WO2024181783A1 - 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2024181783A1
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유진산
이원섭
심상렬
정보영
박천호
이은아
박범용
강누리
김부연
메튜 드루이커크
잰 아블루글루아라랏
아지쿠마르 드사이아브히쉑
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US Department of Health and Human Services
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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating systemic capillary leak syndrome (SCLS), and relates to a composition for preventing or treating systemic capillary leak syndrome comprising a Tie2 receptor activating agent as an active ingredient.
  • SCLS systemic capillary leak syndrome
  • SCLS is a rare disease of unknown etiology characterized by transient episodes of potentially life-threatening capillary leaks.
  • the main signs and symptoms associated with SCLS include hypotension, elevated hemoglobin and hematocrit, hypoalbuminemia, and patients exhibit hypersensitivity of the epidermal microvasculature to histamine or morphine during the non-episodic phase.
  • biomarkers associated with SCLS most patients (68-85%) have a monoclonal gammopathy of unknown significance (MGUS) (Amoura, Z., et al., Systemic capillary leak syndrome: report on 13 patients with special focus on course and treatment. Am J Med, 1997. 103(6): p. 514-9.0).
  • vascular permeability enhancement characteristic of acute SCLS attacks are changes in endothelial topography and increases in the levels of angiogenic permeability factors such as angiopoietin 2 (Angpt2 angiopoietin2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the episodic serum of patients.
  • Angpt2 angiopoietin2 angiopoietin 2
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • IVIG Intravenous immunoglobulin administration
  • theophylline and/or terbutaline appears to provide some symptom reduction in a small subset of patients, which may provide a novel therapeutic approach to treatment, prompting us to investigate the function of Tie2 receptor in the pathogenesis of SCLS.
  • the inventors of the present invention have used a Tie2 receptor activating agent in vitro in SCLS patient-derived endothelial cells and in vivo in a SCLS susceptible mouse model (SJL), and as a result, when exposed to vascular leakage mediators (histamine, VEGF, LPS and TNF ⁇ ), the patient-derived endothelial cells, when pretreated with a Tie2 receptor activating agent, maintained intercellular interactions, showed a significant improvement in survival rate when exposed to a lethal dose of histamine, and significantly recovered hypersensitivity to histamine, eliminated the tendency for excessive systemic or cutaneous vascular leakage when exposed to histamine or VEGF, and improved vascular permeability enhancement induced by respiratory infection, thereby completing the present invention.
  • vascular leakage mediators histamine, VEGF, LPS and TNF ⁇
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for preventing or treating systemic capillary leak syndrome.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating systemic capillary leak syndrome (SCLS) comprising a Tie2 receptor activating agent.
  • SCLS systemic capillary leak syndrome
  • the present invention also provides a method for preventing or treating systemic capillary leak syndrome, comprising administering to a subject a Tie2 receptor activating agent.
  • the present invention further provides the use of a Tie2 receptor activating agent for use in the manufacture of a formulation for the prevention or treatment of systemic capillary leak syndrome.
  • FIG. 1 ECIS profiles of PMC-403-induced BOEC cell responses.
  • FIG. 1 PMC-403-induced protective response.
  • BOEC cells were exposed to angiogenic permeability factors: (A, B, C) histamine (pt1 2 mM, hd3 10 mM); (D, E, F) VEGF (pt1 10 ng/ml, hd3 70 ng/ml); (G, H, I) LPS (pt1 33 ng/ml, hd2 100 ng/ml)) and (J, K, L) TNF ⁇ (pt1 100 pg/ml, hd2 100 pg/ml).
  • Impedance D1 ⁇ 2Z1 ⁇ 2 changes recorded at 4 kHz over time.
  • FIG. 3 High-resolution imaging of BOEC cells in response to PMC-403 protection. Representative immunofluorescence images of SCLS patient BOEC (pt1) treated with histamine. Confluent monolayers of serum-starved BOEC were pretreated with PMC-403 (30 ⁇ g/ml) or mIgG2a (30 ⁇ g/ml). Histamine was added to each well 2 h after antibody pretreatment, and 15 min later, each sample was fixed and stained for VE-cadherin (green), F-actin (red) to identify F-actin, and DAPI (blue). In the wells treated with PMC-403, gaps between cell-cell junctions are reduced (white arrows). Scale bar 10 mm.
  • FIG. 4 Systemic histamine challenge SCLS-susceptible mice (SJL/J) survive longer and are less anaphylactic when pretreated with PMC-403. SJL/J mice were pretreated with PMC-403 (30 ⁇ g/ml) or mIgG2a (30 ⁇ g/ml) 2 h before intraperitoneal lethal dose (10 mg/kg) of histamine.
  • A Kaplan–Meier analysis of survival plots representing the probability of death in systemic histamine-treated animals.
  • FIG. 5 Systemic histamine administration induces vascular leakage but not PMC-403 pretreatment in SJL/J mice.
  • A, B, C Systemic histamine injection induced vascular leakage in muscle and skin. EB was injected ro followed by sublethal doses of histamine (2.5 mg/kg) i.p.: **p ⁇ 0.003, ***p ⁇ 0.0002.
  • D, E, F PMC-403 pretreatment inhibits histamine-induced vascular leakage: antibody was injected i.v., followed 2 h later by EB i.v., followed by histamine (2.5 mg/kg) i.p.
  • Extravasation dye is normalized to the dry weight of tissues/organs and is expressed as fold change compared to control PBS (C) or mIgG2a (F).
  • C control PBS
  • F mIgG2a
  • FIG. 6 The skin vasculature of SJL/J mice was susceptible to leakage when histamine was administered intradermally (Miles assay), but skin vascular leakage was significantly reduced in mice pretreated with PMC-403.
  • A Skin biopsy from an intradermal histamine-treated mouse.
  • FIG. 7 Intradermal VEGF administration significantly reduced extravasation in the skin of PMC-403-pretreated SJL/J mice.
  • A Skin biopsy from an intradermal histamine-treated mouse.
  • B Quantification of EB extravasation in skin biopsies. Extravasation dye was normalized to the dry weight of the skin sample and is presented as fold change compared to control mIgG2a (C).
  • FIG. 9 Histamine dose-dependent responses of BOEC monitored by ECIS.
  • B Representative values of changes at 15 min, and concentration-response curves were plotted as a function of the logarithm of histamine concentration (C) to determine the 50% effective concentration (EC50).
  • FIG. 10 Comparison of Tie2 expression between pt and hd BOECS.
  • the expression levels of Tie2 protein in BOECs were measured by FACS analysis.
  • A Relative Tie2 expression levels were established between BOECs compared to Tie2 levels in hd#2 cells (asterisk). Tie2 levels were not significantly different between these samples.
  • B Cumulative data showing Tie2 levels between pt vs hd BOECs. Measurements were performed at least twice, except for pt#4 and hd#4. ns, not significant.
  • FIG. 11 High-resolution image of SCLS patient BOEC (pt1) treated with VEGF.
  • Confluent monolayers of serum-starved BOEC were pretreated with PMC-403 (30 ⁇ g/mL) or mIgGa (30 ⁇ g/mL).
  • PMC-403 30 ⁇ g/mL
  • mIgGa 30 ⁇ g/mL
  • VEGF was added to each well, and 15 min later, each sample was fixed and stained for VE-cadherin (green), phalloidin (red) to identify F-actin, and DAPI (blue).
  • FIG. 12 High-resolution images of SCLS patient BOECs (pt1) treated with LPS.
  • Confluent monolayers of serum-starved BOECs were pretreated with PMC-403 (30 ⁇ g/ml) or mIgG2a (30 ⁇ g/ml). After 2 h of antibody pretreatment, LPS was added to each well, and 10 h later, each sample was fixed and stained for VE-cadherin (green), phalloidin (red) to identify F-actin, and DAPI (blue). Scale bar 10 mm.
  • FIG. 13 High-resolution image of SCLS patient BOEC (pt1) treated with TNF ⁇ .
  • Confluent monolayers of serum-starved BOEC were pretreated with PMC-403 (30 ⁇ g/ml) or mIgG2a (30 ⁇ g/ml). After 2 h of antibody pretreatment, TNF ⁇ was added to each well, and 10 h later, each sample was fixed and stained for VE-cadherin (green), phalloidin (red) to identify F-actin, and DAPI (blue). Scale bar 10 mm.
  • FIG. 14 High-resolution images of SCLS patient BOEC (hd2) treated with LPS. Confluent monolayers of serum-starved BOEC were pretreated with PMC-403 (30 ⁇ g/ml) or mIgG2a (30 ⁇ g/ml). After 2 h of antibody pretreatment, LPS was added to each well, and 10 h later, each sample was fixed and stained for VE-cadherin (green), phalloidin (red) to identify F-actin, and DAPI (blue). Scale bar 10 mm.
  • FIG. 15 High-resolution images of SCLS patient BOEC (hd2) treated with TNF ⁇ .
  • Confluent monolayers of serum-starved BOEC were pretreated with PMC-403 (30 ⁇ g/ml) or mIgG2a (30 ⁇ g/ml).
  • PMC-403 30 ⁇ g/ml
  • mIgG2a 30 ⁇ g/ml
  • TNF ⁇ was added to each well, and 10 h later, each sample was fixed and stained for VE-cadherin (green), phalloidin (red) to identify F-actin, and DAPI (blue).
  • the present invention is a result of confirming the effect of a Tie2 receptor activator-based agent on endothelial cell (EC) barrier dysfunction induced by cytokines related to systemic capillary leak syndrome (SCLS).
  • EC endothelial cell
  • SCLS systemic capillary leak syndrome
  • the Tie2 receptor activating agent can comprise an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a Tie2 receptor.
  • Antibody means an antibody that specifically binds to Tie2.
  • the scope of the present invention includes not only complete antibody forms that specifically bind to TIE2, but also antigen-binding fragments of such antibody molecules.
  • a complete antibody has two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain linked to a heavy chain by a disulfide bond.
