WO2024122459A1 - 認知機能障害ステージを判定する方法 - Google Patents

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WO2024122459A1
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drebrin
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智明 白尾
祐子 関野
幹夫 東海林
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アルメッド株式会社
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for determining a stage of cognitive impairment in a subject. More particularly, the present disclosure relates to a method for determining a stage of cognitive impairment based on the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A.
  • Alzheimer's disease the main cause of dementia, is an irreversible progressive brain disease that is believed to occur when synapses in the brain become dysfunctional.
  • the increase in the number of Alzheimer's disease patients has become a major social concern in recent years, and there is a need to establish early diagnosis methods and therapeutic drugs.
  • Senile plaques have been observed in the postmortem brains of Alzheimer's disease patients, and these are known to be aggregates of "amyloid ⁇ protein" (amyloid plaques).
  • amyloid ⁇ protein amyloid ⁇ protein
  • the deposition of amyloid ⁇ protein is the earliest pathological lesion that can be confirmed pathologically, and it has been reported that amyloid ⁇ protein aggregates and directly exhibits neuronal toxicity.
  • amyloid cascade hypothesis abnormalities in the production and accumulation of amyloid ⁇ protein are widely related to the onset of Alzheimer's disease. This is called the amyloid cascade hypothesis.
  • amyloid ⁇ protein is the main cause of Alzheimer's disease. It has also been found that the accumulation of amyloid ⁇ protein in the brain begins more than 20 years before the onset of the disease.
  • Alzheimer's disease can be caused by reduced cerebral blood flow (depression, etc.), cerebral hemorrhage, cerebral infarction, drug addiction, etc., and in addition to Alzheimer's disease-type dementia, mitochondrial genetic diseases and dementia caused by diabetes are also known.
  • Alzheimer's disease can only be diagnosed definitively by performing a pathological autopsy after death, and diagnosis during life is made by questionnaire tests and imaging tests. In this case, the diagnosis is made by questionnaire tests after the patient feels subjective symptoms such as severe forgetfulness, but an objective diagnosis cannot be made.
  • questionnaire tests and imaging tests can definitively diagnose late-stage dementia, they cannot diagnose early stages such as mild cognitive impairment (MCI), and early treatment cannot be started.
  • MCI mild cognitive impairment
  • the present disclosure provides a technology for easily and accurately determining the stage of cognitive impairment in a subject.
  • the present disclosure provides: (Item 1) A method for determining a stage of cognitive impairment in a subject, comprising: Measuring the level or amount of at least one of drebrin or a molecule derived from drebrin in a biological sample taken from the subject; and determining a stage of cognitive impairment in the subject based on the level or amount. (Item A1) A method for determining a stage of cognitive impairment in a subject, comprising: Measuring the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A in a biological sample taken from the subject; and determining a stage of cognitive impairment in the subject based on the level or amount.
  • drebrin A or a molecule derived from drebrin A comprises drebrin A-related protein (DARP).
  • DARP drebrin A-related protein
  • the DARP comprises at least the amino acid sequence of positions 221 to 353 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, and/or at least a portion of the amino acid sequence.
  • (Item A5) The method according to any one of the preceding items, comprising measuring the level or amount of at least one of amyloid beta and phosphorylated tau in the biological sample.
  • the biological sample is selected from the group consisting of cerebrospinal fluid, blood, urine, saliva, and tears.
  • (Item A6a) The method according to any one of the preceding claims, wherein the biological sample is cerebrospinal fluid.
  • (Item A10) The method according to any one of the above items, wherein the biological sample is cerebrospinal fluid, and when the level or amount of at least one of the drebrin A or molecules derived from drebrin A is an abnormal value and the level or amount of at least one of the amyloid ⁇ is a standard value, the subject is determined to be cognitively unimpaired (CU) in Alzheimer's disease.
  • (Item A10a) The method according to any one of the preceding items, wherein the drebrin A or a molecule derived from drebrin A is A-DARP.
  • (Item A11) The method according to any one of the above items, wherein the biological sample is cerebrospinal fluid, and the level or amount of at least one of the drebrin A or molecules derived from drebrin A is a standard value, and 1) the level or amount of at least one of the phosphorylated tau is an abnormal value, or 2) the level or amount of at least one of the amyloid ⁇ is an abnormal value, the subject is determined to be cognitively unimpaired (CU) in Alzheimer's disease.
  • the drebrin A or a molecule derived from drebrin A is A-DARP.
  • (Item A12) The method according to any one of the above items, wherein the biological sample is cerebrospinal fluid, and when the level or amount of at least one of the drebrin A or molecules derived from drebrin A is a standard value, the level or amount of at least one of the phosphorylated tau is an abnormal value, and the level or amount of at least one of the amyloid ⁇ is a standard value, the subject is determined to be cognitively unimpaired (CU) in Alzheimer's disease.
  • the drebrin A or a molecule derived from drebrin A is A-DARP.
  • (Item A14) The method according to any one of the above items, wherein the subject is judged to have dementia in Alzheimer's disease when the level or amount of at least one of the drebrin A or molecules derived from drebrin A is a standard value, the level or amount of at least one of the phosphorylated tau is an abnormal value, and the level or amount of at least one of the amyloid beta concentrations is an abnormal value.
  • (Item A15) The method according to any one of the preceding items, wherein when the biological sample is cerebrospinal fluid, the abnormal value of the level or amount of at least one of the drebrin A or molecules derived from drebrin A is about 100 pg/ml or more.
  • a method for determining a stage of cognitive impairment in a subject comprising: determining a stage of cognitive impairment based on the level or amount of at least one component in a biological sample taken from the subject; (a) determining that the subject has mild cognitive impairment (MCI) in Alzheimer's disease when the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A in a biological sample collected from the subject is an abnormal value; (b) when the biological sample is cerebrospinal fluid, and the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A in the biological sample collected from the subject is an abnormal value, and the level or amount of at least one of amyloid ⁇ is a standard value, the subject is judged to be cognitively unimpaired (CU) in Alzheimer's disease; (c) when the biological sample is cerebrospinal fluid, and the level or amount of at least one of drebrin A or a
  • (Item C1) A method for using the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A as an index for determining a stage of cognitive impairment in a subject, comprising: Measuring the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A in a biological sample taken from the subject; and using the level or amount as an index for determining a stage of cognitive impairment in the subject.
  • the disclosed method of assessment allows for early and simple assessment of the stage of cognitive impairment, which previously relied on imaging tests, etc., leading to the prevention of the onset of these diseases and early treatment.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of an analysis of the association between A-DARP and the stage of brain cognitive dysfunction when all cases are used in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of an analysis of the relationship between A-DARP and the stage of brain cognitive dysfunction, excluding patients with diseases other than Alzheimer's disease and patients with complications, in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of an analysis of the relationship between A ⁇ 42 in cerebrospinal fluid and the stage of brain cognitive dysfunction in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of stage determination of brain cognitive dysfunction in a total of 22 cases including uncomplicated Alzheimer's disease patients and healthy subjects in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of stage determination of brain cognitive dysfunction in a total of 31 cases including Alzheimer's disease patients and healthy subjects in one embodiment of the present disclosure.
