 pg/kg, even more preferably between 25 mg/kg and 5 pg/kg, even more preferably between 20 mg/kg and 8 pg/kg, even more preferably between 15 mg/kg and 10 pg/kg, even more preferably between 1 mg/kg and 50 pg/kg, and even more preferably between 800 pg/kg and 80 pg/kg.
  • Another additional object of the invention relates to a pharmaceutical composition, comprising one or more compounds of formula I, as defined above and one or more additional active compounds, and/or one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants or vehicles.
  • pharmaceutically acceptable is meant a material that can be administered to a subject together with the selected compound without causing any undesirable biological effects or interacting deleteriously with any of the other components of the pharmaceutical composition in which it is contained.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a pharmaceutically acceptable disintegrant, surfactant, binder, and lubricant.
  • the pharmaceutical composition comprises another additional active compound, such as steroids or corticosteroids (for example, dexamethasone), and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as salicylates, ibuprofen, naproxen.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • the other active ingredient is Dexamethasone.
  • the additional active compound is another compound of formula I, described above.
  • a combination of when referring to two or more additional compounds, agents, or active pharmaceutical ingredients, means the administration of two or more compounds, agents, or active pharmaceutical ingredients to the subject before, simultaneously, or subsequently to each other.
  • the additional active compound is selected from a mucolytic agent, a bronchodilator, an antibiotic, an antiviral agent, an anti-inflammatory agent, a nutritional agent and combinations thereof.
  • the compounds of Formula I of the invention and pharmaceutically acceptable compositions may be administered to a subject orally, intravenously, rectally, parenterally, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, topically (as powders, ointments or drops), buccally, as an oral or nasal spray, or the like, depending on the severity of the infection being treated preferably intravenously.
  • the compounds or compositions of the invention may be administered at dosage levels of about 0.01 mg/kg to about 50 mg/kg and preferably about 1 mg/kg to about 25 mg/kg, of the subject's body weight per day, one or more times per day, to obtain the desired therapeutic effect.
  • Another additional object of the invention relates to a pharmaceutical composition, comprising one or more compounds of formula I, as defined above and one or more additional active compounds, and/or one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants or vehicles for use in the treatment of an inflammatory disease.
  • each of the terms “comprises”, “consists essentially of” and “consists of” may be substituted for either of the other two terms.
  • the terms “a” or “an” may refer to one or a plurality of the elements they modify (e.g., "a reagent” may mean one or more reagents), unless it is contextually clear that one or more of the elements is being described.
  • the term “about” as used herein refers to a value within 10% of the underlying parameter. (i.e., plus or minus 10%; for example, a weight of "about 100 grams” may include a weight between 90 grams and 110 grams).
  • listing includes all ranges between any two of the listed values (for example, listing "80%, 90%, or 95%” includes ranges of "80% to 90%,””80% to 95%,” and “90% to 95%”).
  • the advantages of the present invention include: advantages at the production level, as these are chemically synthesized compounds, which have been optimized in the laboratory, maintaining identical properties of solubility, stability and reproducible characteristics in the product batches. This optimization should lead to advantages of both an economic nature, as the synthesis is cheaper than obtaining it from natural products, and the speed of production of the compounds.
  • the dose used in the in vitro tests shows that very little product is required to obtain the desired effect, and at this dose no toxic effect has been observed in the cells analyzed.
  • Figure 1 Graphical representation of the percentage of inhibition of the Alk5 kinase in vitro of different synthesized compounds of the present invention, (the commercial compound GW788388 (GW) was used as a control).
  • FIG. 2 Evaluation of cell viability (cytotoxicity) on THP-1-XBIueTM-CD14 human macrophages of the different compounds at three different concentrations (1, 5 and 10 pM), the vehicle is PBS. GW788388 (GW) was used as a control. ***p ⁇ 0.001
  • the data were represented as the mean value ⁇ the standard error of the mean. Being # p ⁇ 0.01 ; ## p ⁇ 0.001 ; ***p ⁇ 0.0001 analyzed by one-way ANOVA adjusted with Dunnet's multiple comparison method.
  • a reaction mixture of imidazo[1,2-a]pyridine (115 mg, 0.973 mmol), bromobenzene (0.204 mL, 1.946 mmol), Pd(AcO) (0.027 mg, 0.097 mmol) and KOAc (0.200 mg, 1.946 mmol) in DMF (4 mL) is irradiated with microwaves under an inert atmosphere. After 1 h at 160 °C the solvent is removed under reduced pressure and the reaction mixture is extracted using AcOEt as organic solvent. The organic phases are dried over MgSO4 and the solvent is removed under reduced pressure.
  • the reaction crude is purified on a chromatographic column using a Toluene/MeOH mixture (10:1) to obtain 147 mg, Yield 77%.
  • R 2 H, Aryl
  • the corresponding 4- or 5- halo-2-aminopyridine (1 eq) is added to a mixture of the corresponding boronic acid (1 ,2 eq), K2CO3 (1 ,3 eq) and Pd(PPhs)4 (2% mol) in a mixture of DME/H2O (4:1 , 5 mL/mmol) under an inert atmosphere in a microwave tube. After 30 minutes at 110 °C the solvent is evaporated under reduced pressure and the reaction crude is purified in a chromatographic column using the corresponding eluents.
  • the corresponding 4- or 5- halo-2-aminopyndine (1 eq) is added to a mixture of the corresponding boronic acid (1 .6 eq), Na2COs (2 eq) and Pd(PPhs)4 (2-10% mol) in a dioxane/FW mixture (12:1 , 20 mL/mmol), and the mixture is refluxed under argon for 18 h. After evaporating the solvent under reduced pressure, the reaction crude is purified on a chromatographic column using the corresponding eluents.
  • R 2 H, Aryl
  • Heterocyclization (B1) The corresponding a-halo-ketone (1,5 - 2 eq) is added to a mixture of the corresponding halo-2-aminopyridine and NaHCO3 (0.1 g/5 mL -if EtOH was used as solvent-) in EtOH.
  • the reaction mixture was heated at a temperature above the boiling point of the solvent used, in each case, for 18 hours. After the reaction time had elapsed, the solvent was evaporated under reduced pressure and the reaction crude was suspended in an aqueous solution of K2CO3 and subsequently extracted using AcOEt. The organic phases were dried over anhydrous MgSO4, filtered and the solvent was evaporated under reduced pressure to obtain the corresponding imidazo[1,2-a]pyridines.
  • the corresponding halo-imidazo[1,2-a]pyridine (1 eq) is added to a mixture of the corresponding boronic acid (1,2 eq), and the corresponding base (NaHCCh (1,3 eq) or K2CO3 (1,1 eq)) and Pd( PPh3 )4 (2 mmol%) in 1,4-dioxane/ H2O (3:1) or DME/ H2O (4:1) - depending on the reaction- in a microwave tube.
  • the mixture is heated at 130 °C for 30 minutes. After the reaction time, the solvent was evaporated under reduced pressure and the reaction crude was purified on a chromatographic column to obtain the corresponding ⁇ midazo[1,2-a]pyridines.
  • the corresponding halo-imidazo[1,2-a]pyridine (1 eq) is added to a mixture of the corresponding boronic acid (1,2 eq) and the corresponding base (NaHCOs (1,3 eq) or K2CO3 (1,1 eq)) and Pd( PPh3 ) 4 (2 mmol%) in 1,4-dioxane/H2O (3:1) or DME/ H2O (4:1) - depending on the reaction.
  • the mixture is heated at reflux for 18 h . After the reaction time, the solvent was evaporated under reduced pressure and the reaction crude was purified on a chromatographic column to obtain the corresponding imidazo[1,2-a]pyridines.
  • 6-lodo-2-(4-(trifluoromethyl)phenyl)imidazo[1,2-a]pyridine (25)
  • a mixture of 5-[odo-2-aminopyridine (41 mg, 0.136 mmol), NaHCO3 (80 mg, 0.1 g/5 mL EtOH) and 2-bromo-1 -(4-(t ⁇ fluoromethyl)phenyl)ethan- 1-one (60 mg, 0.204 mmol) in EtOH (4 mL) was stirred at 90 °C and the crude reaction mixture was purified by column chromatography using C ⁇ Ch/ MeOH as eluent to obtain 25 mg, Yield 47%.
  • reaction crude was purified on a chromatographic column using C ⁇ Ch/MeOH as eluent to obtain 440 mg of compound 26. Yield 92 %.
  • the compound PS1906 also has an anti-inflammatory effect in an in vivo murine model of acute lung injury (ALI), where it presents major macroscopic differences and a significantly different effect from the group of sick mice treated with LPS.
  • ALI acute lung injury
  • Flow cytometry analysis of bronchoalveolar lavage showed a dose-dependent anti-inflammatory effect of the compound PS1906, both in neutrophils and lymphocytes and in the total count of infiltrated cells.
  • Pd(OAc)2 (10 mmol%) is added to a solution of the corresponding imidazo[1,2- a]pyridine (1 eq), the corresponding haloheteroanl (1,3 eq) and KOAc (2 eq) in DMF (4 mL) in a microwave tube, under a stream of argon. After irradiating the tube at 165 °C for 2 hours, a concentrated solution of KOH (1 mL) is added to the reaction mixture and it is left under stirring for 1 hour at room temperature. After the reaction time has elapsed, H2O is added and the reaction mixture is extracted with AcOEt. The organic phases are dried over MgSÜ4 and the solvent is evaporated under reduced pressure.
  • reaction crude was purified on a chromatographic column using a Hexane/AcOEt (1:4) mixture as eluent to obtain the corresponding product (42) as a yellow solid with a yield of 33%.
  • the commercially available recombinant Alk5 protein (Abeam, ref. ab105908) was used, as well as the commercial Kinase-Glo® Luminiscent kinase assay platform (Promega, ref. TB372), which determines the adenosine triphosphate (ATP) not consumed in the phosphorylation reaction by its conjugation to luciferin in a reaction catalyzed by the luciferase enzyme in the presence of Mg 2+ . The observed luminescence is inversely proportional to the kinase activity.
  • the compound GW788388 Hydrate (Sigma-Aldrich ref. SML0116), widely used in this type of assays, was used as an inhibition control.
  • the phosphorylation reaction assay was developed with serial dilutions of substrate (1:8 was estimated as the best) and different concentrations of ATP, in this case the concentration of 100 pM was estimated as the ideal.
  • concentration of recombinant kinase was determined by performing assays with serial dilutions of the same (from 20 ng to 0.62 ng), determining 3 ng as the ideal concentration per well (final volume 100 pL).
  • the chemically synthesized compounds were tested. They were initially dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 1 mM. From this stock solution, dilutions were made in kinase buffer (Tris-HCl pH 7.540 mM; MgCl220 mM; Bovine serum albumin (BSA) 0.1 mg/mL) of 10 pM and titrating concentrations of 5 and 10 pM. The reactions were carried out in a total volume of 50 pL in multi-well plastic plates (96 wells) of Microtiter® MicroliteTM 1+ microtiter (Thermo Scientific, ref. 7571), which can be used to determine luminescence in luminometers. The reaction included:
  • the incubation was 2h at room temperature with shaking and darkness following the instructions of the commercial system.
  • THP-1-XBIueTM-CD14 macrophages (InvivoGen, 8 to 13 passages), derived from human THP-1 monocytes, and stably expressing the NF-kB and AP-1 promoter-inducible alkaline phosphatase enzyme gene, were evaluated.
  • the dye MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetratozoliumbromide) (Biotium) was used. This assay is based on the cleavage of the tetrazolium salt MTT (yellow) to form formazan crystals (purple), produced by metabolically active cells.
  • the formazan is solubilized with DMSO and its concentration is determined by spectrophotometry; the optical density is proportional to the number of viable cells.
  • THP1-XBIueTM-CD14 monocytes (InvivoGen, 8–13 passages) were differentiated to a macrophage-like phenotype using phorbol-12-myostat-13-acetate (PMA, Sigma Aldrich), which at 100 ng/mL has been shown to be the most effective alternative for obtaining THP-1 macrophages, with similarity to peripheral blood mononuclear macrophages (PBMC) (Starr et al., 2018).
  • PMA phorbol-12-myostat-13-acetate
  • PBMC peripheral blood mononuclear macrophages
  • cells were seeded in 96-well plates at a density of 3 ⁇ 105 cells/mL in RPMI 1640 medium (Gibco) supplemented with 10% FBS, penicillin, streptomycin (both at a concentration of 100 pg/mL, Sigma-Aldrich) and PMA (100 ng/mL) (Sigma-Aldrich), and were cultured at 37 °C, 5% CO2 for 48 h. The medium was then replaced with an equivalent one without the PMA supplementation, and the cells were cultured this time at 37 °C, 5% CO2 for a further 24 h.
  • RPMI 1640 medium Gibco
  • penicillin penicillin
  • streptomycin both at a concentration of 100 pg/mL
  • PMA 100 ng/mL
  • Cells were then washed twice with PBS (10 mM, pH 7.4), and 100 pL of RPMI 1640 supplemented with penicillin and streptomycin (100 pg/mL) but without FBS was added. Cells were plated in 96-well plates under identical conditions as those used in the anti-inflammation assays. Cells were then washed with PBS and treated with different compounds: 1) PBS (10 pL) (positive growth control, (vehicle)); 2) different concentrations of the produced chemical compounds (1 pM, 5 pM and 10 pM).
  • the NF-kB transcription factor As a biomarker, which is involved in inflammatory processes.
  • the THP-1-XBIueTM-CD14 cell line (InvivoGen) has been used, derived from human THP-1 monocytes, and which stably expresses the gene for the NF-kB and AP-1 promoter-inducible alkaline phosphatase enzyme.
  • These cells stably overexpress CD14, a macrophage-specific Toll-like receptor (TLR), such as TLR4.
  • TLR macrophage-specific Toll-like receptor
  • THP1-XBIueTM-CD14 cells activate these transcription factors and consequently the synthesis and secretion of alkaline phosphatase, which is easily detected by adding the commercial substrate QUANTI-BlueTM (InvivoGen), which turns blue/purple in the presence of the secreted phosphatase.
  • THP1-XBIueTM-CD14 cells (InvivoGen, passages 8–13) were processed as above, differentiating into macrophages in the presence of PMA (Sigma Aldrich). Cells were then washed twice with PBS (10 mM, pH 7.4), and 100 pL of RPMI 1640 supplemented with penicillin and streptomycin (100 pg/mL) but without FBS was added. Cells in culture were subsequently treated with: 1) 10 pL PBS (negative control); 2) GW788388 (positive control); and 5 pM concentrations of the synthesized compounds.
  • PMA Sigma Aldrich
  • LPS lipopolysaccharide
  • THP-1-XBIueTM-CD14 macrophages (InvivoGen, 8 to 13 passages), derived from human THP-1 monocytes, and which stably express the gene for the NF-kB and AP-1 promoter-inducible alkaline phosphatase enzyme, were evaluated.
  • Caco-2 human intestinal epithelial cells (ATCC®, HTB-37TM, 10 to 12 passages) were evaluated.
  • trypan blue (Gibco) was used as an exclusion stain. This dye penetrates those cells whose membrane is damaged (a sign of cell death), and stains their cytoplasm dark blue.
  • the cell suspensions tested were centrifuged at 500 x g (5 min at 24 °C), the cell pellets were resuspended in 0.1 mL of PBS, and then 10 pL were mixed with 10 pL of trypan blue (0.4%) filtered through 0.22 pm.
  • the percentage of live cells was determined in 10 pL of the above mixture using a chamber and a CountessTM cell counting apparatus (Invitrogen). Eight replicates of the biological assays were performed.
  • both cell types were seeded in 96-well plates under identical conditions to those used in the anti-inflammation assays.
  • the cells were then washed with PBS and treated with different compounds: 1) PBS (10 pL) (positive growth control, (vehicle)); 2) 20% DMSO (negative control, since high doses of this compound are cytotoxic); 3) different concentrations of the compounds PS1801 and PS1906 (1, 5 and 10 pM).
  • the plates were incubated for 24 hours at 37 °C, 5% CO2 and then 10 pL of MTT was added to each well and the plate was incubated for 4 hours at 37 °C, 5% CO2.
  • the formazan crystals formed were dissolved in 180 pL of DMSO and the plate was incubated for 20 minutes with shaking at room temperature. The absorbance was measured in each well at 595 nm (test) and at 655 nm (background), following the manufacturer's instructions, in a ⁇ MarkTM Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad). The samples were analyzed in triplicate.
  • THP1-XBIueTM-CD14 monocytes (InvivoGen, passages 8 to 13) were differentiated to a macrophage-like phenotype using PMA (Sigma Aldrich) and seeded in 96-well plates at a density of 3 x 105 cells/mL in RPMI 1640 medium (Gibco) supplemented with 10% FBS, penicillin, streptomycin (both at a concentration of 100 pg/mL, Sigma-Aldrich) and PMA (100 ng/mL) (Sigma-Aldrich), and cultured at 37 °C, 5% CO2 for 48 h.
  • PMA Sigma Aldrich
  • the medium was then replaced with an equivalent medium, but without PMA supplementation, and the cells were cultured this time at 37 °C, 5% CO2 for a further 24 h.
  • the cells were then washed twice with PBS (10 mM, pH 7.4), and 100 pL of RPMI 1640 supplemented with penicillin and streptomycin (100 pg/mL) but without FBS was added.
  • LPS lipopolysaccharide
  • mice of the C57BL/6J-OlaHsd strain were chosen.
  • Adult mice were maintained under pathogen-free conditions in a temperature-controlled room with a 12-h light-dark cycle. Diet and water were available ad libitum.
  • Mice were anesthetized i.p. with an injection of an anesthetic cocktail containing atropine sulfate (1 mg/kg; B. Braun, 1 mg/mL), xylazine hydrochloride (20 mg/kg; Rompun® Bayer, 20 mg/mL) and ketamine (100 mg/kg; Anesketin Dechra, 100 mg/mL).
  • mice With the animal properly anesthetized, the trachea was exposed, a catheter (Introcan Safety 22G, Braun) was inserted, and mice received an intratracheal injection of sterile lipopolysaccharide (LPS) (L2262, Sigma) at a high dose of 10 mg/kg in 25 ⁇ l of 1X PBS, followed by 200 ⁇ l of air to ensure deposition in each lung. Healthy control mice received an intratracheal injection of 25 ⁇ l of PBS. After intratracheal administration, wounds were closed and mice were allowed to recover with free access to food and water.
  • LPS sterile lipopolysaccharide
  • the lung was removed by separating the right lobe from the left.
  • the right lobe was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) for 24 h at 4°C, and the left lobe was rapidly frozen in liquid nitrogen for subsequent protein isolation and immunoblotting assays.
  • PFA-fixed right lobes were placed in 70% alcohol at 4°C and cut transversely into two portions.
