KR20160106255A - 광감응제가 도입된 고분자 담체 및 이를 이용한 혈관구성세포의 증식 촉진방법 - Google Patents

광감응제가 도입된 고분자 담체 및 이를 이용한 혈관구성세포의 증식 촉진방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광감응제가 도입된 고분자 담체 및 이를 이용한 혈관구성세포의 증식 촉진방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 고분자 담체는 고분자물질에 광감응제가 도입된 것으로서, 광조사에 의해 활성산소종을 생성하는 것이 가능하다. 이러한 본 발명은 약물 형태의 광감응제를 세포에 직접적으로 투여하여 세포내 활성산소종의 형성을 자극하는 기존의 방법과는 차별성이 있다. 그리고 활성산소종의 생성량을 혈관구성세포를 증식할 수 있는 정도로 조절하는 것이 가능하여 혈관구성세포의 증식을 촉진할 수 있다. 이렇게 혈관구성세포의 증식 촉진을 조절하는 것은 인공혈관 이식의 성공률을 향상시키는 방안으로 활용될 수 있다.

Description

광감응제가 도입된 고분자 담체 및 이를 이용한 혈관구성세포의 증식 촉진방법{Photosensitizer embedded polymer carrier and a method for enhancing proliferation of vascular cell}
본 발명은 광감응제가 도입된 고분자 담체 및 이를 이용한 혈관구성세포의 증식 촉진방법에 관한 것이다.
활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 과산화수소(H2O2), 슈퍼옥사이드(O2 -), 하이드록실라디칼(OH·), 1중항 산소(1O2)와 같은 반응성이 큰 이온 또는 분자를 총칭하는 용어이다. 활성산소종은 산소의 정상적인 대사작용에 의해서 자연스럽게 생기며, 세포신호와 항상성에 중요한 역할을 한다. 활성산소종의 농도는 자외선이나 높은 열에 노출되는 것처럼 환경적인 스트레스로 인하여 매우 빠르게 증가할 수 있다.
즉, 활성산소종은 생물학적 기능에 있어서 필수적인 역할을 하는 물질로서, 상기 활성산소종은 단백질, 전사인자 및 유전자에 직접 작용하여 이들의 구조를 변화시키거나 또는 이들의 기능을 조절함으로써 다수의 신호전달경로를 조절한다. 또한 일정량의 활성산소종 증가는 세포의 증식을 촉진할 수 있으나, 과량의 활성산소종은 지질, 단백질 및 DNA를 산화적으로 손상시키는 원인이 될 수 있다.
한편, PDT(‘광역학처리’ 또는 ‘광역학치료’)란 광감응제(혹은 ‘광민감제’ 또는 ‘광감각제’라고도 함)로 알려진 비독성 약물 또는 염료를 암을 포함하는 병변을 가진 환자에게 전신적 또는 국소적으로 투여하는 것으로 정의할 수 있다. 그리하여 빛과 광감응제의 상호작용에 의해 에너지 전달이 일어나면서 국소적인 화학적 효과가 발생된다. 이러한 PDT에 관련된 종래 기술은 활성산소종을 통해 특정 부위의 세포를 사멸시키는 기술이 있었다. 하지만, 이러한 종래 기술은 활성산소종을 통해 세포를 사멸시키는데 연구의 초점이 맞추어져 있었을 뿐, 활성산소종을 통해 세포를 증식시키는 것에 관하여는 현재 연구가 미진한 실정이다.
한편, 동맥경화와 같은 혈관 질환을 가지고 있는 환자의 치료에는 인공혈관으로 그 부위를 대체하는 기술이 기존에 존재하고 있으나, 재협착과 폐색이 발생하여 상기 인공혈관의 이식 성공률이 낮다는 문제점이 있다(하기 특허문헌 1 참조).
특허문헌 1. 대한민국 등록특허 제10-0905137호
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 광감응제가 도입된 고분자 담체에 의하여 활성산소종을 생성하는 것이 목적이다. 또한 이렇게 생성된 활성산소종을 통해, 해당 조직에 유용하게 활용될 수 있는 세포의 증식을 촉진하는 것이 목적이다. 특히 상기 세포로서 구체적으로는 혈관구성세포의 증식을 촉진하는 것이 목적이다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 양태에 따른 고분자 담체는
고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어지며; 및
광조사에 의하여 활성산소종을 생성하고;
상기 활성산소종을 통해 혈관구성세포의 증식을 촉진하는 고분자 담체이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 활성산소종 생성방법은
1) 고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어진 고분자 담체에 광조사하는 단계; 및
2) 상기 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계;
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 혈관구성세포는
고분자물질에 광감응제가 도입된 고분자 담체에 광조사하고, 이로부터 생성된 활성산소종을 통해 세포의 증식이 촉진되어 이루어진 혈관구성세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 혈관구성세포의 증식 촉진방법은
1) 고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어진 고분자 담체에 광조사하는 단계;
2) 상기 1)단계에서의 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계; 및
3) 상기 2)단계에서 생성된 활성산소종에 의해 혈관구성세포의 증식이 촉진되는 단계;
를 포함한다.
