WO2024128201A1 - ｍＲＮＡワクチン - Google Patents

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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • DNA vaccines are thought to have a risk of mutagenesis due to random insertion into the host genome, whereas mRNA vaccines, which use mRNA to present antigenic proteins, are thought to have no risk of mutagenesis in the host genome and have been attracting attention in recent years.
  • Non-Patent Document 2 J. Control. Release (2011) 151, p. 104-0109. Such large aggregates may clog capillaries in the lungs, etc.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 (Biomaterials 197 255-267 2019, Advanced Healthcare Materials 11 2102016 2022) describe the improvement of the in vivo introduction efficiency of mRNA by mRNA functionalization.
  • Non-Patent Document 5 (Biomaterials 150 162-170 2018) describes the application of mRNA functionalization to mRNA vaccines.
  • an mRNA vaccine containing an mRNA encoding an antigen, at least one RNA oligomer hybridized to the mRNA, and a cationic polymer encapsulating the mRNA, in which the at least one RNA oligomer is modified with polyethylene glycol, is useful as an mRNA vaccine, and thus completed the present invention.
  • RNA sequence consists of a sequence of 15 to 23 bases.
  • RNA sequence consists of a sequence of 12 to 30 bases.
  • RNA sequence consists of a 17-base sequence.
  • polyethylene glycol modification is made at the 5' end or 3' end of the RNA oligomer sequence without an overhang sequence.
  • RNA vaccine according to any one of [1] to [4] above, wherein the at least one RNA oligomer is one or two RNA oligomers.
  • [6c] The mRNA vaccine according to any one of [1] to [6b] above, wherein the cationic polymer is selected from linear or branched polyethyleneimine, polylysine, polyarginine, chitosan derivatives, polymethacrylic acid derivatives, polyamino acid derivatives having cationic residues in their side chains, polyether derivatives, amphiphilic polyamino acid derivatives, and block copolymers of amphiphilic polyamino acids and hydrophilic polymers.
  • the cationic polymer is selected from linear or branched polyethyleneimine, polylysine, polyarginine, chitosan derivatives, polymethacrylic acid derivatives, polyamino acid derivatives having cationic residues in their side chains, polyether derivatives, amphiphilic polyamino acid derivatives, and block copolymers of amphiphilic polyamino acids and hydrophilic polymers.
  • the 5'UTR and 3'UTR sequences of the mRNA may have 100% sequence identity with the naturally occurring sequences, or may be partially or entirely replaced with other 5'UTR and/or 3'UTR sequences.
  • Examples of other 5'UTR and/or 3'UTR sequences include 5'UTR and/or 3'UTR sequences of mRNAs encoding globin, hydroxysteroid (17- ⁇ ) dehydrogenase 4, or albumin.
  • Chemical modification of mRNA bases is known to improve the enzyme resistance of mRNA, for example.
  • Examples of such chemically modified bases in mRNA itself include methylated bases (e.g., 5-methylcytosine), sulfur-modified bases (e.g., 2-thiouridine), pseudouridine, N1-methylpseudouridine, and 5-methoxyuridine.
  • Modifying the G/C content of the coding region of mRNA involves modifying it so that it has a higher G (guanine)/C (cytosine) content, which makes the mRNA more stable.
  • the modification of the mRNA Cap structure involves changing the 2nd position of the first or second ribose on the 5' side to a methoxy group, which is known to improve expression efficiency.
  • the position in the mRNA to which the RNA oligomer is hybridized may be any of the 5'UTR, coding region, 3'UTR, and polyA sequence. It is preferable to predict the secondary structure of the mRNA and design the RNA oligomer so that it hybridizes to a portion of the mRNA strand that does not have a secondary structure. In other words, it is preferable to design the RNA oligomer so that it hybridizes to a portion of the entire mRNA sequence that does not have a secondary structure. Examples of software for predicting the secondary structure of mRNA include those described in the Examples below.
  • the polyethylene glycol modification of the RNA oligomer may be performed without an overhang sequence, or may be performed via an overhang sequence.
  • an "overhang sequence” is a sequence that does not hybridize to mRNA.
  • either the 5' end or the 3' end of the RNA sequence of (a) or (b) may be modified with polyethylene glycol via an overhang sequence.
  • the protein translation activity from the mRNA tends to decrease slightly when the polyethylene glycol used has a weight-average molecular weight of 12k PEG.
  • the translation activity is maintained to some extent when the PEG chain length is longer. In other words, the protein translation activity from the mRNA decreases as the PEG chain length increases, and the translation activity tends to be maintained high when the PEG chain length is shorter (for example, 2k).
  • the translation activity can be appropriately maintained by appropriately adjusting the weight-average molecular weight of the polyethylene glycol used.
  • the optimal number of PEGs to efficiently deliver mRNA to the spleen while suppressing delivery to the lungs varies depending on the chain length of the PEG. For example, when PEG 2k is used, 2 or 4 strands are preferable, while when PEG 12k is used, 1 strand is preferable (FIG. 3). Furthermore, with PEG 2k, there was no pulmonary vascular obstruction when there were two or four strands ( Figure 5).
  • Hybridization of RNA oligomers to mRNA can be performed by known methods and conditions.
  • the mixture is heated and left to stand for a certain period of time, and then the temperature is gradually lowered. Heating is performed for the purpose of more efficiently binding the mRNA and oligomer by breaking the complementary bonds that already exist within and between the molecules of the mRNA and oligomer.
  • the temperature and time can be adjusted as appropriate. The more slowly the temperature is lowered, the greater the specificity of the hybridization.
  • the chain length of the oligomer does not have a significant effect on the setting of hybridization conditions.
  • the conditions should be set appropriately while evaluating the hybridization efficiency. For example, the methods and conditions described in the Examples below can be mentioned.
  • a "subject” is a human or a non-human organism, such as birds and non-human mammals (e.g., cows, monkeys, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, pigs, dogs, rabbits, sheep, and horses).
  • non-human mammals e.g., cows, monkeys, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, pigs, dogs, rabbits, sheep, and horses.
  • the additives are selected from the above, either alone or in appropriate combination, depending on the dosage form of the mRNA vaccine.
  • purified double-stranded RNA can be dissolved in a solvent (e.g., physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.) to which Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. can be added.
  • a solvent e.g., physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. can be added.
  • the RNA may be freeze-dried to form a dosage form that is dissolved before use.
  • excipients for freeze-drying include sugars such as mannitol, glucose, lactose, sucrose, mannitol, and sorbitol; starches such as starches derived from corn, wheat, rice, potato, or other plants; celluloses such as methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, or sodium carboxymethylcellulose; gums such as gum arabic and gum tragacanth; gelatin; collagen; and the like.
  • the storage state of the mRNA vaccine is not limited, and a state such as a solution or powder can be selected taking into consideration its stability (storage property) and ease of use.
  • the kit may contain other components in addition to the mRNA vaccine. Examples of the other components include various buffers and instructions for use (manuals for use).
  • the kit may or may not contain an adjuvant. Preferably, the kit does not contain an adjuvant.
  • PEG Polyethylene Glycol
