WO2024138753A1 - 一种hla-a*24:02限制性抗原点替换方法、获得的多肽及其应用 - Google Patents

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提供一种HLA-A*24:02限制性抗原点替换方法、获得的多肽及其应用，具体地，提供了一种筛选HLA-A*24:02 分型限制性表位抗原肽的方法，所述方法包括以下步骤:(1)在HLA-A*24:02 分型限制性表位数据中筛选数目最多、长度为9-11个氨基酸的肽段，并分析确认最保守位点及偏好氨基酸;(2)根据该偏好氨基酸在原始肽最保守位点上进行氨基酸替换，获得替换肽;(3)验证所述替换肽的功能，筛选获得替换肽。提供的替换肽具备比原始肽更强的亲和力和免疫原性，而且能够对原始型多肽负载的T2细胞或肿瘤细胞产生杀伤作用，更加适合用于未来的免疫治疗产品的开发。

Description

一种HLA-A*24:02限制性抗原点替换方法、获得的多肽及其应用 技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种HLA-A*24:02限制性抗原点替换方法、获得的多肽及其应用。
背景技术
我国每年新发癌症病例约380万，死亡人数约229万，发病率及死亡率呈现逐年上升趋势，癌症防控形势严峻。手术、化疗、放疗等传统癌症治疗手段无癌细胞特异性，适应症有限，多针对局部病灶，且有潜在副反应，患者治疗过程伴随极大痛苦。而以PD-1抗体为代表的免疫检查点抑制剂有效率低(ORR，16.3％)，CAR-T疗法局限于血液瘤、细胞因子风暴副作用强，成为了肿瘤免疫治疗行业的痛点。肿瘤特异性新生抗原疗法(Neo-T)的是个体化治疗和肿瘤免疫治疗的下一个前沿方向，其特异性强、细胞因子风暴风险低、能应用于各类实体瘤患者，已被多例临床试验结果证明。
近三年来，肿瘤免疫治疗在国内外“井喷式”发展，已有14种相关药物获批上市，被用于各种恶性肿瘤治疗。免疫治疗领域产值在2017年已经达到了1070亿美元，到2025年预计会达到1800亿美元，新抗原免疫治疗药物自2014年起，已被包括哈佛大学、德国缅因兹大学在内的多个研究团队证明了其出色的疗效和安全性，在临床研究中得到了患者和医生的认可。
然而，具备临床应用价值的新抗原必须同时具备高HLA亲和力以及强免疫原性。患者虽然肿瘤突变众多，但突变产生的新抗原难以同时具备亲和力和免疫原性，导致最终可用于治疗的新抗原少之又少，严重阻碍了新抗原免疫疗法的推广应用。本发明提出的新抗原点替换技术，能够直接提高新抗原的亲和力及免疫原性，发现更多可用于免疫治疗的新抗原靶点，让更多患者得以接受肿瘤新抗原疗法，具备广阔的市场前景。
高度变异且快速增生的肿瘤细胞往往导致细胞内的遗传不稳定性(genetic instability)，并发生大量的基因突变。癌细胞中普遍存在的基因突变及其产物是健康细胞和正常基因组中所没有的，而非同义(non-synonymous)突变的表达可以产生肿瘤特异性抗原，即所谓的新抗原(neoantigens)(Sahin U，Derhovanessian E，Miller M，et al.Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer[J].Nature，2017，547(7662):222-226.)。它们不仅是肿瘤特异性抗原，而且由于不存在中枢性耐受的基础环境，可能带有高度免疫原性，激活CD4+、CD8+T细胞产生免疫应答，成为肿瘤免疫治 疗的新靶点，且具备构建癌症疫苗的理想条件。
癌症新抗原免疫治疗，是通过筛选新抗原靶点，然后在患者体内直接注射新抗原肽(多肽疫苗)或新抗原核酸序列(核酸疫苗)以使机体产生新抗原特异性免疫细胞攻击癌细胞，或先在体外培养制备新抗原特异性免疫细胞再注入患者体内(细胞疗法)攻击癌细胞(Ott P A，Hu Z，Keskin D B，et al.An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma[J].Nature，2017，547(7662):217-221.)。
衡量新抗原是否是免疫治疗有效靶点的关键是多肽能否结合到靶细胞表面的HLA分子(亲和力)，并刺激T细胞活化、增殖并杀伤靶细胞(免疫原性)。既往研究表明，患者体内能产生的同时具备HLA亲和力和免疫原性的新抗原数目极少，影响了免疫治疗的效果，而对于本身肿瘤突变负荷(tumor mutational burden，TMB)较低的患者，这一问题则更为严重，可能导致患者因缺乏靶点而无法接受免疫治疗。新抗原作为短肽，其亲和力及免疫原性主要由其序列首尾的HLA锚点氨基酸以及序列中部的TCR锚点决定，改变这些锚点氨基酸显然也会影响新抗原的免疫学功能(Pathangey L B，Lakshminarayanan V，Suman V J，et al.Aberrant glycosylation of anchor-optimized MUC1 peptides can enhance antigen binding affinity and reverse tolerance to cytotoxic T lymphocytes[J].Biomolecules，2016，6(3):31。Menez-Jamet J，Gallou C，Rougeot A，et al.Optimized tumor cryptic peptides:the basis for universal neo-antigen-like tumor vaccines[J].Annals of Translational Medicine，2016，4(14).)。本发明即提出了一种通用的氨基酸点替换技术，能够对HLA-A*24:02分型的新抗原进行序列优化，从而获得高亲和力和免疫原性的新抗原，并应用于免疫治疗。
Yu H，Li J，Yuan Y，et al.Residue substitution enhances the immunogenicity of neoepitopes from gastric cancers[J].Cancer Biology&Medicine，2021，18(4):1053.该文献阐述了一项对胃癌新抗原进行氨基酸替换以增强其免疫原性的研究，但仅限HLA-A*02:01限制性表位，且未阐明该种方案应如何应用于实际治疗。
