WO2024112031A1 - 세포 배양, 성장 촉진, 세포시트 분리 및 전달의 전 과정이 가능한 광감응성 고분자 필름 기반의 올인원 세포제어 기법 - Google Patents

세포 배양, 성장 촉진, 세포시트 분리 및 전달의 전 과정이 가능한 광감응성 고분자 필름 기반의 올인원 세포제어 기법 Download PDF

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박종철
구민아
이미희
홍승희
고은정
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    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a photosensitive polymer film containing a polymer material and a photosensitizer, a method for promoting cell proliferation and a method for separating cells, including the step of irradiating the photosensitive polymer film with light.
  • a photosensitizer is a substance that generates reactive oxygen species (ROS) by irradiating light energy. Since active oxygen plays an important role in the early stages of the molecular mechanism that induces cell separation, the possibility of cell separation using photosensitizers has recently been suggested.
  • ROS reactive oxygen species
  • Reactive oxygen species are highly reactive ions such as hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), superoxide (O 2 - ), hydroxyl radical (OH ⁇ ), and singlet oxygen ( 1 O 2 ). It is a general term for molecules. Reactive oxygen species occur naturally through normal metabolism of oxygen and play an important role in cell signaling and homeostasis. The concentration of reactive oxygen species can increase very quickly due to environmental stress, such as exposure to ultraviolet rays or high heat.
  • reactive oxygen species are substances that play an essential role in biological functions.
  • the reactive oxygen species act directly on proteins, transcription factors, and genes to change their structures or regulate their functions, thereby transmitting multiple signals. Adjust the path. Additionally, a certain amount of increase in reactive oxygen species can promote cell proliferation, but excessive amounts of reactive oxygen species can cause oxidative damage to lipids, proteins, and DNA.
  • PDT photodynamic treatment' or 'photodynamic therapy'
  • photosensitizers also known as 'photosensitizers' or 'photosensitizers'
  • PDT photodynamic treatment' or 'photodynamic therapy'
  • PDT refers to the use of non-toxic drugs or dyes known as photosensitizers (also known as 'photosensitizers' or 'photosensitizers') to treat lesions including cancer. It can be defined as systemically or locally administered to the patient.
  • energy transfer occurs due to the interaction between light and the photosensitizer, creating a local chemical effect.
  • the prior art related to this PDT was a technology that kills cells in a specific area through reactive oxygen species.
  • research in this prior art has only focused on killing cells through reactive oxygen species, and current research on proliferating cells through reactive oxygen species is insufficient.
  • the step of promoting cell growth and the cell sheet separation step can be performed as separate steps because there is a difference in the amount of photosensitizer required and the level of light irradiation energy, and the light energy density under the same amount of photosensitizer.
  • the present invention was devised to solve the problems of the prior art as described above, and includes a method of manufacturing a photosensitive polymer film containing a polymer material and a photosensitizer and a method of cell growth comprising the step of irradiating the photosensitive polymer film with light. It is about an all-in-one cell control technique that enables both stimulation and cell sheet separation and delivery.
  • a cell sheet is a concept distinct from an independent single cell, where single cells are gathered together to share an extracellular matrix (ECM) and are connected to each other in a single layer or multilayer. It refers to the state of forming a cell layer of. Even when the cell density increases within a limited space during in vitro culture to form a cell layer, it is difficult to define that the state of the cell sheet has been maintained if the state of the cell layer is converted back to an independent single cell due to chemical or physical decomposition of a substrate such as trypsin.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell sheet refers to a cell layer composed of fibroblasts, preferably human neonatal dermal fibroblasts, but also a single layer composed of adult normal human epidermal keratinocytes. It is also possible to manufacture a multi-layer composite cell sheet by overlapping cell layers.
  • the cell sheet can be used to test cosmetics or cosmetics.
  • photosensitivity materials are a general term for materials that change their molecular state by light energy such as visible light.
  • photosensitizers mean active oxygen oxidation by irradiation of light energy. It refers to a substance that generates (reactive oxygen species, ROS), but is not limited to this.
  • the photosensitizer used herein is Hematoporphyrin (Hp), ALA (5-Aminolevulinic Acid), and Chlorin, preferably chlorin e6, but limited thereto. It doesn't work.
  • Active oxygen which is generated when a photosensitizer is stimulated by light energy, plays an important role in the initial stage of the molecular mechanism that induces cell separation, so it can be used to induce cell separation.
  • the spin-coating method is a technique widely used in the microelectronics industry to produce a thin and uniform layer. It refers to a method of placing a fluid on a substrate and rotating it at high speed to spread the fluid widely by centrifugal force. It is not limited.
  • the solvent is also called a solvent and refers to a substance used to dissolve a substance and make it into a solution.
  • a solvent is a substance that acts as a solution medium and dissolves the solute, and is mainly in liquid or gaseous form. For example, when a solution is created by dissolving a substance in a liquid or when a liquid is dissolved into a liquid, the liquid with the largest amount is called the solvent, and the solvent in the solution has a higher proportion of the solution than the solute.
  • the solvent is preferably a polar solvent, but is not limited thereto, and the solvent includes methanol, ethanol, propanol, acetic acid, glycerin, methylene chloride, acetone, ethyl acetate, DMSO, DMF, acetonitrile, pyridine, and fluoroalcohol. It may be any one or more selected from the group consisting of, and is preferably hexafluoroisopropanol (HFIP), but is not limited thereto.
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • the concentration of the photosensitizer introduced into the polymer material by controlling the concentration of the photosensitizer introduced into the polymer material, the proliferation of angiogenic cells is promoted by inducing the production of an appropriate amount of reactive oxygen species that enables the proliferation of angiogenic cells.
  • the photosensitive polymer film in which a photosensitizer is introduced into this polymer material is a polymer film that enables the generation of an appropriate amount of reactive oxygen species to proliferate angiogenic cells upon light irradiation.
  • an appropriate amount of reactive oxygen species for proliferating the angiogenic cells is produced at a low concentration.
  • the photosensitive polymer film enables the generation of reactive oxygen species to the extent of promoting the proliferation of angiogenic cells when irradiated with an appropriate level of light.
  • the photosensitizer is used at a concentration of 0.01 to 10 ⁇ g/cm2. It is desirable. If the photosensitizer is not introduced at the above concentration, reactive oxygen species cannot be generated at a low concentration sufficient to promote the proliferation of angiogenic cells, which is undesirable.
  • vascular endothelial cells vascular smooth muscle cells, fibroblasts, etc.
  • vascular smooth muscle cells vascular smooth muscle cells
  • fibroblasts etc.
  • it may be more preferably vascular endothelial cells.
  • polymer film may be included without particular limitation as long as it enables the generation of reactive oxygen species by introducing a photosensitizer.
  • polymer films suitable for the present invention include polyurethane (PU), PLGA (poly(lactic- It is preferably at least one selected from the group consisting of co-glycolic acid), PLLA (Poly(L-lactic acid)), PET (polyethylene terephthalate), and polyketone (PK).
