WO2024123133A1 - 락티플란티바실러스 속 균주, 그의 유래의 배양액 및 그의 항알러지 용도 - Google Patents

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WO2024123133A1
WO2024123133A1 PCT/KR2023/020198 KR2023020198W WO2024123133A1 WO 2024123133 A1 WO2024123133 A1 WO 2024123133A1 KR 2023020198 W KR2023020198 W KR 2023020198W WO 2024123133 A1 WO2024123133 A1 WO 2024123133A1
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WO
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strain
composition
allergic
serum
plantarum
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PCT/KR2023/020198
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English (en)
French (fr)
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양보기
장명호
곽민정
김아람
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주식회사 지아이바이옴
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Definitions

  • Allergy is a disease in which substances that have no effect on ordinary people cause hypersensitivity reactions such as hives, itching, runny nose, and coughing only in certain people due to a malfunction of the immune system. It is caused by environmental pollution, westernization of diet and lifestyle, and stress. It can be caused by environmental factors, genetics, and various allergens. The prevalence of allergic diseases is increasing worldwide, and 20-25% of the population suffers from rhinitis, asthma, atopic dermatitis, and food allergies.
  • Allergies include not only IgE-mediated allergic reactions in which IgE antibodies are the cause of the reaction, but also non-IgE-mediated reactions that occur due to immune system components other than IgE antibodies.
  • the mechanism of non-IgE-mediated allergic disease is not well known, but it is known that innate immunity and cellular immunity (T-lymphocyte process) are involved.
  • T-lymphocyte process innate immunity and cellular immunity
  • mast cells play a role in both IgE-mediated allergic reactions and non-IgE-mediated allergic reactions, and play an important function in inflammation and immune regulation. When the mast cells are activated, degranulation of the mast cells is induced, and chemical mediators such as histamine, cytokines, and chemokines present in the granules are secreted out of the cells.
  • mast cell granules Chemical mediators present in mast cell granules are known to cause allergic reactions by inducing increased vascular permeability, smooth muscle contraction, and increased mucus secretion.
  • mast cells produce various cytokines through high-affinity IgE receptor (Fc ⁇ RI), which promotes the expression of inflammatory reaction inducers and causes an inflammatory allergic reaction.
  • Fc ⁇ RI high-affinity IgE receptor
  • IL-4 induces the production of IgE and regulates IgE-mediated immune responses, and it has been reported that the production of IL-4 is increased even in actual allergic patients (Ngoc et al., 2005).
  • the present inventor used the results of identifying the intestinal bacterial flora to discover an anti-allergy active substance that has not only IgE-mediated allergy therapeutic activity but also non-IgE-mediated allergy therapeutic activity, contributing to the development of an allergy treatment agent.
  • One aspect is inhibiting the production of Th2 (Helper T Cells Type 2) cytokines or allergic reactions containing Lactiplantibacillus plantarum strains belonging to the Lactiplantibacillus sp. as an active ingredient.
  • Th2 Helper T Cells Type 2
  • cytokines or allergic reactions containing Lactiplantibacillus plantarum strains belonging to the Lactiplantibacillus sp. as an active ingredient.
  • One aspect is to provide the Lactiplantibacillus plantarum GBCC_F0154 strain belonging to the Lactiplantibacillus genus (Lactiplantibacillus sp. ), deposited with accession number KCTC 15152BP.
  • Another aspect is to provide a lysate, culture medium, or extract of the culture medium derived from the strain.
  • Another aspect is to provide a health functional food for preventing or improving allergic diseases containing Lactiplantibacillus plantarum strains, lysates, cultures, or mixtures thereof derived from the strains as active ingredients.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of allergic diseases containing Lactiplantibacillus plantarum strains, lysates, cultures, or mixtures thereof derived from the strains as active ingredients.
  • Another aspect is to provide a cosmetic composition for preventing or improving allergic skin diseases, which contains Lactiplantibacillus plantarum strains, lysates, cultures, or mixtures thereof derived from the strains as active ingredients.
  • Another aspect is to provide a food composition containing a Lactiplantibacillus plantarum strain, a lysate, a culture medium, or a mixture thereof derived from the strain as an active ingredient.
  • One aspect is to inhibit the production of Th2 (Helper T Cells Type 2)-mediated cytokines or to cause allergies, including Lactiplantibacillus plantarum strains belonging to the Lactiplantibacillus sp.
  • Th2 Helper T Cells Type 2
  • a composition that alleviates the reaction is provided.
  • One aspect provides a Lactiplantibacillus plantarum strain belonging to the Lactiplantibacillus sp .
  • Lactiplantibacillus is a genus of aerobic or facultative anaerobic Gram-positive bacilli that is widely distributed in nature. Microorganisms belonging to the Lactiplantybacillus genus include Lactiplantybacillus plantarum and Fermentum. As a result of research to develop a new strain with excellent anti-allergy effect, the present inventors selected Lactiplantibacillus plantarum GBCC_F0154 as an anti-allergy candidate strain. The strain was deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resources Center under the accession number KCTC 15152BP on October 24, 2022. The strain corresponds to a probiotic strain, is harmless to the human body, and can be used without side effects.
  • the Lactiplantibacillus plantarum strain may be a strain deposited under the accession number KCTC 15152BP.
  • the Lactiplantibacillus plantarum strain may be a strain containing the 16S rRNA gene of SEQ ID NO: 1.
  • the strain may be a strain having 16S rRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a 16S rRNA containing a nucleotide sequence having 97% or more nucleotide sequence homology thereto. Specifically, it has at least 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% or 100% homology with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 1 of the present specification.
  • the Lactiplantibacillus plantarum strain may be a strain containing the recA gene sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the strain may be a strain having recA including the recA gene sequence of SEQ ID NO: 2 or a gene sequence having more than 97% gene sequence homology thereto. Specifically, it has at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% or 100% homology with the gene sequence consisting of SEQ ID NO: 2 of the present specification.
  • the strain may be a strain that is a mutation of a naturally occurring strain.
  • the strain may be live bacteria, dead bacteria, attenuated bacteria, or a cytoplasmic fraction obtained by crushing the strain, and preferably may be live bacteria.
  • the strain may have anti-allergic activity.
  • allergy-causing mechanisms can be divided into first-stage mechanisms and second-stage mechanisms.
  • an external allergen first penetrates into the body through epithelial cells, and the infiltrated allergen is phagocytosed by Antigen Presenting Cells and presents some of its fragments to T cells. It can be.
  • the T cells presented with the antigen are differentiated into Th2 cells (Helper T Cells Type 2) and can produce Th2-mediated cytokines such as IL (Interleukin)-4.
  • Th2 cells Helper T Cells Type 2 cells
  • Th2-mediated cytokines such as IL (Interleukin)-4.
  • the produced cytokines can activate B cells and induce the production of IgE (Immunoglobulin E) from B cells.
  • IgE Immunoglobulin E
  • the produced IgE antibodies bind to the Fc ⁇ RI receptors present on the surface of mast cells. This state is called an atopic state and can be said to be a state of preparation (waiting) for allergy induction.
  • the allergen that has infiltrated in the first stage and was remembered from the immune cells re-infiltrates and cross-links with IgE bound to the mast cells, thereby inducing the degranulation process of the mast cells, thereby inducing the inside of the mast cells.
  • This may be a stage in which allergic inflammatory factors such as histamine, leukotriene, and tryptase that were present in the body are released to the outside. These substances, which typically include histamine, can be a direct cause of various allergic inflammatory diseases.
  • the current mechanism of action of treatments or allergy improvement materials may be focused on preventing the release of histamine from mast cells and the role of histamine, which is the final stage of allergy.
  • the strain may have the activity of suppressing Th2 cytokine production, suppressing the degranulation activity of mast cells, suppressing the level of IgE in serum, or suppressing the level of MCPT-1 in serum.
  • the inhibition of degranulation activity of mast cells may involve inhibiting the secretion of ⁇ -hexosaminidase from activated mast cells.
  • the strain may reduce the concentration of IgE in serum or reduce the binding of IgE to the surface receptor of mast cells. Additionally, the strain may suppress the level of MCPT-1 in serum.
  • the strain according to one embodiment can be usefully used in the treatment of allergic diseases.
  • Another aspect provides a lysate, a culture solution, an extract of the culture solution, or a mixture thereof derived from a Lactiplantibacillus plantarum strain.
  • culture medium may be used interchangeably with “culture supernatant,” “culture supernatant,” “conditioned culture medium,” or “conditioned medium,” and allows strains of the Lactiplantibacillus genus to grow and survive in vitro. It may refer to the entire medium containing the strain, its metabolites, extra nutrients, etc. obtained by culturing the strain in a medium capable of supplying nutrients for a certain period of time.
  • the culture refers to a product obtained by culturing a probiotic strain in a known medium, and the product may or may not include the strain itself.
  • the medium may be selected from known liquid media or solid media, for example, MRS liquid medium, GAM liquid medium, MRS agar medium, GAM agar medium, and BL agar medium, but is not limited thereto.
  • the culture medium may include the culture medium itself, its concentrate, or freeze-dried product obtained by cultivating the strain, or the culture supernatant obtained by removing the strain from the culture medium, its concentrate, or freeze-dried product.
  • lysate may be used interchangeably with “lysate” and refers to an aqueous medium solution or suspension of broken microbial cells, such as Lactiplantibacillus plantarum.
  • Cell lysates include, for example, macromolecules such as DNA, RNA, proteins, peptides, carbohydrates, lipids, etc. and/or micromolecules such as amino acids, sugars, fatty acids, etc., or fractions thereof.
  • the lysate also contains cell debris, which may be smooth or granular in structure.
  • culture extract refers to an extract from the culture medium or its concentrate, and may include extracts, diluted or concentrated extracts, dried products obtained by drying the extracts, crude or purified products thereof, and fractions thereof. You can.
  • the culture medium is for cultivating Lactiplantibacillus plantarum in an appropriate medium (e.g., MRS plate medium) at any temperature above 10°C or below 40°C for a certain period of time, for example, 4 to 50 hours. It may be obtained by culturing for a period of time.
  • an appropriate medium e.g., MRS plate medium
  • the culture medium and culture conditions for culturing the Lactiplantibacillus plantarum can be appropriately selected or modified by those skilled in the art.
  • compositions comprising a lysate derived from a Lactiplantibacillus plantarum strain, a culture medium, an extract of the culture medium, or a mixture thereof.
  • the composition may further include an additive selected from the group consisting of preservatives, dyes, emulsifiers, sweeteners, stabilizers, flavor enhancers, flavoring agents, and acidulants.
  • an additive selected from the group consisting of preservatives, dyes, emulsifiers, sweeteners, stabilizers, flavor enhancers, flavoring agents, and acidulants.
  • it may be one or more formulations selected from the group consisting of solutions, emulsions, viscous mixtures, powders, granules, tablets, and capsules.
  • the composition may have anti-allergic activity.
  • the anti-allergic activity may include inhibition of Th2 cytokine production, inhibition of degranulation activity of mast cells, inhibition of IgE levels in serum, or inhibition of MCPT-1 levels in serum, and food allergy inhibition activity.
  • the inhibition of degranulation activity of mast cells may involve inhibiting the secretion of ⁇ -hexosaminidase from activated mast cells.
  • the Th2 cytokine may be one or more selected from the group consisting of IL-4, IL-5, IL-10, and IL-13.
