WO2024136283A1 - 고농도의 헴을 생산하는 효모 돌연변이 균주 및 이를 이용한 헴 고생산 방법 - Google Patents

고농도의 헴을 생산하는 효모 돌연변이 균주 및 이를 이용한 헴 고생산 방법 Download PDF

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    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates to a yeast mutant strain that produces high concentrations of heme and a method for high heme production using the same. More specifically, it relates to a yeast mutant strain that produces high concentrations of heme, and more specifically, to a yeast strain produced by irradiating wild-type Saccahromyces cerevisiae with ultraviolet rays under specific conditions. Saccharomyces yeast mutant strain with improved heme production ability compared to wild type, method for producing the yeast mutant strain, heme production method using the yeast mutant strain, medium composition for culturing the yeast mutant strain, and the yeast mutant strain Provided is a food composition containing heme produced from.
  • TVP textured vegetable protein
  • Impossible Foods a food tech company that is considered the most technologically advanced in the alternative meat market, produces and adds heme, which plays an important role in adding flavor to meat, using GMO (genetically modified organism) yeast.
  • GMO genetically modified organism
  • Related technology is disclosed in Patent Document 1.
  • consumers who oppose GMO-derived foods have a negative perception of the consumption of heme produced using GMO yeast.
  • interest in alternative meat is increasing, and consumption of related foods is also increasing.
  • currently produced alternative meat relies on imports for most of its main raw materials, so research on replacing it with domestic resources is needed. This is the situation.
  • regulations on GMO-derived foods are being strengthened in Korea, there are restrictions on adding heme produced using GMO yeast to alternative meat.
  • heme is generally extracted from animal blood using organic solvents or enzymatic hydrolysis, but the safety of heme separated and purified from slaughter blood is problematic due to the risk of diseases that can be caused in animals, such as mad cow disease. Because the content in the blood is low, a lot of blood is required, and because animal slaughter is required when using this method, vegetarian consumers do not prefer to consume alternative meat containing heme extracted from animal slaughter.
  • Saccahromyces cerevisiae is a single-celled eukaryote and is a GRAS (Generally Recognized as Safe) strain that has been used for alcohol and baking purposes in food processing for a long time.
  • GRAS Generally Recognized as Safe
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent No. 10-2229968
  • the purpose of the present invention is to provide a Saccharomyces yeast mutant strain with improved heme production ability compared to the wild type, which is prepared by irradiating wild type Saccahromyces cerevisiae with ultraviolet rays under specific conditions.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a Saccharomyces yeast mutant strain with improved heme production ability compared to the wild type, a heme production method using the same, and a medium composition for cultivating the yeast mutant strain.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition containing heme produced from the above yeast mutant strain.
  • the present invention provides a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) with improved heme production ability compared to the wild type.
  • the strain may be derived from Saccharomyces cerevisiae KCCM12638, a yeast strain for producing American whiskey.
  • the strain is Saccharomyces cerevisiae KCCM12638 ( Saccharomyces cerevisiae )
  • KCCM12638 is irradiated with ultraviolet rays with a wavelength of 250 to 260 nm at a distance of 20 to 50 cm in the vertical direction at a dose of 3000 to 9000 mW/cm 2 . It can be prepared by irradiating for 1 to 2 hours.
  • the strain has a 2383T>A mutation on chromosome 1, a 5951C>G mutation on chromosome 2, and 413A>T on chromosome 3 compared to Saccharomyces cerevisiae KCCM12638.
  • 468T>A mutation 364680A>T mutation on chromosome 8
  • 1064782T>A 1064817G>T
  • 1064835A>T mutation on chromosome 12 354374G>T
  • the present invention also provides a method for producing a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) with improved heme production ability compared to the wild type, comprising the following steps:
  • the production method may further include the step of diluting the pre-cultured strain a') so that the optical density at 600 nm is 0.5 to 1.5 between steps a) and b).
  • step b) is performed by applying ultraviolet rays with a wavelength of 250 to 260 nm to Saccharomyces cerevisiae KCCM12638 at 3000 to 9000 mW/cm 2 at a distance of 20 to 50 cm in the vertical direction. It can be performed by irradiating at a dose for 1 to 2 hours.
  • step b) compared to Saccharomyces cerevisiae KCCM12638, 2383T>A mutation in chromosome 1, 5951C>G mutation in chromosome 2, and 413A> in chromosome 3.
  • a step of selecting a mutant strain having a single nucleotide sequence variation of the 6739G>A mutation and the 30,149A>T mutation on chromosome 15 may be additionally included.
  • the present invention provides a method for producing heme using the above-described Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP).
  • the heme production method may include the following steps:
  • the strain in step a) is glucose, fructose or galactose as a carbon source, yeast extraction, peptone, tryptone, malt extract, beef extract, casein, and soytone as a nitrogen source.
  • soytone sodium nitrate
  • NH 4 Cl ammonium chloride
  • ammonium sulphate ((NH 4 ) 2 SO 4 ). It can be cultured in a medium that does.
  • the nitrogen source may be 2 to 6% (w/v) of yeast extract and 0.1 to 3% (w/v) of peptone.
  • the strain in step a) is agitated at a pH of 3 to 6, at a stirring rate of 100 to 1500 rpm (revolutions per minute), and with air at a rate of 0.5 to 10 vvm (aeration volume/medium volume/minute). It can be injected and fed-batch cultured.
  • the present invention provides a medium composition for culturing Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) comprising:
  • the medium composition may be a medium for heme production.
  • the present invention relates to a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) with increased heme production ability compared to the wild type, a culture of the strain, heme produced from the strain, or A food composition containing heme isolated from a culture of the above strain is provided.
  • Saccharomyces cerevisiae mutant strain accession number KCTC 15212BP
  • the food may be artificial meat or meat substitute food.
  • the present invention provides the use of the above-described medium composition for increasing heme production of Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP).
  • Saccharomyces cerevisiae mutant strain according to the present invention is a wild-type Saccharomyces cerevisiae KCCM12638, which is already used in the food industry, by applying ultraviolet rays under specific conditions. As it is manufactured through irradiation, it is possible to secure a yeast strain that exhibits high heme production ability in a much simpler and simpler method than existing GMO yeast.
  • the Saccharomyces cerevisiae mutant strain prepared in this way exhibits improved heme production ability compared to the wild type, enabling more efficient heme production.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing a method for extracting heme present in yeast strain cells.
  • Figure 2 shows Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) KCCM12638 strain 40YP20D (4% (w/v) yeast extract (40 g/L), 2% (w/v) bacto peptone (20 g/L), 2% (w) under pH 3.5 conditions. /v) Glucose (20 g/L))
  • A is cell, metabolite, and heme concentration
  • B) is dissolved oxygen (DO%)
  • C) represents the feeding solution injection speed.
  • Figure 3 shows Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) As a result of fed-batch cultivation of the KCCM12638 strain using 40YP20D medium at pH 4.5, (A) is the cell, metabolite, and heme concentration, (B) is the dissolved oxygen amount (DO%), and (C) is the feeding solution. solution) Indicates the injection speed.
  • Figure 4 shows Saccharomyces cerevisiae according to ultraviolet irradiation time. ( S. cerevisiae ) This is a graph showing the survival rate of the KCCM12638 strain.
  • Figure 5 shows Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) S288C and Saccharomyces cerevisiae, the parent strain of the mutant yeast of the present invention ( S. cerevisiae )
  • This shows the results of comparing the ITS (internal transcribed spacer) portion (ITS1, 5.8S rRNA, and ITS2 base sequences) of KCCM12638 by performing BLAST.
  • the query is Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) ITS part (ITS1, 5.8S rRNA, ITS2) of S288C
  • the subject is Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae )
  • It is the ITS part (ITS1, 5.8S rRNA, ITS2) of KCCM12638.
  • the query sequence is shown in SEQ ID NO: 1
  • the subject sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Figure 6 shows the parent strain, Saccharomyces cerevisiae. ( S. cerevisiae ) KCCM12638 and the ITS portion (ITS1, 5.8S rRNA, and ITS2 base sequences) of Saccharomyces cerevisiae mutant strain derived therefrom (accession number KCTC 15212BP) were compared by performing BLAST. It shows one result.
  • the query is Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) ITS part (ITS1, 5.8S rRNA, ITS2) of KCCM12638
  • the subject is Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) It is the ITS part (ITS1, 5.8S rRNA, ITS2) of KCTC 15212BP.
  • the query sequence is shown in SEQ ID NO: 2, and the subject sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the present inventors used wild-type yeast with high heme production ability as the parent strain among various yeast strains already used in the food industry.
  • the parent strain was irradiated with ultraviolet rays under specific conditions to prepare a mutant strain with improved heme productivity compared to the wild type.
  • the first aspect of the present invention relates to a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) with improved heme production ability compared to the wild type and a method for producing the same.
  • a yeast strain with a high heme content is first selected among various yeast strains already used in the food industry and used as a parent strain. did. According to the selection results, Saccharomyces cerevisiae , a type of wild type Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) KCCM12638 was confirmed to have a higher heme production ability than other yeast strains, and was selected as the parent strain.
  • Saccharomyces cerevisiae selected as the parent strain S. cerevisiae
  • the parent strain was inoculated in 40YP20D medium containing glucose as a carbon source and yeast extract and bacto-peptone as nitrogen sources, and the acidity, stirring speed, and air injection speed of the culture medium were adjusted. Fed-batch culture was then performed.
