WO2024167348A1

WO2024167348A1 - 의료용 티로시나아제를 위한 단백질 공학 전략 및 이의 응용

Info

Publication number: WO2024167348A1
Application number: PCT/KR2024/001920
Authority: WO
Inventors: 김병기; 이욱재; 김은정
Original assignee: Seoul National University R&DB Foundation
Current assignee: SNU R&DB Foundation
Priority date: 2023-02-10
Filing date: 2024-02-08
Publication date: 2024-08-15
Anticipated expiration: 2025-08-10
Also published as: KR20240125853A

Abstract

본원발명은 의료용 티로시나아제를 위한 단백질 공학 전략 및 이의 응용에 관한 것이다. 본원발명은, 티로시나아제를 의료용 단백질로 사용하기 위한 두 가지 단백질 공학 전략을 제시하고 있다. 첫 번째는 의료용 티로시나아제의 허가 과정의 간소화를 위해 두 개의 서브 유닛으로 구성된 티로시나아제를 하나로 연결시켜주는 전략이고, 두 번째는 응집현상이 일어나지 않도록 하는 돌연변이를 일으키는 전략이다. 본원발명은 티로시나아제의 활성 감소를 잃으키지 않는 단백질 공학을 제시하고 있기 때문에 효소 공학적인 관점에서 큰 의미를 가지며, 티로시나아제를 이용하는 다양한 응용 및 산업 분야에 적용할 수 있다는 점에서 시사하는 바가 크다. 또한, 본원발명은 의료용 단백질로 사용하기 위한 전략이므로, 티로시나아제 효소에 한정되는 것이 아니라, 다양한 단백질들을 단백질 공학적으로 돌연변이를 일으키거나 융합 단백질을 만들 때, 이용할 수 있는 방법으로 활용 가치가 높다.

Description

의료용 티로시나아제를 위한 단백질 공학 전략 및 이의 응용

본원발명은 티로시나아제를 의료용 단백질로 사용하기 위한 단백질 공학 전략에 관한 것이다.

티로시나아제 (EC 1. 14. 18. 1) 는 티로신 (L-Tyrosine) 을 다이하이드록시페닐알라닌 (L-Dihydroxyphenylalanine, L-DOPA) 으로 하이드록실화시키고, 추가적인 산화과정을 통해 퀴논 (Quinone) 을 만드는 효소이다. 티로시나아제의 기질은 티로신에만 한정되지 않으며, 티로시나아제는 모노페놀형 기질에 전반적으로 작용하는 높은 기질 특이성을 보인다.

티로시나아제의 반응을 통해 퀴논형의 물질이 생산되면, 주변의 다른 페놀, 아민, 티올 그룹들과 같은 친핵체들과 함께 마이클 어디션 (Michael Addition) 반응이나 쉬프 베이스 (Schiff's Base) 반응을 통해 가교를 이룰 수 있게 된다. 이러한 이유로 카테콜 (Catechol) 형 물질의 생산이나 멜라닌을 생산하는 연구들이 많이 수행된바 있다. 또 다른 측면으로는, 생체 고분자에 모노페놀형 물질을 접합하여, 가교를 통해 생체재료를 만들거나 코팅을 하는 연구가 많이 진행되고 있다. 이렇게 생체고분자의 가교를 하이드로젤 생산, 스캐폴드 생산 및 세포 코팅 등에 적용하는 연구가 진행된 바 있다.

티로시나아제의 단백질 공학은 굉장히 까다롭게 여겨진다. 티로시나아제는 제 3 형 구리 함유 효소로, 돌연변이가 생기게 되면 활성을 잃기 때문이다 (비특허문헌 1). 티로시나아제를 이용한 단백질 공학으로, 광활성화 티로시나아제를 생산하여 빛에 의해 티로시나아제가 활성화되고, 생체 내에서 멜라닌을 합성할 수 있는 기술이 보고된 바 있다 (비특허문헌 2).

한편, 방선균 유래 티로시나아제는 단백질 구조상 평평한 구조를 가지고 있다고 보고된 바 있어서, 생체 고분자 기질에 높은 활성을 가지고 있다. 단백질 기질인 젤라틴과 티라민을 치환한 히알루론산에서, 방선균 유래 티로시나아제가 버섯 유래 티로시나아제와 바실러스 메가터리움 유래 티로시나아제보다 훨씬 더 높은 활성을 보인 사례가 보고되었다 (비특허문헌 3). 상기 비특허문헌 3 에서, 1w% 티라민 치환 히알루론산과 3w% 젤라틴이 가교화되는 시간을 측정하였을 때, 50초 이내로 젤화가 이루어지는 것이 확인되었다. 또한, 항염증 효과를 위해 티라민 치환 히알루론산과 에피갈로카테킨 갈레이트 치환 히알루론산을 섞은 조합으로 티로시나아제가 7초 이내에 젤화가 이루어진 것을 확인한 사례가 보고되었다 (비특허문헌 4). 이와 같이 방선균 유래 티로시나아제를 이용한 하이드로젤 가교 연구가 많이 진행된 바 있다.