  • the composition may reduce the concentration of IgE in serum or reduce the binding of IgE to the surface receptor of mast cells. Additionally, the strain may suppress the level of MCPT-1 in serum.
  • the anti-allergic activity may include the activity of inhibiting mast cell degranulation by 60% to 90% when the supernatant of Lactiplantibacillus plantarum GBCC_F0154 strain is treated with mast cell RBL-2H3. .
  • the anti-allergic activity may include the activity of suppressing ear swelling by 30% to 60% when the Supernatant of Lactiplantibacillus Plantarum GBCC_F0154 strain is treated with an MC903-induced atopic dermatitis animal model. .
  • the anti-allergic activity is an activity that reduces the concentration of ovalbumin-specific IgE in the serum by 20% to 30% when the Lactiplantibacillus plantarum GBCC_F0154 strain is treated in an ovalbumin-induced asthma animal model. It may include an activity that reduces the concentration of Th2 cytokines in serum by 50% to 60%.
  • the anti-allergic activity is an activity or serum that reduces the concentration of Th2 cytokines in serum by 40% to 60% when the Lactiplantibacillus plantarum GBCC_F0154 strain is treated in an ovalbumin-induced rhinitis animal model. It may include an activity that reduces the concentration of total IgE and ovalbumin-specific IgE by 20% to 30%.
  • Another aspect provides the use of Lactiplantibacillus plantarum, a lysate, a culture, or an extract of the strain to improve, prevent, or treat a disease.
  • the use may include preventing, ameliorating, or treating a disease or condition mediated by Immunoglobulin E (IgE) or not mediated by IgE.
  • a disease mediated by IgE (Immunoglobulin E) or not mediated by IgE may be an allergic disease.
  • allergic disease refers to a disease caused by an allergic reaction in which the body's immune response to external antigens is excessive, specifically edema, anaphylaxis, and allergic rhinitis. ), asthma, allergic conjunctivitis, allergic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, urticaria, chronic spontaneous urticaria, urticaria, It may be one or more diseases selected from the group consisting of pruritus, anaphylactic shock, insect allergy, food allergy, drug allergy, and respiratory allergy, but is not limited thereto.
  • the development process of the allergic disease is largely divided into early reactions and late reactions.
  • the initial reaction is when an antibody (IgE) is produced by antigen stimulation, and the antibody binds to the high affinity receptor (Fc ⁇ RI) on the surface of a mast cell.
  • Fc ⁇ RI high affinity receptor
  • the antibody (IgE) bound to Fc ⁇ RI is generated. It combines with and quickly transmits signals into mast cells to secrete inflammatory chemical mediators (cytokines, histamines, leukotrienes) that cause allergies.
  • IL-4 is produced by T cells and mast cells, and plays a role in regulating class switching of B cells and promoting the production of IgE
  • IL-5 is produced by eosinphiles. It affects production, activation, and survival, and eosinophils are activated by IgE. Therefore, the activity of IL-4, IL-5, and eosinophils is associated with increased IgE.
  • the allergic disease may be a disease or condition mediated by IgE (Immunoglobulin E) or not mediated by IgE, or a condition related to an allergic disease.
  • IgE Immunoglobulin E
  • the term “treat” may mean curing inflammation or bacterial infection in a shorter time compared to natural healing.
  • the treatment may include amelioration and/or alleviation of inflammation or bacterial infection. Additionally, the treatment may mean healing and/or recovery of symptoms caused by inflammation or bacterial infection.
  • the composition may include 0.001% by weight to 80% by weight of the Lactiplantibacillus plantarum strain based on the total weight of the composition.
  • the administered dose of the Lactiplantibacillus plantarum strain is 0.01 mg to 10,000 mg, 0.1 mg to 1000 mg, 1 mg to 100 mg, 0.01 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.01 mg to 10 mg, or 0.01 mg to 1 mg. You can.
  • the strain is included in the composition in a therapeutically effective amount or nutritionally effective concentration, for example, the strain is 10 3 to 10 16 CFU/g, 10 3 to 10 15 CFU/g, 10 3 to 10 14 CFU/g.
  • 1X10 3 to 1X10 16 CFU/g of live or dead cells may be administered once or in divided doses.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and those skilled in the art will Taking these factors into consideration, the dosage can be adjusted appropriately.
  • the frequency of administration may be once a month, once every two weeks, once a week, once a day, twice a day, or three times a day, specifically once or with clinically acceptable side effects. It can be administered more than twice within the range, and can be administered at one or two or more locations.
  • the dosage per kg is the same as that for humans, or, for example, the above-mentioned administration is based on the volume ratio (e.g., average value) of organs (e.g., heart, etc.) between the target animal and human.
  • the converted dose can be administered.
  • Possible routes of administration include oral, sublingual, parenteral (e.g., subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrathecal, intravenous, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, or intralesional), rectal, or topical. (including transdermal), inhalation, and injection, or insertion of an implantable device or substance.
  • the composition includes killed dried strains, and can be administered in an amount of 1g to 10g, 0.5g to 1.5g, 2.5g to 3.5g, or 4.5g to 5.5g, once a day to 3 times. It may be administered once.
  • Another aspect provides a food composition
  • a food composition comprising a Lactiplantibacillus plantarum strain, a lysate, a culture medium, or a mixture thereof derived from the strain as an active ingredient.
  • Another aspect provides a health functional food for preventing or improving allergic diseases containing Lactiplantibacillus plantarum strains, lysates, cultures, or mixtures thereof derived from the strains as active ingredients.
  • strain The “strain”, “anti-allergic activity”, and “allergic disease” are as defined above.
  • the food composition or health functional food may have anti-allergic activity.
  • the anti-allergic activity may have the activity of inhibiting Th2 cytokine production, inhibiting the degranulation activity of mast cells, inhibiting the level of IgE in serum, or inhibiting the level of MCPT-1 in serum.
  • the inhibition of degranulation activity of mast cells may involve inhibiting the secretion of ⁇ -hexosaminidase from activated mast cells.
  • the Th2 cytokine may be one or more selected from the group consisting of IL-4, IL-5, IL-10, and IL-13.
  • the health functional food may reduce the concentration of IgE in serum or reduce the binding of IgE to the surface receptor of mast cells. Additionally, the strain may suppress the level of MCPT-1 in serum.
  • the health functional food is preferably manufactured in a dosage form selected from powder, granule, pill, tablet, capsule, candy, syrup and beverage, but is not limited thereto.
  • the health functional food of the present invention can be manufactured by adding the active ingredients as is or mixing them with other foods or food ingredients, and can be manufactured appropriately according to conventional methods.
  • the improvement of the allergic disease may include alleviating immune hypersensitivity or improving skin condition due to immune hypersensitivity.
  • improving the allergic disease may include suppressing the degranulation activity of mast cells or suppressing the level of IgE or MCPT-1 in serum.
  • the allergic disease includes edema, anaphylaxis, allergic rhinitis, asthma, allergic conjunctivitis, allergic dermatitis, and atopic dermatitis.
  • dermatitis contact dermatitis, urticaria, chronic spontaneous urticaria, urticaria, pruritus, anaphylactic shock, insect allergy, food allergy, drug allergy, and respiratory allergy. .
  • the allergic disease may include an allergic reaction caused by house dust, fungi, mites, or animal hair, skin, or excrement.
  • the food composition may be for preventing or improving allergic diseases.
  • the food includes meat, sausages, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, cereals, baked goods, dairy products, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various powdered milk, and infants.
  • These include powdered milk, milk, milk powder, yogurt, cheese, fermented milk, soup, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, food additives, health functional foods and health foods, etc. Includes all foods.
  • the above-mentioned health functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and is a medicine processed to efficiently exhibit bioregulatory functions in addition to nutritional supply, with high medical effects. It means food.
  • “function” means adjusting nutrients to the structure and function of the human body or obtaining useful effects for health purposes, such as physiological effects.
  • the food of this application can be manufactured by a method commonly used in the art, and can be manufactured by adding raw materials and ingredients commonly added in the art. Additionally, the food formulation can be manufactured without limitation as long as it is a formulation recognized as a food.
  • the food composition of the present application can be manufactured in various types of formulations, and unlike general drugs, it is made from food as a raw material and has the advantage of not having side effects that may occur during long-term use of the drug, and is excellent in portability.
  • GBCC_F0154 can be taken as a supplement to enhance the effect of preventing or improving allergies.
  • health food refers to food that has a more active health maintenance or promotion effect compared to general food
  • health supplement food refers to food for the purpose of health supplementation.
  • health functional food, health food, and health supplement may be used interchangeably.
  • the health functional food is a food manufactured by adding the composition according to the example to food materials such as beverages, teas, spices, gum, and confectionery, or by encapsulating, powdering, or suspending it, and consuming it may cause health problems. It means bringing about a specific effect, but unlike regular drugs, it has the advantage of not having any side effects that may occur when taking the drug for a long time since it is made from food.
  • the food composition according to one example can be expected to be highly effective in preventing or improving allergic diseases because it can be consumed on a daily basis, so it can be very useful.
  • the food composition may further include a physiologically acceptable carrier.
  • a physiologically acceptable carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art can be used.
  • the food composition may contain additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve smell, taste, vision, etc.
  • it may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, pantothenic acid, etc.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), and chromium (Cr).
  • it may contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine.
  • the food composition contains preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), disinfectants (bleaching powder, high bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxide) roxitoluene (BHT), etc.), colorants (tar color, etc.), coloring agents (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleaching agents (sodium sulfite), seasonings (MSG monosodium glutamate, etc.), sweeteners (dulcine, cyclemate, saccharin) , sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), leavening agents (alum, D-potassium hydrogen tartrate, etc.), strengtheners, emulsifiers, thickeners (grease), coating agents, gum base agents, anti-foam agents, solvents, improvers, etc. May
  • the composition according to one example can be added as is or used with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present application may be added in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less, relative to the food or beverage.
  • the content when consumed for a long time for health and hygiene purposes, the content may be below the above range. Since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in amounts above the above range.
  • the food composition it can be used as a health drink composition, and in this case, it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, like regular drinks.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins; It may be a sugar alcohol such as xylitol, sorbitol, or erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g, per 100 mL of the health drink composition of the present application.
  • the health drink composition includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, It may contain alcohol or carbonating agent. Additionally, it may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, or vegetable beverage. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health drink composition of the present application.
  • the food composition according to an example may contain various weight% if it can show the effect of preventing or improving allergic diseases.
  • GBCC_F0154 according to an example is 0.00001 to 100% by weight, 0.01% by weight, based on the total weight of the food composition. It may contain from 80% by weight, or from 5 to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or symptom relief), but is not limited thereto.
  • 10 8 of Lactiplantibacillus Plantarum GBCC_F0154 conjugated to a polymer polysaccharide binder It may be included at a concentration of CFU/g to 10 10 CFU/g.
  • the health functional food composition can be used alone or with other foods or food ingredients, such as the strain or its culture medium, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw materials.
  • beverage compositions may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like ordinary beverages.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the health food composition also contains nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, and carbonated beverages. It may contain the carbonating agent used, or a combination thereof.
  • the health functional food composition may also contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, vegetable beverage, or a combination thereof.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of allergic diseases containing Lactiplantibacillus plantarum strains, lysates, cultures, or mixtures thereof derived from the strains as active ingredients.
  • strain The “strain”, “anti-allergic activity”, and “allergic disease” are as defined above.
  • the pharmaceutical composition may have anti-allergic activity.