본 발명에 따른 고분자 담체는 고분자물질에 광감응제가 도입된 것으로서, 광조사에 의해 활성산소종을 생성하는 것이 가능하다. 이러한 본 발명은 약물 형태의 광감응제를 세포에 직접적으로 투여하여 세포내 활성산소종의 형성을 자극하는 기존의 방법과는 차별성이 있다. 그리고 활성산소종의 생성량을 혈관구성세포의 증식을 촉진할 수 있는 정도로 조절하는 것이 가능하다. 이를 통해 혈관구성세포의 증식을 촉진할 수 있다. 이렇게 혈관구성세포의 증식 촉진을 조절하는 것은 인공혈관 이식의 성공률을 향상시키는 방안으로 활용될 수 있다.
도 1은 하기 실험예 1에 따라 실시예에 따른 Hp-PU 필름(고분자 담체)의 특성을 분석한 결과이다.
도 2는 하기 실험예 2 및 실험예 3을 수행한 결과이다.
도 3은 하기 실험예 4에 따라 실시예에 따른 Hp-PU 필름(고분자 담체)이 혈관내피세포의 성장을 촉진하는 것이 가능한지 확인한 결과이다.
도 4는 하기 실험예 5에 따라 PDT에 의해 유도된 세포내 활성산소종의 정량 및 하기 실험예 6에 따라 세포의 증식이 PDT에 의해 유도된 세포내 활성산소종의 적절한 증가에 의한 것임을 확인한 결과이다.
도 5는 하기 실험예 7 및 하기 실험예 8의 결과이다.
이에 본 발명자들은 광조사에 의해 활성산소종을 생성하면서 혈관구성세포의 증식을 촉진하는 것이 가능한 고분자 담체 등을 발견하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 광감응제가 도입된 고분자 담체 및 이를 이용한 혈관구성세포의 증식 촉진방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로 본 발명에 따른 고분자 담체는
고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어지며; 및
광조사에 의하여 활성산소종을 생성하고;
상기 활성산소종을 통해 혈관구성세포의 증식을 촉진하는 고분자 담체이다.
이렇게 본 발명에 따른 고분자 담체와 같이 고분자물질에 광감응제를 도입하게 되면 광조사시 산소와 상호작용하여 활성산소종을 생성하는 것이 가능하게 된다. 또한 상기 고분자물질에 도입되는 광감응제의 농도를 조절하면, 혈관구성세포의 증식을 가능하게 하는 적절한 양의 활성산소종 생성을 유도하여 혈관구성세포의 증식을 촉진시키게 된다. 결국, 이러한 고분자물질에 광감응제가 도입된 상기 고분자 담체는 광조사시 혈관구성세포를 증식시키기 위한 적절한 양의 활성산소종 생성을 가능하게 하는 고분자 담체인 것이다. 또한 상기 혈관구성세포를 증식시키기 위한 적절한 양의 활성산소종은 저농도로 생성되는 것이다.
한편, 상기 고분자 담체는 적절한 수준의 광조사시 혈관구성세포의 증식 촉진을 가능하게 할 정도의 활성산소종 생성을 가능하게 하는데, 이러한 경우 상기 고분자물질 100 중량부에 대하여 광감응제가 0.0025-0.02 중량부로 도입되는 것이 바람직하다. 상기 광감응제가 상기 농도로 도입되지 않으면 혈관구성세포의 증식을 촉진할 수 있는 정도로 저농도의 활성산소종을 생성할 수 없어 바람직하지 않다
한편, 상기 혈관구성세포는 인공혈관의 이식에 사용될 수 있는 것이라면 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 혈관내피세포, 혈관평활근세포, 섬유아세포(fibroblast) 등이 이에 해당할 수 있으며, 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 더욱 바람직하게는 혈관내피세포일 수 있다.