  • the parent strain was cultured in a fed-batch manner at pH 3 to 6, with a stirring speed of 100 to 1500 rpm, and injecting air at a rate of 0.5 to 10 vvm, resulting in the highest heme productivity. It was confirmed that it represents .
  • the glucose included in the medium may be replaced with another substance commonly used as a carbon source, for example, fructose or galactose, but is not limited to this.
  • the nitrogen source included in the medium may be 2 to 6% (w/v) of yeast extract and 0.1 to 3% (w/v) of peptone, but is not limited thereto.
  • a person skilled in the art can appropriately select the type and concentration of the carbon source and nitrogen source contained in the medium according to the culture conditions.
  • Saccharomyces cerevisiae showing high heme productivity S. cerevisiae KCCM12638 was irradiated with ultraviolet light to prepare a mutant yeast strain with improved heme productivity compared to the wild type.
  • the PCR tube containing the parent strain was placed at a distance of 30 cm under a 254 nm UV lamp for 2 to 12 hours.
  • the death rate was 97.8% at 2 hours after UV irradiation, and this time period was selected as the optimal UV irradiation time.
  • Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) with improved heme production ability compared to the wild type may be derived from Saccharomyces cerevisiae KCCM12638, and Saccharomyces cerevisiae It can be prepared by irradiating Saccharomyces cerevisiae KCCM12638 with ultraviolet rays with a wavelength of 250 to 260 nm at a dose of 3000 to 9000 mW/cm 2 at a distance of 20 to 50 cm in the vertical direction for 1 to 2 hours. there is.
  • the UV irradiation time is less than 1 hour, it may be difficult to select strains with induced mutations due to the low death rate. Since there is little change in the death rate over time after 2 hours of irradiating ultraviolet rays, it is unnecessary to irradiate ultraviolet rays for more than 2 hours.
  • Saccharomyces cerevisiae S288C S.
  • 'ITS part' single nucleotide polymorphism
  • the SNPs of the KCCM12638 and KCTC 15212BP strains were compared.
  • the KCTC 15212BP strain has at least 12 SNPs compared to the KCCM12638 strain, that is, 2383T>A mutation on chromosome 1, 5951C>G mutation on chromosome 2, and 413A>T on chromosome 3.
  • Saccharomyces cerevisiae mutant strain prepared in this way shows improved heme production ability compared to the parent strain, wild-type Saccharomyces cerevisiae KCCM12638. This can be used in a method for industrially mass producing heme.
  • the second aspect of the present invention relates to a method for producing heme using the above-described Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) and a medium composition for culturing the strain. .
  • the heme production method includes a) cultivating a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP); and b) recovering heme from the strain.
  • the culture in step a) can be performed by using the pre-culture medium in which the strain was cultured, by using an isolated strain, or by using a frozen strain or a culture thereof.
  • the term “culture” means growing the strain under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the culture method according to the present invention includes batch culture, continuous culture, and fed-batch culture, and specifically, batch process or injection batch or repeated injection batch process (fed). It can be cultured continuously in a batch or repeated fed batch process, but is not limited to this.
  • the culture according to the present invention is not particularly limited, but can be cultured using, for example, a liquid culture tank, a rotary drum fermentor, or a tray fermentor.
  • a liquid culture tank a rotary drum fermentor
  • a tray fermentor a tray fermentor.
  • the rotary drum type or tray fermenter if it is useful for fermentation of strains, it can be used in the method of the present invention without restrictions on its type, and an appropriate device can be selected and used depending on the production scale.
  • the pH of the culture can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, and sulfuric acid to the culture in an appropriate manner.
  • foam generation can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the culture.
  • Saccharomyces cerevisiae mutant strain in step a) (accession number KCTC 15212BP) is its parent strain, Saccharomyces cerevisiae KCCM12638 Can be cultured in the same medium as the culture medium.
  • the strain in step a) contains glucose, fructose or galactose as a carbon source, yeast extract, peptone, tryptone, malt extract, beef extract, casein, and soytone ( soytone), sodium nitrate (NaNO 3 ), ammonium chloride (NH 4 Cl), and ammonium sulphate ((NH 4 ) 2 SO 4 ). Containing at least one selected from the group consisting of It can be cultured in medium.
  • the strain in step a) contains 3 to 7% (w/v) of glucose, fructose or galactose as a carbon source, yeast extract at a concentration of 2 to 6% (w/v) and 0.1 to 3% (w) as a nitrogen source.
  • the culture conditions of the Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) in step a) may be the same as the conditions for culturing its parent strain, Saccharomyces cerevisiae KCCM12638. .
  • the strain in step a) can be cultured in a fed-batch manner at pH 3 to 6, more preferably pH 3 to 5.5, with a stirring speed of 100 to 1500 rpm and air injected at a rate of 0.5 to 10 vvm.
  • a stirring speed 100 to 1500 rpm
  • air injection speed etc. for the purpose of increasing heme productivity.
  • an additional supply solution may be injected at the time when all the initial glucose is consumed in step a).
  • the feed solution may contain various carbon sources and/or various nitrogen sources like the initial medium, and may contain the same or different carbon and/or nitrogen sources as the initial medium.
  • a feed solution identical to the initial medium but containing a high concentration of carbon source and nitrogen source was injected, but those skilled in the art would consider the components and culture conditions of the initial medium and include them in the feed solution.
  • the ingredients and their concentrations can be appropriately selected and controlled.
  • the injection rate of the feed solution can be determined within a range where the glucose concentration of the culture medium is close to 0 g/L and the ethanol concentration does not exceed 10 g/L.
  • the injection rate of the feed solution containing the carbon source and the nitrogen source within the above range may be, for example, 1 to 50 mL/hr, preferably 2 to 35 mL/hr, but is not limited thereto.
  • step b) can be performed using a method known in the art for recovering heme by disrupting the yeast strain.
  • step b) may be performed by a series of processes shown in FIG. 1.
  • FIG. 1 The process of FIG. 1 is briefly described as follows.
  • yeast lysis buffer e.g. Y-PERTM Yeast Protein Extraction Reagent
  • ACN acetonitrile
  • Acetonitrile 1.6 ml of 1.7 M hydrochloric acid (HCl) solution prepared by mixing at a volume ratio of 8:2 was added to the recovered precipitate and allowed to react for 20 minutes.
  • MgSO 4 at a saturated concentration at room temperature and 100 ⁇ g/ml were added. After adding 0.4 ml of a solution containing L NaCl and stirring for 5 minutes, the aqueous solution layer and the acetonitrile layer are separated by centrifugation, and the acetonitrile layer containing heme is recovered.
  • Methods for recovering heme in the present invention include centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC, but are not limited thereto.
  • heme in the heme production method of the present invention, in step b), heme can be recovered by harvesting the strain before the heme concentration in the medium reaches 0.5mM. This is because when the heme concentration in the medium reaches 0.5mM, yeast growth may be inhibited and heme production may decrease.
  • step b) may include additional recovery of heme from the strain culture medium.
  • the culture medium used in step a) may be optimized to increase heme productivity of Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP).
  • the second aspect of the present invention provides a medium composition for cultivating Saccharomyces cerevisiae mutant strain (Accession Number KCTC 15212BP).
  • the medium composition according to the present invention may include the medium used in step a) of the above-described heme production method, for example, i) 3 to 7% (w/v) of glucose, fructose or galactose as a carbon source; and ii) 2 to 6% (w/v) yeast extract and 0.1 to 3% (w/v) peptone as a nitrogen source, but are not limited thereto.
  • the Saccharomyces cerevisiae mutant strain shows improved heme productivity compared to its parent strain, Saccharomyces cerevisiae KCCM12638,
  • the medium composition can be used as a medium composition for heme production.
  • a second aspect of the present invention provides the use of the above-described composition for increasing heme production in a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP), wherein the composition comprises i ) 3 to 7% (w/v) glucose, fructose or galactose as carbon source; and ii) 2 to 6% (w/v) yeast extract and 0.1 to 3% (w/v) peptone as a nitrogen source.
  • a second aspect of the present invention provides the use of the above-described composition for the production of a culture medium for increasing heme production of Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP), wherein:
  • the composition includes i) 3 to 7% (w/v) of glucose, fructose or galactose as a carbon source; and ii) 2 to 6% (w/v) yeast extract and 0.1 to 3% (w/v) peptone as a nitrogen source.
  • Heme produced as described above can be used in various foods.
  • the third aspect of the present invention is a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP), a culture of the strain, a heme produced from the strain, or a heme isolated from the culture of the strain. It relates to a food composition containing heme.
  • the present invention also provides a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212BP) for food production, a culture of the strain, a heme produced from the strain, or a culture of the strain. Provides the use of heme separated from.
  • Saccharomyces cerevisiae mutant strain accession number KCTC 15212BP
  • the strain may be one or more selected from the group consisting of the strain itself, strain lysate, strain concentrate, strain extract, and strain dry matter.
  • the term "lysate” refers to something obtained by physically and chemically treating the strain itself, high-pressure sterilization, or ultrasonic treatment, or by crushing the supernatant, fermentation product, or culture solution obtained by centrifuging the culture of the strain. However, it is not limited to this.
  • “fermented product” refers to a strain obtained by culturing a microorganism in a medium for a certain period of time, a medium containing its metabolites, extra nutrients, etc., a culture medium from which the strain is removed from the medium, and dilution of the medium or culture medium. It may contain water, concentrate, or dried products thereof.
  • the term “fermentation” means that it is not a putrefaction reaction during the process in which microorganisms decompose organic matter using their own enzymes.