  • the photosensitizer is not particularly limited, but the photosensitizer suitable for the present invention is preferably a group consisting of hematoporphyrin (Hp), amino levulinic acid (ALA, 5-Aminolevulinic Acid), and chlorin. It is preferable that it is at least one selected from.
  • Hp hematoporphyrin
  • ALA amino levulinic acid
  • 5-Aminolevulinic Acid 5-Aminolevulinic Acid
  • chlorin It is preferable that it is at least one selected from.
  • reactive oxygen species are generated in an appropriate amount to enable the proliferation of angiogenic cells, and there is no particular limitation, but preferably hydrogen peroxide, superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, hydrogen peroxide, and nitric oxide ( It may be any one or more selected from the group consisting of NO).
  • the support refers to a material that serves as a base for cells to be attached and cultured, and is preferably a fibrin gel support or a hydrogel support, but is not limited thereto.
  • the photosensitive polymer support refers to a support as a polymer compound into which a photosensitizing agent is introduced, and for the purpose of the present invention, the photofunctional polymer support can be used as a support for cell culture.
  • the dish is not limited as long as it can directly culture cells, but is preferably a plate, dish, or flask having O ⁇ P wells. More preferably, it may be a Petri dish.
  • O and P are each a natural number of 2 or more, preferably a natural number of 2 to 64, more preferably a natural number of 2 to 32.
  • a 6/12/24/48/96/1024 well plate may be used, or a circular plate such as a 35/60/100 ⁇ dish or a culture flask such as a T25/75 flask may be used.
  • a plate for growing or separating cells including a photosensitive polymer film containing a photosensitizer and a polymer material.
  • the polymer material is polyurethane (PU), poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), poly(L-lactic acid) (PLLA), polyethylene terephthalate (PET), and polyketone.
  • PU polyurethane
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid)
  • PLA poly(L-lactic acid)
  • PET polyethylene terephthalate
  • PK polyketone
  • the photosensitizer is one or more cells selected from the group consisting of hematoporphyrin (Hp), 5-Aminolevulinic Acid (ALA), and Chlorin e6. Provides a plate for growth or separation.
  • Hp hematoporphyrin
  • ALA 5-Aminolevulinic Acid
  • Chlorin e6 Provides a plate for growth or separation.
  • a plate for cell growth or separation wherein the chlorin e6 concentration is 0.01 to 10 ⁇ g/cm2.
  • the solvent is methanol, ethanol, propanol, acetic acid, glycerin, methylene chloride, acetone, ethyl acetate, DMSO, DMF, acetonitrile, pyridine, and hexafluoroisopropanol (HFIP).
  • a plate for cell growth or separation using at least one polar solvent selected from the group is provided.
  • the polymer material is polyurethane (PU), poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), poly(L-lactic acid) (PLLA), polyethylene terephthalate (PET), and polyketone.
  • PU polyurethane
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid)
  • PLA poly(L-lactic acid)
  • PET polyethylene terephthalate
  • PK provides a method for manufacturing a plate for cell growth or separation, which is at least one selected from the group consisting of (PK).
  • the photosensitizer is one or more cells selected from the group consisting of hematoporphyrin (Hp), 5-Aminolevulinic Acid (ALA), and Chlorin e6.
  • Hp hematoporphyrin
  • ALA 5-Aminolevulinic Acid
  • Chlorin e6 Provides a method of manufacturing a plate for growth or separation.
  • a method of manufacturing a plate for cell growth or separation wherein the chlorin e6 concentration is 0.01 to 10 ⁇ g/cm2.
  • the solvent is methanol, ethanol, propanol, acetic acid, glycerin, methylene chloride, acetone, ethyl acetate, DMSO, DMF, acetonitrile, pyridine, and hexafluoroisopropanol (HFIP).
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • step (a) irradiating light to a plate for cell growth or separation, including a light-sensitive polymer film containing a photosensitizer and a polymer material; (b) generating reactive oxygen species by light irradiation in step (a); and (c) promoting cell proliferation by reactive oxygen species in step (b).
  • the active oxygen species is a cell characterized in that at least one selected from the group consisting of hydrogen peroxide, superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, hydrogen peroxide, and nitric oxide (NO). Provides a method for promoting proliferation.
  • a method for promoting cell proliferation wherein the cells are fibroblasts.
  • a method for promoting cell proliferation wherein the cells are human dermal fibroblasts.
  • a method of promoting cell proliferation involves irradiating light energy at 0.01 mW/cm2 to 0.2 mW/cm2 for 5 minutes to 1 hour.
  • a cell sheet by culturing cells on a plate for cell growth or separation, which includes a light-sensitive polymer film containing a photosensitizer and a polymer material; (b) contacting a gel support on the cell sheet; (c) generating reactive oxygen species by irradiating the photosensitive polymer film and the cell sheet with light; (d) separating the cell sheet from the photosensitive polymer film using the reactive oxygen species; and (e) transferring the separated cell sheet to a gel support.
  • the active oxygen species is characterized in that at least one selected from the group consisting of hydrogen peroxide, superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, hydrogen peroxide, and nitric oxide (NO).
  • a cell separation method is provided.
  • a method for isolating cells wherein the cells are fibroblasts.
  • a method for isolating cells wherein the cells are human dermal fibroblasts.
  • a cell separation method is provided wherein the gel support is a fibrin gel support or a hydrogel support.
  • the light irradiation provides a cell separation method in which light energy is irradiated at 1 mW/cm2 to 50 mW/cm2 for 1 minute to 20 minutes.
  • irradiating light to a plate for cell growth or separation including a light-sensitive polymer film containing a photosensitizer and a polymer material; (b) generating reactive oxygen species by light irradiation in step (a); (c) promoting cell proliferation by reactive oxygen species in step (b); (d) producing a cell sheet through proliferation of cells in step (c); (e) contacting a gel support on the cell sheet; (f) generating reactive oxygen species by irradiating the photosensitive polymer film and the cell sheet with light; (g) separating the cell sheet from the photosensitive polymer film with the reactive oxygen species; and (h) transferring the separated cell sheet to the gel support.
  • the active oxygen species is characterized in that at least one selected from the group consisting of hydrogen peroxide, superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, hydrogen peroxide, and nitric oxide (NO).
  • the active oxygen species is characterized in that at least one selected from the group consisting of hydrogen peroxide, superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, hydrogen peroxide, and nitric oxide (NO).
  • a method for growing and isolating cells wherein the cells are fibroblasts.
  • a method for growing and isolating cells wherein the cells are human dermal fibroblasts.
  • a method for growing and separating cells wherein the gel support is a fibrin gel support or a hydrogel support.
  • the light irradiation in step (a) provides a method for growing and separating cells, wherein the light energy is irradiated at 0.01 mW/cm2 to 0.2 mW/cm2 for 5 minutes to 1 hour. .
  • a method for growing and separating cells wherein the light irradiation in step (f) is irradiated with light energy of 1 mW/cm2 to 50 mW/cm2.