  • ALI score histopathological scoring of acute lung injury
  • both transverse portions were dehydrated through an ethanol series, cleared in xylene, embedded in paraffin wax, cut into 5 ⁇ m sections, mounted on Superfrost Plus slides (Thermo Fisher Scientific), and stained with hematoxylin and eosin solution.
  • Tissues were processed at the Histopathology Unit of the CNIC, and all slides were scanned with a NanoZoomer-2.0-RS digital slide scanner (C110730®, Hamamatsu, Japan) and visualized with NanoZoomer Digital Pathology software (Hamamatsu).
  • ALI was scored with a semiquantitative system, using a 0 to 4 scale combining assessments of inflammatory cell infiltration of the airspace and vessel wall, alveolar congestion, hemorrhage, alveolar wall thickness, and hyaline membrane formation. A score of 0 indicates no lesion, 1 indicates mild lesion, 2 moderate lesion, 3 severe lesion, and 4 very severe lesion.
  • the % reduction in kinase activity values refer to the 100% reduction in activity of the inhibition control compound GW788388 Hydrate (Sigma-Aldrich ref. SML0116).
  • Figure 1 shows the results obtained with the different compounds, where it is observed that the compound PS1906 (16) was one of those that showed the greatest inhibitory effect on the Alk5 tyrosine kinase.
  • ALI acute lung damage
  • This model is evaluated following a score extracted from the histopathological analysis of fixed lung sections stained with Hematoxylin and Eosin.
  • Panel A of Figure 6 shows representative images of the lung of each group where macroscopic differences can be observed.
  • the quantification of the ALI score shows a positive effect for the product PS1906.
  • Flow cytometry analysis of bronchoalveolar lavage showed a dose-dependent anti-inflammatory effect of compound PS1906, both in neutrophils (panel C of Fig. 6) and in lymphocytes (panel D of Fig. 6; although these results do not show statistical significance probably due to the low participation of this cell type in early stages of acute lung damage).

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Abstract

La presente invención se refiere a la síntesis química y producción de compuestos derivados de Imidazo[1,2-a] piridina de fórmula I : (I) donde R2, R3, R5, R6 y R7 tienen los significados indicados en la descripción, método de obtención de los mismos, así como a su uso terapéutico como composición farmacéutica para uso antiinflamatorio in vitro e in vivo en enfermedades que cursen con procesos inflamatorios y pro-fibróticos.

Description

DERIVADOS DE IMIDAZO[1,2-A]PIRIDINA CON ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está relacionada con la obtención de productos químicos sintéticos con aplicación cosmética, nutracéutica y terapéutica (sector Biomédico).
Se enmarca en el campo de la preparación de nuevos compuestos mediante proceso de síntesis química de derivados de imidazo[1 ,2-a] piridina mediante reacción de acoplamiento de Suzuki y heterociclación, con potente actividad antiiflamatoria in vitro en cultivos celulares e in vivo en modelos de ratón.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La inflamación es una respuesta normal del sistema inmunológico a la infección. Sin embargo, cuando se permite que continúe sin control, puede resultar en trastornos autoinmunes o autoinflamatorios, enfermedades neurodegenerativas o incluso cáncer. La comprensión cada vez mayor de que la inflamación crónica es crucial en muchas enfermedades abre nuevas vías de tratamiento.
Actualmente se encuentra disponible una variedad de agentes antiinflamatorios seguros y efectivos, incluida la aspirina y otros medicamentos antiinflamatorios no esferoides (AINE), con muchos más medicamentos en desarrollo. Un fármaco antiinflamatorio eficaz debería poder inhibir el desarrollo de la inflamación sin interferir en la homeostasis normal. Por lo general, los medicamentos antiinflamatorios inhiben las ciclooxigenasas (COX), que participan en la biosíntesis de prostaglandinas que promueven la inflamación. Los AINE convencionales se asocian con efectos secundarios gástricos y renales, ya que inhiben tanto la COX-1 constitutiva como la COX-2 inducible. La mayoría de los inhibidores selectivos de la COX-2 (COXIB) carecen de efectos secundarios gástricos, pero están asociados con efectos secundarios cardíacos en el uso a largo plazo.
Por otro lado, el exceso de especies reactivas al oxígeno (ROS) en el cuerpo causa estrés oxidativo, que daña la proteína p53 y la poli (ADP-ribosil)acion (PARP), que, a su vez, desencadena la activación de proteasas (calpaínas), la degradación de proteínas y la alteración de las funciones mitocondriales, lo que reduce los niveles de ATP y finalmente conduce a la necrosis celular. La desregulación de ROS puede causar disfunción celular que resulta en el desarrollo de muchas enfermedades como cánceres, enfermedades cardiovasculares, accidentes cerebrovasculares y, en última instancia, la muerte.
Los enfoques actuales para superar la inflamación incluyen el uso de derivados antiinflamatorios inmuno selectivos, agonistas selectivos del receptor de glucocorticoides, estatinas, inhibidores de histonas desacetilasas, agonistas de PPAR, resolvinas y proteínas e inhibidores de TNFa, entre otros.
El factor de crecimiento transformante-beta (TGFP) es un agente crucial en la homeostasis del sistema inmunológico, involucrado entre otros, en la migración de células inflamatorias, inhibición del crecimiento, invasión, transición epitelio-mesenquimal (EMT), remodelación de la matriz extracelular (MEC) y la inmunosupresión. Sin embargo, aunque normalmente está regulado dinámicamente e involucrado en el mantenimiento de la homeostasis tisular, el TGFp a menudo se sobreexpresa crónicamente en diferentes patologías, como cáncer, fibrosis e inflamación. La vía de señalización de TGFp se ha convertido en un objetivo popular para el desarrollo de fármacos.
Además, TGFp es la citoquina profibrogénica más potente y su expresión aumenta en casi todas las enfermedades fibróticas. Existe una creciente evidencia de que las especies reactivas de oxígeno (ROS) modulan la señalización de TGFp a través de diferentes vías. En particular, TGFpi aumenta la producción de ROS y suprime las enzimas antioxidantes, lo que conduce a un desequilibrio redox. Las ROS, a su vez, inducen / activan TGFpi y median muchos de los efectos fibrogénicos de TGFp.
En ese sentido, los compuestos que inhiben selectivamente los receptores de TGFp podrían tener el potencial de inhibir la respuesta inflamatoria y desarrollarse para aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de la fibrosis, carcinogénesis en etapa tardía, aterosclerosis y enfermedades de cicatrización excesiva en las que la actividad de TGFp se ha implicado en la vía de señalización. La inhibición de TGFp es capaz de reducir la inflamación perivascular, retardando así el progreso de la enfermedad. En este sentido, la deficiencia de su receptor ALK5 es capaz de inhibir la inflamación mediada por macrófagos. A su vez, la vía TGFp / ALK5 se ha propuesto como una diana terapéutica capaz de restaurar la sensibilidad a la actividad antiinflamatoria de los corticoides en inflamaciones provocadas por infecciones virales respiratorias. En la mayoría de las células, TGFp envía señales a través de la combinación de TGFpR- II y ALK5.
ALK5 es una tirosina quinasa que es el receptor tipo I del factor de crecimiento tumoral beta (TGFp-l), y que ha sido descrito como mediadora en la respuesta inflamatoria, inductora de fibrosis de diversos orígenes, así como promotora de la supervivencia, la migración, la diferenciación y la proliferación celular, relacionada con diversas patologías, incluyendo procesos tumorales. De hecho, la inhibición de Alk5 tiene un claro efecto inhibidor de la respuesta inflamatoria promoviendo la respuesta antiinflamatoha en macrófagos humanos. A la inhibición de Alk5 se refiere Ling LE, Lee WC. Tgf-beta type I receptor (Alk5) kinase inhibitors in oncology. Curr Pharm Biotechnol. 2011 Dec;12(12):2190-202. https://doi.org/10.2174/138920111798808257.
Por otro lado, recientemente se ha descrito que el direccionamiento de la vía de señalización TGFp / Smad atenúa la formación de cicatrices queloides e hipertróficas. La formación de cicatrices aberrantes, que incluye cicatrices queloides e hipertróficas, se asocia con una cicatrización patológica desorganizada proceso con inflamación crónica. La vía de señalización de TGFp / Smad es la vía más canónica a través de la cual se regula la formación de colágenos en los fibroblastos y miofibroblastos. En los últimos años se han desarrollado vahas estrategias terapéuticas que se dirigen a la vía de señalización de TGF-p / Smad para atenuar la formación anormal de cicatrices en la piel.
Muy recientemente, también se ha descrito el posible tratamiento de COVID-19 con bloqueo de TGFp (Chen et al., 2020; Ferreira-Gomes et al., 2021). La principal causa de muerte en pacientes infectados es un síndrome de dificultad respiratoria aguda grave (SDRA) causado por el virus SARS-Cov-2. El síndrome se atribuye a respuestas inflamatorias en gran parte incontroladas caracterizadas por una "tormenta de citocinas", edema y fibrosis en los pulmones en las etapas finales. Esto conduce al fallo funcional de los pulmones y a la muerte de los pacientes.
El síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA) es una forma de edema pulmonar no cardiogénico, debido a una lesión alveolar secundaria a un proceso inflamatorio intenso de los pulmones. A pesar de su alta incidencia, el SDRA no tiene un tratamiento especifico, más allá de atacar el origen (antibióticos en caso de infección bacteriana), minimizar la ventilación potencialmente defina y evitar un balance de líquidos positivo. La fibrosis en el pulmón puede deberse principalmente al factor de crecimiento transformante beta (TGFP). Además, el TGFp también participa en la homeostasis de líquidos en el pulmón. Se ha propuesto que la tormenta de citocinas y la patogénesis de COVID-19 son una consecuencia de la red de citocinas desequilibrada, resultante del aumento de la actividad biológica del factor de crecimiento transformante-p (TGFP) (Shen et al., 2021). El aumento repentino e incontrolado del TGF-p activo (posiblemente con la ayuda de algunas citocinas proinflamatorias como TNFa, IL-6 e IL-1 p) inevitablemente dan como resultado un edema y fibrosis rápidos y masivos que remodelan y finalmente bloquean las vías respiratorias. Además, TGFp, por internalización del canal de sodio epitelial (ENaC), también suprime el sistema antioxidante y las especies reactivas de oxígeno juegan un papel importante en la lesión pulmonar, que se eleva durante la infección por SARS-CoV-2. Con todas estas características, se sugiere una posible inmunoterapia para el COVID-19 grave mediante el bloqueo del factor de crecimiento transformante beta (TGFP).
Recientemente ha sido descrita la evaluación antiinflamatoria de derivados del ácido ¡midazo[1 ,2-a]p¡r¡d¡ncarboxíl¡co (Márquez-Flores et al, 2012), derivados de imidazo[1 ,2- a]piridina 2,3,6-sustituidos con actividad anti-inflamatoria in vitro medida mediante el ensayo de desnaturalización de proteína de albúmina de suero bovino (BSA), (Budumuru et al, 2019), y 7-aril-¡midazo[1 , 2-a] pi rid in-3-i Iq u inol inas como inhibidores de ALK. ((Engers et al., 2020).
Galunisertib y Vactosertib son inhibidores de la via TGFp y/o ALK5 que han mostrado un buen perfil de seguridad en ensayos en Fase I, y están siendo considerados como potenciales agentes antitumorales debido a la implicación de la mencionada vía en la proliferación y migración celular.
WO 2013147711 se refiere a compuestos entre los cuales se encuentran ciertas imidazo- piridinas que actúan como inhibidores de las quinasas MNK2a, MNK2b, MNK1a y MNK1 b, que interactúan con la quinasa MAP, a composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos y al uso de los compuestos para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades, como enfermedades proliferativas, por ejemplo, cáncer, enfermedades inflamatorias, enfermedad de Alzheimer. Los compuestos divulgados por WO2013147711 son distintos de los preparados en la presente invención. Ademas, no hay ninguna evidencia en WO2013147711 que muestre que dichos compuestos tienen capacidad inhibidora de la tirosina quinasa Alk5, que es el receptor I del factor de crecimiento transformante o TGFp, que es la base de la actividad de los compuestos de la presente invención.
W02008014219 divulga un método para inhibir la actividad/función de PB quinasas utilizando derivados de tiozolidinediona. Entre los compuestos divulgados se encuentran algunas se refiere a compuestos entre los cuales se encuentran ciertas imidazo-piridinas que actúan como inhibidores. Se dice que son útiles para tratar estados patológicos seleccionados tales como trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias o lesiones pulmonares. Los compuestos divulgados por W02008014219 son distintos de los preparados en la presente invención. Ademas, no hay ninguna evidencia en W02008014219 que muestre que dichos compuestos tienen capacidad inhibidora de la tirosina quinasa Alk5, que es el receptor I del factor de crecimiento transformante o TGFp, que es la base de la actividad de los compuestos de la presente invención.
US2004122044 divulga formulaciones farmacéuticas con compuestos que tienen un esqueleto imidazo[1 ,2-a]-piridin-3-il-amida o compuestos de amina como ingredientes activos para inhibir la óxido nítrico sintasa. Se mencionan también algunos tratamientos de enfermedades que se pueden tratar con dichos compuestos. Sin embargo, los compuestos divulgados por US2004122044 son distintos de los preparados en la presente invención. Ademas, solo muestra ejemplos de actividad anti NO sintasa, pero no hay ninguna evidencia en US2004122044 que muestre que dichos compuestos tienen actividad para las enfermedades concretas o problemas para los cuales están previstos los compuestos de la presente invención.
WO2019099336 se refiere a compuestos derivados de indol entre los cuales se encuentran ciertas imidazo-piridinas, útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. No obstante, las imidazo-piridinas divulgadas no coinciden en ningún caso con compuestos de la presente invención, puesto que según la fórmula (I) de la reivindicación principal, cuando el sustituyente en las posiciones 6 o 7 del esqueleto imidazo-pridina es un heterociclo, dicho heterociclo nunca está sustituido con una piperidina. Por lo tanto, la actividad en el campo de la medicina no tiene por qué ser la misma, ni siquiera similar a la de los compuestos de la presente invención. En particular no se demuestra en WO2019099336 que los índoles divulgados tienen capacidad inhibidora de la tirosina quinasa Alk5, que es el receptor I del factor de crecimiento transformante o TGFp, que es la base de la actividad de los compuestos de la presente invención. El artículo RODRIGUEZ, J. C. et al., “Microwave-assisted synthesis and luminescent activity of imidazo[1 ,2a]pyridine derivatives”; Journal of Heterocyclic Chemistry, 2020, divulga una serie de compuestos potencialmente útiles en el campo de la medicina. Dichos compuestos son distintos de los obtenidos en la presente invención, además de que en este documento no se demuestra ninguna actividad en medicina, ni cosmética para los compuestos mostrados.
Los compuestos de la invención utilizan la inhibición de ALK5, perteneciente a la familia de receptores TGFp, como estrategia antiinflamatoria, capaz de prevenir eventos fibróticos entre otros (Nolte y Margadant, 2020). Estos compuestos son útiles en el tratamiento del cáncer, enfermedades pulmonares, enfermedades fibróticas, prevención de la formación de cicatrices queloides e hipertróficas y así como un tratamiento para COVID-19 grave.
Los compuestos de la invención tienen la estructura química de un esqueleto de imidazo[1 ,2-a]piridina aromático planar funcionalizado en distintas posiciones de este esqueleto heterocíclico, destacando especialmente aquellos derivados sustituidos en C- 7 con un sistema heterocíclico aromático. Algunos de ellos se prepararon a partir de 7- bromoimidazo[1 ,2-a]piridina y ácidos (hetero) arilborónicos mediante acoplamientos de Suzuki. El esqueleto de imidazo[1 ,2-a]piridina es conocido como una estructura privilegiada ya que está presente en muchos fármacos comerciales como Zolpidem, Olprinona, Soraprazan y muchos otros compuestos que actualmente se encuentran en diferentes etapas de pruebas biológicas y evaluación preclínica, mostrando múltiples aplicaciones terapéuticas.
Los compuestos de la invención son compuestos basados en estructuras con actividad inhibidora de la tirosina quinasa Alk5, que es el receptor I del factor de crecimiento transformante o TGFp.
Presentaron potente actividad antiinflamatoria tanto in vitro (sobre macrófagos humanos en cultivo y macrófagos humanos en cultivo) como in vivo en un modelo animal de daño pulmonar agudo, asi como efecto antifibrótico en un modelo múrido.
Referencias:
Chen et al., 2020: Chen W. A potential treatment of COVID-19 with TGF-p blockade. Int J Biol Sci. 2020 Apr21;16(11):1954-1955.
Figure imgf000009_0001
Ferreira-Gomes et al., 2021 : Ferreira-Gomes M, Kruglov A, Durek P, Heinrich F, Tizian C, Heinz GA, Pascual-Reguant A, Du W, Mothes R, Fan C, Frischbutter S, Habenicht K, Budzinski L, Ninnemann J, Jani PK, Guerra GM, Lehmann K, Matz M, Ostendorf L, Heiberger L, Chang HD, Bauherr S, Maurer M, Schónrich G, Raftery M, Kallinich T, Mall MA, Angermair S, Treskatsch S, Dórner T, Corman VM, Diefenbach A, Volk HD, Elezkurtaj S, Winkler TH, Dong J, Hauser AE, Radbruch H, Witkowski M, Melchers F, Radbruch A, Mashreghi MF. SARS-CoV-2 in severe COVID-19 induces a TGF-p- dominated chronic immune response that does not target itself. Nat Commun. 2021 Mar 30; 12(1 ): 1961. https://doi.Org/10.1038/s41467-021 -22210-3.
Shen et al., 2021: Shen WX, Luo RC, Wang JQ, Chen ZS. Features of Cytokine Storm Identified by Distinguishing Clinical Manifestations in COVID-19. Front Public Health. 2021 May 24;9:671788. https://doi.org/10.3389/fpubh.2021.671788.
Márquez-Flores et al., 2012: Márquez-Flores YK, Campos-Aldrete ME, Sagado-Zamora H, Correa-Basurto J, Meléndez-Camargo ME. Acute and chronic anti-inflammatory evaluation of imidazo[1,2-A]pyridine carboxylic acid derivatives and docking analysis. Medicinal Chemistry Research, 2012; 3491-3498. https://doi.org/10.1007/s00044-011 -9870-3.