  • the method of obtaining the fermented product from the strain is not particularly limited, and can be obtained according to a method commonly used in the relevant technical field or similar fields.
  • the fermented product obtained from the strain is not only the fermented material itself, but also the culture medium of the strain in which the strain and the culture coexist, the fermented product obtained by filtering the strain from the culture medium, and the culture medium by centrifuging Supernatant excluding the strain, fermented product obtained by sterilizing the strain from the culture medium and filtering it, extract obtained by extracting the fermented product or the culture medium containing it, diluted solution of the fermented product or extract thereof, and the fermented product or extract thereof. It may include all types of materials including fermented products generated from the strain, such as dried material and lysate obtained by collecting and crushing the bacterial cells of the strain.
  • extract refers to a liquid component obtained by immersing the desired material in various solvents and then extracting it at room temperature, low temperature, or heated state for a certain period of time, and a solid content obtained by removing the solvent from the liquid component. It means result.
  • it can be comprehensively interpreted to include dilutions of the results, concentrates thereof, crude preparations, purifications, etc. of the above results.
  • the term “dried material” refers to a product from which moisture has been removed from the strain itself or a culture, and may include bacterial cells and cultures dried by known drying methods such as spray drying, freeze drying, and vacuum drying.
  • the term “culture” refers to a product obtained by culturing the above strain in a medium.
  • the culture of the present invention contains the components remaining in the culture medium of the Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212P) and the remaining medium after harvesting the strain, or It may include components of a culture medium containing it.
  • the term “culture medium” refers to the part of the culture excluding the strain.
  • the culture medium of the present invention may include the culture supernatant excluding the strain or the portion of the culture supernatant excluding the lysate after centrifugation in the culture medium of the Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212P). You can.
  • the culture may be a Saccharomyces cerevisiae mutant strain (accession number KCTC 15212P), a total culture of the strain, a culture medium, fractions thereof, etc.
  • the culture medium may be a culture supernatant of the strain.
  • the culture supernatant can be obtained by centrifuging the culture of the strain, and the fraction can be obtained by subjecting the strain, the culture, culture supernatant, etc. to methods such as centrifugation and chromatography.
  • the food composition contains 0.02 to 80% by weight, preferably 0.02% by weight, of the strain, the culture of the strain, the heme produced from the strain, or the heme isolated from the culture of the strain, based on the total weight of the composition. It may contain from 50% by weight to 50% by weight, but is not limited to this, and its content may be appropriately changed depending on the type of food, food intake target, intake purpose, etc.
  • the food may be artificial meat or meat substitute food, but is not limited thereto.
  • the artificial meat or meat substitute food refers to a meat replica imitated to have a texture, texture, flavor and/or flavor similar to meat.
  • the food composition is not particularly limited as long as it is a drinkable food.
  • Non-limiting examples of such foods include hot dogs, burgers, meat cuts, sausages, steaks, fillets, grilled meats, breasts, thighs, wings, meatballs, meatloaf, bacon, strips, fingers, nuggets, cutlets or cubes.
  • the food may be provided in the form of a soup or stew base, a bouillon, for example, a powder or cube, a flavor packet, or a food additive such as a seasoning packet or shaker.
  • S. cerevisiae KCCM12638 a type of wild-type Saccharomyces cerevisiae used in whiskey production, was used. It was acquired from the Korea Microbiological Conservation Center. In order to determine the culture performance and heme content of the parent strain, the following processes 1-2 to 1-5 were performed.
  • yeast glycerol stock stored in a deep freezer 50 ⁇ l was mixed with 5 mL YP20D (1% (w/v) yeast extract (10 g/L), 2% (w/v) bacto peptone. (20 g/L), 2% (w/v) glucose (20 g/L)) was inoculated into a test tube and pre-cultured at 25°C and 250 rpm for 48 hours.
  • YP20D 1% (w/v) yeast extract (10 g/L), 2% (w/v) bacto peptone. (20 g/L), 2% (w/v) glucose (20 g/L)
  • the pre-cultured yeast strain was mixed with 100 mL YP50D (1% (w/v) yeast extract (10 g/L), 2% (w/v) bacto peptone (20%) so that the optical density at 600 nm (OD600) was 1.0. g/L), 5% (w/v) glucose (50 g/L)) was inoculated into a baffled flask containing medium.
  • Yeast cells were disrupted by adding Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA).
  • the yeast cell disruption solution was pretreated to measure the heme concentration present in the yeast extract.
  • 1.2 ml of acetonitrile (ACN) was added to 0.4 ml of yeast extract and reacted for 5 minutes, then centrifuged, the supernatant was removed, and only the precipitate was collected.
  • 1.6 ml of acetonitrile:1.7 M hydrochloric acid (HCl) solution prepared by mixing at a volume ratio of 8:2 was added and reacted for 20 minutes.
  • the concentration of heme was measured using high performance liquid chromatography (HPLC) (Thermo fisher Ultimate 3000) equipped with a YMC-Pack ODS-A, 12 nm, 5 ⁇ m, 150 x 4.6 mm column (YMC, Japan) and UV detector. . Detailed analysis conditions are shown in Tables 1 and 2. Hemin (Sigma, USA) was used as a heme standard material.
  • Saccharomyces cerevisiae D452-2 a common laboratory yeast strain, was used as a control and compared with the heme concentration of Saccharomyces cerevisiae KCCM12638, a yeast strain for making American whiskey. Saccharomyces cerevisiae D452-2 produces 2.5 mg/L of heme, while S Saccharomyces cerevisiae KCCM12638 produces 8.6 mg/L, compared to other yeasts. It was found that the heme production was high compared to the strain. Based on the results of this example, Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) KCCM12638 was used as the parent strain for UV random mutation.
  • fed-batch culture can significantly increase the amount of bacterial cells by continuously supplying carbon and nitrogen sources necessary for the growth of microorganisms, thereby increasing the amount of production of the desired substance.
  • the final attempt was to increase the heme production of S. cerevisiae KCCM12638 strain through fed-batch culture.
  • the dissolved oxygen (DO) was maintained at a high level by increasing the speed to a maximum of 1200 rpm and 5 vvm, and the concentrations of glucose, glycerol, acetate, and ethanol (ethyl alcohol) in the medium were maintained at a high level.
  • the column temperature was maintained at 70°C and the mobile phase was measured using HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000) equipped with an organic acid H+ column (Phenomenex, Torrance, CA) and an RI (Refractive index) detector. Heme concentration was measured by flowing a 5 mM sulfuric acid (H 2 SO 4 ) solution at a flow rate of 0.6 mL/min.
  • yeast strain KCCM12638 glycerol stock stored in a deep freezer 50 ⁇ l was mixed with 5 mL YP20D (1% (w/v) yeast extract (10 g/L), 2% (w/v) Bacto peptone (20 g/L), 2% (w/v) glucose (20 g/L)) was inoculated into a test tube containing medium and pre-cultured at 25°C and 250 rpm for 48 hours.
  • the pre-cultured yeast strain was diluted so that the optical density at 600 nm (OD600) was 1.0, and 0.2 mL of it was collected by centrifugation.
  • the recovered bacteria were released into YP20D and then transferred to a PCR tube.
  • PCR tubes containing yeast cells were placed under a 254 nm UV lamp at a distance of 30 cm at an irradiation dose of 3000 to 9000 mW/cm 2 for 2 to 12 hours. As shown in Figure 4, it was confirmed that the death rate was 97.8% at 2 hours after UV irradiation, and this time period was selected as the optimal UV irradiation time.
  • the yeast cells that were UV irradiated for 2 hours were diluted 10 3 , 10 4 , and 10 5 times, and then 0.1 mL was spread on YPD agar medium and cultured at 30°C for 48 hours.
  • Example 2 Colonies that emerged after UV treatment were randomly selected, and pre-culture and main culture (baffle flask shaking culture) were performed as in Example 1 to analyze the concentration of heme. Among the analyzed colonies, we attempted to select strains with higher heme content than the parent strain KCCM12638. The resulting culture results (OD600) and heme content are shown in Table 3 below.
  • the OD600 of the tested strains was at a similar level, and the heme content increased by 5% compared to the parent strain, KCCM12638.
  • the strain with the heme content increased by about 1.05 times was named Saccharomyces cerevisiae HS-Y009, and this strain was registered at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center Gene Bank (KCTC) on November 29, 2022. It was deposited and given the accession number KCTC 15212BP.
  • Whole genome re-sequencing was commissioned to Macrogen, and SNP information was obtained between the parent strain, KCCM12638, and the UV mutant strain, KCTC 15212BP, using Saccharomyces cerevisiae S288C as the entire genome. secured.
  • Whole-genome resequencing is the comparison of base sequences of individuals or populations by analyzing mutations between specific individuals in a species with a full-length genome (reference genome). Through full-length genome resequencing, the distribution and pattern of mutations at the genome level can be confirmed.
  • the ITS1, 5.8S rRNA, and ITS2 base sequences (hereinafter referred to as the ITS part) were extracted from the base sequences obtained through whole-genome resequencing, and the KCTC 15212BP strain was identified as the parent strain of Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ).
  • BLAST https:/blast.ncbi.nlm
  • S288C S288C of the full-length genome from full-length genome resequencing with the ITS part of Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) KCCM12638, the parent strain of the mutation. .nih.gov/
  • 841 of the 848 KCCM12638 ITS portions matched S288C.
  • the ITS portion was compared with the parent strain, Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) KCCM12638, and the UV mutant strain, Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) KCTC 15212BP.
  • Saccharomyces cerevisiae S. cerevisiae
  • the UV mutant strain Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) KCTC 15212BP.
