WO2024256742A1 - Antídoto - Google Patents

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WO2024256742A1
WO2024256742A1 PCT/ES2024/070374 ES2024070374W WO2024256742A1 WO 2024256742 A1 WO2024256742 A1 WO 2024256742A1 ES 2024070374 W ES2024070374 W ES 2024070374W WO 2024256742 A1 WO2024256742 A1 WO 2024256742A1
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WO
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seq
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antidote
antithrombin
heparin
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PCT/ES2024/070374
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English (en)
French (fr)
Inventor
Irene MARTÍNEZ MARTÍNEZ
Ginés LUENGO GIL
Salvador ESPÍN GARCÍA
Isabel ZUAZU JAUSORO
Horacio CANO GRACIA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fundacion para la Formacion e Investigacion Sanitarias de la Region de Murcia
Original Assignee
Fundacion para la Formacion e Investigacion Sanitarias de la Region de Murcia
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8128—Antithrombin III

Definitions

  • the present invention falls within the pharmaceutical sector and refers to an antidote against heparins and their medical use in the treatment of hemorrhagic risk.
  • Heparin is a highly sulfated glycosaminoglycan. It has the highest density of negative charges known in a biological molecule. It is an anticoagulant drug that acts by preventing the formation and spread of clots within the blood, but is not capable of breaking up or lysing the clot already formed. It is used for the treatment of deep vein thrombosis and pulmonary embolism, acute coronary syndrome, atrial fibrillation, cardiopulmonary bypass, extracorporeal circulation, hemodialysis and central or peripheral venous catheters. The main complication of heparin treatment is bleeding and thrombocytopenia, which involves a decrease in the number of circulating platelets in the bloodstream below normal levels.
  • heparin acts as a cofactor for antithrombin.
  • Unfractionated heparin is the only physiological heparin. It is isolated from mast cells present in the intestinal mucosa of pigs or bovines. Low molecular weight heparins are obtained by chemical or enzymatic fragmentation from unfractionated heparins. These heparins also have different actions. Unfractionated heparins have mainly an anti-Flla action, while low molecular weight heparins (LMWH) and pentasaccharide have mainly an anti-FXa action.
  • LMWH low molecular weight heparins
  • heparins in use are the following:
  • DVT deep vein thrombosis
  • VTE venous thromboembolism
  • Another of the hepatic antidotes described in the literature is based on antithrombin, since it has a hepatic binding domain.
  • This recombinant antithrombin lacked one of its 4 glycans, specifically the N135 glycan, which favored a greater affinity for hepatic.
  • the incorporation of a proline in position 394 decreased the anticoagulant capacity of antithrombin by 3 orders of magnitude.
  • the antidote based on a recombinant antithrombin of the present invention is much better than that described in EP2175877B1 since the mutations it presents with respect to the antithrombin sequence make it expressed better and have greater affinity for heparin.
  • the present invention relates to an antidote based on a recombinant antithrombin without the capacity to inhibit the target proteases of coagulation, but with greater affinity for heparin than the wild-type protein.
  • the antidote of the present invention is capable of reversing the anticoagulant effect of low molecular weight heparins.
  • an antidote and “recombinant antithrombin” are synonyms and are used interchangeably.
  • an antidote could also be a molecule capable of binding to heparin and preventing it from acting without needing to be a recombinant antithrombin.
  • antithrombin refers to an antithrombin, preferably a human antithrombin, comprising at least one substitution, insertion and/or deletion of one or more amino acids within its amino acid sequence.
  • low molecular weight heparins refers to heparin with a weight in the range of about 4000 to 6500 Daltons.
  • nucleotide may refer to either ribonucleotide or deoxyribonucleotide, unless otherwise stated.
  • the alpha glycoform with 4 N-glycans, is the majority (90-95%), while the beta glycoform, which lacks N-glycosylation at position 135, is the minority (5-10%).
  • the generation of the beta glycoform is explained by the presence of a serine residue at position 137 (in the sequence of mature antithrombin, once the signal peptide has been eliminated) and responsible for the N-glycosylation of asparagine (N) 135.
  • the presence of serine instead of threonine at position 137 reduces the efficiency of the first process of incorporation of the carbohydrate nucleus into the protein skeleton.
  • the inventors have discovered that by introducing the mutations 1039TG>AC to give rise to the change of amino acid M to N and 1044GTG>ACA to give rise to the change of amino acid V to T.
  • These mutations produce the addition of a new N-glycan, this glycan is very far from position 135 whose relevance has been explained in the previous paragraph, therefore the technical effect of these mutations is that the secretion of the protein is increased when it is synthesized in vitro, since the glycosylation sites are necessary for the secretion of antithrombin when it is expressed in eukaryotic cells and additionally it allows an affinity for heparin of more than 2.5 times higher than that of Beta-antithrombin since the glycosylation chains are involved in the antithrombin-glycosaminoglycans binding similar to cellular heparin.
  • the state of the art only discloses a mutation in the nucleotide sequence corresponding to amino acid 137 to eliminate the N-glycan at position 135 that differentiates Alpha-antithrombin from Beta-antithrombin, however, the introduction of the 2 mutations indicated above allows the introduction of a new N-glycan group in the sequence that allows the antidote of the invention to be secreted better and to have greater affinity for heparin.
  • the present invention relates to an antidote comprising
  • N is any combination of three nucleotides that does not translate into a serine, threonine, or cysteine
  • SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of the gene encoding the SERPINC1 protein in Homo sapiens. This sequence is the region between nucleotide 69 and 1463, CDS (Coding Sequence) of Genebank, NM_000488.4 (1552 bp mRNA linear PRI 10-APR-2023)
  • mutants encompasses at least one substitution, insertion and/or deletion of one or more nucleotides that results in a change in the amino acid when the sequence is translated.
  • the recombinant antithrombin encoded by a variant of SEQ ID NO: 2 may comprise one or more mutations as indicated in the preceding paragraph.
  • the technical effect of the 504 TCC>NNN variation is that N-glycosylation of the asparagine residue at position 135 is avoided, which means that antithrombin is in beta conformation instead of alpha glycoform.
  • the variation 504 TCC> NNN is 504 T>G, this variation results in the change of amino acid S to A.
  • the advantage of this deletion is that the antidote of the invention binds with greater affinity to heparin, thus achieving a substantially reduced capacity to inhibit factor Xa (FXa) and factor II (FII).
  • the antidote of the invention comprises a recombinant antithrombin encoded in SEQ ID NO: 3 that has the following mutations with respect to SEQ ID NO: 1
  • the recombinant antithrombin encoded by a variant of SEQ ID NO: 3 may comprise one or more mutations as indicated above.
  • SEQ ID NO:1 The amino acid sequence encoding SEQ ID NO:1 is found in SEQ ID NO:4. This is the native sequence of human antithrombin disclosed in GenPept NP_000479; 464 aa; linear PRI 10-APR-2023
  • the first 32 amino acids of SEQ ID NO: 4 correspond to a signal peptide that is physiologically expressed, but is processed inside the cell so that the protein that is secreted does not contain that peptide because it is proteolyzed, in SEQ ID NO: 5 the same sequence is disclosed but without the signal peptide.
  • amino acid sequence translated from SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: 6, and the amino acid variations are S169A/M347N/V349T/AR425 with respect to SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 7 is identical to SEQ ID NO: 6, but without the first 32 amino acids corresponding to the signal peptide. Therefore, the mutations S169A/M347N/V349T/AR425 of SEQ ID NO: 6 are equivalent to S137A/M315N/V317T/AR393 of SEQ ID NO 7.
  • the antidote of the invention comprises a recombinant antithrombin encoded in SEQ ID NO: 7 that has the following mutations Regarding SEQ ID NO:5
  • the antidote that is purified once expressed does not have the signal peptide, since it is lost when it moves out of the cell, this would be the functional form of the peptide.
  • mutants encompasses at least one substitution, insertion and/or deletion of one or more amino acids within the sequence.
  • the recombinant antithrombin encoded by a variant of SEQ ID NO: 7 may comprise one or more mutations as indicated in the previous paragraph.
  • the antidote of the invention comprises a recombinant antithrombin encoded in SEQ ID NO: 6 that has the following mutations with respect to SEQ ID NO: 4
  • the recombinant antithrombin encoded by a variant of SEQ ID NO: 6 may comprise one or more mutations as indicated above.
  • the recombinant antithrombin of the invention has a substantially reduced anticoagulant activity relative to the anticoagulant activity of native antithrombin, or having substantially no anticoagulant activity, said recombinant antithrombin further having: a substantially reduced, or substantially lost, thrombin inhibitory activity, or a reduced or substantially lost factor Xa (FXa) inhibitory activity, or a reduced or substantially lost factor Ha (Fila) inhibitory activity, or a substantially reduced, or substantially lost, thrombin inhibitory activity and factor Xa and factor Ha inhibitory activity.
  • FXa reduced or substantially lost factor Xa
  • Fila reduced or substantially lost factor Ha inhibitory activity
  • the thrombin or factor Xa inhibitory activity is "substantially reduced” means that the activity of antithrombin to inhibit thrombin or factor Xa is reduced compared to said activity in wild-type antithrombin.