또 다른 연구로는, 방선균 티로시나아제를 이용한 고분자 가교를 통해 세포를 코팅할 수 있고, 이렇게 코팅된 이자 베타 세포가 몸 속으로 전달되어 면역 반응을 회피할 뿐만 아니라, 성공적으로 인슐린을 분비할 수 있다는 사례가 보고되었다 (비특허문헌 5). 이와 같이, 방선균 티로시나아제는 신개념 세포치료제로 각광받고 있다.

한편, 다른 방선균 유래의 티로시나아제를 이용하여 융합 단백질을 만든 것에 대한 보고가 있다 (비특허문헌 6). 상기 비특허문헌 6 에서는, 스트렙토마이세스 안티바이오티커스 (Streptomyces antibioticus) 유래의 티로시나아제를 사용하였고, MelC1 과 MelC2 를 연결하는 링커로 히스택 (His-tag) 을 이용하였다. 또한, 상기 비특허문헌 6 의 목적은 단백질의 분비를 위한 단백질 공학이다.

[선행기술문헌]

[비특허문헌]

(비특허문헌 1) Lee, Nahum, et al.　Applied microbiology and biotechnology　99.19 (2015): 7915-7924.

(비특허문헌 2) Lee, Uk-Jae, et al.　Advanced Science　9.7 (2022): 2103503.

(비특허문헌 3) Kim, Su-Hwan, et al. Biomaterials 178 (2018): 401-412.

(비특허문헌 4) Kim, Su-Hwan, et al.　Biomaterials　242 (2020): 119905.

(비특허문헌 5) Kim, Minji, et al. Science advances　7.26 (2021): eabf7832.

(비특허문헌 6) Ryu, Jaewook, et al. Applied and environmental microbiology　85.20 (2019): e01350-19.

티로시나아제의 이종 이량체 구조는 몸 속으로 들어갔을때, 면역 반응을 일으킬 수 있는 가능성이 더 높으며, 의료용 단백질로 제조하고 사용하기 위해서는 이종 이량체 구조보다 단량체 구조가 유리하다. 또한, 단백질의 두 개의 서브 유닛에 대해 각각 의료용 허가를 받기 위해서는 두 번의 새로운 평가가 요구되어지는데, 독립적으로 단백질을 발현하고, 정제를 진행하게 되면, 단백질의 활성에도 큰 저해가 있을 것으로 판단된다. 이에, 단백질 두 개의 서브 유닛을 하나로 합쳐서 융합 단백질로 만든 후에, 의료용 단백질 평가를 진행하는 것이 효과적이다.

한편, 방선균 유래 티로시나아제는 MelC1 이라는 캐디 단백질과 MelC2 라는 촉매 단백질로 구성되어지고, MelC1 은 샤페론처럼 작용하여 MelC2 의 구조적 접힘을 돕기 때문에 발현이 필수적이다. 하지만, MelC1 과 MelC2 를 함께 발현하면, MelC1 이 응집되는 현상이 보고된바 있다 (Matoba, Yasuyuki, et al. "Activation mechanism of the Streptomyces tyrosinase assisted by the caddie protein." Biochemistry 56.41 (2017): 5593-5603). 이러한 응집현상은 단백질의 정제 후에 추가로 발생하는 손실로 여겨질 수 있고, 단백질을 분석하는 과정에서 어려움이 있으며, 효소의 정제된 산물이 일정하지 않는 단점이 있다. 특히, 질량분석의 경우에는 컬럼을 막히게 할 수 있다. 그렇기 때문에, 티로시나아제를 응집현상 없이 발현하는 기술이 요구되어진다.

본원 발명자들은, 상기한 과제를 해결하기 위하여, 티로시나아제를 의료용 단백질로 사용하기 위한 두가지 단백질 공학 전략을 제시하고 있다.

첫 번째는 의료용 티로시나아제의 허가 과정의 간소화를 위해 두 개의 서브 유닛으로 구성된 티로시나아제를 하나로 연결시켜주는 전략이고, 두 번째는 응집현상이 일어나지 않도록 하는 돌연변이를 일으키는 전략이다.

구체적으로, 본원발명은 하기를 제공한다.

[1] MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제로서, 상기 링커는 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커인, 융합 티로시나아제.

[2] [1] 에 있어서,

상기 MelC2 단백질이 링커를 통해 상기 MelC1 단백질의 C 말단에 연결되거나, 또는,

상기 MelC1 단백질이 링커를 통해 상기 MelC2 단백질의 C 말단에 연결된, 융합 티로시나아제.