  • 484 of the 484 nucleotide sequences of the ITS portion of the S. cerevisiae KCCM12638 strain and the S. cerevisiae KCTC 15212BP strain match KCTC.
  • 15212BP was also confirmed to be a S. cerevisiae strain derived from KCCM12638.
  • the KCTC 15212BP strain has at least 12 SNPs compared to the KCCM12638 strain. Specifically, strain KCTC 15212BP has a 2383T>A mutation on chromosome 1, a 5951C>G mutation on chromosome 2, a 413A>T, 468T>A mutation on chromosome 3, a 364680A>T mutation on chromosome 8, and a mutation on chromosome 12.

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Abstract

본 발명은 고농도의 헴(Heme)을 생산하는 효모 돌연변이 균주 및 이를 이용한 헴 고생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 야생형 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)에 특정 조건으로 자외선을 조사하여 제조된, 야생형 대비 증대된 헴 생산능을 갖는 사카로마이세스 효모 돌연변이 균주, 상기 효모 돌연변이 균주의 제조방법, 상기 효모 돌연변이 균주를 이용한 헴 생산방법, 상기 효모 돌연변이 균주 배양용 배지 조성물 및 상기 효모 돌연변이 균주로부터 생산되는 헴을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

Description

고농도의 헴을 생산하는 효모 돌연변이 균주 및 이를 이용한 헴 고생산 방법
본 발명은 고농도의 헴을 생산하는 효모 돌연변이 균주 및 이를 이용한 헴 고생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 야생형 사카로마이세스 세레비지에 (Saccahromyces cerevisiae)에 특정 조건으로 자외선을 조사하여 제조된, 야생형 대비 향상된 헴 (Heme) 생산능을 갖는 사카로마이세스 효모 돌연변이 균주, 상기 효모 돌연변이 균주의 제조방법, 상기 효모 돌연변이 균주를 이용한 헴 생산방법, 상기 효모 돌연변이 균주 배양용 배지 조성물 및 상기 효모 돌연변이 균주로부터 생산되는 헴을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
지구온난화, 식량부족, 동물복지 등의 문제를 해결하기 위한 해결책으로 대체 단백질 소재에 대한 관심이 높아지고 있다. 또한, 세계적으로 소비자들의 건강에 대한 관심과 함께 채식 인구가 증가하면서 대체육에 대한 관심도 더불어 증가하고 있다. 이러한 사회적 흐름에 부합하여 다양한 대체육 제품의 개발 및 출시가 활발하게 이루어지고 있으며, 동물성 육류를 영향학적으로 대체할 수 있는 식물성 대체육 시장이 지속적으로 성장하고 있다.
초기 식물성 대체육 제조 기술은 조직 식물 단백질 (TVP, Textured Vegetable Protein)을 주원료로 시작되었으며, 원료 다변화와 원료별 특성 연구, 고수분 성형 기술을 이용한 고기의 식감구현, 고기 맛의 핵심 요소인 헴 (heme)의 생명공학기술을 이용한 생산 및 첨가의 순으로 발전해왔다.
대체육 시장에서 기술적으로 가장 앞서 있다고 평가받는 푸드테크 기업인 임파서블 푸드 (Impossible Foods)는 육류에 풍미를 내는 데 중요한 역할을 하는 헴을 GMO (genetically modified organism) 효모를 이용하여 생산하여 첨가하고 있으며, 이와 관련된 기술은 특허문헌 1에 개시되어 있다. 그러나, GMO 유래 식품을 반대하는 소비자들은 GMO 효모를 이용하여 생산된 헴의 소비에 부정적인 인식을 가지고 있다. 한편, 국내에서도 미국, 유럽과 마찬가지로 대체육에 대한 관심이 증가하고, 관련 식품 소비도 증가하고 있으나, 현재 생산되는 대체육은 주요 원료를 대부분 수입에 의존하고 있어 이를 국내산 자원으로 대체하는 연구가 필요한 실정이다. 특히, 국내에서는 GMO 유래 식품에 대한 규제가 강화되는 추세에 있어 GMO 효모를 이용하여 생산된 헴을 대체육에 첨가하는 데 제약이 있다.
한편, 헴은 일반적으로 유기용매나 효소적 가수분해에 의해 동물의 혈액에서 추출되기도 하지만, 도축 혈액으로부터 분리, 정제된 헴은 광우병 등과 같이 동물에서 유발될 수 있는 질병의 위험 때문에 안전성이 문제되고, 혈액 내 함량이 낮아 많은 혈액이 필요하며, 이 방법을 이용하는 경우 동물 도축이 반드시 요구되기 때문에 채식을 추구하는 소비자들은 동물을 도축하여 추출된 헴이 함유된 대체육 소비를 선호하지 않는다.
사카로마이세스 세레비지에 (Saccahromyces cerevisiae)는 단세포 진핵생물로 오랜 기간 식품공정에서 주정 및 제빵 용도로 사용되고 있는 GRAS (Generally Recognized as Safe) 균주이다. 본 발명에서는 야생형 효모를 사용하여 보다 단순한 방법으로 효모의 헴 생산성을 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 하였다. 이에 따라, 식품 산업에 이미 사용되고 있는 다양한 효모 균주 중 높은 헴 생산능을 가지는 야생형 효모를 모균주로 선정하고, 상기 모균주에 특정 조건의 자외선을 조사하여 야생형 대비 헴 생산성이 향상된 돌연변이 균주를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 등록특허 제10-2229968호
본 발명은 야생형 사카로마이세스 세레비지에 (Saccahromyces cerevisiae)에 특정 조건의 자외선을 조사하여 제조되는, 야생형 대비 헴 (Heme) 생산능이 향상된 사카로마이세스 효모 돌연변이 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 야생형 대비 헴 (Heme) 생산능이 향상된 사카로마이세스 효모 돌연변이 균주의 제조방법, 이를 이용한 헴 생산방법 및 상기 효모 돌연변이 균주 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 효모 돌연변이 균주로부터 생산되는 헴을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 야생형 대비 향상된 헴(Heme) 생산능을 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 아메리칸 위스키 제조용 효모 균주인 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638에 250 내지 260 nm 파장의 자외선을 수직 방향으로 20 내지 50 cm 떨어진 위치에서 3000 내지 9000 mW/cm2의 조사량으로 1 내지 2시간 동안 조사하여 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638과 비교하여, 1번 염색체에서 2383T>A 돌연변이, 2번 염색체에서 5951C>G 돌연변이, 3번 염색체에서 413A>T, 468T>A 돌연변이, 8번 염색체에서 364680A>T 돌연변이, 12번 염색체에서 1064782T>A, 1064817G>T, 1064835A>T 돌연변이, 13번 염색체에서 354374G>T, 908390C>T 돌연변이, 14번 염색체에서 6739G>A 돌연변이 및 15번 염색체에서 30,149A>T 돌연변이의 단일염기서열변이를 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 야생형 대비 향상된 헴(Heme) 생산능을 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 제조방법을 제공한다:
a) 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638을 전배양하는 단계; 및
b) 상기 전배양된 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638에 자외선을 조사하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 상기 a) 단계 및 b) 단계 사이에, a') 전배양된 균주를 600 nm에서 광학밀도가 0.5 내지 1.5가 되도록 희석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계는 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638에 250 내지 260 nm 파장의 자외선을 수직 방향으로 20 내지 50 cm 떨어진 위치에서 3000 내지 9000 mW/cm2의 조사량으로 1 내지 2시간 동안 조사하여 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계 이후에, c) 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638과 비교하여, 1번 염색체에서 2383T>A 돌연변이, 2번 염색체에서 5951C>G 돌연변이, 3번 염색체에서 413A>T, 468T>A 돌연변이, 8번 염색체에서 364680A>T 돌연변이, 12번 염색체에서 1064782T>A, 1064817G>T, 1064835A>T 돌연변이, 13번 염색체에서 354374G>T, 908390C>T 돌연변이, 14번 염색체에서 6739G>A 돌연변이 및 15번 염색체에서 30,149A>T 돌연변이의 단일염기서열변이를 가지는 돌연변이 균주를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)를 이용한 헴(Heme) 생산방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 헴 생산방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
a) 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)를 배양하는 단계; 및
b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 균주는 탄소원으로 포도당, 과당 또는 갈락토오스, 질소원으로 효모 추출, 펩톤, 트립톤, 맥아 추출물 (malt extract), 육추출물 (beef extract) 카세인 (casein), 소이톤 (soytone), 질산 나트륨 (sodium nitrate, NaNO3), 염화 암모늄 (ammonium chloride, NH4Cl) 및 황산 암모늄 (Ammonium sulphate, (NH4)2SO4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 질소원은 2 내지 6 %(w/v)의 효모 추출물 및 0.1 내지 3 %(w/v)의 펩톤일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 균주는 pH 3 내지 6에서, 100 내지 1500 rpm (revolutions per minute)의 교반속도로, 0.5 내지 10 vvm (aeration volume/medium volume/minute)의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양할 수 있다.
추가로, 본 발명은 다음을 포함하는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP) 배양용 배지 조성물을 제공한다:
i) 탄소원으로 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; 및
ii) 질소원으로 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤.
이때, 상기 배지 조성물은 헴 생산용 배지일 수 있다.
나아가, 본 발명은 야생형 대비 증대된 헴(Heme) 생산능을 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주로부터 생산되는 헴 또는 상기 균주의 배양물로부터 분리되는 헴을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 인공육 또는 육류 대체 식품일 수 있다.