  • cognition dysfunction refers to a state in which some kind of substantial disorder has occurred in brain functions related to cognition, such as perception, memory, attention, and executive functions, and is not limited to the presence or absence of symptoms or their severity.
  • drebrin A refers to the adult isoform in neurons of drebrin, an actin-binding protein that is expressed in large amounts in neurons during development. Drebrin is involved in the morphogenesis of neurons, particularly process formation, by changing the properties of actin fibers. In developing and migrating neurons, it is present in the cell body and the entire process, but in mature neurons, it is specifically present in the spine structure (dendritic spine). There are two isoforms of drebrin: embryonic type drebrin E and adult type drebrin A. Drebrin A, which is specifically found in the dendritic spine of mature neurons, has the characteristic of being expressed only in neurons. It is also known that drebrin in dendritic spines is widely lost in dementia diseases such as Alzheimer's disease.
  • a molecule derived from drebrin A refers to a part or fragment of drebrin A, or a molecule obtained by any modification of these.
  • DARP drebrin A-related protein
  • A-DARP refers to a peptide that contains at least the peptide sequence from positions 221 to 353 of drebrin A (SEQ ID NO: 1), or a portion thereof.
  • CDA cerebrospinal fluid
  • PDA refers to A-DARP in the blood.
  • abnormal value when referring to a biomarker refers to a value that is not a standard value, and is also called a "non-standard value.”
  • standard value when referring to a biomarker refers to a value that is normal, and since it is a characteristic of the value alone, even if the value itself is a standard value, it may be normal or may not be normal (disease state).
  • a method for determining the stage of cognitive impairment in a subject comprising the steps of measuring the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A in a biological sample collected from the subject, and determining the stage of cognitive impairment in the subject based on the level or amount.
  • the stage of cognitive impairment can be determined simply by measuring the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A in a biological sample, and is therefore useful for preventing the onset of cognitive impairment and for early treatment.
  • the present disclosure relates to a method for the detection of drebrin A (SEQ ID NO: 1) localized in the brain, which is a human drebrin A protein (SEQ ID NO: 1) localized in the brain.
  • DARPs drebrin A related proteins
  • DARPs drebrin A related proteins
  • DARPs drebrin A related proteins
  • drebrin A or a molecule derived from drebrin A may include drebrin A-related protein (DARP).
  • DARP may be a drebrin A or splice variant having at least a part of the Ins2 translation sequence RPYCPFIKASDSGPSSSSSSSSSPPRTPFPYITCHRTPNLSSSLPC (SEQ ID NO: 2) characteristic of drebrin A, or a dimer, oligomer, or polymer composed of them.
  • drebrin A or a molecule derived from drebrin A such as DARP may be used alone in the method of the present disclosure, or one or more molecules may be used in combination in the method of the present disclosure.
  • the total concentration of drebrin A or a molecule derived from drebrin A such as DARP may be measured and used in the method of the present disclosure.
  • the DARP may contain at least the amino acid sequence from positions 221 to 353 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and in one embodiment, the DARP may also contain intact drebrin A from positions 1 to 795 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Methods for measuring intact drebrin A are known, for example, the method described in JP 2016-40540A.
  • the concentration of drebrin A or a molecule derived from drebrin A, such as DARP can be measured by any known method.
  • the concentration of drebrin A or a molecule derived from drebrin A, such as DARP can be measured by, for example, Western blotting, ELISA, immunoprecipitation, etc., using an antibody that recognizes DARP.
  • the anti-DARP antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, as long as it has a part of DARP as an epitope, and may be used alone or in combination of two or more types.
  • the present disclosure relates to an antibody that recognizes a drebrin A-specific epitope for use in the method of the present disclosure.
  • Drebrin A-specific epitope means an epitope that is not present in drebrin E but is present in drebrin A, and is preferably a region including at least a part of the Ins2 translation sequence RPYCPFIKASDSGPSSSSSSSSSPPRTPFPYITCHRTPNLSSSLPC (SEQ ID NO: 2), and/or a specific three-dimensional structure that is created because drebrin A contains the Ins2 translation sequence.
  • a method of using anti-DARP antibody as a primary antibody and detecting with a labeled secondary antibody that recognizes the primary antibody can be preferably used.
  • the primary antibody is a rabbit antibody
  • a labeled anti-rabbit IgG antibody can be used as a secondary antibody
  • a labeled anti-mouse IgG antibody can be used as a secondary antibody.
  • Anti-DARP antibodies that can be used in the measurement of the present invention are known and already commercially available. Specific examples include the DAS2 antibody described in THE JOURNAL OF COMPARATIVE NEUROLOGY 505:352-362 (2007).
  • the labeling substance in the above-mentioned labeled secondary antibody may include enzymes, radioisotopes, fluorescent substances, luminescent substances, gold colloids, etc.
  • enzymes are preferred from the viewpoint of sensitivity and ease of operation, and horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), glucose oxidase (GOD), etc. are more preferred.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • AP AMPPD (3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane disodium salt), 9-(4-chlorophenylthiophosphoryloxymethylidene)-10-methylacridan disodium salt, etc.
  • substrate for chemiluminescence may be used as the substrate.
  • Other fluorescent dyes such as FITC (fluoresceinisothiocyanate) and rhodamine can also be used as labeling substances.
  • Methods for detecting and quantifying drebrin A or molecules derived from drebrin A vary depending on the labeling method, and can be performed by methods well known and conventional to those skilled in the art.
  • a chromogenic or luminescent substrate can be added, and the absorbance or luminescence intensity can be measured to quantify the substance to be measured.
  • the substance to be measured can be quantified by measuring its fluorescence intensity.
  • a radioisotope is used as the labeling substance, the substance to be measured can be quantified by measuring its radioactivity.
  • the substance to be measured can be quantified by measuring its absorbance.
  • a calibration curve standard curve
  • the measured values may be collated with the calibration curve to calculate the concentrations of drebrin A or molecules derived from drebrin A, such as DARP, in the samples, which may be used for comparison in the method of the present disclosure; however, the absorbance, radioactivity, and luminescence intensity may be directly used for comparison in the method of the present disclosure without calculating the concentrations of drebrin A or molecules derived from drebrin A, such as DARP.
  • the biological sample means a body fluid collected from a subject or a control.
  • the body fluid may be cerebrospinal fluid, blood, urine, saliva, and tears, among which cerebrospinal fluid and blood are preferred.
  • Blood includes serum, plasma, and the like.
