WO2024259577A1 - 基于玻璃片的芯片基片制备方法 - Google Patents

基于玻璃片的芯片基片制备方法 Download PDF

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WO2024259577A1
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glass sheet
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coupling reagent
reagent
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黄鑫
廖莎
李慧敏
陈奥
章文蔚
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BGI Shenzhen Co Ltd
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BGI Shenzhen Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a method for preparing a chip substrate based on a glass sheet.
  • Spatial transcriptomics refers to the generation of all transcriptome data from a complete tissue sample, so that it can locate and distinguish the active expression of functional genes in specific tissue regions, providing valuable information for research and diagnosis.
  • spatial transcriptome technology allows scientists to detect all gene activities in tissue samples and map the location where the activities occur. This technology has brought many new discoveries that will help scientists better understand diseases and biological processes.
  • FC chip STOmics Gene Expression Reagent Set-S1 (Stereo Chip, spatiotemporal expression chip, hereinafter referred to as SC chip) and STOmics Fluorescent Reagent Set-F1 (Fluorescent Chip, spatiotemporal fluorescent chip, hereinafter referred to as FC chip).
  • SC chip STOmics Gene Expression Reagent Set-S1
  • FC chip Fluorescent Reagent Set-F1
  • the raw material of FC chip is a silicon microarray chip independently developed by BGI, with an array resolution of up to 500 nanometers. Very few photolithography machines can achieve such high precision, so the cost of silicon chip itself is very high, accounting for 82.4% of the total material cost, but the price of FC chip is low, so the profit margin of FC chip is low.
  • FC chip Before using SC chip to capture tissue transcripts, etc., it is necessary to use FC chip to explore tissue permeabilization conditions.
  • FC chip When using FC chip to test tissue permeabilization time, 4 F1 chips are generally used for time gradient test. There have been cases where the permeabilization time results explored on FC chip are inconsistent with those on SC chip. One of the reasons may be the difference in probes between the 4 F1 chips.
  • the present invention provides a method for preparing a chip substrate based on a glass sheet, the method comprising the following steps:
  • the present invention provides a chip preparation method, which, based on the method steps described in the first aspect, further comprises:
  • the present invention provides a chip prepared by the method described in the third aspect, wherein the chip comprises a glass sheet having an amino group on its surface, a coupling reagent with an azide group forms an amide bond with the amino group, and a probe modified at the 5' end reacts with the azide group to bind the probe to the surface of the glass sheet.
  • the present invention replaces the flow-channel reaction with an immersion reaction, which can realize the reuse of reaction reagents, thereby further reducing reagent costs;
  • the glass slide FC chip can achieve different permeabilization time gradients of the same tissue on the same glass slide, which has better stability;
  • the present invention can realize the testing of multiple tissues on a glass slide, and the patch position can be freely designed, so the size and quantity of the tissues are flexible and variable.
  • Figure 1 shows the poly T structure at the 3' end of the probe coupled to the surface of the glass slide in the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the process of preparing a chip using a glass slide in Example 1 of the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram of probe detection (poly T combined with polyA-cy5) in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a fluorescence microscope photographing result in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the permeabilization process in Example 3 of the present invention.
  • glass sheet refers to a rigid or flexible glass material having a length, width, and thickness.
  • probe refers to a nucleic acid sequence (DNA or RNA) with a detection label and a known sequence that is complementary to the target gene.
  • a probe with a known target nucleotide sequence is fixed on the surface of a gene chip, and the nucleic acid sequence is determined by hybridization with the nucleic acid probe.
  • the present invention provides a method for preparing a chip substrate based on a glass sheet, the method comprising the following steps:
  • step 1) the glass slide is directly immersed in the reagent having an amino group.
  • the reagent with amino group is selected from: isopropylamine, ethylenediamine, aniline, lysine, polylysine, arginine, leucine and tryptophan;
  • the coupling reagent is selected from: N-hydroxysuccinimide active ester, imide ester, fluorophenyl ester, STP ester, maleimide and SMCC.