  • the heavy chain constant regions are of the gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types, and have subclasses of gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1), and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the light chain constant regions are of the kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • An antigen-binding fragment of an antibody, or antibody fragment refers to a fragment that has an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, and Fv.
  • Fab has a structure with the variable regions of the light and heavy chains, the constant region of the light chain, and the first constant region (CH1) of the heavy chain and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F(ab')2 antibody is generated when the cysteine residues in the hinge region of Fab' form a disulfide bond.
  • Double-chain Fv two-chain Fv
  • single-chain Fv single-chain Fv
  • scFv single-chain Fv
  • antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (for example, a Fab can be obtained by restriction digestion of a whole antibody with papain, and an F(ab')2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), and can also be produced by genetic recombination technology.
  • proteolytic enzymes for example, a Fab can be obtained by restriction digestion of a whole antibody with papain, and an F(ab')2 fragment can be obtained by digestion with pepsin
  • the antibody according to the present invention is in the Fv form (e.g., scFv) or in the complete antibody form.
  • the heavy chain constant region can be selected from any one of the isotypes of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3) or gamma 4 (IgG4).
  • the light chain constant region can be of the kappa or lambda type.
  • Heavy chain means a full-length heavy chain and fragments thereof, comprising a variable domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen, and three constant domains CH1, CH2 and CH3.
  • light chain means a full-length light chain and fragments thereof, comprising a variable domain VL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen, and a constant domain CL.
  • Tie2 receptor activating agents include, but are not limited to, monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single-chain Fvs (scFV), single-chain antibodies, Fab fragments, F(ab') fragments, disulfide-linked Fvs (sdFV), and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of the above antibodies.
  • scFV single-chain Fvs
  • Fab fragments F(ab') fragments
  • sdFV disulfide-linked Fvs
  • anti-Id anti-idiotypic antibodies
  • the above monoclonal antibodies refer to antibodies obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in trace amounts of individual antibodies comprising the population. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations, which typically contain different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • Epitope refers to a protein determinant to which an antibody can specifically bind.
  • Epitopes are usually composed of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and usually have specific three-dimensional structural features as well as specific charge characteristics. Conformational and non-conformational epitopes are distinguished in that binding to the former is lost in the presence of denaturing solvents, but not to the latter.
  • non-human (e.g., murine) antibody is a chimeric antibody comprising one or more amino acid sequences (e.g., CDR sequences) derived from one or more non-human antibodies (donor or source antibody) that contain minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin.
  • a humanized antibody is a human immunoglobulin (recipient antibody) in which residues from the hypervariable region of the recipient are replaced by residues from the hypervariable region of a non-human species (donor antibody) such as mouse, rat, rabbit or non-human primate that retains the desired specificity, affinity and capacity.
  • residues within one or more framework domains (FRs) of the variable region of the recipient human antibody may be replaced by corresponding residues from a non-human species donor antibody. This helps maintain the proper three-dimensional configuration of the grafted CDR(s), thereby improving affinity and antibody stability.
  • Humanized antibodies may include new residues that do not appear in the recipient antibody or in the donor antibody, for example, to further refine antibody performance.
  • human antibody means a molecule derived from human immunoglobulin, and all amino acid sequences constituting the antibody, including the complementarity determining region and structural region, are composed of human immunoglobulin.
  • chimeric antibodies immunoglobulins in which a portion of the heavy and/or light chain is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remainder of the chain(s) is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass, as well as fragments of such antibodies that exhibit the desired biological activity.
  • Antibody variable domain refers to the light and heavy chain portions of an antibody molecule comprising the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDRs; i.e., CDR1, CDR2, and CDR3), and the framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • VH refers to the variable domain of the heavy chain.
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • CDRs complementarity determining regions
  • CDR1, CDR2, and CDR3 refer to the amino acid residues in an antibody variable domain that are necessary for antigen binding.
  • Each variable domain typically has three CDR regions, identified as CDR1, CDR2, and CDR3.
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 of SEQ ID NO: 6 (hereinafter, PMC-403).
  • the "framework regions” are the variable domain residues other than the CDR residues.
  • Each variable domain typically has four FRs, identified as FR1, FR2, FR3, and FR4.
  • TIE2 antibodies are monovalent or bivalent and contain single or double chains. Functionally, the binding affinity of TIE2 antibodies is in the range of 10 -5 M to 10 -12 M.
  • the binding affinity of TIE2 antibodies is 10 -6 M to 10 -12 M, 10 -7 M to 10 -12 M, 10 -8 M to 10 -12 M, 10 -9 M to 10 -12 M, 10 -5 M to 10 -11 M, 10 -6 M to 10 -11 M, 10 -7 M to 10 -11 M, 10 -8 M to 10 -11 M, 10 -9 M to 10 -11 M, 10 -10 M to 10 -11 M, 10 -5 M to 10 -10 M, 10 -6 M to 10 -10 M, 10 -7 M to 10 -10 M, 10 -8 M to 10 -10 M, 10 -9 M to 10 -10 M, 10 -5 M to 10 -9 M, 10 -6 M to 10 -9 M, 10 -7 M to 10 -9 M, 10 -8 M to 10 -9 M, 10 -5 M to 10 -8 M,
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the above TIE2 may comprise a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region of SEQ ID NO: 8.
  • It may comprise an isolated nucleic acid molecule encoding an antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to the above TIE2.
  • an "isolated nucleic acid molecule” means a nucleic acid molecule of the invention that is separated from at least about 50% of the proteins, lipids, carbohydrates, or other materials with which the nucleic acid is found in nature when isolated from a source cell, or is operably linked to a polynucleotide with which it is not linked in nature, or does not occur in nature as part of a larger polynucleotide sequence.
  • an isolated nucleic acid molecule of the invention is substantially free of any other contaminant nucleic acid molecule, or other contaminants found in its natural environment that would interfere with its use in polypeptide production or in therapeutic, diagnostic, prophylactic, or research applications.
  • amino acid sequence of the antibody may be modified to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the antibody.
  • modifications may include, for example, deletions, insertions, and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid mutations are made based on the relative similarity of the amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc. Analysis of the size, shape, and type of amino acid side chain substituents reveals that arginine, lysine, and histidine are all positively charged residues; alanine, glycine, and serine have similar sizes; and phenylalanine, tryptophan, and tyrosine have similar shapes.
  • arginine, lysine, and histidine can be considered biologically functional equivalents.
  • alanine, glycine, and serine can be considered biologically functional equivalents.
  • phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be considered biologically functional equivalents.
  • the antibody of the present invention or the nucleic acid molecule encoding it is interpreted to also include a sequence showing substantial identity with the sequence described in the sequence number.
  • the substantial identity means a sequence showing at least 90% homology, most preferably at least 95% homology, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more homology when the sequence of the present invention and any other sequence are aligned to the greatest extent possible and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • NCBI Basic Local Alignment Search Tool is accessible from NCBI, etc., and can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastp, blasm, blastx, tblastn, and tblastx on the Internet.
  • BLAST is accessible at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Methods for comparing sequence homology using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html.
  • the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention can have 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more homology to the specified sequences or the entirety described in the specification.
  • homology can be determined by sequence comparison and/or alignment by methods known in the art.
  • percent sequence homology of the nucleic acids or proteins of the present invention can be determined using a sequence comparison algorithm (i.e., BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, or visual inspection.
  • An expression vector comprising the above isolated nucleic acid molecule is provided.
  • expression vector used in the present invention means a vector that is suitable for transformation of a host cell and contains a nucleic acid sequence that directs or controls the expression of an inserted heterologous nucleic acid sequence.
  • the vector includes linear nucleic acids, plasmids, phagemids, cosmids, RNA vectors, viral vectors, and analogs thereof.
  • the viral vectors include, but are not limited to, retrovirus, adenovirus, and adeno-associated virus.
  • expression of a heterologous nucleic acid sequence or “expression” of a protein of interest means transcription of an inserted DNA sequence, translation of an mRNA transcript, and production of a fusion protein product or an antibody or antibody fragment.
  • a useful expression vector may be RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) or a variant thereof.
  • a useful expression vector may include a human cytomegalovirus (CMV) promoter to promote continuous transcription of the gene of interest in mammalian cells, and a bovine growth hormone polyadenylation signal sequence to increase steady-state levels of post-transcriptional RNA.
  • CMV human cytomegalovirus
  • a host cell comprising the above expression vector is provided.
  • host cell refers to prokaryotic and eukaryotic cells into which a recombinant expression vector can be introduced.
  • transformed and “transfected” as used herein refer to the introduction of a nucleic acid (e.g., a vector) into a cell by a number of techniques known in the art.
  • the host cell can be transformed or transfected with the DNA sequence of the present invention and used for expression and/or secretion of the target protein.
  • Host cells that can be used in the present invention can include immortal hybridoma cells, NS/0 myeloma cells, 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), HeLa cells, CAP cells (human amniotic fluid derived cells), or COS cells.
  • the above Tie2 receptor activating agent can reduce vascular leakage through a protective response of vascular endothelial cells exposed to vascular leakage mediators.
  • the above Tie2 receptor activating agent can improve hypersensitivity to vascular leakage mediators.
  • the vascular leakage mediators can be at least one selected from the group consisting of histamine, vascular endothelial growth factor (VEGF), lipopolysaccharide (LPS), and tumor necrosis factor- ⁇ (TNF ⁇ ).
  • the Tie2 receptor activating agent can alleviate vascular hyperpermeability induced by respiratory viral infection.
  • a fully humanized mouse antibody (PMC-403) recognizing the Tie2 receptor in both humans and mice was used.
  • EC barrier function was assessed in real time using electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using blood-outgrowth endothelial cells (BOECs) from SCLS patients and normal human donors with canonical permeability mediators.
  • ECIS electric cell-substrate impedance sensing
  • BOECs blood-outgrowth endothelial cells
  • IF immunofluorescence
  • SJL SCLS-susceptible mouse model was used to evaluate the physiological role of PMC-403 on histamine-induced, VEGF-induced, and influenza-induced systemic and cutaneous vascular leakage in SJL mice.