  • the anti-allergic activity may have the activity of inhibiting Th2 cytokine production, inhibiting the degranulation activity of mast cells, inhibiting the level of IgE in serum, or inhibiting the level of MCPT-1 in serum.
  • the inhibition of degranulation activity of mast cells may involve inhibiting the secretion of ⁇ -hexosaminidase from activated mast cells.
  • the Th2 cytokine may be one or more selected from the group consisting of IL-4, IL-5, IL-10, and IL-13.
  • the pharmaceutical composition may reduce the concentration of IgE in serum or reduce the binding of IgE to the surface receptor of mast cells. Additionally, the strain may suppress the level of MCPT-1 in serum.
  • the allergic disease includes edema, anaphylaxis, allergic rhinitis, asthma, allergic conjunctivitis, allergic dermatitis, and atopic dermatitis.
  • dermatitis contact dermatitis, urticaria, chronic spontaneous urticaria, urticaria, pruritus, anaphylactic shock, insect allergy, food allergy, drug allergy, and respiratory allergy. .
  • the allergic disease may include an allergic reaction caused by house dust, fungi, mites, or animal hair, skin, or excrement.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and the lubricant may be magnesium stearate, talc, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, disintegrant, binder, lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be calcium carboxymethylcellulose, sodium starch glycolate, calcium monohydrogen phosphate anhydride, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as an oral or parenteral dosage form. It can be specifically formulated for oral, rectal, intravenous, intravascular, intratumoral, subcutaneous, intradermal, or intraperitoneal delivery. More specifically, the oral dosage form may be granules, powder, liquid, tablet, capsule, dry syrup, or a combination thereof, and the parenteral dosage form may be an injection.
  • Another aspect is to provide a cosmetic composition for preventing or improving allergic diseases containing Lactiplantibacillus plantarum strains, lysates, cultures, or mixtures thereof derived from the strains as active ingredients.
  • strain The “strain”, “anti-allergic activity”, and “allergic disease” are as defined above.
  • the cosmetic composition may have anti-allergic activity.
  • the cosmetic composition may have, for example, an softening lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, essence, pack, gel, ampoule, or skin-adhesive type cosmetic formulation.
  • Ingredients included in the cosmetic composition may include ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the composition as an active ingredient, for example, conventional auxiliaries and carriers such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances. may include.
  • Another aspect provides a method of preventing, ameliorating, or treating a condition in a subject comprising treating or administering an effective amount of the composition described above to the subject in need thereof.
  • the condition of the subject may be a disease or condition mediated by IgE (Immunoglobulin E) or not mediated by IgE, or a condition related to an allergic disease.
  • IgE Immunoglobulin E
  • the term “administration” refers to the physical introduction of a composition into a subject using any of a variety of methods and delivery systems known to those skilled in the art.
  • the administration may be performed by methods known in the art.
  • Administration may be administered directly to the subject by any means, such as, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. You can.
  • the administration may be administered systemically or locally.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the subject may be an individual in need of an improvement in a condition related to inflammation or a condition related to bacterial infection.
  • the administration of the composition according to one embodiment is 0.00001 mg to 1,000 mg, for example, 0.00001 mg to 500 mg, 0.00001 mg to 100 mg, 0.00001 mg to 50 mg, 0.00001 mg to 25 mg, 1 mg to 1 mg per day.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and those skilled in the art will Taking these factors into consideration, the dosage can be adjusted appropriately.
  • the frequency of administration can be once a day or more than twice within the range of clinically acceptable side effects, and can be administered at one or two or more locations, daily or at intervals of 2 to 5 days.
  • the number of days of administration can range from 1 to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after an appropriate period.
  • the dosage per kg is the same as that for humans, or the above dosage is converted into, for example, the volume ratio (e.g., average value) of the organs (heart, etc.) between the target animal and the human.
  • One dose can be administered.
  • the new strain and its derived lysate, culture medium, extract of the culture medium, or mixtures thereof have effects that can be usefully used in the prevention, improvement, or treatment of allergic diseases.
  • Figure 1 is a graph showing the degranulation inhibition effect of GBCC_F0154 culture supernatant on RBL-2H3 mast cells.
  • Figure 2 is a graph showing the effect of GBCC_F0154 on suppressing ear swelling in the MC903-induced atopic dermatitis mouse model.
  • Figure 3 is a graph showing the effect of GBCC_F0154 on reducing total IgE in serum in the MC903-induced atopic dermatitis mouse model.
  • Figure 4 is a graph showing the effect of GBCC_F0154 on reducing MCPT-1 in serum in the MC903-induced atopic dermatitis mouse model.
  • Figure 5 is a graph showing the effect of reducing total IgE in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in a food allergy animal model.
  • Figure 5 is a graph showing the effect of reducing total IgE in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in a food allergy animal model.
  • Figure 6 is a graph showing the effect of reducing MCPT-1 in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in a food allergy animal model.
  • Figure 7 is a graph showing the effect of reducing ovalbumin-specific IgE in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in an ovalbumin-induced asthma animal model.
  • Figure 8 is a graph showing the effect of suppressing Th2 cytokines in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in an ovalbumin-induced asthma animal model.
  • Figure 9 is a graph showing the inhibitory effect on Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13) in the nasal mucosa of the group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in an ovalbumin-induced rhinitis animal model.
  • Figure 10 is a graph showing the effect of reducing total IgE and ovalbumin-specific IgE in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in an ovalbumin-induced rhinitis animal model.
  • Lactiplantybacillus Plantarum Lactiplantibacillus plantarum
  • the Lactiplantibacillus plantarum strain of the present invention was isolated from pickled cabbage (sauerkraut), a German-style kimchi made at home. After soaking, pickled cabbage that was 13 days old was plated on MRS (deMan, Rogosa, Sharpe) plate medium, a lactic acid bacteria culture medium, through continuous dilution of 1/10 in PBS buffer. After culturing in an anaerobic chamber at 37°C for 3 days, bacterial colonies were observed, and a single colony was subcultured on a new MRS plate medium for pure isolation. Identification of the pure isolated strain was confirmed through PCR and Sanger sequencing of the 16S rRNA gene.
  • GBCC_F0154 is 100% identical to the standard strain of Lactiplantibacillus plantarum in terms of 16S rRNA gene sequence, but shows a similarity of over 98.5%, which is the standard value generally applied for distinguishing bacterial species using the 16S rRNA gene. Three more species were identified (Table 2).
  • Lactobacillus plantarum Before the strain name of Lactiplantibacillus plantarum was changed, it was named Lactobacillus plantarum .
  • the sequence similarity of the recA gene which is widely used as a taxonomic biomarker for bacteria, A more accurate identification was performed based on .
  • GBCC_F0154 was confirmed to be a strain corresponding to Lactiplantibacillus plantarum (Table 3).
  • the recA gene sequence of GBCC_F0154 is shown as SEQ ID NO: 2.
  • the inventors named the GBCC_F0154 strain as " Lactiplantibacillus plantarum GBCC_F0154" (Accession number: KCTC 15152BP) and donated it to the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Materials Biological Resources Center (Korean collection for type cultures, KCTC). Deposited on October 24, 2022.
  • RBL-2H3 cells were suspended in 15% FBS and MEM medium in a 24-well plate, then 1.5 After washing the cells once with PIPES buffer (25mM PIPES, 119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2 , 1mM CaCl2 , 5.6mM glucose, 0.1%BSA), culture supernatants of various L. plantarum strains were washed. It was diluted 1:15 in PIPES buffer and pretreated for 2 hours in each well. The culture supernatant was obtained by culturing the L. plantarum strain in MRS medium, precipitating the strain by centrifugation, collecting only the supernatant, and filtering it through a 0.22 ⁇ m filter.
  • PIPES buffer 25mM PIPES, 119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2 , 1mM CaCl2 , 5.6mM glucose, 0.1%BSA
  • DNP-HSA antigen
  • 25 ng/mL DNP-HSA (antigen) was added and stimulated for 15 minutes, and then the reaction was stopped by cooling on ice for 5 minutes.
  • the supernatant was transferred to an e-tube, washed once with PIPES buffer, and the cells remaining on the plate were disrupted with 0.1% triton X-100.
  • the supernatant and dissolved cell samples were mixed with 30 ⁇ L each of substrate buffer (1 mM 4-Nitrophenyl N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminide, 0.1 M sodium citrate) in a 96-well plate and reacted at 37°C for 1 hour. .
  • substrate buffer (1 mM 4-Nitrophenyl N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminide, 0.1 M sodium citrate
  • Figure 1 is a graph showing the degranulation inhibition effect of GBCC_F0154 culture supernatant on RBL-2H3 mast cells.
  • the culture supernatant of the L. plantarum GBCC_F0154 strain showed an effect of inhibiting mast cell degranulation by about 77.2%, making it the most effective in suppressing allergic reactions. It was confirmed that there is.
  • mice Six-week-old BALB/c mice were obtained, and after a one-week acclimatization period, the freeze-dried L. plantarum GBCC_F0154 strain was suspended in D-PBS and administered 2x per mouse from 7 days before inducing atopic dermatitis until just before the end of the test. 10 9 CFU was administered orally daily. After correcting the mice to induce atopic dermatitis, the disease-inducing group was treated with 20 ⁇ L of 2 nmol MC903 (Calcipotriol, C 27 H 40 O 3 ) dissolved in ethanol in both ears daily for 12 days, while the normal group was treated with ethanol only. It was applied.
  • 2 nmol MC903 Calcipotriol, C 27 H 40 O 3
  • the thickness of the mouse ears was measured at the same time every day and is shown in Figure 2.
  • the change in ear edema was calculated by subtracting the ear thickness measured before disease induction from the ear thickness measured daily after disease induction.
  • Figure 2 is a graph showing the effect of GBCC_F0154 on suppressing ear swelling in the MC903-induced atopic dermatitis mouse model.
  • IgE is the most representative marker of atopic dermatitis, and the total IgE concentration in serum was measured from the MC903-induced atopic dermatitis animal model in Experimental Example 2 using the Mouse IgE ELISA Kit (Biolegend #432404).
  • Microwell plates were incubated overnight at 4°C with capture antibody diluted in coating buffer, then washed four times with wash buffer and blocked with assay diluent at room temperature for 1 hour. After washing 4 times, standard sample and serum sample diluted 1:1000 were added and reacted at room temperature for 2 hours, washed 4 times, detection antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 4 times and adding avidin-HRP and reacting at room temperature for 30 minutes, washing 5 times and adding TMB substrate solution, blocking light for 20 minutes and reacting at room temperature. The color reaction was stopped by adding a stop solution to each well, and the absorbance was measured at 450 nm with an ELISA reader, as shown in Figure 3.
  • Figure 3 is a graph showing the effect of GBCC_F0154 on reducing total IgE in serum in the MC903-induced atopic dermatitis mouse model.
  • the total IgE concentration in serum increased rapidly in the control group (MC903) compared to the normal group, but in the experimental group administered the L. plantarum GBCC_F0154 strain (MC903+GBCC_F0154), the total IgE in serum was about 51.3%. The effect of reducing concentration was confirmed.
  • Capture antibodies diluted with coating buffer were stored on microwell plates overnight at 4°C, then washed three times with wash buffer and blocked with ELISA/ELISPOT diluent for 1 hour at room temperature. After washing three times, standard samples and serum samples diluted 1:100 were added and reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, detection antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times and adding avidin-HRP and reacting at room temperature for 30 minutes, washing five times, adding TMB substrate solution, blocking light for 15 minutes and reacting at room temperature. The color reaction was stopped by adding a stop solution to each well, and the absorbance was measured at 450 nm with an ELISA reader, as shown in Figure 4.