  • the biological sample may be directly subjected to measurement of the level or concentration of molecules derived from drebrin A, such as drebrin A or DARP, but preferably is pretreated before measurement to increase the detection sensitivity of molecules derived from drebrin A, such as drebrin A or DARP.
  • the method of the present disclosure may further include a step of measuring the level or amount of at least one of amyloid ⁇ and/or phosphorylated tau in a biological sample.
  • the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A in a biological sample collected from the subject can be measured to determine the stage of cognitive impairment in the subject.
  • the method of the present disclosure can determine the stage of cognitive impairment into categories such as, for example, dementia due to Alzheimer's disease, mild cognitive impairment (MCI) due to Alzheimer's disease, cognitively unimpaired (CU) due to Alzheimer's disease, and diseases other than Alzheimer's disease, but the stage categories are not limited to these.
  • the method of the present disclosure can also determine the stage of cognitive impairment such as Alzheimer's disease, vascular dementia, dementia with Lewy bodies, Parkinson's disease, corticobasal degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, cerebral hemorrhage, cerebral infarction, brain tumor, etc.
  • the subject in the method of the present disclosure may be a subject who has developed cognitive impairment, a subject who has not developed cognitive impairment, and/or a subject whose future cognitive impairment is unknown.
  • a control for comparing the level or amount of at least one of the drebrin A or molecules derived from drebrin A in a subject can be a healthy individual who has a low or almost no risk of developing cognitive dysfunction, or who has not developed cognitive dysfunction.
  • the threshold can be set based on the level or amount of at least one of the drebrin A or molecules derived from drebrin A in such a healthy individual.
  • the method of the present disclosure can determine the stage of cognitive impairment based on the following criteria:
  • the subject can be determined to have mild cognitive impairment (MCI) in Alzheimer's disease.
  • MCI mild cognitive impairment
  • the biological sample is cerebrospinal fluid
  • the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A is a standard value, and 1) the level or amount of at least one of phosphorylated tau is an abnormal value, or 2) the level or amount of at least one of amyloid ⁇ is an abnormal value
  • the subject can be determined to be cognitively unimpaired (CU) in Alzheimer's disease.
  • CU cognitively unimpaired
  • the subject when the biological sample is cerebrospinal fluid, and at least one level or amount of drebrin A or a molecule derived from drebrin A is a standard value, at least one level or amount of phosphorylated tau is an abnormal value, and at least one level or amount of amyloid ⁇ is a standard value, the subject can be determined to be cognitively unimpaired (CU) in Alzheimer's disease.
  • CU cognitively unimpaired
  • A-DARP as drebrin A or a molecule derived from drebrin A.
  • drebrin A or a molecule derived from drebrin A, amyloid beta, and phosphorylated tau are all within standard values, it can be determined that there is no brain damage.
  • the subject when the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A is a standard value, the level or amount of at least one of phosphorylated tau is an abnormal value, and the level or amount of at least one of amyloid ⁇ concentrations is an abnormal value, the subject can be determined to have dementia in Alzheimer's disease.
  • the stage of cognitive impairment in a subject can be determined based on the criteria set forth in the table below.
  • the standard and abnormal values of the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A, amyloid ⁇ , and/or phosphorylated tau used in determining the stage of cognitive impairment by the method of the present disclosure can be set appropriately depending on the type of biological sample used in the determination, the type of DARP used in the determination, the type of stage divided by the determination, the characteristics of the subject, etc.
  • the abnormal value of the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A can be about 100 pg/ml or more.
  • the abnormal value of at least one level or amount of amyloid beta can be about 900 pg/ml or less. In one embodiment, when the biological sample is cerebrospinal fluid, the abnormal value of at least one level or amount of phosphorylated tau can be about 50 pg/ml or more.
  • the abnormal value of at least one of the levels or amounts of the drebrin A or the molecule derived from drebrin A can be about 2000 pg/ml or less.
  • the abnormal value of at least one of the levels or amounts of the drebrin A or the molecule derived from drebrin A can be about 1000 pg/ml or more, or about 400 pg/ml or less.
  • abnormal value of at least one of the levels or amounts of the drebrin A or the molecule derived from drebrin A may vary depending on the measurement method or the subject of measurement, and an "abnormal value" refers to a value that is not a standard value when referring to a biomarker, and is also called a "non-standard value.”
  • an agent in another aspect of the present disclosure, includes an antibody that recognizes a drebrin A-specific epitope for determining a stage of cognitive impairment in a subject based on the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A.
  • a method for using the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A as an index for determining the stage of cognitive impairment in a subject comprising the steps of measuring the level or amount of at least one of drebrin A or a molecule derived from drebrin A in a biological sample collected from the subject, and using the level or amount as an index for determining the stage of cognitive impairment in the subject.
  • an appropriate selection can be made from the embodiments described elsewhere in this specification.
  • Short Protocols in Molecular Biology A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al. (1999).
  • gene synthesis and fragment synthesis services such as GeneArt, GenScript, Integrated DNA Technologies (IDT) can be used, and other references include, for example, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. et al. (1994).
  • the concentrations of amyloid ⁇ 40 and amyloid ⁇ 42 in the cerebrospinal fluid were measured by sandwich ELISA using the Human ⁇ Amyloid (1-40) ELISA Kit WakoII and Human/Rat ⁇ Amyloid (1-42) ELISA Kit WakoHigh-Sensitive (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) according to the manufacturer's instructions.
  • Total tau and phosphorylated tau in the cerebrospinal fluid were measured using INNOTEST hTAU Ag and PHOSPHO-TAU (181P) (FUJIREBIO Inc, Tokyo, Japan).
  • DARP was measured by sandwich ELISA using a combination of antibodies capable of specifically detecting drebrin A. Specifically, the hDrebrin-A ELISA Kit sold and distributed by the applicant (Almed Co., Ltd.) was used.
  • Brain cognitive dysfunction stage determination The values of phosphorylated tau, amyloid beta 42, and DARP in patients without complications obtained as described above were divided into standard and abnormal values.
  • a threshold was determined for the A-kit measurement value CDA (corresponding to A-DARP) in cerebrospinal fluid, and the value was divided into standard and abnormal values.
  • Example 1 Determination of brain cognitive dysfunction stage by A-DARP using 50 cases
  • the results of an analysis of the relationship between A-DARP and the stage of brain cognitive dysfunction in 50 cases using a nonparametric Kruskal-Wallis test are shown in FIG.
  • Example 2 Assessment of brain cognitive dysfunction stage by A-DARP in patients with uncomplicated Alzheimer's disease
  • the relationship between the measured values using the hDrebrinA ELISA kit and the stage of brain cognitive impairment was analyzed, excluding patients with other than Alzheimer's disease and patients with complications. The results are shown in Figure 2.
  • a ⁇ 42 in cerebrospinal fluid was significantly different among the mild cognitive impairment in Alzheimer's disease (ADMCI) group, the dementia (ADD) group, and the normal group. These results confirmed that A ⁇ 42 in cerebrospinal fluid can be used to determine MCI or dementia in Alzheimer's disease.