[3] [1] 또는 [2] 에 있어서,

활성 pH 는 pH 6 내지 10 인, 융합 티로시나아제.

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서,

상기 티로시나아제는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 유래의 티로시나아제인, 융합 티로시나아제.

[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서,

상기 MelC1 단백질은 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 Y91F 의 변이를 포함하는 변이된 MelC1 단백질인, 융합 티로시나아제.

[6] 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 Y91F 의 변이를 포함하는 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는, 변이된 티로시나아제.

[7] [6] 에 있어서,

활성 pH 는 pH 6 내지 10 인, 변이된 티로시나아제.

[8] [6] 또는 [7] 에 있어서,

상기 티로시나아제는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 유래의 티로시나아제인, 변이된 티로시나아제.

[9] 티로시나아제를 제조하는 방법으로서,

MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커로 연결하여, MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제를 제조하는 단계, 및

상기 융합 티로시나아제를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.

[10] 하이드로젤을 합성하는 방법으로서,

MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커로 연결하여, MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제를 제조하는 단계,

상기 융합 티로시나아제를 정제하는 단계, 및

모노페놀형 구조를 갖는 화합물에 상기 융합 티로시나아제를 첨가하여, 하이드로젤을 합성하는 단계를 포함하는, 방법.

[11] 티로시나아제의 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 억제되는 티로시나아제를 제조하는 방법으로서,

서열번호 1 의 위치 91번째의 티로신을 페닐알라닌으로 치환하여 변이된 MelC1 단백질을 제조하는 단계,

상기 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는 변이된 티로시나아제를 제조하는 단계, 및

상기 변이된 티로시나아제를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.

[12] 하이드로젤을 합성하는 방법으로서,

상기 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는 변이된 티로시나아제를 제조하는 단계,

상기 변이된 티로시나아제를 정제하는 단계, 및

모노페놀형 구조를 갖는 화합물에 상기 변이된 티로시나아제를 첨가하여, 하이드로젤을 합성하는 단계를 포함하는, 방법.

본원발명에 따르면, 티로시나아제의 두 개의 서브 유닛이 하나로 연결되기 때문에, 티로시나아제 제조 시, 티로시나아제의 중합 효소로서의 장점을 유지하면서도 단백질의 분리 및 정제를 한 번만 해도 되는 효과가 있다. 또한, 본원발명은 티로시나아제를 의료용 단백질로 사용하고자 할 때 허가 과정이 간소화되는 이점이 있다.

또한, 본원발명에 따르면, 티로시나아제의 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 억제되기 때문에, 단백질의 정제 후에 추가로 발생하는 손실을 억제할 수 있고, 효소의 정제된 산물을 일정하게 수득할 수 있는 이점이 있다.

티로시나아제는 구리 함유 효소로 돌연변이를 일으키면 활성을 잃기 쉬워 연구가 상당히 까다로운 효소로 밝혀져 있다. 이에, 본원발명은 티로시나아제의 활성 감소를 잃으키지 않는 단백질 공학을 제시하고 있기 때문에 효소 공학적인 관점에서 큰 의미를 가진다. 티로시나아제는 멜라닌 합성, 하이드로젤 가교, 세포 코팅, 단백질 변형 등에 적용될 수 있기 때문에, 이러한 티로시나아제의 단백질 공학 전략은 티로시나아제를 이용하는 다양한 응용 및 산업 분야에 적용할 수 있다는 점에서 시사하는 바가 크다.

또한, 본원발명은 의료용 단백질로 사용하기 위한 전략이므로, 티로시나아제 효소에 한정되는 것이 아니라, 다양한 단백질들을 단백질 공학적으로 돌연변이를 일으키거나 융합 단백질을 만들 때 이용할 수 있는 방법으로 활용 가치가 높다.

본원발명은 티로시나아제를 의약품으로 사용하기 위한 단백질의 공학적 방법 및 자체적 물질에 대한 내용을 모두 포함한다.

도 1 은 야생형 티로시나아제와, 본원발명에 따른 변이 티로시나아제 및 융합 티로시나아제를 비교한 모식도이다.

도 2 는 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 유래 티로시나아제의 구조 (PDB ID: 6J2U) 를 이미지화한 것이다.

도 3 은 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 유래 티로시나아제의 MelC1 단백질에 Y91F 돌연변이를 수행한 SaTYR Y91F 의 발현 양상이다.

도 4 는 대조군 (SaTYR WT) 과 돌연변이군 (SATYR Y91F) 의 SDS-PAGE 분석 결과이다.

도 5 는 대조군 (SaTYR WT) 과 돌연변이군 (SATYR Y91F) 의 활성을 비교한 결과이다.

도 6 은 돌연변이군 (SATYR Y91F) 의 pH 에 따른 활성을 평가한 결과이다.