  • the thrombin or factor Xa inhibitory activity is considered reduced when said activity represents from about 90%, or 80% or 70% or 60% or 50% or 40% or 30% to about 5% of the thrombin or factor Xa inhibitory activity of wild-type antithrombin.
  • the anti-Xa and anti-IIa inhibitory activities can be measured with any system known in the state of the art.
  • Substantially lost thrombin or factor Xa inhibitory activity means that the activity of antithrombin to inhibit thrombin or factor Xa is absent compared to such activity in wild-type antithrombin.
  • treatment refers to the medical treatment of a subject with the intent to cure, ameliorate, stabilize, or prevent a disease, pathological condition, or disorder.
  • This term includes active treatment, i.e., treatment specifically directed at the amelioration of a disease, pathological condition, or disorder, and also includes causal treatment, i.e., treatment directed at the elimination of the cause of the associated disease, pathological condition, or disorder.
  • this term includes palliative treatment, i.e., treatment designed to alleviate symptoms rather than cure the disease, pathological condition, or disorder; preventative treatment, i.e., treatment directed at partially or completely minimizing or inhibiting the development of the associated disease, pathological condition, or disorder; and supportive treatment, i.e., treatment employed to supplement other specific therapy directed at the amelioration of the associated disease, pathological condition, or disorder.
  • palliative treatment i.e., treatment designed to alleviate symptoms rather than cure the disease, pathological condition, or disorder
  • preventative treatment i.e., treatment directed at partially or completely minimizing or inhibiting the development of the associated disease, pathological condition, or disorder
  • supportive treatment i.e., treatment employed to supplement other specific therapy directed at the amelioration of the associated disease, pathological condition, or disorder.
  • treatment although intended to cure, ameliorate, stabilize, or prevent a disease, pathological condition, or disorder, need not actually result in cure, amelioration, stabilization, or prevention.
  • the effects of treatment may be measured
  • Such measurements and assessments may be made in qualitative and/or quantitative terms.
  • the characteristics or features of a disease, pathological condition, or disorder and/or the symptoms of a disease, pathological condition, or disorder may be reduced to any effect or any amount.
  • treatment and “treating” refer to the medical management of a subject with the intent to cure, ameliorate, or stabilize such bleeding risk.
  • the term “prevent” refers to the administration of the recombinant antithrombin of the invention prior to the onset of clinical symptoms of a disease or condition in order to prevent a physical manifestation of the aberrations associated with the disease or condition.
  • the term “prevent” refers to the administration of the recombinant antithrombin of the invention prior to the onset of clinical symptoms of hemorrhagic risk in order to prevent bleeding in the subject.
  • the term "subject” includes, but is not limited to, Animals.
  • the subject may be a vertebrate, more particularly a mammal (e.g., a human, horse, pig, rabbit, dog, sheep, goat, non-human primate, cow, cat, guinea pig, or rodent), fish, bird, or reptile or amphibian.
  • the term does not denote a particular age or sex. Thus, adult and newborn subjects, as well as fetuses, whether male or female, are covered by the definition of subject.
  • a patient is a subject afflicted with a disease or disorder.
  • patient includes human and veterinary subjects.
  • the antidote for use in treating hemorrhagic risk may be administered to a subject comprising a human or an animal, including but not limited to a mouse, dog, cat, horse, bovine or ovine, and the like.
  • the "variant" of any of the sequences SEQ_ID NO: 2 or SEQJD NO: 3 encoding the recombinant antithrombin of the invention could have the codon sequence optimized for expression in any host cell (a particular organism or cell type, for example, a human cell line,) in at least 10% of the codons, preferably at least 20% of the codons, more preferably at least 30% of the codons, even more preferably at least 40% of the codons, even more preferably at least 50% of the codons, even more preferably at least 60% of the codons, even more preferably at least 70% of the codons, even more preferably at least 80% of the codons, and even more preferably at least 90% of the codons. Codon optimization does not comprise a change in the amino acid sequence.
  • the hemorrhagic risk is produced by the administration of heparin to the subject, said heparin may be one or more of the following, low molecular weight heparin, unfractionated heparin and pentasaccharide, preferably low molecular weight heparins (LMWH) and/or unfractionated heparin (UFH), since as demonstrated later in the embodiment examples, the antidote of the invention comprises a reduced or substantially lost inhibitory activity of factors Ha and Xa.
  • LMWH low molecular weight heparins
  • UH unfractionated heparin
  • heparin has been administered, previously, simultaneously or to the recombinant antithrombin of the invention.
  • the antidote of the invention be administered within 24 hours after the subject has been given LMWH or UFH.
  • a doctor would know identify the optimal period of time in which the antidote of the invention should be administered to achieve the best anti-hemorrhagic effect, given the risk of hemorrhage.
  • Said specialist would monitor the condition of the patient to whom LMWH or UFH has been administered, and if there is bleeding or symptoms of hemorrhage, he would administer the antidote of the invention to the subject.
  • the hemorrhagic risk is associated with one or more of the following processes, for which treatment with heparin is indicated: infections, inflammations or hypoxic injuries, in particular sepsis and ischemia/reperfusion related to stroke, ischemia/reperfusion related to surgery and ischemia/reperfusion related to organ transplantation, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, acute coronary syndrome, cardiopulmonary bypass, extracorporeal circulation, hemodialysis, central or peripheral venous catheters, venous thromboembolism (VTE) in general surgery when there is renal failure or obesity, treatment of DVT of the lower extremities with or without pulmonary embolism, hip fracture surgery, renal failure, pulmonary thromboembolism and atrial fibrillation.
  • infections, inflammations or hypoxic injuries in particular sepsis and ischemia/reperfusion related to stroke, ischemia/reperfusion related to surgery and ischemia/reperfusion related to organ transplantation, deep vein thrombosis, pulmonary embo
  • hemorrhagic risk is associated with pulmonary thromboembolism or atrial fibrillation.
  • the bleeding risk also includes thrombocytopenia.
  • the recombinant antithrombin of the invention may be administered to a subject suffering from, or at risk of suffering from, a hemorrhagic risk with an effective amount of said recombinant antithrombin having reduced or substantially lost factor lia and Xa inhibitory activity.
  • the amount may be an amount from a minimum of about 0.1 mg of the recombinant antithrombin per kg of the subject, about 0.2 mg/kg, or about 0.5 mg/kg, to a maximum of about 100 mg/kg, about 200 mg/kg, or up to about 500 mg/kg.
  • the amount of recombinant antithrombin exhibiting reduced or substantially lost factor lia and Xa inhibitory activity can be from about 0.1 mg/kg to about 100 mg/kg, from about 0.2 mg/kg to about 200 mg/kg, from about 0.5 mg/kg to about 500 mg/kg, from about 0.1 mg/kg to about 10 mg/kg, from about 0.1 mg/kg to about 20 mg/kg, from about 0.1 mg/kg to about 50 mg/kg, from about 0.5 mg/kg to about 20 mg/kg, from about 0.5 mg/kg to about 50 mg/kg, from about 0.5 mg/kg to about 100 mg/kg, from about 0.5 to about 200 mg/kg, from about 0.5 mg/Kg to about 500 mg/Kg, from about 15 mg/Kg about 25 mg/kg, about 15 mg/kg to about 50 mg/kg, about 18 mg/kg to about 30 mg/kg, about 18 mg/kg to about 50 mg/kg.
  • the recombinant antithrombin of the present invention is for occasional use, when there is a risk of bleeding and/or heparin has been administered to a subject, not for sustained use over time unless the subject is being administered one or more doses of heparin continuously over time.
  • the antidote of the invention is administered to a subject at a dose of about 20 IU/kg to about 600 IU/kg, preferably about 40 IU/kg to about 300 IU/kg.
  • the antidote of the invention can be administered to humans and other animals intravenously, orally, rectally, parenterally, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, topically (as powders, ointments or drops), buccally, as an oral or nasal spray, or the like, preferably intravenously.
  • Another additional object of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the antidote of the invention and one or more additional active compounds, and/or one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants or vehicles.
  • Additional active compounds are all those commonly used in the clinic to prevent the risk of hemorrhage.
  • pharmaceutically acceptable is meant a material that is not biologically or otherwise undesirable, that is, the material can be administered to a subject together with the selected compound without causing any undesirable biological effects or interacting in a deleterious manner with any of the other components of the pharmaceutical composition in which it is contained.
  • a or an may refer to one or a plurality of the modifying elements (e.g., "a reagent” may mean one or more reagents), unless it is contextually clear that one or more of the elements is being described.
  • the term “about” as used herein refers to a value within 10% of the underlying parameter (i.e., plus or minus 10%; e.g., a weight of "about 100 grams” may include a weight between 90 grams and 110 grams).
  • FIG. 1 Western blot showing the increased secretion of recombinant antithrombin (antidote) of the invention compared to antithrombin alpha (alpha-AT) and antithrombin beta (beta-AT).
  • R-SDS means that the electrophoresis is performed with sodium dodecyl sulphate (SDS) under reducing conditions (with beta-mercaptoethanol or dithiothreitol).
  • Figure 3 Graphs showing the activity of the antidote of the invention (recombinant antithrombin) on Fila and FXa.
  • PBS is the control and is Phosphate buffered saline.