  • the present invention provides a chip substrate prepared by the method described in the first aspect, wherein the chip substrate comprises a glass sheet, the surface of the glass sheet carries amino groups, and a coupling reagent with an azide group forms an amide bond with the amino group.
  • the present invention provides a chip preparation method, which, based on the method steps described in the first aspect, further comprises:
  • the glass slide is immersed in a probe solution containing an oligonucleotide strand with a 5' end modification.
  • the 3' end of the probe is a poly-T structure.
  • the present invention provides a chip prepared by the method described in the third aspect, wherein the chip comprises glass
  • the glass sheet has amino groups on its surface, a coupling reagent with an azide group forms an amide bond with the amino group, and a probe modified at the 5' end reacts with the azide group to bind the probe to the surface of the glass sheet.
  • the glass sheet refers to a rigid or flexible glass material having length, width and thickness, and can be a common glass sheet in daily life.
  • the glass sheet is a glass slide.
  • reagents with amino groups can generate strong adhesion through the interaction between its polycations and anions on the glass.
  • Common molecular weights of polylysine are 70,000-150,000, 150,000-300,000 and >300,000. The larger the molecular weight, the stronger the adhesion.
  • the amino groups on the surface are also successfully bound to the glass sheet.
  • the coupling reagent is an important "bridge” for tightly binding the probe in step 3) and the amino group in step 1).
  • the ester-activated cross-linking agent and the labeled compound in the coupling reagent react with the amino group on the surface of the glass sheet under physiological to weakly alkaline conditions (i.e., pH value of 7.2-9) to form a stable amide bond. Therefore, the coupling reagent is also successfully bound to the glass sheet, and the azide group on the coupling reagent is also exposed.
  • the probe solution contains an oligonucleotide chain with a modification at the 5' end.
  • the chemical group at the 5' end is tightly combined with the azide group of the coupling reagent through a click chemistry reaction, and finally the probe with a poly T tail is successfully bound to the surface of the glass sheet.
  • Example 1 Development of a fluorescent chip process based on a glass sheet as a carrier
  • This example mainly demonstrates the development of the process flow and the principle verification, and performs probe quality testing.
  • the steps are as follows:
  • step 2 Use a pipette to suck out the reagents in step 2), add coupling reagents to the six areas (B1, B2, C1, C2, D1, D2), add SMCC to B1, C1, and D1, and add N-hydroxysuccinimide (NHS) active ester to B2, C2, and D2, and react for 30 minutes. No reagents are added to A1 and A2;
  • polyA-cy5 solution (1uM polyA-cy5 primer dissolved in 5xSSC solution) to the eight regions A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, and D2, and react for 20 minutes. If the probe is successfully planted, polyA-cy5 will bind to the poly T on the probe and emit fluorescence.
  • the principle diagram is shown in Figure 3.
  • Example 2 Application of glass slide-based fluorescent chip to mouse brain tissue
  • This example mainly applies the fluorescent chip in Example 1 to rat brain tissue.
  • the reagents used in the experiments in this example are all "STOmics Fluorescent Reagent Kit-F1" kit (commercially available).
  • RT Remove the permeabilization reagent on the chip surface, add RT MIX, and react in a 42°C incubator for 3h;
  • Example 3 Application of glass slide-based fluorescent chip to mouse spleen and heart
  • This example mainly applies the FC chip with glass slide as carrier to the spleen and heart of mice.
  • the reagents used in the experiment in this example are all "STOmics Fluorescence Reagent Kit-F1" kit (commercially available). The experimental process is as follows:
  • Chip preparation The entire glass slide was first soaked in isopropylamine reagent for 10 min, then soaked in imidoester reagent for 30 min, and then soaked in probe solution for 3 h;
  • the chip in the present invention has high flexibility and clear and intuitive data results.