公开号EP1911461B1公布了多条HPV E6和E7蛋白来源的抗原表位及其点替换肽，但仅限HLA-A*02:01限制性表位，且均为病毒序列来源，并非新抗原。
Pathangey L B，Lakshminarayanan V，Suman V J，et al.Aberrant glycosylation of anchor-optimized MUC1 peptides can enhance antigen binding affinity and reverse tolerance to cytotoxic T lymphocytes[J].Biomolecules，2016，6(3):31.该文献阐述了一项对肿瘤相关抗原(MUC1)进行氨基酸替换以增强其免疫原性的研究，但仅限HLA-A*02:01限制性表位，也并非新抗原。
以上技术存在的共同缺陷：
1)部分技术直接使用新抗原作为治疗靶点，其本身的亲和力及免疫原性未经过优化改良，可能不足以诱导足够的免疫反应，导致免疫治疗的抗癌作用有限。
2)部分技术使用氨基酸点替换后的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)作为治疗靶点，其本身的亲和力及免疫原性虽然经过优化改良，但是受限于TAA也同时存在于正常细胞，因而有潜在的脱靶风险，可能引起不良反应。同时，TAA的基因突变虽然是患者高频，但也并非所有患者均携带，因而其技术应用范围有限。
3)氨基酸点替换方案仅针对欧美人群高频的HLA-A02:01限制性抗原肽，而对中国人群高频的HLA-A*24:02限制性抗原肽未能提供氨基酸替换方案。
细胞免疫是一种不涉及抗体，而是由T细胞介导的机体自然免疫应答，即T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为致敏T细胞，对表达抗原的细胞进行直接杀伤或释放细胞因子进行协同杀伤的过程。表达抗原的细胞能够通过蛋白酶体、内质网、高尔基体的协作，将抗原多肽呈递到细胞表面的HLA I类分子上，之后T细胞表面的T细胞受体(T cell receptor，TCR)通过与HLA和抗原结合，传导活化信号到T细胞内部，从而完成激活。在这一过程中，HLA I类分子与抗原表位的结合主要通过HLA蛋白亚基与抗原多肽的氨基酸之间形成共价键，而多肽上的不同位点对结合的贡献程度不同。与HLA锚点通常位于抗原两端不同的是，TCR锚点通常位于抗原的中间，如第四位到第六位。正是由于TCR锚点与HLA锚点的不重合，使得两者与抗原的结合能够互不影响。
发明内容
为了解决现有技术中的技术问题，本发明提供了一种HLA-A*24:02限制性抗原点替换方法、获得的多肽及其应用。本发明提出的抗原点替换方法，其核心是优化肿瘤抗原的氨基酸序列以获得免疫功能(HLA亲和力、免疫原性等)更强的肿瘤抗原，并应用于各类癌症的免疫治疗或预防，其应用方式包括但不限于细胞制剂、核酸疫苗、多肽疫苗、抗体、小分子药物等。
本发明提供了一种HLA-A*24:02限制性抗原肽的氨基酸替换方法，能够用于获取新的、更好的免疫治疗的新抗原靶点，开发包括但不限于细胞制剂、核酸疫苗、多肽疫苗在内的多种医疗产品，用于预防或治疗癌症等相关疾病。本发明所要解决的技术问题有：
1)本发明基于对HLA-A*24:02分型序列特征的研究，确定了HLA-A*24:02限制性新抗原的点替换方案，包括替换氨基酸的具体位点及种类。
2)本发明通过实验证实了点替换新抗原具备比未替换新抗原更强的HLA-A*24:02 亲和力及免疫原性，而且采用点替换新抗原刺激诱导得到的特异性T细胞能够靶向杀伤负载未替换新抗原的靶细胞，且点替换新抗原杀伤效果强于未替换新抗原的T细胞。
3)本发明仅以新抗原特异性T细胞作为实施例，但本发明的应用范围并不局限于T细胞药物研发，还有其他不同应用形式，如DNA疫苗、mRNA疫苗、DC疫苗、靶向替换肽抗原的抗体药物、靶向替换肽抗原的小分子药物等。
本发明根据对HLA锚点和TCR锚点的先验知识，对抗原表位上的氨基酸进行替换，从而改善抗原表位的亲和力及免疫原性。
本发明提出了一种新抗原点替换技术方案。基于该技术方案，本发明在实施例中以4条新抗原(以下简称“原始肽”)为原型，替换了其一个或多个氨基酸位点，累计得到了14条点替换新抗原(以下简称“替换肽”)，并通过实验验证了替换肽与HLA-A24:02分子的高亲和力及免疫原性，并证明了采用替换肽刺激诱导产生的抗原特异性T细胞，能够对原始肽负载的T2细胞或肿瘤细胞产生交叉反应，且细胞杀伤效果强于原始肽刺激诱导产生的抗原特异性T细胞。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种筛选HLA-A*24:02分型限制性表位抗原肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在HLA-A*24:02分型限制性表位数据中筛选数目最多、长度为9-11个氨基酸的肽段，分析所述肽段的序列保守性，确认最保守位点及偏好氨基酸；
(2)根据(1)所获得的偏好氨基酸，在原始肽对应肽段的最保守位点上进行氨基酸替换，获得替换肽；
(3)验证所述替换肽的功能，筛选获得亲和力高于原始肽的替换肽。
本发明中，HLA-A*24:02分型限制性表位数据可以从例如IEDB数据库(https://www.iedb.org/)中下载。术语“最保守位点”是指该位点上最高频氨基酸的出现频率高于其他位点的相应值。最保守位点指该位点上最高频氨基酸的出现频率高于其他位点的相应值，本领域技术人员将各位点的最高频氨基酸的出现频率按大小排序，根据需要可以获得top1、top2、top3、top5等位点，并称之为最保守位点。
所述原始肽是SK-MEL-5细胞系HLA-A*24:02的限制性新抗原，其可以从从TRON数据库(http://celllines.tron-mainz.de/)中下载获得，且预测的亲和力IC50高于50nM。所述亲和力例如可以通过netMHCpan进行预测。
在某些实施方案中，(1)中，确认所述最保守位点为肽段的第一位、第二位和最末位氨基酸；优选地，第一位的偏好氨基酸为V或I，第二位的偏好氨基酸为Y或F，最末位的偏好氨基酸为F、L或I。