Budumuru et al.; 2019: Budumuru P, Golagani S, and Pushpanjali B. Microwave- assisted synthesis of imidazo[1,2-a]pyridine derivatives and their anti-inflammatory activity IJPSR, 2019; 10(3): 1172-1179 http://dx.doi.Org/10.13040/I JPSR.0975-8232.10(3).1172-79
Engers et al., 2020: Engers DW, Bollinger SR, Felts AS, Vadukoot AK, Williams CH, Blobaum AL, Lindsley CW, Hong CC, Hopkins CR. Discovery, synthesis and characterization of a series of 7-aryl-imidazo[1 ,2-a]pyridine-3-ylquinolines as activin-like kinase (ALK) inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 2020 Sep 15;30(18):127418. https://doi.Org/10.1016/j.bmcl.2020.127418
Nolte and Margadant et al., 2020: Nolte M, Margadant C. Controlling Immunity and
Inflammation through Integrin-Dependent Regulation of TGF-p. Trends Cell Biol. 2020
Jan;30(1):49-59. https://doi.Org/10.1016/j.tcb.2019.10.002 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I:
Figure imgf000010_0001
I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:
R2 representa H; arilo, donde el grupo arilo puede estar no sustituido o puede estar sustituido con grupos alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, o sustituido con haloalquilo (tal como -CF3), o sustituido con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, tal como metoxilo, etoxillo, propilo, butanilo,
R3 representa H, halógeno (F, Cl, Br, I); haloalquilo; alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; amino; arilo ó heteroarilo, donde los grupos arilo y heteroarilo pueden estar no sustituidos o pueden estar sustituidos con grupos alquilo de 1 a 5 átomos de carbono o con uno o más grupos alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono (tal como etoxicarbonilo),
R5 representa H; alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono; alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; nitro; carboxilo; alquilo de 1 a 5 átomos de carbono no sustituido o sustituido con uno o más grupos hidroxi, preferentemente sustituido con un grupo hidroxi; por un grupo N-(3-met¡lén-2-oxo¡ndol¡n-5-¡l)-3-(p¡per¡din-1-¡l)propanam¡da) o carbaldehido,
R6 representa un átomo de hidrógeno (H); un grupo alquilo no sustituido de 1 a 5 átomos de carbono; un grupo alquilo de 1 a 5 átomos de carbono sustituido con uno o más grupos hidroxi, preferentemente sustituido con uno o más grupos hidroxi, tal como hidroximetilo; un grupo alcoxilo de 1 a 5 átomos de carbono; halógeno (F, Cl, Br, I); un grupo alcoxicarbonilo (-O-(C=O)-R) donde R tiene de 1 a 3 átomos de carbono, tal como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo; un grupo nitro; un grupo alquenilo de 2 a 10 átomos, tal como de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono - preferentemente de 3 a 10 átomos de carbono, no sustituido o sustituido, por ejemplo, por un grupo arilo, tal como fenilo; alquenilo de 2 átomos de carbono sustituido con fenilo (estirilo); arilo, donde el grupo arilo puede ser no sustituido o puede estar sustituido por uno o más grupos hidroxilo (por ejemplo, sustituido por un hidroxilo), o sustituido con uno o más grupos metoxilo; heteroarilo, tal como furanilo, tiofenilo, pirrolilo o piridinilo; o heteroarilo donde el grupo heteroarilo está seleccionado entre, dibenzotiofenilo, un grupo de fórmula II, un grupo de fórmula III:
Figure imgf000011_0001
donde D, B, E, G representan independientemente N, CH ó C-R, donde R puede ser alquilo de uno a 3 átomos de carbono no sustituido, arilo no sustituido o cicloalquilo no sustituido Z representa CH ó N
Y representa CH ó N
W representa O ó S ó NH, tal como benzotiofenilo, benzofuranilo, benzopirrolilo,
- R7 representa un átomo de hidrógeno (H); un grupo arilo no sustituido o un grupo arilo sustituido con uno o más grupo hidroxi, tal como hidroxifenilo (por ejemplo, sustituido por un hidroxilo) , o sustituido con uno o más grupos metoxilo; halógeno (F, Cl, Br, I); alquenilo de 2 a 10 átomos, tal como de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono - preferentemente de 3 a 10 átomos de carbono no sustituido o sustituido por un grupo arilo tal como fenilo; alquenilo de 2 átomos de carbono sustituido con fenilo (estirilo); alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; un grupo heteroarilo, tal como furanilo, tiofenilo, pirrolilo o piridinilo; o heteroarilo donde el grupo heteroarilo está seleccionado entre benzotiofenilo, benzofuranilo, benzopirrolilo; dibenzotiofenilo, un grupo de fórmula II y un grupo de fórmula III como se han definido anteriormente,
- en el que: - al menos 3 de los sustituyentes R2, R3, R5, R6 y R7 son simultáneamente H, y la posición del carbono 8 de la estructura de ¡midazo[1 ,2a]p¡hd¡na no lleva sustituyentes, y
- cuando R5 es carbaldehido, al menos uno de R2, R3, R6 o R7 es distinto de H,
- cuando R6 es arilo o arilo sustituido, R3 no es arilo sustituido
- cuando R3 representa un grupo amino, R6 no representa hidrógeno
- cuando R2 representa arilo no sustituido, o arilo sustituido con un grupo metilo o con metoxilo, al menos uno de los sustituyentes R2, R3, R5, R6 y R7 no es H
- al menos uno de los grupos R3, R5, R6, R7 es distinto de H, cuando R2 es arilo no sustituido, o es un arilo sustituido con halógeno, metilo o metoxilo. o es un compuesto de fórmula (I) en el que
R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono y simultáneamente R6 es un grupo arilo sustituido con un halógeno (F, Cl, Br, I), y los demás sustituyentes tienen los significados indicados anteriormente.
El grupo es N-(3-met¡lén-2-oxo¡ndol¡n-5-¡l)-3-(p¡per¡d¡n-1-¡l)propanamida) en la posición
R5, da lugar a un compuesto de fórmula I que es como se muestra a continuación:
Figure imgf000012_0001
“Arilo ’’significa un grupo fenilo; carbociclo aromático condensado, tal como naftilo o antranilo; o indanilo, sin heteroátomos.
“Alquilo”, si no se indica otra cosa, significa alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, en particular, metilo, etilo, propilo o butilo
“Alquenilo”, si no se indica otra cosa, significa alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono.
“Heteroarilo” si no se indica otra cosa, significa un grupo monocíclico, o bicíclico fusionado, compuesto por entre 5 y 10 miembros en el anillo, que tiene al menos un resto aromático y que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre y nitrógeno.
“Haloalquilo”, si no se indica otra cosa, significa un grupo alguilo de 1 a 3 átomos de carbono, sutituido con uno o más átomos de halógeno, seleccionado entre flúor, cloro, bromo o iodo.
“Cicloalquilo” tiene el significado habitual, es decir, un sustituyentes univalente derivado de un cicloalcanos sin cadenas laterales.
Según realizaciones particulares R2 representa arilo sustituido con un grupo CF3 o con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi; y de forma preferente para estas realizaciones, R3y R5 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R2 representa arilo sustituido con un grupo para-metoxi-fenilo, y de forma preferente, además, R3y R5 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi, y simultáneamente R6 es un alquilo de uno a 5 átomos de carbono, por ejemplo metilo, o simultáneamente R6 es un grupo arilo sustituido con un hidroxilo, o con halógeno (F, Cl, Br, I); y de forma preferente para estas realizaciones, R3y R5 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R2 representa un grupo seleccionado entre arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi; y simultáneamente R6 es alquilo de uno a 5 átomos de carbono, por ejemplo metilo, o simultáneamente R6 es un grupo arilo sustituido con un hidroxilo, o con halógeno; y de forma preferente para estas realizaciones, R3y R5 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R2 representa un fenilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con p-metoxilo, o R2 representa fenilo sustituido con trihalometilo, tal como un grupo p-trifluorometilfenilo; y simultáneamente R7 es un grupo heteroarilo, por ejemplo, 2-benzo[b]furilo; y de forma preferente, para estas realizaciones, R3, R4, R5y R6 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales: - R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi, y R7 es arilo sustituido con hidroxilo o con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi, o
- R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi, y R7 representa alquenilo sustituido con un grupo arilo, por ejemplo, sustituido con un fenilo; y de forma preferente para estas realizaciones, R3 y R5 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi, y R7 es arilo sustituido con hidroxilo o con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi, o alquenilo sustituido con un grupo arilo, por ejemplo, sustituido con un fenilo; y de forma preferente para estas realizaciones, R3y R5 son simultáneamente H.
Según realizaciones preferentes, R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi, R3 es H, R6 es H, grupo alquilo o grupo arilo, y R7 es H o arilo sustituido con hidroxilo o con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, sustituido con metoxi; y de forma preferente, para estas realizaciones, R3y R5 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R3 es un arilo no sustituido; y de forma preferente para estas realizaciones, R2, R5y R6 son simultáneamente H; y de forma más preferente para estas realizaciones, R2, R5 , R6 y R7 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R3 representa un heterociclo aromático, que puede estar no sustituido, o puede estar sustituido con un grupo alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono, tal como un grupo etoxicarbonilo; y de forma preferente para estas realizaciones, R2, R5y R6 son simultáneamente H; y de forma más preferente para estas realizaciones, R2, R5 , R6 y R7 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R3 es un grupo seleccionado entre benzofuranilo, benzotiofenilo e indol, que puede estar no sustituido o puede estar sustituido con un grupo alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono, tal como un grupo etoxicarbonilo; y de forma preferente para estas realizaciones, R2, R5 y R6 son simultáneamente H; y de forma más preferente, para estas realizaciones, R2, R5 , R6 y R7 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R3 es un grupo seleccionado entre benzofuranilo, benzotiofenilo e indol, que puede estar no sustituido o puede estar sustituido con un grupo alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono, tal como un grupo etoxicarbonilo; y simultáneamente y R7 es un grupo seleccionado entre benzofuranilo, benzotiofenilo e indol; de forma preferente para estas realizaciones, R2, R5 y R6 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R5 representa H, etoxicarbonilo, nitro, carboxilo, hidroximetilo, carbaldehído, o etoxilo, y preferentemente, para estas realizaciones R2, R3 , R6 y R7son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R7 y R6 representan independientemente un fragmento
Figure imgf000015_0001
II en el que D, B, E, G representan independientemente CH ó C-R, donde R puede ser alquilo no sustituido de uno a 3 átomos de carbono, arilo no sustituido o cicloalquilo no sustituido, Z representa CH y W representa O.
Según realizaciones particulares adicionales, R7 o R6 representa un fragmento
Figure imgf000015_0002
II en el que D, B, E, G representan independientemente CH, Z representa CH y W representa O.
Según realizaciones particulares adicionales, R6 representa un grupo alquilo de 1 a 5 átomos de carbono o alcoxicarbonilo (-O-(C=O)-R) donde R tiene de 1 a 3 átomos de carbono, tal como metoxicarbonilo; y preferentemente, para estas realizaciones R2, R3 , R5 y R7son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R7 representa un grupo arilo no sustituido, tal como fenilo, y preferentemente, para estas realizaciones R2, R3 , R5 y R7 son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares adicionales, R7 representa un grupo bennzofuranilo, , y preferentemente, para estas realizaciones R2, R3 , R5 y R6son simultáneamente H.
Según realizaciones particulares, el compuesto de fórmula I está seleccionado entre:
- Ácido ¡m¡dazo[1 ,2-a]pihd¡n-5-carboxíl¡co (2)
- lmidazo[1,2-a]piridin-5-carboxilato de etilo (3)
- 3-Fenilimidazo[1 ,2-a]piridina (4)
- lmidazo[1,2-a]piridin-5-ilmetanol (5)
- 2-(4-Metoxifenil)-6-metilimidazo[1 ,2-a]piridina (8)
- 4-(lmidazo[1,2-a]piridin-7-il)fenol (12)
- 4-(2-(4-(T rifluorometil)fenil)imidazo[1 , 2-a] pi rid i n-7-i l)fenol (13)
- 4-(2-(4-(T rifluorometil)fenil)imidazo[1 ,2-a]pi rid i n-6-i l)fenol (15)
- 4-(2-(4-Metoxifenil)imidazo[1 ,2-a]piridin-7-il)fenol (16)
- 4-(2-(4-Metoxifenil)imidazo[1 ,2-a]piridin-6-il)fenol (17)
- (E)-7-Estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (19)
- (E)-2-(4-Metoxifenil)-7-estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (20)
- 7-(3,4-Dimetoxifenil)imidazo[1,2-a]piridina (21)
- 6-lodo-2-(4-(trifluorometil)fenil)imidazo[1 ,2-a]piridina (25)
- 7-(Benzofuran-2-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (26) PS1906
- 4-(lmidazo[1,2-a]piridin-6-il)fenol (27)
- (E)-6-Estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (28)
- 6-(Benzofuran-2-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (29)
- 6-(3,4-Dimetoxifenil)imidazo[1,2-a]piridina (30)
- Etil 5-(imidazo[1,2-a]piridin-3-il)-1/7-indol-2-carboxilato (31) (PS1801)
- 7-(Benzofuran-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (32)
- 6-(Benzofuran-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (33)
- 7-(Furan-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (34) - 6-(Furan-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (35)
- 7-(Tiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (36)
- 6-(Tiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (37)
- 7-(Piridin-4-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (38)
- 6-(Piridin-4-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (39)
- 7-(Dibenzotiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (40)
- 6-(Dibenzotiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (41)
- 5-(7-(Benzofuran-2-il)-3-imidazo[1 ,2-a]piridin)-1/7-indol-2-carboxilato de etilo, (42)
- N-(3-(imidazo[1 ,2-a]piridin-5-ilmetil0n)-2-oxoindolin-5-il)-3-(piperidin-1-il)propanamida.
Según una realización preferente, el compuesto de fórmula I es 7-(benzofuran-2- il)imidazo[1 ,2-a]piridina. (26), PS1906.
Según una realización preferente adicional, el compuesto de fórmula I es etil 5- (imidazo[1 ,2-a]piridin-3-il)- 1 H-indol-2-carboxilato, compuesto (31).
La presente invención se refiere también a un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I que comprende:
1) Hacer reaccionar una amino piridina de fórmula (IV) (comercial)
Figure imgf000017_0001
(IV) en el que X es Cl, Br, o I, con R-B(OH)2 en el que R es un fragmento de fórmula R7 o R6 definido anteriormente para obtener un compuesto de fórmula (V)
Figure imgf000017_0002
y 2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (V) con una halocetona de fórmula (VI)
Figure imgf000018_0001
en la que X es Cl, Br o I y R2 dando lugar a un compuesto de fórmula I definida anteriormente.
La reacción de la etapa 1) se puede llevar a cabo en presencia de un catalizador de Pd(0) y una base inorgánica tal como carbonato potásico.
La temperatura para la reacción de la etapa 1) puede estar entre 80 y 150 °CT
La reacción de la etapa 1) se puede realizar de forma convencional (18-24 h) o con microondas (1-5 h).
El disolvente para la reacción de la etapa 1), puede ser, por ejemplo, un disolvente polar, tal como 1 ,2-dimetoxietano, 1 ,4-dioxano, DMF, DMSO.
La reacción de la etapa 2) se puede llevar a cabo en presencia de un disolvente, tal como los que se han mencionado para la etapa 1) y una base orgánica o inorgánica, tal como bicarbonato sódico o potásico, fosfato sódico o potásico, acetato potásico, metóxido potásico.
La reacción de la etapa 2) se puede llevar a cabo a una temperatura entre 25 y 120 °C, preferentemente a reflujo.
Una alternativa adicional del procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I comprende:
1) Hacer reaccionar una amino piridina de fórmula (IV)
Figure imgf000018_0002
en la que X es Cl, Br, o I, con una halocetona de fórmula (VI))
Figure imgf000019_0001
en la que X es Cl, Br o I y R2 tiene el significado dado anteriormente dando lugar a un compuesto de fórmula Vil
Figure imgf000019_0002
2) y hacer reaccionar el compuesto de fórmula (Vil) con R-B(OH)2 en la que R- es un fragmento de fórmula R6 o R7 definido anteriormente dando lugar a un compuesto de fórmula I.
En el caso de los compuestos de fórmula I sustituidos en la posición 7 con un sustituyante heterocíclico aromático, el procedimiento comprende hacer reaccionar 7- bromoimidazo[1 ,2-a]piridina y ácidos (hetero) arilborónicos mediante acoplamientos de Suzuki.
Una tercera alternativa del procedimiento para preparar los compuestos de fórmula I, cuando llevan un heteroarilo como sustituyante en el carbono C3 es utilizar la reacción de Heck, que comprende hacer reaccionar una imidazopiridina con un haloheteroarilo, en presencia de un catalizador de Pd(0) que se genera in situ.
Para analizar la actividad inhibidora de Alk5 de los compuestos de la invención en ensayos de actividad quinasa in vitro se siguieron los estudios de Roth y col. (Roth et al., 2010). Para ello se utilizaron Alk5 recombinante (Abeam, ref. ab105908), determinando la actividad quinasa mediante el sistema comercial Kinase-Glo® Luminiscent kinase assay platform (Promega, ref. TB372). Como control positivo de inhibición se utilizó el compuesto GW788388 Hydrate (Sigma-Aldrich ref. SML0116) cuya fórmula es (4-{4-[3- (piridin-2-il)-1 H-pirazol-4-il]-piridin-2-il}-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)benzamida hidrato, un potente inhibidor de Alk5 y de uso oral. La invención tiene aplicaciones en Biomedicina, en el sector farmacéutico, así como en cosmética, y nutracéutica. Se pueden obtener formulaciones efectivas para su aplicación tanto tópica, como por vías oral y parenteral.
Un objeto adicional de la invención se refiere a un compuesto de fórmula I, tal como se ha descrito anteriormente, para su uso como medicamento.
Según realizaciones particulares dicho uso comprende el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto.
Los términos "tratamiento" y "tratar" utilizados en el presente documento se refieren al tratamiento médico de un sujeto con la intención de curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, afección patológica o trastorno. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido específicamente a la mejora de una enfermedad, afección patológica o trastorno, y también incluye el tratamiento causal, es decir, el tratamiento dirigido a la eliminación de la causa de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociado. Además, este término incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento diseñado para aliviar los síntomas en lugar de curar la enfermedad, afección patológica o trastorno; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados; y el tratamiento de apoyo, es decir, el tratamiento empleado para complementar otra terapia específica dirigida a la mejora de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados. Se entiende que el tratamiento, aunque esté destinado a curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, afección patológica o trastorno, no tiene por qué producir realmente la curación, mejora, estabilización o prevención. Los efectos del tratamiento pueden medirse o evaluarse como se describe en el presente documento y como se conoce en la técnica, según convenga para la enfermedad, afección patológica o trastorno de que se trate. Dichas mediciones y evaluaciones pueden realizarse en términos cualitativos y/o cuantitativos. Así, por ejemplo, las características o rasgos de una enfermedad, afección patológica o trastorno y/o los síntomas de una enfermedad, afección patológica o trastorno pueden reducirse a cualquier efecto o en cualquier cantidad. En el contexto de un sujeto que padece una enfermedad inflamatoria, los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren a la gestión médica de un sujeto con la intención de curar, mejorar o estabilizar dicha enfermedad inflamatoria.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" incluye, entre otros, animales, plantas y cualquier otro organismo o entidad. El sujeto puede ser un vertebrado, más concretamente un mamífero (por ejemplo, un ser humano, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro, una oveja, una cabra, un primate no humano, una vaca, un gato, una cobaya o un roedor), un pez, un ave o un reptil o anfibio.. El término no denota una edad o sexo en particular. Por lo tanto, los sujetos adultos y recién nacidos, así como los fetos, ya sean varones o hembras, están cubiertos por la definición de sujeto. Un paciente es un sujeto afectado por una enfermedad o trastorno. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios. En otro aspecto de la invención, uno o más compuestos de fórmula I para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria pueden administrarse a un sujeto que comprenda un ser humano o un animal, incluidos, entre otros, un ratón, un perro, un gato, un caballo, un bovino o un ovino y similares.