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Abstract

本发明公开一种基于玻璃片的芯片基片制备方法，包括以下步骤：使玻璃片表面携带氨基；使带有叠氮基团的偶联试剂与玻璃片表面的氨基反应，形成酰胺键。本发明还公开了一种芯片制备方法，在芯片基片制备方法的基础上，包括步骤：使5'端修饰的探针与所述偶联试剂的叠氮基团反应，将探针结合在玻璃片表面。本发明使用玻璃片替代硅片，降低了芯片原材料的成本，同时保证芯片的探针数量和质量，并且提升了芯片使用的稳定性。

Description

基于玻璃片的芯片基片制备方法 技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于玻璃片的芯片基片制备方法。
背景技术
细胞和其在组织样本中的相对位置之间的关系对于理解疾病病理学是至关重要的。单细胞转录组测序技术虽然解决了细胞异质性的问题，使得可以找到疾病中起关键作用的细胞，但无法还原到具体的空间位置，导致对细胞功能的探究还不是特别精确。
近年来空间转录组技术的研究逐渐受到广大研究学者的青睐，其不仅可以提供研究对象的转录组等数据信息，同时还能定位其在组织中的空间位置，这对于癌症发病机制、神经科学、发育生物学等众多领域的研究都有重要意义。空间转录组学是指从一个完整的组织样本中产生全部的转录组数据，从而能够定位和区分功能基因在特定组织区域内的活跃表达，为研究和诊断提供宝贵信息。作为一项突破性技术，空间转录组技术允许科学家检测组织样本中的所有基因活动，并绘制活动发生的位置。该技术已经带来了许多新的发现，将有助于科学家更好地理解疾病和生物学过程。
目前华大基因时空组学技术Stereo-seq有两种产品：STOmics基因表达试剂套装-S1(Stereo Chip，即时空表达芯片，后续简称SC芯片)和STOmics荧光试剂套装-F1(Fluorescent Chip，即时空荧光芯片，后续简称FC芯片)。FC芯片的原材料为华大自主研发的硅材质的微阵列芯片，阵列分辨率可达500纳米，极少数光刻机可实现如此高的精度，因此硅片自身成本很高，占总物料成本的82.4％，但FC芯片售价较低，因此FC芯片的利润空间低。在使用SC芯片进行组织转录本等捕获之前，需要使用FC芯片进行组织透化条件摸索。利用FC芯片进行组织透化时间测试时，一般使用4张F1芯片做时间梯度测试，出现过FC芯片上摸索的透化时间结果和SC芯片不一致的情况，其原因之一可能是4张F1芯片之间的探针差异。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于玻璃片的时空荧光芯片制备方法，以降低芯片原材料的成本，同时保证芯片的探针数量和质量，并且提升芯片使用的稳定性。
在第一方面，本发明提供了一种基于玻璃片的芯片基片制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)使玻璃片表面携带氨基；
2)使带有叠氮基团的偶联试剂与玻璃片表面的氨基反应，形成酰胺键。
在第二方面，本发明提供了利用第一方面所述的方法制备的芯片基片，所述芯片基片包括玻璃片，所述玻璃片表面携带氨基，带有叠氮基团的偶联试剂与所述氨基形成酰胺键。
在第三方面，本发明提供了一种芯片制备方法，所述方法在第一方面所述的方法步骤的基础上还包括：
3)使5'端修饰的探针与所述偶联试剂的叠氮基团反应，将探针结合在玻璃片表面。
在第四方面，本发明提供了利用第三方面所述的方法制备的芯片，所述芯片包括玻璃片，所述玻璃片表面携带氨基，带有叠氮基团的偶联试剂与所述氨基形成酰胺键，5'端修饰的探针与所述叠氮基团反应，将探针结合在玻璃片表面。
采用上述方案，本发明的有益效果是：
1)降低芯片原材料成本：本发明使用常见廉价易得的玻璃片替代硅片以降低芯片原材料成本，市面上常见的7.5cm×2.5cm的载玻片50pcs价格为30元，芯片原材料成本降低至现有硅片的1/1000；