  • Figure 4 is a graph showing the effect of GBCC_F0154 on reducing MCPT-1 in serum in the MC903-induced atopic dermatitis mouse model.
  • control group (MC903) had a sharp increase in serum MCPT-1 concentration compared to the normal group, but in the experimental group (MC903+GBCC_F0154) administered the L. plantarum GBCC_F0154 strain, MCPT in serum was about 41.0%. The effect of reducing concentration by -1 could be confirmed.
  • mice Five-week-old BALB/c mice were obtained, went through a one-week acclimatization period, and were sensitized by intraperitoneal injection of a mixture of 50 ⁇ g of OVA and 1 mg of alum hydroxide twice at two-week intervals to induce a food allergic reaction. Two weeks after the last sensitization date, allergic reactions were induced by oral administration of 50 mg of ovalbumin five times at two-day intervals.
  • freeze-dried L. plantarum GBCC_F0154 strain was suspended in D-PBS and orally administered daily at 2 x 10 9 CFU per mouse from the time of ovalbumin sensitization to immediately before the end of the test. .
  • Capture antibodies diluted with coating buffer were left on microwell plates overnight at 4°C, then washed four times with wash buffer and blocked with assay diluent for 1 hour at room temperature. After washing 4 times, standard sample and serum sample diluted 1:1000 were added and reacted at room temperature for 2 hours, washed 4 times, detection antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 4 times and adding avidin-HRP and reacting at room temperature for 30 minutes, washing 5 times and adding TMB substrate solution, blocking light for 20 minutes and reacting at room temperature. The color reaction was stopped by adding a stop solution to each well, and the absorbance was measured at 450 nm with an ELISA reader, and the results are shown in Figure 5.
  • Figure 5 is a graph showing the effect of reducing total IgE in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in a food allergy animal model.
  • the total IgE concentration in the serum of the control group (OVA) increased sharply compared to the normal group, but the total IgE in the serum was about 20.0% in the experimental group (OVA+GBCC_F0154) administered with the L. plantarum GBCC_F0154 strain. The effect of reducing concentration was confirmed.
  • the Mouse MCPT-1 (mMCP-1) ELISA Kit (Invitrogen #88-7503) was used to check the concentration of mast cell protease-1 (MCPT-1) in the serum from an ovalbumin-induced food allergy animal model. It was measured.
  • Capture antibodies diluted with coating buffer were stored on microwell plates overnight at 4°C, then washed three times with wash buffer and blocked with ELISA/ELISPOT diluent for 1 hour at room temperature. After washing three times, standard samples and serum samples diluted 1:100 were added and reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, detection antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times and adding avidin-HRP and reacting at room temperature for 30 minutes, washing five times, adding TMB substrate solution, blocking light for 15 minutes and reacting at room temperature. The color reaction was stopped by adding a stop solution to each well, and the absorbance was measured at 450 nm with an ELISA reader, and the results are shown in Figure 6.
  • Figure 6 is a graph showing the effect of reducing MCPT-1 in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in a food allergy animal model.
  • control group had a sharp increase in MCPT-1 concentration in the serum compared to the normal group, but in the experimental group administered the L. plantarum GBCC_F0154 strain (OVA+GBCC_F0154), MCPT in the serum was about 41.9%. The effect of reducing concentration by -1 could be confirmed.
  • OVA ovalbumin
  • mice Five-week-old BALB/c mice were obtained, and after an acclimatization period of one week, they were sensitized by intraperitoneal injection twice at two-week intervals with a mixture of 50 ⁇ g of OVA and 1 mg of alum hydroxide to create an asthma mouse model.
  • asthma was induced by instilling 150 ⁇ g of ovalbumin into the nasal cavity under anesthesia from the 21st to the 25th day and aspirated into the lungs, and serum was obtained 24 hours after the last challenge.
  • ovalbumin-specific IgE wash ovalbumin-coated plates 4 times, add standard sample and serum sample diluted 1:2, react at room temperature for 2 hours, wash 4 times, add detection antibody, and react for 1 hour. The reaction was carried out at room temperature. After washing 4 times and adding avidin-HRP and reacting at room temperature for 30 minutes, washing 5 times and adding TMB substrate solution, blocking light for 20 minutes and reacting at room temperature. The color reaction was stopped by adding a stop solution to each well, and the absorbance was measured at 450 nm with an ELISA reader. The results are shown in Figure 7.
  • Figure 7 is a graph showing the effect of reducing ovalbumin-specific IgE in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in an ovalbumin-induced asthma animal model.
  • the concentration of ovalbumin-specific IgE in the serum of the control group increased rapidly compared to the normal group, but in the experimental group administered the L. plantarum GBCC_F0154 strain (OVA+GBCC_F0154), about 21.2% of the serum
  • OVA+GBCC_F0154 the L. plantarum GBCC_F0154 strain
  • Capture antibodies diluted with coating buffer were left on microwell plates overnight at 4°C, then washed four times with wash buffer and blocked with assay diluent for 1 hour at room temperature. After washing 4 times, standard sample and 1:5 diluted serum sample were added and reacted at room temperature for 2 hours, washed 4 times, detection antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 4 times and adding avidin-HRP and reacting at room temperature for 30 minutes, washing 5 times and adding TMB substrate solution, blocking light for 20 minutes and reacting at room temperature. The color reaction was stopped by adding a stop solution to each well, and the absorbance was measured at 450 nm with an ELISA reader, and the results are shown in Figure 8.
  • Figure 8 is a graph showing the effect of suppressing Th2 cytokines in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in an ovalbumin-induced asthma animal model.
  • the serum IL-5 concentration in the control group increased sharply compared to the normal group, but in the experimental group (OVA+GBCC_F0154) administered with the L. plantarum GBCC_F0154 strain, the IL-5 concentration increased by about 53.8% compared to the control group. It was confirmed that the production amount of IL-5 in serum decreased.
  • the rhinitis alleviating effect of the L. plantarum GBCC_F0154 strain was confirmed in an animal model in which rhinitis was induced with ovalbumin (OVA).
  • mice 5-week-old BALB/c mice were obtained, went through a one-week acclimatization period, and were sensitized by intraperitoneal injection of a mixture of 50 ⁇ g of OVA and 2 mg of alum hydroxide three times at one-week intervals to create a rhinitis mouse model.
  • rhinitis was induced by intranasally instilling 100 ⁇ g of ovalbumin without anesthesia to prevent the antigen from being aspirated into the lungs.
  • Figure 9 is a graph showing the inhibitory effect on Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13) in the nasal mucosa of the group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in an ovalbumin-induced rhinitis animal model.
  • Th2 cytokines in the nasal mucosa of the rhinitis-induced group significantly increased compared to the normal group.
  • IL-4 mRNA expression level showed a statistically significant inhibitory effect of about 43.4%, and IL-5 mRNA expression level was A reduction effect of 45.9% and IL-13 mRNA expression level of 41.0% was confirmed.
  • Total IgE in serum was determined by adding capture antibodies diluted with a coating buffe to microwell plates over night at 4°C, followed by washing 4 times with a wash buffe and blocking with assay diluent for 1 hour at room temperature. Wash the plates four times, add standard samples and serum samples diluted 1:500 (total IgE) and 1:2 (ovalbumin-specific IgE) and react at room temperature for 2 hours, then wash four times and apply detection antibody. It was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 4 times and adding avidin-HRP and reacting at room temperature for 30 minutes, washing 5 times and adding TMB substrate solution, blocking light for 20 minutes and reacting at room temperature. The color reaction was stopped by adding a stop solution to each well, and the absorbance was measured at 450 nm using an ELISA read. The results are shown in Figure 10.
  • Figure 10 is a graph showing the effect of reducing total IgE and ovalbumin-specific IgE in the serum of a group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain in an ovalbumin-induced rhinitis animal model.
  • the total IgE concentration in the serum of the control group (OVA) increased sharply compared to the normal group, but the total IgE in the serum was about 33.5% in the experimental group (OVA+GBCC_F0154) administered with the L. plantarum GBCC_F0154 strain.
  • the effect of reducing concentration was confirmed.
  • the effect of reducing ovalbumin-specific IgE in serum by about 20.5% was confirmed in the experimental group administered L. plantarum GBCC_F0154 strain.
  • the above results mean that the L. plantarum GBCC_F0154 strain can be usefully used to prevent, improve, or treat atopic dermatitis or allergic diseases.

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Abstract

신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물 및 이들의 항알러지 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 신규 균주 및 이의 유래 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물에 의하면, 알러지 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

락티플란티바실러스 속 균주, 그의 유래의 배양액 및 그의 항알러지 용도
신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물 및 이들의 항알러지 용도에 관한 것이다.
알러지(Allergy)는 면역시스템의 오작동으로 보통 사람에게는 별 영향이 없는 물질이 특정 사람에게만 두드러기, 가려움, 콧물, 기침 등의 과민반응을 유발하는 질환으로서, 환경오염, 식생활과 생활습관의 서구화 및 스트레스와 같은 환경인자, 유전 및 다양한 알레르겐(allergen)에 의해 유발될 수 있다. 알러지 질환은 전 세계적으로 유병률이 증가하고 있는 추세이며, 전 국민의 20~25%가 비염, 천식, 아토피피부염 및 식품알러지 등으로 고통받고 있다.
알러지(Allergy)는 IgE 항체가 반응의 원인인 IgE 매개 알러지 반응뿐만 아니라, IgE 항체 외의 다른 면역 체계 구성 요소로 인해 발생하는 non-IgE 매개 반응도 존재한다. Non-IgE 매개 알러지 질환의 메커니즘은 잘 알려져 있지 않으나, 선천성 면역, 세포성 면역(T-림프구 과정)이 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 비만세포는 IgE 매개 알러지 반응 및 non-IgE 매개 알러지 반응에서 모두 역할을 수행하며, 염증과 면역 조절에서 중요한 기능을 한다. 상기 비만세포가 활성화되면 비만세포의 탈과립이 유도되어 과립 내 존재하던 히스타민, 사이토카인 및 케모카인 등의 화학적 매개물질이 세포 밖으로 분비된다. 비만 세포 과립 내 존재하던 화학적 매개물질은 혈관투과성 항진, 평활근 수축, 점액분비 항진을 유도하여 알러지 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 비만세포는 high-affinity IgE receptor(FcεRI)에 의해 다양한 사이토카인을 생성하며, 이로 인해 염증반응 유도인자들의 발현을 촉진시켜 염증성 알러지 반응을 유발한다. 비만세포가 생성한 사이토카인 중 IL-4는 IgE의 생성을 유도하고, IgE 매개 면역반응을 조절하며, 실제 알러지 환자에서도 IL-4의 생성이 증가되는 것이 보고되었다(Ngoc 등, 2005).
알러지 질환을 치료하기 위하여, 알레르겐 회피, 항알러지 약물 투여, 체내 IgE 합성 조절, 항 IgE 항체 개발 등 다양한 방법이 제안되었다. 그러나 대부분의 방법이 알러지 질환의 근본 원인을 치료할 수 없거나, 약의 효능이 불충분하거나 심각한 부작용이 발생하는 등 많은 단점을 가지고 있다.
