CN112142837A

CN112142837A - 新抗原肽组合物及其在肿瘤免疫治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN112142837A
Application number: CN201910577914.7A
Authority: CN
Inventors: 杜发明; 李凤娥; 霍冲; 邓丽刚; 邹庆薇; 王亚玲
Original assignee: Tianjin Hengjia Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Tianjin Hengjia Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2020-12-29

Abstract

本发明提供一种新抗原肽组合物及其在肿瘤免疫治疗药物中的应用，所述新抗原肽组合物包括SEQ ID No.1‑26中的至少一种新抗原肽；所述肿瘤免疫治疗药物为用于肿瘤患者免疫治疗的免疫原性组合物或疫苗组合物，包括SEQ ID No.1‑26中的至少一种新抗原肽和药学上可接受的辅料；所述的新抗原肽组合物可用于治疗肿瘤细胞含有SEQ ID No.1‑26中至少一种新抗原肽的相应基因突变和HLA分型的患者。本发明的新抗原肽组合物中的新抗原表位均经过免疫原性验证，具有激活T细胞靶向杀死肿瘤细胞的作用；且本发明的新抗原肽组合物能够用于治疗EGFR突变型肿瘤患者的药物制备,且治疗的范围更广，为患者的免疫治疗提供了新选择。

Description

新抗原肽组合物及其在肿瘤免疫治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于分子免疫学和生物医学技术领域，具体涉及一种新抗原肽组合物及其在肿瘤免疫治疗药物中的应用。

背景技术

肺癌是临床常见的高度恶性肿瘤，预后极差，五年生存率不足10％。按照组织学分型，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌发病率约占80％。手术是治疗肺癌首选和最主要的治疗方法。但半数以上的非小细胞肺癌患者在首次诊断时已经发生了远处转移，失去了手术治疗的机会。肿瘤靶向药物的出现，在很大程度的改变了肿瘤的传统治疗模式，大大的改善了患者的预后，显著延长了无进展生存期和总生存期，特别是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的出现。表皮生长因子受体(EGFR)突变能够发生在大约一半的非小细胞肺癌患者，其介导的信号通路激活在非小细胞肺癌的发生、发展中起着不可缺少的作用。非小细胞NCCN指南推荐有EGFR基因突变的晚期肺癌患者将靶向药物作为一线治疗方案。

EGFR基因是由28个外显子组成，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，其中外显子18-21是最见的基因突变点位，对于EGFR基因敏感突变的晚期非小细胞肺癌患者，在无进展生存、有效率方面，与传统化疗相比均有明显延长，同时生存质量及耐受性较好。19-del和21号L858R基因突变是EGFR最为常见类型，也是EGFR-TKI最敏感的点位，其中肺腺癌出现19-del和21号L858R基因突变较多。通常在靶向治疗后，会不可避免的出现耐药。其中，以20号外显子上的T790M突变最为常见，目前临床统计到的有大概60％左右的患者存在EGFR-TKI获得性耐药性。T790M突变学说认为，EGFR基因第20外显子在应用EGFR-TKI治疗过程中发生了二次突变，其结果该空间位阻的形成影响酪氨酸激酶与EGFR-TKI之间氢键的形成，最终导致EGFR-TKI无法与酪氨酸激酶相结合，也就是易瑞沙等一线靶向药无法继续有效，T790M的突变是EGFR-TKI继发性耐药最主要的因素。

随着免疫学和生物技术的发展，肿瘤免疫治疗已成为继手术、化疗、放疗、靶向治疗之后肿瘤治疗模式的又一革新。免疫治疗是利用免疫系统识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞的能力，通过干预手段提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发或增强机体抗肿瘤免疫应答，起到协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长的作用。肿瘤细胞在基因变异的基础上产生的带有特异性氨基酸序列变异的蛋白被称为新抗原(neoantigen)，这些异常蛋白，如果在细胞内(肿瘤细胞或APCs)被降解成短肽段(抗原表位)，与特定MHC-I类或MHC-II类分子高亲和力结合，并以复合物形式呈递到细胞表面，被T细胞表面表达的T淋巴细胞受体(TCR)识别，引起T细胞活化，进而攻击和清除肿瘤细胞。将基因突变导致的新抗原表位肽进行人工合成，构建个性化的肿瘤疫苗，回输到体内激活免疫细胞，能杀死带有所述抗原的肿瘤细胞。