  • FIG. 4 Graph showing FXa activity in mice treated with PBS (control), heparin (HPBM), antidote of the invention (recombinant antithrombin) and the antidote of the invention (recombinant antithrombin) together with heparin (HPBM).
  • Vmax means maximum velocity.
  • Site-directed mutagenesis was performed on this plasmid using the primers indicated in Table 1. The mutations were performed sequentially in the order indicated in the table from top to bottom. A person skilled in the art would know how to perform such mutations using the general knowledge common in the area and standard laboratory protocols.
  • HEK-EBNA eukaryotic cells were transfected for the expression of the recombinant protein.
  • the cells were cultured to 60% confluence at 37°C, 5% CO2, in DMEM with GlutaMAX-l medium (Invitrogen), supplemented with 5% FBS (Sigma-Aldrich). 200 g/mL of plasmid was transfected for 30 minutes in OptiMEM with LX (Invitrogen), as suggested by the manufacturer.
  • the cells were washed with PBS and changed to CD-CHO medium (Invitrogen) supplemented with 4 mM L-glutamine and 0.25 mg/mL Geneticin (Invitrogen).
  • the cells were cultured at 37°C for 10 days.
  • the medium was collected and replaced with fresh medium every 2 days.
  • the protein was purified by heparin affinity chromatography on HiTrap Heparin columns (GE Healthcare), using an ⁇ KTA Purifier (GE Healthcare) in 100 mM Tris-HCl and 10 mM citric acid, in a gradient of 0.15 to 2 M NaCl. Finally, the protein was eluted and desalted on 5 mL HiTrap Desalting columns (GE Healthcare) and stored at 70°C.
  • the protein was obtained with high efficiency, due to its high secretion rate into the medium and its high affinity for heparin. With a single purification step, a homogeneity of over 90% was obtained. This means that the protein is at least 90% pure in the supernatant and that if there are contaminating proteins, they do not exceed 10% of the total. For a single purification step, this is a very high efficiency, which saves time and resources for the production of the antidote of the invention.
  • the antidote of the invention was purified from the culture medium harvests by heparin affinity chromatography on HiTrap Heparin columns (GE Healthcare), using an ⁇ KTA purifier (GE Healthcare) in 100 mMTr ⁇ s-HCI pH 7.4 and 10 mM citric acid, in a gradient of 0.15 to 3 M NaCl.
  • the antithrombin fractions were applied to a HiTrap Q column (GE Healthcare) in 50 mMThs-HCI pH 7.4, in a gradient of 0.15 to 2 M NaCl. Finally, the proteins were desalted on 5 ml HiTrap Desalting columns (GE Healthcare).
  • Polyacrylamide gel electrophoresis was performed at 8% under denaturing conditions. After separation, proteins were transferred by western blot onto a polyvinylidene difluoride membrane. Antithrombin was detected by immunostaining with a polyclonal antibody against human antithrombin made in rabbit (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain), followed by donkey anti-rabbit IgG conjugated with horseradish peroxidase (GE Healthcare, Barcelona, Spain), with detection using an ECL kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). The secretion rate at 24 hours after transfection relative to the wild type protein was evaluated by densitometry using the ImageJ program.
  • the antidote of the invention has the same electrophoretic mobility as the alpha form (since both have 4 N-glycans) and is present in the secreted medium more than the normal alpha and beta forms, specifically 2.7 times more.
  • Figure 2 shows the silver staining of the antidote of the invention on a polyacrylamide gel in which electrophoresis with SDS has been performed under reducing conditions, which shows the purity of the recombinant antithrombin (antidote) at different concentrations in micrograms.
  • the recombinant antithrombin of the invention (antidote) has a higher affinity for heparin than Beta-antithrombin, which means that it is capable of binding to heparin more efficiently than physiological antithrombin with a higher affinity for heparin.
  • none of the recombinant antithrombins described in EP2379101 B1 comprise the mutations of the present invention at positions 1039 and 1044 of the nucleotide chain that translate into the changes in the M315N and V317N amino acids, therefore, the recombinant antithrombin of the invention has a higher affinity for heparin than those described in EP2379101 B1, which translates into greater anticoagulant activity.
  • Anti-FXa and anti-FIla activities were assayed by incubating antithrombin with low molecular weight heparin (0.096 nM) or unfractionated heparin (0.03 nM) with FXa (2 pM) or Fila (2 pM), respectively.
  • Hydrolysis of chromogenic substrates S-2765 for FXa or S-2238 for Fila
  • Blood samples were obtained after administration of the drugs for a period of up to 24 hours.
  • the initial concentration of the antidote of the invention is 600 pg/mL, starting from said solution 0, 1, 5, 10, 25, or 50 pL of said solution were administered to 500 pL of serum sample.
  • Example 1 Patient anticoagulated with Enoxaparin (60 mg every 12 hours) for a pulmonary thromboembolism, Table 5:
  • Example 2 Patient anticoagulated with a type of low molecular weight heparin (Bemiparin) (7500 Ul/day) for atrial fibrillation, Table 6.
  • Bemiparin a type of low molecular weight heparin (7500 Ul/day) for atrial fibrillation
  • Example 3 Patient anticoagulated with Bemiparin (5000 lll/day) for atrial fibrillation Table 7.
  • Example 4 Patient anticoagulated with Bemiparin (5000 lll/day) for atrial fibrillation Table 8.
  • mice were C57BL/6J mice.
  • the animal experiments were approved by the Animal Experimentation Committee of the University of Murcia and were carried out in accordance with the European guidelines for animal experimentation. To do this, we grouped the mice into 4 groups. Each group contained 5 males and 5 females. Each mouse was first anesthetized with isoflurane administered by inhalation and received an injection of 100 mg/kg of benzyl alcohol. 100 l subcutaneously and 10 minutes later an injection of 100 pl into the retro-orbital sinus. In group 1, both injections contained PBS.
  • group 2 we injected subcutaneous low-molecular-weight heparin (Clexane) and PBS into the retro-orbital sinus.
  • group 3 we injected subcutaneous PBS and antidote into the retro-orbital sinus.
  • group 4 we injected subcutaneous low-molecular-weight heparin (Clexane) and antidote into the retro-orbital sinus.
  • Five minutes after the last injection blood was drawn from the vena cava with syringes containing sodium citrate and then euthanasia was performed.
  • Low-molecular-weight heparin (Clexane) was injected at a dose of 3 mg/kg and the antidote at a concentration of 20 mg/kg. Once the blood was extracted, the plasma was isolated by centrifugation at 2300g for 15 minutes and the anti-FXa activity was measured.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of the gene encoding the SERPINC1 protein in Homo sapiens. This sequence is the region between nucleotide 69 and 1463, CDS (Coding Sequence) of Genebank, NM_000488.4 (1552 bp mRNA linear PRI 10-APR-2023)
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence encoding the antidote or recombinant protein of the invention, including, with respect to SEQ ID NO: 1, the mutations 504TCC>NNN, 1039TG>AC and 1044GTG>ACA and the deletion of 1272CGT
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence encoding the antidote or recombinant protein of the invention, including, with respect to SEQ ID NO: 1, the mutations 504T>G, 1039TG>AC and 1044GTG>ACA and the deletion of 1272CGT
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of SERPINC1 , see also GenPept NP_000479; 464 aa; linear PRI 10-APR-2023
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of the recombinant antithrombin of the invention with all mutations with the signal peptide: S169A/M347N/V349T/AR425
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of the recombinant antithrombin of the invention with all mutations without the signal peptide S137A/M315N/V317T/AR393 SEQ ID NO: 8-15 primers used

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Abstract

La presente invención divulga una antitrombina recombinante para su uso en el tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto.

Description

ANTÍDOTO
Campo de la técnica
La presente invención se encuadra dentro del sector farmacéutico y se refiere a un antídoto contra heparinas y su uso médico en el tratamiento del riesgo hemorrágico.
Antecedentes
La heparina es un glicosamino glicano altamente sulfatado. Tiene la mayor densidad de cargas negativas conocida en una molécula biológica. Es un fármaco anticoagulante que actúa previniendo la formación y extensión del coágulo dentro de la sangre, pero no es capaz de romper o lisar el coágulo ya formado. Se utiliza para el tratamiento de la trombosis venosa profunda y el embolismo pulmonar, el síndrome coronario agudo, la fibrilación auricular, el bypass cardiopulmonar, la circulación extracorpórea, la hemodiálisis y los catéteres venosos centrales o periféricos. La principal complicación del tratamiento con heparina es la hemorragia y la trombocitopenia, que supone la disminución de la cantidad de plaquetas circulantes en el torrente sanguíneo por debajo de los niveles normales. El mecanismo de acción de la heparina se basa en la unión y activación de la antitrombina, principal inhibidor fisiológico de la cascada de la coagulación. Esta unión ocurre a través de interacciones electrostáticas que provocan un cambio conformacional en la antitrombina que, en consecuencia, inhibe de forma más eficiente a sus dianas Factor Xa de la coagulación (FXa) y Factor Ha de la coagulación o trombina (Fila) principalmente. De esta forma la heparina actúa como un cofactor de la antitrombina.