  • Example 4 Determination of brain cognitive dysfunction stage by combination of amyloid ⁇ 42, phosphorylated tau, and DARP
  • MCI was assessed for amyloid ⁇ 42, phosphorylated tau, and A-DARP (CDA) alone in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients, as well as for MCI when each was combined.
  • Figure 4 shows the results of MCI assessment for amyloid ⁇ 42, phosphorylated tau, and A-DARP (CDA) alone in a total of 22 cases including Alzheimer's disease patients without complications and healthy individuals, as well as the results of MCI assessment for a total of 22 cases including Alzheimer's disease patients without complications and healthy individuals, when each was combined.
  • Figure 5 shows the MCI assessment results for amyloid ⁇ 42, phosphorylated tau, and A-DARP (CDA) alone in a total of 31 cases, including both Alzheimer's disease patients and healthy individuals, as well as the MCI assessment results when each was combined in a total of 31 cases, including both Alzheimer's disease patients and healthy individuals.
  • CDA A-DARP
  • the disclosed method of assessment allows for early and simple assessment of the stage of cognitive impairment, which previously relied on imaging tests, etc., leading to the prevention of the onset of these diseases and early treatment. As such, it is expected to be applied in the medical and pharmaceutical fields.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of human drebrin A
  • SEQ ID NO: 2 INS2 sequence

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Abstract

被験者における認知機能障害ステージを早期に判定すること。被験者における認知機能障害ステージを判定する方法であって、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程と、該レベルまたは量に基づいて、該被験者における認知機能障害ステージを判定する工程とを含む、方法。

Description

認知機能障害ステージを判定する方法
　本開示は、被験者における認知機能障害ステージを判定する方法に関する。より特定すると、本開示は、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量に基づき、認知機能障害ステージを判定する方法に関する。
　認知症の主な原因であるアルツハイマー病は、不可逆的な進行性の脳疾患であり、脳におけるシナプスが機能不全に陥ることによって生じるとされている。アルツハイマー病患者の増加は、近年、大きな社会的関心事となっており、その早期診断方法や治療薬の確立が望まれている。アルツハイマー病患者の死後脳では老人斑が観察され、これは「アミロイドβ蛋白質」の凝集体（アミロイド斑）であることが知られている。アミロイドβ蛋白質の沈着が、病理学的に確認できる最も初期の病変であり、アミロイドβ蛋白質が凝集し、そして直接神経細胞毒性を示すことが報告されている。そして、家族性アルツハイマー病患者の遺伝子解析から、アミロイドβ蛋白質の産生及び蓄積の異常がアルツハイマー病の発症に広く関連しているということが現在広く受け入れられている。これは、アミロイドカスケード仮説と呼ばれている。このように、アミロイドβ蛋白質がアルツハイマー病の主原因であることは、数多くの研究により広く受け入れられている。また、脳へのアミロイドβ蛋白質の蓄積は、発症より２０年以上前から始まっていることがわかっている。
　ところで、アルツハイマー病などの認知機能障害においてみられるシナプス機能不全は、脳の血流の低下（うつ病など）、脳出血、脳梗塞、薬物依存などが原因となって生じることもあり、さらにアルツハイマー病型の認知症以外にも、ミトコンドリアの遺伝子疾患、糖尿病に由来する認知症なども知られている。アルツハイマー病の診断は、死亡後に病理解剖を行うことによってのみ診断を確定することができ、生前の診断は質問式検査や画像検査によって行う。この場合、物忘れが激しいなどの自覚症状を感じてから質問式検査などで診断を行うが、客観的診断を行うことができない。また質問式検査や画像検査では、認知症後期の確定診断はできても、軽度認知障害（ＭＣＩ）のような早期の診断ができず、早期の治療開始ができていないのが実情である。
　そこで本開示は、被験者における認知機能障害ステージを簡便かつ正確に判定する技術を提供する。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　被験者における認知機能障害ステージを判定する方法であって、
　該被験者から採取された生体試料中のドレブリンまたはドレブリンに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程と、
　該レベルまたは量に基づいて、該被験者における認知機能障害ステージを判定する工程と
を含む、方法。
（項目Ａ１）
　被験者における認知機能障害ステージを判定する方法であって、
　該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程と、
　該レベルまたは量に基づいて、該被験者における認知機能障害ステージを判定する工程と
を含む、方法。
（項目Ａ２）
　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子は、ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰ）を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３）
　前記ＤＡＲＰが、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも２２１位～３５３位、および／またはそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４）
　さらに、前記生体試料中のアミロイドβ、および／またはリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５）
　前記生体試料中のアミロイドβおよびリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６）
　前記生体試料が、脳脊髄液、血液、尿、唾液、および涙液からなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６ａ）
　前記生体試料が、脳脊髄液である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６ｂ）
　前記測定は、前記生体試料を前処理したものにおける測定を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ７）
　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における軽度認知障害（mild　cognitive　impairment：ＭＣＩ）であると判定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ９）
　さらにアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１０）
　前記生体試料が脳脊髄液であり、前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１０ａ）
　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子がＡ－ＤＡＲＰである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１１）
　前記生体試料が脳脊髄液であり、前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、かつ１）リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合、または２）アミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１１ａ）
　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子がＡ－ＤＡＲＰである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１２）
　前記生体試料が脳脊髄液であり、前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１２ａ）
　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子がＡ－ＤＡＲＰである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１３）
　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子、アミロイドβ、およびリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量がいずれも標準値の場合に、脳障害がないと判定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１３ａ）