  • a Tie2 receptor-activating antibody (PMC-403) was used in vitro in SCLS patient-derived endothelial cells and in vivo in a SCLS-susceptible mouse model (SJL).
  • SJL SCLS-susceptible mouse model
  • mediators of vascular leakage histamine, VEGF, LPS, and TNF ⁇
  • patient-derived endothelial cells maintained cell-to-cell interactions when pretreated with PMC-403, but not isotype control antibody.
  • administration of PMC-403 antibody to SJL mice significantly improved survival when exposed to lethal doses of histamine, and also significantly reversed histamine hypersensitivity.
  • PMC-403-pretreated animals did not tend to exhibit excessive systemic or cutaneous vascular leakage when exposed to histamine or VEGF.
  • increased vascular permeability induced by respiratory infection also appeared to be improved.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating systemic capillary leak syndrome comprising a Tie2 receptor activator.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating systemic capillary leak syndrome, which comprises administering a Tie2 receptor activator to a subject.
  • the present invention relates to the use of a Tie2 receptor activator in the manufacture of a composition for preventing or treating systemic capillary leak syndrome.
  • the above entity may be a mammal, preferably a human.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any route.
  • the composition of the present invention may be provided to the animal by any suitable means, either directly (e.g., topically, by injection, implantation or local administration into a tissue site) or systemically (e.g., parenterally or orally).
  • the pharmaceutical composition may, for example, comprise a portion of an aqueous or physiologically applicable fluid suspension or solution.
  • the carrier or vehicle may be added to the composition and delivered to the patient as it is physiologically acceptable.
  • a carrier such as a body fluid for the formulation may generally include saline solution.
  • the frequency of administration will vary depending on the pharmacokinetic parameters of the formulation used.
  • the clinician will administer the pharmaceutical composition until the dosage that achieves the desired effect is reached.
  • the pharmaceutical composition may be administered as a single dose, as two or more doses spaced apart, or as a continuous infusion via an implantable device or catheter. Further refinement of the appropriate dosage is routinely accomplished by those skilled in the art and is within the scope of their routine practice.
  • the unit dosage is 0.01 ⁇ g/kg to 100 mg/kg in humans, specifically, 1 ⁇ g/kg to 10 mg/kg of body weight.
  • Administration of the fusion protein can be by periodic bolus injections, or by continuous intravenous, subcutaneous, or intraperitoneal administration from an external reservoir (e.g., an intravenous bag) or an internal source (e.g., a bioerodable implant).
  • Suitable routes include oral, parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, inhalational, intradermal, intrathecal, epidural, and infusion techniques), transdermal, rectal, intranasal, topical (including buccal and sublingual), vaginal, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal administration.
  • Topical administration may include using transdermal delivery, such as a transdermal patch or iontophoresis device.
  • the preferred route may vary, for example, depending on the condition of the recipient.
  • oral administration it may be formulated as a pill, capsule, tablet, etc., together with a pharmaceutically acceptable carrier, lubricant, or excipient.
  • parenteral administration it may be formulated as a unit dose injection together with a pharmaceutically acceptable parenteral vehicle or diluent.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, and the carrier is one or more selected from the group consisting of lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but is not limited thereto.
  • the carrier is one or more selected from the group consisting of lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc,
  • the pharmaceutical composition may further comprise one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweetening agents, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, and preservatives, which are typically used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition or the antibody or antigen-binding fragment thereof may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration.
  • the oral composition may be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device that allows the active agent to travel to the target cell.
  • Systemic capillary leak syndrome is a disease in which the permeability of capillaries temporarily increases, allowing plasma and proteins to move from the blood vessels into the interstitial space.
  • Treatment refers to any sign of success in the treatment or amelioration of an impairment, pathology or condition, including any subjective or objective parameter, such as alleviation; remission; making symptoms or impairments more tolerable to the patient; reducing the pathology or condition; slowing the rate of regression or decline; creating a less debilitating final point of regression; improving the physical or mental well-being of the patient.
  • Treatment or amelioration of symptoms may be based on objective or subjective parameters, including physical examination, neuropsychiatric testing and/or psychiatric evaluation.
  • an “effective amount” is generally an amount sufficient to reduce the severity or frequency of a symptom, eliminate a symptom, its underlying cause, prevent the onset of a symptom or its underlying cause, or ameliorate or correct impairment resulting from or associated with a disease state.
  • An effective amount is a therapeutically effective amount or a prophylactically effective amount.
  • a “therapeutically effective amount” is an amount sufficient to correct a disease state or symptom, particularly a condition or symptom associated with a disease state, or otherwise prevent, impede, delay or reverse the progression of a disease state or any other undesirable symptom associated with the disease in any way.
  • a “prophylactically effective amount” is an amount of a pharmaceutical composition that, when administered to a subject, has the intended prophylactic effect, e.g., preventing or delaying the onset of a disease state, or reducing the likelihood of onset (or recurrence) of a disease state or associated symptom.
  • BOEC Blood outgrowth endothelial cells
  • the back hair of animals was removed at least 2 days before performing the experiment.
  • Animals were first injected intravenously (i.v.) with PMC-403 or mIgG2a isotype control antibody (30 mg/kg animal body weight) (t-2 h). Two hours later (t 0 h), the animals were injected retroorbitally (r.o.) with 100 ⁇ l of 2% Evans blue dye (EB in PBS, Sigma) followed by histamine (625 ng, 125 ng, 25 ng) or saline (total 50 ⁇ l) at four different points on the back skin of the animals. Thirty minutes after the intradermal injection (t 0.5 h), the dorsal skin was harvested with a 12-mm biopsy punch and dried overnight at 95 °C.
  • EB dye was extracted from the dried samples using formamide (Sigma; 65 °C for 24 h). The EB content in each sample was determined by measuring the absorbance at 620 nm, and results were expressed as the amount of EB dye (ng) per skin sample and normalized to the isolated/dried sample.
  • VEGF-induced skin vascular leakage was similar to histamine treatment, except that pyrilamine maleate PM (4 mg/kg body weight; Sigma) was injected intraperitoneally (i.p.) at t-30 min to reduce the permeability background when handling the animals.
  • mice were injected i.v. with PMC-403 or mIgG2a isotype control antibody (30 mg/kg body weight of animal) (t -2 hr.). Two hours later, 100 ⁇ l of 2% EB in PBS was injected r.o. (t 0 hr.). Immediately after EB dye injection, histamine 10 mg/kg body weight (in PBS) was injected i.p.
  • mice 15 min after histamine injection (t 2.25 hr.), mice were deeply anesthetized by isoflurane inhalation and perfused with 20 ml of heparinized PBS via the left ventricle of the heart. Tissues were extracted and divided into two parts: one part was heated at 95 °C overnight to obtain the dry weight, and the second part was fixed in neutral-buffered formalin. Paraffin-embedded tissue sections were stained with hematoxylin and eosin and examined microscopically. The amount of EB dye was quantified as described above and normalized to the dry weight of individual tissues. Results are expressed as a fold change compared to the corresponding control group (MIgG2a or PBS-treated mice).
  • BOEC were titrated in duplicate (at least twice) with four different concentrations of agonist.
  • Impedance values of each well were recorded every 60 seconds throughout the entire time of the assay and normalized to the impedance value immediately prior to addition of permeability mediator or immediately prior to addition of antibody for EC50 measurements, i.e.,
  • (t)
  • Cells were washed twice with ice-cold PBS supplemented with freshly prepared PMSF (1 mM). Cells were lysed for 15 min on ice using 1x RIPA (EMD Millipore, 20-188) supplemented with 1x PhosSTOP and 1x cOmplete protease inhibitor cocktail (Roche, 4693159001, 11836153001) and subjected to 40-50 ⁇ g SDS-PAGE analysis.
  • Membranes were washed four times for 15 min each with 1x TBST at room temperature and incubated with secondary antibodies for 1 h at room temperature.
  • PBST phosphate-buffered saline
  • Tween 20 0.1% v/v
  • Washed cells were stained overnight at 4°C with secondary antibody anti-mouse IgG (H + L) Alexa FluorTM 488 (Invitrogen A-11017) in blocking buffer.
  • Wells were washed four times with PBST, for 15 min each at room temperature, and incubated for 90 min with Texas red phalloidin (1:80) (Molecular Probes, T7471), DAPI (3 mM) in blocking buffer. Samples were washed four times with PBST, for 15 min each at room temperature, and twice with PBS, and kept at 4°C until imaging.
  • BOECs at 2 ⁇ 105 samples were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 15 min at room temperature. Fixed cells were washed twice with 2% BSA in PBS and blocked with blocking buffer (1% BSA in PBS + 0.05% Tx100 + 0.05% NaN3) for 30 min at room temperature. Cells were stained with Alexa Fluor® 488 anti-human CD202b (1:40) (BioLegend clone 33.1 cat#334208), Alexa Fluor® 594 anti-human CD31 (1:40) (BioLegend clone WM59 cat#3034126) for 2.5 hr on ice.
  • Example 1 Quantitative EC permeability measurement using BOEC derived from SCLS patients.
  • BOEC-403 To evaluate the effect of PMC-403 on SCLS patient-derived ECs, we used a BOEC library generated from circulating endothelial progenitors from adult peripheral blood that have the capacity to differentiate into mature endothelial cells in culture.
  • One of the major advantages of using BOECs is that it provides a less invasive approach to study EC dysfunction associated with vascular disorders such as SCLS ex vivo from patients.
  • ECIS analysis Treatment with PMC-403 antibody resulted in an increase in impedance values of 11.50 ⁇ 1.43 and 6.03 ⁇ 1.2% in BOECs from SCLS patients and healthy donors, respectively (Fig. 1).
  • Example 2 Pretreatment of BOEC with PMC-403 alleviates defects due to permeability factor.
  • Example 3 PMC-403 pretreatment ameliorates histamine hypersensitivity in a SCLS-susceptible mouse model (SJL).
  • Example 4 Systemic and cutaneous vascular leakage induced by permeability mediators is reduced by PMC-403 pretreatment.