  • the photosensitive polymer film and all-in-one according to the present invention According to the cell control method, the entire process of cell culture, growth promotion, cell sheet separation and delivery can be achieved in one photosensitive polymer film with only a difference in light energy density and irradiation time under a photosensitive polymer film containing the same photosensitizer. has.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the entire process of an all-in-one cell control technique using a photosensitive polymer film and optical energy irradiation equipment in the infrared wavelength range.
  • the all-in-one cell control technique according to the present invention can achieve cell proliferation and cell sheet separation in one light-sensitive polymer film by controlling only the irradiation amount and irradiation time of light energy.
  • Figure 2 shows the results of confirming the concentration of active oxygen generation according to changes in light energy density and irradiation time in the photosensitive polymer film.
  • this graph confirms that the amount of active oxygen generated increases as light energy density and irradiation time increase in the same type of photosensitive polymer film.
  • the DPBF degradation of high power density in Figure 2 shows the results of investigation at 20mW/cm2.
  • Figure 3 shows the results of comparing cell proliferation rates before and after light energy irradiation. That is, after culturing human dermal fibroblasts on a photosensitive polymer film and irradiating mW/cm2 light energy for 30 minutes, the cell proliferation rate was checked for 5 days before and after irradiation. As a result, cell proliferation was promoted after irradiation with light energy. It was confirmed that it was induced.
  • Figure 4 shows the results confirming cell separation in the photosensitive polymer film before and after irradiation with light energy. That is, after culturing human dermal fibroblasts on a photosensitive polymer film to induce cell sheet formation, when irradiating 10-20 mW/cm2 of light energy, cells are separated from the film and the proportion of cells attached to the film increases. It was confirmed that it was lowered.
  • Figure 5 shows the results of confirming the cell transfer effect and cell survival to the hydrogel support using the cell sheet separation technique. That is, using the cell sheet separation conditions, the photosensitive polymer film with the cultured cell sheet was transferred to the hydrogel support, and it was confirmed that the cell sheet could be separated from the film and transferred to the hydrogel when irradiated with light energy.
  • green fluorescence indicates viable cells, meaning that the cells were delivered without damage.
  • Figure 6 shows that a photosensitive polymer film made of polyurethane polymer has an elastic and porous structure, so when a high concentration of hematoporphyrin photosensitizer is introduced, 10 ⁇ g/cm2 of the photosensitizer is released from the film. This result confirms that about 7.5% is emitted in the case of 20 ⁇ g/cm2 and about 54.4% in the case of 20 ⁇ g/cm2.
  • Figure 7 shows that when a high concentration of hematoporphyrin photosensitizer is introduced into the photosensitive polymer film made of polyurethane polymer used in the present invention, the photosensitizer from the film is about 2.87 at 10 ⁇ g/cm2. %, in the case of 50 ⁇ g/cm2, it was confirmed that about 5.46% was emitted.
  • Figure 8 shows that when the minimum amount of light that can be uniformly irradiated with a light energy irradiation device is irradiated on the light-sensitive polymer film previously used for cell sheet separation, cell destruction due to excessive generation of reactive oxygen species does not occur and the cells are destroyed. This result shows that it is difficult to maintain the minimum amount of light that can achieve a low level of active oxygen generation that can only affect proliferation.
  • the amount of active oxygen generated when light energy was irradiated to the photosensitive polymer film prepared by the method of Preparation Example 1 was measured using DPBF (1,3-diphenylisobenzofuran). Since DPBF (1,3-diphenylisobenzofuran) is decomposed by active oxygen, the amount of active oxygen generated by light energy irradiation can be confirmed by measuring the degree of decomposition of DPBF by measuring the absorbance of DPBF at a wavelength of 411 nm. After the film is sufficiently submerged in the DPBF solution ( 1.85 The absorbance was measured using a UV-Vis spectrophotometer. As a result of the experiment, it was confirmed that the amount of active oxygen generated increased as light energy density and irradiation time increased in the same type of photosensitive polymer film, which is shown in Figure 2.
  • Photodynamic therapy increases the concentration of reactive oxygen species by infiltrating a photosensitizer into target cells to absorb photons of a specific wavelength and transfer excitation energy to oxygen molecules present within the cells.
  • concentration of reactive oxygen species rises above the threshold, irreversible cell death is induced. That is, human dermal fibroblasts were cultured on the photosensitive polymer film prepared in Preparation Example 1, irradiated with light energy of 0.05 mW/cm2 for 30 minutes, and cell proliferation rate was checked for 5 days before and after irradiation. It was confirmed that irradiating 0.05 mW/cm2 of light energy for 30 minutes did not induce irreversible cell death but promoted cell proliferation. This is shown in Figure 3.
  • a hydrogel scaffold was produced using fibrin gel, which does not change physical properties depending on temperature.
  • fibrin gel was prepared by first mixing 10 mg/ml of fibrinogen and 50 units/ml of thrombin, and coagulating the mixture at 37°C for 1 hour.
  • the light energy was irradiated with a light energy generating device at a light quantity of 10 to 20 mW/cm2 for 1 to 5 minutes. After 1 hour of light irradiation, the degree of adhesion of cells to the photosensitive polymer film and fibrin gel and the survival status of cells separated by generation of active oxygen were confirmed using a cell death assay (live/dead cell assay).
  • Cell death analysis is a method of checking cell survival using two fluorescent probes. Living cells are stained with green fluorescence by calcein AM, and dead cells are stained with green fluorescence by EthD-1 (ethidium homodimer-1). This is a method of staining with red fluorescence.
  • a dissolution test was conducted to measure the degree of dissolution of Hp introduced from the photosensitive polymer film prepared by the method of Preparation Example 1.
  • DPBS Dynamic Phosphate Buffered Saline
  • the film was shaken at a vibration speed of 50 rpm in a constant temperature water bath at 37°C to induce elution of Hp from the film for each hour.
  • Hp eluted with DPBS was re-dissolved by adding 1 ml of pure ethanol (Absolute ethanol), and the fluorescence spectrum of Hp was measured using a UV-Vis spectrophotometer.
  • a film with a photosensitizer concentration of 10 ⁇ g/cm2 or more is required, and the photosensitive polymer film manufacturing method of the present invention Unlike conventional films, polyurethane films do not have the photosensitizer fixed in the film and a significant amount is eluted, which can cause side effects such as cell death due to differences in the concentration of the photosensitizer, and generate a uniform amount of reactive oxygen species. This has a difficult drawback.
  • a comparative test was conducted to determine whether cell proliferation was promoted when the photo-functional polymer film for cell separation was irradiated with light energy levels to promote cell proliferation.
  • the amount of active oxygen generated when light energy was irradiated to a photofunctional polymer film for cell separation was measured using DPBF (1,3-diphenylisobenzofuran). Since DPBF (1,3-diphenylisobenzofuran) is decomposed by active oxygen, the amount of active oxygen generated by light energy irradiation can be confirmed by measuring the degree of decomposition of DPBF by measuring the absorbance of DPBF at a wavelength of 411 nm. After the film is sufficiently submerged in the DPBF solution ( 1.85 The absorbance was measured using a UV-Vis spectrophotometer.