其中第二和最末位置的氨基酸被称为主要锚点，其第一、第三等位置的氨基酸被称为次要锚点。由于不同的HLA分子具有不同的结合受体区域，因而不同的HLA分子的结合抗原表位具有不同的序列保守性特征。以HLA-A*24:02为例，这种保守性特征体现为该HLA分子所结合抗原肽的第一个氨基酸倾向于V/I，第二个氨基酸倾向于Y/F，而最末位氨基酸倾向于F/L/I。与之类似的是，TCR分子与多肽的结合也具有锚点和序列保守性特征。
在某些实施方案中，(2)中，将所述原始肽的第一位氨基酸替换为V，第二位氨基酸替换为Y或F，和/或最末位氨基酸替换为F或L。
本领域技术人员皆知，当所述原始肽对应的最保守位点上的氨基酸即为偏好氨基酸时，无需进行氨基酸替换；当所述原始肽对应的最保守位点上的氨基酸不为偏好氨基酸时，则进行氨基酸替换。在某些实施方案中，
所述原始肽的第一位氨基酸替换为V，最末位氨基酸替换为F；
所述原始肽的第一位氨基酸替换为V；
所述原始肽的第一位氨基酸替换为V，最末位氨基酸替换为F；或，
所述原始肽的第二位氨基酸替换为Y和最末位氨基酸替换为F。
在某些实施方案中，(2)中，当所述替换肽为9肽或11肽时，所述替换肽的第一位氨基酸为V或R，第二位氨基酸为Y或F和最末位氨基酸为F。
在某些实施方案中，当所述替换肽为9肽时，
所述替换肽的第一位氨基酸为V，第二位氨基酸为Y和最末位氨基酸为F，或，
所述替换肽的第一位氨基酸为V，第二位氨基酸为F和最末位氨基酸为F，或，
所述替换肽的第一位氨基酸为R，第二位氨基酸为Y和最末位氨基酸为F；
所述替换肽为11肽时，所述替换肽的第一位氨基酸为V，第二位氨基酸为Y和最末位氨基酸为F。
本发明第二方面提供多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:25-36中的任一个序列所示。
优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、27、29、32、33、34或35所示。
更优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、29、34或35所示。
本发明第三方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码如本发明第二方面所述的多肽。
本发明第四方面提供一种多肽疫苗，其包括一种或多种如本发明第二方面所述的多肽。
本发明第五方面提供一种核酸疫苗，其包括一种或多种如本发明第三方面所述的核 酸。
本发明第六方面提供一种抗原特异性免疫细胞，其在体外将一种或多种如本发明第二方面所述的多肽与免疫细胞共培养获得。
在某些实施方案中，所述免疫细胞为T细胞或DC细胞。优选地，所述T细胞为CD4+或CD8+T细胞。
本发明第七方面提供一种如本发明第二方面所述的多肽或本发明第三方面所述的核酸在制备疫苗或抗体中的应用。
在某些实施方案中，所述疫苗为多肽疫苗、核酸疫苗或DC疫苗。
在某些实施方案中，所述核酸疫苗为DNA疫苗或mRNA疫苗。
本发明的积极进步效果：
本发明设计的抗原点替换技术是一种HLA-A*24:02限制性新抗原优化的通用型方案，基于该技术得到的替换肽能够用于治疗包括实施例中黑色素瘤在内的多种癌症疾病。替换肽由于优化了其HLA锚点，因而具备了比原始肽更强的亲和力和免疫原性，而且由点替换肽刺激得到的特异性T细胞制剂，能够对原始型多肽负载的T2细胞或肿瘤细胞产生杀伤作用，这种杀伤作用要远远强于直接用原始肽刺激得到的T细胞制剂。因而替换肽更加适合用于未来的免疫治疗产品的开发。
附图说明
图1为本发明技术路线示意图。
图2为HLA*A24:02限制性表位的长度分布示意图。
图3为HLA*A24:02限制性表位的8个氨基酸长度序列保守性特征示意图。
图4为HLA*A24:02限制性表位的9个氨基酸长度序列保守性特征示意图。
图5为HLA*A24:02限制性表位的10个氨基酸长度序列保守性特征示意图。
图6为HLA*A24:02限制性表位的11个氨基酸长度序列保守性特征示意图。
图7为HLA*A24:02限制性表位的12个氨基酸长度序列保守性特征示意图。
图8为HLA*A24:02限制性表位的13个氨基酸长度序列保守性特征示意图。
图9为HLA*A24:02限制性表位的14个氨基酸长度序列保守性特征示意图。
图10为HLA*A24:02限制性表位的15个氨基酸长度序列保守性特征示意图。
图11为CTL特异性杀伤呈递原始肽的靶细胞(NO:1c批次)。
图12为CTL特异性杀伤呈递原始肽的靶细胞(NO:3a批次)。
图13为CTL特异性杀伤呈递原始肽的靶细胞(NO:4e批次)。
图14为CTL特异性杀伤呈递原始肽的靶细胞(NO:4f批次)。
图15为CTL抑制小鼠肿瘤生长。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
1、多肽的氨基酸替换及预测打分：
从IEDB数据库(https://www.iedb.org/)中下载HLA-A*24:02分型限制性的抗原表位数据，并分析序列保守性特征，确认其在HLA锚定位的偏好氨基酸，即第一位最偏好氨基酸V,第二位最偏好氨基酸Y，最末位最偏好氨基酸F。从TRON数据库(http://celllines.tron-mainz.de/)中下载获得SNU-5细胞系HLA-A*24:02限制性新抗原数据，即为原始肽。挑选任意数目的高亲和力的原始肽，将其相应HLA锚定位依据方案进行氨基酸替换，获得替换肽，并对原始肽和替换肽进行netMHCpan亲和力预测，预测所得用IC50值(单位：nM)表示，IC50值小于50表示该多肽具有高亲和力，IC50值小于500表示该多肽具有低亲和力，IC50值大于500代表该多肽不具备亲和力。人工合成对应的原始肽及替换肽。
2、多肽T2亲和力验证：
取2×10 5个T2细胞(ATCC编号CRL-1992)铺用500μl含有人类β 2微球蛋白(最终浓度，3μg/ml)的IMDM无血清培养基重悬到24孔板里，加入人工合成的替换肽(最终浓度100μM)，在培养箱(37℃，5％CO 2)，培养过夜。实验设置2个复孔：不加多肽的T2细胞被用作背景对照，加入CMV多肽(NLVPMVATV，SEQ ID NO:37)作为阳性对照。将细胞200g，离心5分钟收集细胞。细胞用PBS洗涤两次后，将细胞直接用抗相应HLA分型分子的FITC单克隆抗体(Anti-HLA-A24(Human)mAb-FITC，MBL，Code No.K0209-4)孵育，4℃维持30分钟。然后用流式细胞仪进行分析。荧光指数(FI)用下列公式计算：