  • vascular leakage in SJL mice has been reported primarily in skeletal muscle and skin.
  • aged mice were administered systemically (r.o.) with the albumin-binding dye Evans blue (EB), followed by systemic (i.p.) administration of sublethal doses of histamine (2.5 mg/kg).
  • SJL mice exhibited vascular leakage primarily in skeletal muscle and skin, approximately 6.2 ⁇ 1.1-fold and 1.7 ⁇ 0.2-fold, respectively (Fig. 5A–C).
  • PMC-403 but not mIgG2a antibody, a reversal of the vascular leakage phenotype was observed (Fig. 5D–F).
  • a Tie2 receptor-activating antibody (PMC-403) was used in vitro in SCLS patient-derived endothelial cells and in vivo in a SCLS-susceptible mouse model (SJL).
  • SJL SCLS-susceptible mouse model
  • mediators of vascular leakage histamine, VEGF, LPS, and TNF ⁇
  • patient-derived endothelial cells maintained cell-to-cell interactions when pretreated with PMC-403, but not isotype control antibody.
  • administration of PMC-403 antibody to SJL mice significantly improved survival when exposed to lethal doses of histamine, and also significantly reversed histamine hypersensitivity.
  • PMC-403-pretreated animals did not tend to exhibit excessive systemic or cutaneous vascular leakage when exposed to histamine or VEGF.
  • increased vascular permeability induced by respiratory infection also appeared to be improved.
  • PMC-403 may be considered as a potential therapeutic agent for diseases such as SCLS with dysregulation of vascular barrier function.
  • the present invention provides a novel use of a Tie2 receptor activating agent, namely, a preventive or therapeutic effect on systemic capillary leak syndrome.

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Abstract

본 발명은 전신 모세혈관 누출 증후군 (Systemic Capillary Leak Syndrome: SCLS)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, Tie2 수용체 활성화 제제를 유효성분으로 포함하는 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 전신 모세혈관 누출 증후군 (Systemic Capillary Leak Syndrome: SCLS)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, Tie2 수용체 활성화 제제를 유효성분으로 포함하는 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
SCLS는 치명적인 잠재적 혈관 누출의 일시적인 현상을 특징으로 하는 원인 불명의 드문 질병이다. SCLS와 관련된 주요 징후와 증상은 저혈압, 헤모글로빈 및 헤마토크릿 수치 상승, 저알부민 혈증을 포함하고, 환자들은 표피 미세혈관계가 비 에피소드 단계 (non-episodic phase)에서 히스타민 또는 모르핀에 노출되면 과민성을 나타낸다. SCLS와 관련된 알려진 바이오마커는 없지만, 대부분의 환자(68-85%)는 MGUS(monoclonal gammopathy of unknown significance)를 가지고 있다 (Amoura, Z., et al., Systemic capillary leak syndrome: report on 13 patients with special focus on course and treatment. Am J Med, 1997. 103(6): p. 514-9.0).
또한, 급성 SCLS 발작에 특징적인 혈관 투과성 항진의 근저에 있는 공통의 조직학적 및 생화학적 메커니즘은 내피 형상의 변화와 환자의 에피소딕 혈청 (episodic serum)에서의 안지오포이에틴 2(Angpt2 angiopoietin2)와 혈관 내피 성장 인자 (VEGF vascular endothelial growth factor)와 같은 혈관신생 투과성 인자 수준의 증가이다. Angpt2와는 달리, 상동체인 Angpt1은 내피 혈관계를 안정화시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 혈관신생 투과성 요인으로부터 안지오포이에틴과 관련된 내피 투과성의 복잡한 특성이 분명하게 된다.
흥미롭게도, Angpt1과 Angpt2는 내피세포상 동일한 수용체 Tie2 (면역 글로불린 유사 및 EGF 유사 도메인을 갖는 티로신 키나아제)에 결합하고, SCLS 질환에서 Tie2 관련 혈관 안정성은 더 평가해야 할 것으로 남아 있다. 정맥내 면역글로불린 투여(IVIG intravenous immunoglobulin administration) 또는 테오필린 (theophylline) 및/또는 테르부탈린 (terbutaline) 투여는 소수의 환자 그룹에서 증상을 다소 감소시키는 것으로 보이며, 치료에 대한 신규한 치료적 접근을 제공할 수 있다는 점에서, SCLS의 병인 중 Tie2 수용체 기능을 밝히기 위해 연구에 착수했다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 Tie2 수용체 활성화 제제를 SCLS 환자 유래의 내피세포 생체외에서 사용하고, SCLS 감수성 마우스 모델 (SJL)의 생체내에 사용한 결과, 혈관 누출 중재자 (히스타민, VEGF, LPS 및 TNFα)에 노출된 경우, 환자 유래의 내피세포는 Tie2 수용체 활성화 제제로 전처리된 경우 세포간 상호작용을 유지하고, 치사량의 히스타민에 노출되었을 때 생존율이 크게 개선되었고, 히스타민에 대한 과민증도 크게 회복되며, 히스타민 또는 VEGF에 노출되었을 때 전신 또는 피부의 혈관누출이 과도하게되는 경향이 없어지며, 호흡기 감염에 의해 유발된 혈관 투과성 항진도 개선됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Tie2 수용체 활성화 제제를 포함하는 전신 모세혈관 누출 증후군 (SCLS: systemic capillary leak syndrome)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, Tie2 수용체 활성화 제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료에 사용하는 제제의 제조에 사용하기 위한 Tie2 수용체 활성화 제제의 용도를 제공한다.
도 1. PMC-403 유도 BOEC 세포 반응의 ECIS 프로파일. SCLS 환자 2(pt)(A, B)와 건강한 기증자로부터 유래된 BOEC(C, D) 세포의 4kHz에서 시간대별 임피던스 D½Z½변화. 혈청 결핍 세포는 t = 0 (검은 화살표)에서 PMC-403 (30 mg/ml) (파란색), Angpt1 (200 ng/ml) (녹색), 마우스 IgG 아이소타입 컨트롤 항체 (mIgG2a, 30 mg/ml) (빨간색) 또는 Mock (검정)와 배양되었다. t=1시간에 관찰된 저항의 최대 변화의 각각의 정량 분석은 B, D에 표시된다. 3 명의 다른 환자 (pt)와 3 개의 다른 건강한 기증자 (hd) 유래 BOEC의 데이터를 결합한 저항의 상대적인 변화를 패널 E에 나타낸다. 각 pt 및 hd BOEC 균주를 사용한 실험은 특정 세포주에 대해 적어도 3회 이상 반복되었다. 평균값으로 표시하였다(±sem). 상대 저항의 변화는 작용제 PMC-403 또는 Angpt1 또는 mIgG2a아이소 타입 컨트롤 X 100에 대한 모의 존재하에 저항의 변화로 계산된다.
도 2. PMC-403 유도 보호 반응. BOEC 세포는 혈관신생 투과성 인자에 노출되었다: (A, B, C) 히스타민 (pt1 2 mM, hd3 10 mM). (D, E, F) VEGF (pt1 10 ng/ml, hd3 70 ng/ml). (G, H, I) LPS (pt1 33 ng/ml, hd2 100 ng/ml)) 및 (J, K, L) TNFα(pt1 100 pg/ml, hd2 100 pg/ml). 시간대별 4kHz에서 기록된 임피던스 D½Z½ 변화. 혈청 결핍 상태의 BOEC는 먼저 PMC-403 (30 mg/ml, 청색) 또는 mIgG2a (30 mg/ml, 빨강) (검은 화살표)로 전처리되었다. 약 2시간 후, 작용제를 ECIS 웰에 첨가하였다(검은 화살표). 작용제 반응은 임피던스의 최대 감소에 대한 영향으로 결정되었다 (점선). 실험은 적어도 2회 이상 반복되었다. 3명의 환자 (pt)와 3명의 건강한 기증자 (hd)로부터의 BOEC로부터 시험한 각 작용제의 데이터를 조합한 보호 반응의 정량 분석을 패널 C, F, I, L에 나타내었다. DIgG 아이소타입 컨트롤의 전처리된 세포에서 내성의 변화. % Protection = [(1 - PMC-403 또는 Angpt1 또는 모의 전처리 세포에서 작용제에 의한 내성 변화) / △] X 100.
도 3. PMC-403 보호효과에 대한 BOEC 세포 고해상도 이미징. 히스타민으로 치료 한 SCLS 환자 BOEC (pt1)의 대표적인 면역 형광 이미지. 혈청 결핍 상태의 BOEC의 합류 단층을 PMC-403 (30 ㎍ / ml) 또는 mIgG2a(30 ㎍ / ml)로 전처리하였다. 항체 전처리 2 시간 후 각 웰에 히스타민을 첨가하고 15 분 후에 각 샘플을 고정하고 VE-cadherin (녹색), F-액틴을 확인하기 위한 F-actin (빨간색) 및 DAPI (청색)에 대해 염색했다. PMC-403으로 처리된 웰에서는 세포간 접합부 사이의 갭이 줄어든다(흰색 화살표). 스케일 바 10mm.
도 4. 전신성 히스타민 챌린지 SCLS 감수성 마우스(SJL/J)는 PMC-403으로 전처리하면 더 오래 생존하고 과민성이 낮다. SJL/J 마우스 복강 내 치사량 (10 mg / kg)의 히스타민 주사 2 시간 전에 PMC-403 (30 μg/ml) 또는 mIgG2a(30 μg/ml)로 전처리 하였다. (A) 전신 히스타민 투여 동물에서 사망 확률을 나타내는 생존 플롯의 카플란 - 마이어 분석. (B) 히스타민에 대한 과민증 : 과민증은 전신 히스타민 주사 ³30 분 후에 생존하고 살아있는 것으로 기록된 동물로 결정된다. n PMC-403 = 11, n MIgG2a= 12; ±sem; *, p = 0.0175.