　前記生体試料が、脳脊髄液である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１４）
　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの濃度が少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知症であると判定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１５）
　前記生体試料が脳脊髄液の場合、前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量の異常値が約１００ｐｇ／ｍｌ以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１５ａ）
　前記生体試料が、脳脊髄液である上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１６）
　前記生体試料が脳脊髄液の場合、前記アミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量の異常値が約９００ｐｇ／ｍｌ以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１７）
　前記生体試料が脳脊髄液の場合、前記リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量の異常値が約５０ｐｇ／ｍｌ以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１８）
　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を用いて測定される、上記項目のいずれか一項記載の方法。
（項目ＡＡ１）
　被験者における認知機能障害ステージを判定する方法であって、
　該被験者から採取された生体試料中の成分の少なくとも１つのレベルまたは量に基づき、認知機能障害ステージを判定する工程を含み、
（ａ）該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、該被験者がアルツハイマー病における軽度認知障害（mild　cognitive　impairment：ＭＣＩ）であると判定され、
（ｂ）該生体試料が脳脊髄液であり、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、該被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定され、
（ｃ）該生体試料が脳脊髄液であり、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、かつ１）リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合、または２）アミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、該被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定され、
（ｄ）該生体試料が脳脊髄液であり、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定され、
（ｅ）該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子、アミロイドβ、およびリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量がいずれも標準値の場合に、脳障害がないと判定され、
（ｆ）該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの濃度が少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、該被験者がアルツハイマー病における認知症であると判定される、方法。
（項目Ｂ１）
　ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量に基づいて、被験者における認知機能障害ステージを判定するための、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を含む剤。
（項目Ｃ１）
　ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を、被験者における認知機能障害ステージを判定するための指標とする方法であって、
　該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程と、
　該レベルまたは量を、該被験者における認知機能障害ステージを判定するための指標とする工程と
を含む、方法。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
　本開示の判定方法によれば、これまで画像検査などに頼っていた認知機能障害のステージ判定を早期かつ簡便に行うことができるため、これらの疾病の発症予防や早期治療につながる。
図１は、本開示の一実施形態において、全症例を用いた場合のＡ－ＤＡＲＰと脳認知機能障害のステージとの関連を解析した結果を示すグラフである。 図２は、本開示の一実施形態において、アルツハイマー病以外の患者や合併症を持つ患者を除いた場合のＡ－ＤＡＲＰと脳認知機能障害のステージとの関連を解析した結果を示すグラフである。 図３は、本開示の一実施形態において、脳脊髄液中のＡβ４２と脳認知機能障害のステージとの関連を解析した結果を示すグラフである。 図４は、本開示の一実施形態において、合併症の無いアルツハイマー病患者および健常者を合わせた計２２症例における脳認知機能障害のステージ判定結果を示す図である。 図５は、本開示の一実施形態において、アルツハイマー病患者および健常者を合わせた計３１症例における脳認知機能障害のステージ判定結果を示す図である。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
　本明細書において、「認知機能障害」とは、知覚機能、記憶機能、注意機能、実行機能などの認知に関する脳機能において実質的に何らかの障害が起きている状態をいい、症状の有無や重症度は限られない。
　本明細書において、「ドレブリンＡ」とは、発生過程の神経細胞に多量に発現するアクチン結合タンパク質であるドレブリンのうち、神経細胞における成体型のアイソフォームをいう。ドレブリンはアクチンファイバーの性状を変えることにより神経細胞の形態形成、特に突起形成に関与し、発生中で移動している神経細胞では、細胞体と突起全体に存在するが、成熟した神経細胞では棘構造（樹状突起スパイン）中に特異的に存在する。ドレブリンには、胚性型（embryonic　type）のドレブリンＥと成体型（adult　type）のドレブリンＡという２つのアイソフォームが存在しており、成熟した神経細胞の樹状突起スパインに特異的に見られるドレブリンＡは、神経細胞にしか発現しないという特徴を有している。またアルツハイマー病などの痴呆性疾患では樹状突起スパインのドレブリンが広範囲に消失していることが知られている。
　本明細書において、「ドレブリンＡに由来する分子」とは、ドレブリンＡの一部、断片、またはそれらに任意の修飾が施された分子をいう。
　本明細書において、「ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰ）」とは、ドレブリンＡに特徴的なＩｎｓ２翻訳配列の少なくとも一部を有するドレブリンＡの断片またはスプライスバリアント、またはそれらから構成されるダイマー、オリゴマー、もしくはポリマーをいう。
　本明細書において、「Ａ－ＤＡＲＰ」とは、ドレブリンＡ（配列番号１）の少なくとも２２１位から３５３位までのペプチド配列またはその一部を含むペプチドをいう。
　本明細書において、「ＣＤＡ」とは、脳脊髄液中のＡ－ＤＡＲＰをいう。
　本明細書において、「ＰＤＡ」とは、血液中のＡ－ＤＡＲＰをいう。
　本明細書において、「異常値」とは、バイオマーカーについていうとき、標準値ではない値を言い、「非標準値」ともいう。
　本明細書において、「標準値」とは、バイオマーカーについていうとき、正常の場合にとる値をいい、値のみの特徴であるため、値自体が標準値であっても正常の場合もあるし、正常ではない（疾患状態）であることもあり得る。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
　本開示の一局面において、被験者における認知機能障害ステージを判定する方法であって、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程と、該レベルまたは量に基づいて、該被験者における認知機能障害ステージを判定する工程とを含む、方法が提供される。本開示の方法によれば、生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定するだけで認知機能障害ステージを判定することができるため、認知機能障害の発症予防や早期治療に有用である。
　本開示は、脳に局在するヒトドレブリンＡ（配列番号１：MAGVSFSGHRLELLAAYEEVIREESAADWALYTYEDGSDDLKLAASGEGGLQELSGHFENQKVMYGFCSVKDSQAALPKYVLINWVGEDVPDARKCACASHVAKVAEFFQGVDVIVNASSVEDIDAGAIGQRLSNGLARLSSPVLHRLRLREDENAEPVGTTYQKTDAAVEMKRINREQFWEQAKKEEELRKEEERKKALDERLRFEQERMEQERQEQEERERRYREREQQIEEHRRKQQTLEAEEAKRRLKEQSIFGDHRDEEEETHMKKSESEVEEAAAIIAQRPDNPREFFKQQERVASASAGSCDVPSPFNHRPGRPYCPFIKASDSGPSSSSSSSSSPPRTPFPYITCHRTPNLSSSLPCSHLDSHRRMAPTPIPTRSPSDSSTASTPVAEQIERALDEVTSSQPPPLPPPPPPAQETQEPSPILDSEETRAAAPQAWAGPMEEPPQAQAPPRGPGSPAEDLMFMESAEQAVLAAPVEPATADATEIHDAADTIETDTATADTTVANNVPPAATSLIDLWPGNGEGASTLQGEPRAPTPPSGTEVTLAEVPLLDEVAPEPLLPAGEGCATLLNFDELPEPPATFCDPEEVEGEPLAAPQTPTLPSALEELEQEQEPEPHLLTNGETTQKEGTQASEGYFSQSQEEEFAQSEELCAKAPPPVFYNKPPEIDITCWDADPVPEEEEGFEGGD）、またはドレブリンＡの断片、もしくはスプライスバリアント、またはそれらから構成されるダイマー、オリゴマー、もしくはポリマーであるドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰ：Ｄｒｅｂｒｉｎ　Ａ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のレベルまたは量が、被験者の認知機能障害ステージに応じて変化することを見出したことに基づくものである。したがって、本開示の一実施形態において、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子は、ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰ）を含むことができる。本開示において、ＤＡＲＰとは、ドレブリンＡに特徴的なＩｎｓ２翻訳配列RPYCPFIKASDSGPSSSSSSSSSPPRTPFPYITCHRTPNLSSSLPC（配列番号２）の少なくとも一部を有するドレブリンＡのまたはスプライスバリアント、またはそれらから構成されるダイマー、オリゴマー、もしくはポリマーであればよい。一実施形態において、ドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子は、本開示の方法に単独で用いることもでき、１又は２以上の分子の組み合わせで本開示の方法に用いることもできる。また、ドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の総濃度を測定し、本開示の方法に用いることもできる。