  • FLuc mRNA-(L-7602) was purchased from Trilink and used (coding sequence of fLuc mRNA: https://www.trilinkbiotech.com/media/folio3/productattachments/product_insert/fluc_orf_catno_l-7202_l-7602_l-7702_1.txt).
  • PEGylated mRNA was prepared using fLuc mRNA (Trilink) as follows.
  • RNA secondary structure prediction software http://rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/), and RNA oligomers were designed for the parts of the RNA strand that did not have a secondary structure.
  • the RNA oligomers, including the 5'-end PEG modification, were synthesized by Gene Design Co., Ltd. at the request of the customer. Here, linear PEGs with a weight-average molecular weight of 2,000 or 12,0000 were used.
  • the following 5'-end PEG-modified RNA oligomers were purchased from Gene Design Co., Ltd.
  • Sequence p1 (SEQ ID NO: 1): GGGGCCCUUCUUGAUGU Sequence p2 (SEQ ID NO: 2): UCGUUGUAGAUGUCGUU Sequence p3 (SEQ ID NO:3): CACGUUCAGGAUCUUCU Sequence p4 (SEQ ID NO: 4): AUGGCGGUGUCGGGGAU Sequence p5 (SEQ ID NO:5): GGGUGCUCUUGGCGAAG Sequence p6 (SEQ ID NO:6): UUGUCGUCGCCCUCGGG Sequence p7 (SEQ ID NO: 7): UACUUGAUCAGGCUCUU
  • Hybridization was carried out by adding one equivalent of RNA oligomer to the mRNA, heating at 65°C for 5 minutes, and cooling to 30°C over 10 minutes. This produced PEGylated mRNA.
  • RNA oligomers with the following sequences were used for PEGylated mRNAs with 1, 2, 3, 4 and 7 RNA oligomers (PEG1, PEG2, PEG3, PEG4 and PEG7, respectively).
  • PEG1 sequence p4
  • PEG2 sequences p2, p6
  • PEG3 sequences p1, p4, p7
  • PEGylated mRNA with zero RNA oligomers PEG0 was not subjected to hybridization.
  • Polymeric nanoparticles were prepared by mixing PEGylated mRNA and polycations. Specifically, linear polyethyleneimine (LPEI) (product name: in vivo jetPEI, PolyPlus) or polyaspartide in which diethyltriamine or cyclohexylethyl is added to the side chain of aspartic acid (PAsp (DET / CHE) polymerization degree 26 was produced according to the method disclosed in International Publication No. 2020/067142) was used as the polycation. Specifically, the number of amino groups in the polycation (N) and the number of phosphate groups in the mRNA (P) were mixed so that the ratio (N / P ratio) was 4 to prepare polymeric nanoparticles.
  • LPEI linear polyethyleneimine
  • PAsp DET / CHE
  • the effect of PEG chain length was evaluated using cultured cells. Specifically, DC2.4 cells were seeded at 5,000 cells/well on a 96-well plate, and after 24 hours, the above-mentioned nanoparticles were added so that the amount of fLuc mRNA per well was 100 ng. After 24 hours, the amount of luciferase expression was quantified using a luciferin substrate (luciferase assay system (Promega)) and a luminometer (Lumat3 LB9508 luminometer, Berthold Technologies).
  • the optimal number of PEGs for efficiently delivering mRNA to the spleen while suppressing its delivery to the lungs varies depending on the chain length of the PEG. For example, 2 or 4 PEGs are preferred for PEG 2k, while 1 PEG is preferred for PEG 12k.
  • the PEG chain length is short, the distribution to the lungs is suppressed while maintaining the distribution to the spleen by increasing the number of PEG chains.
  • FIG. 4 shows the results when PEG2000 was used as the polymer nanoparticle with the polyaspartamide derivative PAsp(DET/CHE) aspartamide having diethylenetriamine (DET) and 2-cyclohexylethylamine (CHE) introduced into the side chain.
  • Cy5-labeled mRNA fLuc mRNA was labeled with Cy5 using Label IT® TrackerTM Intracellular Nucleic Acid Localization Kit (Mirus).
  • sample Polymeric nanoparticles were prepared from Cy5-labeled mRNA in the same manner as in Example 2. The polymer nanoparticles used here were made of linear PEG with a weight-average molecular weight of 2,000.
  • Test method BALB/c mice (female, 7 weeks old) were anesthetized with isoflurane and fixed on the microscope stage of an A1R+ in vivo confocal microscope (Nikon).
  • Pulmonary inflammatory response was examined. Specifically, polymeric nanoparticles composed of fLuc mRNA prepared in 1.2 were administered to mice via the tail vein in a 200 ⁇ L solution containing 5 ⁇ g of fLuc mRNA in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl. Four hours after administration, the mice were sacrificed and the lungs were removed. Total RNA was extracted using RNeasy mini kit (Qiagen) and reverse transcribed using ReverTra Ace (registered trademark) qPCR RT Master Mix (Toyobo).
  • Quantitative PCR was then performed using a taqman gene expression assay (applied biosystems) and a Mic qPCR Cycler (Bio Molecular Systems) to determine the amount of IFN ⁇ and the amount of Actin ⁇ as a control.
  • the polymer nanoparticles used here were made of linear PEG with a weight-average molecular weight of 2,000. The results are shown in Figure 6. As shown in Figure 6, it was found that pulmonary inflammatory response was reduced in PEG2 and PEG4 compared to PEG0.
  • Example 2 Vaccine Effect 2.1 Preparation of Polyethylene Glycol (PEG)-Modified mRNA
  • the mRNA used was OVA mRNA (CleanCap (registered trademark) OVA mRNA-(L-7610)) purchased from Trilink (OVA mRNA coding sequence: https://www.trilinkbiotech.com/media/folio3/productattachments/product_insert/ova_orf_catno_l-7210_l-7610_.txt).
  • OVA mRNA CleanCap (registered trademark) OVA mRNA-(L-7610)
  • Trilink OVA mRNA coding sequence: https://www.trilinkbiotech.com/media/folio3/productattachments/product_insert/ova_orf_catno_l-7210_l-7610_.txt).
  • PEGylated mRNA of OVA mRNA was prepared as follows.
  • RNA secondary structure prediction software http://rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/), and RNA oligomers were designed for the portion of the RNA strand that does not have a secondary structure.
  • the RNA oligomers, including the 5'-end PEG modification, were synthesized by Gene Design Co., Ltd. at the request of the customer. A linear PEG with a weight-average molecular weight of 2,000 was used here.
  • the following 5'-end PEG-modified RNA oligomers were purchased from Gene Design Co., Ltd. These RNA oligomers hybridize to the coding region of the mRNA.
  • Sequence p8 (SEQ ID NO: 8): GGUUCAGGAUGUCCCGC Sequence p9 (SEQ ID NO: 9): GUCCUCGUCCUUGAAGG Sequence p10 (SEQ ID NO: 10): GCUUCUCGAAGUUGAUG Sequence p11 (SEQ ID NO: 11): GGCGAUGUGCUUGAUGC
  • RNA oligomers with the following sequences were used for PEGylated mRNAs with 2 and 4 RNA oligomers (PEG2 and PEG4, respectively).
  • PEG2 sequences p8, p10
  • PEG4 sequences P8 to P11 It should be noted that no hybridization was carried out for PEGylated mRNA (PEG0) having zero RNA oligomers.
  • Polymeric nanoparticles were prepared by mixing PEGylated mRNA and polycations. Specifically, PEGylated mRNA and linear polyethyleneimine (LPEI) (product name: in vivo jetPEI, PolyPlus) were mixed so that the ratio of the number of amino groups in LPEI (N) to the number of phosphate groups in mRNA (P) (N/P ratio) was 4.
  • LPEI linear polyethyleneimine
  • the results are shown in the right panel of Figure 7.
  • the vertical axis in the right panel of Figure 7 indicates the number of splenocytes that produced IFN- ⁇ in response to OVA, which is an index of cellular immunity.
  • the cationic polymer complex (PEG0) using single-stranded OVA mRNA was able to induce high levels of cellular immunity, but pulmonary vascular obstruction occurred, and the problem of inflammatory reactions makes clinical application of this form difficult.
  • cationic polymer complexes (PEG2 and PEG4) using OVA mRNA hybridized with PEG-modified RNA oligomers did not cause pulmonary vascular obstruction and were safe.
  • PEG2 and PEG4 sufficient cellular immune responses were observed, even when compared with the cationic polymer complex (PEG0) using unmodified single-stranded OVA mRNA.
  • Example 3 Toxicity test sample
  • the polymer nanoparticles used were those prepared in Example 1.
  • the polymer nanoparticles used here had a polycation of LPEI and a linear PEG with a weight-average molecular weight of 2,000.
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • LDH lactate dehydrogenase
  • BUN blood urea nitrogen
  • CRE creatinine