한편, 상기 고분자물질은 광감응제가 도입되어 활성산소종을 생성하는 것을 가능하게 하는 것이라면 특별한 제한 없이 모두 이에 포함될 수 있으나, 본 발명에 적절한 고분자물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 상기 광감응제는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 본 발명에 적절한 광감응제는 바람직하게는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 활성산소종은 적절한 양으로 생성되어 혈관구성세포의 증식을 가능하게 하는 것으로서 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 적절한 광조사의 크기는 300-1,000 ㎼/㎠인 것이 바람직한데, 상기 광조사의 크기가 300 ㎼/㎠미만일 경우에는 활성산소종의 생성량이 혈관구성세포의 증식을 촉진시키기에 충분한 양으로 생성되지 못해 바람직하지 않으며, 상기 광조사의 크기가 1000 ㎼/㎠를 초과하는 경우에는 활성산소종이 과량으로 생성되어 혈관구성세포의 증식 촉진을 유도하지 못하기 때문에 바람직하지 않다. 즉, 상기 활성산소종이 저농도의 적절한 양으로 생성되어야 광조사를 통해 혈관구성세포의 증식 촉진을 유도하게 되는데, 광조사의 크기가 상기 300-1,000 ㎼/㎠의 수치범위에 해당하는 경우에 혈관구성세포의 증식 촉진을 유도할 수 있는 정도의 적절한 양으로 활성산소종을 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 활성산소종 생성방법은
1) 고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어진 고분자 담체에 광조사하는 단계; 및
2) 상기 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계;
를 포함한다.
이때 상기 고분자 담체는 상기 고분자물질 100 중량부에 대하여 광감응제가 0.0025-0.02 중량부로 도입되는 것이 저농도의 적절한 양으로 활성산소종을 생성하는 것이 되어 바람직하다.
한편, 상기 고분자물질은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 상기 광감응제는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 활성산소종은 혈관구성세포의 증식을 가능하게 하는 것으로서 바람직하게는 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 상기 2)단계에서의 활성산소종은 상기 1)단계에서 300-1,000 ㎼/㎠광조사에 의해 생성되는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 혈관구성세포는 고분자물질에 광감응제가 도입된 고분자 담체에 광조사하고, 이로부터 생성된 활성산소종을 통해 세포의 증식이 촉진되어 이루어진 혈관구성세포이다.
한편, 상기 고분자 담체는 상기 고분자물질 100 중량부에 대하여 광감응제가 0.0025-0.02 중량부로 도입되는 것이 바람직한데, 상기 0.0025-0.02 중량부로 광감응제가 도입되는 것이 저농도의 적절한 양으로 활성산소종을 생성하게 되며, 결국에는 혈관구성세포의 증식을 촉진할 수 있어 바람직하다.
한편, 상기 혈관구성세포는 혈관을 구성하고 있는 세포라면 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 혈관내피세포일 수 있다.
한편, 상기 고분자물질은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 상기 광감응제는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 상기 활성산소종은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 상기 활성산소종은 300-1,000 ㎼/㎠ 광조사에 의해 저농도의 적절한 양으로 활성산소종을 생성할 수 있으며, 이를 통해 혈관구성세포의 증식을 유도할 수 있어 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 혈관구성세포의 증식 촉진방법은
1) 고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어진 고분자 담체에 광조사하는 단계;
2) 상기 1)단계에서의 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계; 및
3) 상기 2)단계에서 생성된 활성산소종에 의해 혈관구성세포의 증식이 촉진되는 단계;
를 포함한다.
상기 본 발명에 따른 혈관구성세포의 광조사에 의해 활성산소종의 생성을 가능하게 하면서 이를 통해 혈관구성세포의 증식을 촉진하는 방법이다. 이러한 효과는 고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어진 고분자 담체에 광조사하는 과정을 통해 달성되게 된다. 즉, 상기 고분자 담체에 광조사를 하게 되면, 상기 2)단계에서 활성산소종이 생성 되고, 이러한 활성산소종은 적절한 정도의 저농도 양으로 생성되면서 혈관구성세포의 증식을 촉진시키게 된다.
한편, 이렇게 활성산소종의 생성 및 혈관구성세포의 증식을 촉진하는 광감응제의 함량은 상기 고분자물질 100 중량부에 대하여 광감응제가 0.0025-0.02 중량부로 도입되어 이를 가능하게 한다. 즉, 상기 수치범위에 해당하는 함량으로 광감응제가 도입되어야만 저농도로 활성산소종을 생성하면서 혈관구성세포로 증식을 촉진하여 바람직하다.
한편, 상기 혈관구성세포는 혈관을 구성하고 있는 세포라면 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 바람직하게는 혈관내피세포일 수 있다.