또한, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 헴 생산 증대를 위한 전술한 배지 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)는 식품 산업에 이미 사용되고 있는, 야생형 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638에 특정 조건으로 자외선을 조사함으로써 제조되는 바, 기존 GMO 효모에 비해 훨씬 단순하고 간단한 방법으로 높은 헴 생산능을 나타내는 효모 균주를 확보할 수 있다. 이와 같이 제조된 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)는 야생형 대비 향상된 헴 생산능을 나타내어 보다 효율적인 헴 생산이 가능하다.
도 1은 효모 균주 세포 내 존재하는 헴을 추출하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 2는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638 균주를 pH 3.5 조건에서 40YP20D (4% (w/v) 효모 추출물 (40 g/L), 2% (w/v) 박토 펩톤 (20 g/L), 2% (w/v) 포도당 (20 g/L)) 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과로, (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량 (Dissolved Oxygen, DO%), (C)는 공급 용액 (feeding solution) 주입 속도를 나타낸다.
도 3은 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638 균주를 pH 4.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과로, (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량 (DO%), (C)는 공급 용액 (feeding solution) 주입 속도를 나타낸다.
도 4는 자외선 조사 시간에 따른 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638 균주의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) S288C와 본 발명의 돌연변이 효모의 모균주인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638의 ITS (internal transcribed spacer) 부분 (ITS1, 5.8S rRNA 및 ITS2 염기서열)을 BLAST를 수행하여 비교한 결과를 나타낸 것이다. 이때, 쿼리(Query)는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) S288C의 ITS 부분 (ITS1, 5.8S rRNA, ITS2)이고, 서브젝트(Subject)는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638의 ITS 부분 (ITS1, 5.8S rRNA, ITS2)이다. 쿼리 서열은 서열번호 1, 서브젝트 서열은 서열번호 2에 나타내었다.
도 6은 모균주인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638과 이로부터 유래된 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 ITS 부분 (ITS1, 5.8S rRNA 및 ITS2 염기서열)을 BLAST를 수행하여 비교한 결과를 나타낸 것이다. 이때, 쿼리(Query)는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638의 ITS 부분 (ITS1, 5.8S rRNA, ITS2)이고, 서브젝트(Subject)는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCTC 15212BP의 ITS 부분 (ITS1, 5.8S rRNA, ITS2)이다. 쿼리 서열은 서열번호 2, 서브젝트 서열은 서열번호 3에 나타내었다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 특징부의 크기, 양 및 물리적 특성을 표현하는 모든 수는 모든 경우 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에 개시된 수치 파라미터는 본 명세서에 개시된 교시 내용을 이용하여 당업자가 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다.
본 발명자들은 야생형 효모를 사용하여 보다 단순한 방법으로 효모의 헴 생산성을 향상시킬 수 있는 기술 개발의 필요성에 따라, 식품 산업에 이미 사용되고 있는 다양한 효모 균주 중 높은 헴 생산능을 가지는 야생형 효모를 모균주로 선정하고, 상기 모균주에 특정 조건의 자외선을 조사하여 야생형 대비 헴 생산성이 향상된 돌연변이 균주를 제조하였다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 야생형 대비 향상된 헴 (Heme) 생산능을 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 식품산업에 바로 적용 가능한 헴 고함량 효모 균주를 제조하기 위해, 식품 산업에 이미 사용되고 있는 다양한 효모 균주 중 헴 고함량 효모 균주를 일차적으로 선별하고 이를 모균주로 활용하고자 하였다. 선별 결과에 따라, 야생형 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)의 일종인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638이 다른 효모 균주에 비해 높은 헴 생산능을 가진다는 것을 확인하고, 이를 모균주로 선정하였다.
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 상기 모균주로 선정된 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638의 배양 조건을 최적화하기 위해, 탄소원으로 포도당, 질소원으로 효모 추출물 및 박토 펩톤을 포함하는 40YP20D 배지에서 모균주를 접종하고, 배양 배지의 산도, 교반 속도 및 공기 주입 속도를 조절하여 유가식 배양을 수행하였다. 그 결과, 도 2 및 3에 나타난 바와 같이 상기 모균주는 pH 3 내지 6에서, 100 내지 1500 rpm의 교반속도로, 0.5 내지 10 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것이 가장 높은 헴 생산성을 나타내는 것으로 확인되었다.
이때, 상기 배지에 포함되는 포도당은 탄소원으로 통상적으로 사용되는 다른 물질, 예를 들어 과당 또는 갈락토오스로 대체될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 배지에 포함되는 질소원으로 효모 추출물은 2 내지 6 %(w/v), 펩톤은 0.1 내지 3 %(w/v)로 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 배지에 포함되는 탄소원과 질소원의 종류 및 농도를 배양 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 높은 헴 생산성을 나타내는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638에 자외선을 조사하여 야생형에 비해 헴 생산성이 향상된 돌연변이 효모 균주를 제조하고자 하였다. 돌연변이 효모 균주 제조를 위해 254nm의 UV 램프 밑 30cm 거리에 상기 모균주가 들어있는 PCR 튜브를 2 내지 12시간 동안 두었다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 UV 조사 후 2시간째에서 97.8%의 사멸률을 보이는 것으로 확인되어, 이 시간대를 최적의 UV 조사 시간으로 선정하였다.
UV 처리 후 올라온 콜로니를 무작위로 선정하여 헴 농도를 분석한 결과, 모균주에 비해 헴 함량이 약 5% 증가한 돌연변이 효모 균주가 발굴되어, 이를 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) HS-Y009로 명명하고, 2022년 11월 29일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 15212BP를 부여받았다.
따라서, 상기 야생형 대비 향상된 헴 생산능을 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638로부터 유래될 수 있으며, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638에 250 내지 260 nm 파장의 자외선을 수직 방향으로 20 내지 50 cm 떨어진 위치에서 3000 내지 9000 mW/cm2의 조사량으로 1 내지 2시간 동안 조사하여 제조될 수 있다.
이때, 자외선을 조사하는 거리가 수직 방향으로 20 cm 미만인 경우 단시간의 자외선 조사에도 사멸률이 현저히 높아지는 문제가 발생할 수 있고, 자외선을 조사하는 거리가 수직 방향으로 50 cm를 초과하는 경우 장시간의 자외선 조사에도 돌연변이가 유도되지 않는 문제가 발생할 수 있다.
이때, 자외선을 조사하는 시간이 1시간 미만인 경우 사멸률이 낮아 돌연변이가 유도된 균주를 선별하기 어려울 수 있다. 자외선을 조사한지 2시간이 경과된 이후로는 시간 경과에 따른 사멸률에 변화가 거의 없으므로, 2시간을 초과하여 자외선을 조사하는 것은 불필요하다.
본 발명자들은 전장 유전체 리시퀀싱 (Whole genome re-sequencing)을 통해 야생형 대비 헴 생산능이 향상된 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 유전체 수준에서 돌연변이의 분포 및 양상을 확인하고자 하였다. 이를 위해, 먼저 사카로마이세스 세레비지에 S288C (S. cerevisiae S288C)를 전장 유전체로 사용하여 모주인 KCCM12638과 UV 돌연변이 균주인 KCTC 15212BP 간의 단일염기다형성 (Single Nucleotide　polymorphism, SNP) 정보를 확보하고, 전장 유전체 리시퀀싱을 통해 확보한 염기서열에서 ITS1, 5.8S rRNA 및 ITS2 염기서열 (이하, 'ITS 부분'이라 함)을 추출하여 KCTC 15212BP 균주와 모주인 KCCM12638의 ITS 부분을 비교하는 BLAST를 수행하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 848개의 KCCM12638 ITS 부분 중 841개의 염기서열이 S288C와 일치하였고, 도 6에 나타난 바와 같이 KCCM12638과 UV 돌연변이 균주인 KCTC 15212BP의 ITS 부분은 484개의 염기서열 중 484개가 모두 일치하여 KCTC 15212BP 또한 KCCM12638에서 유래한 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 균주임을 확인하였다.
다음으로, KCTC 15212BP 균주가 KCCM12638에서 변형된 독자적 생산 균주인지 확인하기 위하여, KCCM12638과 KCTC 15212BP 균주의 SNP를 비교하였다. 그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 KCTC 15212BP 균주는 KCCM12638 균주와 비교하여 최소 12개의 SNP, 즉, 1번 염색체에서 2383T>A 돌연변이, 2번 염색체에서 5951C>G 돌연변이, 3번 염색체에서 413A>T, 468T>A 돌연변이, 8번 염색체에서 364680A>T 돌연변이, 12번 염색체에서 1064782T>A, 1064817G>T, 1064835A>T 돌연변이, 13번 염색체에서 354374G>T, 908390C>T 돌연변이, 14번 염색체에서 6739G>A 돌연변이 및 15번 염색체에서 30,149A>T 돌연변이의 SNP를 갖는 것으로 확인되었다.