도 5. 히스타민의 전신 투여는 혈관 누출을 유발하지만 SJL/J 마우스에서 PMC-403 전처리하는경우 혈관 누출을 유발하지 않는다. (A, B, C) 히스타민을 전신 주사하면 근육과 피부에 혈관 누출이 유발되었다. EB를 r.o. 주사한 다음 아치사 용량의 히스타민 (2.5 mg/kg)을 i.p. 주사하였다: **p<0.003, ***p<0.0002. (D, E, F) PMC-403 전처리는 히스타민 유발 혈관 누출을 억제시킨다 : 항체를 정맥 내 주사하고 2 시간 후에 EB를 정맥 내 주사 한 후 히스타민 (2.5 mg / kg)을 복강 내 주사했다. (A, D) 혈관외부누출 염료는 조직/장기의 건조 중량에 대해 정규화되며 대조 PBS (C) 또는 mIgG2a(F)에 비해 배율 변화로 표시된다. 각 기호는 한 마리의 마우스를 나타내며 사용된 동물의 수를 나타낸다 : n PBS = 7, n 히스타민 = 9, n 히스타민 + PMC-403 = 9, n 히스타민 + MIgG2a= 7. 평균값을 보여준다 (±sem): *, p<0.05; ***, p<0.001; ns, 유의하지 않음.
도 6. SJL/J 마우스의 피부 혈관계는 히스타민을 피내 투여했을 경우(마일즈 분석)에 누출의 영향을 받기 쉬웠지만, PMC-403으로 전처리한 마우스에서는 피부 혈관 누출이 대폭 감소했다. (A) 피내 히스타민 처리 마우스로부터의 피부 생검. (B) 피부 생검에서 EB 혈관 외 누출의 정량화. 혈관 외부 누출 염료는 피부 샘플의 건조 중량에 대해 표준화되었으며 대조군 mIgG2a(C)에 비해 배율 변화로 나타났다. 제1 항체를 i.v. 주사하고, 2시간 후에 EB를 r.o. 주사한 후, 히스타민을 i.d. 주사하였다. 사용한 동물의 수: n PMC-403 = 9, n MIgG2a= 9. 평균값을 나타낸다 (±sem): **, p<0.002. ****, p<0.0001; ns, 유의하지 않음.
도 7. VEGF를 피부에 접종하면 PMC-403으로 전처리된 SJL / J 마우스의 피부에서 혈관 누출이 크게 감소했다. (A) 피내 히스타민 처리 마우스로부터의 피부 생검. (B) 피부 생검에서 EB 혈관외 누출의 정량화. 혈관 외부 누출 염료는 피부 샘플의 건조 중량에 대해 표준화되었으며 대조군 mIgG2a(C)에 비해 배율 변화로 나타났다. t-2시간에 항체를 정맥내 주사하고, t-30분에 백그라운드를 감소시키기 위해 말레산 피릴라민을 복강내 투여하고, t=0시간에 EB를 복강내 주사한 후, VEGF를 복강 내 내부 주사했다. 사용한 동물의 수: n PMC-403 = 5, n MIgG2a= 6. 평균값 ( ±sem): ****, p<0.0001; ns, 유의하지 않음.
도 8. PMC-403-Tie2 상호작용의 생화학적 특성.
도 9. ECIS에 의해 모니터링되는 BOEC의 히스타민 용량별 반응. (A) D½SCLS 환자 1 (pt1) BOEC를 사용하여 4kHz에서 기록된 시간 변화에 따른 임피던스 D½Z½ 변화. 농도 반응은 t = 15 분에서 관찰된 임피던스의 최대 변화에 의해 결정되었다. (B) 15 분에 변화의 대표값 및 농도-반응 곡선을 히스타민 농도의 로그 함수로 플롯팅 (C) 하고 50% 유효농도(EC50)를 결정했다.
도 10.pt와 hd BOECS 사이의 Tie2 발현 비교. BOEC에서 Tie2 단백질의 발현 수준은 FACS 분석에 의해 측정되었다. (A) hd # 2 세포 (별표)에서 Tie2 수준과 비교하여 BOEC간에 상대적인 Tie2 발현 수준을 확립했다. Tie2 레벨은 이러한 샘플 간에 유의미한 차이가 없었다. (B) pt vs hd BOEC 간의 Tie2 레벨을 나타내는 누적 데이터. 측정은 pt#4 및 hd#4를 제외하고 적어도 두 번 수행되었다. ns, 유의하지 않음.
도 11. VEGF로 처리된 SCLS 환자 BOEC (pt1)의 고해상도 이미지. 혈청 결핍 상태의 BOEC의 합류 단층을 PMC-403(30㎍/㎖) 또는 mIgGa(30㎍/㎖)로 전처리하였다. 2 시간의 항체 전처리 후, 각 웰에 VEGF를 첨가하고, 15 분 후에 각 샘플을 고정하고, VE-cadherin (녹색), F-액틴을 확인하기 위한 phalloidin (적색) 및 DAPI (청색) )에 대해 염색했다. 스케일 바 10mm.
도 12. LPS로 처리된 SCLS 환자 BOECs (pt1)의 고해상도 이미지. 혈청 결핍 상태의 BOEC의 합류 단층을 PMC-403 (30㎍ /ml) 또는 mIgG2a(30㎍/ml)로 전처리하였다. 항체 전처리 2 시간 후, LPS를 각 웰에 첨가하고, 10 시간 후에 각 샘플을 고정하고, VE-cadherin (녹색), F-액틴을 확인하기 위한 phalloidin (빨간색) 및 DAPI (청색)에 대해 염색했다. 스케일 바 10mm.
도 13. TNFa로 처리된 SCLS 환자 BOEC (pt1)의 고해상도 이미지. 혈청 결핍 상태의 BOEC의 합류 단층을 PMC-403 (30㎍/ml) 또는 mIgG2a(30㎍/ml)로 전처리하였다. 2 시간의 항체 전처리 후, 각 웰에 TNFα 를 첨가하고, 10 시간 후에 각 샘플을 고정하고, VE-cadherin (녹색), F-액틴을 확인하기 위한 phalloidin (적색) 및 DAPI (청색)에 대해 염색했다. 스케일 바 10mm.
도 14. LPS로 처리된 SCLS 환자 BOEC (hd2)의 고해상도 이미지. 혈청 결핍 상태의 BOEC의 합류 단층을 PMC-403 (30㎍/ml) 또는 mIgG2a(30㎍/ml)로 전처리하였다. 항체 전처리 2 시간 후, LPS를 각 웰에 첨가하고, 10 시간 후에 각 샘플을 고정하고, VE-cadherin (녹색), F-액틴을 확인하기 위한 phalloidin (빨간색) 및 DAPI (청색) 에 대해 염색했다. 스케일 바 10mm.
도 15. TNFα로 처리한 SCLS 환자 BOEC (hd2)의 고해상도 이미지. 혈청 결핍 상태의 BOEC의 합류 단층을 PMC-403 (30㎍/ml) 또는 mIgG2a(30㎍/ml)로 전처리하였다. 2 시간의 항체 전처리 후, 각 웰에 TNFα 를 첨가하고, 10 시간 후에 각 샘플을 고정하고, VE-cadherin (녹색), F-액틴을 확인하기 위한 phalloidin (적색) 및 DAPI (청색)에 대해 염색했다. 스케일 바 10mm.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 전신 모세혈관 누출 증후군 (SCLS: systemic capillary leak syndrome) 관련 사이토카인에 의해 유발된 내피세포 (EC endothelial cell) 장벽 기능장애에 대한 Tie2 수용체 활성화 제제 기반 효과를 확인한 결과이다. SCLS의 포유류 모델에서 혈관 누출을 방지하기 위한 Tie2 수용체 활성화 제제의 효능을 확인하였다.
하나의 실시예에서, 상기 Tie2 수용체 활성화 제제는 Tie2 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
"항체(antibody)"는 Tie2에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 TIE2에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
"중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
Tie2 수용체 활성화 제제는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 하나 이상의 비-인간 항체(공여체 또는 공급원 항체)로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 서열(예를 들어, CDR 서열)을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 인간화를 위해 수용자 인간 항체의 가변 영역의 하나 이상의 프레임워크 도메인 (framework domain, FR) 내의 잔기가 비-인간 종 공여체 항체부터 상응하는 잔기로 대체될 수 있다. 이를 통해 그래프팅된 CDR(들)의 적절한 3차원 구성을 유지하도록 돕고, 이로써 친화성 및 항체 안정성을 개선시킬 수 있다. 인간화된 항체는, 예를 들어, 항체 성능을 추가로 세밀화하기 위해, 추가의 수용자 항체 또는 공여체 항체에서 나타나지 않는 새로운 잔기를 포함할 수 있다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
"항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
구체적으로, 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다 (이하, PMC-403).
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
TIE2 항체는 1가 또는 2가이고, 단쇄 또는 이중 쇄를 포함한다. 기능적으로, TIE2 항체의 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, TIE2 항체의 결합 친화성은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M이다.
상기 TIE2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 7의 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
상기 TIE2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 단리된 핵산분자를 포함할 수 있다.
"단리된 핵산 분자"는 전체 핵산이 공급원 세포로부터 단리될 때 그와 함께 자연에서 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 약 50% 이상으로부터 분리되었거나, 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는, 보다 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 단리된 핵산 분자에는 임의의 다른 오염 핵산 분자, 또는 폴리펩타이드 생산 또는 그의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에서 그의 사용을 저해하는 그의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물이 실질적으로 존재하지 않는다.
예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NCBI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
상기 단리된 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "발현벡터"란, 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시하거나 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 상기 벡터는 선형(linear) 핵산, 플라스미드, 파지미드(phagemids), 코스미드(cosmids), RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 상기 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 및 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "이종 핵산 서열의 발현" 또는 "발현"은, 삽입된 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역, 및 융합 단백질 생산물 또는 항체 또는 항체 단편의 생산을 의미한다.
유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 유용한 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호 서열을 포함할 수 있다.
상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "숙주세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어, "형질전환된" 및 "형질감염된"은 당업계에 공지된 많은 기술에 의한 세포 내로의 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는 본 발명의 DNA 서열로 형질 전환되거나 형질 감염시킬 수 있으며, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주 세포는 불사의 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cells), NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cells), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CAP 세포 (인간 양수 유래 세포), 또는 COS 세포를 포함할 수 있다.