한편, 상기 고분자물질은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 상기 광감응제는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한 상기 활성산소종은 혈관구성세포의 증식 촉진을 가능하게 하는 것으로서 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 상기 2)단계에서의 활성산소종은 상기 1)단계에서 300-1,000 ㎼/㎠ 광조사에 의해 생성되는 것이 바람직하며, 이러한 수치범위로 광조사 되어야 혈관구성세포의 증식 촉진을 가능하게 할 수 있어 바람직하다.
결국, 본 발명에 따른 고분자 담체에 적절한 양의 광조사를 수행하고, 이를 통해 저농도의 적절한 양으로 활성산소종이 생성되면, 혈관구성세포의 증식 촉진이 가능하게 된다. 그리하여 이렇게 혈관구성세포의 증식을 조절하는 것은 인공혈관 이식성공률을 향상시키는 방안으로 활용하는 것이 가능하게 한다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
<재료>
광감응제로 알려진 헤마토포피린(Hp)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 상용화된 폴리우레탄(PU)인 Carbothane® TPU는 Lubrizol(Wickliffe, OH, USA)에서 제공하였다.
< Hp 가 포함된 고분자 필름(고분자 담체 )의 제조>
고분자 혼합용액을 유리 페트리접시(직경 10 cm) 위에 용매 캐스팅하여 폴리우레탄(PU) 필름을 제조하였다. Hp-PU 필름(고분자 담체) 제조를 위한 캐스팅 용액은 클로로포름(Sigma-Aldrich)에 미리 혼합한 10 %(w/v) 폴리우레탄에 적당량의 Hp를 용해하여 제조하였다. 후드 내에서 2 일 동안 서서히 실온에서 용매를 증발시켰다. 필름을 유리 페트리 접시에서 제거한 후 원형으로 펀칭하였고, 그 후 70 % 에탄올 용액에 30 분 동안 담가 살균 처리하고 증류수로 5 회 세척하였다.
< 광역학 처리>
자체 설계한 PDT 용 녹색 발광다이오드(LED) 시스템을 광원으로 사용하였다. 510 nm 파장에서 발광피크를 갖는 녹색 LED광은 광감응제로 사용된 Hp의 가시광 영역에서의 최대 흡광 파장과 일치한다. LED 조사 시, 세포는 37 ℃로 유지되는 5 % CO2 인큐베이터 내에 보관하였다.
< Hp - PU 필름(고분자 담체 )의 특성 확인>
정상상태 흡광 및 발광 스펙트럼을 각각 UV-Vis 분광광도계(Hitachi, U-2900, Tokyo, Japan)와 분광형광계(Hitachi, F-4500, Tokyo, Japan)를 사용하여 얻었다. Hp의 고분자 매트릭스 내 분포는 공초점현미경(Carl Zeiss, LSM 700, NY, USA)을 사용하여 관찰하였다.
< Hp - PU 필름에서 생성되는 1중항 산소와 활성산소종의 검출>
1중항 산소의 생성은 1중항 산소의 탈여기 시 발생하는 인광신호에 의해 직접 측정하였다. Nd-YAG(Continuum surelite II-10, 10 Hz, 7 ns FWHM 펄스) 펌핑 파라미터 진동자(OPO) 레이저(Continuum OPO plus, 5 ns FWHM 펄스)를 여기광원으로 사용하여 시간과 파장에 따른 1중항 산소 인광을 검출하였다. 인광신호는 여기빔과 수직 방향에서 모노크로미터(Optometrics LLC, mini-chrom04)과 NIR-PMT(Hamamatsu, H10330A)를 사용하여 검출하였다. 신호는 500 MHz 디지털 오실로스코프(Agilent Technology, DS07052A)를 사용하여 얻었으며 컴퓨터를 이용하여 데이터를 분석하였다.
Hp-PU 필름으로부터 활성산소종의 생성을 확인하기 위하여, 활성산소 소거제인 1,3-디페닐-이소벤조퓨란(DPBF)을 사용하여 Hp-PU 필름을 시험하였다. DPBF(1.85×10-5 M)가 용해되어 있는 1 mL의 에탄올 용액에 Hp-PU 필름을 담근 후, 암실에서 녹색 LED를 광원으로 사용하여 Hp-PU 필름에 빛을 조사하였다. 총 광출력을 전력계(S130C, Thorlab, Inc., USA)를 사용하여 측정하였다. 조사된 LED 광의 출력은 470 ㎼/㎠이었으며 총 조사시간은 30 분이었다. 광을 조사하면서 10 분마다 411 nm에서 DPBF 흡광피크의 광학밀도(O.D.)를 UV-Vis 분광광도계(Synergy H4, BioTek, USA)를 사용하여 모니터링하였다.