FI＝[平均荧光强度(MFI)样品-MFI background]/MFI background，其中MFI background代表不含肽的值。FI>1.5表明该肽具有对所选HLA分子的高亲和性，1.0<FI<1.5表明该肽具有对所选HLA分子中等亲和力，以及0.5<FI<1.0表明该肽具有对所选HLA分子低亲和力。按同样方案对所有替换肽和原始肽进行亲和力验证。
3、抗原特异性CD8+T细胞制备
取具备相应HLA分型健康志愿者的外周血100ml，采用Ficoll淋巴细胞分离液，分离外周血单个核细胞(PBMC)，将PBMC用贴壁法获取单核细胞，并用CD8磁珠筛选PBMC细胞中的CD8+的T细胞。采用GM-CSF，IL-4，IFN-gamma，LPS，诱导贴壁细胞为成熟DC细胞，并负载替换肽。将负载多肽的成熟DC细胞与志愿者的CD8+T细胞共培养10天后，使CD8+T细胞激活成为替换肽特异性CD8+T细胞，设为实验组。按同样方案制备所有替换肽和原始肽特异性CD8+T细胞，CMV特异性CD8+T细胞，设为对照组。
4、ELISPOTs验证CD8+T细胞免疫反应
取第3步中获得的替换肽特异性CD8+T细胞与负载了原始肽或无关肽Apo I(ALADGVQKV，SEQ ID NO:1)的T2细胞，分别加入到人IFN-gamma干扰素ELISPOTs板中培养与检测。最终对ELISPOT实验产生的斑点进行计数。判定实验多肽具有免疫原性的要求如下：斑点数(多肽)/斑点数(无关肽)>2，即实验多肽引起的斑点数超过无关肽斑点数目的两倍以上。按同样方案检测所有替换肽和原始肽特异性CD8+T细胞和CMV特异性CD8+T细胞的免疫反应。
5、LDH释放实验验证CD8+T细胞杀伤活性
取第3步中获得的替换肽特异性CD8+T细胞，以及负载了原始肽或无关肽或未负载肽的T2细胞进行共孵育，并设置最大释放孔，体积校正孔，培养基对照孔，自发释放孔，不同效靶比(T细胞与T2细胞的数目比)等对照，每组设置3个复孔，4h后，取出共孵育的细胞上清50μl，加入50μl LDH底物混合液，使细胞上清催化LDH底物反应，用终止液中止反应后，读取490nm波长和680nm参考波长的OD值，根据对照孔，计算T细胞杀伤T2的杀伤活性。按同样方案检测所有替换肽和原始肽特异性CD8+T细胞的杀伤活性。
杀伤活性计算公式为：杀伤效率(％)＝(实验孔-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放+培养基孔)/(靶细胞最大释放-体积校正孔-靶细胞自发释放+培养基孔)×100％。
6、抗原特异性T细胞的宫颈癌小鼠模型药效学研究
采用64只7-9周龄的免疫缺陷NOG鼠和宫颈癌细胞株SNU-5细胞来构建皮下瘤模型，每只小鼠皮下接种2×10 6个SNU-5细胞。接种后，定期观察小鼠的肿瘤生长情况并监测瘤体积大小，肿瘤长至50-100mm 3后根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组，进行尾静脉给药。
小鼠总共分为8组：1)PBS组佐剂组，2)原始肽特异性T细胞低剂量组，3)原始肽特异性T细胞中剂量组，4)原始肽特异性T细胞高剂量组，5)替换肽特异性T细胞 低剂量组，6)替换肽特异性T细胞中剂量组，7)替换肽特异性T细胞高剂量组，8)无关肽对照T细胞高剂量组，每组各8只。其中高剂量组细胞为2×10 7/剂量，中剂量组为7×10 6/剂量，低剂量组为2×10 6/剂量，共给药2次，第一次给药结束后，7天后进行第二次给药。同时联合IL-2(5万IU/剂，每天3剂)。确定成瘤后(接种后5-8天)每2天对肿瘤长宽进行测量，测量原则：用游标卡尺卡住肿瘤边缘分别测量肿瘤游标卡尺测量肿瘤最长径(长)和最短径(宽)，记录测量数据，计算肿瘤体积。
A.肿瘤大小计算：
肿瘤体积(mm 3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。
B.疗效评价：
相对肿瘤抑制率TGI(％)：
TGI＝1-T/C(％)。T/C％为肿瘤增殖率，即在某一时间点，治疗组和对照组肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的肿瘤体积(TV)或瘤重(TW)。计算公式如下：
T/C％＝TTV/CTV*100％(TTV：治疗组平均肿瘤体积；CTV：溶媒对照组平均肿瘤体积)。
技术路线示意图如图1所示。
实施例1多肽的氨基酸替换及预测打分
从IEDB数据库(https://www.iedb.org/)中下载HLA-A*24:02分型限制性的表位数据，共得到15358条长度为8-15个氨基酸的表位。将所得表位依据序列长度分组，确定HLA-A*24:02分型限制性表位的长度集中于9-11个氨基酸(图2)。之后采用Icelogo软件(https://iomics.ugent.be/icelogoserver/)分析HLA-A*24:02分型限制性表位的序列保守性特征，蛋白背景设置为人源蛋白组数据(Swiss-Prot human database)，结果表明，HLA-A*24:02分型限制性表位的最保守的锚点为第一位、第二位和最末位，其中第一位的最保守氨基酸为V，第二位的最保守氨基酸为Y，最末位的最保守氨基酸为F(图3至图10)。
从TRON数据库(http://celllines.tron-mainz.de/)中下载获得SNU-5细胞系HLA-A*24:02限制性新抗原数据，共得到38条新抗原，即为原始肽(表1)，对原始肽进行亲和力预测。分别挑选9个氨基酸长度、10个氨基酸长度及11个氨基酸长度的最高亲和力肽段(CYPHIIRLL(SEQ ID NO:4)、RYGIKQQSLF(SEQ ID NO:11)、SYSTCNVFSGF(SEQ ID NO:17))作为候选原始肽。鉴于该3条肽段的第一位、第二位和最末位至少有一位已经是最保守氨基酸，因而另外挑选一条最末位、第一位、第二位均非最保守氨 基酸的原始肽，以便研究三位点同时替换(RFYVLPLLL(SEQ ID NO:6))。将上述4条原始肽的第一位、第二位及最末位的氨基酸逐位遍历地替换为上述分析确定相应位置的保守氨基酸，累计获得16条替换肽，对原始肽和替换肽进行亲和力预测(表2)。显然，经过点替换的新抗原具备比原始肽更强的预测亲和力。
表1 SNU-5细胞系新抗原的原始肽序列
Figure PCTCN2022144367-appb-000001
表2原始肽与替换肽的亲和力预测得分