Existen distintos tipos de heparinas usadas en la clínica. La heparina no fraccionada es la única fisiológica. Se aísla de los mastocitos presentes en la mucosa intestinal porcina o bovina. Las heparinas de bajo peso molecular se obtienen por fragmentación química o enzimática a partir de las no fraccionadas. Estas heparinas también tienen distinta acción. Las heparinas no fraccionadas tienen principalmente una acción anti-Flla, mientras que las heparinas de bajo peso molecular (HPBM) y el pentasacárido tienen principalmente acción anti-FXa.
En la clínica, las heparinas que se encuentran en uso son las siguientes:
Heparina sódica de 1000 U/ml y de 5000 U/ml (Unidad de actividad enzimática por mi) Heparinas de bajo peso molecular, Tabla 1 :
Tabla 1 : Heparinas de bajo peso molecular empeladas en la clínica
Figure imgf000003_0001
Ul: unidades internacionales
Se: subcutáneo
Las distintas heparinas también tienen distintas indicaciones:
- Heparina sódica: Cuando hay muy alto riesgo trombótico y hemorrágico. Ejemplo: prótesis valvulares. Tratamiento de trombosis venosa profunda (TVP) de extremidades inferiores con o sin embolismo pulmonar, sólo en fase aguda.
- Heparinas de bajo peso molecular: Profilaxis tromboembolismo venoso (TEV) en cirugía general, cuando hay insuficiencia renal u obesidad. Tratamiento TVP de extremidades inferiores con o sin embolismo pulmonar.
- Fondaparinux: Profilaxis TEV en cirugía de fractura de cadera y cuando hay insuficiencia renal.
Además, es necesario hacer un ajuste posológico en pacientes con insuficiencia renal, en personas de edad avanzada, en obesos y en embarazadas. Esto es importante ya que las heparinas son consideradas medicamentos de alto riesgo por el Instituto para el Uso Seguro del Medicamento (ISMP). Los «medicamentos de alto riesgo» son aquellos que cuando no se utilizan correctamente presentan una gran probabilidad de causar daños graves o incluso mortales a los pacientes. Sólo existe un antídoto para las hepañnas no fraccionadas, el sulfato de protamina, pero produce hipotensión y braquicardia. Para las hepañnas de bajo peso molecular no existe ningún método aprobado para su neutralización. En ficha técnica viene reflejado el uso de sulfato de protamina cuando el sangrado es grave. El sulfato de protamina solo va a neutralizar la fracción anti-lla de la HBPM y sólo es efectivo si hace menos de 8 horas de su administración. Por tanto, su efectividad es mínima. Hay que tener en cuenta que el exceso de dosis puede tener efectos anticoagulantes, por lo que es mejor no utilizarlo. Las dosis recomendadas en ficha técnica son: Sulfato de protamina: 1 mg por cada 100 Ul Anti-Xa de HBPM y si persiste el sangrado: 0.5 mg por cada 100 Ul Anti-Xa de HBPM.
En el caso del pentasacáñdo Fondapañnux tampoco existe ningún antídoto específico. Si existe sangrado grave, se puede utilizar complejo protrombínico.
Otro de los antídotos de hepañna que han sido descritos en la bibliografía se basa en la antitrombina, puesto que tiene un dominio de unión a hepañna. Esta antitrombina recombinante carecía de uno de sus 4 glicanos, concretamente del glicano N135, lo que favorecía una mayor afinidad por la hepañna. Adicionalmente, la incorporación de una prolina en posición 394 disminuía la capacidad anticoagulante de la antitrombina en 3 órdenes de magnitud. En experimentos con ratones, los autores demuestran que esta antitrombina administrada a una concentración 2.5 veces superior a la concentración de la antitrombina plasmática, neutralizaba el 86% la actividad anti-FXa en 5 minutos en ratones tratados con pentasacáñdo (Bianchini EP, Fazavana J, Picard V, Borgel D. Development of a recombinant antithrombin variant as a potent antidote to fondaparinux and other heparin derivatives. Blood. 2011;117(6): 2054-60). No divulgan experimentos in vivo con las otras hepañnas, solo ex vivo. Esta antitrombina mutada y su uso para el tratamiento o prevención de desórdenes de la coagulación está patentada (EP2175877B1). En la patente, describen la actividad inhibitoria del FXa de distintos mutantes de antitrombina (AT-R393H, AT-Pro394, AT-AR393-S394, AT-AR393, AT- AS394, AT-N135Q-R393H, AT-N135Q-Pro394, AT-N135Q-AR393-S394, AT-N135Q- AR393, ATN135Q-AS394). En ratones, ensayan el efecto de todos estos mutantes como antídotos del pentasacáñdo.
El antídoto basado en una antitrombina recombinante de la presente invención es mucho mejor que el descrito en EP2175877B1 ya que las mutaciones que presenta respecto a la secuencia de la antitrombina hacen que se exprese mejor y tenga mayor afinidad por la heparina.
La presente invención divulga a un antídoto basado en una antitrombina recombinante sin capacidad para inhibir a las proteasas diana de la coagulación, pero con mayor afinidad por la heparina que la proteína silvestre. En modelos ¡n vivo en ratón y ex vivo en plasma de pacientes anticoagulados, hemos comprobado que el antídoto de la presente invención es capaz de revertir el efecto anticoagulante de heparinas de bajo peso molecular.
Descripción
En la presente memoria, los términos “antídoto” y “antitrombina recombinante” son sinónimos y se emplean de forma intercambiable. En el estado de la técnica, un antídoto también podría ser una molécula con capacidad de unirse a la heparina y no dejarla actuar sin necesidad de ser una antitrombina recombinante.
El término "antitrombina recombinante" se refiere a una antitrombina, preferentemente una antitrombina humana, que comprende al menos una sustitución, inserción y/o deleción de uno o más aminoácidos dentro de su secuencia de aminoácidos.
En la presente memoria, el término “heparinas de bajo peso molecular” se refiere a heparina con un peso comprendido en el intervalo de alrededor de 4000 a 6500 Daltons.
En la presente memoria, el término "nucleótido" puede referirse a ambos, ribonucleótido o desoxirribonucleótido, a menos que se explique lo contrario.
Existen dos glicoformas de antitrombina en plasma. La glicoforma alfa, con 4 N-glicanos, es la mayoritaria (90-95%), mientras que la glicoforma beta, que carece de N- glicosilación en posición 135, es la minoritaria (5-10%). La generación de glicoforma beta se explica por la presencia de un residuo serina en posición 137, (en la secuencia de la antitrombina madura, una vez eliminado el péptido señal) y responsable de la N- glicosilación de la asparagina (N) 135. La presencia de serina en vez de treonina en posición 137 reduce la eficiencia del primer proceso de incorporación del núcleo glucídico al esqueleto proteico. La ausencia del componente glucídico en el residuo N135 tiene importantes consecuencias funcionales, ya que aumenta de dos a cinco veces la afinidad por heparina y otros glicosaminoglicanos como el heparán sulfato, proceso clave en la activación de la actividad anticoagulante de la antitrombina. Esta glicosilación en la posición 135 produce un impedimento esférico de la conformación alfa para unirse a la heparina.
Sorprendentemente, los inventores han descubierto que introduciendo las mutaciones 1039TG>AC para dar lugar al cambio de aminoácido M por N y 1044GTG>ACA para dar lugar al cambio de aminoácido V por T. Estas mutaciones producen la adición de un N-glicano nuevo, este glicano está muy alejado de la posición 135 cuya relevancia se ha explicado en el párrafo anterior, por lo tanto el efecto técnico de estas mutaciones es que se aumenta la secreción de la proteína cuando se sintetiza in vitro, ya que los sitios de glicosilación son necesarios para la secreción de antitrombina cuando ésta se expresa en células eucariotas y adicionalmente permite una afinidad por la heparina de más de 2,5 veces superior a la de la Beta-antitrombina ya que las cadenas de glicosilación están implicadas en la unión antitrombina-glicosaminoglicanos similares a la heparina celular.
El estado de la técnica sólo divulga una mutación en la secuencia de nucleótidos correspondiente con el aminoácido 137 para eliminar el N-glicano de la posición 135 que diferencia la Alfa-antitrombina de la Beta-antitrombina, sin embargo, la introducción de las 2 mutaciones indicadas anteriormente, permite la introducción de un nuevo grupo N-glicano en la secuencia que permite que el antídoto de la invención se secrete mejor y tenga mayor afinidad por la heparina.
La presente invención se refiere a un antídoto que comprende
- una antitrombina recombinante codificada en la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 2, que presenta las siguientes mutaciones con respecto a SEQ ID NO:1
A) 1039 TG>AC
B) 1044 GTG>ACA
C) 504 TCC> NNN, donde N es cualquier combinación de tres nucleótidos que no se traduzca en una serina, treonina o cisteína
D) Deleción de los nucleótidos en posición 1273, 1274 y 1275 de SEQ ID NO:1 o
- una antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 2 que tenga al menos un 80 % de identidad, más preferiblemente un 85 % de identidad, aún más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, y aún más preferiblemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta un 99 % de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 2, manteniendo fijas las mutaciones A)-D) de SEQ ID NO: 2 con respecto a SEQ ID NO:1 para su uso en la prevención y/o tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto.