<유출시험>
Hp-PU 필름으로부터 Hp가 유출되는지 확인하기 위하여, Hp-PU 필름을 37 ℃에서 500 μL의 인산완충 식염수(PBS)에 72 시간 동안 담근 후, 회수한 PBS에 에탄올(1 mL)을 가하고 UV-Vis 분광광도계(Synergy H4, BioTek, USA)로 측정하였다.
<세포배양>
Lonza(Basel, Switzerland)에서 구입한 사람의 제대정맥 혈관내피세포(HUVEC)를 보충물질(hEGF, 하이드로코르티손, GA-1000, FBS, VEGF, hFGF-B, R3-IGF-1, 아스코르브산, 헤파린; Lonza, Switzerland)이 첨가된 내피세포 기본배양액(EBM-2)으로 배양하였고, 37 ℃의 5 % CO2 인큐베이터에 보관하였다. 세포배양계대수가 10 이하인 HUVEC을 실험에 사용하였다.
<세포증식 분석>
HUVEC을 웰 당 2×104 세포의 밀도로 Hp-PU 필름 상에 도말하였다. 세포를 37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 후 녹색 LED 광원을 조사하였다. 조사 후, 시간(즉시, 1 일, 3 일)에 따른 세포의 생존능을 분석하였다. 세포를 암실에서 EGM-2 와 함께 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라조늄 브로마이드(MTT) 용액(5 mg/mL)으로 4 시간 동안 배양하였다. DMSO를 가하여 포르마잔 염을 용해시킨 후 570 nm에서 광학밀도를 측정하였다.
< 세포내 활성산소종 ( ROS ) 농도의 측정>
세포내 활성산소종 분석키트(Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 세포내 활성산소종 농도를 측정하였다. HUVEC를 웰 당 2×104 세포의 밀도로 Hp-PU 필름 상에 도말하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 형광염료인 1 mM 2,7-디클로로-디하이드로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA)를 37 ℃의 암실에서 1 시간 동안 세포배지에 가하였다. 염료용액을 제거한 후, 0.5 mL의 신선한 배지를 가하였다. 이어, 상기한 바와 같이 세포를 빛에 노출시켰다. 24 시간 후에, 세포를 PBS로 3 회 세척하고 세포용해 완충액인, 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 TE 완충액(Tris 인산염 완충액, pH 8.0, 1.0 mM EDTA 포함)으로 용해하였다. 용해물을 UV-Vis 분광광도계(Synergy H4, BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 형광을 측정하였다. 산화된 디클로로플루오레신(DCF) 생성물의 여기를 위한 여기파장은 480 nm이었고 발광 측정파장은 530 nm이었다.
< 활성산소종 소거제에 의한 세포증식의 억제>
PDT에 의해 촉진된 세포증식이 세포내 활성산소종 농도의 변화에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 자유라디칼 소거제(5 mM N-아세틸시스테인, NAC) 또는 1중항 산소 소거제(10 μM 아지드화나트륨, NaN3)로 전처리하였다. 소거제를 신선한 배지로 교체한 후 세포에 빛을 조사하였다. 세포증식은 MTT 분석에 의해 평가하였다.
<세포주기 분석>
세포를 웰 당 8×104 세포의 밀도로 12웰 플레이트 내의 Hp-PU 필름 상에 도말하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이어, 상기한 바와 같이 세포를 빛에 노출시켰다. 24 시간 후에, 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 -20 ℃에서 1 시간 동안 70 % 에탄올 내에서 고정하였다. 세포를 PBS로 3 회 세척하고 원심분리하였다. 얻어진 샘플에 RNase A(최종농도 20 U/mL, Sigma)를 37 ℃에서 30 분간 처리한다. 샘플을 암실에서 1 시간 동안 100 ㎍/mL 프로피듐 아이오다이드(PI, Sigma) 염색용액으로 처리하여 DNA를 염색하였고, 형광 하에서 세포분류기(BD FACS Verse)를 사용하여 세포주기의 분포를 분석하였다.