상기한 알러지 발생 기전에서 알 수 있듯이, 항알러지 활성이 있다고 하기 위해서는 단순히 IgE 매개 알러지 치료 활성 뿐만 아니라, non-IgE 매개 알러지에 대한 치료 활성도 있어야 한다.
최근 장내 세균의 균총을 규명하는 메타게놈 프로젝트 진행결과 장내 균총의 분포와 알러지를 포함하는 다양한 면역계 질환과의 상관관계가 밝혀지고 있다. 현재 장내 세균의 분포, 다양성 및 장 면역과 면역계의 밀접 연관성이 규명되고 있다. 또한 장내 미생물은 숙주가 지닌 효소만으로는 생성할 수 없는 영양분을 공급하고 숙주의 대사 및 면역 체계와 깊은 연관을 지니는 한편 과민성대장증후군, 비만, 아토피, 우울증, 류마티스 관절염, 자폐 스펙트럼 장애, 치매 등 다양한 질병의 발생과 관련되어 있다고 보고되고 있다.
본 발명자는 상기 장내 세균의 균총을 규명하는 결과를 이용하여 IgE 매개 알러지 치료 활성 뿐만 아니라 non-IgE 매개 알러지에 대한 치료 활성을 가지는 항알러지 활성물질을 발굴하여알러지 치료제 개발에 이바지하였다.
일 양상은 락티플란티바실러스 속(Lactiplantibacillus sp.)에 속하는 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주를 유효성분으로 포함하는 Th2(Helper T Cells Type 2) 사이토카인의 생성을 억제하거나 알러지 반응을 완화하는 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 수탁번호 KCTC 15152BP로 기탁된, 락티플란티바실러스 속(Lactiplantibacillus sp.)에 속하는 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) GBCC_F0154 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 알러지 질환의 예방 또는 개선을 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 락티플란티바실러스 속(Lactiplantibacillus sp.)에 속하는 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주를 유효성분으로 포함하는 Th2(Helper T Cells Type 2) 매개 사이토카인의 생성을 억제하거나 알러지 반응을 완화하는 조성물을 제공한다.
일 양상은 락티플란티바실러스 속(Lactiplantibacillus sp.)에 속하는 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주를 제공한다.
락티플란티바실러스(Lactiplantibacillus)는 자연계에 널리 분포하는 호기성 또는 통성 혐기성의 그람 양성 간균 속 미생물이다. 락티플란티바실러스 속에 속하는 미생물에는 락티플란티바실러스 플란타룸, 퍼멘텀 등이 있다. 본 발명자들은 항알러지 효과가 우수한 새로운 균주를 개발하기 위해 연구한 결과, 항알러지 후보 균주로서 Lactiplantibacillus plantarum GBCC_F0154를 선별하였다. 상기 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2022년 10월 24일자로 수탁번호 KCTC 15152BP로 기탁되었다. 상기 균주는 프로바이오틱 균주에 해당하며, 인체에 무해하며, 부작용 없이 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 락티플란티바실러스 플란타룸 균주는 수탁번호 KCTC 15152BP로 기탁된 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 락티플란티바실러스 플란타룸 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 유전자를 포함하는 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 16S rRNA 또는 이와 뉴클레오타이드 서열 상동성이 97%이상인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 16S rRNA를 가지는 균주일 수 있다. 구체적으로, 본 명세서의 서열번호 1로 이루어진 뉴클레오티드 서열과 적어도 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 상동성을 가진다.
일 구체예에 있어서, 상기 락티플란티바실러스 플란타룸 균주는 서열번호 2의 recA 유전자 서열을 포함하는 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 2의 recA 유전자 서열 또는 이와 유전자 서열 상동성이 97%이상인 유전자 서열을 포함하는 recA를 가지는 균주일 수 있다. 구체적으로, 본 명세서의 서열번호 2로 이루어진 유전자 서열과 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 상동성을 가진다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 자연적으로 일어난 균주의 돌연변이인 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 생균, 사균, 약화된 균주(attenuated bacteria) 또는 균주를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물(cytoplasmic fraction)일 수 있으며, 바람직하게는 생균일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 항알러지 활성을 갖는 것일 수 있다.
구체적으로 설명하면, 특정 이론에 제한됨 없이, 알러지 유발 기전은 1단계 기전 과 2단계 기전으로 나눌 수 있다.
상기 1단계는 최초로 외부의 알레르겐이 상피 세포(Epithelial Cells)를 통하여 체내에 침투하게 되고, 이렇게 침투한 알레르겐은 항원제시세포(Antigen Presenting Cells)에 의해서 포식되어 그 일부의 파편을 T세포에게 제시하게 될 수 있다. 이때, 항원을 제시 받은 T세포는 Th2세포(Helper T Cells Type 2)로 분화되어, IL(Interleukin)-4 등과 같은 Th2-매개 사이토카인(Cytokine)을 생성할 수 있다. 상기 생성된 사이토카인들은 B세포를 활성화시켜, B세포로부터 IgE(Immunoglobulin E)의 생산을 유도할 수 있다. 이 때, 생산된 IgE 항체들은 비만세포의 표면에 존재하는 FcεRI 수용체와 결합하게 되는데, 이러한 상태를 아토피 상태라 말하며, 알레르기 유발 준비(대기) 상태라고 말할 수 있다.
상기 2단계는 상기 1단계에서 침투하여 면역세포로부터 기억되었던 알레르겐이 재침투하여 비만세포상에 결합되어 있는 IgE와 교차 결합함으로써 비만세포의 탈과립(Degranulation) 과정을 유도하고, 이로 인해 비만세포의 내부에 존재하던 히스타민이나, 류코트리엔(Leukotrien), 트립타아제(Tryptase) 등의 알레르기성 염증인자들이 외부로 배출되는 단계일 수 있다. 히스타민을 대표적으로 포함하는 이러한 물질들은 각종 알레르기성 염증 질환들을 일으키는 직접적인 원인이 될 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 현재는 치료제나 알레르기 개선 소재의 작용 기전은 알레르기의 최종 단계인 비만세포의 히스타민 방출 및 히스타민의 역할을 막는데 집중되어 있을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 Th2 사이토카인 생성 억제, 비만세포의 탈과립 활성 억제, 혈청 내 IgE 수준 억제, 또는 혈청 내 MCPT-1 수준 억제 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 비만세포의 탈과립 활성 억제는 활성 비만세포(mast cell)에서 β-헥소사미니다제의 분비를 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 혈청 내 IgE의 농도를 감소시키거나 IgE의 비만세포의 표면 수용체에 결합을 감소시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 혈청 내 MCPT-1의 수준을 억제시키는 것일 수 있다.
따라서, 일 구체예에 따른 균주는 알러지 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주 유래의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "배양물 상등액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 락티플란티바실러스 속 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 상기 배양물은 프로바이오틱스 균주를 공지의 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하며, 상기 산물은 균주 자체가 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, GAM 액체 배지, MRS 한천 배지, GAM 한천 배지, BL 한천 배지일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액으로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상등액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파쇄물(lysate)"은 "용해물"과 호환적으로 사용될 수 있고, 이는 깨진 락티플란티바실러스 플란타룸과 같은 미생물 세포의 수성 배지 용액 또는 현탁액을 의미한다. 세포 용해물은, 예를 들어 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질 등과 같은 거대 분자 및/또는 아미노산, 당, 지방산 등과 같은 미소분자, 또는 그의 분획을 포함한다. 또한, 상기 용해물은 매끈하거나 과립 구조일 수 있는 세포 잔해를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배양액은 락티플란티바실러스 플란타룸을 적절한 배지(예를 들면, MRS 평판 배지)에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정시간, 예를 들면 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 락티플란티바실러스 플란타룸을 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주 유래의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 보존제, 염료, 유화제, 감미료, 안정화제, 향미 증진제, 향미제 및 산미제로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가제를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 용액, 유탁액, 점성형 혼합물, 분말, 과립, 정제 및 캡슐로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 항알러지 활성을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항알러지 활성은 Th2 사이토카인 생성 억제, 비만세포의 탈과립 활성 억제, 혈청 내 IgE 수준 억제, 또는 혈청 내 MCPT-1 수준 억제 활성, 식품 알레르기 억제 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 비만세포의 탈과립 활성 억제는 활성 비만세포(mast cell)에서 β-헥소사미니다제의 분비를 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Th2 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 혈청 내 IgE의 농도를 감소시키거나 IgE의 비만세포의 표면 수용체에 결합을 감소시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 혈청 내 MCPT-1의 수준을 억제시키는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 항알러지 활성은 락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154 균주 상등액을 비만세포 RBL-2H3에 처리하였을 때, 비만세포 탈과립을 60% 내지 90% 억제하는 활성을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 항알러지 활성은 락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154 균주 상등액을 MC903 유도 아토피 피부염 동물모델에 처리하였을 때, 귀 부종의 30% 내지 60% 억제하는 활성을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 항알러지 활성은 락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154 균주를 MC903 유도 아토피 피부염 동물모델에 처리하였을 때, 혈청 내 총 IgE의 농도가 40% 내지 60% 감소하는 활성 또는 혈청 내 MCPT-1의 농도가 40% 내지 60% 감소하는 활성을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 항알러지 활성은 락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154 균주를 식품 알레르기 동물모델에 처리하였을 때, 혈청 내 총 IgE의 농도가 20% 내지 30% 감소하는 활성 또는 혈청 내 MCPT-1의 농도가 15% 내지 30% 감소하는 활성 또는 혈청 내 MCPT-1의 농도가 40% 내지 60% 감소하는 활성을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 항알러지 활성은 락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154 균주를 난알부민 유도 천식 동물모델에 처리하였을 때, 혈청 내 난알부민 특이 IgE의 농도가 20% 내지 30% 감소하는 활성 또는 혈청 내 Th2 사이토카인의 농도가 50% 내지 60% 감소하는 활성을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 항알러지 활성은 락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154 균주를 난알부민 유도 비염 동물모델에 처리하였을 때, 혈청 내 Th2 사이토카인의 농도가 40% 내지 60% 감소하는 활성 또는 혈청 내 총 IgE 및 난알부민 특이 IgE의 농도가 20% 내지 30% 감소하는 활성을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 질병 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 용도는 IgE(Immunoglobulin E)에 의해 매개되는 또는 IgE에 의해 매개되지 않는 질환 또는 병태의 예방, 개선, 또는 치료를 포함할 수 있다. 구체적으로, IgE(Immunoglobulin E)에 의해 매개되는 또는 IgE에 의해 매개되지 않는 질환은 알러지성 질환인 것일 수 있다.
본 명세서에서 "알러지 질환"이란 외부 항원에 대한 신체 내 면역 반응이 과도하게 나타나는 알러지(allergy)반응에 의해 발병하는 질환을 의미하는 것으로서, 구체적으로 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기(urticaria), 만성 자발성 두드러기(chronic spontaneous urticaria), 담마진, 소양증, 아나필락틱 쇼크, 곤충 알러지, 식품 알러지, 약품 알러지 및 호흡기 알러지로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 알러지 질환의 발생과정은 크게 초기반응과 후기 반응으로 구분된다. 초기반응은 항원의 자극에 의해 항체(IgE)가 생산된 후 항체가 비만세포(mast cell) 표면의 high affinity receptor(FcεRI)에 결합하였을 때 항원이 재침입하면 FcεRI 와 결합하고 있는 항체(IgE)와 결합하여 비만세포 내로 신호를 빠르게 전달하여 알러지를 일으키는 화학 적 매개물질(inflammatory chemical mediator ; cytokine, histamine, leukotrienes)을 분비하게 된다.