도 7 은 본원발명에 따른 융합 티로시나아제의 구성 및 모식도이다.

도 8 은 융합 티로시나아제의 SDS-PAGE 분석 결과이다.

도 9 는 융합 티로시나아제의 pH 에 따른 활성을 평가한 결과이다.

도 10 은 융합 티로시나아제의 발현 후 세포 배양액이다.

도 11 은 융합 티로시나아제의 활성을 분석한 결과이다.

도 12 는 링커의 유연성에 따른 융합 티로시나아제의 활성을 비교한 결과이다.

도 13 은 링커의 길이에 따른 융합 티로시나아제의 SDS-PAGE 분석 결과이다.

도 14 는 링커의 길이에 따른 융합 티로시나아제의 활성을 비교한 결과이다.

도 15 는 개량 티로시나아제의 젤화를 나타낸 결과이다.

이하, 본원발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본원발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본원발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

한 구현예에서, 본원발명은 MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제로서, 상기 링커는 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커인, 융합 티로시나아제에 관한 것이다.

한 구현예에서, 본원발명의 융합 티로시나아제는 MelC2 단백질이 링커를 통해 MelC1 단백질의 C 말단에 연결되거나, 또는, MelC1 단백질이 링커를 통해 MelC2 단백질의 C 말단에 연결된다. 바람직하게는, 본원발명의 융합 티로시나아제는 MelC1 단백질이 링커를 통해 MelC2 단백질의 C 말단에 연결된다.

한 구현예에서, 본원발명의 융합 티로시나아제의 활성 pH 는 pH 6 내지 10 이고, 바람직하게는 pH 6 내지 8 이다.

한 구현예에서, 본원발명의 융합 티로시나아제의 발현 온도는 10℃내지 50℃이고, 바람직하게는 15℃내지 30℃이고, 더욱 바람직하게는 15℃내지 20℃이다.

한 구현예에서, 본원발명의 융합 티로시나아제는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 유래의 티로시나아제이고, 바람직하게는 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 유래의 티로시나아제이다.

본원발명의 융합 티로시나아제의 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질은 당해 분야에 널리 알려져 있는 단백질을 사용할 수 있다. 한 구현예에서, 본원발명의 융합 티로시나아제의 MelC1 단백질은 서열번호 1 의 MelC1 단백질이거나, 또는, 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 Y91F 의 변이를 포함하는 변이된 MelC1 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 한 구현예에서, 본원발명의 융합 티로시나아제의 MelC2 단백질은 서열번호 2 의 MelC2 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 서열번호 1 은 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 유래 티로시나아제의 야생형 MelC1 단백질의 서열이고, 서열번호 2 는 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 유래 티로시나아제의 야생형 MelC2 단백질의 서열이다.

본원발명의 융합 티로시나아제에서 MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 연결하는 링커는 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커이고, 융합 티로시나아제의 활성의 관점에서, 바람직하게는 10 내지 50개 아미노산 길이의 링커이고, 더욱 바람직하게는 10 내지 40개 아미노산 길이의 링커이고, 가장 바람직하게는 10 내지 30개 아미노산 길이의 링커이다.

본원발명의 융합 티로시나아제에서 MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 연결하는 링커는 당해 분야에 널리 알려져 있는 링커를 사용할 수 있다.

본원발명의 융합 티로시나아제의 활성의 관점에서, MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 연결하는 링커는 가요성 링커 (flexible linker) 일 수 있다. 본원발명의 융합 티로시나아제에서 사용될 수 있는 가요성 링커는 당해 분야에 널리 알려져 있는 가요성 링커를 사용할 수 있다. 예를 들어, Gly 및 Ser 으로 이루어진 링커를 사용할 수 있고, 서열번호 3 내지 6 에서 선택되는 어느 하나의 링커일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

다른 구현예에서, 본원발명은 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 Y91F 의 변이를 포함하는 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는, 변이된 티로시나아제에 관한 것이다.

한 구현예에서, 본원발명의 변이된 티로시나아제의 활성 pH 는 pH 6 내지 10 이고, 바람직하게는 pH 6 내지 8 이다.

한 구현예에서, 본원발명의 변이된 티로시나아제의 발현 온도는 10℃내지 50℃이고, 바람직하게는 15℃내지 30℃이고, 더욱 바람직하게는 15℃내지 20℃이다.

한 구현예에서, 본원발명의 변이된 티로시나아제는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 유래의 티로시나아제이고, 바람직하게는, 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 유래의 티로시나아제이다.

본원발명의 변이된 티로시나아제의 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질은 당해 분야에 널리 알려져 있는 단백질을 사용할 수 있다. 한 구현예에서, 본원발명의 융합 티로시나아제의 MelC2 단백질은 서열번호 2 의 MelC2 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

야생형 티로시나아제는 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 일어나는 반면, 본원발명에 따른 변이된 티로시나아제는 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 일어나지 않는다.