　本開示の一実施形態において、ＤＡＲＰは、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも２２１位～３５３位のアミノ酸配列を含むことができ、一実施形態において、ＤＡＲＰは、配列番号１のアミノ酸配列の１位～７９５位までのインタクトドレブリンＡを含むこともできる。インタクトドレブリンＡを測定する方法は公知であり、例えば特開2016-40540Ａに記載された方法が知られている。
　本開示の一実施形態において、ドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の濃度は、公知の任意の手法によって測定することができる。本開示の一実施形態において、ドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の濃度は、例えばＤＡＲＰを認識する抗体を用いたウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法などによって測定することができる。抗ＤＡＲＰ抗体としては、ＤＡＲＰの一部をエピトープとする抗体であればモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、１種で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、全身に存在するドレブリンＥと区別するために、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を用いて測定されることが好ましい。一態様において、本開示は、本開示の方法に用いるための、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体に関する。「ドレブリンＡ特異的エピトープ」とは、ドレブリンＥには存在せず、ドレブリンＡに存在するエピトープを意味し、好ましくはＩｎｓ２翻訳配列RPYCPFIKASDSGPSSSSSSSSSPPRTPFPYITCHRTPNLSSSLPC（配列番号２）の、少なくとも一部を含む領域、及び／又は、ドレブリンＡがＩｎｓ２翻訳配列を含むために作られる特異的立体構造である。
　ウェスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法を行う場合、一次抗体として抗ＤＡＲＰ抗体を用い、一次抗体を認識する標識化二次抗体により検出する方法を好ましく使用することができる。例えば、一次抗体がラビット抗体である場合は標識化抗ラビットＩｇＧ抗体を、一次抗体がマウス抗体である場合は標識化抗マウスＩｇＧ抗体を、二次抗体として用いることができる。
　本発明での測定に使用できる抗ＤＡＲＰ抗体は公知であり、既に市販もされている。具体的には、例えば、THE JOURNAL OF COMPARATIVE NEUROLOGY 505:352-362 (2007)に記載されているＤＡＳ２抗体を挙げることができる。
　上記標識化二次抗体における標識物質としては、酵素、放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、金コロイド等が挙げられる。これらのうち、感度及び操作の簡便さの観点から酵素が好ましく、西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等がより好ましい。標識物質としてＨＲＰを用いる場合はＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）等を、ＡＰを用いる場合はＡＭＰＰＤ（３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）、９－（４－クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）－１０－メチルアクリダン二ナトリウム塩等、または化学発光（Chemiluminescence）用の基質を基質として使用することができる。また、標識物質としては、他にＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン等の蛍光色素等も使用することができる。
　ドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の検出・定量方法は、標識の方法によって異なり、当業者に周知慣用の方法で行うことができる。例えば、標識物質としてＨＲＰ、ＡＰ、ＧＯＤ等を用いた場合は、発色基質や発光基質を添加し、吸光度や発光強度を測定して測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として蛍光物質を用いた場合は、その蛍光強度を測定することで測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として放射性同位元素を用いた場合は、放射能を測定することで測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として金コロイドを用いた場合は、吸光度を測定することで測定対象物質を定量することができる。定量の際は、例えば、予め既知のドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の濃度の試料で検量線（標準曲線）を作成しておき、測定値を検量線に照合して試料中のドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の濃度を算出し、本開示の方法における比較に用いてもよいが、ドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の濃度を算出せず、吸光度、放射能、発光強度を直接本開示の方法における比較に用いてもよい。一実施形態において、被験者におけるドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子のレベルまたは濃度（例えば、上記のようにして算出したＤＡＲＰの濃度や、吸光度、放射能、発光強度）が、対照におけるドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子のレベルまたは濃度よりも高いか否か、或いは低いか否かを評価（判定）するために、閾値（カットオフ値）は任意のものを設定することができ、かかる閾値としては、例えば、対照におけるドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子のレベルまたは濃度の平均値、平均値＋標準偏差（ＳＤ）、平均値＋２ＳＤ、平均値＋３ＳＤ、平均値－ＳＤ、平均値－２ＳＤ、平均値－３ＳＤ、中央値、中央値＋ＳＤ、中央値＋２ＳＤ、中央値＋３ＳＤ、中央値－ＳＤ、中央値－２ＳＤ、中央値－３ＳＤ等を挙げることができる。
　本開示の一実施形態において、生体試料とは、被験者や対照者から採取した体液を意味する。一実施形態において、体液には、脳脊髄液、血液、尿、唾液、および涙液等を挙げることができ、中でも脳脊髄液や血液が好ましい。血液には、血清、血漿等が含まれる。生体試料は、そのままドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子のレベルまたは濃度の測定に供してもよいが、好ましくは測定前に、ドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の検出感度を高めるための前処理が施される。前処理の方法としては、生体試料中の測定対象タンパク質の検出感度を高める方法であればよく、例えばドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子を検出するための抗体を用いた免疫沈降を挙げることができる。また、生体試料中をプロテインＡ／Ｇビーズで処理し、ビーズに吸着した画分を本開示の方法に供することで、ドレブリンＡまたはＤＡＲＰなどのドレブリンＡに由来する分子の検出感度を高めることもできる。
　本開示の一実施形態において、本開示の方法は、さらに、生体試料中のアミロイドβ、および／またはリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程を含むことができる。上記のとおり、本開示の方法では、被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定することで、被験者における認知機能障害ステージを判定することができるが、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量に加えて、アミロイドβ、および／またはリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量を測定することにより、認知機能障害ステージの判定の精度をさらに高めることができ、またアルツハイマー病創薬で対象となる患者の層別化および治療薬の効果判定に大きな力を発することができる。糖尿病はアルツハイマー病による認知症の発症リスクを２倍以上も上昇させるところ、ＣＵステージや軽度認知障害のステージを判定できれば、未発症のうちから糖尿病の適切な管理を行い、患者数を抑制することができる。また糖尿病以外でも、認知症のリスク因子は多く知られており、未発症のうちからそれらを管理することにより、認知症の発症リスクを減らすことができる。
　本開示の一実施形態において、本開示の方法は、認知機能障害のステージを、例えば、アルツハイマー病の認知症、アルツハイマー病の軽度認知障害（mild　cognitive　impairment：ＭＣＩ）、アルツハイマー病の認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）、アルツハイマー病以外の疾患などの区分に判定することができるが、ステージ区分はこれらに限られるものではない。例えば、本開示の方法によれば、認知機能障害として、アルツハイマー病、脳血管性認知症、レビー小体型認知症、パーキンソン病、大脳皮質基底核変性症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、脳出血、脳梗塞、脳腫瘍等などのステージ判定も行うことができる。