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica para la proteína SERPINC1 en Homo sapiens. Esta secuencia es la región comprendida entre el nucleótido 69 hasta el 1463, CDS (Coding Sequence) de Genebank, NM_000488.4 (1552 bp mRNA linear PRI 10-APR-2023)
El término “mutaciones” comprenden al menos una sustitución, inserción y/o supresión de uno o vahos nucleótidos que se traducen en un cambio del aminoácido al traducirse la secuencia.
La antitrombina recombinante codificada por una vanante de SEQ ID NO: 2 puede comprender una o más mutaciones tal y como se indica en el párrafo anterior.
El efecto técnico de las variaciones 1039 TG>AC y 1044 GTG>ACA se ha explicado en los párrafos anteriores
El efecto técnico de la variación 504 TCC> NNN es que se evita la N-glicosilación del residuo de la asparragina en posición 135, lo que implica que la antitrombina sea de conformación beta en vez de glicoforma alfa.
En una realización particular, la variación 504 TCC> NNN es 504 T>G, esta variación da lugar al cambio de aminoácido S por A.
El efecto técnico de la deleción de 3 nucleótidos en posición 1273, 1274 y 1275 de SEQ ID NO:1 que da lugar a una deleción de un aminoácido de arginina (AR) en dicha posición, la ventaja de esta deleción es que el antídoto de la invención se une con mayor afinidad a la heparina, logrando así una capacidad sustancialmente reducida de inhibir factor Xa (FXa) y factor II (FII)
En otra realización particular, el antídoto de la invención comprende una antitrombina recombinante codificada en la SEQ ID NO: 3 que presenta las siguientes mutaciones con respecto a SEQ ID NO:1
A) 1039 TG>AC B) 1044 GTG>ACA
C) 504 T> G, y
D) Deleción de los nucleótidos en posición 1273, 1274 y 1275 de SEQ ID NO:1 o una antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 3 que tenga al menos un 80 % de identidad, más preferiblemente un 85 % de identidad, aún más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, y aún más preferiblemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta un 99 % de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 3, manteniendo fijas las mutaciones A)-D) de SEQ ID NO: 3 con respecto a SEQ ID NO:1 para su uso en la prevención y /o tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto
La antitrombina recombinante codificada por una vanante de SEQ ID NO: 3 puede comprender una o más mutaciones tal y como se ha indicado anteriormente
La secuencia de aminoácidos que codifica la SEQ ID NO:1 se encuentra en SEQ ID NO:4. Esta es la secuencia nativa de la antitrombina humana divulgada en GenPept NP_000479; 464 aa; linear PRI 10-APR-2023
Los 32 primeros aminoácidos de SEQ ID NO: 4 corresponden a un péptido señal que se expresa fisiológicamente, pero se procesa en el interior de la célula de manera que la proteína que se secreta no contiene ese péptido porque se proteoliza, en SEQ ID NO: 5 se divulga la misma secuencia pero sin el péptido señal
De esta forma, la secuencia de aminoácidos traducida a partir de SEQ ID NO: 3, es SEQ ID NO: 6, y las variaciones de aminoácidos son S169A/M347N/V349T/AR425 con respecto a SEQ ID NO: 4
La SEQ ID NO: 7 es idéntica a SEQ ID NO: 6, pero sin los 32 primeros aminoácidos que corresponden al péptido señal. Por lo tanto, las mutaciones S169A/M347N/V349T/AR425 de SEQ ID NO: 6 son equivalentes a S137A/M315N/V317T/AR393 de SEQ ID NO 7
En otra realización particular, el antídoto de la invención comprende una antitrombina recombinante codificada en la SEQ ID NO: 7 que presenta las siguientes mutaciones con respecto a SEQ ID NO:5
A) S137A
B) M315N
C) V317T, y
D) AR393 de SEQ ID N0:5 o una antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 7 que tenga al menos un 80 % de identidad, más preferiblemente un 85 % de identidad, aún más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, y aún más preferiblemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta un 99 % de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 7, manteniendo fijas las variaciones A)-D) de SEQ ID NO: 7 con respecto a SEQ ID NO: 5 para su uso en la prevención y/o tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto.
El antídoto que se purifica una vez expresado no tiene el péptido señal, ya que se pierde al trasladarse fuera de la célula, esta sería la forma funcional del péptido
El término “mutaciones” comprenden al menos una sustitución, inserción y/o supresión de uno o vahos aminoácidos dentro de la secuencia.
La antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 7 puede comprender una o más mutaciones tal y como se indica en el párrafo anterior
En otra realización particular, el antídoto de la invención comprende una antitrombina recombinante codificada en la SEQ ID NO: 6 que presenta las siguientes mutaciones con respecto a SEQ ID NO:4
A) S169A
B) M347N
C) V349T, y
D) AR425 de SEQ ID NO:4 o una antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 6 que tenga al menos un 80 % de identidad, más preferiblemente un 85 % de identidad, aún más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, y aún más preferiblemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta un 99 % de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 6, manteniendo fijas las variaciones A)-D) de SEQ ID NO: 6 con respecto a SEQ ID NO: 4 para su uso en la prevención y /o tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto
La antitrombina recombinante codificada por una vanante de SEQ ID NO: 6 puede comprender una o más mutaciones tal y como se ha indicado anteriormente.
La antitrombina recombinante de la invención tiene una actividad anticoagulante sustancialmente reducida con respecto a la actividad anticoagulante de la antitrombina nativa, o que no tiene sustancialmente ninguna actividad anticoagulante, dicha antitrombina recombinante que tiene además: una actividad inhibidora de la trombina sustancialmente reducida, o sustancialmente perdida, o una actividad inhibidora del factor Xa (FXa) reducida o sustancialmente perdida, o una actividad inhibidora del factor Ha (Fila) reducida o sustancialmente perdida, o una actividad inhibidora de la trombina y una actividad inhibidora del factor Xa y factor Ha sustancialmente reducidas, o sustancialmente perdidas.
La actividad inhibidora de la trombina o del factor Xa está "sustancialmente reducida" significa que la actividad de la antitrombina para inhibir la trombina o el factor Xa está reducida en comparación con dicha actividad en la antitrombina de tipo silvestre. Preferentemente, según la invención, la actividad inhibidora de la trombina o del factor Xa se considera reducida cuando dicha actividad representa de aproximadamente el 90%, o el 80% o el 70% o el 60% o el 50% o el 40% o el 30% a aproximadamente el 5% de la actividad inhibidora de la trombina o del factor Xa de la antitrombina de tipo silvestre. Las actividades inhibidoras anti-Xa y anti-lla se pueden medir con cualquier sistema conocido en el estado de la técnica.
La actividad inhibidora de la trombina o del factor Xa "sustancialmente perdida" significa que la actividad de la antitrombina para inhibir la trombina o el factor Xa está ausente en comparación con dicha actividad en la antitrombina de tipo silvestre.
Los términos "tratamiento" y "tratar" utilizados en el presente documento se refieren al tratamiento médico de un sujeto con la intención de curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, afección patológica o trastorno. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido específicamente a la mejora de una enfermedad, afección patológica o trastorno, y también incluye el tratamiento causal, es decir, el tratamiento dirigido a la eliminación de la causa de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociado. Además, este término incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento diseñado para aliviar los síntomas en lugar de curar la enfermedad, afección patológica o trastorno; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados; y el tratamiento de apoyo, es decir, el tratamiento empleado para complementar otra terapia específica dirigida a la mejora de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados. Se entiende que el tratamiento, aunque esté destinado a curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, afección patológica o trastorno, no tiene por qué producir realmente la curación, mejora, estabilización o prevención. Los efectos del tratamiento pueden medirse o evaluarse como se describe en el presente documento y como se conoce en la técnica, según convenga para la enfermedad, afección patológica o trastorno de que se trate. Dichas mediciones y evaluaciones pueden realizarse en términos cualitativos y/o cuantitativos. Así, por ejemplo, las características o rasgos de una enfermedad, afección patológica o trastorno y/o los síntomas de una enfermedad, afección patológica o trastorno pueden reducirse a cualquier efecto o en cualquier cantidad. En el contexto de un sujeto que padece una enfermedad inflamatoria, los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren a la gestión médica de un sujeto con la intención de curar, mejorar o estabilizar dicho riesgo hemorrágico.
En el presente documento, el término "prevenir" se refiere a la administración de la antitrombina recombinante de la invención antes de la aparición de los síntomas clínicos de una enfermedad o afección con el fin de prevenir una manifestación física de las aberraciones asociadas a la enfermedad o afección. En el contexto del riesgo hemorrágico, el término "prevenir" se refiere a la administración de la antitrombina recombinante de la invención antes de la aparición de los síntomas clínicos del riesgo hemorrágico para prevenir el sangrado en el sujeto.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" incluye, entre otros, animales. El sujeto puede ser un vertebrado, más concretamente un mamífero (por ejemplo, un ser humano, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro, una oveja, una cabra, un primate no humano, una vaca, un gato, una cobaya o un roedor), un pez, un ave o un reptil o anfibio. El término no denota una edad o sexo en particular. Por lo tanto, los sujetos adultos y recién nacidos, así como los fetos, ya sean varones o hembras, están cubiertos por la definición de sujeto. Un paciente es un sujeto afectado por una enfermedad o trastorno. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios. En otro aspecto de la invención, el antídoto para su uso en el tratamiento del riesgo hemorrágico puede administrarse a un sujeto que comprenda un ser humano o un animal, incluidos, entre otros, un ratón, un perro, un gato, un caballo, un bovino o un ovino y similares.