후기 반응은 Th2-type 2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-10, IL-13)이 tissue fibroblast 또는 epithelial cell들의 키모카인(chemokine ; monocyte chemoattractant protein-1, eotaxin-1, RANTES) 생산을 유도하여, 그 결과 염증성 세포(inflammatory cell) 특히 호산구(eosinphile)가 알레르기 반응부위로 이동하는 것이다. 그 결과 알레르기 증상의 대부분은 비만세포나 호산구가 분비하는 histamine 등의 염증반응 매개물질에 의해 기도, 피부 등의 상피세포 주변의 모세혈관의 확장, 면역 세포의 유입, 근육의 수축과 점액 분비물의 증가에 따른 가려움증, 부종, 충혈, 기침, 가래 등의 임상적 증상으로 나타난다.
특히, Th2-type 2 사이토카인 중 IL-4는 T 세포 및 mast cell에서 생성되며, B 세포의 클래스 전환을 조절하고 IgE의 생성을 촉진하는 등의 역할을 하여, IL-5는 호산구(eosinphile) 생성, 활성화 및 생존에 영향을 미치고, 호산구(eosinphile)는 IgE에 의하여 활성화 된다. 따라서 IL-4, IL-5 및 호산구(eosinphile)의 활성은 IgE 증가와 관련이 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알러지 질환은 집먼지, 균류, 진드기, 또는 동물의 털, 피부 또는 배설물로 기인하는 알러지 반응을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알러지 질환은 IgE(Immunoglobulin E)에 의해 매개 또는 IgE에 의해 매개되지 않는 질환 또는 병태, 또는 알러지성 질환과 관련된 상태일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료 (treat)"는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 염증 또는 박테리아 감염증 등이 치유되는 것을 의미할 수 있다. 상기 치료는 염증 또는 박테리아 감염증의 개선 및/또는 완화를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 염증 또는 박테리아 감염증으로부터 유발되는 증상의 치유 및/또는 회복을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%의 락티플란티바실러스 플란타룸 균주를 포함할 수 있다. 또한, 락티플란티바실러스 플란타룸 균주의 투여 용량은 0.01mg 내지10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다. 상기 균주는 치료적 유효량 또는 영양적으로 유효한 농도로 조성물에 포함되는데, 예를 들면, 상기 균주가 103 내지 1016 CFU/g, 103 내지 1015 CFU/g, 103 내지 1014 CFU/g, 103 내지 1013 CFU/g, 103 내지 1012 CFU/g, 104 내지 1016 CFU/g, 104 내지 1015 CFU/g, 104 내지 1014 CFU/g, 104 내지 1013 CFU/g, 104 내지 1012 CFU/g, 105 내지 1016 CFU/g, 105 내지 1015 CFU/g, 105 내지 1014 CFU/g, 105 내지 1013 CFU/g, 105 내지 1012 CFU/g, 106내지 1013 CFU/g, 106 내지 1012 CFU/g, 107 내지 1013 CFU/g, 107 내지 1012 CFU/g, 108 내지 1013 CFU/g 또는 108 내지 1012 CFU/g 의 함량으로 포함되거나, 동등한 수의 생균 또는 사균의 배양물로 조성물에 포함될 수 있다. 구체적으로 성인 환자의 경우 1X103 내지 1X1016 CFU/g의 생균 또는 사균이 한 번 또는 여러 번에 걸쳐서 나누어 투여될 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 한달에 1회, 2주에 1회, 1주에 1회, 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회 투여될 수 있고, 구체적으로 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg(체중)당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 피하, 피내, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 정맥내, 관절내, 활액낭내, 흉골내 또는 병소내), 직장, 국소 (경피 포함), 흡입, 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다. 일 실시예에 따르면 상기 조성물은 사멸화 건조 균주를 포함하며, 1회 1g 내지 10g, 0.5g 내지1.5g, 2.5g 내지 3.5g, 또는 4.5g 내지 5.5g 투여 가능하고, 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.
상기 "균주", "항알러지 활성", 및 "알러지 질환"은 상기한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 항알러지 활성을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항알러지 활성은 Th2 사이토카인 생성 억제, 비만세포의 탈과립 활성 억제, 혈청 내 IgE 수준 억제, 또는 혈청 내 MCPT-1 수준 억제 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 비만세포의 탈과립 활성 억제는 활성 비만세포(mast cell)에서 β-헥소사미니다제의 분비를 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Th2 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 건강기능식품은 혈청 내 IgE의 농도를 감소시키거나 IgE의 비만세포의 표면 수용체에 결합을 감소시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 혈청 내 MCPT-1의 수준을 억제시키는 것일 수 있다. 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 건강기능식품은 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알러지 질환의 개선은 면역 과민반응의 완화 또는 면역 과민반응에 의한 피부상태 개선을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알러지 질환의 개선은 비만세포의 탈과립 활성 억제, 또는 혈청 내 IgE 또는 MCPT-1의 수준을 억제하는 것을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알러지 질환은 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기(urticaria), 만성 자발성 두드러기(chronic spontaneous urticaria), 담마진, 소양증, 아나필락틱 쇼크, 곤충 알러지, 식품 알러지, 약품 알러지 및 호흡기 알러지로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알러지 질환은 집먼지, 균류, 진드기, 또는 동물의 털, 피부 또는 배설물로 기인하는 알러지 반응을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 식품 조성물은 알러지 질환의 예방 또는 개선을 위한 것일 수 있다.
상기 식품 조성물에 있어서, 상기 식품은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 씨리얼, 베이킹 제품, 유제품, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 분유, 영아용 조제분유, 우유, 우유 분말, 요구르트, 치즈, 발효유, 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 식품 첨가물, 건강 기능(성) 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 출원의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 출원의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 출원의 GBCC_F0154는 알러지의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 알 예에 따른 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
일 예에 따른 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 알러지 질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 출원의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 출원의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 출원의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
일 예에 따른 식품 조성물은 알러지 질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 예를 들면, 일 예에 따른 GBCC_F0154 를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량%, 0.01 내지 80중량%, 또는 5 내지 50 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 증상완화)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 고분자 다당 바인더에 컨쥬게이트된 열사 락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154를 108 CFU/g 내지 1010 CFU/g 농도로 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일주스, 과일주스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 "균주", "항알러지 활성", 및 "알러지 질환"은 상기한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항알러지 활성이 있는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항알러지 활성은 Th2 사이토카인 생성 억제, 비만세포의 탈과립 활성 억제, 혈청 내 IgE 수준 억제, 또는 혈청 내 MCPT-1 수준 억제 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 비만세포의 탈과립 활성 억제는 활성 비만세포(mast cell)에서 β-헥소사미니다제의 분비를 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Th2 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 혈청 내 IgE의 농도를 감소시키거나 IgE의 비만세포의 표면 수용체에 결합을 감소시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 혈청내 MCPT-1의 수준을 억제시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알러지 질환은 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기(urticaria), 만성 자발성 두드러기(chronic spontaneous urticaria), 담마진, 소양증, 아나필락틱 쇼크, 곤충 알러지, 식품 알러지, 약품 알러지 및 호흡기 알러지로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알러지 질환은 집먼지, 균류, 진드기, 또는 동물의 털, 피부 또는 배설물로 기인하는 알러지 반응을 포함하는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 구체적으로 경구, 직장, 정맥, 혈관 내, 종양 내, 피하, 피내, 또는 복강 내 전달을 위해 제형화될 수 있다. 더욱 구체적으로 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있고, 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.
또 다른 양상은 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환의 예방 또는 개선을 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 "균주", "항알러지 활성", 및 "알러지 질환"은 상기한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항알러지 활성이 있는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 개체의 상태는 IgE(Immunoglobulin E)에 의해 매개되는 또는 IgE에 의해 매개되지 않는 질환 또는 병태, 또는 알러지성 질환과 관련된 상태일 수 있다.
본 명세서의 용어, "투여"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 조성물을 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 의미한다. 상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 염증과 관련된 상태, 또는 박테리아 감염과 관련된 상태의 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.00001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.00001 mg 내지500 mg, 0.00001 mg 내지 100 mg, 0.00001 mg 내지 50 mg, 0.00001 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 신규 균주 및 이의 유래 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물에 의하면, 알러지 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 RBL-2H3 비만세포에 대한 GBCC_F0154 배양 상등액의 탈과립 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 MC903 유도 아토피 피부염 마우스모델에서 GBCC_F0154의 귀 부종 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 MC903 유도 아토피 피부염 마우스모델에서 GBCC_F0154의 혈청 내 총 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 MC903 유도 아토피 피부염 마우스모델에서 GBCC_F0154의 혈청 내 MCPT-1 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 식품 알레르기 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 총 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 식품 알레르기 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 총 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 식품 알레르기 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 MCPT-1 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 난알부민 유도 천식 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 난알부민 특이 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 난알부민 유도 천식 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 Th2 사이토카인 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 난알부민 유도 비염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 코 점막 내 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 난알부민 유도 비염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 총 IgE 및 난알부민 특이 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 실시예들은 다양한 변환을 가할 수 있는 바, 실시예들은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
실시예 1. 락티플란티바실러스 플란타룸( Lactiplantibacillus plantarum ) 균주의 분리 및 동정
1.1. 균주의 분리
본 발명의 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주는 가정집에서 담근 독일식 김치인 양배추 절임(사우어크라우트, sauerkraut)으로부터 분리되었다. 담근 후, 13일이 지난 양배추 절임을 PBS 버퍼에 1/10씩 연속희석 방법을 통하여 유산균 배양 배지인 MRS (deMan, Rogosa, Sharpe) 평판 배지에 도말하였다. 3일간 37℃혐기 챔버 내에서 배양한 후, 박테리아의 집락을 관찰하였으며, 이로부터 순수분리를 위해 단일 집락을 새로운 MRS 평판배지에 계대배양을 하였다. 순수 분리된 균주의 동정은 16S rRNA 유전자의 PCR 및 Sanger 시퀀싱 방법을 통해 확인하였다. 균주의 장기 보관을 위하여 지수기 말기에 도달한 균체에 30% 글리세롤을 1:1 비율로 첨가한 후 -70℃초저온 냉동고에 보관하였다. 순수 분리 및 동정 이후의 배양도 MRS 평판배지 및 액체배지에서 수행하였다. MRS 고체 배지에서 48시간동안 배양하였을 때, 1 내지 3mm 크기의 표면이 매끈하고 둥근 모양의 흰색 콜로니를 형성하였다.
상기 방법을 통해 락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154(이하 'GBCC_F0154'라고도 함) 균주를 최종 선별하였다.
1.2. 선별한 균주의 분자생물학적 동정
락티플란티바실러스 플란타룸 GBCC_F0154 균주의 동정은 16S rRNA 유전자 및 recA 유전자 서열 유사성을 기반으로 진행하였다. 박테리아 배양체로부터 FastDNA® SPIN Kit for soil (MP Bio, 6560200)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 표 1에 표기된 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하였다.
유전자 프라이머 서열 (5'-> 3')
16S rRNA 27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG(서열번호 3)
1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT(서열번호 4)
recA L. p_recA_F CTGATGCACGGAAAGCAGC(서열번호 5)
L. p_recA_R CGCTTAAATGGYGGYGCMACC(서열번호 6)
박테리아의 16S rRNA 유전자를 PCR 증폭하기 위한 27F와 1492R 프라이머를 이용하여 생산된 서열은 서열번호 1으로 나타내었다. GBCC_F0154는 16S rRNA 유전자 서열로는 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum)의 표준 균주와 100% 일치하나, 16S rRNA 유전자를 이용한 박테리아 종 구분을 위해 일반적으로 적용되는 기준값인 98.5% 이상의 유사도를 보이는 종이 3종이 더 확인되었다(표 2).