<아질산염의 정량>
HUVEC을 웰 당 2×104 세포의 밀도로 Hp-PU 필름 상에 도말하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 다음 빛을 조사하였다. 조사 후 즉시, 1 일 및 3 일 동안 더 배양한 다음, 배양배지 내에 축적된 아질산염을 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. 간략하게 설명하면, 50 ㎕의 상층액을 100 ㎕의 Griess 시약(5 %(v/v) 인산 내의 1 %(w/v) 설파닐아미드와 0.1 %(w/v) 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드)과 혼합하였다. 혼합액을 실온에서 10 분 동안 처리한 후, 분광형광계(Synergy H4, BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산염 표준곡선을 이용하여 아질산염의 농도를 확인하였다.
<통계분석>
모든 측정값은 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 정규분포 데이터의 평균값들의 차이는 Student t-검정에 의해 평가하였다. P < 0.05를 통계적으로 차이가 있는 것으로 간주하였다.
실험예
< 실험예 1: 헤마토포피린이 포함된 필름( Hp - PU 필름)의 특성 분석>
일정량의 헤마토포피린(Hp)을 폴리우레탄(PU) 필름에 도입시켰다(도 1A). 도 1B의 (b), (c)에서 보듯이, Hp가 고분자 매트릭스 내에 균일하게 도입되었으며 Hp-PU의 형광강도는 포함된 Hp의 농도에 비례하였다. 도 1C는 에탄올 내에서 측정한 Hp의 흡광 스펙트럼으로, 하나의 B 밴드(395 nm)와 4개의 Q 밴드(500 nm, 533 nm, 570 nm, 622 nm)가 관찰된다. Hp-PU 필름의 흡광 스펙트럼에서도 B 밴드와 Q 밴드가 비슷한 파장에서 관찰되나, 피크 위치가 약간 적색 편이 되어 있다. 이러한 피크 위치의 변화는 Hp와 고분자 매트릭스의 결합 및/또는 고분자 매트릭스 내에서 Hp 자체의 결합으로 인한 진동에너지 상태 변화 때문으로 생각된다. 도 1D는 용액 내에서 Hp의 형광 스펙트럼(λex = 510 nm)으로, 625 nm와 690 nm에서 피크가 관찰된다. Hp-PU 필름의 형광 스펙트럼 역시 고분자 매트릭스 내에 포함된 Hp 분자의 여기로 인해 유사한 적색편이를 보인다. Hp-PU 필름의 흡광 및 발광 스펙트럼의 강도는 고분자 매트릭스 내에 포함된 Hp의 농도에 비례하였다.
PU 고분자로부터의 Hp 유출을 PBS 내에서 조사하였다. PBS(pH = 7.4) 내에서 72 시간 동안 유출을 유도한 후 형광을 측정한 결과, PU 고분자로부터 유출된 Hp의 양은 1.8 %(1 ㎍/㎠ Hp-PU 필름) 및 3.3 %(2 ㎍/㎠ Hp-PU 필름)로 극히 소량이었다.
< 실험예 2: Hp - PU 필름으로부터의 1중항 산소 인광 검출>
1중항 산소의 생성을 가장 직접적으로 측정하는 방법은 고분자 매트릭스 내의 광여기된 Hp에 의한 1중항 산소분자의 비활성화로 인해 발생하는 인광을 검출하는 것이다. PBS 내에서 인광을 측정한 결과, 도 2A에서 보듯이 1195-1345 nm의 다양한 검출파장에서 Hp-PU 필름으로부터의 1중항 산소 인광신호가 측정되었다. 인광신호의 감쇠를 하나의 지수함수로 피팅한 결과, 감쇠시간이 25 μs로 확인되었다. 1중항 산소의 감쇠가 지연된 것은 수산화기가 없는 미세환경이었기 때문이다. 그러나, Hp-PU 필름에서 생성된 1중항 산소의 감쇠는 도입된 광민감제의 농도와는 무관하였으며, 1중항 산소 인광의 강도는 광감응제의 농도에 의존하였다. 따라서, Hp-PU 필름에서 생성되는 1중항 산소의 양은 Hp의 농도에 비례하여 증가하였다(1 ㎍/㎠: 2 ㎍/㎠ = 1: 2.05).