Tal y como se ha indicado anteriormente, los compuestos de la fórmula I son capaces de inhibir la actividad fosforilante de la kinasa Alk5 lo que inhibe la activación de los macrófagos inhibiéndose así la respuesta inflamatoria.
El término "inhibir" significa reducir o disminuir la actividad fosforlinate de la kinasa Alk5. Puede tratarse de una inhibición completa de la actividad o la expresión de la kinasa, o de una inhibición parcial. La inhibición puede compararse con un control o con un nivel estándar. La inhibición puede ser 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64,65, 66,
67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,
91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% comparado con dicho control.
En una realización particular, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo consistente en enfermedades que cursan con componente inflamatorio y/o pro-fibrótico.
En otra realización particular, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria pulmonar seleccionada del grupo consistente en síndrome por distres respiratorio agudo, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la fibrosis pulmonar, la hipertensión pulmonar, inflamación pulmonar, preferentemente síndrome por distres respiratorio agudo y fibrosis pulmonar.
En otra realización particular, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria intestinal que cursa con un fuerte componente inflamatorio como por ejemplo la enfermedad de Chron y la colitis ulcerosa, En otra realización particular, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria cardiovascular que cursa con un fuerte componente inflamatorio como por ejemplo infarto agudo de miocardio, miocarditis, o aterosclerosis.
En otra realización particular, la enfermedad inflamatoria es cualquier enfermedad inflamatoria que cursa con un fuerte componente inflamatorio como por ejemplo la diabetes de tipo 2, esclerosis múltiple o cáncer.
En otra realización particular el compuesto de formula I es etil 5-(¡midazo[1,2-a]p¡r¡d¡n-3- ¡l)-1 H-indol-2-carboxilato (31) (PS1801).
En otra realización particular el compuesto de formula I es etil 5-(¡midazo[1,2-a]p¡r¡d¡n-3- ¡l)-1/7-indol-2-carboxilato (31) (PS1906).
En una realización particular, la concentración de PS1801 o PS1906 administrada a un sujeto está comprendida entre 1000 mg/kg y 1 pg/kg de peso corporal, preferiblemente entre 500 mg/kg y 2 pg/kg, más preferiblemente entre 100 mg/kg y 3 pg/kg, aún más preferiblemente entre 50 mg/kg y 4 pg/kg, aún más preferiblemente entre 25 mg/kg y 5 pg/kg, aún más preferiblemente entre 20 mg/kg y 8 pg/kg, aún más preferiblemente entre 15 mg/kg y 10 pg/kg, aún más preferiblemente entre 1 mg/kg y 50 pg/kg, y aún más preferiblemente entre 800 pg/kg y 80 pg/kg.
Otro objeto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica, que comprende uno o más compuesto de formula I, tal y como se ha definido anteriormente y uno o más compuestos activos adicionales, y/o uno o más portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que puede ser administrado a un sujeto junto con el compuesto seleccionado sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera deletérea con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido.
En una realización adicional, el vehículo fármaceuticamente aceptable puede ser un desintegrante, tensioactivo, aglutinante y lubricante farmacéuticamente aceptables.
En una realización particular la composición farmacéutica comprende otro compuesto activo adicional, tal como esferoides o corticosteroides (por ejemplo, dexametasona), y los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) como salicilatos, ibuprofeno, naproxeno. En una realización particular, cuando se emplea el compuesto de fórmula I para el Síndrome por Distrés respiratorio Agudo, el otro principio activo es Dexametasona.
En otra realización particular, el compuesto activo adicional es otro compuesto de fórmula I, descrito anteriormente.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "una combinación de", cuando se refiere a dos o más compuestos, agentes o ingredientes farmacéuticos activos adicionales, significa la administración de dos o más compuestos, agentes o ingredientes farmacéuticos activos al sujeto antes, simultáneamente o posteriormente entre sí.
En una realización particular, el compuesto activo adicional se selecciona entre un agente mucolítico, un broncodilatador, un antibiótico, un agente antivírico, un agente antiinflamatorio, un agente nutricional y combinaciones de los mismos.
Los compuestos de formula I de la invención y las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden administrarse a un sujeto por vía oral, intravenosa, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como polvos, pomadas o gotas), bucal, como aerosol oral o nasal, o similares, dependiendo de la gravedad de la infección que se esté tratando preferentemente por vía intravenosa. En ciertas realizaciones, los compuestos o las composiciones de la invención pueden administrarse a niveles de dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y preferentemente de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.
Otro objeto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica, que comprende uno o más compuesto de formula I, tal y como se ha definido anteriormente y uno o más compuestos activos adicionales, y/o uno o más portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
Cada uno de los términos " comprende", " consiste esencialmente en" y " consiste en" puede sustituirse por cualquiera de los otros dos términos. Los términos "un" o "una" pueden referirse a uno o a una pluralidad de los elementos que modifican (por ejemplo, "un reactivo" puede significar uno o más reactivos), a menos que esté contextualmente claro que se describe uno de los elementos o más de uno. El término "aproximadamente", tal como se utiliza aquí, se refiere a un valor dentro del 10% del parámetro subyacente (es decir, más o menos el 10%; por ejemplo, un peso de "aproximadamente 100 gramos" puede incluir un peso entre 90 gramos y 110 gramos). El uso del término "aproximadamente" al principio de un listado de valores modifica cada uno de los valores (por ejemplo, "aproximadamente 1 , 2 y 3" se refiere a "aproximadamente 1 , aproximadamente 2 y aproximadamente 3"). Cuando se describe un listado de valores, el listado incluye todos los valores intermedios y todos los valores fraccionarios de los mismos (por ejemplo, el listado de valores "80%, 85% o 90%" incluye el valor intermedio 86% y el valor fraccionario 86,4%). Cuando un listado de valores va seguido del término "o más", el término "o más" se aplica a cada uno de los valores enumerados (por ejemplo, el listado de "80%, 90%, 95% o más" o "80%, 90% o 95% o más" se refiere a "80% o más, 90% o más, o 95% o más"). Cuando se describe un listado de valores, el listado incluye todos los rangos entre dos de los valores listados (por ejemplo, el listado de "80%, 90% o 95%" incluye rangos de "80% a 90%", "80% a 95%" y "90% a 95%"). A continuación, se exponen algunos ejemplos de aplicación de la tecnología.
Entre las ventajas de la presente invención se encuentran: ventajas tanto a nivel de producción, por ser compuestos de síntesis química, la cual se ha optimizado en el laboratorio, manteniendo los lotes de producto idénticas propiedades de solubilidad, estabilidad y características reproducidles. Dicha optimización debe derivar en ventajas tanto de índole económica, siendo mas económica la síntesis que la obtención a partir de productos naturales, como de rapidez en la producción de los compuestos. La dosis utilizada en los ensayos in vitro muestran que se requiere muy poca cantidad de producto para obtener el efecto deseado, y a dicha dosis no se ha observado efecto tóxico en las células analizadas.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 : Representación gráfica del porcentaje de inhibición de la quinasa Alk5 in vitro de diferentes compuestos sintetizados de la presente invención, (como control se utilizó el compuesto comercial GW788388 (GW)).
Figura 2: Evaluación de la viabilidad celular (citotoxicidad) sobre macrófagos humanos THP-1-XBIue™-CD14 de los diferentes compuestos a tres concentraciones diferentes (1 , 5 y 10 pM), el vehículo es PBS. GW788388 (GW) se utilizó como control. ***p<0, 001
***p<0.001 Figura 3: Efecto de los compuestos PS1906 y PS1801 sobre la viabilidad de células epiteliales humanas (Caco-2) y macrófagos (THP-1-XBIue™-CD14) a diferentes concentraciones (1 , 5 y 10 pM). GW788388 (GW) se utilizó como control.
Figura 4. Evaluación del efecto antiinflamatorio en macrófagos THP-1-XBIue™-CD14 estimulados con LPS bacteriano y posteriormente tratados con los compuestos PS1906 y PS1801 a 5 pM. GW788388 (GW) se utilizó como control. ****p<0.0001
Figura 5. Evaluación de efecto antiinflamatorio en macrófagos THP-1-XBIue™-CD14 sin estimular previamente con LPS bacteriano y tratados con los compuestos PS1906 y PS1801 a 5 pM. GW788388 (GW) fue usado como control.
Figura 6. Evaluación ¡n vivo (modelo de ratón con daño agudo pulmonar (ALI) producido por la exposición a LPS bacteriano) del efecto protector del compuesto PS1906 a diferentes dosis equipotentes (D1 y D2) siendo D1 = 156 pg/kg y D2 = 312 pg/kg. A) Imágenes cortes histológicos de pulmón de ratones teñidos con Hematoxilina y Eosina; B) representación gráfica de valoración de daño pulmonar (ALI Score) en los diferentes tratamientos; C) Recuento de neutrófilos por mL de lavado broncoalveolar de los ratones analizados (representados en escala logarítmica Log10); D) Recuento de linfocitos por mL de lavado broncoalveolar de los ratones analizados (representados en escala logarítmica Log10). Los datos se representaron como el valor de la media ± el error estándar de la media. Siendo # p<0.01 ; ## p<0.001 ; ***p<0.0001 analizado mediante ANOVA de una vía ajustado con el método múltiple de comparaciones de Dunnet.
EJEMPLOS
MATERIALES Y MÉTODOS
A. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS QUÍMICOS
Síntesis de derivados de imidazo[1,2-a]piridina
Ácido imidazo[1,2-a]piridin-5-carboxílico (2)
Figure imgf000026_0001
Se irradia con microondas, en atmósfera inerte, una mezcla de reacción de 2-cloroacetilo (13 mg, 0,173 mmol), ácido 6-aminopicolínico (20 mg, 0,144 mmol) en isopropanol (1 ,5 mL). Después de 40 min. a 170 °C bajo irradiación de microondas el sólido resultante es filtrado y secado para obtener 25 mg, Rto 43%.
RMN 1H (400 MHz, Metanol-d4) 5 9,22 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 8,29 (dd, J = 7,2, 1 ,3 Hz, 1 H); 8,21 - 8,13 (m, 2H); 8,06 (dd, J = 9,0; 7,3 Hz, 1 H).
RMN 13C (101 MHz, Metanol-d4) 5 161 ,7; 140,9; 132,3; 129,5; 122,8; 121 ,5; 116,5; 115,9. lmidazo[1,2-a]piridin-5-carboxilato de etilo (3)
Figure imgf000026_0002
Se añade lentamente cloruro de tionilo (0,072 mL, 0,987 mmol) a una disolución, en un tubo sellado, del ácido ¡m¡dazo[1 ,2-a]piñd¡n-5-carboxíl¡co (64 mg, 0,395 mmol) en EtOH (7 mL). Después de 24 horas a 78 °C el disolvente se elimina a presión reducida y la mezcla de reacción se neutraliza usando una solución acuosa de NaHCCh. El crudo de reacción es extraído usando como disolvente orgánico AcOEt. Las fases orgánicas se secan sobre MgSO4 y el disolvente es eliminado a presión reducida para obtener 50 mg, Rto 66%.
RMN 1H (400 MHz, Acetona-cfe) 5 8,82 (s, 1 H); 7,86 (dd, J = 10,7; 8,2 Hz, 2H); 7,75 (s, 1 H); 7,36 (dd, J = 8,9; 7,2 Hz, 1 H); 4,49 (q, J = 7,1 Hz, 2H); 1 ,44 (t, J = 7,1 Hz, 3H).
RMN 13C (101 MHz, Acetona-de) 5 162,7; 147,0; 135,6; 127,2; 123,50; 123,3; 119,5; 115,4; 62,8; 14,6.
3-Fenilimidazo[1 ,2-a]piridina (4)
Figure imgf000027_0001
Se irradia con microondas, en atmósfera inerte, una mezcla de reacción de imidazo[1 ,2- a] pi rid ina (115 mg, 0,973 mmol), bromo benceno (0,204 mL, 1 ,946 mmol), Pd(AcO) (0,027 mg, 0,097 mmol) y KOAc (0,200 mg, 1 ,946 mmol) en DMF (4 mL). Después de 1 hora a 160 °C el disolvente es eliminado a presión reducida y la mezcla de reacción es extraída usando AcOEt como disolvente orgánico. Las fases orgánicas son secadas sobre MgSÜ4 y el disolvente es eliminado a presión reducida. El crudo de reacción es purificado en columna cromatográfica usando una mezcla de Tolueno/MeOH (10:1) para obtener 147 mg, Rto 77%.
RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 5 8,34 (d, J = 7,0 Hz, 1 H); 7,74 - 7,64 (m, 2H); 7,54 (dt, J = 15,4; 7,4 Hz, 4H); 7,46 - 7,39 (m, 1 H); 7,25 - 7,15 (m, 1 H); 6,81 (t, J = 6,8 Hz, 1 H).
RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) 5 146,3; 132,7; 129,5; 129,4; 128,3; 128,2; 125,9; 124,4; 123,5; 118,4; 112,7. lmidazo[1 ,2-a]piridin-5-ilmetanol (5)
Figure imgf000027_0002
Se añade lentamente, bajo atmosfera inerte, MeOH (13 pL, 0,325 mmol) a una mezcla de etil ¡m¡dazo[1 ,2-a]piñd¡na-5-carbox¡lato (30 mg, 0,158 mmol) y UBH4 (7 mg, 0,325 mmol) en Et2O (3 mL). Después de 5 horas a temperatura ambiente la mezcla de reacción se saturó con una disolución de HCI 2M a 0 °C. La mezcla de reacción es extraída AcOEt usando como disolvente orgánico, las fases orgánicas son secadas sobre MgSCU y el disolvente es eliminado a presión reducida para obtener el producto buscado.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 7,88 (d, J = 1 ,3 Hz, 1 H); 7,63 (d, J = 1 ,3 Hz, 1 H); 7,53 (d, J = 9,0 Hz, 1 H); 7,26 (dd, J = 9,1 ; 6,8 Hz, 1 H); 6,92 (d, J = 6,6 Hz, 1 H); 4,76 (s, 2H).
RMN 13C (101 MHz, DMSO) 5 145,0; 138,4; 133,2; 124,2; 115,5; 110,5; 109,4; 59,6. 2-(4-Metoxifenil)-6-metilimidazo[1,2-a]piridina (8)
Figure imgf000028_0001
Se añade, bajo atmosfera inerte, 2-bromo-1-(4-metoxifenil)etan-1-ona (160 mg, 0,694 mmol) a una disolución de 5-metilpiridin-2-amina (50 mg. 0,462 mmol) en acetona (4 mL). Después de 18 horas a 60 °C se elimina el disolvente a presión reducida y la mezcla de reacción se basifica con una solución acuosa de NaOH (1 M). La mezcla de reacción es extraída usando CH2CI2 como disolvente orgánico, las fases orgánicas son secadas sobre MgSCU y el disolvente es eliminado a presión reducida. El crudo de reacción es purificado en columna cromatográfica usando una mezcla de Hex/AcOEt (1 :1) como eluyente para obtener 72 mg, Rto 65%.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-Ó6) 5 8,28 (s, 1 H); 8,17 (s, 1 H); 7,87 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,45 (d, J = 9,2 Hz, 1 H); 7,07 (dd, J = 9,2; 1 ,8 Hz, 1 H); 6,99 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 3,79 (s, 3H); 2,27 (s, 3H).
RMN 13C (101 MHz, DMSO-Ó6) 5 158,9; 144,2; 143,8; 127,5; 126,7; 126,7; 124,1 ; 121 ,15; 115,8; 114,1 ; 107,7; 55,1 ; 17,5.
Procedimiento experimental A: Reacción de acoplamiento cruzado (A1) y heterociclación (A2)
Figure imgf000029_0001
R = Aril, Fórmula I
X = Cl, Br (E)-estirenil R = R6, R7 (Aril, (E)-estirenil R2 = H, Aril
R2 = H, Aril
Reacción de Suzuki (A1):
La 4- ó 5- halo-2-aminopiridina (1 eq) correspondiente se añade a una mezcla del correspondiente ácido borónico (1 ,2 eq), K2CO3 (1 ,3 eq) y Pd(PPhs)4 (2% mol) en una mezcla de DME/H2O (4:1 , 5 mL/mmol) bajo atmosfera inerte en un tubo de microondas, Después de 30 minutos a 110 °C el disolvente es evaporado a presión reducida y el crudo de reacción se purifica en columna cromatográfica empleando los eluyentes correspondientes.
Alternativa del procedimiento mediante calefacción convencional
Alternativamente, la 4- ó 5- halo-2-aminopiñdina (1 eq) correspondiente se añade a una mezcla del correspondiente ácido borónico (1 ,6 eq), Na2COs (2 eq) y Pd(PPhs)4 (2-10% mol) en una mezcla de dioxano/FW (12:1 , 20 mL/mmol), y la mezcla se mantiene a reflujo bajo argón durante 18 h. Tras evaporar el disolvente a presión reducida, el crudo de reacción se purifica en columna cromatográfica empleando los eluyentes correspondientes.
Heterociclación (A2):
Se añade la correspondiente a-halo cetona (1 ,75 eq) a una mezcla de la aminopiñdina sustituida en posición 2 (1 eq) y NaHCCh (0,1 g/ 5 mL) en EtOH (4 mL). Después de 18 horas a 90°C el disolvente fue evaporado a presión reducida, el sólido resultante fue suspendido en una disolución de K2CO3 en H2O y fue extraído usando como fase orgánica AcOEt. Las fases orgánicas fueron secadas sobre MgSCU y el disolvente orgánico fue evaporado a presión reducida para dar lugar a las imidazopiridinas correspondientes.