  • the photosensitive polymer film for cell proliferation and the photosensitive polymer film for cell sheet separation each have differences in the type and concentration of the photosensitizer, so cell proliferation in one photosensitive polymer film
  • in one photosensitive polymer film It was confirmed that all processes of cell culture, growth promotion, cell sheet separation and transfer can be performed at once by controlling only the density and irradiation time of light energy, which can be accomplished with low cost, simple procedures, and short time required. .

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Abstract

본 발명은 고분자 물질과 광감응제를 포함하는 광감음성 고분자 필름 제조방법과 상기 광감응성 고분자 필름에 광조사하는 단계를 포함하는 세포의 증식 촉진 방법 및 세포 분리 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 광감응성 고분자 필름은 하나의 광감응성 고분자 필름에서 세포 배양, 성장 촉진, 세포시트 분리 및 전달의 모든 과정이 광에너지의 밀도와 조사 시간만 조절함에 따라 한 번에 이루어짐으로써 낮은 비용과 간단한 절차, 적은 소요 시간에 따라 이루어 질 수 있다.

Description

세포 배양, 성장 촉진, 세포시트 분리 및 전달의 전 과정이 가능한 광감응성 고분자 필름 기반의 올인원 세포제어 기법
본 발명은 고분자 물질과 광감응제를 포함하는 광감음성 고분자 필름 제조방법과 상기 광감응성 고분자 필름에 광조사하는 단계를 포함하는 세포의 증식 촉진 방법 및 세포 분리 방법에 관한 것이다.
광감응제란 광에너지 조사에 의해 활성산소(Reactive oxygen species, ROS)를 발생시키는 물질을 말한다. 활성산소는 세포 분리를 유도하는 분자 기전의 초기 단계에 중요한 역할을 하므로, 최근 광감응제를 이용한 세포 분리의 가능성이 제시되고 있다. 세포 배양의 지지체로 많이 사용되는 고분자로부터의 세포 시트 분리 방법에 있어서 온도감응형 세포 배양 지지체 및 이를 이용한 세포 시트 분리에 관한 기술은 개시되어 있으나, 광감응형 세포 시트 분리 기술 개발은 아직 미비한 실정이다.
활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 과산화수소(H2O2), 슈퍼옥사이드(O2 -), 하이드록실라디칼(OH · ), 1중항 산소(1O2)와 같은 반응성이 큰 이온 또는 분자를 총칭하는 용어이다. 활성산소종은 산소의 정상적인 대사작용에 의해서 자연스럽게 생기며, 세포신호와 항상성에 중요한 역할을 한다. 활성산소종의 농도는 자외선이나 높은 열에 노출되는 것처럼 환경적인 스트레스로 인하여 매우 빠르게 증가할 수 있다.
즉, 활성산소종은 생물학적 기능에 있어서 필수적인 역할을 하는 물질로서, 상기 활성산소종은 단백질, 전사인자 및 유전자에 직접 작용하여 이들의 구조를 변화시키거나 또는 이들의 기능을 조절함으로써 다수의 신호전달 경로를 조절한다. 또한 일정량의 활성산소종 증가는 세포의 증식을 촉진할 수 있으나, 과량의 활성산소종은 지질, 단백질 및 DNA를 산화적으로 손상시키는 원인이 될 수 있다.
한편, PDT('광역학처리' 또는 '광역학치료')란 광감응제(혹은 '광민감제' 또는 '광감각제'라고도 함)로 알려진 비독성 약물 또는 염료를 암을 포함하는 병변을 가진 환자에게 전신적 또는 국소적으로 투여하는 것으로 정의할 수 있다. 그리하여 빛과 광감응제의 상호작용에 의해 에너지 전달이 일어나면서 국소적인 화학적 효과가 발생된다. 이러한 PDT에 관련된 종래 기술은 활성산소종을 통해 특정 부위의 세포를 사멸시키는 기술이 있었다. 하지만, 이러한 종래 기술은 활성산소종을 통해 세포를 사멸시키는데 연구의 초점이 맞추어져 있었을 뿐, 활성산소종을 통해 세포를 증식시키는 것에 관하여는 현재 연구가 미진한 실정이다.
또한 상기 세포 성장을 촉진시키는 단계와 세포시트 분리 단계는 필요한 광감응제의 양, 광조사 에너지의 수준에 차이가 있어서 각각 별도의 단계로 이루어질 수 있을 뿐, 동일한 광감응제의 양 하에서 광에너지 밀도와 조사 시간의 차이만으로 세포 성장 촉진 및 세포시트 분리와 전달이 모두 가능한 기술 개발은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 고분자 물질과 광감응제를 포함하는 광감음성 고분자 필름 제조방법과 상기 광감응성 고분자 필름에 광조사하는 단계를 포함하는 세포 성장 촉진 및 세포시트 분리와 전달이 모두 가능한 올인원 세포제어 기법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구체예에서 세포 시트(cell sheet)란, 독립된 단일 세포(single cell)와 구별되는 개념으로서, 단일 세포들이 모여 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM)을 공유하며 서로 연결됨으로써 단층 또는 중층의 세포층을 이루고 있는 상태를 의미한다. 체외 배양시 한정된 공간 안에서 세포의 밀집도가 높아져 세포층을 이루는 경우에도, 트립신 등의 화학적 또는 물리학적 기질 분해로 인해 세포층의 상태가 다시 독립된 단일 세포로 전환된다면 세포 시트의 상태를 유지하였다고 정의하기 어렵다. 본 발명에 있어서 세포 시트란, 섬유아세포(fibroblast), 바람직하게는 피부 유래의 섬유아세포(Human neonatal dermal fibroblast)로 구성된 세포층을 의미하나, 여기에 피부각질세포(adult normal human epidermal keratinocyte)로 구성된 단층의 세포층을 중첩하여 다중층 형태의 복합 세포 시트를 제조하는 것도 가능하다.
본 발명에서 상기 세포 시트는 화장품 또는 화장품을 테스트하는 데에 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 광감응제(Photosensitivie materials)란, 가시광선 등의 광에너지에 의해 분자 상태를 변화시키는 물질을 총칭하는 것으로서, 본 명세서에 있어서 광감응제란 광에너지 조사에 의해 활성산소(Reactive oxygen species, ROS)를 발생시키는 물질을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서 사용된 광감응제는 헤마토포피린(Hematoporphyrin, Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)이며 바람직하게는 클로린 e6(hlorin e6)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 광감응제가 광에너지에 의해 자극되어 발생시키는 활성산소는 세포 분리를 유도하는 분자 기전의 초기 단계에 중요한 역할을 하므로, 이를 이용하여 세포 분리를 유도할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, (a) 고분자 물질과 광감응제를 용매에 용해시켜 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 용액을 스핀코팅(spin-coating) 방식으로 넓게 펼치는 단계;를 포함하는 광감응성 고분자 필름 제조방법을 제공한다.