상기 Tie2 수용체 활성화 제제는 혈관 누출 유도제 (vascular leakage mediators)에 노출된 혈관 내피세포의 보호 반응을 통해 혈관 누출을 감소시킬 수 있다. 상기 Tie2 수용체 활성화 제제는 혈관 누출 유도제에 대한 과민증을 개선시킬 수 있다. 이 때, 상기 혈관 누출 유도제는 히스타민, VEGF (vascular endothelial growth factor), LPS (lipopolysaccharide) 및 TNFα (Tumor necrosis factor-α)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 Tie2 수용체 활성화 제제는 호흡기 바이러스 감염에 의해 유발된 혈관 투과성 항진 (vascular hyperpermeability)을 완화시킬 수 있다.
인간과 마우스 모두에서 Tie2 수용체를 인식하는 완전 인간화된 마우스 항체 (PMC-403)를 사용하였다. 표준 투과성 중재자 (canonical permeability mediators)를 가지는 SCLS 환자와 정상 인간 기증자 유래 혈액 신장 내피 세포 (BOEC blood-outgrowth endothelial cells)를 이용한 전기 세포 기질 임피던스 감지 (ECIS electric cell-substrate impedance sensing)를 사용하여 EC 장벽 기능을 실시간으로 평가하였다. 또한, 면역형광 (IF) 및 FACS를 통해 인간 유래 BOEC 세포 및 세포 내 조직에 대한 PMC-403의 영향을 테스트했다. 이러한 생체 내 관찰을 강화하기 위해 SCLS 감수성 마우스 모델 (SJL SCLS-susceptible mouse model)을 사용하여 SJL 마우스에서 히스타민 유발, VEGF 유발 및 인플루엔자 유발 전신 및 피부 혈관 누출에 대한 PMC-403의 생리학적 역할을 평가했다.
Tie2 수용체 활성화 항체 (PMC-403)를 SCLS 환자 유래의 내피세포 생체외에서 사용하고, SCLS 감수성 마우스 모델 (SJL)의 생체내에서 사용하였다. 혈관 누출 중재자 (히스타민, VEGF, LPS 및 TNFα)에 노출된 경우, 환자 유래의 내피세포는 아이소타입 컨트롤 항체가 아닌 PMC-403으로 전처리되었을 때 세포간 상호작용을 유지했다. 게다가, SJL 마우스에게 PMC-403 항체를 투여하면, 치사량의 히스타민에 노출되었을 때 생존율이 크게 개선되었고, 히스타민에 대한 과민증도 크게 회복되었다. 아마도 가장 흥미로운 관찰은 PMC-403으로 전처리된 동물이 히스타민 또는 VEGF에 노출되었을 때 전신 또는 피부의 혈관누출이 과도하게되는 경향이 없었다는 것이다. 마지막으로 호흡기 감염에 의해 유발된 혈관 투과성 항진도 개선되는 것으로 보인다. 전반적으로, 이러한 관찰은 PMC-403이 혈관 장벽 기능에 대한 조절 장애가 있는 SCLS와 같은 질병의 잠재적인 치료제로 간주될 수 있다는 견해를 지지한다.
이를 바탕으로, 본 발명은 Tie2 수용체 활성화 제제를 포함하는 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 Tie2 수용체 활성화 제제를 개체에 투여하는 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료용 조성물 제조에 Tie2 수용체 활성화 제제를 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
약학 조성물은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접적으로(예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로(예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 정맥 내, 피하, 눈(ophthalmic), 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내(intraorbital), 뇌 내(intracerebral), 두개 내(intracranial), 척추 내(intraspinal), 뇌실 내(intraventricular), 수막강 내(intrathecal), 조내(intracistenal), 캡슐 내(intracapsular), 비 내(intranasal) 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 약학 조성물은 예를 들면, 수성(aqueous) 이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함할 수 있다. 이에 따라, 담체 또는 운반체(vehicle)가 생리학적으로 허용가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있다. 따라서, 제제를 위한 체액과 같은 담체로 일반적으로 생리식염수를 포함할 수 있다.
또한, 투여 빈도는 사용되는 제제의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 약학 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 약학 조성물은 단일 용량으로서, 시간 간격을 둔 2회 이상의 용량으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 정밀화는 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무 영역 내에 해당한다.
또한, 단위 투여량은 인간에 있어서 0.01 ㎍/kg 내지 100 mg/kg이며, 구체적으로, 1 ㎍/체중kg 내지 10 mg/kg이다. 상기 함량이 최적량이긴 하나, 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있으며, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 융합 단백질의 투여는 주기적인 급속 주입(periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원(external reservoir) (예, 정맥주사 보유주머니(intravenous bag)) 또는 내측(예, 생체부식성 임플란트(bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
적합한 경로에는 경구, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 흡입, 피내, 수막강내, 경막, 및 주입 기술 포함), 경피, 직장, 비내, 국소 (볼 및 설하 포함), 질, 복강내, 폐내 및 비내 투여가 포함된다. 국소 투여는 경피 패치 또는 이온삼투요법 장치와 같이 경피 투여를 이용하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 경로는, 예를 들어 수용자의 상태에 따라서 다양할 수 있다. 경구 투여하는 경우에는, 이를 제약상 허용되는 담체, 활택제 또는 부형제와 함께, 환제, 캅셀제, 정제 등으로서 제형화할 수 있다. 비경구 투여하는 경우에는, 이를 제약상 허용되는 비경구 비히클 또는 희석제와 함께, 단위 투여 주사제 형태로 제형화할 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
전신 모세혈관 누출 증후군은 모세혈관의 투과성이 일 시적으로 증가하여 혈관 내에서 간질 공간으로 혈장 및 단백질이 이동하는 질환이다.
"치료"는 임의의 주관적 또는 객관적 매개변수, 예를 들어 경감; 관해; 환자에 대해 더 용인 가능한 증상 또는 손상 생성, 병리 또는 병태의 감소; 퇴보 또는 쇠퇴 속도의 늦춤; 덜 쇠약하게 하는 최종 퇴보 지점의 생성; 환자의 신체적 또는 정신적 웰빙의 개선을 포함하는 손상, 병리 또는 병태의 치료 또는 개선에서의 임의의 성공 징후를 지칭한다. 증상의 치료 또는 개선은 신체 검사, 신경정신병학적 검사 및/또는 정신 의학적 평가를 포함하는 객관적 또는 주관적 매개변수에 기반할 수 있다.
"유효량"은 일반적으로 증상의 중증도, 빈도를 감소시키거나, 증상, 근본적인 원인을 제거하거나 증상의 발생 또는 근본적인 원인을 예방하거나, 질환 상태로부터 초래되거나 또는 이와 관련된 손상을 개선시키거나 또는 교정하는 데 충분한 양이다.
유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다. "치료적 유효량"은 질환 상태 또는 증상, 특히 질환 상태와 관련된 상태 또는 증상을 교정하거나, 또는 질환 상태 또는 어떠한 방법으로든 질환과 관련된 임의의 다른 바람직하지 않은 증상의 진행을 달리 예방하거나, 방해하거나, 지연시키거나 또는 반전시키는 데 충분한 양이다. "예방적 유효량"은 대상체에게 투여될 때, 의도된 예방적 효과, 예를 들어, 질환 상태 개시의 예방 또는 지연, 또는 질환 상태 또는 관련 증상의 개시(또는 재발) 가능성 감소를 갖는 약제학적 조성물의 양이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. 방법
1.1 환자샘플-세포배양
BOEC (Blood outgrowth endothelial cells)는 SCLS 피험자 또는 정상적인 인간 기증자로부터 준비되었고, IRB 승인 연구 프로토콜 (I-0184) 하에서 미국 국립보건원 임상센터(Clinical Center of the National Institutes)에서 수집되었다. 10% FBS(GIBCO) 및 VEGFA(+3 ng/ml)를 추가한 EGM2+ 배지(Lonza)를 포함한 I형 콜라겐으로 코팅된 배양 웰에서, 95% 공기 분위기 및 5% CO2 에서 37℃의 일정한 습도하에서 배양하였다.
1.2 마일스 검정.
마우스의 히스타민 유도 피부 혈관누출에 대한 PMC-403 항체의 영향을 평가하기 위해 Miles 분석을 사용했다.
[PMC-403]
Figure PCTKR2024002554-appb-img-000001
실험 수행하기 최소 2 일 전에 동물의 등 털을 제거하였다. 동물은 먼저 PMC-403 또는 mIgG2a 이소형 대조군 항체(동물 체중 1kg 당 30mg)를 정맥내(i.v.)에 주사하였다(t-2시간). 2 시간 후 (t 0 시간), 동물에게 100 μl의 2 % 에반스 블루 염료 (PBS의 EB, Sigma)를 후안와 주사 (r.o.)를 통해 주사한 다음 히스타민 (625 ng, 125 ng, 25 ng) 또는 식염수 (총 50 μl)를 동물의 뒤 피부 중 4 개의 다른 지점에 주입한다. 피내 주사 30 분 후 (t 0.5 시간), 등쪽 피부를 12mm 생검 펀치로 채취하고 95 ℃에서 밤새 건조시켰다. EB 염료는 포름아미드(Sigma; 65℃에서 24시간)를 사용하여 건조 샘플로부터 추출하였다. 각 샘플의 EB양은 620 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정되었고, 결과는 피부 샘플당 EB 염료량(ng)으로 표현되었고, 분리/건조된 샘플에 대해 정규화되었다. VEGF 유도 피부 혈관 누출은 동물을 다룰 때의 투과성 백그라운드를 줄이기 위해 t-30 분에 복강 내 (i.p.) 주사된 말레산 피리라민 (pyrilamine maleate PM, 체중 kg 당 4 mg, Sigma)을 사용한 것을 제외하고 치료는 히스타민 치료와 거의 유사했다.