癌症疫苗可以诱导靶向并破坏肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞。当前的癌症疫苗可包含共有的肿瘤相关性抗原和基于肿瘤基因突变的新抗原，其中相关性抗原是在许多个体中发现的肿瘤中被选择性表达或过表达的天然蛋白质，但是由于它们易受自身耐受的免疫抑制作用的影响，作为用于靶向针对特定肿瘤类型的T细胞应答的免疫原是不理想的；新抗原疫苗可以克服包含共有的肿瘤抗原的疫苗的一些缺点，是肿瘤免疫治疗的理想靶标，因为新抗原只在肿瘤中进行特异性表达，所以几乎不太可能诱导耐受性，损伤正常组织细胞。然而，使用患者特异性新抗原需要对个体受试者基因组及HLA分型进行测序并计算可能适用于该个体受试者中的个体化新抗原肽组合物，使得设计的疫苗适用的人群非常有限，而且对于计算得到的新抗原的准确性一般不会很高，其免疫原性仍需要进一步评估。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。因此，本发明的目的在于提出一种新抗原肽组合物及其在肿瘤免疫治疗药物中的应用，具有激活T细胞靶向杀死肿瘤细胞的作用；且本发明的新抗原肽组合物能够用于治疗EGFR突变型肿瘤患者的范围更广，为患者的免疫治疗提供了新选择。

第一方面，本发明提供一种新抗原肽组合物及编码所述新抗原肽的核酸，所述新抗原肽组合物包括SEQ ID No.1-26中的至少一种新抗原肽。

所述的新抗原肽组合物中的新抗原肽包含针对EGFR基因的L858R、19del、T790M突变的新抗原表位，且能够结合HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB不同分型的HLA蛋白。

所述新抗原表位肽能与相应HLA蛋白形成新抗原表位肽-HLA复合物。HLA蛋白可来源自抗原呈递细胞或靶细胞即肿瘤细胞。

优选地，所述新抗原表位肽可与抗原呈递细胞共孵育，诱导抗原呈递细胞成熟并在细胞表面形成新抗原表位肽-HLA复合物。

优选地，所述抗原呈递细胞为DC细胞。

所述新抗原表位肽-HLA复合物能够被HLA限制性T淋巴细胞识别或诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞。

所述新抗原表位肽、新抗原表位肽-HLA复合物、共孵育新抗原表位肽的抗原呈递细胞均可诱导T淋巴细胞活化，形成细胞毒性T淋巴细胞，杀伤呈递新抗原表位肽的靶细胞。

所述新抗原表位肽、负载新抗原表位肽的抗原呈递细胞、被负载新抗原表位肽的抗原呈递细胞激活的细胞毒性T淋巴细胞均可应用于抗肿瘤免疫治疗领域，如作为治疗性肿瘤疫苗的活性成分。

第二方面，本发明提供一种肿瘤治疗免疫药物，包括第一方面所述的新抗原肽组合物SEQ ID No.1-26中的至少一种新抗原肽和药学上可接受的辅料。

所述肿瘤免疫治疗药物包括用于肿瘤患者免疫治疗的免疫原性组合物或疫苗组合物。

所述辅料包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或佐剂中一种或几种。

优选地，所述载体包括核酸分子或病毒载体中的至少一种。

优选地，所述核酸分子包括RNA或DNA质粒中的至少一种。

优选地，所述病毒载体包括腺病毒或慢病毒中的至少一种。所述病毒载体在引入急性或慢性感染宿主或引入未感染的宿主中之后，表达免疫原性肽，并且引起宿主特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。