본원발명에 따른 융합 티로시나아제 또는 변이된 티로시나아제는 당해 분야에 널리 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다.

본원발명에 따른 융합 티로시나아제를 제조하는 방법은 MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커로 연결하여, MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제를 제조하는 단계를 포함한다. 본원발명에 따른 융합 티로시나아제를 제조하는 방법은 제조된 융합 티로시나아제를 정제하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 본원발명에 따른 융합 티로시나아제를 제조하는 방법은 서열번호 1 의 위치 91번째의 티로신을 페닐알라닌으로 치환하여 변이된 MelC1 단백질을 제조하는 단계를 포함한다. 본원발명은 티로시나아제의 두 서브 유닛인 MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 하나의 단백질로 융합하였기 때문에 티로시나아제의 중합 효소로서의 활성을 유지하면서도 하나의 단백질만 발현 및 정제하면 되는 이점을 가진다.

다른 구현예에서, 본원발명은 본원발명에 따른 융합 티로시나아제를 이용하여 하이드로젤을 합성하는 방법을 제공한다.

본원발명에 따른 하이드로젤을 합성하는 방법은 MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커로 연결하여, MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제를 제조하는 단계를 포함한다. 본원발명에 따른 하이드로젤을 합성하는 방법은 제조된 융합 티로시나아제를 정제하는 단계를 포함한다. 본원발명에 따른 하이드로젤을 합성하는 방법은 모노페놀형 구조를 갖는 화합물에 제조된 융합 티로시나아제를 첨가하여, 하이드로젤을 합성하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 본원발명에 따른 하이드로젤을 합성하는 방법은 서열번호 1 의 위치 91번째의 티로신을 페닐알라닌으로 치환하여 변이된 MelC1 단백질을 제조하는 단계를 포함한다. 본원발명은 티로시나아제의 두 서브 유닛인 MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 하나의 단백질로 융합하였기 때문에 하이드로젤 합성 시 티로시나아제의 중합 효소로서의 활성을 유지하면서도 하나의 단백질만 발현 및 정제하면 되는 이점을 가진다.

다른 구현예에서, 본원발명은 티로시나아제의 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 억제되는 티로시나아제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본원발명에 따른 티로시나아제의 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 억제되는 티로시나아제를 제조하는 방법은 서열번호 1 의 위치 91번째의 티로신을 페닐알라닌으로 치환하여 변이된 MelC1 단백질을 제조하는 단계를 포함한다. 본원발명에 따른 티로시나아제의 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 억제되는 티로시나아제를 제조하는 방법은 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는 변이된 티로시나아제를 제조하는 단계를 포함한다. 본원발명에 따른 티로시나아제의 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 억제되는 티로시나아제를 제조하는 방법은 제조된 변이된 티로시나아제를 정제하는 단계를 포함한다. 본원발명은 티로시나아제의 MelC1 단백질의 티로신 잔기를 페닐알라닌으로 치환하였기 때문에 티로시나아제의 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 억제되고, 티로시나아제의 중합 효소로서의 활성을 유지할 수 있는 이점을 가진다.

다른 구현예에서, 본원발명은 하이드로젤을 합성하는 방법에 관한 것이다. 본원발명에 따른 하이드로젤을 합성하는 방법은 서열번호 1 의 위치 91번째의 티로신을 페닐알라닌으로 치환하여 변이된 MelC1 단백질을 제조하는 단계를 포함한다. 본원발명에 따른 하이드로젤을 합성하는 방법은 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는 변이된 티로시나아제를 제조하는 단계를 포함한다. 본원발명에 따른 하이드로젤을 합성하는 방법은 제조된 변이된 티로시나아제를 정제하는 단계를 포함한다. 본원발명에 따른 하이드로젤을 합성하는 방법은 모노페놀형 구조를 갖는 화합물에 변이된 티로시나아제를 첨가하여, 하이드로젤을 합성하는 단계를 포함한다. 본원발명은 티로시나아제의 두 서브 유닛인 MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 하나의 단백질로 융합하였기 때문에 하나의 단백질만 발현 및 정제하면 되는 이점을 가진다. 본원발명은 티로시나아제의 MelC1 단백질의 티로신 잔기를 페닐알라닌으로 치환하였기 때문에 하이드로젤 합성 시 티로시나아제의 MelC1 단백질의 응집이 억제되고, 티로시나아제의 중합 효소로서의 활성을 유지할 수 있는 이점을 가진다.