　本開示の一実施形態において、本開示の方法における被験者としては、認知機能障害を発症している対象、認知機能障害を発症していない対象、および／または認知機能障害を発症するか否かが不明な対象などを挙げることができる。
　本開示の一実施形態において、対象者のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を比較する対照としては、認知機能障害を発症するリスクが低いか或いはほとんど無い、または認知機能障害を発症していない健常者を挙げることができる。また閾値の設定に当たっては、このような健常者のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量に基づいて設定することができる。
　本開示の一実施形態において、本開示の方法は以下の基準に基づいて認知機能障害ステージを判定することができる。
　一実施形態において、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、被験者がアルツハイマー病における軽度認知障害（mild　cognitive　impairment：ＭＣＩ）であると判定することができる。
　一実施形態において、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、さらにアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、被験者がアルツハイマー病における軽度認知障害（mild　cognitive　impairment：ＭＣＩ）であると判定することができる。
　一実施形態において、生体試料が脳脊髄液であり、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定することができる。この場合、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子としてＡ－ＤＡＲＰ、および／またはＡ－ＤＡＲＰを含む分子を用いることが好ましい。
　一実施形態において、生体試料が脳脊髄液であり、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、かつ１）リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合、または２）アミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定することができる。この場合、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子としてＡ－ＤＡＲＰ、および／またはＡ－ＤＡＲＰを含む分子を用いることが好ましい。
　一実施形態において、生体試料が脳脊髄液であり、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定することができる。この場合、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子としてＡ－ＤＡＲＰを用いることが好ましい。
　一実施形態において、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子、アミロイドβ、およびリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量がいずれも標準値の場合に、脳障害がないと判定することができる。
　一実施形態において、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの濃度が少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、被験者がアルツハイマー病における認知症であると判定することができる。
　一実施形態において、本開示の方法において、被験者における認知機能障害ステージの判定は、以下の表に記載した基準に基づいて行うことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本開示の一実施形態において、本開示の方法による認知機能障害ステージの判定に用いるドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子、アミロイドβ、および／またはリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量の標準値および異常値は、判定に用いる生体試料の種類、判定に用いるＤＡＲＰの種類、判定によって区分するステージの種類、被験者の性質などに応じて適宜設定することができる。例えば、生体試料が脳脊髄液の場合、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量の異常値は約１００ｐｇ／ｍｌ以上とすることができる。
　また他の実施形態において、生体試料が脳脊髄液の場合、アミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量の異常値は約９００ｐｇ／ｍｌ以下とすることができる。また一実施形態において、生体試料が脳脊髄液の場合、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量の異常値は約５０ｐｇ／ｍｌ以上とすることができる。
　一実施形態において、生体試料が血液であり、かつドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子がＡ－ＤＡＲＰ、および／またはＡ－ＤＡＲＰを含む分子である場合、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量の異常値が約２０００ｐｇ／ｍｌ以下とすることができる。他の実施形態において、生体試料が血液であり、かつドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子がＡ－ＤＡＲＰ、および／またはＡ－ＤＡＲＰを含む分子である場合、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量の異常値が、約１０００ｐｇ／ｍｌ以上、または約４００ｐｇ／ｍｌ以下とすることもできる。ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量は、その測定手法や測定の対象によって異常値の値は異なっていてもよく、「異常値」とは、バイオマーカーについていうとき、標準値ではない値を言い、「非標準値」ともいう。
　本開示の他の局面において、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量に基づいて、被験者における認知機能障害ステージを判定するための、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を含む剤が提供される。
　本開示の他の局面において、ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を、被験者における認知機能障害ステージを判定するための指標とする方法であって、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程と、該レベルまたは量を、該被験者における認知機能障害ステージを判定するための指標とする工程とを含む、方法が提供される。一実施形態において、このような方法においては、本明細書の他の箇所で説明した実施形態を適宜選択して用いることができる。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．
　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
１．脳脊髄液からのリン酸化タウおよびアミロイドβ４２の検出、並びに血液および脳脊髄液からのＤＡＲＰの検出
　合併症無しの患者からそれぞれ血液および脳脊髄液を取得し、脳脊髄液からリン酸化タウおよびアミロイドβ４２をそれぞれ検出し、また血液および脳脊髄液からＤＡＲＰを検出した。
　脳脊髄液中のアミロイドβ４０とアミロイドβ４２の濃度は、Human　βAmyloid　(1-40)　ELISA　Kit　WakoIIおよびHuman/RatβAmyloid　(1-42)　ELISA　Kit　WakoHigh-Sensitive（和光純薬工業株式会社、大阪、日本）を用いて製造者の指示に従ってサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定した。また脳脊髄液中のトータルタウとリン酸化タウはINNOTEST　hTAU　AgおよびPHOSPHO-TAU　(181P)　(FUJIREBIO　Inc,　Tokyo,　Japan)を用いて測定した。
　ＤＡＲＰについては、ドレブリンＡを特異的に検出可能な抗体の組み合わせを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定した。具体的には、出願人（アルメッド株式会社）が販売・配布している、hDrebrin-A ELISA Kit を使用した。
２．脳認知機能障害ステージ判定
　上記のようにして得た合併症無しの患者のリン酸化タウ、アミロイドβ４２、ＤＡＲＰのそれぞれの値について、標準値と異常値に分けた。またＤＡＲＰについては、脳脊髄液でのＡキット測定値ＣＤＡ（Ａ－ＤＡＲＰに相当）について閾値を決めて、標準値と異常値に分けた。
　Ａ－ＤＡＲＰを用いたときの単独でのＭＣＩおよび認知症の判定、並びにアミロイドβおよび／またはリン酸化タウとの組み合わせによるＭＣＩおよび認知症の判定の結果を以下にそれぞれ示した。
（実施例１：５０症例を用いた場合のＡ－ＤＡＲＰによる脳認知機能障害ステージ判定）
　５０症例を用いた場合のＡ－ＤＡＲＰと脳認知機能障害のステージとの関連をノンパラメトリックKruskal-Wallisテストにより解析した結果を図１に示した。
　図１に示したとおり、全症例を用いた場合には、脳脊髄液中のＣＤＡはアルツハイマー病の軽度認知障害（ＡＤＭＣＩ）のグループ、認知症（ＡＤＤ）のグループ、および正常（ｎｏｒｍａｌ）のグループでは、有意な差を認められなかったため、続いて全症例から合併症を除いた症例についてより詳しく精査した。
（実施例２：合併症のないアルツハイマー病患者におけるＡ－ＤＡＲＰによる脳認知機能障害ステージ判定）
　ｈＤｒｅｂｒｉｎＡ　ＥＬＩＳＡ　キットによる測定値と脳認知機能障害のステージとの関連をアルツハイマー病以外の患者や合併症を持つ患者を除いて解析した。結果を図２に示した。