优选地，所述辅料包括生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗水性缓冲液中的一种或几种。

优选地，所述佐剂包括明矾、铝的其它化合物、卡介苗(BCG)、弗氏完全佐剂(FCA)、聚-ICLC、STING激动剂、咪喹莫特中的一种或几种。

优选地，所述佐剂可以与肿瘤治疗免疫药物同时使用或依次序使用，例如注射肿瘤治疗免疫药物后涂抹于注射部位。

所述肿瘤治疗免疫药物使用频次包括一次或多次给药。

所述肿瘤治疗免疫药物的给药方式包括皮下、肌肉内、皮内、静脉或通过粘膜给与途径中的一种或几种。

所述肿瘤治疗免疫药物可以单独使用，或与化疗、靶向治疗、免疫检查点抑制剂、过继性细胞治疗方法中的一种或几种联合使用。

第三方面，本发明提供如第一方面所述的新抗原肽组合物在肿瘤免疫治疗药物中的应用。

所述新抗原肽组合物可以应用于肿瘤患者免疫治疗，治疗肿瘤细胞含有第一方面所述的新抗原肽中的特定的基因突变和HLA分型的患者。

优选地，所述肿瘤患者包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌中的一种或几种。

新抗原肽组合物作为免疫原性组合物或疫苗组合物的给药方式包括：包括皮下、肌肉内、皮内、静脉或通过粘膜给与途径中的一种或几种。

所述免疫原性组合物或疫苗组合物的制备方法，包括在溶液中，重构冷冻干燥的共有的新抗原免疫原性组合物或疫苗组合物。

所述的共有的新抗原免疫原性组合物可以经由子组合物给予方式给予。所述子组合物给予方式即将共有的新抗原免疫原性组合物分成不同的子组合物组，每一子组合组物包含一部分共有的新抗原免疫原性组合物，并且这些子组合物组可以被给予至受试者或患者身上的不同位置；例如至每一条胳膊或每一条腿，以尽力向患者的每组引流淋巴结递送较少的新抗原，并且从而限制新抗原之间的竞争。且所述不同位置的位置数及由此确定的子组合物组数可以变化。

所述新抗原免疫原性组合物或疫苗组合物的制备步骤包括(a)从每个患者获得肿瘤组织或血液样品；(b)在样品中检测这些肿瘤特异性突变中的一个或多个；(c)确定患者肿瘤中存在的HLA分型；(d)如果在来自该患者的样品中检测到这些肿瘤特异性突变中的至少一个，及存在一个或多个HLA分型，则用组合物中的至少一种新抗原肽进行治疗。

所述肿瘤特异性突变可存在于显著比例的患有癌症的受试者中，故所述新抗原免疫原性组合物或疫苗组合物可不需要对受试者的全基因组进行测序，直接用作治疗多个患者的“现成(off-the-shelf)”产品。例如，该方法可以简单地将所述新抗原免疫原性组合物或疫苗组合物给予体内存在至少一种该组合物对应基因突变的受试者。这与使用患者个体化新抗原混合物的方法不同，后者需要每个对受试者的全基因组或全外显子组进行测序以及新抗原肽组合物的个体化计算和生产。

如第一方面所述的新抗原肽组合物中的新抗原肽可以直接作为多肽疫苗注射或用于负载树突状细胞(DC细胞)，进行DC细胞治疗，或者用于负载DC细胞后激活T细胞，进行T细胞治疗，或用于制备其他诱导治疗癌症的免疫药物。