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Abstract

ここでは、抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーと、前記ｍＲＮＡを内包するカチオン性ポリマーを含むｍＲＮＡワクチンであって、ＲＮＡオリゴマーは、（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列を含み、かつＲＮＡオリゴマーはポリエレングリコール修飾を含む、ｍＲＮＡワクチンが提供される。これにより、新たなｍＲＮＡワクチンが提供される。

Description

ｍＲＮＡワクチン
　本発明は、ｍＲＮＡワクチンなどに関する。
　病原体の病原性を弱めて用いる従来の生ワクチンは病原性の復帰により副作用が生じる恐れがある。また、病原体の病原性をなくして用いる従来の不活化ワクチンは感染細胞が出現しないため細胞性免疫を誘導しにくいという問題がある。
　ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチンなどの核酸ワクチンでは、抗原タンパク質を提示するために核酸を用いる。すなわち、核酸ワクチンは、投与した核酸を抗原提示細胞の核内又は細胞質に移行させて抗原タンパク質を発現させ、抗原タンパク質を提示させることによって免疫を誘導する。核酸ワクチンは、病原性の復帰の問題がないため生ワクチンと比較して安全性が高いと考えられている。また、核酸ワクチンでは抗原提示細胞の細胞質内で抗原タンパク質を産生するため細胞性免疫を誘導することが可能であり、このため、核酸ワクチンは、がんや慢性感染症への展開が可能である。さらに、核酸ワクチンでは配列を変えるだけで比較的自由な核酸の設計が可能であり、このため、核酸ワクチンには、がんの個別化治療に用いることができること、ウイルス変異にも迅速に対応可能あることからパンデミックへの素早い対応が可能であること、などの利点もある。
　このうちＤＮＡワクチンでは、ホストゲノムへのランダムな挿入による変異誘発のリスクがあると考えられている。その一方で、抗原タンパク質を提示するためにｍＲＮＡを用いるｍＲＮＡワクチンは、ホストゲノムへの変異誘発のリスクがないと考えられており、近年注目を集められている。
 
　ｍＲＮＡワクチンでは、脂質性ｍＲＮＡ送達キャリアが主に用いられている（非特許文献１：Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３４，ｐ．３９６－４０１）。脂質性ｍＲＮＡ送達キャリアにおいて、カチオン性脂質やｐＨ応答性脂質が強い免疫賦活化作用を有し、非特異的炎症が生じる可能性があることが知られている。また、脂質性粒子は強い肝臓への指向性を有し、肝臓にて抗原を発現させる可能性がある。さらに、脂質代謝産物の体内への蓄積も懸念される。
　脂質性ｍＲＮＡ送達キャリアに代えてｍＲＮＡ送達キャリアとしてカチオン性ポリマーを用いることも考えられるが、高分子と核酸の複合体は、血液中で血小板等と結合し、数μｍ以上の凝集体を形成することが知られている（非特許文献２：Ｊ．Ｃｏｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１１）１５１，ｐ．１０４－０１０９）。このように大きな凝集体は、肺等の毛細血管を閉塞する恐れがある。
　ここで、特許文献１（国際公開第２０１８／１２４１８１号）には、ｍＲＮＡと、ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを含む二本鎖ＲＮＡを含む、機能化ｍＲＮＡが記載されており、この機能化ｍＲＮＡを用いたｍＲＮＡワクチンも記載されている。
　また、非特許文献３および４（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１９７　２５５－２６７　２０１９、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　１１　２１０２０１６　２０２２）には、ｍＲＮＡ機能化によるｍＲＮＡの生体内導入効率の向上が記載されている。非特許文献５（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１５０　１６２－１７０　２０１８）には、ｍＲＮＡ機能化によるｍＲＮＡワクチンへの応用が記載されている。
国際公開第２０１８／１２４１８１号
Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３４，ｐ．３９６－４０１ Ｊ．Ｃｏｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１１）１５１，ｐ．１０４－０１０９ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１９７　２５５－２６７　２０１９ Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　１１　２１０２０１６　２０２２ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１５０　１６２－１７０　２０１８
　このような状況のもと、新たなｍＲＮＡワクチンが求められていた。
　本発明者らは、抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーと、前記ｍＲＮＡを内包するカチオン性ポリマーを含み、前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーがポリエチレングリコール修飾されているｍＲＮＡワクチンが、ｍＲＮＡワクチンとして有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　ここでは、以下のｍＲＮＡワクチン等が提供される。
［１］　抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーと、前記ｍＲＮＡを内包するカチオン性ポリマーを含むｍＲＮＡワクチンであって、
　ＲＮＡオリゴマーは、
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
　を含み、かつＲＮＡオリゴマーはポリエレングリコール修飾を含む、ｍＲＮＡワクチン。
［２］　前記ＲＮＡ配列が１５～２３塩基の配列からなる、上記［１］に記載のｍＲＮＡワクチン。
［２ａ］　前記ＲＮＡ配列が１２～３０塩基の配列からなる、上記［１］に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３］　前記ＲＮＡ配列が１７塩基の配列からなる、上記［１］に記載のｍＲＮＡワクチン。
［４］　前記ポリエレングリコール修飾は、オーバーハング配列を介さずにＲＮＡオリゴマーの配列の５’末端又は３’末端になされたものである、上記［１］～［３］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［５］　前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーが、１つ又は２つのＲＮＡオリゴマーである、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［５ａ］　前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーが、１～７つのＲＮＡオリゴマーである、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［５ｂ］　前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーが、１～４つのＲＮＡオリゴマーである、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［５ｃ］　前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーが、１～３つのＲＮＡオリゴマーである、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［５ｄ］　前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーが、４つのＲＮＡオリゴマーである、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［５ｅ］　前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーが、３つのＲＮＡオリゴマーである、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［５ｆ］　前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーが、２つのＲＮＡオリゴマーである、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［６］　前記ポリエレングリコールが、重量平均分子量１，０００～３，０００の直鎖状ポリエレングリコールである、上記［１］～［５ｆ］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［６ａ］　前記ポリエレングリコールが、重量平均分子量１，０００～８０，０００の直鎖状ポリエレングリコールである、上記［１］～［５ｆ］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［６ｂ］　前記ポリエレングリコールが、重量平均分子量１，０００～２０，０００の直鎖状ポリエレングリコールである、上記［１］～［５ｆ］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［６ｃ］　前記カチオン性ポリマーが、直鎖状もしくは分枝状ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、キトサン誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、側鎖にカチオン性残基を有するポリアミノ酸誘導体、ポリエーテル誘導体両親媒性ポリアミノ酸誘導体、両親媒性ポリアミノ酸と親水性ポリマーとのブロックコポリマーから選択される、上記［１］～［６ｂ］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［７］　疾患の予防又は治療を必要とする対象において当該疾患の予防又は治療に用いるための、上記［１］～［６ｃ］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
　ここでは、新たなｍＲＮＡワクチンが提供される。当該ｍＲＮＡワクチンは、好ましくは、以下の少なくとも１つの特徴を有する。
　－カチオン性ポリマーの免疫原性が低い。
　－カチオン性ポリマーに生分解性を付与できる。
　－肝臓への集積の恐れが少ない。
　－肺血管を閉塞される恐れが少ない。
　－脾臓へ効果的にｍＲＮＡを送達することが可能である。
 
高分子ナノ粒子を樹状細胞株（ＤＣ２．４）へ導入し、ルシフェラーゼ発現量を確認した結果を示す図である。 高分子ナノ粒子を用いた無細胞翻訳試験の結果を示す図である。 高分子ナノ粒子をマウスに投与し、各組織（脾臓、右肺、左肺および肝臓）でのルシフェラーゼ発現量を確認した結果を示す図である。 高分子ナノ粒子（ポリアスパルタミド）をマウスに投与し、各組織（脾臓、肺および肝臓）でのルシフェラーゼ発現量を確認した結果を示す図である。ルシフェラーゼ発現量は、ＰＥＧ０に対する相対ルシフェラーゼ発現量で示している。 高分子ナノ粒子をマウスに投与し、血管および肺血管への影響を確認した結果を示す図である。試料投与後４０秒、２分および５分後の血管の蛍光画像および肺切片の蛍光画像を示した。 高分子ナノ粒子をマウスに投与し、肺の炎症反応を確認した結果を示す図である。 モデル抗原（ＯＶＡ）を発現するｍＲＮＡを搭載した高分子ナノ粒子をマウスに投与した際のワクチン効果を示す図である。投与から細胞数定量までの手順（左図）、及びワクチンを受けたマウスの脾細胞の中で、抗原（ＯＶＡ）と反応するＩＦＮ－γ産生細胞数（右図）。 毒性試験の結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は本発明を説明するための例示であり、本発明はその要旨を逸脱しない限りさまざまな形態で実施することができる。また、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。
 