< 실험예 3: Hp - PU 필름에서 생성되는 활성산소종의 검출>
녹색 LED 조사 하에 활성산소종을 생성하는 Hp-PU 필름에 대하여 DPBF 분해실험을 수행하였다. DPBF는 활성산소종 소거제로서 1중항 산소와의 1,4-고리화 첨가반응을 통해 비가역적 생성물(1,2-디벤조일벤젠)로 분해되는 엔도퍼옥사이드를 생성한다. 또한, DPBF는 활성산소종의 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼에 의해 분해될 수 있다고 보고된 바 있다. 도 2B에서 보듯이, 411 nm에서 DPBF 흡광피크의 광학밀도(O.D.)는 광 조사(470 ㎼/㎠, 30 분)에 의해 변하지 않은 반면, Hp-PU 필름(1 ㎍/㎠, 10±1.5 %)과 Hp-PU 필름(2 ㎍/㎠, 34±3.1 %)의 경우 광 조사조건에서 DPBF의 O.D.(C/C0)가 감소하였다. 이러한 결과를 통하여, Hp-PU 필름으로부터 활성산소종이 생성되며 그 생성된 양은 필름에 도입에 Hp의 농도와 비례함을 확인할 수 있다.
< 실험예 4: 혈관내피세포의 성장 촉진>
PDT에 의한 세포증식 유도를 MTT 분석에 의해 평가하였다. 필름 내 Hp 농도가 다른, Hp가 도입된 PU 필름을 제조한 후, 세포를 다양한 강도의 빛에 30 분 동안 노출시켰다. 광역학요법은 광감응제를 표적세포에 침투시켜 특정 파장의 광자를 흡수하고 세포내에 존재하는 산소분자에 여기에너지를 전달하도록 함으로써 활성산소종의 농도를 높이는 것이다. 활성산소종 농도가 임계값 이상으로 올라가면 비가역적인 세포사멸이 유도된다. 본 발명자들이 수행한 실험에서도 활성산소종이 과도하게 증가하면 혈관내피세포에 세포독성 효과가 나타난다는 것이 확인되었다. 광 강도가 3,000 mW/㎠ 이상이었을 때, 세포의 생존능은 Hp의 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 그러나, 470 ㎼/㎠의 강도에서는, 1 ㎍/㎠ Hp-PU 필름을 사용하였을 때 PDT에 의해 유도된 활성산소종 증가로 인해 Hp가 없는 필름을 사용했을 때보다 세포의 증식이 촉진되었다. 강도 300 ㎼/㎠ 이하의 빛을 노출시킨 경우에는 세포 증식에 별다른 영향이 없었다. 따라서, 세포외 환경의 활성산소종 증가가 세포 성장과 관련이 있음이 확인되었다. 또한, 세포외 활성산소종의 생성량 조절이 혈관내피세포의 증식 촉진에 있어 매우 중요함이 실험적으로 확인되었다(도 3).
< 실험예 5: PDT 에 의해 유도된 세포내 활성산소종의 정량>
Hp를 포함하는 PU 필름과 녹색 LED 광의 상호작용에 의해 생성된 세포외 활성산소종이 HUVEC의 세포내 활성산소종의 양에 변화를 가져오는지를 실험적으로 조사하였다. 산화된 디클로로플루오레신(DCF) 형광프로브를 사용하여 세포내 활성산소종의 생성을 추적하였다. 470 ㎼/㎠ 광을 24 시간 동안 조사하여, 세포내 활성산소종의 축적을 광역학 처리에 의해 유도하였다(도 4A). PDT에 의해 유도된 활성산소종이 세포막을 통해 확산된 것인지 아니면 세포막에 존재하는 산화스트레스 수용체와 상호작용한 것인지는 확실하지 않지만, 세포외 활성산소종의 생성이 세포내 활성산소종의 생성을 촉진하였음이 확인되었다.
< 실험예 6: PDT 에 의해 유도된 세포증식을 세포 내 활성산소종 소거제에 의하여 억제>
PDT에 의해 촉진된 세포증식이 세포내 활성산소종 의한 것인지를 확인하기 위하여, 세포내 활성산소종 소거제로서 N-아세틸시스테인(NAC) 또는 아지드화나트륨(NaN3)을 미리 도입한 후 MTT 분석에 의해 세포증식능을 측정하였다. HUVEC 세포를 강도 470 ㎼/㎠의 빛에 30 분 동안 노출하였을 때, 1 ㎍/㎠ Hp-PU 필름 상에서의 세포성장이 대조군에 비해 크게 증가하였다. 그러나, 세포를 활성산소종 소거제로 처리한 경우에는 이러한 증식 촉진효과가 전혀 없었다(도 4B). 이러한 결과로부터 PDT에 의해 유도된 세포증식이 세포내 활성산소종의 축적량 변화와 상관관계가 있음을 알 수 있다. 이 실험에서 2종의 소거제를 사용한 이유는 어떤 종류의 활성산소가 세포증식에 긍정적인 영향을 미치는지를 확인하기 위해서였다. 이 실험을 통해 1중항 산소와 자유라디칼이 모두 혈관내피세포의 성장에 영향을 미침이 확인되었다.