2)降低试剂成本：本发明以浸泡式反应替代流道式反应，可实现反应试剂的重复利用，因此可进一步降低试剂成本；
3)提高结果稳定性：载玻片FC芯片可实现在同一载玻片上完成同一组织的不同透化时间梯度，稳定性更好；
4)灵活度更高：本发明可以实现在载玻片上测试多种组织，同时贴片位置可自由设计，因此组织大小及数量灵活多变。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式中的附图作简单地介绍。
图1为本发明中玻璃片表面偶联的探针3'端的poly T结构。
图2为本发明实施例1中使用载玻片制备芯片的流程示意图。
图3为本发明实施例1中探针检测(poly T与polyA-cy5结合)示意图。
图4为本发明实施例2中荧光显微镜拍照结果。
图5为本发明实施例3中透化过程示意图。
图6为本发明实施例3中荧光显微镜拍照结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在本文中，术语“玻璃片”是指具有长度、宽度和厚度的刚性或柔性玻璃材料。
在本文中，术语“探针”是指一段带有检测标记、且顺序已知的、与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。在基因芯片的表面固定序列已知的靶核苷酸的探针，通过与核酸探针杂交进行核酸序列测定。
在第一方面，本发明提供了一种基于玻璃片的芯片基片制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)使玻璃片表面携带氨基；
2)使带有叠氮基团的偶联试剂与玻璃片表面的氨基反应，形成酰胺键。
在一个实施方案中，在步骤1)中，将玻璃片直接浸泡在带有氨基的试剂中。
其中，所述带有氨基的试剂选自：异丙胺、乙二胺、苯胺、赖氨酸、多聚赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和色氨酸；所述偶联试剂选自：N-羟基琥珀酰亚胺活性酯、酰亚胺酯、氟苯基酯、STP ester、马来酰亚胺和SMCC。
在第二方面，本发明提供了利用第一方面所述的方法制备的芯片基片，所述芯片基片包括玻璃片，所述玻璃片表面携带氨基，带有叠氮基团的偶联试剂与所述氨基形成酰胺键。
在第三方面，本发明提供了一种芯片制备方法，所述方法在第一方面所述的方法步骤的基础上还包括：
3)使5'端修饰的探针与所述偶联试剂的叠氮基团反应，将探针结合在玻璃片表面。其中，所述探针的5'端修饰选自：DBCO二苯并环辛炔和巯基。
在一个实施方案中，将玻璃片浸泡在探针溶液中，所述探针溶液含有5'端修饰的寡核苷酸链。
在一个实施方案中，所述探针的3'端为多聚T结构。
在第四方面，本发明提供了利用第三方面所述的方法制备的芯片，所述芯片包括玻璃 片，所述玻璃片表面携带氨基，带有叠氮基团的偶联试剂与所述氨基形成酰胺键，5'端修饰的探针与所述叠氮基团反应，将探针结合在玻璃片表面。
所述玻璃片是指具有长度、宽度和厚度的刚性或柔性玻璃材料，可以是日常生活中常见的玻璃片。在一个实施方案中，所述玻璃片是载玻片。
在本发明中，带有氨基的试剂，如多聚赖氨酸，可以通过其多聚阳离子与玻璃上的阴离子相互作用而产生较强的黏合力，多聚赖氨酸常见的分子量有70,000-150,000、150,000-300,000和>300,000，分子量越大，黏附力越强，多聚赖氨酸粘附在玻璃片上的同时，表面的氨基也成功结合在玻璃片上。
在本发明中，偶联试剂是重要的“桥梁”，用于将步骤3)中的探针和步骤1)中的氨基紧密结合。偶联试剂中酯活化的交联剂和标记化合物在生理至弱碱性条件下(即pH值为7.2-9)与玻璃片表面的氨基反应，形成稳定的酰胺键。因此偶联试剂也成功结合在玻璃片上，同时也暴露出偶联试剂上的叠氮基团。
在本发明中，探针溶液含有5'端带有修饰的寡核苷酸链，5'端的化学基团与偶联试剂的叠氮基团通过点击化学反应紧密结合，最终使带有poly T尾的探针成功结合在玻璃片表面。