1.3 SJL의 생존 분석.
PMC-403 또는 mIgG2a이소형 대조군 항체(동물 체중 1kg 당 30mg)를 주사한 마우스로부터 각종 조직/장기를 수집하였다. 정맥 내 항체 전달 2 시간 후 (t = 2 시간), 마우스를 히스타민 (10 mg / kg)으로 복강 내 처리하고, 2 시간 관찰하고 사망을 기록 하였다.
1.4 전신 혈관 누출 분석.
PMC-403 항체가 다양한 조직/기관에서 혈관 누출을 유발하는지 여부와 보호 효과를 평가하기 위해 마우스에 PMC-403 또는 mIgG2a 아이소타입 컨트롤 항체 (동물 체중 kg 당 30 mg)를 i.v. 주사했다 (t -2 시간). 2 시간 후, PBS 중 2 % EB 100 ㎕를 r.o. (t 0 hr.) 주사하였다. EB 염료 주사 직후, 히스타민 10 mg / kg 체중 (PBS 중)을 i.p. 로 주사하였다. 히스타민 주사 15분 후 (t 2.25 hr.), 이소플루란 흡입에 의해 마우스를 깊게 마취시키고, 심장의 좌심실을 통해 헤파린화 PBS 20ml로 관류하였다. 조직을 추출하고 두 부분으로 나누었다: 한 부분을 95 ℃에서 밤새 가열하여 건조 중량을 얻었고, 두 번째 부분을 중성 완충 포르말린으로 고정시켰다. 파라핀 포매 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 현미경으로 조사하였다. EB 염료의 양은 상기 기재된 바와 같이 정량화되었고, 개별 조직의 건조 중량에 의해 정규화되었다. 결과는 상응하는 대조군 (MIgG2a또는 PBS 투여 마우스)에 비해 배율 변화로서 나타내었다.
1.5 ECIS®를 사용한 임피던스 측정.
실험은 세포 배양 인큐베이터에 보관된 16-웰 어레이 홀더를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 ECIS 시스템(Applied BioPhysics Inc., Troy, NY, USA)에서 수행되었다. 경내피 전기 저항은 4 kHz의 진폭으로 기록되었다. 실험을 시작하기 전에 1000 옴의 컷오프 저항이 필요했다. 일회용 8-웰 전극 어레이(8w10e+)의 성장 표면을 실온에서 타입 I 콜라겐(220㎕ m/웰, 18mM 아세트산 중 50㎍ m/㎖)으로 코팅하였다. 웰을 PBS로 3회 세척하고, 1시간 후에 BOEC 배양 배지(EGM+)로 교체하였다. 이어서 35,000 ~ 60,000 개의 BOEC를 웰당 파종하고 실온에서 30 분간 웰 표면에 부착한 후 8웰 어레이를 ECIS 장치에 넣고 모니터링을 위해 세포 배양 인큐베이터에 밤새 보관했다. 밤새 일정한 임피던스 값에 도달한 후, 세포를 4시간 (t=-4시간) 혈청 결핍시키고, t=0시간 에 하기 방법으로 작용제에 노출시켰다. 혈관 내피 투과성 인자에 노출되면 각 BOEC는 적정 가능한 장벽 파괴를 나타내며 (도 9), 각 작용제의 50% 유효 농도 (half maximal effective concentration values EC50)을 정량화할 수 있도록 한다 (표 1).
Figure PCTKR2024002554-appb-img-000002
EC50 측정에서 BOEC를 4가지 농도의 작용제로 2회씩(적어도 2회) 적정하였다. PMC-403의 작용제에 미치는 영향은 먼저 BOEC를 PMC-403 또는 아이소타입 컨트롤 항체 (30 mμg/ml)에 노출시킴으로써 결정되었다. 9 0 분에서 2 시간 후 (t = 1.5 ~ 2 시간) 다양한 내피 투과성 중재자를 각 테스트 BOEC의 각 EC50값에서 첨가하였다. 각 웰의 임피던스 값은 분석의 전체 시간에 걸쳐 60초마다 기록되었고, EC50 측정을 위한 투과성 매개체의 첨가 직전 또는 항체의 첨가 직전의 임피던스 값, 즉 |Z|(t) = |Z| 작용제 또는 항체를 포함하는 샘플 (t) / |Z| 샘플 (t0)로 정구화되었다.
1.6 웨스턴 블롯 분석.
BOEC는 I형 콜라겐 코팅 디쉬로 컨플루언스까지 증식시키고, 0.2% BSA를 포함하는 EBM으로 하룻밤 혈청 기아 상태(t=0시간)에서 PMC-403 또는 IgG2a(30㎍ m/ml)를 지시된 시간만큼 처리하였다. 세포를 새로 제조된 PMSF(1 mM)로 보충한 빙냉 PBS로 2회 세척하였다. 1x PhosSTOP 및 1x cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, 4693159001, 11836153001)을 첨가한 1x RIPA (EMD Millipore, 20-188)를 사용하여 얼음에 15 분간 세포를 용해시키고 40-50 μg SDS-PAGE 분석에 사용했다. iBlot™ 2 Dry Blotting System (Invitrogen)을 사용하여 샘플을 니트로 셀룰로오스 막으로 전사했다. 블롯을 실온에서 2 시간 동안 블로킹 완충액 (5 % BSA + 1 TBS + 0.1 % Tween-20 + 50 mM NaCl)으로 차단 하였다. 1차 항체와 함께 블로킹 완충액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다: 마우스 항-인간 Tie-2 (1:1000) (Invitrogen, CD202b). 토끼 항인간 P-Tie-2 (1:500) (IR&D, AF2720); 마우스 항인간 FKHR (1:500) (Santa Cruz, sc-374427); 토끼 항인간 (S256P) Fox01A (1:1000) (Abkam, ab131339). 멤브레인을 실온에서 1x TBST로 15분 동안 4회 세척하고 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 배양하였다. IRDye® 680RD 당나귀 항마우스; IRDye® 800CW 염소 항 토끼 (LI-COR). 세척된 멤브레인은 LI-COR Odyssey 9120 적외선 이미징 시스템으로 이미징되었다.
1.7 면역 형광 현미경.
25,000 BOECs/웰을 타입 I 콜라겐-코팅된 ibTreat 8-웰 슬라이드 상에서 컨플루언스로 성장시키고, 0.2% BSA를 함유하는 EBM에서 4시간(t-4시간) 혈청 기아 상태로 만들고 (t=0 시간) PMC-403 또는 mIgG2a (30㎍ m/ ml)로 작용제 처리 2 시간 전 (t + 2 시간), 표시된 기간 동안 처리하였다. 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드(Sigma)로 1시간 이상 고정시킨 후, 0.2% Triton X-100 + PBS 중 2.0% BSA(블록킹 완충액)로 4℃에서 밤새 투과시켰다. 항-인간 CD144 항체 (1:150) (BD Pharmingen, 555661)로 4℃에서 밤새 염색시켰다. 웰을 Tween 20 (01 % v / v)을 함유하는 PBS (PBST)로 4 회, 실온에서 각 15 분 동안 세척하였다. 세척된 세포를 블로킹 완충액 중 2차항체 항 마우스 IgG (H + L) Alexa Fluor ™ 488 (Invitrogen A-11017)로 밤새 4°C로 염색하였다. 웰을 PBST로 4 회, 실온에서 각 15 분 동안 세척하고 차단 버퍼 중 Texas red phalloidin (1:80) (Molecular Probes, T7471), DAPI (3 mM)로 90 분 인큐베이션 하였다. 샘플을 PBST로 4회, 실온에서 각각 15분 동안 세척하고, PBS로 2회 세척하고, 이미징까지 4℃로 유지하였다.
1.8 유동 세포 계측.
2×105 샘플당 BOEC는 실온에서 15분 동안 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 고정되었다. 고정 된 세포를 PBS 중 2% BSA로 2 회 세척하고 실온에서 30 분 동안 차단 완충액 (PBS 중 1% BSA + 0.05% Tx100 + 0.05% NaN3)으로 차단하였다. 세포를 Alexa Fluor® 488 항 인간 CD202b (1:40) (BioLegend clone 33.1 cat#334208), Alexa Fluor® 594 항 인간 CD31 (1:40) (BioLegend clone WM59 cat#3034126)로 얼음 중 2.5hr 동안 염색하였다. 2% BSA를 함유하는 PBST로 2 회 세척하고 FACS 완충액 (PBS 중 1% BSA + 0.05% NaN3)으로 옮겼다. 모든 BOEC는 CD31 발현이 양성이었다. 미염색 세포와 염색 세포의 기하 평균 이동을 사용하여 각 BOEC에서 Tie2 (CD202b) 발현 수준을 측정하였다.
실시예 1. SCLS 환자 유래 BOEC에 의한 정량적 EC 투과성 측정.
SCLS 환자 유래 EC에 대한 PMC-403의 영향을 평가하기 위해 배양 중 성숙 내피세포로의 분화능을 가진 성인 말초 혈액에서 순환 내피 전구세포 (circulating endothelial progenitors)에서 생성된 BOEC 라이브러리를 사용했다. BOEC를 사용하는 주요 이점 중 하나는 환자의 체외 SCLS와 같은 혈관 장애와 관련된 EC 기능 장애를 연구하는 낮은 침습성 접근을 제공하는 것이다. SCLS 또는 건강한 기증자 유래 BOEC에서 세포 간 상호작용에 PMC-403의 영향을 평가 하기 위해 ECIS 분석을 사용했다. PMC-403 항체로 처리한 경우, SCLS 환자와 건강한 기증자 BOEC에서 각각 11.50 ± 1.43 및 6.03 ± 1.2%의 임피던스 값 증가를 보였다 (도 1). 이러한 관찰은 유의하고 (각각 p = 0.019, p = 0.038), 세포 간 상호 작용이 더 밀접한 것을 보여준다. 유사한 양상이 BOEC를 Angpt1로 처리하였을 때 관찰되었고 (각각 7.37 ± 0.68 %, p = 0.019 및 6.73 ± 0.65 %, p = 0.010), PMC-403 및 Tie2 수용체의 상호작용은 Angpt1-T 상호작용을 모방하는 것을 제안한다. 실제로, PMC-403 및 Tie2 수용체의 상호작용을 생화학적으로 테스트한 결과, Angpt1 의존성 결합도 나타났으며, 공통된 상호작용 에피토프를 공유하는 것으로 확인되었다 (도 8). 또한, PMC-403 또는 Angpt1로 처리했을 때, SCLS 환자에서 유래된 BOEC의 관찰된 임피던스 증가는 건강한 기증자 BOEC의 임피던스 증가보다 높았다(각각 p=0.003, p=0.029). 이것은 혈관 투과성 인자에 대한 과민증 (hypersensitivity)을 나타낸다.