　ここでは、例えば、以下のｍＲＮＡワクチンが提供され得る。
　抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーと、前記ｍＲＮＡを内包するカチオン性ポリマーを含むｍＲＮＡワクチンであって、
　ＲＮＡオリゴマーは、
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
　を含み、かつＲＮＡオリゴマーはポリエレングリコール修飾を含む、ｍＲＮＡワクチン。
 
１．ｍＲＮＡ
　ｍＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡを意味し、通常、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）とコード領域と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡは、さらに、通常、５’末端のキャップ構造（５’Ｃａｐ）と３’末端のｐｏｌｙ　Ａ配列を含む。
　ｍＲＮＡワクチンに用いるｍＲＮＡは、次のいずれかのものであってよい。
　（１）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ　Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（２）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ　Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（３）５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ　Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（４）５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ　Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
　ｍＲＮＡワクチンに用いるｍＲＮＡは、公知の方法により、目的タンパク質をコードするテンプレートＤＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏ環境下で転写することで作製することができる。例えば、Ｂｌｏｏｄ　１０８（１３）（２００６）４００９－１７に記載の方法に従って、作製することができる。具体的には、目的タンパク質のコード配列の下流にｐｏｌｙ　Ａ／Ｔ鎖が組み込まれた鋳型ＤＮＡをｐｏｌｙ　Ａ／Ｔ鎖のすぐ下流で切断し、翻訳酵素、ヌクレオシド、５’キャップアナログを含むバッファー溶液中にてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を行い、その後、ｍＲＮＡを精製することで作製する。
　ｍＲＮＡのコード領域によってコードされる目的蛋白質、すなわち抗原としては、免疫応答を誘発するのに好適な公知の抗原から任意に選択することができる。抗原としては、より具体的には、腫瘍抗原、ウイルス由来抗原、細菌由来抗原、真菌由来抗原、原生生物由来抗原、動物由来抗原、植物由来抗原、自己免疫疾患の自己抗原などが挙げられる。ｍＲＮＡにコードされる抗原は、１つの抗原であってもよいし、あるいは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ又は５つ以上）の同一又は異なる抗原であってもよい。いくつかの態様では、ｍＲＮＡのコードされる抗原は、１つの抗原である。
　ｍＲＮＡのｐｏｌｙ　Ａ配列の長さは、例えば、１０～５００塩基であり、好ましくは、３０～３００塩基であり、より好ましくは、６０～２５０塩基である。
　ｍＲＮＡの５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの配列は、天然に生じる配列と１００％の配列同一性を有するものとしてよく、あるいは、部分的又はその全体を他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列と置換してもよい。他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列としては、例えば、グロビン、ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７－β）ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　４、又はアルブミンをコードするｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列が挙げられる。
　いくつかの態様では、ｍＲＮＡは修飾されていない。この場合、ｍＲＮＡ自体は天然のものであるため翻訳の過程はほとんど障害されないことが期待できる。
　別のいくつかの態様では、ｍＲＮＡをさらに安定化させるためにｍＲＮＡは修飾されている。ｍＲＮＡの修飾としては、ｍＲＮＡの塩基の化学修飾、ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量の修飾、ｍＲＮＡのＣａｐ構造の修飾などが挙げられる。
　ｍＲＮＡの塩基の化学修飾は、例えば、ｍＲＮＡの酵素耐性を向上させることが知られているものである。そのようなｍＲＮＡ自体の化学修飾塩基は、例えば、メチル化塩基（例えば、５－メチルシトシン）、硫黄修飾塩基（例えば、２－チオウリジン）、シュードウリジン、Ｎ１メチルシュードウリジン及び５－メトキシウリジンが挙げられる。
　ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量の修飾は、Ｇ（グアニン）／Ｃ（シトシン）の含有量が多くなるように修飾することであり、これにより、より安定なｍＲＮＡとすることができる。
　ｍＲＮＡのＣａｐ構造の修飾は、５’側の１番目もしくは２番目のリボースの２位をメトキシ基とすることであり、これにより、発現効率が向上することも知られている。
　ｍＲＮＡの修飾は、公知の方法又はそれに準ずる方法により行うことができる。
 