이와 같이 제조된 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)는 모균주인 야생형 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638에 비해 향상된 헴 생산능을 나타내는 바, 이를 산업적으로 헴을 대량 생산하기 위한 방법에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제2 측면은 전술한 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)를 이용한 헴 (Heme) 생산방법 및 상기 균주를 배양하기 위한 배지 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 헴 생산방법은 a) 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)를 배양하는 단계; 및 b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 배양은 상기 균주를 배양한 전배양액을 그대로 사용하거나, 분리된 균주를 사용하거나 또는 동결 보관된 균주 또는 이의 배양물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "배양"은 상기 균주를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에 따른　배양　방법에는 회분식　배양 (batch culture), 연속식　배양 (cintinuous culture) 및 유가식　배양 (fed-batch culture)이 포함되며, 구체적으로는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로　배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 배양은 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대 액상 배양 탱크, 회전 드럼식 발효기 (rotary drum fermentor) 또는 트레이 발효기 (tray fermentor)를 사용하여 배양할 수 있다. 상기 회전 드럼식 또는 트레이 발효기 이외에도 균주의 발효에 유용한 것이라면 그 형식에 제한 없이 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 생산 규모에 따라 적절한 장치를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서는 배양　중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을　배양물에 적절한 방식으로 첨가하여,　배양물의 pH를 조정할 수 있다.　배양　중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한　배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여,　배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)는 이의 모주인 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KCCM12638을 배양하는 배지와 동일한 배지에서 배양될 수 있다.
예를 들어, 상기 a) 단계의 균주는 탄소원으로 포도당, 과당 또는 갈락토오스, 질소원으로 효모 추출, 펩톤, 트립톤, 맥아 추출물 (malt extract), 육추출물 (beef extract) 카세인 (casein), 소이톤 (soytone), 질산 나트륨 (sodium nitrate, NaNO3), 염화 암모늄 (ammonium chloride, NH4Cl) 및 황산 암모늄 (Ammonium sulphate, (NH4)2SO4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다. 구체적으로, 상기 a) 단계의 균주는 탄소원으로 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스, 질소원으로 2 내지 6 %(w/v) 농도의 효모 추출물 및 0.1 내지 3 %(w/v) 농도의 펩톤을 포함하는 배지에서 배양할 수 있으나, 이로 한정되지 않으며, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 헴 생산성을 높이기 위한 목적으로 배지에 포함되는 탄소원과 질소원의 종류 및 농도를 배양 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
또한, 상기 a) 단계의 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 배양 조건은 이의 모주인 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638를 배양하는 조건과 동일할 수 있다.
예를 들어, 상기 a) 단계의 균주는 pH 3 내지 6, 보다 바람직하게는 pH 3 이상 5.5 미만, 100 내지 1500 rpm의 교반속도로, 0.5 내지 10 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양할 수 있으나, 이로 한정되지 않으며, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 헴 생산성을 높이기 위한 목적으로 pH, 교반 속도, 공기 주입 속도 등을 적절하게 조절할 수 있다.
이때, 상기 a) 단계에서 초기 포도당을 모두 소모한 시점에 추가로 공급 용액이 주입될 수 있다. 상기 공급 용액은 초기 배지와 같이 다양한 탄소원 및/또는 다양한 질소원을 포함할 수 있고, 초기 배지와 동일하거나 다른 탄소원 및/또는 질소원을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 초기 배지와 동일하나 고농도의 탄소원 및 질소원을 포함하는 공급 용액을 주입하였으나, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 초기 배지의 성분 및 배양 조건을 고려하여 공급 용액에 포함되는 성분 및 이의 농도를 적절히 선택하고 조절할 수 있다.
상기 공급 용액의 주입 속도는 배양액의 포도당 농도가 0 g/L에 가깝고, 에탄올 농도가 10 g/L를 초과하지 않는 범위 내에서 결정될 수 있다. 상기 범위에 포함되는, 탄소원 및 질소원을 포함하는 공급 용액의 주입 속도는 예를 들어 1 내지 50 mL/hr, 바람직하게는 2 내지 35 mL/hr일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 헴 생산방법에 있어서, 상기 b) 단계는 효모 균주를 파쇄하여 헴을 회수하는 본 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 b) 단계는 도 1에 기재된 일련의 과정에 의해 수행될 수 있다.
상기 도 1의 과정을 간략히 서술하면, 다음과 같다.
먼저, 상기 a) 단계의 배양 과정을 거친 효모 균주는 원심 분리한 후 OD600*mL=60 당 0.4 ml의 효모 용해 버퍼 (예컨대 Y-PER™ Yeast Protein Extraction Reagent)를 첨가하여 효모 세포를 파쇄하고, 파쇄된 0.4 ml의 효모 추출물에 1.2 ml의 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN)을 첨가하여 5분간 반응시킨 후 원심분리하여 상등액은 제거하고 침전물만 취한다. 회수된 침전물에 8 : 2의 부피 비율로 섞어 제조한 아세토나이트릴 : 1.7 M 염산 (HCl) 용액 1.6 ml을 첨가하여 20분 동안 반응시키고, 추가로 상온에서 포화된 농도의 MgSO4와 100 μg/L의 NaCl을 포함하는 용액 0.4 ml를 첨가하여 5분 동안 교반시킨 후, 원심분리하여 수용액층과 아세토나이트릴 층을 분리하고, 헴이 포함되어 있는 아세토나이트릴 층을 회수한다.
본 발명에 있어서 헴을 회수하는 방법에는, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 헴 생산방법에 있어서, 상기 b) 단계는 배지 내 헴 농도가 0.5 mM에 도달하기 전에 균주를 수확(harvest)하여 헴을 회수할 수 있다. 이는 배지 내 헴 농도가 0.5 mM에 도달하면 효모 생장이 저해되어 헴 생산량이 감소할 수 있기 때문이다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계는 균주 배양액에서 헴을 추가로 회수하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 헴 생산방법에 있어서, 상기 a) 단계에서 사용되는 배양 배지는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 헴 생산성을 높이기 위해 최적화된 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 제2 측면은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)를 배양하기 위한 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 배지 조성물은 전술한 헴 생산방법의 a) 단계에서 사용되는 배지를 포함할 수 있으며, 예를 들어, i) 탄소원으로 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; 및 ii) 질소원으로 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물을 사용하는 경우 사카로마이세스 세레비지에 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)는 이의 모균주인 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638에 비해 향상된 헴 생산성을 나타내는 바, 상기 배지 조성물은 헴 생산용 배지 조성물로 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 제2 측면은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 헴 생산 증대를 위한 전술한 조성물의 용도를 제공하며, 여기서, 상기 조성물은 i) 탄소원으로 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; 및 ii) 질소원으로 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명의 제2 측면은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 헴 생산 증대용 배양 배지의 제조를 위한 전술한 조성물의 용도를 제공하며, 여기서, 상기 조성물은 i) 탄소원으로 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; 및 ii) 질소원으로 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤을 포함할 수 있다.
상기와 같이 생산된 헴은 다양한 식품에 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제3 측면은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주로부터 생산되는 헴 또는 상기 균주의 배양물로부터 분리되는 헴을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 식품 제조를 위한 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주로부터 생산되는 헴 또는 상기 균주의 배양물로부터 분리되는 헴의 용도를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 균주 자체, 균주 파쇄물, 균주 농축물, 균주 추출물 및 균주 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 용어, "파쇄물"은 균주 자체를 물리화학적으로 처리하거나, 고압 멸균 또는 초음파 처리하여 수득한 것이거나, 균주의 배양물을 원심분리하여 얻은 상등액, 발효물 또는 배양액을 파쇄하여 수득한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "발효물"은 미생물을 배지에서 일정 기간 동안 배양하여 수득한 균주, 그의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 배지, 상기 배지로부터 균주를 제거한 배양액, 상기 배지 또는 배양액의 희석물 또는 농축물, 또는 이들의 건조물을 포함할 수 있다. 상기 "발효"는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시키는 과정 중 부패 반응이 아닌 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 균주로부터 발효물을 수득하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야 또는 유사 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수득할 수 있다.
본 발명에서, 상기 균주로부터 수득한 발효물은 발효된 물질 자체 뿐만 아니 라, 균주 및 배양물이 공존하는 균주의 배양 배지, 상기 배양 배지로부터 균주를 여과시킨 발효물, 상기 배양 배지를 원심분리하여 균주를 제외한 상등액, 상기 배양 배지로부터 균주를 멸균처리하고 이를 여과시킨 발효물, 상기 발효물 또는 이를 포함하는 배양 배지를 추출한 추출물, 상기 발효물 또는 이의 추출물을 희석시킨 희석액, 상기 발효물 또는 이의 추출물을 건조시킨 건조물, 상기 균주의 균체를 포집해서 파쇄시킨 용해물 등 상기 균주로부터 발생한 발효물을 포함하는 모든 종류의 물질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 가온 상태에서 일정 시간 동안 추출하여 수득한 액상 성분, 상기 액상 성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 용어, "건조물"은 상기 균주 자체 또는 배양물에서 수분이 제거된 것으로, 분무 건조, 동결 건조, 진공 건조 등의 공지된 건조 방법으로 건조된 균체 및 배양물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 균주를 배지에서 배양하여 수득한 산물을 의미한다. 그 예로 본 발명의 배양물은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212P)의 배양 배지 에서 상기 균주를 수확한 후 남은 배지에 잔존한 성분을 포함하거나, 상기 균주를 포함하는 배양 배지의 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "배양액"은 상기 배양물에서 균주를 제외한 부분을 의미한다. 그 예로 본 발명의 배양액은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212P)의 배양 배지에서 원심분리 후 상기 균주를 제외한 배양 상등액 또는 배양 상등액에서 파쇄물을 제외한 부분을 포함할 수 있다.