4-(lmidazo[1 ,2-a]pirid¡n-7-¡l)fenol (12)
Figure imgf000030_0001
Empleando el método experimental A2, una mezcla de 4-(4-hidroxifenil)-2-aminopiridina (30 mg, 0,161 mmol), NaHCOs (83 mg, 0,1 g/5 mL EtOH) y 2-cloroacetaldehído (20 pL, 0,322 mmol) en EtOH (4 mL) fue agitada a 90 °C para obtener 25 mg, Rto 74%.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 5 8,53 (d, J = 7,2 Hz, 1 H); 7,89 (s, 1 H), 7,70 (s, 1 H); 7,61 (d, J = 8,2 Hz, 2H); 7,54 (s, 1 H); 7,20 (d, J = 6,9 Hz, 1 H); 6,86 (d, J = 8,3 Hz, 2H).
RMN 13C (101 MHz, DMSO-cfe) 5 173,7; 158,6; 145,2; 136,2; 133,5; 127,5; 126,7; 116,0; 112,4; 111,3; 111,0.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 2:98 a 95:5 (5 min), tr = 3,95 min, [M+H+] = 211.
4-(2-(4-(Trifluorometil)fenil)imidazo[1,2-a]piridin-7-il)fenol (13)
Figure imgf000030_0002
Empleando el método experimental A2 una mezcla de 4-(4-hidroxifenil)-2-aminopiridina (30 mg, 0,161 mmol), NaHCOs (83 mg, 0,1 g/5 mL EtOH) y 2-bromo-1-(4- (trifluoromet¡l)fenil)etan-1-ona (30 mg, 0,322 mmol) en EtOH (4 mL) fue agitada a 90 °C. El crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica usando C^Ch/MeOH como eluyente para obtener 31 mg, Rto 54%. RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) 5 9,74 (s, 1 H); 8,56 (d, J = 7,1 Hz, 1 H); 8,52 (s, 1 H); 8,19 (d, J = 8,1 Hz, 2H); 7,80 (d, J = 6,4 Hz, 3H); 7,68 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 7,26 (dd, J = 7,2; 1,9 Hz, 1 H); 6,89 (d, J = 8,6 Hz, 2H);
RMN 13C (126 MHz, DMSO-cfe) 5 158,4; 146,2; 143,6; 138,4; 137,5; 128,7; 128,2; 127,3; 126,4; 126,1 (q, CF = 3,8 HZ); 124,8 (q, JCF = 271 Hz); 116,3; 112,2; 111 ,8; 110,5.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 30: 70 a 95:5 (10 min), tr = 1 ,96 min, [M+H+] = 355.
4-(2-(4-(Trifluorometil)fenil)imidazo[1,2-a]piridin-6-il)fenol (15)
Figure imgf000031_0001
Empleando el método experimental A2 una mezcla de 5-(4-hidroxifenil)-2-aminopiridina (50 mg, 0,268 mmol), NaHCCh (83 mg, 0,1 g/5 mL EtOH) y 2-bromo-1-(4- (trifluorometil)fenil)etan-1-ona (215 mg, 0,805 mmol) en EtOH (4 mL) fue agitada a 90 °C. El crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica para obtener 31 mg, Rto 31%.
RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) 5 9,65 (s, 1 H); 8,77 (dd, J = 1 ,9; 1 ,0 Hz, 1 H); 8,52 (s, 1 H); 8,20 (d, J = 7,8 Hz, 2H); 7,80 (d, J = 7,9 Hz, 2H); 7,65 (d, J = 9,4 Hz, 1 H); 7,58 (dd, J = 9,4; 1,8 Hz, 1 H); 7,56 - 7,53 (m, 2H); 6,89 (d, J = 8,6 Hz, 2H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-cfe) 5 157,4; 144,1; 142,9; 137,9; 127,7; 127,1 ; 126,0; 125,7; 125,6 (q, JCF = 3,8 Hz); 125,6; 124,3 (q, CF = 272,5 Hz); 122,9; 116,7; 115,9; 110,8.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 30:70 a 95:5 (10 min), tr = 2,91 min, [M+H+] = 355.
4-(2-(4-Metoxifenil)imidazo[1,2-a]piridin-7-il)fenol (16)
Figure imgf000031_0002
Empleando el método experimental A2 una mezcla de 4-(2-aminopiridin-4-il)fenol (69 mg, 0,386 mmol) y 2-bromo-1-(4-(metoxi)fenil)etan-1-ona (103 mg, 0,464 mmol) en acetona (5 mL) fue agitada a 90 °C. El crudo de reacción fue filtrado (0,22 pM) para obtener 82 mg, Rto 67%.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 5 9,79 (s, 1 H); 8,58 (d, J = 7,1 Hz, 1 H); 8,33 (s, 1 H); 7,89 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,77 (s, 1 H); 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,34 (d, J = 7,1 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 6,91 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 3,81 (s, 3H).
RMN 13C (101 MHz, DMSO-cfe) 5 159,4; 158,2; 144,2; 142,7; 127,9; 127,9; 127,0; 127,0; 124,7; 115,9; 114,3; 112,1 ; 109,6; 108,0; 55,2.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 15:85 a 95:5 (5 min), tr = 4,09 min, [M+H+] = 317.
4-(2-(4-Metoxifenil)imidazo[1,2-a]piridin-6-il)fenol (17)
Figure imgf000032_0001
Empleando el método experimental A2 una mezcla de 4-(6-aminopiridin-3-il)fenol (70 mg, 0,375 mmol) y 2-bromo-1-(4-(metoxi)fenil)etan-1-ona (103 mg, 0,464 mmol) en acetona (5 mL) fue agitada a 90 °C. El crudo de reacción fue filtrado para obtener 71 mg, Rto 60%.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 5 9,64 (s, 1 H); 8,76 (s, 1 H); 8,30 (s, 1 H); 7,90 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,61 (m, 2H); 7,54 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 7,04 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 6,89 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 3,81 (s, 3H).
RMN 13C (126 MHz, DMSO-cfe) 5 159,2; 157,4; 143,1 ; 127,7; 127,0; 126,9; 125,8; 125,7; 122,8; 115,8; 115,6; 114,2; 108,5; 55,1.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 15:85 a 95:5 (5 min), tr = 4,13 min, [M+H+] = 317.
(E)-7-Estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (19)
Figure imgf000033_0001
Empleando el método experimental A2 una mezcla de (E)-4-estirilpiridin-2-amina (50 mg, 0,254 mmol) y 2-cloroacetaldehido (19 pL, 0,305 mmol) en acetona (6 mL) fue agitada a 40 °C para obtener 53 mg, Rto 94%.
RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 5 8,00 (d, J = 7,1 Hz, 1 H); 7,54 (d, J = 8,0 Hz, 2H); 7,46 (d, J = 8,8 Hz, 3H); 7,31 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 7,26 - 7,17 (m, 2H); 7,03 (dd, J = 16,5; 6,5 Hz, 3H).
RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) 5 145,8; 136,7; 134,4; 134,1 ; 130,6; 128,9; 128,3; 126,8; 125,5; 115,7; 112,6; 110,2.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 5:95 a 95:5 (5 min), tr = 4,59 min, [M+H+] = 221 .
(E)-2-(4-Metoxifenil)-7-estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (20)
Figure imgf000033_0002
Empleando el método experimental A2 una mezcla de (E)-4-estirilpiridin-2-amina (63 mg, 0,323 mmol) y 2-bromo-1-(4-(trifluorometil)fenil)etan-1-ona (88 mg, 0,387 mmol) en acetona (2 mL) fue agitada a 40 °C. El crudo de reacción fue filtrado (0,22 pM) para obtener 60 mg, Rto 47%.
RMN 1H (500 MHz, Cloroformo-d) 5 7,98 (d, J = 7,0 Hz, 1 H); 7,73 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,67 (s, 1 H); 7,44 (s, 1 H); 7,39 (d, J = 7,1 Hz, 2H); 7,22 (t, J = 7,6 Hz, 2H); 7,14 (t, J = 7,3 Hz, 1 H); 7,01 (d, J = 16,3 Hz, 1 H); 6,98 - 6,92 (m, 2H); 6,81 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 3,69 (s, 3H).
RMN 13C (126 MHz, Cloroformo-d) 5 159,4; 145,5; 145,3; 136,2; 134,3; 130,2; 128,5; 127,9; 127,0; 126,4; 126,45; 125,7; 125,2; 114,3; 113,9; 109,9; 107,5; 55,1.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 15:85 a 95:5 (5 min), tr = 4,81 min, [M+H+] = 327.
7-(3,4-Dimetoxifenil)imidazo[1 ,2-a]piridina (21 )
Figure imgf000034_0001
Empleando el método experimental A2 una mezcla de 4-(3,4-dimetoxifenil)piridin-2-amina (50 mg, 0,217 mmol), NaHCOs(50 mg, 0,1 g/5 mL EtOH) y 2-cloroacetaldehido (27 L, 0,434 mmol) en EtOH (2,5 mL) fue agitada a 90 °C para obtener 52 mg, Rto 94%.
RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 58,13 (d, J = 7,1 Hz, 1H); 7,76 (s, 1H); 7,63 (s, 1H); 7,55 (s, 1H);7,20 (dd, J = 8,3; 2,2 Hz, 1H); 7,15 (d, J = 2,2 Hz, 1H);7,04 (dd, = 7,1; 1,8 Hz, 1H); 6,95 (d, J= 8,3 Hz, 1H); 3,95 (s, 3H); 3,92 (s, 3H).
RMN13C (101 MHz, Cloroformo-d) 5 149,5; 146,1; 137,4; 134,3; 131,6; 125,6; 119,3; 113,9; 112,3; 111,9; 111,7; 109,9; 56,1.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 10:90 a 95:5 (5 min), tr= 1,46 min, [M+H+] = 255.
Procedimiento experimental B: Heterociclación (B1) y reacción de acoplamiento de Suzuki (B2)
Figure imgf000034_0002
X - Cl, Br, I R = Aril, (E)-estirenil Fórmula I R2= H, Aril R = R6, R7 (Aril, (E)-estirenil
R2= H, Aril
Heterociclación (B1): Se añade la correspondiente a-halo-cetona (1 ,5 - 2 eq) a una mezcla de la correspondiente halo-2-aminopiñdina y NaHCOs (0,1 g/5 mL -si se utilizó EtOH como disolvente-) en EtOH. La mezcla de reacción fue calentada a una temperatura superior a la temperatura de ebullición del disolvente empleado, en cada caso, durante 18 horas. Transcurrido el tiempo de reacción el disolvente fue evaporado a presión reducida y el crudo de reacción fue suspendido en una disolución acuosa de K2CO3 y posteriormente fue extraído utilizando AcOEt. Las fases orgánicas fueron secadas sobre MgSO4 anhidro, filtradas y el disolvente fue evaporado a presión reducida para obtener las correspondientes imidazo[1 ,2-a]piridinas.
Reacción de Suzuki (B2):
Se añade la correspondiente halo-imidazo[1 ,2-a]piridina (1 eq) a una mezcla del correspondiente ácido borónico (1 ,2 eq), y la correspondiente base (NaHCCh (1 ,3 eq) o K2CO3 (1 ,1 eq)) y de Pd(PPh3)4 (2 mmol%) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1) o DME/H2O (4:1) - dependiendo de la reacción- en un tubo de microondas. La mezcla se calienta a 130 °C durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo de reacción el disolvente fue evaporado a presión reducida y el crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica para obtener las correspondientes ¡midazo[1 ,2-a]p¡hd¡nas.
Se añade la correspondiente halo-imidazo[1 ,2-a]piridina (1 eq) a una mezcla del correspondiente ácido borónico (1 ,2 eq) y la correspondiente base (NaHCOs (1 ,3 eq) o K2CO3 (1 ,1 eq)) y de Pd(PPh3)4 (2 mmol%) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1) o DME/H2O (4:1) - dependiendo de la reacción. La mezcla se calienta a reflujo durante 18 h. Transcurrido el tiempo de reacción el disolvente fue evaporado a presión reducida y el crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica para obtener las correspondientes imidazo[1 ,2- a]piridinas.
6-lodo-2-(4-(trifluorometil)fenil)imidazo[1 ,2-a]piridina (25)
Figure imgf000035_0001
Empleando el método experimental B1 una mezcla de 5-¡odo-2-aminop¡r¡d¡na (41 mg, 0,136 mmol), NaHCOs (80 mg, 0,1 g/5 mL EtOH) y 2-bromo-1-(4-(tñfluorometil)fen¡l)etan- 1-ona (60 mg, 0,204 mmol) en EtOH (4 mL) fue agitada a 90 °C y el crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica usando C^Ch/MeOH como eluyente para obtener 25 mg, Rto 47%.
RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 5 8,40 (s, 1 H); 8,03 (d, J = 8,0 Hz, 2H); 7,85 (s, 1 H); 7,68 (d, J = 8,1 Hz, 2H); 7,45 (d, J = 9,4 Hz, 1 H); 7,37 (dd, J = 9,5; 1 ,6 Hz, 1 H).
RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) 5 144,6; 144,4; 136,6; 133,4; 126,3; 125,9 (q, JCF = 273 Hz); 124,3 (q, JCF = 3,8 Hz); 118,7; 108,7; 75,8.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 40:60 a 95:5 (10 min), tr = 5,57, [M+H+] = 389.
7-(Benzofuran-2-il)imidazo[1,2-a]piridina. (26) PS1906
Figure imgf000036_0001
Empleando el método experimental A1 , se añaden sucesivamente 4-¡odo-2-aminop¡ñd¡na (440 mg, 2.15 mmol), ácido benzofuran-2-borónico (584 mg, 3.6 mmol), Pd(PPhs)4, (248 mg, 10 mol%), y Na2COs (477 mg, 4.5 mmol) a una mezcla de dioxano (74 mL) y H2O (6 mL). La mezcla se mantiene a reflujo bajo argón durante 18 h. Tras eliminación del disolvente a vació, el crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna empleando C^Ch/MeOH como eluyente para obtener 431 mg, Rto 95 %. Empleando el método experimental A2, el producto así obtenido (5-(benzofuran-2-¡l)piñd¡n-2-am¡na) se disolvió en EtOH (15 mL) y se añadieron sucesivamente una disolución de cloroacetaldehido (40% en agua, 1.0 mL) y NaHCOs (344 mg, 4.1 mmol). La mezcla se mantuvo a reflujo durante 18 h. Tras dilución con acetato de etilo, filtración a través de celita, lavado con disolución saturada de cloruro sódico, secado de la fase orgánica sobre MgSÜ4, filtración, y evaporación del disolvente a vacío, el crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica usando C^Ch/MeOH como eluyente para obtener 440 mg del compuesto 26. Rto 92 %.
Empleando el método experimental B2 se disolvió el ácido benzofuran-2-borónico (62 mg, 0,106 mmol), K2CO3 (46 mg, 0,106 mmol), Pd(PPhs)4, (6 mg, 2 mol%) y 7- bromoimidazo[1 ,2-a]piridina (50 mg, 0,082 mmol) en 5 mL de una mezcla de DME/ H2O (4:1). El crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica usando CH2Cl2/MeOH como eluyente para obtener 42 mg, Rto 70 %.
RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 5 8,09 - 8,00 (m, 2H); 7,62 (s, 1 H); 7,55 - 7,43 (m, 3H); 7,29 - 7,21 (m, 1 H); 7,20 - 7,11 (m, 2H); 7,01 (s, 1 H).
RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) 5 155,2; 153,8; 145,5; 135,0; 129,0; 126,7; 125,8; 125,1 ; 123,3; 121 ,2; 113,0; 112,9; 111 ,4; 109,7; 103,2.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 15:85 a 95:5 (5 min), tr = 1 ,39 min, [M+H+] = 235.
El compuesto PS1906, tiene también efecto antiinflamatorio en un modelo múrido in vivo de daño pulmonar agudo (ALI en inglés), donde presenta grandes diferencias macroscópicas y un significativamente diferente al grupo de ratones enfermos tratados con LPS. El análisis por citometría de flujo del lavado broncoalveolar evidenció un efecto antiinflamatorio dependiente de dosis del compuesto PS1906, tanto en neutrófilos como en linfocitos y en el recuento total de células infiltradas.
4-(lmidazo[1 , 2-a] p i ri d i n -6-i I )fe no I (27)
Figure imgf000037_0001
Empleando el método experimental B2 se disolvió el ácido 4-hidroxifenil borónico (20 mg, 0,147 mmol), K2CO3 (22 mg, 0,160 mmol), Pd(PPhs)4, (2 mg, 2 mmol%) y 6- iodoimidazo[1 ,2-a]piridina (30 mg, 0,123 mmol) en 3 mL de una mezcla de DME/H2O (4:1). El crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica usando CH2Cl2/MeOH como eluyente para obtener 28 mg, Rto 70 %.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 5 9,60 (s, 1 H); 8,78 (s, 1 H); 7,93 (s, 1 H); 7,63 - 7,55 (m, 2H); 7,55 - 7,48 (m, 3H); 6,87 (d, J = 8,6 Hz, 2H).
RMN 13C (101 MHz, DMSO) 5 157,2; 143,5; 133,3; 127,6; 127,3; 125,1 ; 124,4; 122,9; 116,7; 115,8; 113,3.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 2:98 a 95:5 (5 min), tr = 3,92 min, [M+ H+] = 211.
(E)-6-Estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (28)
Figure imgf000038_0001
Empleando el método experimental B2 se disolvió el ácido stiril borónico (22 mg, 0,147 mmol), NaHCOs (11 mg, 0,135 mmol), Pd(PPhs)4, (2 mg, 2 mmol%) y 6-¡odoimidazo[1 ,2- a]piridina (30 mg, 0,123 mmol) en 3 mL de una mezcla de 1 ,4-dioxano/H2O (3:1). El crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica usando CH2CI2/MeOH como eluyente para obtener 25 mg, Rto 91 %.
RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 5 8,05 (s, 1 H); 7,57 - 7,50 (m, 2H); 7,47 (s, 1 H); 7,46 - 7,36 (m, 3H); 7,34 - 7,25 (m, 2H); 7,25 - 7,17 (m, 1 H); 6,99 (d, J = 16,3 Hz, 1 H); 6,92 (d, J = 16,3 Hz, 1 H).
RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) 5 145,1 ; 136,9; 134,1 ; 129,5; 128,9; 128,1 ; 126,5; 124,3; 124,2; 123,5; 122,4; 117,9; 112,9.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 10:90 a 95:5 (5 min), tr = 4,13 min, [M+H+] = 221.
6-(Benzofuran-2-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (29)
Figure imgf000038_0002
Empleando el método experimental B2 se disolvió el ácido benzofuran-2-borónico (16 mg, 0,106 mmol), K2CO3 (15 mg, 0,106 mmol), Pd(PPhs)4, (2 mg, 2 mmol%) y 6- iodoimidazo[1 ,2-a]piridina (20 mg, 0,082 mmol) en 3 mL de una mezcla de DME/H2O (4:1). El crudo de reacción fue purificado en HPLC semipreparativo (gradiente: 10: 90 a 40: 60 CH3CN/H2O durante 30 min) para obtener 10 mg, Rto 52 %.