实施例
实施例1：基于玻璃片为载体的荧光芯片工艺流程开发
本实施例主要是展示工艺流程的开发及原理性验证，并进行探针质量检测。步骤如下：
1)使用工装卡槽，对一片载玻片进行分区，分区编号如图2所示，主要目的是设置非探针区域(非反应区域)，以证明反应区探针连接成功；
2)向B1、B2、C1、C2、D1、D2六个区域滴加带有氨基的试剂，B1和B2滴加色氨酸，C1和C2滴加精氨酸，D1和D2滴加多聚赖氨酸，室温反应10min。A1和A2滴加分子级水，作为空白对照；
3)使用枪头吸出步骤2)的试剂，在六个区域(B1、B2、C1、C2、D1、D2)中滴加偶联试剂，B1、C1、D1中滴加SMCC，B2、C2、D2中滴加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，反应30min。A1和A2不加试剂；
4)使用枪头吸出步骤3)的试剂，在六个区域(B1、B2、C1、C2、D1、D2)中滴加探针溶液，B1、C1、D1中滴加5'端DBCO二苯并环辛炔修饰的探针溶液，B2、C2、 D2中滴加5'端巯基修饰的探针溶液，反应3h。A1和A2不加试剂；
5)至此，B1、B2、C1、C2、D1、D2六个区域已经偶联上3'端带有poly T结构的寡核苷酸链探针；
6)A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2八个区域均滴加polyA-cy5溶液(1uM的polyA-cy5引物溶解于5xSSC溶液中)，反应20min，如果成功种上探针，polyA-cy5会和探针上的poly T结合而发荧光，原理示意图如图3所示；
7)将载玻片在荧光显微镜下拍照，结果显示阴性对照A1和A2明显暗于其他区域，B1、B2、C1、C2、D1、D2六个活性区域明显具有较强发光，信号值均在2.5w-3.5w之间，且每个活性区域与非活性区域的边缘界限清晰，说明探针偶联成功，且效果较好。
实施例2：基于玻璃片为载体的荧光芯片应用于鼠脑组织
本实施例主要是将实施例1中的荧光芯片应用于鼠脑组织。本实施例中的实验所用的试剂均为“STOmics荧光试剂套装-F1”试剂盒(市购)。
实验流程如下：
1)取出组织。OCT包埋的新鲜鼠脑组织从-80℃冰箱取出放在冷冻切片机内平衡；
2)切片机调整。冷冻切片机箱体预冷(-20℃)和样本头预冷(-10℃至-15℃，根据实际操作过程调整)；
3)切片及贴片。对组织块进行修理，切去组织块周围多余的OCT包埋剂；使用OCT将组织块固定到样品托上；使用切片机将组织切为10μm厚度后，贴到玻璃片FC芯片上，分别贴在B1、C1、D1区域；
4)烤片。贴片结束后，快速于37℃烤片3min；
5)固定。上一步烤干的芯片放于-20℃预冷的甲醇溶液中固定40min；
6)透化。将固定好的组织芯片从甲醇中取出，无尘纸吸干芯片背面和周围的甲醇，加入透化试剂，置于37℃10min；
7)RT。吸掉芯片表面的透化试剂，滴加RT MIX，42℃温箱内反应3h；
8)组织移除。吸掉芯片表面的RT MIX，组织移除试剂，37℃温箱内反应1h；
9)荧光显微镜拍照。加SRE后荧光拍照，显微镜选择10倍镜或根据组织大小自行选择，CY3或TRITC通道，曝光时间约1s左右。
结果如图4所示，3个区域的鼠脑组织荧光明显、形态清晰，说明探针捕获效果较好。
实施例3：基于玻璃片为载体的荧光芯片应用于鼠脾脏和心脏
本实施例主要是将玻璃片为载体的FC芯片应用于小鼠的脾脏和心脏。本实施例中的实验所用的试剂均为“STOmics荧光试剂套装-F1”试剂盒(市购)。实验流程如下：
1)芯片制备。将整张载玻片先浸泡在异丙胺试剂中10min，再浸泡在酰亚胺酯试剂中30min，再浸泡在探针溶液中3h；
2)取出组织。OCT包埋的新鲜鼠脾脏和心脏组织从-80℃冰箱取出放在冷冻切片机内平衡；