２．ＲＮＡオリゴマー
　ｍＲＮＡには、少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズしている。また、当該ＲＮＡオリゴマーは、ポリエチレングリコール修飾を含むものである。
　すなわち、ＲＮＡオリゴマーは、例えば、
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
　を含み、かつＲＮＡオリゴマーはポリエレングリコール修飾を含むものである。
　「９０％以上の同一性を有するＲＮＡ配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、ＲＮＡ配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ　Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　「ｍＲＮＡにハイブリダイズする」とは、後述のハイブリダイズ条件で、ＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。
　ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの連続する１２～４０塩基の配列にハイブリダイズするように設計されている。いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡの配列に相補的な配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～３０塩基の配列からなる。より好ましくは、ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡの配列に相補的な配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列からなるものである。さらに好ましくは、ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡの配列に相補的な配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列からなるものである。
　ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせるｍＲＮＡ中の位置は、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ　Ａ配列のいずれの位置でもよい。ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ｍＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してハイブリダイズするようにＲＮＡオリゴマーを設計するのが望ましい。すなわち、ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡ全配列のうち２次構造を持たない部分に対してハイブリダイズするように設計するのが好ましい。ｍＲＮＡの２次構造を予測するソフトウエアとしては、例えば、後述の実施例に記載のものが挙げられる。
　いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの、５’ＵＴＲ、コード領域、および３’ＵＴＲの配列の少なくとも１つの領域、例えば、コード領域にハイブリダイズするように設計する。
　ＲＮＡオリゴマーのポリエレングリコール修飾は、オーバーハング配列を介さずに行ってよく、あるいは、オーバーハング配列を介して行ってもよい。ここで、「オーバーハング配列」は、ｍＲＮＡにハイブリダイズしない配列である。
　ポリエレングリコール修飾は、オーバーハング配列を介さずに行う場合、ＲＮＡオリゴマーは、好ましくは、前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列のみからなる。この場合、ポリエレングリコール修飾は、ＲＮＡオリゴマーの配列の例えば５’末端又は３’末端に行う。
　一方、ポリエレングリコール修飾は、オーバーハング配列を介して行う場合、ＲＮＡオリゴマーは、好ましくは、前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列とオーバーハング配列からなる。この場合、ポリエレングリコール修飾は、ＲＮＡオリゴマーの前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列の５’末端又は３’末端に、例えば、１～５塩基のオーバーハング配列を介して行う。
　ＲＮＡオリゴマーに関して、オーバーハング配列を介して前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端のどちらの末端をポリエレングリコール修飾してもよい。
　ここで、カチオン性ポリマーと核酸の複合体は、血液中で大きな凝集体を形成し、肺血管を閉塞させる恐れがある。ワクチンでは、全身投与により脾臓を標的化することで高い効果が期待できるところ、複合体が肺移行すると、複合体の脾臓への送達が妨げられる可能性がある。ここで提供されるｍＲＮＡワクチンは、ＲＮＡオリゴマーのポリエレングリコール修飾により、凝集体の形成を抑えて肺移行を最小限に抑え、ワクチンに必要な脾臓への送達が可能となる。
　また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による修飾を行うと、ｍＲＮＡ輸送担体にｍＲＮＡを搭載した際、輸送担体がポリエチレングリコール鎖により覆われ、そのステルス性により安定化されることに加え、ポリエチレングリコール鎖のシールディング効果により表面電位が減少し、カチオン性タンパク質である分解酵素からの認識を抑えることができる。その結果、ｍＲＮＡの酵素分解を防ぐことができることが期待できる。
　ポリエチレングリコールによる修飾は、公知の方法又はそれに準ずる方法にて行うことができる。例えば、５’末端アミノ化ＲＮＡオリゴマーを、ＮＨＳ活性化エステル－ＰＥＧ（例えば、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＣＳ，ＧＳ，ＡＳ，ＰＳ，ＨＳ及びＴＳ　Ｓｅｒｉｅｓ（ＮＨＳ　ａｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｅｒｓ／ｃａｒｂｏｎａｔｅ），ＹＵＫＡ　ＳＡＮＧＹＯ　ＣＯ．，ＬＴＤ）と反応させることで、ＰＥＧ化ＲＮＡオリゴマーを得ることができる。あるいは、ポリエチレングリコールによる修飾は、例えば、文献Ｍ．Ｏｉｓｈｉ，ｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ　６（４），２００５，７１８－７２５に記載の方法又はそれに準ずる方法にて行うこともできる。より具体的には、ＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ－ＡＭＩＮＯ－ＭＯＤＩＦＩＥＲ（ＧＬＥＮＲＥＳＥＲＣＨ）などの開始剤を用いてＲＮＡオリゴマーを合成し、脱保護することで５’末端アミノ化ＲＮＡオリゴマーを得る。この５’末端アミノ化ＲＮＡオリゴと例えばＰＥＧ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることでＰＥＧ化ＲＮＡオリゴマーを得ることができる。用いるポリエチレングリコールとしては、例えば、重量平均分子量１，０００～８０，０００、好ましくは、重量平均分子量１，０００～２０，００００、より好ましくは、重量平均分子量１，０００～３，０００、特に好ましくは、重量平均分子量１，０００～２，００００の直鎖状のＰＥＧや、同分子量の２分岐型、４分岐型、８分岐型などの分岐状のＰＥＧなどが挙げられる。
　あるいは、用いるポリエチレングリコールとしては、例えば、重量平均分子量１，０００～８０，０００、好ましくは、重量平均分子量１，０００～２０，００００、より好ましくは、重量平均分子量１，０００～１５，０００の直鎖状のＰＥＧや、同分子量の２分岐型、４分岐型、８分岐型などの分岐状のＰＥＧなどが挙げられる。
　あるいは、用いるポリエチレングリコールとしては、例えば、重量平均分子量１，０００～８０，０００、好ましくは、重量平均分子量８，０００～２０，００００、より好ましくは、重量平均分子量１０，０００～１５，０００の直鎖状のＰＥＧや、同分子量の２分岐型、４分岐型、８分岐型などの分岐状のＰＥＧなどが挙げられる。
　１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるポリエレングリコール修飾ＲＮＡオリゴマーの数は、少なくとも１つであり、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは、１～２個であり、特に好ましくは、２個である。
　あるいは、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、少なくとも１つであり、好ましくは１～７個であり、より好ましくは１～４個である。
　別の態様では、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、４個である。
　また、別の態様では、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、３個である。
　また、別の態様では、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、２個である。
　また、別の態様では、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、１個である。
　ここで、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるポリエレングリコール修飾ＲＮＡオリゴマーの数、用いるポリエチレングリコールの重量平均分子量などを制御することにより、ｍＲＮＡワクチンの脾臓選択性をある程度制御することも可能である。具体的には、図１に示したように、用いるポリエチレングリコールの重量平均分子量１２ｋのＰＥＧではｍＲＮＡからのタンパク質翻訳活性がやや低下する傾向にある。一方で２ｋのＰＥＧでは、翻訳活性ある程度保たれる。すなわち、ＰＥＧ鎖長が長くなればなるほどｍＲＮＡからのタンパク質翻訳活性が低下し、ＰＥＧ鎖長が短くなると（例えば、２ｋ）翻訳活性が高く保たれる傾向にあるので、用いるポリエチレングリコールの重量平均分子量を適切に調整することで、翻訳活性を適当に維持することができる。また、図３に示したように、ｍＲＮＡの肺への送達を抑制しながら、脾臓へ効率的に送達するためのＰＥＧの本数の最適値は、ＰＥＧの鎖長により異なる。例えば、ＰＥＧ　２ｋの時は、２本や４本が好ましく、一方で、ＰＥＧ　１２ｋの時は、１本が好ましい（図３）。また、ＰＥＧ　２ｋで、２本や４本の時は肺血管の閉塞もない（図５）。さらに、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるポリエレングリコール修飾ＲＮＡオリゴマーの数に関して、２本の場合は（すなわち、ＰＥＧ２の場合は）、０本の場合（ＰＥＧ０）に迫るワクチン効果を示している（図７）。このように、ｍＲＮＡ複合体の肺血管閉塞を抑制しながら、ワクチン効果を得るための最適値を見出すことも可能である。
　複数のポリエレングリコール修飾ＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせる場合、いくつかの態様では、それぞれのポリエレングリコール修飾ＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡ上で重ならないようにＲＮＡオリゴマーを設計する。
 
３．二本鎖ＲＮＡ
　二本鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションにより調製することができる。ハイブリダイゼーションは、より具体的には、後述の実施例に記載の条件又はそれに準ずる条件にて行うことができる。１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、少なくとも１つであり、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは、１～２個であり、特に好ましくは、２個である。
　あるいは、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、少なくとも１つであり、好ましくは１～７個であり、より好ましくは１～４個である。
　別の態様では、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、４個である。
　また、別の態様では、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、３個である。
　また、別の態様では、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、２個である。
　また、別の態様では、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、１個である。
　ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズは、公知の方法及び条件により行うことができる。ハイブリダイズでは、加温して、一定時間静置したのち、徐々に温度を低下させる。加温は、ｍＲＮＡやオリゴマーの分子内、分子間にあらかじめ存在する相補的結合を解くことで、ｍＲＮＡとオリゴマーをより効率的に結合させることを目的として行う。適切なハイブリダイズが保証されるならば、その温度時間は適宜調整可能である。温度低下は緩やかな方がハイブリダイズの特異性が増す。また、オリゴマー鎖長は、ハイブリダイズの条件設定に大きく影響しない。ハイブリダイズ効率を評価しながら、適宜条件を設定するべきである。例えば、後述の実施例に記載の方法及び条件が挙げられる。
　いくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有する。ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有するものとすることで、より強い炎症反応を惹起することができる。
　別のいくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有さない。トリリン酸化を除く方法は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。トリリン酸化を除く方法としては、例えば、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ０２８９Ｓ）を用いる方法が挙げられる。
　二本鎖ＲＮＡは、例えば、輸送担体に内包される形態である。輸送担体は、二本鎖ｍＲＮＡを内包して、対象の体内の好適な箇所に送達することができるものである。輸送担体は、具体的には、カチオン性ポリマーである。脂質性ｍＲＮＡ送達キャリアに代えてｍＲＮＡ送達キャリアとしてカチオン性ポリマーを用いることで、免疫原性の軽減や、肝臓への集積の抑制が期待される。いくつかの態様では、カチオン性ポリマーは、生分解性であり、別のいくつかの態様では、カチオン性ポリマーは、非生分解性である。
　カチオン性ポリマーは、ｍＲＮＡ送達キャリアとして用いることができる限り特に限定されないが、例えば、直鎖状もしくは分枝状ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、キトサン誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、側鎖にカチオン性残基を有するポリアミノ酸誘導体、ポリエーテル誘導体などが挙げられる。
　あるいは、カチオン性ポリマーは、ｍＲＮＡ送達キャリアとして用いることができる限り特に限定されないが、例えば、直鎖状もしくは分枝状ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、キトサン誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、側鎖にカチオン性残基を有するポリアミノ酸誘導体、ポリエーテル誘導体、両親媒性ポリアミノ酸誘導体、両親媒性ポリアミノ酸と親水性ポリマーとのブロックコポリマーなどが挙げられる。
　より具体的には、カチオン性ポリマーとしては、例えば、リニアポリエチレンイミン、両親媒性ポリアスパルタミドなどが挙げられる。両親媒性ポリアミノ酸誘導体および両親媒性ポリアミノ酸と親水性ポリマーとのブロックコポリマーとしては、例えば、国際公開第２０２０／０６７１４２号に記載されているものが挙げられ、これを用いることができる。
　これらの輸送担体は、公知の方法又はそれに準ずる方法にて調製することができる。
 