종 (Species) 표준 균주명 서열 유사도 (%)
Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917(T) 100
Lactiplantibacillus pentosus DSM 20314(T) 99.93
Lactiplantibacillus paraplantarum DSM 10667(T) 99.721
Lactiplantibacillus herbarum TCF032-E4(T) 98.885
락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum)의 균주명이 변경되기 전 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 명명되었는 바, 이와 더불어, 16S rRNA 유전자 외에 박테리아의 taxonomic biomarker로 널리 쓰이는 recA 유전자의 서열 유사성을 기반으로 좀 더 정확한 동정을 수행하였다. 그 결과, GBCC_F0154는 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum)에 해당하는 균주임을 확인하였다(표 3).
종 (Species) 표준 균주명 서열 유사도 (%)
Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917(T) 99.44
Lactiplantibacillus argentoratensis DSM 16365(T) 93.59
Lactiplantibacillus paraplantarum DSM 10667(T) 87.47
Lactiplantibacillus pentosus DSM 20314(T) 86.07
GBCC_F0154의 recA 유전자 서열은 서열번호 2로 나타내었다.
이에, 발명자들은 GBCC_F0154 균주를 "락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) GBCC_F0154" (기탁번호: KCTC 15152BP)로 명명하고 이를 한국생명공학 연구원 소재 생물자원센터 (Korean collection for type cultures, KCTC)에 2022년 10월 24일자에 기탁하였다.
실험예 1. RBL-2H3 비만세포에 대한 L. plantarum GBCC_F0154 배양 상등액의 탈과립 억제 효과
알러지 반응을 유발하는 활성화된 비만세포로부터 L. plantarum GBCC_F0154 균주를 포함한 다양한 L. plantarum 균주의 배양 상등액을 각각 처리하고, 탈과립에 대한 억제 효과를 β-헥소사미니다제의 분비 측정을 통해 스크리닝하였다.
24-well 플레이트에 RBL-2H3 세포를 15% FBS와 MEM 배지에 현탁시킨 후 well당 1.5 x 105 세포를 분주하여, 20 ng/mL DNP-IgE와 같이 약 12시간 동안 배양하며 감작시켰다. 세포를 PIPES 완충액(25 mM PIPES, 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 5.6 mM glucose, 0.1% BSA)으로 1회 세척 후, 다양한 L. plantarum 균주의 배양 상등액을 1:15로 PIPES 완충액에 희석시켜 각 well에 2시간 전처리를 하였다. 배양 상등액은 MRS 배지에 L. plantarum 균주를 배양한 후, 원심분리로 균주를 침전시켜 상등액만 취한 뒤 0.22 μm 필터로 여과하여 상등액을 얻었다. 이후 25 ng/mL DNP-HSA (항원)를 첨가하여 15분 동안 자극시킨 후, 5분간 얼음에서 냉각시켜 반응을 정지시켰다. 상층액을 e-tube에 옮기고, PIPES 완충액으로 1회 세척 후 플레이트에 남아있는 세포는 0.1% triton X-100으로 파쇄시켰다. 상층액과 용해된 세포시료는 96-well 플레이트에 기질 완충액(1 mM 4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, 0.1 M sodium citrate)과 각각 30 μL씩 섞은 다음 37℃에서 1시간 반응시켰다. 0.1 M carbonate 완충액을 넣어 반응을 종결시킨 후, microplate reader를 이용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 도 1에 나타내었다.
도 1은 RBL-2H3 비만세포에 대한 GBCC_F0154 배양 상등액의 탈과립 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 26종의 상이한 L. plantarum 균주의 배양 상등액을 스크리닝한 결과, L. plantarum GBCC_F0154 균주의 배양 상등액이 비만세포 탈과립을 약 77.2% 억제하는 효과를 나타내어 알러지 반응 억제에 가장 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 2. MC903 유도 아토피 피부염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 귀 부종 억제 효과
MC903 유도 아토피 피부염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주의 귀 부종 억제 효과를 확인하였다.
6주령의 BALB/c 마우스를 입수하여 1주일 순화 기간을 거쳐, 동결 건조된 L. plantarum GBCC_F0154 균주를 D-PBS에 현탁시켜 아토피 피부염을 유발하기 7일 전부터 시험 종료 직전까지 마우스 한 마리 당 2 x 109 CFU로 매일 경구투여 하였다. 아토피 피부염을 유발하기 위해 마우스를 보정한 후, 질환 유도군은 양쪽 귀에 에탄올에 용해한 2 nmol MC903 (Calcipotriol, C27H40O3)을 각각 20μL씩 12일 동안 매일 도포하였고, 정상군은 에탄올만 도포하였다. 아토피 피부염 유발에 의한 귀 부종 정도를 확인하기 위해 마우스 귀의 두께를 매일 같은 시간에 측정하였고, 도 2에 나타내었다. 이때, 귀 부종의 변화는 질환 유도 후 매일 측정하는 귀의 두께에서 질환 유도 전에 측정한 귀의 두께를 뺀 값을 사용하였다.
도 2는 MC903 유도 아토피 피부염 마우스모델에서 GBCC_F0154의 귀 부종 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도2에 나타낸 바와 같이, MC903으로 유도된 아토피 피부염 모델에서 대조군(MC903)과 대비하여 L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(MC903+GBCC_F0154)에서 약 43.9%의 귀 부종 억제 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 3. MC903 유도 아토피 피부염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 총 IgE 감소 효과
IgE의 과발현은 아토피 피부염의 가장 대표적인 표식으로, 상기 실험예 2에서의 MC903 유도 아토피 피부염 동물모델로부터 혈청 내 총 IgE 농도를 확인하고자 Mouse IgE ELISA Kit (Biolegend #432404)를 이용하여 측정하였다.
Microwell plates에 coating buffer에 희석한 capture 항체로 4℃에서 overnight한 후, wash buffer로 4회 세척하고 assay diluent로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. 4회 세척하고 표준시료 및 1:1000으로 희석한 혈청샘플을 추가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 4회 세척하고 detection 항체를 추가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 4회 세척하고 avidin-HRP를 추가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 5회 세척하고 TMB 기질 용액을 추가하여 20분 동안 차광하고 실온에서 반응시켰다. 각 well에 반응종결용액(stop solution)을 추가하여 발색반응을 정지시키고, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 도 3에 나타내었다.
도 3은 MC903 유도 아토피 피부염 마우스모델에서 GBCC_F0154의 혈청 내 총 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군(MC903)은 정상군에 비하여 혈청 내 총 IgE 농도가 급격하게 증가하였으나, L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(MC903+GBCC_F0154)에서 약 51.3%의 혈청 내 총 IgE 농도 감소 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 4. MC903 유도 아토피 피부염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 MCPT-1 감소 효과
상기 실험예 2에서의 MC903 유도 아토피 피부염 동물모델로부터 혈청 내 비만 세포 프로테아제-1 (Mast cell protease-1, MCPT-1) 농도를 확인하고자 Mouse MCPT-1 (mMCP-1) ELISA Kit (Invitrogen #88-7503)를 이용하여 측정하였다.
Microwell plates에 coating buffer로 희석한 capture 항체를 4℃에서 overnight한 후, wash buffer로 3회 세척하고 ELISA/ELISPOT diluent로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. 3회 세척하고 표준시료 및 1:100으로 희석한 혈청샘플을 추가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 3회 세척하고 detection 항체를 추가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 3회 세척하고 avidin-HRP를 추가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 5회 세척하고 TMB 기질 용액을 추가하여 15분 동안 차광하고 실온에서 반응시켰다. 각 well에 반응종결용액(stop solution)을 추가하여 발색반응을 정지시키고, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 도 4에 나타내었다.
도 4는 MC903 유도 아토피 피부염 마우스모델에서 GBCC_F0154의 혈청 내 MCPT-1 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군(MC903)은 정상군에 비하여 혈청 내 MCPT-1 농도가 급격하게 증가하였으나, L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(MC903+GBCC_F0154)에서 약 41.0%의 혈청 내 MCPT-1 농도 감소 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 5. 식품 알레르기 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 총 IgE 감소 효과
난알부민(ovalbumin, OVA)에 의한 식품 알레르기(food allergy) 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주의 알레르기 증상 개선 효과를 확인하였다.
5주령의 BALB/c 마우스를 입수하여 1주일 순화 기간을 거쳐, 식품 알레르기 반응을 유발하기 위해 50 ㎍의 OVA와 1 ㎎의 alum hydroxide를 혼합하여 2주 간격으로 총 2회 복강 주사하여 감작시켰다. 마지막 감작일로부터 2주 후, 50 mg의 난알부민을 2일 간격으로 5회 경구 투여함으로써 알레르기 반응이 일어나도록 유도하였다. 또한, 알레르기 치료 효과를 확인하기 위해 동결 건조된 L. plantarum GBCC_F0154 균주를 D-PBS에 현탁시켜, 난알부민을 감작한 시점부터 시험 종료 직전까지 마우스 한 마리 당 2 x 109 CFU로 매일 경구투여 하였다. 난알부민 유도 식품 알레르기 동물모델로부터 혈청 내 총 IgE 농도를 확인하고자 Mouse IgE ELISA Kit (Biolegend #432404)를 이용하여 측정하였다.
Microwell plates에 coating buffer로 희석한 capture 항체를 4℃에서 overnight한 후, wash buffer로 4회 세척하고 assay diluent로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. 4회 세척하고 표준시료 및 1:1000으로 희석한 혈청샘플을 추가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 4회 세척하고 detection 항체를 추가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 4회 세척하고 avidin-HRP를 추가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 5회 세척하고 TMB 기질 용액을 추가하여 20분 동안 차광하고 실온에서 반응시켰다. 각 well에 stop 용액을 추가하여 발색반응을 정지시키고, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 식품 알레르기 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 총 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 대조군(OVA)은 정상군에 비하여 혈청 내 총 IgE 농도가 급격하게 증가하였으나, L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(OVA+GBCC_F0154)에서 약 20.0%의 혈청 내 총 IgE 농도 감소 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 6. 식품 알레르기 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 MCPT-1 감소 효과
난알부민 유도 식품 알레르기 동물모델로부터 혈청 내 비만 세포 프로테아제-1 (Mast cell protease-1, MCPT-1) 농도를 확인하고자 Mouse MCPT-1 (mMCP-1) ELISA Kit (Invitrogen #88-7503)를 이용하여 측정하였다.
Microwell plates에 coating buffer로 희석한 capture 항체를 4℃에서 overnight한 후, wash buffer로 3회 세척하고 ELISA/ELISPOT diluent로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. 3회 세척하고 표준시료 및 1:100으로 희석한 혈청샘플을 추가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 3회 세척하고 detection 항체를 추가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 3회 세척하고 avidin-HRP를 추가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 5회 세척하고 TMB 기질 용액을 추가하여 15분 동안 차광하고 실온에서 반응시켰다. 각 well에 stop 용액을 추가하여 발색반응을 정지시키고, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 식품 알레르기 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 MCPT-1 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 대조군(OVA)은 정상군에 비하여 혈청 내 MCPT-1 농도가 급격하게 증가하였으나, L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(OVA+GBCC_F0154)에서 약 41.9%의 혈청 내 MCPT-1 농도 감소 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 7. 난알부민 유도 천식 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 난알부민 특이 IgE 감소 효과
난알부민 유도 천식 동물모델로부터 혈청 내 난알부민(OVA) 특이 IgE 농도를 확인하고자 Mouse OVA specific IgE ELISA Kit (Biolegend #439807)를 이용하여 측정하였다.