RMN 1H (400 MHz, Acetona-cfe) 5 9,07 (s, 1 H); 8,02 (s, 1 H); 7,74 (dd, J = 9,5; 1 ,8 Hz, 1 H); 7,70 - 7,60 (m, 3H); 7,56 (d, J = 8,1 Hz, 1 H); 7,41 - 7,32 (m, 2H); 7,27 (t, J = 7,4 Hz, 1 H).
RMN 13C (101 MHZ, Acetona-cfe) 5 155,6; 153,9; 145,4; 135,0; 130,0; 125,6; 124,1 ; 123,9; 122,5; 121 ,9; 118,5; 117,0; 114,8; 111 ,7; 103,2.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 10:90 a 95:5 (5 min), tr = 4,40 min, [M+H+] = 235. 6-(3,4-Dimetoxifenil)imidazo[1 ,2-a]pirid¡na (30)
Figure imgf000039_0001
Empleando el método experimental B2 se disolvió el ácido 3,3,4-dimetoxifenil borónico (33 mg, 0,184 mmol), Na2COs (20 mg, 0,246 mmol), Pd(PPhs)4, (7 mg, 5 mmol%) y 6- iodoimidazo[1,2-a]piridina (30 mg, 0,123 mmol) en 3 mL de una mezcla de W/MeOH/Tolueno (1:2:8). El crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica usando CF^Ch/MeOH como eluyente para obtener 30 mg, Rto 96 %.
RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 5 8,25 (s, 1 H); 7,64 (t, J = 10,9 Hz, 3H); 7,39 (dd, J = 9,3; 1 ,9 Hz, 1 H); 7,09 (dd, J = 8,2; 2,2 Hz, 1 H); 7,03 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 6,95 (d, J = 8,2 Hz, 1 H); 3,95 (s, 3H); 3,92 (s, 3H).
RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) 5 149,5; 149,2; 144,7; 134,0; 130,3; 126,9; 125,4; 122,6; 119,5; 117,7; 112,8 111 ,8; 110,3; 56,1 ; 56,1.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 10:90 a 95:5 (5 min), tr = 1 ,39 min, [M+ H+] = 255.
Procedimiento experimental C: Reacción de Heck
Figure imgf000039_0002
Se añade Pd(OAc)2 (10 mmol%) a una disolución de la correspondiente imizado[1 ,2- a]piridina (1 eq), el correspondiente haloheteroañl (1 ,3 eq) y KOAc (2 eq) en DMF (4 mL) en un tubo de microondas, bajo corriente de argón. Después de irradiar el tubo a 165 °C durante 2 horas se añade a la mezcla de reacción una solución concentrada de KOH (1 mL) y se deja bajo agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de reacción se añade H2O y la mezcla de reacción es extraída con AcOEt. Las fases orgánicas se secan sobre MgSÜ4 y el disolvente es evaporado a presión reducida. El crudo de reacción se purifica en columna cromatográfica usando una mezcla de Hexano/AcOEt para obtener las correspondientes imidazo[1 ,2- a]piridinas. Etil 5-(imidazo[1 ,2-a]piridin-3-il)-1 H-indol-2-carboxilato (31)
Figure imgf000040_0001
Empleando el método experimental C se añade Pd(OAc)2 (15 mg, 10 mmol%) a una disolución de ¡mizado[1 ,2-a]pyñd¡ne (80 mg, 0,677 mmol), 5-bromo-1/7-indol-2- carboxilato de etilo (0,235 mg, 0,880 mmol) y KOAc (86 mg, 0,880 mmol) en DMF (4 mL). El crudo de reacción se purificó en columna cromatográfica usando una mezcla de Hexano/AcOEt como eluyente para obtener 130 mg, Rto 62%.
RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d): 5 9,61 (s, 1 H); 8,33 (d, J = 6,9 Hz, 1 H); 7,86 (s, 1 H); 7,70 (d, J = 11 ,5 Hz, 2H); 7,58 (d, J = 8,4 Hz, 1 H); 7,48 (d, J = 8,5 Hz, 1 H); 7,29 (s, 1 H); 7,20 (t, J = 7,9 Hz, 1 H); 6,80 (t, J = 6,9 Hz, 1 H); 4,44 (q, J = 7,1 Hz, 2H); 1 ,43 (t, J = 7,1 Hz, 3H).
RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d): 5 161 ,9; 145,8; 136,7; 132,1 ; 128,8; 128,1 ; 126,4; 126,0; 124,2; 123,5; 122,6; 121 ,8; 118,2; 113,0; 112,6; 108,7; 61 ,3; 14,5.
HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 10:90 a 90:10 (5 min), tr = 4,24, [M+H+] = 306.
7-(Benzofuran-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (32)
Figure imgf000040_0002
La síntesis de 32 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 7-bromoimidazo[1 ,2-a]piridina (0,25 mmol), ácido benzofuran-3-borónico (0,33 mmol) en DME/H2O (4:1 ). Obteniendo un sólido de color blanco amarillento con un rendimiento de 82%. 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 8.21 (d, J = 7.0 Hz, 1 H, 5), 7.98 (d, J = 0.9 Hz, 1 H), 7.97 - 7.90 (m, 2H), 7.69 (s, 1 H), 7.62 (s, 1 H), 7.61 - 7.55 (m, 1 H), 7.44 - 7.33 (m, 2H), 7.09 (d, J = 7.0 Hz, 1 H, 6). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) 5 156.32, 142.59, 134.44, 132.54, 128.94, 128.85, 126.31 , 126.03, 125.45, 123.87, 120.73, 115.14, 112.96, 112.79, 112.41. MS (ES+,m/z), 235 [M+H]+.
6-(Benzofuran-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (33)
Figure imgf000041_0001
La síntesis de 33 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 6-¡odoimidazo[1 ,2-a]piridina (0,20 mmol), ácido benzofuran-3-borónico (0,26 mmol) en DME/H2O (4:1 ). Obteniendo un sólido verde oscuro con un rendimiento de 68%.
1H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 8.42 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 7.79 - 7.76 (m, 1 H), 7.74 (d, J = 9.3 Hz, 1 H), 7.69 (s, 1 H), 7.67 (s, 1 H), 7.58 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.44 (dd, J = 9.3, 1 .7 Hz, 1 H), 7.42 - 7.38 (m, 1 H), 7.35 (td, J = 7.6, 1 .0 Hz, 1 H).13C NMR (126 MHz, CDCI3) 5 155.9, 144.8, 141.7, 134.0, 126.1 , 125.5, 125.2, 123.5, 123.2, 120.0, 118.6, 118.3, 117.9, 113.0, 112.2. MS (ES+,m/z), 235 [M+H]+.
7-(Furan-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (34)
Figure imgf000041_0002
La síntesis de 34 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 7-bromoimidazo[1 ,2-a]piridina (0,25 mmol), ácido furan-3-borónico (0,33 mmol) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1 ). Obteniendo un aceite marrón con un rendimiento de 73%.
1H NMR (500 MHz, CDCI3) ó 8.26 (dd, J = 1.7, 1.0 Hz, 1 H, 10), 7.75 - 7.74 (m, 1 H, 3), 7.71 (d, J = 9.4 Hz, 1 H, 5), 7.66 (d, J = 1 .3 Hz, 1 H, 2), 7.61 (m, 1 H, 8), 7.53
- 7.52 (m, 1 H, 12), 7.37 (dd, J = 9.3, 1 .7 Hz, 1 H, 6), 6.67 (dd, J = 1 .9, 0.9 Hz, 1 H, 11).13C NMR (126 MHz, CDCI3) 5 144.29 (C12), 138.84 (C3), 132.13 (C2), 132.05 (C8a or C10a), 128.5 (C8a or C10a), 124.90 (C6), 122.14 (C10), 121 .6 (C5) 117.64 (C5), 112.76 (C8), 108.33 (C11 ). HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 20:95 to 95:20, tr = 0.98 (92%); MS (ES+,m/z), 185 [M+H]+.
6-(Furan-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (35)
Figure imgf000042_0001
La síntesis de 35 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 6-¡odoimidazo[1 ,2-a]piridina (0,25 mmol), ácido furan-3-borónico (0,32 mmol) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1 ). Obteniendo un aceite de color marrón con un rendimiento de 58%.
1H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 8.11 (dd, J = 7.0, 1.0 Hz, 1 H, 12), 7.81 (s, 1 H, 5), 7.71 (m, 1 H, 10), 7.63 (d, J = 1 .3 Hz, 1 H, 2), 7.56 (m, 1 H, 3), 7.52 (t, J = 1 .7 Hz, 1 H, 7), 6.94 (dd, J = 7.0, 1.7 Hz, 1 H, 11), 6.78 - 6.77 (m, 1 H, 8).13C NMR (126 MHz, CDCI3) 5 146.1 (010a), 144.7 (C2), 139.8 (C5), 134.2 (C3), 126 (C8a), 125.7 (C12), 125.2 (C6), 113.3 (C7), 112.7 (C10), 111.9 (C11 ), 108.8 (C8). HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 2:50 to 50:2, tr = 1.67 (98%); MS (ES+,m/z), 185 [M+H]+.
7-(Tiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (36)
Figure imgf000042_0002
La síntesis de 36 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 7-bromoimidazo[1 ,2-a]piridina (0.30 mmol), ácido tiofen-3-borónico (0.39 mmol) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1 ). Obteniendo un sólido de color rojo oscuro con un rendimiento de 87%. 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 8.12 (d, J = 7.1 Hz, 1 H, 5), 7.82 (s, 1 H, 8), 7.65 (s, 1 H), 7.58 - 7.54 (m, 2H), 7.45 - 7.42 (m, 2H), 7.07 (d, J = 7.1 Hz, 1 H, 6).13C NMR (126 MHz, CDCI3) 5 146.0, 140.1 , 134.4, 132.3, 127.1 , 125.9 (C5), 125.8, 121.6, 113.7 (C8), 112.3, 112.1 (C6). HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 2:50 to 50:2, tr = 4.41 (99%); MS (ES+,m/z), 200 [M+H]+.
6-(Tiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (37)
Figure imgf000043_0001
La síntesis de 37 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 6-¡odoimidazo[1 ,2-a]piridina (0,25 mmol), ácido tiofen-3-borónico (0,32 mmol) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1 ). Obteniendo un sólido de color marrón grisáceo con un rendimiento de 82%.
1H NMR (500 MHz, CDCI3) ó 8.16 (s, 1 H), 7.47 - 7.43 (m, 4H), 7.30 - 7.23 (m, 1 H), 7.15 (s, 1 H), 7.08 (s, 1 H). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) ó 144.7, 138.2, 134.1 , 132.2, 127.2, 125.8, 125.0, 122.5, 120.9, 117.9, 112.9. HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 5:95 to 95:5, tr = 4.21 (99%); MS (ES+,m/z), 200 [M+H]+.
7-(Piridin-4-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (38)
Figure imgf000043_0002
La síntesis de 38 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 7-bromoimidazo[1 ,2-a]piridina (0,41 mmol), ácido pihdinil-4-borónico (0,52 mmol) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1 ). Obteniendo un sólido de color marrón claro con un rendimiento de 61 %.
1H NMR (500 MHz, MeOD4) ó 8.65 (d, J = 6.4 Hz, 2H, 10), 8.59 (d, J = 7.1 Hz, 1 H, 5), 7.99 (s, 1 H, 8), 7.95 (s, 1 H, 3), 7.86 - 7.83 (m, 2H, 11), 7.69 (s, 1 H, 2), 7.37 (dd, J = 7.2, 1.8 Hz, 1 H, 6). 13C NMR (126 MHz, MeOD4) 5 150.9 (C10), 148.0 (C11 a), 146.4 (C8a), 136.1 (C7), 134.7(C2), 128.6 (C5), 122.8 (C11 ), 115.3 (C8), 114.9 (C3), 112.6 (C6). HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 2:95 to 95:2, fr = 0.96 (97%); MS (ES+,m/z), 196 [M+H]+.
6-(Piridin-4-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (39)
Figure imgf000044_0001
La síntesis de 20 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 6-¡odoimidazo[1 ,2-a]piridina (0,33 mmol), ácido pihdinil-4-borónico (0,42 mmol) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1 ). Obteniendo un sólido morado con un rendimiento de 70%.
1H NMR (500 MHz, MeOD4) 5 9.03 - 9.01 (m, 1 H, 5), 8.63 (dd, J = 4.7, 1 .6 Hz, 2H, 10), 7.98 (s, 1 H, 3), 7.79 (dd, J = 4.7, 2.0 Hz, 2H, 11), 7.74 (dd, J = 9.4, 1.8 Hz, 1 H, 7), 7.69 (d, J = 9.4 Hz, 1 H, 8), 7.65 (d, J = 1 .4 Hz, 1 H, 2). 13C NMR (126 MHz, MeOD4) 5 150.8 (C10), 146.9 (C11 a), 146.0 (C8a), 134.2 (C8), 126.9 (C5), 125.9 (C7), 124.9(C6), 122.8 (C11 ), 117.9 (C2), 115.4 (C3). HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 2:95 to 95:2, tr = 0.71 (95%); MS (ES+,m/z), 196 [M+H]+.
7-(Dibenzotiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (40)
Figure imgf000044_0002
La síntesis de 40 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 7-bromoimidazo[1 ,2-a]piridina (0,41 mmol), ácido dibenzotiofen-4-borónico (0,52 mmol) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1 ). Obteniendo un sólido naranja con un rendimiento de 90%.
1H NMR (500 MHz, CDCI3) ó 8.25 (dd, J = 7.0, 0.5 Hz, 1 H, 5), 8.21 - 8.19 (m, 2H), 8.02 (d, J = 0.6 Hz, 1 H), 7.86 - 7.84 (m, 1 H), 7.73 (d, J = 1 .2 Hz, 1 H), 7.67 - 7.66 (m, 1 H), 7.60 - 7.60 - 7.57 (m, 1 H), 7.55 (dd, J = 7.4, 1 .4 Hz, 1 H), 7.49 - 7.47 (m, 2H), 7.22 (dd, J = 7.0, 1 .8 Hz, 1 H, 6).13C NMR (126 MHz, CDCI3) 5 145.91 (C8a), 139.73, 138.66, 137.30, 136.96, 135.95, 134.92 (C7), 132.52, 128.93, 127.44, 127.11 , 126.12, 125.63 (C5), 124.98, 123.08, 121 .63, 117.01 , 113.59 (C6), 112.80. HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 15:95 to 95:15, tr = 4.50 (96%); MS (ES+,m/z), 301 [M+H]+.
6-(Dibenzotiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (41 )
Figure imgf000045_0001
La síntesis de 41 fue realizada empleando el procedimiento general B2. Utilizando 6-¡odoimidazo[1 ,2-a]pihdina (0,33 mmol), ácido dibenzotiofen-4-borónico (0,42 mmol) en 1 ,4-dioxano/H2O (3:1 ). Obteniendo un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 69%.
1H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 8.50 (p, J = 1 .3 Hz, 1 H), 8.23 - 8.19 (m, 2H), 7.87 - 7.84 (m, 1 H), 7.78 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 7.73 (s, 1 H), 7.68 (s, 1 H), 7.61 - 7.53 (m, 2H), 7.51 - 7.48 (m, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) 5 144.80, 139.20, 138.80, 136.51 , 135.65, 134.25, 132.71 , 132.13, 127.14, 126.94, 126.08, 125.77, 125.27, 124.69, 124.54, 122.71 , 121.88, 121.17, 117.93, 112.94. HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 30:95 to 95:30, tr = 1 .17 (94%); MS (ES+,m/z), 301 [M+H]+.
Síntesis 5-(7-(Benzofuran-2-il)-3-imidazo[1,2-a]piridin)-1H-indol-2-carboxilato de etilo, (42)
Figure imgf000045_0002
Se disuelven 7-(benzofuran-2-il)imidazo[1 ,2-a]pirid¡na (0,21 mmol) y 5-bromo-1 /-/- indol-2-carboxilato de etilo (0,28 mmol) en DMF (6 mL) en un tubo de microondas, bajo corriente de nitrógeno Se añade Pd(OAc)2 (10 mmol%). Transcurridas 2 horas bajo irradiación de microondas a 165 °C se añadió a la mezcla de reacción una solución concentrada de KOH (1 mL). Transcurrida 1 hora a temperatura ambiente se añadió H2O y la mezcla de reacción fue extraída con AcOEt. Las fases orgánicas fueron secadas sobre MgSC anhidro, filtradas y el disolvente fue evaporado a presión reducida. El crudo de reacción fue purificado en columna cromatográfica usando como eluyente una mezcla de Hexano/AcOEt (1 :4) para obtener el producto correspondiente (42) como un sólido amarillo con un rendimiento de 33%.
1H NMR (500 MHz, CDCI3) ó 9.38 (s, 1 H, 15) 8.36 (d, J = 7.2 Hz, 1 H, 5), 8.18 (s, 1 H, 11), 7.89 (s, 1 H), 7.77 (s, 1 H), 7.62 - 7.59 (m, 2H), 7.56 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.51 (dd, J = 8.5, 1 .7 Hz, 1 H), 7.35 - 7.30 (m, 2H, 17), 7.27 - 7.23 (m, 2H, 6), 7.11 (s, 1 H), 4.45 (q, J = 7.1 Hz, 2H, 23), 1.45 (t, J = 7.1 Hz, 3H, 24). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) ó 162.0, 155.2, 154.0, 145.9, 136.7, 133.7, 129.1 , 128.9, 128.0, 127.1 , 126.3, 126.0, 125.2, 123.5 (C5), 123.4, 122.5, 121.6, 121.3, 113.2 (C11 ), 111.5, 109.8 (C6), 109.6, 108.8 (C17), 103.2, 61.2 (C23), 14.3 (C24). HPLC-MS (ES+): CH3CN/H2O 40:95 to 95:40, tr = 1.10 (91 %); MS (ES+,m/z), 422 [M+H]+.
B. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBIDORA DE LA QUINASA TGFp-IR (ALK5)
Se analizaron los siguientes compuestos de síntesis química (Tabla 1) para determinar su actividad inhibidora in vitro mediante la determinación de capacidad de fosforilación de la quinasa Alk5 (TGFpRI), siguiendo las indicaciones de Roth et al. (2010) (Roth GJ, Heckel A, Brandl T, Grauert M, HoererS, Kley JT, et al. Design, Synthesis, and Evaluation of Indolinones as Inhibitors of the Transforming Growth Factor p Receptor I (TGFpRI). J Med Chem.2010;53(20):7287-95; https://doi,org/10,1021p 100812a).