４．アジュバント
　いくつかの好ましい態様では、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共には用いない。
　別のいくつかの態様では、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共に用いる。アジュバントと共に用いる場合、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共に製剤化されてもよい。アジュバントは、免疫反応を増強するのに好適な任意の化合物である。そのようなアジュバントは公知であり、当業者であれば、任意のアジュバントの中から適切なものを選択することができる。
 
５．疾患の予防又は治療
　ｍＲＮＡワクチンは、疾患の予防又は治療を必要とする対象において当該疾患の予防又は治療に用いることができる。
　予防又は治療する疾患は、例えば、がん、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌感染症、原生生物感染症、及び自己免疫疾患を挙げることができる。前述のｍＲＮＡのコード領域がコードする抗原を、予防又は治療する疾患に応じて適切に選択することで、当該疾患を予防又は治療することができる。
　「対象」は、ヒト、又はヒト以外の生物、例えば、トリ及び非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、及びウマ）である。
　ｍＲＮＡワクチンは、常法に従って製剤化することができる。いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチンは、医薬的に許容される添加剤を含む。医薬的に許容される添加剤としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬的に許容される界面活性剤等が挙げられる。
　上記添加剤は、ｍＲＮＡワクチンの剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された二本鎖ＲＮＡを溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えばマンニトール、ブドウ糖、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム等のゴム、ゼラチン、コラーゲン等などが挙げられる。
　ｍＲＮＡワクチンの投与量は、対象の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形などによって適宜選択することができる。ｍＲＮＡワクチンの有効投与量は、疾患の兆候又は状態を軽減するワクチンの量である。このようなｍＲＮＡワクチンの治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）、及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定することができる。いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチンの投与量は、成人に対して、１日当たり１０ｎｇ～１ｇ、１００ｎｇ～１００ｍｇ、１μｇ～１０μｇ、又は３０μｇ～３００μｇのｍＲＮＡの範囲とする。
　ｍＲＮＡワクチンの投与経路は適切に選択することができ、例えば、経皮、鼻腔内、経気管支、経肺、筋内、腹腔内、静脈内、皮内、皮下、直腸内、及び膣内の経路を含むが、これらの経路に限定されるものではない。
　ｍＲＮＡワクチンの投与回数は、１回、又は副作用が臨床上許容される範囲内である限り複数回とすることができる。
　いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチン投与における抗体価又は細胞性免疫活性を測定する。例えば、抗体価は、生体より血液を採取し、血清中のＩｇＧを定量することにより評価できる。細胞性免疫活性は、生体よりリンパ球を分離及び培養し、３Ｈ－チミジンの取り込みを測定することにより評価できる。
 
６．キット
　ここで提供されるキットは、前記ｍＲＮＡワクチンを含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば、前記ＲＮＡワクチンを用いた前記各種疾患の治療方法に好ましく用いることができる。
　キットにおいて、前記ｍＲＮＡワクチンの保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
　キットは、前記ｍＲＮＡワクチン以外に、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー及び使用説明書（使用マニュアル）を挙げることができる。キットには、アジュバントを含めてもよいし、含めなくてもよい。好ましくは、キットは、アジュバントを含めない。
 
　以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
 
　実施例１：ｍＲＮＡの体内分布
　１．１　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ｍＲＮＡの作製
　ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ製社よりｆＬｕｃ　ｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）　ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ－（Ｌ－７６０２））を購入して使用した（ｆＬｕｃ　ｍＲＮＡのコード配列：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／ｆｏｌｉｏ３／ｐｒｏｄｕｃｔａｔｔａｃｈｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｉｎｓｅｒｔ／ｆｌｕｃ＿ｏｒｆ＿ｃａｔｎｏ＿ｌ－７２０２＿ｌ－７６０２＿ｌ－７７０２＿＿１．ｔｘｔ）。
　ｆＬｕｃ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を使用してＰＥＧ化ｍＲＮＡを、以下のように作製した。ＲＮＡ２次構造予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｔｉｐｓ．ｄｎａ．ｂｉｏ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｐｋｎｏｔ／）にて、ｆＬｕｃ　ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してＲＮＡオリゴマーを設計した。ＲＮＡオリゴマーは、５’末端のＰＥＧ修飾を含めて、ジーンデザイン社にて、依頼合成した。ここで、重量平均分子量２，０００または１２，００００の直鎖ＰＥＧを用いた。そして、以下の５’末端ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーをジーンデザイン社より購入した。重量平均分子量２，０００の直鎖ＰＥＧ修飾も、重量平均分子量１２，００００の直鎖ＰＥＧ修飾も、同じ配列のＲＮＡオリゴマーに対して行われた。これらのＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡのコード領域にハイブリダイズする。
配列ｐ１（配列番号１）：ＧＧＧＧＣＣＣＵＵＣＵＵＧＡＵＧＵ
配列ｐ２（配列番号２）：ＵＣＧＵＵＧＵＡＧＡＵＧＵＣＧＵＵ
配列ｐ３（配列番号３）：ＣＡＣＧＵＵＣＡＧＧＡＵＣＵＵＣＵ
配列ｐ４（配列番号４）：ＡＵＧＧＣＧＧＵＧＵＣＧＧＧＧＡＵ
配列ｐ５（配列番号５）：ＧＧＧＵＧＣＵＣＵＵＧＧＣＧＡＡＧ
配列ｐ６（配列番号６）：ＵＵＧＵＣＧＵＣＧＣＣＣＵＣＧＧＧ
配列ｐ７（配列番号７）：ＵＡＣＵＵＧＡＵＣＡＧＧＣＵＣＵＵ
　ｍＲＮＡに対して１当量のＲＮＡオリゴマーを加え、６５℃で５分加熱し、１０分かけて３０℃まで冷却することで、ハイブリダイゼーションを行った。これにより、ＰＥＧ化ｍＲＮＡを作製した。
　以下の実施例では、ＲＮＡオリゴマーの本数１、２、３、４および７のＰＥＧ化ｍＲＮＡ（それぞれ、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４およびＰＥＧ７）ために、以下の配列のＲＮＡオリゴマーを用いた。
 