En otra realización particular, la “vahante” de cualquiera de las secuencias SEQ_ID NO: 2 o SEQJD NO: 3 que codifican para la antitrombina recombinante de la invención podría tener la secuencia de los codones optimizada para la expresión en cualquier célula huésped (un organismo o tipo celular particular, por ejemplo, una línea celular humana,) en, al menos un 10% de los codones, preferiblemente al menos un 20% de los codones, más preferiblemente al menos un 30% de los codones, aún más preferiblemente al menos un 40% de los codones, aún más preferiblemente al menos un 50% de los codones, aún más preferiblemente al menos un 60% de los codones, aún más preferiblemente al menos un 70% de los codones, aún más preferiblemente al menos un 80% de los codones, y aún más preferiblemente al menos un 90% de los codones. La optimización de codones no comprende un cambio en la secuencia de aminoácidos.
En una realización particular, el riesgo hemorrágico está producido por la administración al sujeto de heparina, dicha heparina puede ser una o más de las siguientes, heparina de bajo peso molecular, heparina no fraccionada y pentasacáhdo, preferentemente heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y/o heparina no fraccionada (HNF), ya que como se demuestra posteriormente en los ejemplos de realización, el antídoto de la invención comprende una actividad inhibidora de los factores Ha y Xa reducida o sustancialmente perdida.
En otra realización particular, la heparina se ha administrado, anteriormente, simultáneamente o a la antitrombina recombinante de la invención.
Es importante que el antídoto de la invención se administre antes de las 24 horas posteriores a la administración del sujeto con la HBPM o con HNF. Un médico sabría identificar el periodo de tiempo óptimo en el que se ha de administrar el antídoto de la invención para conseguir el mejor efecto anti-hemorrágico, al existir riesgo hemorrágico. Dicho especialista monitorizaría el estado del paciente al que se la ha administrado HBPM o HNF, y si hay sangrado o síntomas de hemorragia, administraría el antídoto de la invención al sujeto.
En otra realización particular, el riesgo hemorrágico está asociado a uno o más de los siguientes procesos, para las que está indicado el tratamiento con heparina: infecciones, inflamaciones o lesiones hipóxicas, en particular la sepsis y la isquemia/reperfusión relacionada con el ictus, la isquemia/reperfusión relacionada con la cirugía y la isquemia/reperfusión relacionada con el trasplante de órganos, trombosis venosa profunda, embolismo pulmonar, síndrome coronario agudo, bypass cardiopulmonar, circulación extracorpórea, hemodiálisis, catéteres venosos centrales o periféricos, tromboembolismo venoso (TEV) en cirugía general cuando hay insuficiencia renal u obesidad, Tratamiento TVP de extremidades inferiores con o sin embolismo pulmonar, cirugía de fractura de cadera, insuficiencia renal, tromboembolismo pulmonar y fibrilación auricular
En una realización preferida el riesgo hemorrágico está asociado a tromboembolismo pulmonar o fibrilación auricular.
En la presente invención, el riesgo hemorrágico también comprende trombocitopenia.
La antitrombina recombinante de la invención se puede administrar a un sujeto que padece, o está en riesgo de padecer, riesgo hemorrágico una cantidad eficaz de dicha antitrombina recombinante que presenta una actividad inhibidora los factores lia y Xa reducida o sustancialmente perdida. La cantidad puede ser una cantidad desde un mínimo de aproximadamente 0,1 mg de la antitrombina recombinante por Kg del sujeto, aproximadamente 0,2 mg/Kg, o aproximadamente 0,5 mg/Kg, hasta un máximo de aproximadamente 100 mg/Kg, aproximadamente 200 mg/Kg, o aproximadamente hasta 500 mg/kg. Por ejemplo, la cantidad de antitrombina recombinante que presenta una actividad inhibidora de los factores lia y Xa reducida o sustancialmente perdida puede ser de aproximadamente 0,1 mg/Kg a aproximadamente 100 mg/Kg, de aproximadamente 0,2 mg/Kg a aproximadamente 200 mg/Kg, de aproximadamente 0. 5 mg/Kg a unos 500 mg/Kg, de unos 0,1 mg/Kg a unos 10 mg/Kg, de unos 0,1 mg/Kg a unos 20 mg/Kg, de unos 0,1 mg/Kg a unos 50 mg/Kg, de unos 0. 5 mg/Kg a unos 20 mg/Kg, de unos 0,5 mg/Kg a unos 50 mg/Kg, de unos 0,5 mg/Kg a unos 100 mg/Kg, de unos 0,5 a unos 200 mg/Kg, de unos 0. 5 mg/Kg a unos 500 mg/Kg, de unos 15 mg/Kg a unos 25 mg/Kg, de unos 15 mg/Kg a unos 50 mg/Kg, de unos 18 mg/Kg a unos 30 mg/Kg, de unos 18 mg/Kg a unos 50 mg/Kg.
Un experto en la materia entendería que la antitrombina recombinante de la presente invención es de uso puntual, cuando haya riesgo de hemorragia y/o se haya administrado heparina a un sujeto, no para un uso sostenido en el tiempo salvo que al sujeto se le estén administrando una o más dosis de heparina de forma continuada en el tiempo.
En una realización adicional, el antídoto de la invención se administra a un sujeto a una dosis de unas 20 Ul/kg a unas 600 Ul/kg, preferentemente de unas 40 Ul/kg a unas 300 Ul/kg.
El antídoto de la invención puede administrarse a seres humanos y otros animales por vía intravenosa, oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como polvos, pomadas o gotas), bucal, como aerosol oral o nasal, o similares, preferentemente por vía intravenosa.
Otro objeto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el antídoto de la invención y uno o más compuestos activos adicionales, y/o uno o más portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables
Los compuestos activos adicionales son todos aquellos habitualmente empleados en la clínica para evitar el riesgo hemorrágico.
Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, es decir, el material puede ser administrado a un sujeto junto con el compuesto seleccionado sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera deletérea con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido.
Cada uno de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede sustituirse por cualquiera de los otros dos términos. Los términos "un" o "una" pueden referirse a uno o a una pluralidad de los elementos que modifican (por ejemplo, "un reactivo" puede significar uno o más reactivos), a menos que esté contextual mente claro que se describe uno de los elementos o más de uno. El término "aproximadamente", tal como se utiliza aquí, se refiere a un valor dentro del 10% del parámetro subyacente (es decir, más o menos el 10%; por ejemplo, un peso de "aproximadamente 100 gramos" puede incluir un peso entre 90 gramos y 110 gramos). El uso del término "aproximadamente" al principio de un listado de valores modifica cada uno de los valores (por ejemplo, "aproximadamente 1 , 2 y 3" se refiere a "aproximadamente 1 , aproximadamente 2 y aproximadamente 3"). Cuando se describe un listado de valores, el listado incluye todos los valores intermedios y todos los valores fraccionarios de los mismos (por ejemplo, el listado de valores "80%, 85% o 90%" incluye el valor intermedio 86% y el valor fraccionario 86,4%). Cuando un listado de valores va seguido del término "o más", el término "o más" se aplica a cada uno de los valores enumerados (por ejemplo, el listado de "80%, 90%, 95% o más" o "80%, 90% o 95% o más" se refiere a "80% o más, 90% o más, o 95% o más"). Cuando se describe un listado de valores, el listado incluye todos los rangos entre dos de los valores listados (por ejemplo, el listado de "80%, 90% o 95%" incluye rangos de "80% a 90%", "80% a 95%" y "90% a 95%"). A continuación, se exponen algunos ejemplos de aplicación de la tecnología
Breve descripción de las figuras
Figura 1 : Western Blot que muestra el incremento de la secreción de la antitrombina recombinante (antídoto) de la invención en comparación con la antitrombina alfa (alfa- AT) y la antitrombina beta (beta -AT). R-SDS significa que la electroforesis se realiza con sodium dodecil sulfato (SDS) en condiciones reductoras (con beta-mercaptoetanol o ditiotreitol).
Figura 2: Tinción con plata de la antitrombina recombinante (antídoto) de la invención.
Figura 3: Gráficas que muestran la actividad del antídoto de la invención (antitrombina recombinante) sobre Fila y FXa. PBS es el control es Tampón fosfato salino
Figura 4: Gráfica que muestra la actividad FXa en ratones tratados con PBS (control), heparina (HPBM), antídoto de la invención (antitrombina recombinante) y el antídoto de la invención (antitrombina recombinante) junto con heparina (HPBM). Vmax significa velocidad máxima.
Ejemplos de realización
Generación del antídoto de la invención
Para introducir las mutaciones deseadas en la secuencia de la antitrombina utilizamos el plásmido pCEP4 con el cDNA que codifica para la expresión de antitrombina humana NG_012462.1 RefSeqGene, concretamente la SEQ ID NO: 1.
Sobre este plásmido se realizaron mutagénesis dirigidas utilizando los cebadores indicados en la Tabla 1. Las mutaciones se realizaron de forma secuencial en el orden indicado en la tabla de arriba abajo. Un experto en la materia sabría cómo realizar dichas mutaciones empleando el conocimiento general común en el área y protocolos habituales de laboratorio.