序列简称 多肽序列 SEQ ID NO: 亲和力(nM) 类别
NO:1 CYPHIIRLL 4 41.51 原始肽
NO:1a VYPHIIRLL 25 39.87 替换肽
NO:1b CYPHIIRLF 26 11.7 替换肽
NO:1c VYPHIIRLF 27 10.31 替换肽
NO:2 RYGIKQQSLF 11 27.74 原始肽
NO:2a VYGIKQQSLF 28 27.39 替换肽
NO:3 SYSTCNVFSGF 17 93.53 原始肽
NO:3a VYSTCNVFSGF 29 73.37 替换肽
NO:4 RFYVLPLLL 6 86.71 原始肽
NO:4a VFYVLPLLL 30 195.87 替换肽
NO:4b RYYVLPLLL 31 13.43 替换肽
NO:4c RFYVLPLLF 32 14.5 替换肽
NO:4d VYYVLPLLL 33 22.01 替换肽
NO:4e VFYVLPLLF 34 30.28 替换肽
NO:4f RYYVLPLLF 35 4.9 替换肽
NO:4g VYYVLPLLF 36 7.56 替换肽
实施例2多肽T2亲和力的验证
取合成的一条替换肽，加入到2×10 5个T2细胞中，并加入人β2微球蛋白(最终浓度，3μg/ml)，培养于24孔板中，在培养箱(37℃，5％CO 2)，培养过夜。实验设置2个复孔：不加多肽的T2细胞被用作背景对照，加入CMV多肽(NLVPMVATV，SEQ ID NO:37)作为阳性对照。将细胞200g，离心5分钟收集细胞。细胞用PBS洗涤两次后，将细胞直接用FITC标记的抗HLA-A02:01的单克隆抗体孵育，4℃维持30分钟。然后用流式细胞仪(BD FACSJazz TM)及其软件检测并分析其平均荧光强度。按相同方案验证所有其他替换肽及原始肽的亲和力，实验结果如表3。显然，大多数经过点替换的新抗原具备比原始肽更强的亲和力，保留所有原始肽及具备高亲和力的替换肽开展下一步验证。
表3多肽序列的亲和力检测结果
序列简称 多肽序列 SEQ ID NO: 类别 平均荧光强度 FI 实验判别 保留
NO:1 CYPHIIRLL 4 原始肽 119 1.02 中亲和力 是
NO:1a VYPHIIRLL 25 替换肽 138 1.34 中亲和力 否
NO:1b CYPHIIRLF 26 替换肽 231 2.92 高亲和力 是
NO:1c VYPHIIRLF 27 替换肽 343 4.81 高亲和力 是
NO:2 RYGIKQQSLF 11 原始肽 89 0.51 低亲和力 否
NO:2a VYGIKQQSLF 28 替换肽 143 1.42 中亲和力 否
NO:3 SYSTCNVFSGF 17 原始肽 149 1.53 高亲和力 是
NO:3a VYSTCNVFSGF 29 替换肽 376 5.37 高亲和力 是
NO:4 RFYVLPLLL 6 原始肽 152 1.58 高亲和力 是
NO:4a VFYVLPLLL 30 替换肽 134 1.27 中亲和力 否
NO:4b RYYVLPLLL 31 替换肽 124 1.10 中亲和力 否
NO:4c RFYVLPLLF 32 替换肽 243 3.12 高亲和力 是
NO:4d VYYVLPLLL 33 替换肽 345 4.85 高亲和力 是
NO:4e VFYVLPLLF 34 替换肽 431 6.31 高亲和力 是
NO:4f RYYVLPLLF 35 替换肽 562 8.53 高亲和力 是
NO:4g VYYVLPLLF 36 替换肽 131 1.22 中亲和力 否
实施例3抗原特异性CD8+T细胞制备
取HLA-A24:02分型健康志愿者的PBMC细胞，2×10 6个PBMC细胞，用贴壁法分离单核细胞(贴3h)，以及CD8磁珠的方法分离得到CD8+的T细胞。采用GM-CSF(1000U/ml)，IL-4(1000U/ml)，诱导贴壁单核细胞为未成熟DC，再用IFN-gamma(100U/ml)、LPS(10ng/ml)以及替换肽，诱导贴壁细胞发育为成熟DC细胞。将负载一 条替换肽的成熟DC细胞辐照，并与志愿者的CD8+T细胞共培养，并加入IL-21，3天后，补加IL-2和IL-7，以后于第5，7天补加一次IL-2和IL-7，第10天取共培养的细胞进行计数，收获替换肽特异性CD8+T细胞。按相同方案制备其他所有替换肽和原始肽特异性CD8+T细胞，实验结果如表4。显然，多数经过点替换后的新抗原有利于提高T细胞培养扩增效率，保留所有培养后细胞数达到1×10 7的替换肽特异性T细胞及相应的原始肽特异性T细胞，以备后续验证。
表4 CD8+T细胞制备结果
序列简称 多肽序列 SEQ ID NO: 类别 培养前细胞数 培养后细胞数 保留
NO:1 CYPHIIRLL 4 原始肽 2×10^6 2.98×10^6 是
NO:1b CYPHIIRLF 26 替换肽 2×10^6 4.12×10^6 否
NO:1c VYPHIIRLF 27 替换肽 2×10^6 1.01×10^7 是
NO:3 SYSTCNVFSGF 17 原始肽 2×10^6 4.67×10^6 是
NO:3a VYSTCNVFSGF 29 替换肽 2×10^6 1.33×10^7 是
NO:4 RFYVLPLLL 6 原始肽 2×10^6 4.19×10^6 是
NO:4c RFYVLPLLF 32 替换肽 2×10^6 7.65×10^6 否
NO:4d VYYVLPLLL 33 替换肽 2×10^6 8.67×10^6 否
NO:4e VFYVLPLLF 34 替换肽 2×10^6 1.45×10^7 是
NO:4f RYYVLPLLF 35 替换肽 2×10^6 1.21×10^7 是
实施例4 ELISPOTs验证CD8+T细胞免疫反应
将一条替换肽特异性CD8+T细胞与负载原始肽或无关肽的T2分别加入到ELISPOTs板中进行培养，20小时后进行ELISPOTs检测(参照试剂盒说明书)。按相同方案检测其他所有替换肽和原始肽特异性CD8+T细胞的免疫反应。阳性对照组是将CMV多肽特异性T细胞与负载CMV多肽或无关肽的T2分别加入到ELISPOTs板中进行培养，检测方法同上，实验结果见图11和表5。显然，点替换后的新抗原具备比原始肽更强的免疫原性，所有组别均保留用于进一步实验验证。
表5多肽刺激特异性CD8+T细胞分泌IFN-gamma干扰素结果
Figure PCTCN2022144367-appb-000002