　ＰＥＧ１：配列ｐ４
　ＰＥＧ２：配列ｐ２，ｐ６
　ＰＥＧ３：配列ｐ１，ｐ４，ｐ７
　ＰＥＧ４：配列ｐ１，ｐ３，ｐ５，ｐ７
　ＰＥＧ７：配列ｐ１～ｐ７
 
　尚、ＲＮＡオリゴマーの本数０本のＰＥＧ化ｍＲＮＡ（ＰＥＧ０）は、ハイブリダイゼーションを行なっていない。
　１．２　高分子ナノ粒子の調製
　高分子ナノ粒子を、ＰＥＧ化ｍＲＮＡとポリカチオンを混合することにより調製した。具体的には、ポリカチオンとして、リニアポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）（製品名：ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｊｅｔＰＥＩ，ＰｏｌｙＰｌｕｓ社）またはアスパラギン酸の側鎖にジエチルトリアミンまたはシクロヘキシルエチルを付加したポリアスパライド（国際公開第２０２０／０６７１４２号に開示された方法に従い、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＣＨＥ）重合度２６を製造した）を用いた。具体的には、ポリカチオン中のアミノ基の数（Ｎ）とｍＲＮＡ中のリン酸基数（Ｐ）の比（Ｎ／Ｐ比）が４となるように混合して高分子ナノ粒子を調製した。
　１．３　高分子ナノ粒子の調製時の物性
　ＬＰＥＩを用いた高分子ナノ粒子の調製時の物性を測定した。具体的には、高分子ナノ粒子を限界ろ過することで、塩濃度を２０ｍＭ以下にして、メビウス（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて、動的光散乱法及び位相分析光散乱により、粒径及びデータ電位を計測した。
　その結果を、表１に粒径及び表２にゼータ電位を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＰＥＧ２０００では、ＰＥＧの本数を少し変化させるだけで、大きくゼータ電位が変化した。このことは、ナノ粒子の物性を制御する上で、ＰＥＧ密度を精密に制御することが重要であることを示している。
　ここで、ｍＲＮＡにＰＥＧを結合させる本手法では、加えたＰＥＧが全て粒子に結合するため、粒子のＰＥＧ化を精密に制御することができる。表２に示すように、このような本手法によるＰＥＧ化の精密制御は、ゼータ電位などのナノ粒子の物性を制御する上で極めて重要である。
　１．４．１　ＰＥＧの鎖長の影響の評価（１）
　ＰＥＧの鎖長の影響を、培養細胞を用いて評価した。具体的には、９６　ｗｅｌｌプレートにＤＣ２．４細胞を５，０００個／ｗｅｌｌ播種し、２４時間後に、１　ｗｅｌｌあたりのｆＬｕｃ　ｍＲＮＡ量が１００　ｎｇとなるよう上述のナノ粒子を添加した。その２４時間後に、ルシフェリン基質（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社））と、ルミノメーター（Ｌｕｍａｔ３　ＬＢ９５０８　ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてルシフェラーゼ発現量を定量した。
　その結果を、図１に示す。図１に示されているように、重量平均分子量２，０００と１２，０００のＰＥＧを比較したところ、重量平均分子量１２，０００のＰＥＧでは発現がやや低下する一方で、重量平均分子量２，０００のＰＥＧでは発現が比較的高いレベルで保たれることが分かった。
　１．４．２　ＰＥＧの鎖長の影響の評価（２）
　ＰＥＧの鎖長の影響を、無細胞翻訳試験にて評価した。無細胞翻訳試験では、４００　ｎｇのｆＬｕｃ　ｍＲＮＡを含むポリプレックスを、Ｒａｂｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて３０℃で１．５時間翻訳した。
　その結果を図２に示す。図２に示されているように、ＰＥＧ鎖長およびＰＥＧ鎖数によりタンパク質への翻訳活性は低下しないことが分かった。
　１．５　ｍＲＮＡの体内分布の測定
　ｍＲＮＡの体内分布を測定した。具体的には、実施例１の１．２で調製したｆＬｕｃのｍＲＮＡからなる高分子ナノ粒子を、５ｕｇ　ｍＲＮＡを含む２００μＬの１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ溶液として、マウスの尾静脈より投与した。投与４時間後にマウスを犠死させ、各臓器を摘出した。Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中でホモジェナイズし、ルシフェリン基質（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社））と、ルミノメーター（Ｌｕｍａｔ３　ＬＢ９５０８　ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてルシフェラーゼ発現量を定量した。ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてタンパク質量を測定し、その量にてルシフェラーゼ発現量の補正を行った。
　ポリカチオンとしてＬＥＰＩを用いたときの高分子ナノ粒子の結果を、図３に示す。図３に示されているように、ｍＲＮＡの肺への送達を抑制しながら、脾臓へ効率的に送達するためのＰＥＧの本数の最適値は、ＰＥＧの鎖長により異なる。例えば、ＰＥＧ　２ｋの時は、２本や４本が好ましく、一方で、ＰＥＧ　１２ｋの時は、１本が好ましい。ＰＥＧ鎖長が短いと、ＰＥＧ鎖数の増加により、脾臓の分布は維持しつつ、肺への分布は抑制された。ＰＥＧ鎖長が長いと、ＰＥＧ鎖数の減少により、脾臓の分布は維持しつつ、肺への分布は抑制された。ＰＥＧ化により、肺へのｍＲＮＡの分布が抑制され、また、脾臓への分布がＰＥＧ化後もある程度維持された。
　高分子ナノ粒子として、側鎖にジエチレントリアミン（ＤＥＴ）と２－シクロへキシルエチルアミン（ＣＨＥ）が導入されたポリアスパルタミド誘導体ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＣＨＥ）アスパルタミドでＰＥＧ２０００を用いた時の結果を図４に示す。肺、肝臓、腎臓及び心臓では、ＰＥＧの本数は集積度に影響をほとんど与えないが、脾臓におけるルシフェラーゼ発現量は、ｍＲＮＡ当たりのＰＥＧの導入本数の増加とともに増加し、４本のＰＥＧを導入したｍＲＮＡは、ＰＥＧを導入していないｍＲＮＡと比べて１０倍近く高いルシフェラーゼ発現につながることが明らかになった。一方、脾臓以外の組織に関しては、ＰＥＧの導入によるルシフェラーゼ発現量の有意な優位な変化は認められなかった。以上より、本ＰＥＧ化技術は、脾臓へのｍＲＮＡデリバリー効率を選択的に増加させることが示された。
　ここで図３中、ｐ＜０．０００１はＰＥＧ０と比べた場合に統計学的有意差があることを示す。統計処理はＡＮＯＶＡ検定ののち、ＰＥＧ０をコントロールとしたＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。
　１．６　血管および肺血管への影響
　試薬調整方法：
　Ｃｙ５標識ｍＲＮＡ：ｆＬｕｃ　ｍＲＮＡをＬａｂｅｌ　ＩＴ（登録商標）　Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社）を用いてＣｙ５標識した。
　試料：
　Ｃｙ５標識ｍＲＮＡから実施例２と同様にして高分子ナノ粒子を調製した。
　ここで用いた高分子ナノ粒子は、重量平均分子量２，０００の直鎖ＰＥＧを用いたものである。
　試験方法：
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢）をイソフルランで麻酔し、Ａ１Ｒ＋ｉｎ　ｖｉｖｏ共焦点顕微鏡（ニコン社）の顕微鏡ステージに固定した。上述のｆＬｕｃのｍＲＮＡからなる高分子ナノ粒子を、５μｇ　ｍＲＮＡを含む２００μＬの１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ溶液として、マウスの尾静脈から注射して、耳たぶ真皮の静脈をビデオモードで蛍光画像を記録した。試料投与後３０分後にマウスの肺を摘出し、凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡にて観察した。図５（Ａ）～（Ｃ）に、試料投与後、４０秒、２分および５分後の耳たぶ真皮の静脈の蛍光画像および図５（Ｄ）～（Ｆ）に肺切片の蛍光画像を示した。ＰＥＧ化していないｍＲＮＡは血液中で凝集して、肺の毛細血管を閉塞させるが、ＰＥＧ化ｍＲＮＡは血液中での凝集が抑制され、肺の毛細血管を閉塞させないことがわかる。
　１．７　肺の炎症反応
　肺の炎症反応を調べた。具体的には、１．２で調製したｆＬｕｃのｍＲＮＡからなる高分子ナノ粒子を、５μｇ　ｍＲＮＡを含む２００μＬの１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ溶液として、マウスの尾静脈より投与した。投与４時間後にマウスを犠死させ、肺を摘出した。ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ社）を用いて逆転写したのち、ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙ　（ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｍｉｃ　ｑＰＣＲ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、定量ＰＣＲを行い、ＩＦＮβ量をＡｃｔｉｎβ量を対照として求めた。
　ここで用いた高分子ナノ粒子は、重量平均分子量２，０００の直鎖ＰＥＧを用いたものである。
　その結果を、図６に示す。図６に示されているように、肺の炎症反応が、ＰＥＧ０と比べて、ＰＥＧ２、ＰＥＧ４で軽減することが分かった。
　ここで図６中、「＊＊」及び「＊」はＰＥＧ０と比べた場合、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５という統計学的有意差があることを示す。統計処理はＡＮＯＶＡ検定ののち、Ｔｕｋｅｙ検定を行った。
　実施例２：ワクチン効果
　２．１　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ｍＲＮＡの作製
　ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ製社よりＯＶＡ　ｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）　ＯＶＡ　ｍＲＮＡ－（Ｌ－７６１０））を購入して使用した（ＯＶＡ　ｍＲＮＡのコード配列：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／ｆｏｌｉｏ３／ｐｒｏｄｕｃｔａｔｔａｃｈｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｉｎｓｅｒｔ／ｏｖａ＿ｏｒｆ＿ｃａｔｎｏ＿ｌ－７２１０＿ｌ－７６１０＿．ｔｘｔ）
　ＯＶＡ　ｍＲＮＡのＰＥＧ化ｍＲＮＡを、以下のように作製した。ＲＮＡ２次構造予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｔｉｐｓ．ｄｎａ．ｂｉｏ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｐｋｎｏｔ／）にて、ＯＶＡ　ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してＲＮＡオリゴマーを設計した。ＲＮＡオリゴマーは、５’末端のＰＥＧ修飾を含めて、ジーンデザイン社にて、依頼合成した。ここで、重量平均分子量２，０００の直鎖ＰＥＧを用いた。そして、以下の５’末端ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーをジーンデザイン社より購入した。これらのＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡのコード領域にハイブリダイズする。
配列ｐ８（配列番号８）：ＧＧＵＵＣＡＧＧＡＵＧＵＣＣＣＧＣ
配列ｐ９（配列番号９）：ＧＵＣＣＵＣＧＵＣＣＵＵＧＡＡＧＧ
配列ｐ１０（配列番号１０）：ＧＣＵＵＣＵＣＧＡＡＧＵＵＧＡＵＧ
配列ｐ１１（配列番号１１）：ＧＧＣＧＡＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＧＣ
　ｍＲＮＡに対して１当量のＲＮＡオリゴマーを加え、６５℃で５分加熱し、１０分かけて３０℃まで冷却することで、ハイブリダイゼーションを行った。これにより、ＰＥＧ化ｍＲＮＡを作製した。
　以下の実施例では、ＲＮＡオリゴマーの本数２および４のＰＥＧ化ｍＲＮＡ（それぞれ、ＰＥＧ２およびＰＥＧ４）ために、以下の配列のＲＮＡオリゴマーを用いた。
　ＰＥＧ２：配列ｐ８，ｐ１０
　ＰＥＧ４：配列Ｐ８～Ｐ１１
　尚、ＲＮＡオリゴマーの本数０本のＰＥＧ化ｍＲＮＡ（ＰＥＧ０）は、ハイブリダイゼーションを行なっていない。
　２．２　高分子ナノ粒子の調製
　高分子ナノ粒子を、ＰＥＧ化ｍＲＮＡとポリカチオンを混合することにより調製した。具体的には、ＰＥＧ化ｍＲＮＡとリニアポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）（製品名：ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｊｅｔＰＥＩ，ＰｏｌｙＰｌｕｓ社）を、ＬＰＥＩ中のアミノ基の数（Ｎ）とｍＲＮＡ中のリン酸基数（Ｐ）の比（Ｎ／Ｐ比）が４となるように混合した。
　２．３　ワクチン効果の確認試験
　図７の左図に実験の手順を示す。先ず、ＯＶＡ　ｍＲＮＡ　５μｇを含む２００μＬの１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ溶液をＣ５７ＢＬ６Ｎマウスの尾静脈内へ０日目と１４日目に投与した。１４日目の投与の７日後、脾臓細胞を回収し、ＩＦＮ－γ　ＥＬＩＳｐｏｔ　ＰＬＵＳ、Ｍｏｕｓｅ（－）ＨＲＰキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）にてＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを行った。ここでは、９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに５００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ蒔いた。最終ＯＶＡ濃度１０μｇ／ｍＬで２４時間培養したのち、ＩＦＮ－γ産生細胞数を計測した。
　その結果を図７の右図に示す。図７の右図の縦軸は、ＯＶＡに反応してＩＦＮ－γを産生した脾細胞の数を示し、細胞性免疫の指標となる。図７の右図に示されているように、１本鎖のＯＶＡ　ｍＲＮＡを用いたカチオン性ポリマー複合体（ＰＥＧ０）では、細胞性免疫では細胞性免疫を高く誘導できたものの、肺血管の閉塞があり、炎症反応の問題から、この形での臨床応用は困難である。一方で、ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせたＯＶＡ　ｍＲＮＡを用いたカチオン性ポリマー複合体（ＰＥＧ２およびＰＥＧ４）では、肺血管の閉塞が見られず、安全である。さらに、ＰＥＧ２、ＰＥＧ４では、ＰＥＧ未修飾の１本鎖ＯＶＡ　ｍＲＮＡを用いたカチオン性ポリマー複合体（ＰＥＧ０）と比較しても、十分な細胞性免疫反応が観察された。
　このように、ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせたＯＶＡ　ｍＲＮＡを用いたカチオン性ポリマー複合体により、強い細胞性免疫を誘導することができることが分かった。
実施例３：毒性試験
試料
　高分子ナノ粒子として、実施例１で調製したものを用いた。ここで用いた高分子ナノ粒子は、ポリカチオンはＬＰＥＩ、重量平均分子量２，０００の直鎖ＰＥＧである。
操作方法
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢）に、５μｇのｆＬｕｃ　ｍＲＮＡを含む試料２００μＬの１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌポリプレックス溶液を尾静脈から注射した。注射後２４時間に下大静脈から採血し、遠心分離して血漿を得た。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（ＣＲＥ）の濃度を、Ｄｒｉ－Ｃｈｅｍ　７０００ＩＺ（富士フィルム社）を用いて測定した。
　その結果を図８に示す。いずれの項目においても、ＰＥＧ０、ＰＥＧ２、ＰＥＧ４のいずれもＮＴと比較して有意な差は認められなかった。ここで、ＮＴは、無処置群を意味する。
 