상기 스핀코팅(spin-coating) 방식이란 얇고 균일한 층을 제작하기 위해 미세 전자 산업에서 널리 사용되는 기법으로, 유체를 기판 위에 올려놓고 고 속으로 회전시키면서 원심력에 의해 유체를 넓게 펼치는 방식을 말하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매는 용제라고도 불리는 것으로 어떤 물질을 녹여 용액으로 만들 때 쓰이는 물질을 말한다. 용매는 용액의 매체가 되어 용질을 녹이는 물질로, 주로 액체나 기체상을 띤다. 예를 들어 액체에 물질을 녹여 용액을 만들 때나 액체에 액체가 녹아들어가는 경우에 그 양이 많은 쪽의 액체를 용매라고 하며, 용액 중에서 용매는 용질에 비해 용액을 구성하는 비율이 높다. 본 발명에서 용매는 극성 용매인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세트산, 글리세린, 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 에틸 아세테이트, DMSO, DMF, 아세토나이트릴, 피리딘, 플루오르알콜로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol, HFIP)이나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 고분자물질에 도입되는 광감응제의 농도를 조절하면, 혈관구성세포의 증식을 가능하게 하는 적절한 양의 활성산소종 생성을 유도하여 혈관구성세포의 증식을 촉진시키게 된다. 결국, 이러한 고분자물질에 광감응제가 도입된 상기 광감응성 고분자 필름은 광조사시 혈관구성세포를 증식시키기 위한 적절한 양의 활성산소종 생성을 가능하게 하는 고분자 필름인 것이다. 또한 상기 혈관구성세포를 증식시키기 위한 적절한 양의 활성산소종은 저농도로 생성되는 것이다.
한편, 상기 광감응성 고분자 필름은 적절한 수준의 광조사시 혈관구성세포의 증식 촉진을 가능하게 할 정도의 활성산소종 생성을 가능하게 하는데, 이러한 경우 상기 광감응제는 0.01~10㎍/㎠ 농도인 것이 바람직하다. 상기 광감응제가 상기 농도로 도입되지 않으면 혈관구성세포의 증식을 촉진할 수 있는 정도로 저농도의 활성산소종을 생성할 수 없어 바람직하지 않다.
한편, 상기 혈관구성세포는 인공혈관의 이식에 사용될 수 있는 것이라면 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 혈관내피세포, 혈관평활근세포, 섬유아세포(fibroblast) 등이 이에 해당할 수 있으며, 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 더욱 바람직하게는 혈관내피세포일 수 있다.
한편, 상기 고분자 필름은 광감응제가 도입되어 활성산소종을 생성하는 것을 가능하게 하는 것이라면 특별한 제한 없이 모두 이에 포함될 수 있으나, 본 발명에 적절한 고분자 필름은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 상기 광감응제는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 본 발명에 적절한 광감응제는 바람직하게는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 활성산소종은 적절한 양으로 생성되어 혈관구성세포의 증식을 가능하게 하는 것으로서 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 지지체란, 세포가 부착되어 배양될 수 있는 기반이 되는 재료를 의미하며, 바람직하게는 피브린 겔 지지체 또는 하이드로 젤 지지체일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 광감응성 고분자 지지체란 광감응제가 도입된 고분자 화합물로서의 지지체를 의미하며 본 발명의 목적상 광기능성 고분자 지지체는 세포 배양을 위한 지지체로서 사용될 수 있다.
본 발명에서, 접시는 직접적인 세포의 배양이 이루어질 수 있는 것이면 제한되지 않으나, 바람직하게는 O×P개의 웰을 가지는 플레이트, 디시(Dish) 또는 플라스크(Flask)인 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 페트리 디쉬(Petri dish)일 수 있다. 이때, O 및 P은 각각 2 이상의 자연수로, 바람직하게는 2 내지 64의 자연수, 더욱 바람직하게는 2 내지 32의 자연수이다. 예시적으로 6/12/24/48/96/1024 웰 플레이트가 사용되거나, 35/60/100 Ψ 디시와 같은 원형 플레이트나 T25/75 플라스크와 같은 배양플라스크가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 광감응제와 고분자 물질이 함유된 광감응성 고분자 필름을 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 고분자 물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 광감응제는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린 e6(Chlorin e6)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 클로린 e6(chlorin e6)는 0.01~10㎍/㎠ 농도인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세트산, 글리세린, 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 에틸 아세테이트, DMSO, DMF, 아세토나이트릴, 피리딘, 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol, HFIP)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상인 극성 용매인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, (a) 고분자 물질과 광감응제를 용매에 용해시켜 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 용액을 필름으로 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제조된 광감응성 고분자 필름을 플레이트에 부착하는 단계;를 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 고분자 물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 광감응제는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린 e6(Chlorin e6)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 클로린 e6(chlorin e6)는 0.01~10㎍/㎠ 농도인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세트산, 글리세린, 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 에틸 아세테이트, DMSO, DMF, 아세토나이트릴, 피리딘, 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol, HFIP)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상인 극성 용매인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, (a) 광감응제와 고분자 물질이 함유된 광감응성 고분자 필름을 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트에 광조사하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서의 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서의 활성산소종에 의해 세포의 증식이 촉진되는 단계;를 포함하는 세포의 증식 촉진방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 촉진방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 세포는 섬유아세포(fibroblast)인, 세포의 증식 촉진방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 세포는 인간 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblast)인, 세포의 증식 촉진방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 광조사는 광에너지를 0.01㎽/㎠ 내지 0.2㎽/㎠로 5분 내지 1시간 조사하는 것인, 세포의 증식 촉진방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, (a) 광감응제와 고분자 물질이 함유된 광감응성 고분자 필름을 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트에 세포를 배양하여 세포 시트를 제조하는 단계; (b) 상기 세포 시트 위에 젤 지지체를 접촉시키는 단계; (c) 상기 광감응성 고분자 필름과 상기 세포 시트에 광조사하여 활성산소종이 생성되는 단계; (d) 상기 활성산소종으로 세포 시트를 광감응성 고분자 필름으로부터 분리시키는 단계; 및 (e) 상기 분리된 세포 시트를 젤 지지체로 전달하는 단계를 포함하는, 세포 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세포 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 세포는 섬유아세포(fibroblast)인, 세포 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 세포는 인간 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblast)인, 세포 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 젤 지지체는 피브린 겔 지지체 또는 하이드로 젤 지지체인, 세포 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 광조사는 광에너지를 1㎽/㎠ 내지 50㎽/㎠로 1분 내지 20분조사하는 것인, 세포 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, (a) 광감응제와 고분자 물질이 함유된 광감응성 고분자 필름을 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트에 광조사하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서의 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서의 활성산소종에 의해 세포의 증식이 촉진되는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서의 세포의 증식을 통하여 세포 시트를 제조하는 단계; (e) 상기 세포 시트 위에 젤 지지체를 접촉시키는 단계; (f) 상기 광감응성 고분자 필름과 상기 세포 시트에 광조사하여 활성산소종이 생성되는 단계; (g) 상기 활성산소종으로 상기 세포 시트를 상기 광감응성 고분자 필름으로부터 분리시키는 단계; 및 (h) 상기 분리된 세포 시트를 상기 젤 지지체로 전달하는 단계를 포함하는, 세포의 생육 및 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세포의 생육 및 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 세포는 섬유아세포(fibroblast)인, 세포의 생육 및 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 세포는 인간 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblast)인, 세포의 생육 및 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 젤 지지체는 피브린 겔 지지체 또는 하이드로 젤 지지체인, 세포의 생육 및 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 (a) 단계에서의 광조사는 광에너지를 0.01㎽/㎠ 내지 0.2㎽/㎠로 5분 내지 1시간 조사하는 것인, 세포의 생육 및 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 (f) 단계에서의 광조사는 광에너지를 1㎽/㎠ 내지 50㎽/㎠로 조사하는 것인, 세포의 생육 및 분리 방법을 제공한다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
일정량의 활성산소종 증가는 세포의 증식을 촉진할 수 있으나, 과량의 활성산소종은 지질, 단백질 및 DNA를 산화적으로 손상시키는 원인이 될 수 있으며 활성산소종은 세포 분리를 유도하는 분자 기전의 초기 단계에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 상기 세포의 증식 단계와 세포 분리 단계에서 필요한 활성산소종의 농도에는 차이가 존재한다. 즉, 세포 성장을 촉진시키는 단계와 세포시트 분리 단계는 필요한 광감응제의 양, 광조사 에너지의 수준에 차이가 있어서 각각 별도의 단계로 이루어질 수 밖에 없는데, 본 발명에 따른 광감응성 고분자 필름과 올인원 세포제어 방법에 따르면 동일한 광감응제를 포함한 광감응성 고분자 필름 하에서 광에너지 밀도와 조사 시간의 차이만으로 세포 배양, 성장 촉진, 세포시트 분리 및 전달의 전 과정이 모두 하나의 광감응성 고분자 필름에서 가능한 효과를 가지고 있다.