실시예 2. PMC-403에 의한 BOEC의 전처리는 투과성 인자로 인한 결함을 완화한다.
SCLS 또는 건강한 기증자 유래 BOEC에서 내피 투과성 인자에 대한 PMC-403의 영향을 평가하기 위해 아포화 농도 (subsaturating concentrations)의 작용제 (agonist)를 사용하였다 (도 2, 표 1). 아고니스트인 히스타민에 대하여 3명의 별개의 환자(pt)와 3명의 별개의 건강한 기증자(hd)의 BOEC를 종합적으로 테스트했지만, VEGF 환자의 BOEC는 건강한 기증자의 BOEC보다 더 높은 감도를 가진 것으로 보인다 (3.78 배 p<0.0001, 6.26-폴드 p = 0.0392, 각각). 반면에 LPS 차이는 거의 없었고, TNFα에 대한 감도는 감소했다 (0.31 배, p = 0.0138). 따라서, 아포화 농도의 작용제를 사용하여 PMC-403에 대한 pt 및 hd BOEC 반응을 평가하였다. 일반적으로, 효능제인 히스타민, VEGF, LPS 및 TNFα에 노출되면 SCLS와 건강한 기증자의 BOEC 모두 다양한 정도로 보호 반응을 보였다(도 2). 이러한 관찰 결과는 PMC-403이 생체 외에서 BOEC의 보호 반응을 유도할 수 있음을 시사한다. 아마도 관찰된 일부 작용제 감수성은 SCLS 환자의 BOEC에서 비정상적 Tie2 발현 수준으로 인한 것일 수 있는데, Tie2 발현의 50% 손실(Tie2 +/- 마우스)이 Tie2 KO 마우스에서 혈관 누출로 이어질 수 있기 때문이다. 따라서 이러한 BOEC에서 Tie2 발현 수준을 평가하였다(도 10). Tie2 발현 수준은 4명의 개별 환자 유래 BOEC와 4명의 개별 건강한 공여자로부터의 BOEC 사이에서 동등한 것으로 보이며, 이러한 BOEC에서 Tie2 발현 수준에는 유의한 차이가 없었다. ECIS 데이터는 실시간으로 EC 장벽 기능을 제공하였지만, 면역형광 이미징을 사용하여 이들 PMC-403 및/또는 작용제로 처리된 BOEC에서 세포내 분자 조직을 시각적으로 검사하였다(도 3, 및 도 11-15). 환자의 BOEC를 저용량 또는 중용량의 히스타민으로만 치료하였을 때, 세포간 상호작용은 히스타민 처리 15분 이내에 명확하게 약해졌다. 그러나 동일한 조건하에서 아이소타입 컨트롤 mIgG2a로 전처리된 BOEC가 아닌 PMC-403으로 전처리된 BOEC는 세포 간 상호작용에 장애를 거의 나타내지 않았다. 이러한 관찰은 시험된 모든 작용제들 사이에서 일관되었다. 전반적으로, BOEC의 육안 검사는 ECIS 데이터를 지원하고 EC가 생체 외에서 혈관 투과성 인자에 노출되었을 때 PMC-403 항체가 보호할 수 있는 가능성을 보여준다.
실시예 3. PMC-403 전처리는 SCLS 감수성 마우스 모델 (SJL)에서 히스타민 과민증을 완화한다.
최근 SCLS의 임상적 특징을 자발적으로 보여주는 자연 발생 마우스 모델 (SJL / J)이 보고되었다 [Raza, A., et al., A natural mouse model reveals genetic determinants of systemic capillary leak syndrome (Clarkson disease). Commun Biol, 2019. 2: p. 398.]. Chr6에 위치한 히스타민 과민 유전자좌를 가지고 있으며 인간 SCLS GWAS 후보와 공통된 유전적 및 표현형의 유사성을 공유하는 것으로 보인다. SJL 마우스와 SCLS 환자는 혈관 투과성 항진 (vascular hyperpermeability)에 대한 감수성 증가와 관련하여 유사한 유전적 특성을 공유하기 때문에 이러한 동물에서 PMC-403의 영향을 평가하기로 결정했다. SJL 마우스가 치사량의 히스타민 (10 mg/kg)으로 전신 투여 (i.p. systemically challenged) 되었을 경우, PMC-403 전처리 동물은 2시간까지 36%의 절대 생존율의 우위성을 보였다 (도 4A). 실제로, 이들 동물은 히스타민 치료의 30 분 이내에 관찰된 히스타민 과민증을 감소시킨 것으로 보인다 22.2 ±10.2% vs 70 ±12.2% (도 4B).
실시예 4. 투과성 중재자가 유발하는 전신 및 피부의 혈관 누출은 PMC-403 전처리에 의해 감소한다.
SCLS 환자와 마찬가지로 SJL 마우스에서 혈관 누출은 주로 골격근과 피부에서 보고되었다. 동물의 혈관 누출 정도를 평가하기 위해 노화된 마우스에 알부민 결합 염료인 에반스 블루 (EB)를 정맥 내 (r.o.)로 전신 투여한 다음, 준치사량 (sublethal doses)의 히스타민 (2.5 mg/kg)을 전신 (i.p.) 투여하였다. SJL 마우스는 주로 골격근과 피부에 혈관 누출을 보였으며 각각 약 6.2 ±1.1 배와 1.7 ±0.2 배였다 (도 5A-C). 그러나, 이들 마우스를 mIgG2a항체가 아닌 PMC-403으로 전처리하면, 혈관 누출 표현형의 역전이 관찰되었다(도 5D-F). 히스타민의 전신 투여는 전신에 영향을 미치고 피부 혈관계를 선택적으로 묘사하지만 마일즈 분석을 사용하기로 결정했다. 투과성 중재자를 피부에 접종하고 미세피부혈관계 (microdermalvasculature)의 누출도를 EB의 전신 투여에 의해 평가한다. 먼저, PMC-403 또는 mIgG2a항체를 2시간 동안 정맥내 주사한 후, EB를 r.o. 을 통해 전신 투여한 다음, 이어서 히스타민을 피내 주사하였다 (도 6A). 피부 생검 후 혈관외 누출 EB를 추출하고 정량화했다 (도 6B). mIgG2a마우스에서는 미세혈관누출이 분명하고 용량 의존적이었지만 PMC-403으로 전처리한 동물에서는 누출이 3-4 배 감소했다 (도 6C). SCLS 환자는 표피 미세 혈관계가 히스타민에 노출되면 과민성을 나타내지만, 에피소드 혈청에서 혈관신생 투과성 인자 VEGF 수준의 증가로 보면 마일즈 분석에서 VEGF의 사용이 생리학적으로 더 관련될 수 있음을 시사한다. SJL 마우스에 다양한 용량의 VEGF를 피내 접종하여 피부 누출 반응을 평가했다 (도 7). 미세 혈관 누출은 분명하고 mIgG2a마우스에서 용량의존적이었지만 PMC-403으로 전처리 한 동물은 누출을 각각 1000ng 및 250ng 접종으로 2.8 ± 1.0 배에서 5.1 ± 3. 5배 유의하게 감소시켰다(도 6C).
요약하면, Tie2 수용체 활성화 항체 (PMC-403)를 SCLS 환자 유래의 내피세포 생체외에서 사용하고, SCLS 감수성 마우스 모델 (SJL)의 생체내에서 사용하였다. 혈관 누출 중재자 (히스타민, VEGF, LPS 및 TNFα)에 노출된 경우, 환자 유래의 내피세포는 아이소타입 컨트롤 항체가 아닌 PMC-403으로 전처리되었을 때 세포간 상호작용을 유지했다. 게다가, SJL 마우스에게 PMC-403 항체를 투여하면, 치사량의 히스타민에 노출되었을 때 생존율이 크게 개선되었고, 히스타민에 대한 과민증도 크게 회복되었다. 아마도 가장 흥미로운 관찰은 PMC-403으로 전처리된 동물이 히스타민 또는 VEGF에 노출되었을 때 전신 또는 피부의 혈관누출이 과도하게되는 경향이 없었다는 것이다. 마지막으로 호흡기 감염에 의해 유발된 혈관 투과성 항진도 개선되는 것으로 보인다. 전반적으로, 이러한 관찰은 PMC-403이 혈관 장벽 기능에 대한 조절 장애가 있는 SCLS와 같은 질병의 잠재적인 치료제로 간주될 수 있다는 견해를 지지한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명을 통해 Tie2 수용체 활성화 제제의 신규 용도 즉, 전신 모세혈관 누출 증후군의 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (8)

  1. Tie2 수용체 활성화 제제를 포함하는 전신 모세혈관 누출 증후군 (SCLS: systemic capillary leak syndrome)의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Tie2 수용체 활성화 제제는 Tie2 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7의 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 경쇄 가변영역을 포함하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 Tie2 수용체 활성화 제제는 혈관 누출 유도제 (vascular leakage mediators)에 노출된 혈관 내피세포의 보호 반응을 통해 혈관 누출을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Tie2 수용체 활성화 제제는 혈관 누출 유도제에 대한 과민증을 개선시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 혈관 누출 유도제는 히스타민, VEGF (vascular endothelial growth factor), LPS (lipopolysaccharide) 및 TNFα (Tumor necrosis factor-α)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 Tie2 수용체 활성화 제제는 호흡기 바이러스 감염에 의해 유발된 혈관 투과성 항진 (vascular hyperpermeability)을 완화시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
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