하기의 실시예를 통하여 본원발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본원발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본원발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험예 1 : 의료용 티로시나아제의 돌연변이 잔기 선정

키메라 소프트웨어 (Chimera software) 를 이용하여, 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 유래의 티로시나아제의 구조 (PDB ID: 6J2U) 를 이미지화하였고, MelC1 의 Y 잔기를 확인하였다. 그 결과, Y45, Y65, Y91 의 총 3개의 티로신 잔기를 찾을 수 있었고, Y91 잔기가 가장 외부에 노출되어 있어, 티로시나아제 반응시 가교 결합이 일어나는 것으로 예상할 수 있었다. 결과를 도 2 에 나타낸다.

실험예 2 : 티로시나아제 돌연변이 균주의 발현 평가

구조적 분석을 통해 선정된 MelC1 의 Y91F 돌연변이를 수행하였다. 티로시나아제를 제조하기 위해 대장균 (E.coli) BL21(DE3) 에 플라스미드를 넣는 형질전환을 진행하였다. pETDuet 벡터에 MelC1 유전자와 MelC2 유전자를 넣어준 후에, 서열번호 1 의 MelC1 단백질에 Y91F 돌연변이를 도입하였다.

형질전환된 대장균을 100 μg/mL 농도의 암피실린의 LB (Luria Beratni) 고체 배지에 도포하여 콜로니를 얻었다. 그 콜로니를 4 ml의 LB 액체 배지에서 하룻밤 동안 37℃, 200 rpm 조건에서 배양하였다. 50 ml의 멸균된 TB 배지 (Terrific broth) 에 100 μg/mL 농도의 암피실린을 넣어주고, 이전의 배양액의 4 ml을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 배양하였으며, OD₆₀₀이 0.6 - 0.8에 도달하였을때, 0.05 mM IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside) 와 1mM 의 CuSO₄를 넣어주었다. 이를 각각 18℃와 25℃ 및 200 rpm 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. 단백질을 수득하기 위해, 4,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 세포를 수득하였고, 50 mM 의 Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0) 5 mL 을 첨가하여 세포를 세척하였다. 여기에 다시 50 mM 의 Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0) 5 mL 을 넣은 후, 초음파 파쇄기 (Vibra & cell, USA) 를 이용하여 세포 파쇄를 수행하였다. 세포 파쇄액을 총 분획 (Total Fraction, T) 로 명명하고, 세포 파쇄액을 1.7 mL 튜브에 분주하고, 16,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 단백질을 포함하는 세포 추출액의 가용성 분획 (Soluble Fraction, S) 을 얻었다. 그리고, 이를 SDS-PAGE 로 확인한 결과, 18 ℃의 발현 조건에서 더 많은 단백질이 발현되고, 용해도가 높다는 것을 알 수 있었다. 결과를 도 3 에 나타낸다.

실험예 3 : 돌연변이 티로시나아제의 가교 평가

스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 유래 티로시나아제 대조군 (SaTYR WT) 과 Y91F 돌연변이군 (SaTYR Y91F) 에 대하여, 실험예 2 의 과정을 거쳐 얻은 세포 추출액을 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 히스택 (His-tag) 정제를 진행하였다. 먼저, 1 컬럼 부피 (column volumne) 의 프리-바인딩 완충용액 (pre-binding buffer) (5 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl 완충용액) 을 이용하여, Ni-NTA 의 활성을 유도하고, 세포 추출액을 Ni-NTA 컬럼에 통과시켜 티로시나아제를 컬럼에 결합시킨 뒤, 2 배의 컬럼 부피의 세척 완충용액 (wash buffer) (25 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl 완충용액) 을 이용하여, Ni-NTA 컬럼에 강하게 결합하지 않은 불순물들을 제거하였다. 마지막으로 용출 완충용액 (elution buffer) (250 mM 이미다졸, 50 mM Tris-HCl) 을 이용하여, Ni-NTA 컬럼으로부터 티로시나아제를 분리해낸 뒤, 이미다졸을 1/2500 수준으로 희석하기 위해 10k 필터를 이용하고 50 mM Tris-HCl 로 완충용액을 교체하여 정제된 티로시나아제를 수득하였다. 그리고, 이를 SDS-PAGE 로 확인한 결과, 대조군에서는 가교가 일어난 티로시나아제가 SDS-PAGE 상단부에 관찰되는 것을 확인할 수 있었고 (상단의 파란색 화살표), 반면, SaTYR Y91F 돌연변이주에서는 가교가 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 결과를 도 4 에 나타낸다.