도 1은 광감응성 고분자 필름과 적외선 영역 파장대의 광에너지 조사 장비를 사용하는 올인원 세포제어 기법의 전 과정을 나타내는 모식도이다. 본 모식도에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 올인원 세포제어 기법은 광에너지의 조사량과 조사 시간만 조절함으로써, 세포 증식과 세포 시트 분리가 하나의 광감응성 고분자 필름에서 이루어질 수 있다.
도 2는 광감응성 고분자 필름에서 광에너지 밀도 및 조사 시간의 변화에 따른 활성산소 발생 농도를 확인한 결과이다. 즉, 동일한 타입의 광감응성 고분자 필름에서 광에너지 밀도 및 조사 시간의 증가에 따라 활성산소의 발생량이 증가하는 것을 확인한 그래프이다. 특히 도2의 high power density의 DPBF degradation은 20mW/cm2로 조사한 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 광에너지 조사 전/후 세포 증식율을 비교한 결과이다. 즉, 광감응성 고분자 필름 위에서 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblasts)를 배양하며 ㎽/㎠의 광에너지를 30분간 조사한 후, 조사 전과 조사 후 5일간 세포 증식율을 확인한 결과 광에너지 조사 후 세포 증식이 촉진되고 유도됨을 확인하였다.
도 4는 광에너지 조사 전/후 광감응성 고분자 필름에서 세포 분리를 확인한 결과이다. 즉, 광감응성 고분자 필름에서 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblasts)를 배양하여 세포시트 형성 유도 후 10-20㎽/㎠의 광에너지 조사 시 필름으로부터 세포가 분리되어 필름 위 부착되어 있는 세포의 비율이 낮아짐을 확인하였다.
도 5는 세포시트 분리 기법을 이용한 하이드로 젤 지지체로의 세포 전달 효과 및 세포 생존 확인한 결과이다. 즉, 세포시트 분리 조건을 이용하여 세포시트가 배양된 광감응성 고분자 필름을 하이드로 젤 지지체로 옮겨 광에너지 조사 시 세포시트가 필름으로부터 분리되어 하이드로 젤로 전달이 가능함을 확인하였다. 도 5에서 녹색 형광은 생존 세포를 표지하는 것으로 세포 손상 없이 전달된 것을 의미한다.
도 6은 폴리우레탄(polyurethane) 고분자로 제작한 광감응성 고분자 필름은 신축성 있고 다공성 구조를 가지고 있어 고농도의 헤마토포르피린(hematoporphyrin) 광감응제를 도입했을 때, 필름으로부터 광감응제가 10㎍/㎠의 경우 약 7.5%, 20㎍/㎠의 경우 약 54.4%가 방출되는 것을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에서 사용한 폴리케톤(polyurethane) 고분자로 제작한 광감응성 고분자 필름은 고농도의 헤마토포르피린(hematoporphyrin) 광감응제를 도입했을 때, 필름으로부터 광감응제가 10㎍/㎠의 경우 약 2.87%, 50㎍/㎠의 경우 약 5.46%가 방출되는 것을 확인한 결과이다.
도 8은 기존에 세포시트 분리를 위해 사용된 광감응성 고분자 필름에 광에너지 조사 장비로 균일하게 조사할 수 있는 최소 광량을 조사했을 때, 과도한 활성산소종의 발생으로 인한 세포 파괴가 발생하지 않고 세포 증식 촉진에만 영향을 줄 수 있는 낮은 수준의 활성산소 발생량을 얻을 수 있는 최소 광량을 유지하기 어렵다는 것을 보여주는 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 광감응성 고분자 필름의 제조
0.1-2㎍/㎠ 농도의 클로린 e6(chlorin e6) 광감응제를 이용하여 광감응성 고분자 필름을 제조하고자 하였다. 구체적으로, 펠렛 형태의 폴리케톤(polyketone, PK)고분자와, 특히 1㎍/㎠ 농도의 클로린 e6(chlorin e6) 광감응제를 HFIP(hexafluoroisopropanol(1,1,1,3,3,3,-Hexafluoro-2-propanol)) 용제에 용해시켜 얻은 용액을 리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethyleneterephthalate, PET) 고분자 필름 위에 일정량 분주하여 3000rpm의 회전속도로 약 40초에서 60초 동안 스핀코팅(spin coating)하는 방식으로 광감응성 고분자 필름을 제작하였다.