상기 배양물은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212P), 상기 균주의 전체 배양물, 배양 배지, 이들의 분획물 등이 될 수 있다. 상기 배양액은 상기 균주의 배양 상등액 등이 될 수 있다. 이때, 상기 배양 상등액은 상기 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 분획물은 상기 균주, 상기 배양물, 배양 상등액 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주로부터 생산되는 헴 또는 상기 균주의 배양물로부터 분리되는 헴을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 이의 함량은 식품의 종류, 식품 섭취 대상, 섭취 목적 등에 따라 적절하게 변경될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 인공육 또는 육류 대체 식품일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 인공육 또는 육류 대체 식품은 육류와 비슷한 식감, 질감, 풍미 및/또는 향미를 가지도록 모사한 고기 모조물을 의미한다.
상기 식품 조성물은 음용할 수 있는 식품이라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 식품의 비제한적인 예로는, 핫도그, 버거, 세절육, 소시지, 스테이크, 필렛, 구운 고기, 가슴살, 넓적다리살, 날개살, 미트볼, 미트로프, 베이컨, 스트립, 핑거, 너겟, 커틀렛 또는 큐브 형태의 동물 기반 또는 비-동물 기반 (예를 들어, 식물 기반) 식제품, 또는 동물 기반 또는 비-동물 기반 식제품의 조합을 포함한다.
상기 식품은 또 다른 양태로서, 스프 또는 스튜 베이스, 부용, 예를 들어, 분말 또는 큐브, 풍미제 패킷, 또는 조미 패킷 또는 쉐이커와 같은 식품 첨가제 형태로 제공될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[실시예 1]
효모 모균주의 선정과 분석
1-1. 모균주의 선정
식품산업에 바로 적용 가능한 헴 고함량 효모 균주를 제조하기 위하여, 위스키 제조에 사용되는 야생형 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)의 일종인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638을 한국미생물보존센터로부터 분양받았다. 모균주의 배양성적과 헴 함량을 파악하기 위하여 하기 1-2 내지 1-5의 과정을 수행하였다.
1-2. 전배양
초저온 냉동고 (deep freezer)에 보관 중인 효모 글리세롤 (glycerol) 스탁 (stock) 50 μl를 5 mL YP20D (1% (w/v) 효모 추출물 (10 g/L), 2% (w/v) 박토 펩톤 (20 g/L), 2% (w/v) 포도당 (20 g/L)) 배지가 포함되어 있는 시험관에 접종하여 25 ℃, 250 rpm에서 48시간 전배양하였다.
1-3. 본배양 및 효모 세포 파쇄
전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 100 mL YP50D (1% (w/v) 효모 추출물 (10 g/L), 2% (w/v) 박토 펩톤 (20 g/L), 5% (w/v) 포도당 (50 g/L)) 배지가 포함되어 있는 배플형 플라스크에 접종하였다. 25 ℃, 250 rpm 조건에서 48시간 진탕배양한 효모 균주 세포를 OD600ХmL=60이 되도록 (예를 들어, OD600=1이라면 60 mL의 배양액) 원심분리로 회수한 후, 0.4 mL의 Y-PER쪠 Yeast Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)를 첨가하여 효모 세포를 파쇄하였다.
1-4. 헴 농도 측정
도 1에 나타낸 바와 같이, 효모 추출물에 존재하는 헴 농도를 측정하기 위해 효모 세포 파쇄 용액을 전처리하였다. 도 1에 순서에 따라, 0.4 ml의 효모 추출물에 1.2 ml의 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN)을 첨가하여 5분간 반응시킨 후, 원심분리하여 상등액은 제거하고 침전물만 취하였다. 회수된 침전물에 8:2의 부피비로 섞어 제조한 아세토나이트릴 : 1.7 M 염산(HCl) 용액 1.6 ml을 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. 추가로, 상온에서 포화된 농도의 MgSO4와 100 μg/L의 NaCl을 포함하는 용액 0.4 ml를 첨가하여 5분 동안 교반시킨 후 원심분리하여 수용액층과 아세토나이트릴층을 분리하였다. 헴이 포함되어 있는 아세토나이트릴층을 취한 후 HPLC 분석을 진행하였다.
헴의 농도는 YMC-Pack ODS-A, 12 nm, 5 μm, 150 x 4.6 mm 컬럼 (YMC, Japan) 및 UV 검출기가 장착된 HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000)를 통해 측정하였다. 상세한 분석 조건은 표 1 및 표 2와 같다. 헴 표준물질로는 헤민 (Sigma, USA)을 사용하였다.
HPLC 조건
Mobile phase A ACN/H2O (5:95 v/v) + 0.1% Formic acid
Mobile phase B ACN/H2O (95:5 v/v) + 0.1% Formic acid
Flow rate 0.4 mL/min
Injection volume 20 μL
Autosampler temperature 5 ℃
Colum temperature 50 ℃
Detector UV-Vis at 400 nm
Gradient Time [min] A (%) B (%)
0 80 20
10 0 100
11 0 100
11.1 0 100
12 80 20
25 80 20
일반적인 실험용 효모 균주인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) D452-2를 대조군으로 하여 아메리칸 위스키 제조용 효모 균주인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638의 헴 농도와 비교하였다. 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) D452-2는 2.5 mg/L의 헴을 생산하는데 반해, S 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638은 8.6 mg/L를 나타내어 다른 효모 균주 대비 높은 헴 생산량을 보이는 것을 알 수 있었다. 본 실시예 결과를 토대로, 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638을 UV 무작위 돌연변이의 모주로 사용하였다.
1-5. 효모의 유가식 배양과 헴 생산 농도
유가식 배양은 회분식 배양과 다르게 미생물의 생장에 필요한 탄소원 및 질소원을 계속적으로 공급하여 균체량을 현저하게 증대시킬 수 있으며, 이에 따라 목적하는 물질의 생성량을 증대시킬 수 있다. 본 발명에서는 최종적으로 유가식 배양을 통해 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638 균주의 헴 생산량을 증대시키고자 하였다.
유가식 배양은 2.5 L 규모의 생물배양기에서 작업 부피 (working volume)를 1 L로 하여 진행하였다. 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 100 mL YP20D 배지가 포함되어 있는 배플형 플라스크에 접종하여 25 ℃, 250 rpm에서 48시간 계대배양을 진행하였다. 계대배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 1 L의 40YP20D ((4% (w/v) 효모 추출물 (40 g/L), 2% (w/v) 박토 펩톤 (20 g/L), 2% (w/v) 포도당 (20 g/L)) 배지에 접종하였다. 배양조건은 pH를 3.5 또는 4.5로 유지하여 25 ℃, 700 rpm, 2 vvm 조건에서 진행하였다. 초기 포도당을 모두 소모한 시점에서 추가로 공급 용액 (feeding solution; 280 g/L 효모 추출물, 140 g/L 박토 펩톤, 350 g/L 포도당)을 4-24 mL/hr의 유속으로 주입하였다. 공급 용액의 주입속도는 효모 배양액의 포도당 농도가 0 g/L에 가깝고 에탄올의 농도가 10 g/L를 초과하지 않는 범위 내에서 결정하였다. 교반속도 및 공기주입 속도를 각각 최소 700 rpm 및 2 vvm에서 최대 1200 rpm 및 5 vvm까지 증가시켜 용존 산소량 (DO)을 높은 수치로 유지하였다. 포도당 (glucose), 글리세롤 (glycerol), 초산 (acetate) 및 에탄올 (ethyl alcohol)의 배지 중 농도는 Rezex ROA-organic acid H+ column (Phenomenex,Torrance, CA) 및 RI (Refractive index) 검출기가 장착된 HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000)를 통해 측정하였다. 컬럼 온도는 70 ℃로 유지하였으며, 이동상으로는 5 mM의 황산 (H2SO4) 용액을 0.6 mL/min의 유속으로 흘려주어 검출하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다.
pH 3.5와 pH 4.5 조건에서 상기와 같은 방법으로 유가식 배양을 수행해본 결과, 도 2에서 확인되는 바와 같이 pH 3.5 조건에서는 최대 37.3 mg/L 헴이 생산되었고, 도 3에서 확인되는 바와 같이 pH 4.5 조건에서는 최대 48.5 mg/L 헴이 생산되어 pH 4.5 조건이 헴 생산에 바람직한 것으로 확인되었다.
[실시예 2]
무작위 변이를 통한 개량균주 제조
2-1. UV 랜덤 돌연변이 제조
초저온 냉동고 (deep freezer)에 보관 중인 효모 균주 KCCM12638 글리세롤 (glycerol) 스탁 (stock) 50 μl을 5 mL YP20D (1% (w/v) 효모 추출물 (10 g/L), 2% (w/v) 박토 펩톤 (20 g/L), 2% (w/v) 포도당 (20 g/L)) 배지가 포함되어 있는 시험관에 접종하여 25 ℃, 250 rpm에서 48시간 전배양하였다.
전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 희석 후 그 중 0.2mL를 취하여 원심분리로 회수하였다. 회수된 균체를 YP20D에 풀어준 후 PCR 튜브로 옮겨주었다. UV 랜덤 돌연변이 제조를 위하여 254nm의 UV 램프 밑 30cm 거리에서 3000 내지 9000 mW/cm2 조사량으로 효모 균체가 들어있는 PCR 튜브를 2~12시간 동안 두었다. 도 4에 나타난 바와 같이 UV 조사 후 2시간째에서 97.8%의 사멸률을 보이는 것으로 확인되었는바, 이 시간대를 최적의 UV 조사 시간으로 선정하였다. 2시간 동안 UV 조사된 효모 균체를 103, 104, 105 배로 희석한 후 0.1 mL를 취하여 YPD 아가 배지에 도말하여 30 ℃, 48시간동안 배양하였다.