5주령의 BALB/c 마우스를 입수하여 1주일 순화 기간을 거쳐, 천식 마우스 모델을 제작하기 위해 50 ㎍의 OVA와 1 ㎎의 alum hydroxide를 혼합하여 2주 간격으로 총 2회 복강 주사하여 감작시켰다. 마지막 감작일로부터 1주 후, 21일부터 25일까지 마취를 시행한 상태에서 150 ㎍의 난알부민을 비강 내로 점적하여 폐로 흡인시켜 천식을 유도하였고, 마지막 챌린지 24시간 후 혈청을 얻었다.
난알부민 특이 IgE는 난알부민이 코팅된 Plates를 4회 세척하고 표준시료 및 1:2로 희석한 혈청샘플을 추가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 4회 세척하고 detection 항체를 추가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 4회 세척하고 avidin-HRP를 추가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 5회 세척하고 TMB 기질 용액을 추가하여 20분 동안 차광하고 실온에서 반응시켰다. 각 well에 stop 용액을 추가하여 발색반응을 정지시키고, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 난알부민 유도 천식 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 난알부민 특이 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군(OVA)은 정상군에 비하여 혈청 내 난알부민 특이 IgE 농도가 급격하게 증가하였으나, L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(OVA+GBCC_F0154)에서 약 21.2%의 혈청 내 난알부민 특이 IgE 농도 감소 효과를 확인하였다.
실험예 8. 난알부민 유도 천식 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 Th2 사이토카인 억제 효과
난알부민 유도 천식 동물모델로부터 혈청 내 IL-5 농도를 확인하고자 Mouse IL-5 ELISA Kit (Biolegend #431204)를 이용하여 측정하였다.
Microwell plates에 coating buffer로 희석한 capture 항체를 4℃에서 overnight한 후, wash buffer로 4회 세척하고 assay diluent로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. 4회 세척하고 표준시료 및 1:5로 희석한 혈청샘플을 추가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 4회 세척하고 detection 항체를 추가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 4회 세척하고 avidin-HRP를 추가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 5회 세척하고 TMB 기질 용액을 추가하여 20분 동안 차광하고 실온에서 반응시켰다. 각 well에 stop 용액을 추가하여 발색반응을 정지시키고, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 난알부민 유도 천식 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 Th2 사이토카인 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 대조군(OVA)은 정상군에 비하여 혈청 내 IL-5 농도가 급격하게 증가하였으나, L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(OVA+GBCC_F0154)에서는 대조군에 대비하여 약 53.8%의 혈청 내 IL-5의 생성량이 감소한 것을 확인하였다.
실험예 9. 난알부민 유도 비염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 코 점막 내 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13) 억제 효과
본 실시예에서는 난알부민(ovalbumin, OVA)으로 비염(rhinitis)을 유도한 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주의 비염 완화 효과를 확인하였다.
5주령의 BALB/c 마우스를 입수하여 1주일 순화 기간을 거쳐, 비염 마우스 모델을 제작하기 위해 50 ㎍의 OVA와 2 ㎎의 alum hydroxide를 혼합하여 1주 간격으로 총 3회 복강 주사하여 감작시켰다. 마지막 감작일로부터 1주 후, 21일부터 26일까지 폐로 항원이 흡인되지 않도록 마취를 하지 않은 상태에서 100 ㎍의 난알부민을 비강 내로 점적하여 비염을 유도하였다. 마지막 챌린지 24시간 후 코 점막을 적출 및 파쇄하여 RNA를 isolation하고 cDNA로 합성한 후, QuantStudio 3 Real-Time PCR Instrument 장비를 이용해 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13)의 mRNA 발현량을 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 난알부민 유도 비염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 코 점막 내 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9에 나타난 바와 같이, 정상군에 비해 비염유도군의 코 점막 내 Th2 사이토카인이 현저하게 증가하였다. 대조군(OVA)과 대비하여 L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(OVA+GBCC_F0154)에서 IL-4 mRNA 발현량은 통계적으로 유의미하게 약 43.4%의 억제 효과를 나타내었고, IL-5 mRNA 발현량은 45.9%, IL-13 mRNA 발현량은 41.0%의 감소 효과를 확인하였다.
실험예 10. 난알부민 유도 비염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 총 IgE 및 난알부민 특이 IgE 감소 효과
난알부민 유도 비염 동물모델로부터 혈청 내 총 IgE 및 난알부민(OVA) 특이 IgE 농도를 확인하고자 Mouse IgE ELISA Kit (Biolegend #432404) 및 Mouse OVA specific IgE ELISA Kit (Biolegend #439807)를 이용하여 측정하였다.
혈청 내 총 IgE는 microwell plates에 coating buffe로 희석한 capture 항체를 4℃에서 overnigh한 후, wash buffe로 4회 세척하고 assay diluent로 1시간 동안 실온에서 blocking 하는 과정을 추가로 진행하였다. Plates를 4회 세척하고 표준시료 및 1:500(총 IgE), 1:2(난알부민 특이 IgE)로 희석한 혈청샘플을 추가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 4회 세척하고 detection 항체를 추가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 4회 세척하고 avidin-HRP를 추가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 5회 세척하고 TMB 기질 용액을 추가하여 20분 동안 차광하고 실온에서 반응시켰다. 각 well에 stop 용액을 추가하여 발색반응을 정지시키고, ELISA reade로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10은 난알부민 유도 비염 동물모델에서 L. plantarum GBCC_F0154 균주 투여군의 혈청 내 총 IgE 및 난알부민 특이 IgE 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10에 나타난 바와 같이, 대조군(OVA)은 정상군에 비하여 혈청 내 총 IgE 농도가 급격하게 증가하였으나, L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군(OVA+GBCC_F0154)에서 약 33.5%의 혈청 내 총 IgE 농도 감소 효과를 확인할 수 있었다. 또한 대조군과 대비하여 L. plantarum GBCC_F0154 균주를 투여한 실험군에서 약 20.5%의 혈청 내 난알부민 특이 IgE 감소 효과를 확인하였다.
이상의 결과를 통해, L. plantarum GBCC_F0154 균주는 아토피 피부염 또는 알러지 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC 15152BP
수탁일자 : 20221024
Figure PCTKR2023020198-appb-img-000001

Claims (31)

  1. 락티플란티바실러스 속(Lactiplantibacillus sp.)에 속하는 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주를 유효성분으로 포함하는 Th2(Helper T Cells Type 2) 매개 사이토카인의 생성을 억제하거나 알러지 반응을 완화하는 조성물.
  2. 수탁번호 KCTC 15152BP로 기탁된, 락티플란티바실러스 속(Lactiplantibacillus sp.)에 속하는 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) GBCC_F0154 균주.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA유전자 서열을 포함하는 것인 균주.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 균주는 서열번호 2의 recA 유전자 서열을 포함하는 것인 균주.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 균주는 자연적으로 일어난 락티플란티바실러스 플란타룸 균주의 돌연변이를 포함하는 것인 균주.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 균주는 생균, 사균, 약화된 균주(attenuated bacteria) 또는 균주를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물(cytoplasmic fraction)인 것인 균주.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 균주는 하기의 특성을 포함하는 것인 균주:
    -Th2 사이토카인 생성 억제;
    -비만세포의 탈과립 활성 억제;
    -혈청 내 IgE 수준 억제; 또는
    -혈청 내 MCPT-1 수준 억제.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 Th2 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 균주.
  9. 청구항 2의 균주 유래의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 포함하는 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 조성물은 IgE에 의해 매개되는 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 조성물은 혈청 내 IgE의 농도를 감소시키거나 IgE의 비만세포의 표면 수용체에 결합을 감소시키는 것인 조성물.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 조성물은 보존제, 염료, 유화제, 감미료, 안정화제, 향미 증진제, 향미제 및 산미제으로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가제를 더 포함하는 것인 조성물.
  13. 청구항 9에 있어서, 용액, 유탁액, 점성형 혼합물, 분말, 과립, 정제 및 캡슐로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것인 조성물.
  14. 수탁번호 KCTC 15152BP로 기탁된 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) GBCC_F0154 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환의 개선 또는 예방을 위한 건강기능식품.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 알러지 질환의 개선은 하기를 포함하는 것인 건강기능식품:
    -Th2 사이토카인 생성 억제;
    -비만세포의 탈과립 활성 억제;
    -혈청 내 IgE 수준 억제; 또는
    -혈청 내 MCPT-1 수준 억제.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 Th2 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 균주.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 알러지 질환의 개선은 면역 과민반응의 완화 또는 면역 과민반응에 의한 피부상태 개선을 포함하는 것인 건강기능식품.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 알러지 질환은 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기(urticaria), 만성 자발성 두드러기(chronic spontaneous urticaria), 담마진, 소양증, 아나필락틱 쇼크, 곤충 알러지, 식품 알러지, 약품 알러지 및 호흡기 알러지로 이루어진 군에서 선택되는 것인 건강기능식품.
  19. 청구항 14에 있어서, 상기 알러지 질환은 집먼지, 균류, 진드기, 또는 동물의 털, 피부 또는 배설물로 기인하는 알러지 반응을 포함하는 것인 건강기능식품.
  20. 수탁번호 KCTC 15152BP로 기탁된 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) GBCC_F0154 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 조성물은 비만세포의 탈과립 억제 활성을 갖는 것인 약학적 조성물.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 조성물은 혈청내 i) IgE의 발현을 억제하거나 ii) MCPT-1의 수준을 억제시키는 것인 약학적 조성물.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 알러지 질환은 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기(urticaria), 만성 자발성 두드러기(chronic spontaneous urticaria), 담마진, 소양증, 곤충 알러지, 식품 알러지, 약품 알러지 및 호흡기 알러지로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학적 조성물.
  24. 청구항 17에 있어서, 상기 알러지 질환은 집먼지, 균류, 진드기 또는 동물의 털, 피부 또는 배설물로 기인하는 알러지 반응을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  25. 청구항 20에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있는 것인, 약학적 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 경구 또는 비경구 투여는 한달에 1회, 2주에 1회, 1주에 1회, 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회 투여하는 것인, 약학적 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 비경구 투여는 피하, 피내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 경막내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 병소내 또는 직장내 투여인 것인, 약학적 조성물.
  28. 청구항 20에 있어서, 상기 조성물은 경구, 직장, 정맥, 혈관 내, 종양 내, 피하, 피내, 또는 복강 내 전달을 위해 제형화되는 것인, 약학적 조성물.
  29. 수탁번호 KCTC 15152BP로 기탁된 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) GBCC_F0154 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 알러지 질환의 개선 또는 예방을 위한 화장료 조성물.
  30. 수탁번호 KCTC 15152BP로 기탁된 락티플란티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) GBCC_F0154 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 식품은 아이스크림, 영아용 조제분유, 우유, 요구르트, 치즈, 발효유, 우유 분말, 씨리얼, 베이킹 제품, 유제품, 음료수, 식품 첨가물으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 식품 조성물.
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