　配列番号１～８：合成ＲＮＡ

Claims (8)

  1. 　抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーと、前記ｍＲＮＡを内包するカチオン性ポリマーを含むｍＲＮＡワクチンであって、
    　ＲＮＡオリゴマーは、
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
    　を含み、かつＲＮＡオリゴマーはポリエレングリコール修飾を含む、ｍＲＮＡワクチン。
  2. 　前記ＲＮＡ配列が１２～３０塩基の配列からなる、請求項１に記載のｍＲＮＡワクチン。
  3. 　前記ＲＮＡ配列が１７塩基の配列からなる、請求項３に記載のｍＲＮＡワクチン。
  4. 　前記ポリエレングリコール修飾は、オーバーハング配列を介さずにＲＮＡオリゴマーの配列の５’末端又は３’末端になされたものである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
  5. 　前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーが、１～７つのＲＮＡオリゴマーである、請求項１～４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
  6. 　前記ポリエレングリコールが、重量平均分子量１，０００～２０，０００の直鎖状ポリエレングリコールである、請求項１～５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
  7. 　前記カチオン性ポリマーが、直鎖状もしくは分枝状ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、キトサン誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、側鎖にカチオン性残基を有するポリアミノ酸誘導体、ポリエーテル誘導体両親媒性ポリアミノ酸誘導体、両親媒性ポリアミノ酸と親水性ポリマーとのブロックコポリマーから選ばれる、請求項１～６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
  8. 　疾患の予防又は治療を必要とする対象において当該疾患の予防又は治療に用いるための、請求項１～７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
     
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KURIMOTO SHOTA, YOSHINAGA NAOTO, IGARASHI KAZUNORI, MATSUMOTO YU, CABRAL HORACIO, UCHIDA SATOSHI: "PEG-OligoRNA Hybridization of mRNA for Developing Sterically Stable Lipid Nanoparticles toward In Vivo Administration", MOLECULES, SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE, vol. 24, no. 7, 1 April 2019 (2019-04-01), DE , pages 1303, XP093180888, ISSN: 1433-1373, DOI: 10.3390/molecules24071303 *

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