实施例5 CFSE和7-AAD双标记技术检测CTL细胞的杀伤能力
取对数生长期的T2细胞，分成负载多肽(一条原始肽，如SEQ ID NO:1)组与不负载多肽组，于37℃、5％CO 2培养箱培养过夜。将培养过夜的T2细胞洗涤，加入0.5μM CFSE溶液，在37℃处理20min。染色结束后立即取出，终止染色，使用DPBS洗涤2-3次，进行计数，重悬至2×10 5个/mL。将CTL细胞按一定效靶比与负载替换肽(与原始肽相对应，如SEQ ID NO:1a)或不负载替换肽的T2混合共培养，于37℃，5％CO2培养箱中孵育，20-22h后，将细胞混合物吹散重悬，全部取出，加入7-ADD，避光染色5min，用于标记死细胞，流式细胞仪上机检测杀伤率。CSFE+7-AAD+双阳性的细胞为被杀伤的靶细胞，CFSE+7ADD-细胞为未被杀伤的靶细胞，根据这些比例来计算靶细胞杀伤T2的杀伤活性。按相同方案检测各分批的原始肽与替换肽的特异性CD8+T细胞的杀伤活性。杀伤率(％)＝(实验组靶细胞中死细胞比例-阴性对照组靶细胞中死细胞比例)/(1-阴性对照组靶细胞中死细胞比例)。结果见表6、图11、图12、图13、图14。显然，点替换后的新抗原CTL具备比原始肽CTL更强的杀伤能力，最终保留SEQ ID NO:4f作为替换肽和SEQ ID NO:4作为原始肽用动物实验验证。
表6 T细胞特异性识别并杀伤呈递实验多肽的靶细胞
杀伤率 组别 效靶比 重复 类别 分批
7.48％ NO:1特异性CTL+T2 2:1 1 原始肽 1
6.10％ NO:1特异性CTL+T2 2:1 2 原始肽 1
9.19％ NO:1特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 1 原始肽 1
9.42％ NO:1特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 2 原始肽 1
20.92％ NO:1特异性CTL+T2 10:1 1 原始肽 1
19.62％ NO:1特异性CTL+T2 10:1 2 原始肽 1
17.50％ NO:1特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 1 原始肽 1
19.20％ NO:1特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 2 原始肽 1
28.16％ NO:1特异性CTL+T2 50:1 1 原始肽 1
35.73％ NO:1特异性CTL+T2 50:1 2 原始肽 1
64.45％ NO:1特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 1 原始肽 1
74.58％ NO:1特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 2 原始肽 1
6.97％ NO:1c特异性CTL+T2 2:1 1 替换肽 1
9.82％ NO:1c特异性CTL+T2 2:1 2 替换肽 1
14.42％ NO:1c特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 1 替换肽 1
10.24％ NO:1c特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 2 替换肽 1
15.67％ NO:1c特异性CTL+T2 10:1 1 替换肽 1
15.58％ NO:1c特异性CTL+T2 10:1 2 替换肽 1
31.22％ NO:1c特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 1 替换肽 1
26.20％ NO:1c特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 2 替换肽 1
28.45％ NO:1c特异性CTL+T2 50:1 1 替换肽 1
26.72％ NO:1c特异性CTL+T2 50:1 2 替换肽 1
84.79％ NO:1c特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 1 替换肽 1
82.82％ NO:1c特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 2 替换肽 1
6.40％ NO:4特异性CTL+T2 2:1 1 原始肽 4
5.36％ NO:4特异性CTL+T2 2:1 2 原始肽 4
11.22％ NO:4特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 1 原始肽 4
8.22％ NO:4特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 2 原始肽 4
16.39％ NO:4特异性CTL+T2 10:1 1 原始肽 4
15.59％ NO:4特异性CTL+T2 10:1 2 原始肽 4
17.00％ NO:4特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 1 原始肽 4
22.62％ NO:4特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 2 原始肽 4
31.40％ NO:4特异性CTL+T2 50:1 1 原始肽 4
35.03％ NO:4特异性CTL+T2 50:1 2 原始肽 4
64.43％ NO:4特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 1 原始肽 4
79.32％ NO:4特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 2 原始肽 4
12.90％ NO:4e特异性CTL+T2 2:1 1 替换肽 4
5.65％ NO:4e特异性CTL+T2 2:1 2 替换肽 4
11.79％ NO:4e特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 1 替换肽 4