Figure imgf000047_0001
Tabla 1. Listado inicial de compuestos analizados
Para ello se utilizó la proteína Alk5 recombinante de origen comercial (Abeam, ref. ab105908), así como el sistema comercial Kinase-Glo® Luminiscent kinase assay platform (Promega, ref. TB372), que determina el adenosin trifosfato (ATP) no consumido en la reacción de fosforilación por su conjugación a luciferina en una reacción catalizada por la enzima luciferasa en presencia de Mg2+. La luminiscencia observada es inversamente proporcional a la actividad quinasa. Como control de inhibición se utilizó el compuesto GW788388 Hydrate (Sigma-Aldrich ref. SML0116), ampliamente utilizado en este tipo de ensayos.
Inicialmente se puso a punto el ensayo de reacción de fosforilación con diluciones seriadas de sustrato (se estimó 1 :8 como la mejor); y diferentes concentraciones de ATP, estimándose en este caso la concentración de 100 pM como la idónea. Así mismo se determinó la concentración de quinasa recombinante realizando ensayos con diluciones seriadas de la misma (de 20ng hasta 0.62 ng), determinándose 3 ng como la concentración idónea por pocilio (volumen final 100 pL).
Una vez determinadas la condiciones óptimas de la reacción, se probaron los compuestos de síntesis química, que inicialmente fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 1mM. A partir de dicha solución madre se realizaron diluciones en tampón quinasa (Tris-HCI pH 7.540 mM; MgCl220 mM; Albúmina suero bovino (BSA) 0.1 mg/mL) de 10pM y valorando concentraciones de 5 y 10 pM. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 50 pL en placas de plástico multipocillo (96 pocilios) de microtitulacion Microtiter® Microlite™ 1+ (Thermo Scientific, ref. 7571), que permiten su uso para determinar luminiscencia en luminómetros. La reacción incluía:
Inhibidores (10pM) .5 pL
ATP (1mM) . 5 pL
Alk5 quinasa (10 ng/uL)..3 pL
Tampón 37 pL
La incubación fue 2h a temperatura ambiente en agitación y oscuridad siguiendo las instrucciones del sistema comercial.
T ranscurrido ese tiempo se añadía 50 pL de sustrato comercial (diluido 1 :8), se dejaba en agitación 10 min a temperatura ambiente y se procedía a la lectura de la luminiscencia en un lector Luminoskan Ascent instrument (Thermo Scientific, Waltham, USA).
Todas las reacciones se realizaron por duplicado.
C. ESTUDIOS DE TOXICIDAD DE COMPUESTOS QUÍMICOS SINTETIZADOS EN CÉLULAS EN CULTIVO
El primer estudio que se realizó fue investigar si dichos compuestos presentaban toxicidad sobre células humanas en cultivo. Se analizó su efecto sobre macrófagos y sobre células de epitelio intestinal.
C.1. Ensayo de citotoxicidad (MTT).
Para cuantificar el porcentaje de células que se mantenían viables en cada uno de los experimentos, se evaluaron macrófagos THP-1-XBIue™-CD14 (InvivoGen de 8 a 13 pases), derivados de monocitos humanos THP-1, y que expresan de forma estable el gen de la enzima fosfatasa alcalina inducible por promotor de NF-kB y AP-1.
Se utilizó el colorante MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetratozoliobromuro) (Biotium). Este ensayo está basado en la escisión de la sal de tetrazolio MTT (de color amarillo), para formar cristales de formazán (de color morado), producida por las células metabólicamente activas. El formazán se solubiliza con DMSO y su concentración se determina por espectrofotometría; la densidad óptica es proporcional al número de células viables. En primer lugar, los monocitos THP1-XBIue™-CD14 (InvivoGen, de 8 a 13 pases) se diferenciaron a un fenotipo de tipo macrófago utilizando forbol-12-mihstato-13-acetato (PMA, Sigma Aldrich), que a 100 ng/mL se ha mostrado como la alternativa más eficaz para la obtención de macrófagos THP-1 , con similitud con macrófagos mononucleares de sangre periférica (PBMC) (Starr et al., 2018). Para ello, las células se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad de 3 x 105 células/mL en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con un 10% de FBS, penicilina, estreptomicina (ambas a una concentración de 100 pg/mL, Sigma-Aldrich) y PMA (100 ng/mL) (Sigma-Aldrich), y fueron cultivadas a 37 °C, 5% CO2 durante 48 h. Posteriormente, el medio fue sustituido por uno equivalente, pero sin la suplementación con PMA, cultivándose esta vez las células a 37 °C, 5% CO2 durante 24 h más. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS (10mM, pH 7.4), y se añadieron 100 pL de RPMI 1640 suplementado con penicilina y estreptomicina (100pg/mL) pero sin FBS. se sembraron en placas de 96 pocilios en condiciones idénticas a las empleadas en los ensayos de antiinflamación. A continuación, se lavaron las células con PBS y se trataron con diferentes compuestos: 1) PBS (10 pL) (control positivo de crecimiento, (vehículo)); 2) diferentes concentraciones de los compuestos químicos producidos (1 pM, 5 pM y 10 pM). Las placas se incubaron durante 24 horas a 37 °C, 5% CO2 y, a continuación, se añadieron 10 pL de MTT a cada pocilio y la placa se incubó durante 4 horas a 37 °C, 5% CO2. Los cristales de formazán formados se disolvieron en 180 pL de DMSO y la placa se incubó 20 minutos en agitación a temperatura ambiente. La absorbancia se midió en cada pocilio a 595 nm (problema) y a 655 nm (background), siguiendo las instrucciones del fabricante, en un equipo ¡Mark™ Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad). Las muestras fueron analizadas por triplicado. El porcentaje de células viables se calculó con la siguiente fórmula:
% Viabilidad = (A595 - Aess Muestra problema) / (A595 - Aess Control positivo) x 100
D. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA EN MACRÓFAGOS EN CULTIVO DE LOS COMPUESTOS SINTETIZADOS
D. 1. Ensayo de efecto antiinflamatorio
Para el estudio de la actividad antiinflamatoria de los compuestos químicos sintetizados hemos utilizado como biomarcador el factor de transcripción NF-kB, implicado en procesos de inflamación. Para ello se ha utilizado la línea celular THP-1-XBIue™-CD14 (InvivoGen), derivada de monocitos humanos THP-1 , y que expresa de forma estable el gen de la enzima fosfatasa alcalina inducible por promotor de NF-kB y AP-1. Además, estas células sobre-expresan de manera estable CD14, un receptor específico de macrófagos de tipo Toll (Toll like receptors, TLR), como TLR4. Así, al estimular este receptor CD14 (por ejemplo, con lipopolisacárido bacteriano, LPS, InvivoGen), las células THP1-XBIue™-CD14 activan esos factores de transcripción y consecuentemente la síntesis y secreción de fosfatasa alcalina, que es detectada fácilmente al añadir el sustrato comercial QUANTI-Blue™ (InvivoGen), que vira a color azul/púrpura en presencia de la fosfatasa secretada.
Las células THP1-XBIue™-CD14 (InvivoGen, de 8 a 13 pases) se procesaron como se mencionó anteriormente, diferenciándolas a macrófagos en presencia de PMA (Sigma Aldrich). A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS (10mM, pH 7.4), y se añadieron 100 pL de RPMI 1640 suplementado con penicilina y estreptomicina (100pg/mL) pero sin FBS. Posteriormente, las células en cultivo se trataron con: 1) 10 pL PBS (control negativo); 2) GW788388 (control positivo); y concentraciones de 5 pM de los compuestos sintetizados. Tras 1 h de incubación se añadió lipopolisacárido (LPS), de la bacteria Escherichia coli (InvivoGen), a una concentración final de 300 ng/mL, y los cultivos se mantuvieron a 37 °C, 5% CO2 durante 24 h.
Tras ese tiempo, se extrajeron 20 pL de sobrenadante del medio de cultivo de cada pocilio y se pasaron a una nueva placa y se añadieron 180 pL del reactivo QUANTI-Blue™. Tras 5 h de incubación a 37 °C, se midió la absorbancia a 655 nm en los pocilios de la placa con un lector ¡Mark™ Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad). Las muestras fueron analizadas por cuadruplicado.
Por otro lado, el mismo proceso se realizó en paralelo, sin añadir el estimulante LPS a las placas, para comprobar la posible actividad inflamatoria intrínseca de dichos compuestos.
Se realizaron 8 réplicas de los ensayos biológicos.
E. ESTUDIOS DE VIABILIDAD CELULAR Y TOXICIDAD DE COMPUESTOS QUÍMICOS 31 (PS1801) Y 26 (PS1906)
Para estudiar si dichos compuestos de los ejemplos 26 y 31 presentaban toxicidad sobre células humanas en cultivo se analizó su efecto sobre macrófagos y sobre células de epitelio intestinal. E.1. Cuantificación de viabilidad celular.
Para cuantificar el porcentaje de células que se mantenían viables en cada uno de los experimentos, se evaluaron macrófagos THP-1-XBIue™-CD14 (InvivoGen de 8 a 13 pases), derivados de monocitos humanos THP-1 , y que expresan de forma estable el gen de la enzima fosfatasa alcalina inducible por promotor de NF-kB y AP-1. Así mismo se evaluaron células de epitelio intestinal humano Caco-2 (ATCC®, HTB-37™ de 10 a 12 pases). Para ello, se usó azul tripán (Gibco) como tinción de exclusión. Este colorante penetra en aquellas células cuya membrana está deteriorada (signo de muerte celular), y tiñe su citoplasma de color azul oscuro. Para ello, las suspensiones celulares ensayadas se centrifugaron a 500 x g (5 min a 24 °C), los sedimentos celulares se resuspendieron en 0,1 mL de PBS, y, a continuación, 10 pL se mezclaron con 10 pL de azul tripán (0,4%) filtrado por 0,22 pm. El porcentaje de células vivas se determinó en 10 pL de la mezcla anterior empleando una cámara y un aparato de contaje celular Countess™ (Invitrogen). Se realizaron 8 réplicas de los ensayos biológicos.
E.2. Ensayo de citotoxicidad (MTT).
En esta segunda evaluación de citotoxicidad sobre THP-1-XBIue-CD14 y Caco-2, se utilizó la técnica previamente descrita con el colorante MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetratozoliobromuro) (Biotium).
Para ello, ambos tipos de células se sembraron en placas de 96 pocilios en condiciones idénticas a las empleadas en los ensayos de antiinflamación. A continuación, se lavaron las células con PBS y se trataron con diferentes compuestos: 1) PBS (10 pL) (control positivo de crecimiento, (vehículo)); 2) DMSO 20% (control negativo, ya que dosis elevadas de este compuesto son citotóxicas); 3) diferentes concentraciones de los compuestos PS1801 y PS1906 (1 , 5 y 10 pM). Las placas se incubaron durante 24 horas a 37 °C, 5% CO2 y, a continuación, se añadieron 10 pL de MTT a cada pocilio y la placa se incubó durante 4 horas a 37 °C, 5% CO2. Los cristales de formazán formados se disolvieron en 180 pL de DMSO y la placa se incubó 20 minutos en agitación a temperatura ambiente. La absorbancia se midió en cada pocilio a 595 nm (problema) y a 655 nm (background), siguiendo las instrucciones del fabricante, en un equipo ¡Mark™ Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad). Las muestras fueron analizadas por triplicado.
Se realizaron 8 réplicas de los ensayos biológicos. El porcentaje de células viables se calculó igualmente con la siguiente fórmula:
% Viabilidad = (A595 - Aess Muestra problema) / (A595 - Aess Control positivo) x 100
F. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA EN MACRÓFAGOS EN CULTIVO DE LOS COMPUESTOS PS1801 Y PS1906
F. 1. Ensayo de efecto antiinflamatorio
Para el estudio de la actividad antiinflamatoria de los compuestos químicos PS1801 y PS1906 hemos seguido el protocolo previamente descrito utilizado como biomarcador el factor de transcripción NF-kB, usando la línea celular THP-1-XBIue™-CD14 (InvivoGen).
De manera análoga a los ensayos previamente descritos, los monocitos THP1-XBIue™- CD14 (InvivoGen, de 8 a 13 pases) se diferenciaron a un fenotipo de tipo macrófago utilizando PMA (Sigma Aldrich) y se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad de 3 x 105 células/mL en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con un 10% de FBS, penicilina, estreptomicina (ambas a una concentración de 100 pg/mL, Sigma-Aldrich) y PMA (100 ng/mL) (Sigma-Aldrich), y fueron cultivadas a 37 °C, 5% CO2 durante 48 h. Posteriormente, el medio fue sustituido por uno equivalente, pero sin la suplementación con PMA, cultivándose esta vez las células a 37 °C, 5% CO2 durante 24 h más. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS (10mM, pH 7.4), y se añadieron 100 pL de RPMI 1640 suplementado con penicilina y estreptomicina (100pg/mL) pero sin FBS.
Posteriormente, las células en cultivo se trataron con: 1) 10 pL PBS (control negativo); 2) GW788388 (control positivo); y 3) 5 pM de los compuestos PS1801 y PS1906. Tras 1 h de incubación se añadió lipopolisacárido (LPS), de la bacteria Escherichia coli (InvivoGen), a una concentración final de 300 ng/mL, y los cultivos se mantuvieron a 37 °C, 5% CO2 durante 24 h.
Tras ese tiempo, se extrajeron 20 pL de sobrenadante del medio de cultivo de cada pocilio y se pasaron a una nueva placa y se añadieron 180 pL del reactivo QUANTI-Blue™. Tras 5 h de incubación a 37 °C, se midió la absorbancia a 655 nm en los pocilios de la placa con un lector ¡Mark™ Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad). Las muestras fueron analizadas por cuadruplicado.
Por otro lado, el mismo proceso se realizó en paralelo, sin añadir el estimulante LPS a las placas, para comprobar la posible actividad inflamatoria intrínseca de dichos compuestos. Se realizaron 8 réplicas de los ensayos biológicos.
G. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados experimentales obtenidos fueron sometidos a análisis de varianza, ANOVA, y para aquellos parámetros que no mostraron una distribución poblacional normal, se aplicó el test no-paramétrico Kruskal-Wallis. Se ha utilizado el programa GraphPad Prism versión 7.0 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com), *P valor < 0.05, **P valor < 0.01 , ***P valor < 0.001.
H. EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA IN VIVO'. MODELO MÚRIDO DE DAÑO AGUDO DE PULMÓN (ACUTE LUNG INJURY, ALI)
Con el fin de evaluar el posible efecto antiinflamatorio de la molécula PS1906 en un modelo in vivo, seleccionamos el modelo de ALI inducido por instilación traquela de lipopolisacarido (LPS) ampliamente descrito en la literatura y previamente realizado por miembros del grupo de investigación (Clemente-Moragón et al., 2020). Este modelo murino es un modelo de inflamación o daño agudo de pulmón que lleva asociado un periodo fibrótico a largo plazo, por lo que puede servir tanto para el estudio de enfermedades pulmonares inflamatorias como de procesos fibróticos pulmonares.
H. 1. Animales
Para este modelo se escogieron ratones de la cepa C57BL/6J-OlaHsd. Los ratones adultos se mantuvieron en condiciones libres de patógenos en una habitación con temperatura controlada y un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. La dieta y el agua estaban disponibles ad libitum. Los ratones fueron anestesiados por vía i.p. con una inyección de un cóctel anestésico conteniendo sulfato de atropina (1 mg / kg; B. Braun, 1 mg / mL), clorhidrato de xilazina (20 mg / kg; Rompun® Bayer, 20 mg / mL) y ketamina (100 mg / kg; Anesketin Dechra, 100 mg / mL). Todos los procedimientos experimentales y otros procedimientos científicos con animales se ajustaron a la Directiva de la UE 2010 / 63EU y la Recomendación 2007/526 / EC, promulgada en la ley española bajo el Real Decreto 53/2013. Los protocolos animales fueron aprobados por los comités éticos locales y el Área de Protección Animal de la Comunidad Autónoma de Madrid. H.2. Elección de las dosis y administración de los tratamientos.
Para la selección de las dosis a adminsitrar se tuvieron en cuenta los estudios in vitro, tomando como concentración eficaz máxima (no toxica) la concentración de 10 pM. Asumiendo una volemia aproximada de 2 mL para un ratón de unos 30g de peso, y teniendo en cuenta una perdida por distribución, metabolismo o secreción del 50% de los productos, calculamos la dosis 1 (D1) y seleccionamos como dosis 2 (D2) el doble de la primera. Así, teniendo en cuenta los respectivos pesos moleculares, las dosis correspondientes para el producto PS1906 fueron 156 pg/kg (D1) y 312 pg/kg (D2). Para la preparación de las diferentes dosis se utilizó como diluyente suero fisiológico. Todas las dosis fueron preparadas para administrar el mismo volumen en el ratón. Las dosis se administraron via intravenosa con el animal debidamente anestesiado momentos previos a la inducción de la inflamación pulmonar.
H.3. Inducción del modelo de inflamación aguda pulmonar.
Con el animal debidamente anestesiado, se expuso la tráquea, se insertó un catéter (Introcan Safety 22G, Braun) y los ratones recibieron una inyección intratraqueal de lipopolisacárido estéril (LPS) (L2262, Sigma) a una dosis alta de 10 mg / kg en 25 pl de PBS 1X, seguida de por 200 I de aire para asegurar la deposición en cada pulmón. Los ratones del grupo control sanos recibieron una inyección intratraqueal de 25 pl de PBS. Después de la administración intratraqueal, se cerraron las heridas y se permitió que los ratones se recuperaran con libre acceso a comida y agua.
H.4. Evaluación del infiltrado inflamatorio en lavado broncoalveolar.
Después de 24 h, se sacrificaron los animales y se lavaron los pulmones con 1 ,5 mL de PBS frío a través de un catéter traqueal (Introcan Safety 22G, Braun), y se extrajo un total de 1 mL de líquido de lavado broncoalveolar de cada ratón para la detección, de neutrófilos y linfocitos por citometría de flujo. La detección se realizó por tamaño y complejidad, así como el mareaje positivo para el marcador Ly6G (neutrófilos) y el marcador CD4 (linfocitos), así como el número total de células usando un citómetro de flujo FACS Canto-3L equipado con software DIVA (BD Biosciences). Los datos se analizaron con el software FlowJo (Ashland). H.5. Procesado de los pulmones para evaluación histopatologica
Al finalizar el protocolo y ras proceder a la eutanasia de los animales, se extrajo el pulmón separando el lóbulo derecho del izquierdo. El lóbulo derecho se fijó en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 24 h a 4°C, y el lóbulo izquierdo se congeló rápidamente en nitrógeno líquido para el posterior aislamiento de proteínas y ensayos de inmunotransferencia. Los lóbulos derechos fijados con PFA se colocaron en alcohol al 70% a 4°C y se cortaron transversalmente en dos porciones. Para la puntuación histopatologica de la lesión pulmonar aguda (ALI score), ambas porciones transversales se deshidrataron mediante una serie de etanol, se aclararon en xileno, se incrustaron en cera de parafina, se cortaron en secciones de 5 pm, se montaron en portaobjetos Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific) y se tiñeron con solución de hematoxilina y eosina. Los tejidos se procesaron en la Unidad de Histopatología del CNIC, y todos los portaobjetos se escanearon con un escáner de portaobjetos digital NanoZoomer-2.0-RS (C110730®, Hamamatsu, Japón) y se visualizaron con el software NanoZoomer Digital Pathology (Hamamatsu). El ALI se puntuó con un sistema semicuantitativo, utilizando una escala de 0 a 4 que combinaba evaluaciones de la infiltración de células inflamatorias del espacio aéreo y la pared de los vasos, la congestión alveolar, la hemorragia, el grosor de la pared alveolar y la formación de la membrana hialina. Una puntuación de 0 indica que no hay lesiones, 1 indica una lesión leve, 2 una lesión moderada, 3 una lesión grave y 4 una lesión muy grave.