3)切片机调整。冷冻切片机箱体预冷(-20℃)和样本头预冷(-10℃至-15℃，根据实际操作过程调整)；
4)切片及贴片。对组织块进行修理，切去组织块周围多余的OCT包埋剂；使用OCT将组织块固定到样品托上；使用切片机将组织切为10μm厚度后，贴到玻璃片FC芯片上；
5)烤片。贴片结束后，快速于37℃烤片3min；
6)固定。上一步烤干的芯片放于-20℃预冷的甲醇溶液中固定40min；
7)透化。将固定好的组织芯片从甲醇中取出，无尘纸吸干芯片背面和周围的甲醇，加入透化试剂，脾脏透化时间分别为3min、6min、12min、16min；心脏透化时间分别为3min、6min、12min、16min(图5)；
8)RT。吸掉芯片表面的透化试剂，滴加RT MIX，42℃温箱内反应3h；
9)组织移除。吸掉芯片表面的RT MIX，组织移除试剂，37℃温箱内反应1h；
10)荧光显微镜拍照。加SRE后荧光拍照，显微镜选择10倍镜或根据组织大小自行选择，CY3或TRITC通道，曝光时间约1s左右。
结果如图6所示，从脾脏结果(左边4个)来看，12min透化时间最好，不同透化时间之间的效果差异明显；从心脏结果(右边4个)来看，6min透化时间最好，不同透化时间之间的效果差异明显。
本实施例中，一张载玻片FC芯片上贴有2种、8个组织，与其他芯片相比，本发明中的芯片灵活性高，数据结果清晰直观。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范 围。

Claims (10)

  1. 一种基于玻璃片的芯片基片制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
    1)使玻璃片表面携带氨基；
    2)使带有叠氮基团的偶联试剂与玻璃片表面的氨基反应，形成酰胺键。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，将玻璃片直接浸泡在带有氨基的试剂中。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述带有氨基的试剂选自：异丙胺、乙二胺、苯胺、赖氨酸、多聚赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和色氨酸。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述偶联试剂选自：N-羟基琥珀酰亚胺活性酯、酰亚胺酯、氟苯基酯、STP ester、马来酰亚胺和SMCC。
  5. 利用权利要求1-4中任一项所述的方法制备的芯片基片，其特征在于，所述芯片基片包括玻璃片，所述玻璃片表面携带氨基，带有叠氮基团的偶联试剂与所述氨基形成酰胺键。
  6. 一种芯片制备方法，其特征在于，所述方法在权利要求1-4中任一项所述的方法步骤的基础上还包括：
    3)使5'端修饰的探针与所述偶联试剂的叠氮基团反应，将探针结合在玻璃片表面。
  7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将玻璃片浸泡在探针溶液中，所述探针溶液含有5'端修饰的寡核苷酸链。
  8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述探针的5'端修饰选自：DBCO二苯并环辛炔和巯基。
  9. 根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述探针的3'端为多聚T结构。
  10. 利用权利要求6-9中任一项所述的方法制备的芯片，其特征在于，所述芯片包括玻璃片，所述玻璃片表面携带氨基，带有叠氮基团的偶联试剂与所述氨基形成酰胺键，5'端修饰的探针与所述叠氮基团反应，将探针结合在玻璃片表面。
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