Tabla 1. Secuencias de los cebadores empleados para introducir las mutaciones deseadas en el gen que codifica la antitrombina mediante mutagénesis dirigida.
Figure imgf000016_0001
Las reacciones de PCR se realizaron según pasos descritos en la Tabla 2.
Tabla 2. Condiciones de temperatura y tiempo para la reacción de POR de mutagénesis dirigida.
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0001
Los reactivos para la reacción de PCR aparecen descritos en la Tabla 3.
Tabla 3. Reactivos y cantidades requeridas para la reacción de PCR con la polimerasa
Pfu Turbo de Roche.
Figure imgf000017_0002
Una vez realizadas las reacciones de PCR y comprobado que las mutaciones se habían introducido correctamente mediante secuenciación de Sanger, se procedió a la transfección de células eucariotas HEK-EBNA para la expresión de la proteína recombinante. Las células se cultivaron al 60% de confluencia a 37°C, 5% de CO2, en DMEM con medio GlutaMAX-l (Invitrogen), suplementado con 5% de FBS (Sigma- Aldrich). Se transfectaron 200 g/mL de plásmido durante 30 minutos en OptiMEM con LX (Invitrogen), tal como sugiere el fabricante. Tras 24 horas, las células se lavaron con PBS y se cambiaron a un medio CD-CHO (Invitrogen) suplementado con 4mM de L- glutamina y 0,25 mg/mL de Geneticin (Invitrogen). Las células se cultivaron a 37°C durante 10 días. Se recogió el medio y se sustituyó por otro nuevo cada 2 días. La proteína fue purificada mediante cromatografía de afinidad por heparina en columnas HiTrap Heparin (GE Healthcare), utilizando un ÁKTA Purifier (GE Healthcare) en 100mM Tris-HCI y 10mM ácido cítrico, en un gradiente de 0,15 a 2M NaCI. Por último, la proteína se eluyó y se desaló en columnas de 5 mL de HiTrap Desalting (GE Healthcare) y se almacenaron a 70°C. La proteína se obtuvo con una gran eficiencia, debido a su alta tasa de secreción al medio y a su elevada afinidad por la heparina. Con un solo paso de purificación se obtuvo una homogeneidad superior al 90%. Esto significa que la proteína está pura en el sobrenadante en al menos un 90% y que de haber proteínas contaminantes no son superiores al 10% del total. Para un solo paso de purificación, esto es una eficiencia muy alta, lo que supone un ahorro de tiempo y recursos para la producción del antídoto de la invención. Estos resultados demuestran que las mutaciones 1039TG>AC y 1044GTG>ACA favorecen la secreción de la antitrombina recombinante de la invención.
Expresión in vitro del antídoto de la invención y evaluación de los niveles de secreción
Se empleó un protocolo similar al descrito en https://doi.org/10.3390/iims22020516. Las células de riñón embrionario humano que expresan el antígeno nuclear 1 de Epstein Barr (HEK-EBNA) se cultivaron hasta el 60% de confluencia a 37°C, 5% de CO2, en DMEM con medio GlutaMAX-l (Invitrogen, Barcelona, España) suplementado con 5% de suero bovino fetal (Sigma-Aldrich, Madrid, España). Se transfectaron 200 pg/mL de plásmidos control o que expresan el antídoto de la invención durante 30 minutos en OptiMEM con LTX (Invitrogen, Barcelona, España), tal como sugiere el fabricante. Se han empleado 2 plásmidos control, uno que expresa la AT-alfa y otro la AT-beta, siendo la AT-alfa SEQ ID NO: 1 , y AT-beta SEQ ID NO:1 +S137A.
Después de 24 horas, las células se lavaron con PBS y se cambiaron a medio CD-CHO (Invitrogen, Barcelona, España) suplementado con 4mM L-glutamina y 0,25 mg/mL de Geneticina (Invitrogen, Barcelona, España). Las células se cultivaron a 37°C durante 10 días. El medio se recogió y se sustituyó por medio fresco cada 2 días. La purificación del antídoto de la invención se realizó a partir del medio de los días 8 a 10 (48 horas).
El antídoto de la invención se purificó a partir de las recolectas del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad con heparina en columnas HiTrap Heparin (GE Healthcare), utilizando un purificador ÁKTA (GE Healthcare) en 100mMTr¡s-HCI pH 7.4 y 10mM de ácido cítrico, en un gradiente de 0,15 a 3M de NaCI. Las fracciones con antitrombina se aplicaron a una columna HiTrap Q (GE Healthcare) en 50 mMThs-HCI pH 7.4, en un gradiente de 0,15 a 2M de NaCI. Finalmente, las proteínas se desalaron en columnas de 5 mi HiTrap Desalting (GE Healthcare).
La electroforesis en gel de poliacrilamida se realizó al 8% en condiciones desnaturalizantes. Tras la separación, las proteínas se transfirieron mediante western blot sobre una membrana de difluoruro de polivinilideno. La antitrombina se detectó mediante inmunotinción con un anticuerpo policlonal frente a antitrombina humana hecho en conejo (Sigma-Aldrich, Madrid, España), seguido de IgG anti-conejo de burro conjugado con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare, Barcelona, España), con detección mediante un kit ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.Ull.). La tasa de secreción a las 24 horas de la transfección en relación con la proteína wild type se evaluó mediante densitometría utilizando el programa ImageJ.
Como se puede observar en la Figura 1, el antídoto de la invención tiene la misma movilidad electroforética que la forma alfa (ya que ambas tienen 4 N-glicanos) y está presente en el medio secretado más que las formas alfa y la beta normales concretamente 2,7 veces más. En la Figura 2 se muestra la tinción plata del antídoto de la invención sobre un gel de poliachlamida en el que se ha realizado una electroforesis con SDS en condiciones reductoras que muestra la pureza de la antitrombina recombinante (antídoto) en distintas concentraciones en microgramos.
Afinidad por hepahna mediante determinación de la emisión de fluorescencia intrínseca
La constante de disociación para la interacción de la antitrombina con la hepahna se determinó como se ha descrito previamente (Langdown J, BelzarKJ, Savory WJ, Baglin TP, Huntington JA. The critical role of hinge-region expulsion in the induced-fit heparin binding mechanism of antithrombin. J. Mol. Biol. 2009;386:1278-1289). Brevemente, el cambio en la fluorescencia intrínseca de la antitrombina, a una concentración de 25-50 nM se monitohzó a 340 nM durante la titración de la hepahna de bajo peso molecular (Enoxapahna, Rovi, España) en un espectrofluorímetro Gary Eclipse (Agilent technologies, Barcelona), excitando a 280 nm y con una apertura de 2.5 nm, tanto para la excitación como para la emisión. Todas las titraciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con una fuerza iónica fisiológica (I = 0.15) en tampón 20 mM Na2HPO4, 100 mM NaCI, 0.1 mM EDTA, 0.1% polietilen glicol 8000, pH 7.4. La intensidad de la emisión de fluorescencia se tomó como el promedio de 100 medidas registradas a intervalos de 1 segundo para cada adición de hepahna. Los datos se ajustaron siguiendo la siguiente fórmula:
Figure imgf000019_0001
Tabla 4: Constante de afinidad por la heparina
Figure imgf000020_0001
Los datos de la tabla 4 demuestran que la antitrombina recombinante de la invención (antídoto) tiene más afinidad por la heparina que la Beta-antitrombina, lo que supone que es capaz de unirse a la heparina con mayor eficiencia que la antitrombina fisiológica con mayor afinidad por la heparina. Así mismo, ninguna de las antitrombinas recombinantes descritas en EP2379101 B1 comprende las mutaciones de la presente invención en las posiciones 1039 y 1044 de la cadena de nucleótidos que se traducen en los cambios de los aminoácidos de M315N y V317N, por lo tanto, la antitrombina recombinante de la invención presente mayor afinidad por la heparina que las descritas en EP2379101 B1 , que se traduce en una mayor actividad anticoagulante.
Ensayo ex vivo: medidas de la actividad anti-FXa de plasmas de pacientes anticoaqulados en presencia del antídoto
Las actividades anti-FXa y anti-FI la se ensayaron incubando antitrombina con heparina de bajo peso molecular (0,096 nM) o heparina no fraccionada (0,03 nM) con FXa (2 pM) o Fila (2 pM), respectivamente. La hidrólisis de los sustratos cromogénicos (S-2765 para FXa o S-2238 para Fila) (Chromogenix, Izasa, España) se registró a 405 nm durante 10 min en un lector de placas. (Fig 3a y 3b)
Utilizando el equipo ACL-TOP, Werfen (Madrid, España), medimos la actividad anti-FXa añadiendo distintas concentraciones del antídoto de la invención en 500 pl de plasma de pacientes anticoagulados con heparinas de bajo peso molecular. El equipo empleado está automatizado, por lo que un experto en el área sabría reproducir este experimento, con la información proporcionada.