실험예 4 : 돌연변이 티로시나아제의 활성 평가

정제된 SaTYR WT 와 SaTYR Y91F 의 활성을 비교하고자 티로시나아제 활성 평가를 진행하였다. 1 mM L-티로신, 200 nM SaTYR, 10 μM CuSO₄ 를 50 mM 의 Tris-HCl (pH 8.0) 를 첨가하고, 37 ℃ 조건에서 30 초마다 475 nm에서의 흡광도를 조사하였다 (N = 4). 도파 크롬 (Dopachrome) 의 흡광계수 (3600 M^-1cm^-1) 를 이용하여 도파크롬의 생산량을 계산하였다. 그리고, 초기 속도를 계산하기 위해, 10 분 이하에서의 그래프 기울기를 계산하였다. 그 결과, SaTYR Y91F 돌연변이가 대조군보다 높은 도파크롬 생산량을 보였고, 빠른 시간 내에 활성을 보였으며, 초기 속도도 약 1.76배 향상된 결과를 보였다. 결과를 도 5 에 나타낸다.

실험예 5 : 돌연변이 티로시나아제의 pH에 따른 활성 평가

정제된 SaTYR Y91F 돌연변이의 활성을 pH 에 따라 비교하고자 티로시나아제 활성평가를 진행하였다. 1 mM L-티로신, 200 nM SaTYR, 10 μM CuSO₄ 를 각각 서로 다른 pH 를 갖는 50 Mm 의 완충용액과 37 ℃ 조건에서 30 초마다 475 nm에서의 흡광도를 조사하였다(N = 4). pH 완충용액은 pH 3, 4, 5, 6 에서는 시트레이트 완충용액, pH 7 에서는 소듐 포스페이트 완충용액, pH 8, 9 에서는 Tris-HCl 완충용액을 사용하였다. 도파크롬(Dopachrome)의 흡광계수 (3600 M^-1cm^-1) 를 이용하여 도파크롬의 생산량을 계산하였다. pH 6, 7, 8, 9 에서 티로시나아제의 활성이 관찰되었다. 결과를 도 6 에 나타낸다.

실험예 6 : 융합 티로시나아제의 구축

티로시나아제를 의료용 단백질로 사용할 때 허가 받아야 할 과정을 줄이고자, MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 융합하여 1개의 단백질로 만드는 단백질 공학을 적용하였다. MelC1-MelC2 순서로 단백질을 연결시켜주기 위해 서열번호 3 의 링커를 연결해주었다. MelC2-MelC1 순서로 단백질을 연결시켜, 융합 단백질의 활성을 링커의 유연성 (flexibility) 에 따라 비교하기 위해 다음과 같이 링커를 구성하였다.

flexible 1 : SGGSGGSGGSAG (서열번호 4), flexible 2 : GGGGSGGGGS (서열번호 5), rigid : AEAAAKEAAAKA (서열번호 6)

실험예 7: 융합 티로시나아제(MelC1-MelC2)의 발현 및 활성 분석

MelC1-MelC2 순서로 융합된 티로시나아제의 발현을 확인하였다. 서열번호 1 에 Y91F 돌연변이를 도입한 MelC1 단백질과 서열번호 2 의 MelC2 단백질을 사용하였다.

총 분획 (T), 가용성 분획 (S), 그리고 정제 후 용출액 (Elution, E) 을 각각 받아서, SDS-PAGE 분석을 한 결과, 발현이 정상적으로 이루어지고 정제 또한 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군 티로시나아제의 활성과 비교한 결과 약 33% 의 활성을 보이는 것을 확인하였다. 결과를 도 8 및 도 9 에 나타낸다.

실험예 8 : 융합 티로시나아제(MelC2-MelC1)의 발현 및 활성 분석

MelC2-MelC1 순서로 융합된 티로시나아제의 활성 분석을 위해 티로시나아제 발현을 진행하였다. 서열번호 1 에 Y91F 돌연변이를 도입한 MelC1 단백질과 서열번호 2 의 MelC2 단백질을 사용하였다. 발현 용액에서 색이 짙어지는 것으로 보아, 티로시나아제의 활성으로 인해 멜라닌이 형성된 것으로 예상되었다. 발현한 대장균을 파쇄하여 가용성 분획을 수득한 후, 200 μl 의 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 에 L-티로신을 녹인 용액 (2 mM) 에 10 μl 의 가용성 분획을 첨가하여 하룻밤 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 그 결과, 멜라닌 생성이 확인되었다. 결과를 도 10 및 도 11 에 나타낸다.

서열번호 1 의 MelC1 단백질과 서열번호 2 의 MelC2 단백질을 사용하여 제조한 융합 티로시나아제 (MelC2-MelC1) 를 정제하여 실험예 4 와 같은 방법으로 티로시나아제의 활성을 비교한 결과, 융합 티로시나아제는 대조군의 약 53%~64% 의 활성을 보였으며, 융합 티로시나아제 간의 비교에서는 flexible 2 의 링커를 가진 단백질이 다소 높은 활성을 나타냈다. 결과를 도 12 에 나타낸다.