2-2. 변이주의 헴 함량 확인
UV 처리 후 올라온 콜로니를 무작위로 선정하여 실시예 1와 같이 전배양과 본배양(배플 플라스크 진탕배양)을 수행하여 헴의 농도를 분석하였다. 분석한 콜로니 중 모균주 KCCM12638보다 헴 함량이 높은 균주를 선별하고자 하였다. 결과에 의한 배양 성적(OD600)과 헴 함량은 하기 표 3과 같다.
균주 48시간
OD600 헴 (mg/L)
KCCM12638 38.8 8.3
KCTC 15212BP 36.5 8.7
상기 표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 테스트한 균주의 OD600은 비슷한 수준이며, 모주인 KCCM12638에 비하여 헴 함량이 5% 증가하였다. 헴 함량이 약 1.05배 증가한 균주를 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) HS-Y009로 명명하였으며, 이 균주를 2022년 11월 29일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 15212BP를 부여받았다.
[실시예 3]
UV 돌연변이 균주의 동정 및 SNP분석
전장 유전체 리시퀀싱 (Whole genome re-sequencing)을 마크로젠에 의뢰하여, 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) S288C를 전장 유전체로 사용하여 모주인 KCCM12638과 UV 돌연변이 균주인 KCTC 15212BP 간의 SNP 정보를 확보하였다. 전장 유전체 리시퀀싱은 전장 유전체(reference genome)를 가진 종을 대상으로 특정 개체 간의 변이를 분석하여 개체나 집단의 염기서열의 비교하는 것이다. 전장 유전체 리시퀀싱을 통하여 유전체 수준에서의 돌연변이의 분포 및 양상을 확인할 수 있다.
우선, 전장 유전체 리시퀀싱을 통해 확보한 염기서열에서 ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 염기서열 (이하, ITS 부분)을 추출하여 KCTC 15212BP 균주가 모주인 KCCM12638과 같은 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae)인지 확인하고자 하였다.
ITS 부분의 비교를 위하여, 전장 유전체 리시퀀싱의 전장 유전체의 S288C와 돌연변이의 모주인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638의 ITS 부분을 비교하는 BLAST(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/)를 수행하였다. 도 5의 비교 결과에서 확인되는 바와 같이, 848개의 KCCM12638 ITS 부분 중 841개의 염기서열이 S288C와 일치하였다.
이어서, 모주인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638과 UV 돌연변이 균주인 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCTC 15212BP와의 ITS 부분을 비교하였다. 도 6에 나타난 바와 같이 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCCM12638 균주와 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) KCTC 15212BP 균주의 ITS 부분은 484개의 염기서열 중 484개가 일치하여 KCTC 15212BP 또한 KCCM12638에서 유래한 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae) 균주임을 확인하였다.
다음으로, KCTC 15212BP 균주가 KCCM12638에서 변형된 독자적 생산 균주인지 확인하기 위하여, 전장 유전체 리시퀀싱 분석 결과 중 SNP를 이용하였다. S288C의 염색체 서열을 기준으로, KCCM12638 및 KCTC 15212BP 균주의 SNP를 비교한 결과를 표 4에 나타내었다. 기준이 되는 S288C의 염색체 서열 정보는 NCBI에 공개되어 있으며, 표 4의 각 염색체에 대한 NCBI ID 정보를 표 5에 나타내었다.
염색체 위치 S288C KCCM12638 KCTC 15212BP
1 2,383 C T A
2 5,951 A C G
3 413 C A T
3 468 G T A
8 364,680 C A T
12 1,064,782 C T A
12 1,064,817 A G T
12 1,064,835 G A T
13 354,374 C G T
13 908,390 G C T
14 6,739 C G A
15 30,149 G A T
염색체 #Chromosome Genbank ID RefSeq ID
1 NC_001133.9 BK006935.2 NC_001133.9
2 NC_001134.8 BK006936.2 NC_001134.8
3 NC_001135.5 BK006937.2 NC_001135.5
3 NC_001135.5 BK006937.2 NC_001135.5
8 NC_001140.6 BK006934.2 NC_001140.6
12 NC_001144.5 BK006945.2 NC_001144.5
12 NC_001144.5 BK006945.2 NC_001144.5
12 NC_001144.5 BK006945.2 NC_001144.5
13 NC_001145.3 BK006946.2 NC_001145.3
13 NC_001145.3 BK006946.2 NC_001145.3
14 NC_001146.8 BK006947.3 NC_001146.8
15 NC_001147.6 BK006948.2 NC_001147.6
표 4에서 확인되는 바와 같이, KCTC 15212BP 균주는 KCCM12638 균주와 비교하여 최소 12개의 SNP를 가지고 있다. 구체적으로, KCTC 15212BP 균주는 1번 염색체에서 2383T>A 돌연변이, 2번 염색체에서 5951C>G 돌연변이, 3번 염색체에서 413A>T, 468T>A 돌연변이, 8번 염색체에서 364680A>T 돌연변이, 12번 염색체에서 1064782T>A, 1064817G>T, 1064835A>T 돌연변이, 13번 염색체에서 354374G>T, 908390C>T 돌연변이, 14번 염색체에서 6739G>A 돌연변이, 15번 염색체에서 30,149A>T 돌연변이의 SNP를 갖는다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)
수탁번호 : KCTC15212BP
수탁일자 : 20221129
Figure PCTKR2023020568-appb-img-000001

Claims (18)

  1. 야생형 대비 증대된 헴(Heme) 생산능을 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae KCCM12638)로부터 유래된 것인, 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae KCCM12638)에 250 내지 260 nm 파장의 자외선을 수직 방향으로 20 내지 50 cm 떨어진 위치에서 3000 내지 9000 mW/cm2의 조사량으로 1 내지 2시간 동안 조사하여 제조되는 것인, 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae KCCM12638)과 비교하여, 1번 염색체에서 2383T>A 돌연변이, 2번 염색체에서 5951C>G 돌연변이, 3번 염색체에서 413A>T, 468T>A 돌연변이, 8번 염색체에서 364680A>T 돌연변이, 12번 염색체에서 1064782T>A, 1064817G>T,1064835A>T 돌연변이, 13번 염색체에서 354374G>T, 908390C>T 돌연변이, 14번 염색체에서 6739G>A 돌연변이, 15번 염색체에서 30,149A>T 돌연변이의 단일염기서열변이를 갖는 것인, 균주.
  5. a) 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae KCCM12638)를 전배양하는 단계; 및
    b) 상기 전배양된 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638에 자외선을 조사하는 단계;
    를 포함하는, 야생형 대비 증대된 헴(Heme) 생산능을 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 a) 단계 및 b) 단계 사이에, a') 전배양된 균주를 600 nm에서 광학밀도가 0.5 내지 1.5가 되도록 희석하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 b) 단계는 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638 (Saccharomyces cerevisiae KCCM12638)에 250 내지 260 nm 파장의 자외선을 수직 방향으로 20 내지 50 cm 떨어진 위치에서 3000 내지 9000 mW/cm2의 조사량으로 1 내지 2시간 동안 조사하여 수행되는 것인, 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 b) 단계 이후에, c) 사카로마이세스 세레비지에 KCCM12638과 비교하여, 1번 염색체에서 2383T>A 돌연변이, 2번 염색체에서 5951C>G 돌연변이, 3번 염색체에서 413A>T, 468T>A 돌연변이, 8번 염색체에서 364680A>T 돌연변이, 12번 염색체에서 1064782T>A, 1064817G>T,1064835A>T 돌연변이, 13번 염색체에서 354374G>T, 908390C>T 돌연변이, 14번 염색체에서 6739G>A 돌연변이, 15번 염색체에서 30,149A>T 돌연변이의 단일염기서열변이를 가지는 돌연변이 균주를 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
  9. 제1항의 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)를 이용한 헴(Heme) 생산방법.
  10. 제9항에 있어서,
    a) 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계;
    를 포함하는, 헴 생산방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 a) 단계의 균주는 탄소원으로 포도당, 과당 또는 갈락토오스, 질소원으로 효모 추출, 펩톤, 트립톤, 맥아 추출물 (malt extract), 육추출물 (beef extract) 카세인 (casein), 소이톤 (soytone), 질산 나트륨 (sodium nitrate, NaNO3), 염화 암모늄 (ammonium chloride, NH4Cl) 및 황산 암모늄 (Ammonium sulphate, (NH4)2SO4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 헴 생산방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 질소원은 2 내지 6 %(w/v)의 효모 추출물 및 0.1 내지 3 %(w/v)의 펩톤인, 헴 생산방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 a) 단계의 균주는 pH 3 내지 6에서, 100 내지 1500 rpm의 교반속도로, 0.5 내지 10 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것인, 헴 생산방법.
  14. i) 탄소원으로 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; 및
    ii) 질소원으로 2 내지 6% (w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤;
    을 포함하는, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP) 배양용 배지 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 상기 배지 조성물은 헴 생산용 배지 조성물인, 배지 조성물.
  16. 야생형 대비 증대된 헴(Heme) 생산능을 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주로부터 생산되는 헴 또는 상기 균주의 배양물로부터 분리되는 헴을 포함하는 식품 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 식품은 인공육 또는 육류 대체 식품인 것인, 식품 조성물.
  18. 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이 균주 (수탁번호 KCTC 15212BP)의 헴 생산 증대를 위한 제14항의 배지 조성물의 용도.
PCT/KR2023/020568 2022-12-21 2023-12-13 고농도의 헴을 생산하는 효모 돌연변이 균주 및 이를 이용한 헴 고생산 방법 Ceased WO2024136283A1 (ko)

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