11.62％ NO:4e特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 2 替换肽 4
19.06％ NO:4e特异性CTL+T2 10:1 1 替换肽 4
18.48％ NO:4e特异性CTL+T2 10:1 2 替换肽 4
7.31％ NO:4e特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 1 替换肽 4
33.68％ NO:4e特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 2 替换肽 4
35.45％ NO:4e特异性CTL+T2 50:1 1 替换肽 4
33.74％ NO:4e特异性CTL+T2 50:1 2 替换肽 4
91.66％ NO:4e特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 1 替换肽 4
87.45％ NO:4e特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 2 替换肽 4
10.60％ NO:4f特异性CTL+T2 2:1 1 替换肽 4
8.48％ NO:4f特异性CTL+T2 2:1 2 替换肽 4
8.82％ NO:4f特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 1 替换肽 4
11.49％ NO:4f特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 2 替换肽 4
17.41％ NO:4f特异性CTL+T2 10:1 1 替换肽 4
15.32％ NO:4f特异性CTL+T2 10:1 2 替换肽 4
31.88％ NO:4f特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 1 替换肽 4
30.96％ NO:4f特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 2 替换肽 4
37.86％ NO:4f特异性CTL+T2 50:1 1 替换肽 4
32.82％ NO:4f特异性CTL+T2 50:1 2 替换肽 4
90.06％ NO:4f特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 1 替换肽 4
89.60％ NO:4f特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 2 替换肽 4
12.43％ NO:3特异性CTL+T2 2:1 1 原始肽 3
11.47％ NO:3特异性CTL+T2 2:1 2 原始肽 3
10.58％ NO:3特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 1 原始肽 3
9.57％ NO:3特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 2 原始肽 3
21.98％ NO:3特异性CTL+T2 10:1 1 原始肽 3
21.42％ NO:3特异性CTL+T2 10:1 2 原始肽 3
17.02％ NO:3特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 1 原始肽 3
17.15％ NO:3特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 2 原始肽 3
33.41％ NO:3特异性CTL+T2 50:1 1 原始肽 3
34.76％ NO:3特异性CTL+T2 50:1 2 原始肽 3
67.38％ NO:3特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 1 原始肽 3
63.88％ NO:3特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 2 原始肽 3
11.96％ NO:3a特异性CTL+T2 2:1 1 替换肽 3
5.39％ NO:3a特异性CTL+T2 2:1 2 替换肽 3
13.35％ NO:3a特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 1 替换肽 3
13.89％ NO:3a特异性CTL+T2负载原始肽 2:1 2 替换肽 3
16.60％ NO:3a特异性CTL+T2 10:1 1 替换肽 3
22.79％ NO:3a特异性CTL+T2 10:1 2 替换肽 3
32.91％ NO:3a特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 1 替换肽 3
28.84％ NO:3a特异性CTL+T2负载原始肽 10:1 2 替换肽 3
29.26％ NO:3a特异性CTL+T2 50:1 1 替换肽 3
31.10％ NO:3a特异性CTL+T2 50:1 2 替换肽 3
94.19％ NO:3a特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 1 替换肽 3
91.49％ NO:3a特异性CTL+T2负载原始肽 50:1 2 替换肽 3
实施例6原始肽特异性T细胞与替换肽特异性T细胞静脉注射对人胃癌SNU-5细胞荷瘤小鼠模型的药效学研究
按照实施例4制备分别制备原始肽特异性T细胞与替换肽特异性T细胞，开展小鼠体内药效评估。采用64只7-9周龄的免疫缺陷NOG鼠和黑色素瘤细胞株SNU-5细胞来构建皮下瘤模型，每只小鼠皮下接种2×10 6个SNU-5细胞。接种后，定期观察小鼠的肿瘤生长情况并监测瘤体积大小，肿瘤长至50-100mm 3后根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组，进行尾静脉给药。