如第一方面所述的新抗原肽组合物可以单独或与其他治疗癌症的方法或其他治疗癌症药物中的一种或几种联合使用。

优选地，所述新抗原肽组合物中每种新抗原肽的注射剂量可以给予50μg～1.5mg，优选10μg～500μg。

所述联合使用包括以任何顺序方式、不同时间或同时给予。

优选地，所述其他治疗癌症药物包括吉非替尼、克唑替尼、曲妥珠单抗、威罗菲尼或抗雌激素中的一种或几种。

如第一方面所述的新抗原肽组合物可用于肿瘤免疫治疗药物试剂盒的制备，所述肿瘤免疫治疗药物试剂盒包含如第一方面所述的SEQ ID No.1-26中的至少一种新抗原肽、药学上可接受的辅料、包装材料、用于保持试剂盒组分的容器、使用说明书。

进一步地，所述试剂盒组分包含冻干形式、干燥形式或水溶液形式，且所述组分可以被预先混合或是单独存储。

本发明的有益效果是：

该新抗原肽组合物中的新抗原表位均经过免疫原性验证，具有激活T细胞靶向杀死肿瘤细胞的作用；且新抗原组合物针对的靶点为肿瘤驱动基因的突变频率较高的位点，对肿瘤的发生发展具有关键性作用，针对该新抗原表位肽的HLA分型占比较高，所以该新抗原肽组合物能够覆盖大部分的EGFR突变型肿瘤患者，为患者的免疫治疗提供了新选择。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1 ELISA检测新抗原肽激活的CTL对靶细胞的杀伤作用。

图2新抗原肽组合物激活的特异性T淋巴细胞体内抗肿瘤实验生存曲线。

具体实施方式：

实施例1新抗原肽免疫功能验证

1.分离外周血单个核细胞(PBMC)

取相应HLA分型的健康供者静脉血20ml，将血液样本用等体积的无菌PBS稀释，将淋巴细胞分离液(Stemcell，07861)移入一个新的50ml离心管，保证与血液体积比为3：4，小心将稀释血液加入分离液的表面，操作尽可能轻柔，避免混合，可以清晰看到两种液体的分界。室温400g离心30min。离心后吸出单个核细胞层，移入新的无菌离心管中，加入PBS洗涤两次。用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数。

2.酶联免疫斑点(ELISPOT)验证多肽免疫反应

将2.5×10⁶个细胞悬浮于90％RPMI-1640+10％FBS(含有20ng/ml IL-2、10ng/mlIL-7、5ng/ml IL-15和5ng/ml IL-21)，加入2.5×10⁵

Human T-Activator CD3/CD28磁珠(Gibco，11131D)，接种到6孔板中，每孔1.25×10⁶个细胞，两孔分别加入新抗原肽(2.5μg/ml)，37℃、5％CO₂条件下孵育24小时后，重悬细胞和磁珠，放置在磁力架上，丢弃磁珠，收集上清细胞继续扩增培养约20天。用200μl含10％FBS的1640培养液，室温孵育人干扰素-γELISPOT检测试剂盒(Mebtech)斑点板30min。按每孔2.5×10⁵个培养后的活细胞，150μl总体积加至96孔板中。加入新抗原肽(终浓度10μg/ml)至相应对应孔，阴性对照不加新抗原肽，阳性对照孔加入1:1000配制的阳性对照液。放入37℃下5％CO₂培养箱培养36-48h。取出斑点板，清空细胞悬液，PBS洗5次，拍干。加入含0.5％FBS的PBS配制的抗体(1:20)100μl/孔，室温孵育2h，用PBS洗5次。加入TMB 100μl/孔，室温避光反应10-30min。加入100μl去离子水终止反应，用200μl去离子水洗两遍。甩干，干燥后读板。其中，所用阳性对照液、抗体、TMB均为人干扰素-γELISPOT检测试剂盒中试剂。