En los siguientes Ejemplos 1-4, los sujetos fueron tratados con los distintos fármacos y posteriormente se recolectó una muestra de sangre de los pacientes, de la cuál se separó el plasma. Una vez que se observó que la muestra estaba anticoagulada se administró el antídoto de la invención y se observó que podía revertir la anticoagulación de la muestra. El objetivo del experimento era determinar que el antídoto de la invención es capaz de revertir la unión de la heparina a la antitrombina. Los pacientes de los experimentos no mostraban sangrados.
Las muestras de sangre se obtuvieron tras la administración de los fármacos durante un periodo de tiempo de hasta 24 horas. La concentración inicial del antídoto de la invención es de 600 pg/mL, partiendo de dicha solución se administraron 0, 1 , 5, 10, 25, o 50 pL de dicha solución a 500 pL de muestra de suero.
Ejemplo 1. Paciente anticoagulado con Enoxaparina (60 mg cada 12 horas) por un tromboembolismo pulmonar, Tabla 5:
Tabla 5: Resultados del paciente del Ejemplo 1
Figure imgf000021_0001
Ejemplo 2. Paciente anticoagulado con un tipo de heparina de bajo peso molecular (Bemiparina) (7500 Ul/día) por una fibrilación auricular, Tabla 6.
Tabla 6: Resultados del paciente del Ejemplo 2
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 3. Paciente anticoagulado con Bemiparina (5000 lll/día) por una fibrilación auricular Tabla 7.
Tabla 7: Resultados del paciente del Ejemplo 3
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Ejemplo 4. Paciente anticoagulado con Bemiparina (5000 lll/día) por una fibrilación auricular Tabla 8.
Tabla 8: Resultados del paciente del Ejemplo 4
Figure imgf000023_0002
Estos resultados en pacientes muestran que la antitrombina recombinante de la invención es capaz de revertir el efecto anticoagulante de Bemiparina y Enoxaparina.
Ensayos ¡n vivo: Inyección en ratones
Para comprobar el efecto de nuestro antídoto ¡n vivo, llevamos a cabo experimentos con ratones C57BL/6J. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de experimentación animal de la Universidad de Murcia y se llevaron a cabo de acuerdo con las guías europeas de experimentación animal. Para ello agrupamos a los ratones en 4 grupos. Cada grupo contenía 5 machos y 5 hembras. Cada ratón fue primero anestesiado con isofluorano administrado por inhalación y recibía una inyección subcutánea de 100 l y 10 minutos después una inyección en el seno retroorbital de 100 pl. En el grupo 1 , las dos inyecciones contenían PBS. En el grupo 2 inyectamos heparina de bajo peso molecular subcutánea (Clexane) y PBS en el seno retroorbital. En el grupo 3 inyectamos PBS subcutáneo y antídoto en el seno retroorbital. En el grupo 4, inyectamos heparina de bajo peso molecular subcutánea (Clexane) y antídoto en el seno retroorbital. A los 5 minutos de la última inyección, se procedía a la extracción de sangre de la vena cava con jeringuillas que contenían citrato sódico y posteriormente se procedía a eutanasia. La heparina de bajo peso molecular (Clexane) se inyectaba a una dosis de 3 mg/Kg y el antídoto a una concentración de 20 mg/Kg. Una vez extraída la sangre, se aislaba el plasma por centrifugación a 2300g 15 minutos y se medía la actividad anti-FXa.
Los resultados demuestran que el antídoto o antitrombina recombinante de la invención es capaz de revertir el efecto anticoagulante de la heparina, Figura 4.
Listado de secuencias.
SEQ ID NO: 1 : Secuencia de nucleótidos del gen que codifica para la proteína SERPINC1 en Homo sapiens. Esta secuencia es la región comprendida entre el nucleótido 69 hasta el 1463, CDS (Coding Sequence) de Genebank, NM_000488.4 (1552 bp mRNA linear PRI 10-APR-2023)
SEQ ID NO: 2: Secuencia de nucleótidos que codifica para el antídoto o proteína recombinante de la invención, incluyendo, con respecto a SEQ ID NO: 1 las mutaciones 504TCC>NNN, 1039TG>AC y 1044GTG>ACA y la deleción de 1272CGT
SEQ ID NO: 3: Secuencia de nucleótidos que codifica para el antídoto o proteína recombinante de la invención, incluyendo, con respecto a SEQ ID NO: 1 las mutaciones 504T>G, 1039TG>AC y 1044GTG>ACA y la deleción de 1272CGT
SEQ ID NO: 4 Secuencia de aminoácidos de SERPINC1 , ver también GenPept NP_000479; 464 aa; linear PRI 10-APR-2023
SEQ ID NO: 5 Secuencia de aminoácidos de SERPINC1 sin el péptido señal
SEQ ID NO: 6 Secuencia de aminoácidos de la antitrombina recombinante de la invención con todas las mutaciones con el péptido señal: S169A/M347N/V349T/AR425
SEQ ID NO: 7 Secuencia de aminoácidos de la antitrombina recombinante de la invención con todas las mutaciones sin el péptido señal S137A/M315N/V317T/AR393 SEQ ID NO: 8-15 cebadores empleados

Claims

Reivindicaciones
1. Un antídoto que comprende
- una antitrombina recombinante codificada en la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 2, que presenta las siguientes mutaciones con respecto a SEQ ID NO:1
A) 1039 TG>AC
B) 1044 GTG>ACA
C) 504 TCC> NNN, donde N es cualquier combinación de tres nucleótidos que no se traduzca en una serina, treonina o cisteína
D) Deleción de los nucleótidos en posición 1273, 1274 y 1275 de SEQ ID NO:1 o
- una antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 2 que tenga al menos un 80 % de identidad, más preferiblemente un 85 % de identidad, aún más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, y aún más preferiblemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta un 99 % de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 2, manteniendo fijas las mutaciones A)-D) de SEQ ID NO: 2 con respecto a SEQ ID NO:1 para su uso en la prevención y/o tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto
2. El antídoto de acuerdo con la reivindicación anterior, que comprende una antitrombina recombinante codificada en la SEQ ID NO: 3 que presenta las siguientes mutaciones con respecto a SEQ ID NO:1
A) 1039 TG>AC
B) 1044 GTG>ACA
C) 504 T> G, y
D) deleción de los nucleótidos en posición 1273, 1274 y 1275 de SEQ ID NO:1 o una antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 3 que tenga al menos un 80 % de identidad, más preferiblemente un 85 % de identidad, aún más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, y aún más preferiblemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta un 99 % de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 3, manteniendo fijas las mutaciones A)-D) de SEQ ID NO: 3 con respecto a SEQ ID NO:1 para su uso en la prevención y /o tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto
3. El antídoto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprende una antitrombina recombinante codificada en la SEQ ID NO: 6 que presenta las siguientes mutaciones con respecto a SEQ ID NO:4
A) S169A
B) M347N
C) V349T, y
D) AR425 de SEQ ID NO:4 o una antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 6 que tenga al menos un 80 % de identidad, más preferiblemente un 85 % de identidad, aún más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, y aún más preferiblemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta un 99 % de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 6, manteniendo fijas las variaciones A)-D) de SEQ ID NO: 6 con respecto a SEQ ID NO: 4 para su uso en la prevención y /o tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto
4. Un antídoto que comprende una antitrombina recombinante codificada en la SEQ ID NO: 7 que presenta las siguientes mutaciones con respecto a SEQ ID NO:5
A) S137A
B) M315N
C) V317T, y
D) AR393 de SEQ ID NO:5 o una antitrombina recombinante codificada por una vahante de SEQ ID NO: 7 que tenga al menos un 80 % de identidad, más preferiblemente un 85 % de identidad, aún más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, y aún más preferiblemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta un 99 % de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 7, manteniendo fijas las variaciones A)-D) de SEQ ID NO: 7 con respecto a SEQ ID NO: 5 para su uso en la prevención y/o tratamiento del riesgo hemorrágico en un sujeto.
5. El antídoto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto se selecciona entre un ser humano, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro, una oveja, una cabra, un primate no humano, una vaca, un gato, una cobaya o un roedor.
6. El antídoto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el riesgo hemorrágico está producido por la administración al sujeto de hepahna, dicha heparina puede ser una o más de las siguientes, heparina de bajo peso molecular, hepahna no fraccionada y pentasacáhdo.
7. El antídoto de acuerdo con la reivindicación anterior donde la hepahna es hepahna de bajo peso molecular y/o hepahna no fraccionada.
8. El antídoto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el riesgo hemorrágico está asociado a uno o más de los siguientes procesos: infecciones, inflamaciones o lesiones hipóxicas, en particular la sepsis y la isquemia/reperfusión relacionada con el ictus, la isquemia/reperfusión relacionada con la cirugía y la isquemia/reperfusión relacionada con el trasplante de órganos, trombosis venosa profunda, embolismo pulmonar, síndrome coronario agudo, bypass cardiopulmonar, circulación extracorpórea, hemodiálisis, catéteres venosos centrales o periféricos, tromboembolismo pulmonar y fibrilación auricular.
9. El antídoto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se administra a un sujeto una cantidad de entre 0,1 mg/Kg a 500 mg/Kg
10. El antídoto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se administra por vía intravenosa, oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica, bucal, o nasal.
11. Una composición farmacéutica que comprende el antídoto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y uno o más compuestos activos adicionales, y/o uno o más portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables
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