总共分为8组：1)PBS组佐剂组，2)原始肽特异性T细胞低剂量组，3)原始肽特异性T细胞中剂量组，4)原始肽特异性T细胞高剂量组，5)替换肽特异性T细胞低剂量组，6)替换肽特异性T细胞中剂量组，7)替换肽特异性T细胞高剂量组，8)Mock-T细胞高剂量组，每组各8只。其中高剂量组细胞为2×10 7/剂量，中剂量组为7×10 6/剂量，低剂量组为2×10 6/剂量，共给药2次，第一次给药结束后，7天后进行第二次给药。同时联合IL-2(5万IU/剂，每天3剂)。结果见图16。确定成瘤后(接种后5-8天)每2天对肿瘤长宽进行测量，并计算相对肿瘤抑制率完成疗效评价。结果显示，成瘤后5天给药，到第31天时，替换肽低、中、高剂量组的TGI分别为37％，68％和82％，其中中剂量和高剂量组能显著抑制SNU-5肿瘤在NOG小鼠体内的生长，且呈现一定的量效关系，原始肽低、中、高剂量组的TGI分别为5％，24％和39％，Mock-T组TGI小于20％。
表7多肽刺激特异性CD8+T细胞分泌IFN-gamma干扰素(NO:1组)
Figure PCTCN2022144367-appb-000003
Figure PCTCN2022144367-appb-000004
表8多肽刺激特异性CD8+T细胞分泌IFN-gamma干扰素(NO:3组)
Figure PCTCN2022144367-appb-000005
表9多肽刺激特异性CD8+T细胞分泌IFN-gamma干扰素(SEQ NO:4组)
Figure PCTCN2022144367-appb-000006
Figure PCTCN2022144367-appb-000007
响应相应肽的特定CTL的IFN-gamma干扰素分泌图像。按照表7、表8、表9所示组别，对肽段特异性T细胞及目标肽进行ELISPOT分析，评估斑点形成细胞(SFC)的数量。多肽与特异性T细胞发生免疫原性反应的判断标准如下：(实验肽点数)/(无关肽点数)>2。Apo I(ALADGVQKV)刺激作为无关肽对照；阴性组为不添加多肽组；实验组为对应的原始肽；阳性对照组为CMV多肽(NLVPMVATV，SEQ ID NO:37)。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (15)

  1. 一种筛选HLA-A*24:02分型限制性表位抗原肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
    (1)在HLA-A*24:02分型限制性表位数据中筛选数目最多、长度为9-11个氨基酸的肽段，分析所述肽段的序列保守性，确认最保守位点及偏好氨基酸；
    (2)根据(1)所获得的偏好氨基酸，在原始肽对应肽段的最保守位点上进行氨基酸替换，获得替换肽；
    (3)验证所述替换肽的功能，筛选获得亲和力高于原始肽的替换肽。
  2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，确认所述最保守位点为肽段的第一位、第二位和最末位氨基酸；优选地，第一位的偏好氨基酸为V或I，第二位的偏好氨基酸为Y或F，最末位的偏好氨基酸为F、L或I。
  3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(2)中，将所述原始肽的第一位氨基酸替换为V，第二位氨基酸替换为Y或F，和/或最末位氨基酸替换为F或L。
  4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，(2)中，
    所述原始肽的第一位氨基酸替换为V，最末位氨基酸替换为F；
    所述原始肽的第一位氨基酸替换为V；
    所述原始肽的第一位氨基酸替换为V，最末位氨基酸替换为F；或，
    所述原始肽的第二位氨基酸替换为Y和最末位氨基酸替换为F。
  5. 如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，(2)中，
    当所述替换肽为9肽或11肽时，所述替换肽的第一位氨基酸为V或R，第二位氨基酸为Y或F和最末位氨基酸为F。
  6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述替换肽为9肽时，
    所述替换肽的第一位氨基酸为V，第二位氨基酸为Y和最末位氨基酸为F，或，
    所述替换肽的第一位氨基酸为V，第二位氨基酸为F和最末位氨基酸为F，或，
    所述替换肽的第一位氨基酸为R，第二位氨基酸为Y和最末位氨基酸为F；
    所述替换肽为11肽时，所述替换肽的第一位氨基酸为V，第二位氨基酸为Y和最末位氨基酸为F。
  7. 一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:25-36中的任一个序列所示；
    优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、27、29、32、33、34或35所示；
    更优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、29、34或35所示。
  8. 一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求7所述的多肽。
  9. 一种多肽疫苗，其特征在于，其包括一种或多种如权利要求7所述的多肽。
  10. 一种核酸疫苗，其特征在于，其包括一种或多种如权利要求8所述的核酸。
  11. 一种抗原特异性免疫细胞，其特征在于，其在体外将一种或多种如权利要求7所述的多肽与免疫细胞共培养获得。
  12. 如权利要求11所述的抗原特异性免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞或DC细胞；优选地，所述T细胞为CD4+或CD8+T细胞。
  13. 如权利要求7所述的多肽或权利要求8所述的核酸在制备疫苗或抗体中的应用。
  14. 如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述疫苗为多肽疫苗、核酸疫苗或DC疫苗。
  15. 如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述核酸疫苗为DNA疫苗或mRNA疫苗。
PCT/CN2022/144367 2022-12-30 一种hla-a*24:02限制性抗原点替换方法、获得的多肽及其应用 WO2024138753A1 (zh)

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