실시예 1. 광감응성 고분자 필름에서의 활성산소 발생 여부 확인
상기 제조예 1의 방법으로 제조된 광감응성 고분자 필름에 광에너지를 조사하였을 때 발생하는 활성산소의 양을 DPBF(1,3-diphenylisobenzofuran)를 이용하여 측정하였다. DPBF(1,3-diphenylisobenzofuran)는 활성산소에 의해 분해되므로, DPBF의 분해 정도를 411nm 파장에 대한 DPBF의 흡광도로 측정함으로써 광에너지 조사에 의해 발생된 활성산소의 양을 확인할 수 있다. DPBF 용액(1.85 X 10-5 M)에 필름이 충분히 잠기도록 넣은 후, 자체 제작한 녹색광 LED(Green LED) 장비로 50 ㎽/㎠의 광에너지를 조사하여 5분 간격으로 위 용액을 회수하여 DPBF의 흡광도를 UV-Vis 분광광도계로 측정하였다. 실험결과 동일한 타입의 광감응성 고분자 필름에서 광에너지 밀도 및 조사 시간의 증가에 따라 활성산소의 발생량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 이는 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 활성산소 발생에 따른 세포 성장 촉진 확인
PDT에 의한 세포증식 유도를 MTT 분석에 의해 평가하였다. 광역학요법은 광감응제를 표적세포에 침투시켜 특정 파장의 광자를 흡수하고 세포내에 존재하는 산소분자에 여기에너지를 전달하도록 함으로써 활성산소종의 농도를 높이는 것이다. 활성산소종 농도가 임계값 이상으로 올라가면 비가역적인 세포사멸이 유도된다. 즉, 상기 제조예 1에서 제조한 광감응성 고분자 필름 위에서 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblasts)를 배양하며 0.05㎽/㎠의 광에너지를 30분간 조사한 후, 조사 전과 조사 후 5일간 세포 증식율을 확인한 결과 0.05㎽/㎠의 광에너지를 30분간 조사시 비가역적인 세포사멸이 유도되는 것이 아니라 세포 증식이 촉진됨을 확인하였다. 이는 도 3에 나타내었다.
실시예 3. 활성산소 발생에 따른 세포 분리 여부 확인
상기 제조예 1의 방법으로 제조된 광감응성 고분자 필름 1.8 ㎠ 면적 당 5 X 104 개의 피부유래 섬유아세포를 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후에는, 광에너지 발현 장치로 녹색광을 조사하였고, 이 때의 조사광량과 조사 시간에 따른 세포의 변화를 MTT 시험법으로 분석하였다. 예비실험을 통하여 조사광량이 50 ㎽/㎠을 초과할 경우 세포들이 회복 불가능한 손상을 입는다는 것과, 20 ㎽/㎠의 광량을 10분 이상 조사할 경우 광에너지 발현 장치로부터 발생한 고열이 세포에 영향을 준다는 것을 확인하였으므로, 본 실시예에서의 광에너지 조사는 10~20 ㎽/㎠의 광량을 10분 이내로 조사하는 것으로 하였다. 구체적으로 1회 실험에서는 10㎽/㎠의 광량을 5분간 조사하였고, 2회 실험에서는 20㎽/㎠의 광량을 또한 5분간 조사하여 세포시트가 분리되는지 확인하였다. 실험결과 2회 실험에서 모두 세포 분리가 일어남으로 인하여, MTT 시험법을 통한 측정값이 감소하였는 바 광에너지 조사시 세포가 분리되어 필름 위 부착되어 있는 세포의 비율이 낮아지는 것을 확인하였다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다.
제조예 2. 하이드로젤 지지체 제조
고분자 필름으로부터 피부 유래 단일세포층을 전달할 수 있는 광감응성 세포전달시스템을 개발하기 위해, 온도에 따른 물성의 변화가 없는 피브린 젤(Fibrin gel)을 이용하여 하이드로젤 지지체(Hydrogel)를 제작하였다. 이를 위해, 먼저 10 ㎎/㎖의 피브리노겐(Fibrinogen)과 50 units/㎖의 트롬빈(Thrombon)을 혼합하였고, 혼합액을 37℃에서 1시간 동안 응고시켜는 방법으로 피브린 젤을 제조하였다.
실시예 4. 광감응성 고분자 필름에서 젤 지지체로 세포 전달 여부 확인
상기 제조예 1의 방법으로 제조된 광감응성 고분자 필름 1.1 ㎠ 면적 당 5 X 104 개의 피부유래 섬유아세포를 접종하고, 24시간 동안 배양한 후, 필름에 부착되어 있는 세포층을 피브린 젤과 접촉하도록 위치시키고 광에너지 발현장치로 광에너지 조사는 10~20 ㎽/㎠의 광량을 1분내지 5분간 조사하였다. 광량 조사 1시간 후에 광감응성 고분자 필름 과 피브린 젤에서의 세포의 부착 정도와 활성산소 발생에 의해 분리된 세포의 생존 상태를 세포사 분석법(live/dead cell assay)으로 확인하였다. 세포사 분석법은 두 가지 형광 프로브를 사용하여 세포의 생존여부를 확인하는 방법으로, 살아있는 세포는 칼세인 AM(calcein AM)에 의해 녹색 형광으로 염색되고, 죽은 세포는 EthD-1(ethidium homodimer-1)에 의해 적색 형광으로 염색되는 방법이다. 실험 결과, 광에너지를 조사하지 않은 경우와 비교하여 10~20 ㎽/㎠의 광량을 조사한 경우에서 더 많은 세포가 광기능성 고분자 필름으로부터 피브린 젤 지지체로 손상없이 전달된 것을 관찰하였다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다.
비교예 1. 광감응성 고분자 필름의 광감응제 용출 시험
상기 제조예 1의 방법으로 제조된 광감응성 고분자 필름으로부터 도입된 Hp의 용출 정도를 측정하기 위하여 용출시험을 실시하였다. 0.5 ㎖의 DPBS (Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline) 용액에 필름이 충분히 잠기도록 넣은 후, 37℃ 항온수조에서 50 rpm의 진동속도로 흔들어 주면서 각 시간별로 필름으로부터 Hp의 용출을 유도하였다. 그 다음 용출용액에서 필름을 제거한 후 DPBS로 용출된 Hp를 1 ㎖의 순수 에탄올(Absolute ethanol)을 첨가하여 재용해 시켜 Hp의 형광스펙트럼을 UV-Vis 분광광도계(UV-Vis spectrophotometer)로 측정하였다.
70시간 이상의 용출시험 결과, 신축성 있고 다공성 구조를 가지고 있어 고농도의 헤마토포르피린(hematoporphyrin) 광감응제를 도입했을 때, 필름으로부터 광감응제가 10㎍/㎠의 경우 약 7.5%, 20㎍/㎠의 경우 약 54.4%가 방출되는 것을 확인하였으며, 본 발명에서 사용한 폴리케톤(polyurethane) 고분자로 제작한 광감응성 고분자 필름은 고농도의 헤마토포르피린(hematoporphyrin) 광감응제를 도입했을 때, 필름으로부터 광감응제가 10㎍/㎠의 경우 약 2.87%, 50㎍/㎠의 경우 약 5.46%가 방출되는 것을 확인하였다. 이는 도 6 및 7에 나타내었다. 즉, 헤마토포르피린(hematoporphyrin) 광감응제와 초록 빛(green light) 사용을 통해 세포 시트를 분리하기 위해서는 광감응제 농도가 10㎍/㎠ 이상의 필름이 요구되는데, 본 발명인 광감응성 고분자 필름 제조방법 따른 필름과 달리 폴리우레탄 필름은 필름 안에 광감응제가 고정되어 있지 못하고 상당한 양이 용출되기 때문에 이로 인한 광감응제 농도 차이에 따른 세포 사멸 등 부작용을 야기할 수 있으며, 균일한 양의 활성산소종 발생이 어려운 단점이 있다.