　図２に示したとおり、アルツハイマー病以外の患者や合併症を持つ患者を除いて解析した場合には、軽度認知障害のＣＤＡの中央値は他のステージよりも高くなっていることが判った。また血液中のＤＡＲＰ（ＰＤＡ）を用いた場合には、正常（ｎｏｒｍａｌ）のグループにおける中央値よりも、軽度認知障害グループや認知症グループのＰＤＡの中央値は低いことがわかった。この結果、ＣＤＡおよびＰＤＡは軽度認知障害の判定に用いることができることがわかる。
（実施例３：脳脊髄液中のＡβ４２による脳認知機能障害ステージ判定）
　続いて、脳脊髄液中のＡβ４２による測定値と脳認知機能障害のステージとの関連について、全症例を用いて解析した。結果を図３に示した。
　図３に示したとおり、全症例を用いた場合には、脳脊髄液中のＡβ４２はアルツハイマー病の軽度認知障害（ＡＤＭＣＩ）のグループ、認知症（ＡＤＤ）のグループ、および正常（ｎｏｒｍａｌ）のグループでは、有意に異なっていた。この結果から、脳脊髄液中のＡβ４２はアルツハイマー病においてＭＣＩまたは認知症であることの判定に使用できることが確認された。
（実施例４：アミロイドβ４２、リン酸化タウ、およびＤＡＲＰの組み合わせによる脳認知機能障害ステージ判定）
　続いて、アルツハイマー病患者の脳脊髄液中のアミロイドβ４２、リン酸化タウ、およびＡ－ＤＡＲＰ（ＣＤＡ）の単独でのＭＣＩの判定、並びにそれぞれを組み合わせた場合のＭＣＩの判定を行った。図４に、合併症の無いアルツハイマー病患者および健常者を合わせた計２２症例におけるアミロイドβ４２、リン酸化タウ、およびＡ－ＤＡＲＰ（ＣＤＡ）の単独でのＭＣＩの判定結果、並びに合併症の無いアルツハイマー病患者および健常者を合わせた計２２症例におけるそれぞれを組み合わせた場合のＭＣＩの判定の結果を示した。
　図４に示されるとおり、脳脊髄液中のアミロイドβ４２、リン酸化タウ、およびＡ－ＤＡＲＰ（ＣＤＡ）を単独で用いる場合には、ＭＣＩの判定を行うことができ、またＡ－ＤＡＲＰ（ＣＤＡ）にアミロイドβ４２やリン酸化タウを組み合わせて判定を行うことで、偽陽性や偽陰性の割合を減らすことができることがわかった。
　図５に、アルツハイマー病患者および健常者を合わせた計３１症例におけるアミロイドβ４２、リン酸化タウ、およびＡ－ＤＡＲＰ（ＣＤＡ）の単独でのＭＣＩの判定結果、並びにアルツハイマー病患者および健常者を合わせた計３１症例におけるそれぞれを組み合わせた場合のＭＣＩの判定の結果を示した。
　図５に示されるとおり、３１症例を用いた場合にも、脳脊髄液中のアミロイドβ４２、リン酸化タウ、およびＡ－ＤＡＲＰ（ＣＤＡ）を単独で用いる場合には、ＭＣＩの判定を行うことができ、またＡ－ＤＡＲＰ（ＣＤＡ）にアミロイドβ４２やリン酸化タウを組み合わせて判定を行うことで、偽陽性や偽陰性の割合を減らすことができることがわかった。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
　本開示の判定方法によれば、これまで画像検査などに頼っていた認知機能障害のステージ判定を早期かつ簡便に行うことができるため、これらの疾病の発症予防や早期治療につながる。そのため、医療、製薬分野において応用が期待される。
配列番号１：ヒトドレブリンＡのアミノ酸配列
配列番号２：ＩＮＳ２配列

Claims (22)

  1. 　被験者における認知機能障害ステージを判定する方法であって、
    　該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程と、
    　該レベルまたは量に基づいて、該被験者における認知機能障害ステージを判定する工程と
    を含む、方法。
  2. 　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子は、ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＤＡＲＰが、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも２２１位～３５３位、および／またはそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　さらに、前記生体試料中のアミロイドβ、および／またはリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記生体試料中のアミロイドβおよびリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記生体試料が、脳脊髄液、血液、尿、唾液、および涙液からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記生体試料が、脳脊髄液である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記測定は、前記生体試料を前処理したものにおける測定を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における軽度認知障害（mild　cognitive　impairment：ＭＣＩ）であると判定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　さらにアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記生体試料が脳脊髄液であり、前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記生体試料が脳脊髄液であり、前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、かつ１）リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合、または２）アミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記生体試料が脳脊髄液であり、前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子、アミロイドβ、およびリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量がいずれも標準値の場合に、脳障害がないと判定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの濃度が少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知症であると判定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記生体試料が脳脊髄液の場合、前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量の異常値が約１００ｐｇ／ｍｌ以上である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記生体試料が脳脊髄液の場合、前記アミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量の異常値が約９００ｐｇ／ｍｌ以下である、請求項４または５に記載の方法。
  18. 　前記生体試料が脳脊髄液の場合、前記リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量の異常値が約５０ｐｇ／ｍｌ以上である、請求項４または５に記載の方法。
  19. 　前記ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を用いて測定される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　被験者における認知機能障害ステージを判定する方法であって、
    　該被験者から採取された生体試料中の成分の少なくとも１つのレベルまたは量に基づき、認知機能障害ステージを判定する工程を含み、
    （ａ）該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、該被験者がアルツハイマー病における軽度認知障害（mild　cognitive　impairment：ＭＣＩ）であると判定され、
    （ｂ）該生体試料が脳脊髄液であり、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、該被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定され、
    （ｃ）該生体試料が脳脊髄液であり、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、かつ１）リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合、または２）アミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、該被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定され、
    （ｄ）該生体試料が脳脊髄液であり、該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの少なくとも１つのレベルまたは量が標準値である場合に、前記被験者がアルツハイマー病における認知機能正常（Cognitively　unimpaired：ＣＵ）であると判定され、
    （ｅ）該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子、アミロイドβ、およびリン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量がいずれも標準値の場合に、脳障害がないと判定され、
    （ｆ）該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量が標準値であり、リン酸化タウの少なくとも１つのレベルまたは量が異常値であり、かつアミロイドβの濃度が少なくとも１つのレベルまたは量が異常値である場合に、該被験者がアルツハイマー病における認知症であると判定される、方法。
  21. 　ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量に基づいて、被験者における認知機能障害ステージを判定するための、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を含む剤。
  22. 　ドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を、被験者における認知機能障害ステージを判定するための指標とする方法であって、
    　該被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡまたはドレブリンＡに由来する分子の少なくとも１つのレベルまたは量を測定する工程と、
    　該レベルまたは量を、該被験者における認知機能障害ステージを判定するための指標とする工程と
    を含む、方法。
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