H.6. Análisis estadístico
Los datos se transformaron en escala logarítmica para apreciar mejor las diferencias entre grupos. Se presentan como media ± desviación estándar y se analizaron con el software Prism v7 (Graph pad, Inc.). Las comparaciones entre los grupos se realizaron mediante ANOVA de una vía. Los valores p se ajustaron con el método de comparaciones múltiples de Dunnet. *** p <0.0001 vs control; * p < 0.05, # # p < 0.01 , # # p < 0.0o1 vs grupo LPS para un n= 4-7 ratones.
RESULTADOS
RESULTADOS DE ENSAYOS DE INHBICION DE ACTIVIDAD QUINASA DE ALK5 Los ensayos realizados pusieron de manifiesto que vahos compuestos presentaban actividad inhibidora de la quinasa Alk5, en comparación con el compuesto GW788388, que rondaba el 25% de inhibición. Los compuestos presentaron el efecto inhibidor que se muestran en la Tabla 2.
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Tabla 2. Fórmula y referencia de los compuestos con actividad inhibidora de quinasa Alk5 in vitro.
Los valores de % de reducción de actividad quinasa se refieren considerando el 100% de reducción de actividad del compuesto control de inhibición GW788388 Hydrate (Sigma- Aldrich ref. SML0116).
En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos con los diferentes compuestos, donde se observa que el compuesto PS1906 (16) fue de los que mostraron mayor efecto inhibidor de la tirosina quinasa Alk5.
RESULTADOS DE ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO EN CULTIVOS CELULARES
Como se observa en la Figura 2, los tratamientos realizados con los compuestos utilizados a 1 pM carecen de efectos citotóxicos sobre macrófagos THP-1 (Figura 2), ya que no disminuyen la viabilidad celular. Se pudo observar que el compuesto 16 resultaba tóxico para las células a concentraciones de 5 pM y 10 pM, mientras que el resto no resultaban tóxicos. También se probó el compuesto GW788388 (control), conocido inhibidor de la actividad quinasa de Alk5 y carente de actividad citotóxica (Figura 2).
Se realizaron 8 réplicas de los ensayos biológicos. RESULTADOS DE VIABILIDAD Y CITOTOXICIDAD DE LOS COMPUESTOS PS1801
Y PS1906
Como se observa en la Figura 3, los tratamientos realizados con los compuestos PS1801 y PS1906 carecen de efectos citotóxicos sobre células epiteliales Caco-2 (Figura 3A) o macrófagos THP-1 (Figura 3B) a todas las concentraciones utilizadas, ya que no disminuyen la viabilidad celular. Dichos resultados confirman los datos previos obtenidos en macrófagos THP-1 y ponen de manifiesto la ausencia de toxicidad en células de epitelio intestinal. Se utilizó DMSO como sustancia tóxica para las células (control positivo), así como el compuesto GW788388 (control) conocido inhibidor de la actividad quinasa de Alk5 y carente de actividad citotóxica.
Se decidió continuar los ensayos utilizando una concentración de 5 pM por ser donde menos disminuía la viabilidad celular en ambos tipos celulares.
9.5. LOS COMPUESTOS PS1801 Y PS1906 PRESENTAN ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA EN MACRÓFAGOS HUMANOS THP-1-XBLUE™ CD14.
Para el estudio de la actividad antiinflamatoria de los compuestos PS1801 y PS1906 hemos utilizado como biomarcador el factor de transcripción implicado en inflamación NF- kB. Se estimularon macrófagos THP-1-XBIue™-CD14 con LPS (Figura 4), un promotor de la expresión de este factor transcripcional, que se une al receptor TLR4, sobreexpresado en estos macrófagos. Con una concentración de los compuestos de 5 pM se consiguió una inhibición significativa de la producción de NF-kB (p < 0.001) dependiente de LPS. Estos resultados confirmaban los resultados obtenidos previamente.
A su vez, se comprobó la actividad de estas vesículas en un ambiente control, sin la estimulación con LPS (Figura 5), revelándose que por sí solas no producen la expresión de NF-kB in vitro. Estos resultados nos indican que los compuestos PS1906 y PS1801 son útiles para disminuir la inflamación derivada de los efectores dependientes de este factor transcripcional, con especial interés cuando se usen como tratamiento en un ambiente previo de inflamación. 9.6. RESULTADOS OBTENIDOS IN VIVO EN MODELO MÚRIDO DE INFLAMACIÓN Y DAÑO AGUDO PULMONAR
Para el estudio de la actividad antiinflamatoria in vivo hemos elegido un modelo de inflamación y daño agudo de pulmón (ALI) empleado para el estudio de enfermedades pulmonares inflamatorias como el Síndrome de Distrés Respiratorio Agudo. Este modelo es evaluado siguiendo una puntuación extraída del análisis histopatológico de cortes fijados de pulmón y teñidos con Hematoxilina y Eosina. El panel A de la figura 6 muestra imágenes representativas del pulmón de cada grupo donde se pueden observar diferencias macroscópicas. La cuantificación del ALI score (mostrada en el panel B de la Fig. 6) muestra un efecto positivo para el producto PS1906. El análisis por citometría de flujo del lavado broncoalveolar evidención un efecto antiinflamatorio dependiente de dosis del compuesto PS1906, tanto en neutrófilos (panel C de la Fig. 6), como en linfocitos (panel D de la Fig. 6; si bien estos resultados no muestran significancia estadística probablemente debido a la escasa participación de este tipo celular en etapas tempranas del daño agudo de pulmón).
REFERENCIAS
Clemente-Moragón A, Gómez M, Villena-Gutiérrez R, Lalama DV, García-Prieto J, Martínez F, Sánchez-Cabo F, Fuster V, Oliver E, Ibáñez B. Metoprolol exerts a non-class effect against ischaemia-reperfusion injury by abrogating exacerbated inflammation. Eur Heart J. 2020 Dec 7;41 (46):4425-4440. https://doi.Org/10.1093/eurheartj/ehaa733

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un compuesto de fórmula I:
Figure imgf000059_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:
R2 representa H; arilo, donde el grupo arilo no está sustituido, o está sustituido con grupos alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, o está sustituido con haloalquilo, o está sustituido con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono,
R3 representa H; halógeno; haloalquilo; alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; amino; arilo ó heteroarilo, donde los grupos arilo y heteroarilo no están sustituidos o están sustituidos con grupos alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, o con alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono,
R5 representa H; alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono; alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; nitro; carboxilo; alquilo de 1 a 5 átomos de carbono no sustituido o sustituido con uno o más grupos hidroxi; un grupo N-(3-met¡lén-2-oxo¡ndolin-5-¡l)-3-(p¡per¡d¡n-1- il)propanamida); o carbaldehído,
R6 representa un átomo de hidrógeno (H); alquilo no sustituido de 1 a 5 átomos de carbono; un grupo alquilo de 1 a 5 átomos de carbono sustituido con uno o más grupos hidroxi; un grupo alcoxilo de 1 a 5 átomos de carbono; halógeno seleccionado entre F, Cl, I; alcoxicarbonilo (-O-(C=O)-R) donde R tiene de 1 a 3 átomos de carbono; nitro; alquenilo de 3 a 10 átomos de carbono no sustituido o sustituido; alquenilo de 2 átomos de carbono sustituido con fenilo (estirilo) ; arilo, donde el grupo arilo no está sustituido o está sustituido por uno o más grupos hidroxilo, o sustituido con uno o más grupos metoxilo; heteroarilo; o heteroarilo donde el grupo heteroarilo está seleccionado entre, dibenzotiofenilo, un grupo de fórmula II, un grupo de fórmula III:
Figure imgf000060_0001
II III donde D, B, E, G representan independientemente N, CH ó C-R, donde R es alquilo de uno a 3 átomos de carbono no sustituido, arilo no sustituido o cicloalquilo no sustituido, Z representa CH ó N
Y representa CH ó N
W representa O ó S ó NH,
R7 representa un átomo de hidrógeno (H); un grupo ahlo no sustituido o un grupo arilo sustituido con uno o más grupo hidroxi, o sustituido con uno o más grupos metoxilo; halógeno; alquenilo de 3 a 10 átomos de C, no sustituido o sustituido por un grupo arilo; alquenilo de 2 átomos de carbono sustituido con fenilo (estirilo) ; alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; un grupo heteroarilo; o heteroarilo donde el grupo heteroarilo está seleccionado entre benzotiofenilo, benzofuranilo, benzopirrolilo; dibenzotiofenilo, un grupo de fórmula II y un grupo de fórmula III como se han definido anteriormente,
- en el que:
- al menos 3 de los sustituyentes R2, R3, R5, R6 y R7 son simultáneamente H, y la posición del carbono 8 de la estructura de imidazo[1 ,2a]piridina no lleva sustituyentes, y
- cuando R5 es carbaldehido, al menos uno de R2, R3, R6 o R7 es distinto de H,
- cuando R6 es arilo o arilo sustituido, R3 no es arilo sustituido
- cuando R3 representa un grupo amino, R6 no representa hidrógeno
- cuando R2 representa arilo no sustituido, o arilo sustituido con un grupo metilo o con metoxilo, al menos uno de los sustituyentes R2, R3, R5, R6 y R7 no es H
- al menos uno de los grupos R3, R5, R6, R7 es distinto de H, cuando R2 es arilo no sustituido, o es un arilo sustituido con halógeno, metilo o metoxilo.
2. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R2 representa arilo sustituido con un grupo CF3 o con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono; y de forma preferente, además, R3y R5 son simultáneamente H.
3. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que:
- R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, y
- simultáneamente R6 es:
- un alquilo de uno a 5 átomos de carbono, o
- un grupo arilo sustituido con un hidroxilo, y preferentemente, además, R3 y R5 son simultáneamente H.
4. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R2 representa un grupo seleccionado entre arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono; y simultáneamente R:6 es
- alquilo de uno a 5 átomos de carbono, o
- un grupo arilo sustituido con un hidroxilo; y de forma preferente R3 y R5 son simultáneamente H.
5. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R2 representa un fenilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono o fenilo sustituido con trihalometilo; y
- simultáneamente R7 es un grupo heteroarilo, preferentemente, 2-benzo[b]furilo; y de forma más preferente, R3, R4, R5y R6 son simultáneamente H.
6. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que:
- R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono y R7 es arilo sustituido con hidroxilo o con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, o
- R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono y R7 representa alquenilo sustituido con un grupo arilo; y de forma preferente, además, R3y R5 son simultáneamente H.
7. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono y R7 es arilo sustituido con hidroxilo o con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono o alquenilo sustituido con un grupo arilo; y de forma preferente, además, R3y R5 son simultáneamente H.
8. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R2 representa arilo sustituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, R3 es H, R6 es H, grupo alquilo o grupo arilo, y R7 es H o arilo sustituido con hidroxilo o con un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono; y de forma preferente, R3y R5 son simultáneamente H.
9. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R3 es un arilo no sustituido; y de forma preferente, además, R2, R5y R6son simultáneamente H; y de forma más preferente, además, R2, R5 , R6 y R7 son simultáneamente H.
10. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R3 representa un heterociclo aromático no sustituido, o un heterociclo aromático sustituido con un grupo alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; y de forma preferente, además, R2, R5 y R6 son simultáneamente H; y de forma más preferente, además, R2, R5 , R6 y R7 son simultáneamente H.
11 . Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R3 es un grupo seleccionado entre benzofuranilo, benzotiofenilo e indol, no sustituido o sustituido con un grupo alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; y de forma preferente, además, R2, R5y R6 son simultáneamente H; y de forma más preferente, además, R2, R5 , R6 y R7 son simultáneamente H.
12. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R3 es un grupo seleccionado entre benzofuranilo, benzotiofenilo e indol, sustituido o sustituido con un grupo alcoxicarbonilo de 2 a 5 átomos de carbono; y simultáneamente, R7 es un grupo seleccionado entre benzofuranilo, benzotiofenilo e indol; de forma preferente, R2, R5 y R6 son simultáneamente H.
13. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R5 representa H, etoxicarbonilo, nitro, carboxilo, hidroximetilo, carbaldehído, o etoxilo, y preferentemente, R2, R3 , R6 y R7 son simultáneamente H.
14. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R6 o R7 representan un fragmento
Figure imgf000063_0001
II en el que D, B, E, G representan independientemente CH ó C-R, donde R puede ser alquilo no sustituido, arilo no sustituido o cicloalquilo no sustituido,
Z representa CH y
W representa O.
15. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R6 o R7 representa un fragmento
Figure imgf000063_0002
II en el que D, B, E, G representan independientemente CH, Z representa C y W representa O.
16. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R6 representa un grupo alquilo de 1 a 5 átomos de carbono o alcoxicarbonilo (-O-(C=O)-R) donde R tiene de 1 a 3 átomos de carbono, y preferentemente, además, R2, R3 , R5 y R7son simultáneamente H.
17. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R7 representa un grupo arilo no sustituido, y preferentemente, además, R2, R3 , R5 y R7son simultáneamente H.
18. Un compuesto según la reivindicación 1 seleccionado entre:
- Ácido ¡m¡dazo[1 ,2-a]pihd¡n-5-carboxíl¡co (2)
- lmidazo[1,2-a]piridin-5-carboxilato de etilo (3)
- 3-Fenilimidazo[1 ,2-a]piridina (4) - Imidazo[1 ,2-a]piridin-5-ilmetanol (5)
- 2-(4-Metoxifenil)-6-metilimidazo[1 ,2-a]piridina (8)
- 4-(lmidazo[1 ,2-a]piridin-7-il)fenol (12)
- 4-(2-(4-(T rifluorometil)fenil)imidazo[1 , 2-a] pi rid i n-7-i l)fenol (13)
- 4-(2-(4-(T rifluorometil)fenil)imidazo[1 ,2-a]pi rid i n-6-i l)fenol (15)
- 4-(2-(4-Metoxifenil)imidazo[1 ,2-a]piridin-7-il)fenol (16)
- 4-(2-(4-Metoxifenil)imidazo[1 ,2-a]piridin-6-il)fenol (17)
- (E)-7-Estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (19)
- (E)-2-(4-Metoxifenil)-7-estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (20)
- 7-(3,4-Dimetoxifenil)imidazo[1,2-a]piridina (21)
- 6-lodo-2-(4-(trifluorometil)fenil)imidazo[1 ,2-a]piridina (25)
- 7-(Benzofuran-2-il)imidazo[1 ,2-a]piridina. (26) PS1906
- 4-(lmidazo[1 ,2-a]piridin-6-il)fenol (27)
- (E)-6-Estirilimidazo[1 ,2-a]piridina (28)
- 6-(Benzofuran-2-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (29)
- 6-(3,4-Dimetoxifenil)imidazo[1,2-a]piridina (30)
- Etil 5-(imidazo[1,2-a]piridin-3-il)-1 H-indol-2-carboxilato (31)
- 7-(Benzofuran-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (32)
- 6-(Benzofuran-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (33)
- 7-(Furan-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (34)
- 6-(Furan-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (35)
- 7-(Tiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (36)
- 6-(Tiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (37)
- 7-(Piridin-4-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (38)
- 6-(Piridin-4-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (39)
- 7-(Dibenzotiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (40)
- 6-(Dibenzotiofen-3-il)imidazo[1 ,2-a]piridina (41)
- 5-(7-(Benzofuran-2-il)-3-imidazo[1 ,2-a]piridin)-1 H-indol-2-carboxilato de etilo, (42)
- 2-(4-Metoxifenil)-6-iodo-imidazo[1 ,2-a]piridina,
- N-(3-(imidazo[1,2-a]piridin-5-ilmetil0n)-2-oxoindolin-5-il)-3-(piperidin-1-il)propanamida.
19. Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que el compuesto de fórmula I está seleccionado entre
Figure imgf000065_0001
20. Un compuesto de fórmula I, definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso como medicamento.
21. El compuesto de fórmula I, de acuerdo con la reivindicación anterior para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto.
22. El compuesto de fórmula I, de acuerdo con la reivindicación anterior en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad pulmonar inflamatoria seleccionada entre síndrome por distrés respiratorio agudo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, inflamación pulmonar, preferentemente síndrome por distrés respiratorio agudo y fibrosis pulmonar.
23. El compuesto de fórmula I, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 20 a 22, en el que el compuesto es etil 5-(¡midazo[1 ,2-a]piridin-3-il)- 1 H-indol-2- carboxilato.
24. El compuesto de fórmula I, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 20 a 22, en el que el compuesto es 7-(benzofuran-2-il)imidazo[1 ,2-a]piridina.
25. El compuesto de fórmula I, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 20 a 22, en una concentración comprendida entre 15 mg/kg y 10 pg/kg, aún más preferiblemente entre 1 mg/kg y 50 pg/kg, y aún más preferiblemente entre 800 pg/kg y 80 pg/kg.
26. Una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos de fórmula I, definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y uno o más compuestos activos adicionales, y/o uno o más portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
27. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación anterior, donde el uno o más vehículos famacéuticamente aceptable se selecciona entre un desintegrante, tensioactivo, aglutinante, lubricante y combinaciones de los anteriores.
28. La composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores 26 a 27, donde el uno o más compuestos activos adicionales se seleccionan entre esferoides, corticosteroides y medicamentos antiinflamatorios no esteroideos.
29. La composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores 26 a 28, donde el uno o más compuestos activos adicionales es uno o más compuestos de fórmula I definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
30. Una composición farmacéutica, definida en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 25 a 29 para su uso como medicamento
31. Una composición farmacéutica, según la reivindicación anterior para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, preferentemente, una enfermedad pulmonar inflamatoria seleccionada entre síndrome por distrés respiratorio agudo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, inflamación pulmonar, preferentemente síndrome por distrés respiratorio agudo y fibrosis pulmonar.
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