비교예 2. 광감응성 고분자 필름의 세포증식 비교 실험
세포 분리를 위한 광기능성 고분자 필름에 세포 증식 촉진을 위한 광에너지 수준을 조사하는 경우에 세포 증식 촉진이 일어나는지 비교 시험을 진행하였다.
즉, 세포 분리를 위한 광기능성 고분자 필름에 광에너지를 조사하였을 때 발생하는 활성산소의 양을 DPBF(1,3-diphenylisobenzofuran)를 이용하여 측정하였다. DPBF(1,3-diphenylisobenzofuran)는 활성산소에 의해 분해되므로, DPBF의 분해 정도를 411nm 파장에 대한 DPBF의 흡광도로 측정함으로써 광에너지 조사에 의해 발생된 활성산소의 양을 확인할 수 있다. DPBF 용액(1.85 X 10-5 M)에 필름이 충분히 잠기도록 넣은 후, 자체 제작한 녹색광 LED(Green LED) 장비로 50 ㎽/㎠의 광에너지를 조사하여 5분 간격으로 위 용액을 회수하여 DPBF의 흡광도를 UV-Vis 분광광도계로 측정하였다.
실험 결과 세포증식 촉진을 유도하기 위해서는 최소한 30분의 광에너지를 조사해야 하는데, 세포시트 분리에 사용한 광기능성 고분자 필름에 광에너지 조사 장비로 균일하게 조사할 수 있는 최소 광량을 조사하였다. 그 결과 도 8에서 보여주는 것처럼 광에너지가 너무 작아 세포증식촉진에 영향을 준 낮은 레벨의 활성산소 발생량을 맞추기 어려워 세포증식 촉진 연구에 적용하기 어렵다는 것을 확인할 수 있었다.
결론
상기 실시예 및 비교예에 따를 때, 세포 증식을 위한 광감응성 고분자 필름과 세포 시트 분리를 위한 광감응성 고분자 필름은 각각 광감응제의 종류와 농도에 차이가 있어 하나의 광감응성 고분자 필름에서 세포 증식과 세포 시트 분리가 이루어지지 못하고, 별도의 광감응성 고분자 필름에서 각 단계가 별도로 이루어짐에 따라 고비용과 복잡한 절차, 긴 소요 시간이 필요한 문제가 있는데 비하여 본원발명에 따를 때, 하나의 광감응성 고분자 필름에서 세포 배양, 성장 촉진, 세포시트 분리 및 전달의 모든 과정이 광에너지의 밀도와 조사 시간만 조절함에 따라 한 번에 이루어짐으로써 낮은 비용과 간단한 절차, 적은 소요 시간에 따라 이루어 질 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (28)

  1. 광감응제와 고분자 물질이 함유된 광감응성 고분자 필름을 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 광감응제는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린 e6(Chlorin e6)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 클로린 e6(chlorin e6)는 0.01~10㎍/㎠ 농도인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세트산, 글리세린, 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 에틸 아세테이트, DMSO, DMF, 아세토나이트릴, 피리딘, 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol, HFIP)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상인 극성 용매인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트.
  6. (a) 고분자 물질과 광감응제를 용매에 용해시켜 용액을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 용액을 필름으로 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 제조된 광감응성 고분자 필름을 플레이트에 부착하는 단계;
    를 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 고분자 물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 광감응제는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린 e6(Chlorin e6)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 클로린 e6(chlorin e6)는 0.01~10㎍/㎠ 농도인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세트산, 글리세린, 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 에틸 아세테이트, DMSO, DMF, 아세토나이트릴, 피리딘, 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol, HFIP)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상인 극성 용매인, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트의 제조방법.
  11. (a) 광감응제와 고분자 물질이 함유된 광감응성 고분자 필름을 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트에 광조사하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서의 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서의 활성산소종에 의해 세포의 증식이 촉진되는 단계;를 포함하는 세포의 증식 촉진방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 촉진방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 세포는 섬유아세포(fibroblast)인, 세포의 증식 촉진방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 세포는 인간 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblast)인, 세포의 증식 촉진방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 광조사는 광에너지를 0.01㎽/㎠ 내지 0.2㎽/㎠로 5분 내지 1시간 조사하는 것인, 세포의 증식 촉진방법.
  16. (a) 광감응제와 고분자 물질이 함유된 광감응성 고분자 필름을 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트에 세포를 배양하여 세포 시트를 제조하는 단계;
    (b) 상기 세포 시트 위에 젤 지지체를 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 광감응성 고분자 필름과 상기 세포 시트에 광조사하여 활성산소종이 생성되는 단계;
    (d) 상기 활성산소종으로 세포 시트를 광감응성 고분자 필름으로부터 분리시키는 단계; 및
    (e) 상기 분리된 세포 시트를 젤 지지체로 전달하는 단계를 포함하는, 세포 분리 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세포 분리 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 세포는 섬유아세포(fibroblast)인, 세포 분리 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 세포는 인간 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblast)인, 세포 분리 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 젤 지지체는 피브린 겔 지지체 또는 하이드로 젤 지지체인, 세포 분리 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 광조사는 광에너지를 1㎽/㎠ 내지 50㎽/㎠로 1분 내지 20분 조사하는 것인, 세포 분리 방법.
  22. (a) 광감응제와 고분자 물질이 함유된 광감응성 고분자 필름을 포함하는, 세포의 생육용 또는 분리용 플레이트에 광조사하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서의 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서의 활성산소종에 의해 세포의 증식이 촉진되는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서의 세포의 증식을 통하여 세포 시트를 제조하는 단계;
    (e) 상기 세포 시트 위에 젤 지지체를 접촉시키는 단계;
    (f) 상기 광감응성 고분자 필름과 상기 세포 시트에 광조사하여 활성산소종이 생성되는 단계;
    (g) 상기 활성산소종으로 상기 세포 시트를 상기 광감응성 고분자 필름으로부터 분리시키는 단계; 및
    (h) 상기 분리된 세포 시트를 상기 젤 지지체로 전달하는 단계를 포함하는, 세포의 생육 및 분리 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세포의 생육 및 분리 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 세포는 섬유아세포(fibroblast)인, 세포의 생육 및 분리 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 세포는 인간 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblast)인, 세포의 생육 및 분리 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 젤 지지체는 피브린 겔 지지체 또는 하이드로 젤 지지체인, 세포의 생육 및 분리 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 광조사는 광에너지를 0.01㎽/㎠ 내지 0.2㎽/㎠로 5분 내지 1시간 조사하는 것인, 세포의 생육 및 분리 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 (f) 단계에서의 광조사는 광에너지를 1㎽/㎠ 내지 50㎽/㎠로 조사하는 것인, 세포의 생육 및 분리 방법.
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