실험예 9 : 융합 티로시나아제(MelC2-flexible2-MelC1)의 개량

flexible 2 를 링커로서 사용한 융합 티로시나아제의 활성을 증대시킬 목적으로 링커의 길이를 조절하였다. 서열번호 1 의 MelC1 단백질과 서열번호 2 의 MelC2 단백질을 사용하였다. 링커 1X (GGGGSGGGGS; 10aa, 서열번호 5) 로부터 이의 반복 서열을 가진 2X (20aa), 3X (30aa), 4X (40aa) 링커가 삽입된 4종의 융합 티로시나아제를 제조하였고, 이를 발현 후 정제하여 실험예 4 와 같은 방법으로 활성을 확인하였다. 융합 티로시나아제의 활성은 2X (20aa) 링커가 삽입된 단백질의 도파크롬 생산량이 가장 높게 나타났다. 결과를 도 13 및 도 14 에 나타낸다.

실험예 10 : 하이드로젤 가교제로서의 티로시나아제

티로시나아제를 가교제로 활용할 수 있으므로 실험예 9 에서 제조한 개량된 티로시나아제를 이용하여 하이드로젤화되는 시간을 비교하였다. 서열번호 1 의 MelC1 단백질과 서열번호 2 의 MelC2 단백질을 사용하였다. 1% HA-티라민 200 μl 에 15 μM 의 효소를 넣고 25 ℃ 에서 30 분간 방치하였다. HA-티라민에 대한 활성은 융합 티로시나아제 3X (30aa) 가 가장 높음을 보였다. 결과를 도 15 에 나타낸다.

이는 티로신에 대한 활성도 (도 14) 와는 일치하지 않았으며, 티로시나아제 효소의 고분자 (HA-티라민) 에 대한 반응성은 상이할 수 있음을 나타낸다. 이로써, MelC2-MelC1 순서로 융합을 진행한 개량 티로시나아제가 의약품 및 가교제로서의 활용 가능성이 있음을 보였다.

발명은 의료용 티로시나아제의 단백질 공학에 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 각종 다른 의료용 단백질을 생산하기 위한 방법으로 사용될 수 있다.

Claims

MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제로서, 상기 링커는 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커인, 융합 티로시나아제.
제 1 항에 있어서,

상기 MelC2 단백질이 링커를 통해 상기 MelC1 단백질의 C 말단에 연결되거나, 또는,

상기 MelC1 단백질이 링커를 통해 상기 MelC2 단백질의 C 말단에 연결된, 융합 티로시나아제.
제 1 항에 있어서,

활성 pH 는 pH 6 내지 10 인, 융합 티로시나아제.
제 1 항에 있어서,

상기 티로시나아제는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 유래의 티로시나아제인, 융합 티로시나아제.
제 1 항에 있어서,

상기 MelC1 단백질은 서열번호 1 의 아미노산 서열에서 Y91F 의 변이를 포함하는 변이된 MelC1 단백질인, 융합 티로시나아제.
서열번호 1 의 아미노산 서열에서 Y91F 의 변이를 포함하는 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는, 변이된 티로시나아제.
제 6 항에 있어서,

활성 pH 는 pH 6 내지 10 인, 변이된 티로시나아제.
제 6 항에 있어서,

상기 티로시나아제는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 유래의 티로시나아제인, 변이된 티로시나아제.
티로시나아제를 제조하는 방법으로서,

MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커로 연결하여, MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제를 제조하는 단계, 및

상기 융합 티로시나아제를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
하이드로젤을 합성하는 방법으로서,

MelC1 단백질과 MelC2 단백질을 10 내지 60개 아미노산 길이의 링커로 연결하여, MelC1 단백질과 MelC2 단백질이 링커로 연결된 융합 티로시나아제를 제조하는 단계,

상기 융합 티로시나아제를 정제하는 단계, 및

모노페놀형 구조를 갖는 화합물에 상기 융합 티로시나아제를 첨가하여, 하이드로젤을 합성하는 단계를 포함하는, 방법.
티로시나아제의 발현 시 MelC1 단백질의 응집이 억제되는 티로시나아제를 제조하는 방법으로서,

서열번호 1 의 위치 91번째의 티로신을 페닐알라닌으로 치환하여 변이된 MelC1 단백질을 제조하는 단계,

상기 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는 변이된 티로시나아제를 제조하는 단계, 및

상기 변이된 티로시나아제를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
하이드로젤을 합성하는 방법으로서,

서열번호 1 의 위치 91번째의 티로신을 페닐알라닌으로 치환하여 변이된 MelC1 단백질을 제조하는 단계,

상기 변이된 MelC1 단백질 및 MelC2 단백질을 포함하는 변이된 티로시나아제를 제조하는 단계,

상기 변이된 티로시나아제를 정제하는 단계, 및

모노페놀형 구조를 갖는 화합물에 상기 변이된 티로시나아제를 첨가하여, 하이드로젤을 합성하는 단계를 포함하는, 방법.