经检测发现加入多肽后的PBMC分泌γ干扰素(IFN-γ)能力升高，新抗原肽具有良好的免疫原性，能够激活特异性免疫反应，见下表：

实施例2新抗原肽激活特异性T淋巴细胞

1.分离和诱导DC细胞

从分型为HLA-A1101的健康供者PBMC分离T细胞和单核细胞，先使用人CD14阳性选择试剂盒(STEMCELL，18058)富集单核细胞。再使用人T细胞分离试剂盒(STEMCELL，17951)从CD14-细胞的分离T细胞。将单核细胞悬浮于X-VIVO-15培养基中并调节至1×10⁶/mL，然后用GM-CSF(100ng/mL)和IL-4(50ng/mL)处理。将细胞在37℃，5％CO₂下培养6天以诱导未成熟的DC，再用TNF-α(10ng/mL)、IL-1β(10ng/mL)、IL-6(100ng/mL)、LPS(1μg/mL)和PGE2(1μg/mL)处理24小时以诱导DC成熟。

2.负载新抗原肽组合物的DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

将2.5×10⁵个DC细胞与1×10⁶个T细胞混合，并且加入IL-2(50ng/mL)、IL-7(5ng/mL)、IL-15(10ng/mL)和本发明的针对EGFR L858R突变和HLA-A1101的新抗原肽HVKITDFGRAK、KITDFGRAK、VKITDFGRAK组合物(各2.5μg/mL)，在37℃、5％CO₂下培养10天，得到新抗原肽组合物诱导的CTL。

3.特异性CTL对靶细胞的杀伤作用

选择表达EGFR L858R的肺癌细胞系H2172作为靶细胞，过表达HLA-A1101全长基因，得到A1101-H2172细胞系，将A1101-H2172调整细胞密度至2×10⁵/ml，按照2×10⁴/孔的量接种靶细胞至96孔板。将步骤2获得的CTL细胞，使用1640培养基(含10％FBS)重悬，然后按照1:1、5:1、10:1、20:1的效靶比，将CTL细胞分别加入到96孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中，培养24h。未经处理的PBMC作为对照。培养结束后，取出96孔板，800g室温离心10min，使用Human IFN-γ ELISA Kit(购自达科为)检测共培养上清中细胞因子IFN-γ的表达。结果见图1，在效靶比20：1时，与靶细胞共孵育的CTL分泌IFN-γ量可达1336.7pg/ml。

实施例3新抗原肽组合物激活的特异性T淋巴细胞体内抗肿瘤实验

取处于对数生长期的A1101-H2172细胞，细胞密度约80-90％，使用胰酶消化细胞，用预冷的PBS洗两遍，调整细胞至合适的浓度。取6周龄裸鼠20只，体重18-20g，腋窝中后部皮下接种1×10⁷个细胞，观察形成的肿瘤，选择肿瘤直径5mm的裸鼠，随机分为两组。治疗组给予实施例2制备的CTL细胞，尾静脉注射1×10⁷个细胞/次，每周2次，连续3周。对照组给予PBS溶液。每周测量肿瘤大小，计算瘤体积，观察两组存活率。结果如图2所示，与对照组相比，CTL细胞治疗组的肿瘤存活率高，新抗原肽诱导的特异性CTL细胞有效抑制了肿瘤细胞的生长。

Claims

1.一种新抗原肽组合物，其特征在于，所述新抗原肽组合物包括SEQ ID No.1-26中的至少一种新抗原肽。

2.根据权利要求书1所述的新抗原肽组合物，其特征在于，所述新抗原肽组合物中的新抗原肽均包含特异性基因突变，且能够结合特定分型的HLA蛋白。

3.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的新抗原肽组合物。

4.一种肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，包括权利要求1所述的SEQ ID No.1-26中的至少一种新抗原肽和药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求书4所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物包括用于肿瘤患者免疫治疗的免疫原性组合物或疫苗组合物。

6.根据权利要求书4所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物使用频次包括一次或多次给药。

7.根据权利要求书4所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物的给药方式包括皮下、肌肉内、皮内、静脉或通过粘膜途径给予。

8.根据权利要求书4所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物可以单独使用，或与化疗、靶向治疗、免疫检查点抑制剂、过继性细胞治疗方法中的一种或几种联合使用。

9.根据权利要求1所述的新抗原肽组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。