< 실험예 7: 세포주기 분석>
세포주기의 G1기에서 S기로의 변화는 진핵세포의 증식 조절에 있어 매우 중요하다. G1기에는, 성장 의존적인 사이클린 의존성 키나아제(CDK)의 활성에 의해 DNA 복제가 촉진되고 G1기에서 S기로의 변화가 시작된다. CDK의 활성화는 양성 피드백을 통해 CDK 활성을 더욱 증가시키고, 이로 인해 게놈 수준의 전사변화가 유도되어 세포가 분열되게 된다. G1-S 전사체는 세포주기를 조절하는 단백질을 코딩한다. 또한, 사이클린 계열의 세포주기 조절단백질이 산화환원 의존적인 세포주기 진행 조절의 중요한 타겟임이 확인되었다. 특히, 외인성 ROS가 타이로신 포스페이트의 활성 조절을 통해 사이클린 D1의 농도를 조절할 수 있으며 산화환원 의존적인 경로를 통해 사이클린 D1의 프로테아좀 의존적인 대사분해 균형을 조절할 수 있다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 PDT에 의한 세포증식 촉진이 G1기에서 S기로의 변화 촉진과 관련이 있을 것으로 생각하였다. 실험 결과, 광 조사 후 S기 세포의 비율이 대조군에 비해 14 %나 증가하였다(도 5A 및 B). 이러한 결과는 사이클린 D1의 발현 조절과 관련하여 내피세포의 세포주기변화에서 활성산소종의 생성이 미치는 영향에 대한 메커니즘을 뒷받침한다.
< 실험예 8: 아질산염의 생성>
혈관내피세포의 한 가지 중요한 기능은 응고 억제물질의 분비와 혈관평활근세포(VSMC)의 증식 억제이다. 산화질소는 VSMC의 항혈전제 및 항증식제로 작용하는 주요 생성물이다. 광 조사 후, Hp-PU 필름 상에서 성장시킨 HUVEC의 산화질소(NO) 분비율은 순수한 PU 필름 상에서 성장한 세포에 비해 큰 차이가 없었다(도 5C). 따라서, PDT에 의해 생성된 낮은 농도의 활성산소종은 증식된 세포의 기능에 부정적인 영향을 미치지 않음이 확인되었다.
<결론>
상기 실험 결과들을 통하여 Hp 가 포함된 PU 필름을 사용하여, 녹색광과 광감응제 사이의 상호작용을 통해 세포외 활성산소종의 생성이 가능함을 확인하였다. 그러므로 본 발명에 따른 상기 실시예는 활성산소종의 생성시간을 조절하거나 원하는 부위로의 활성산소종 전달이 가능하다. 또한 세포외 활성산소종의 생성은 세포내 활성산소종의 생성을 촉진하였다. 또한, 일정량의 세포내 활성산소종 증가는 내피세포의 증식을 촉진하고 S기 세포의 비율을 증가시켰다. 그리하여 본 발명자들은 세포내 활성산소종의 생성 조절이 세포성장에 있어 중요함을 확인하였다. 따라서, 실시예에 따른 광기능성 담체는 약물 형태로 광감응제를 세포에 투여하는 기존의 방법과는 차별성이 있으며, 이를 이용한 세포증식 조절 시스템은 인공혈관의 이식성공률을 향상시키는 데에 유효한 전략을 제공할 것으로 기대된다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (27)

  1. 고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어지며; 및
    광조사에 의하여 활성산소종을 생성하고;
    상기 활성산소종을 통해 혈관구성세포의 증식을 촉진하는 고분자 담체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 담체는 상기 고분자물질 100 중량부에 대하여 광감응제가 0.0025-0.02 중량부로 도입되는 것을 특징으로 하는 고분자 담체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혈관구성세포는 혈관내피세포인 것을 특징으로 하는 고분자 담체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 고분자물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 고분자 담체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 광감응제는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 고분자 담체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 고분자 담체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 담체는 300-1,000 ㎼/㎠의 광조사에 의해 활성산소종을 생성하는 것을 특징으로 하는 고분자 담체.
  8. 1) 고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어진 고분자 담체에 광조사하는 단계; 및
    2) 상기 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계;
    를 포함하는 활성산소종 생성방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 고분자 담체는 상기 고분자물질 100 중량부에 대하여 광감응제가 0.0025-0.02 중량부로 도입되는 것을 특징으로 하는 활성산소종 생성방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 고분자물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 활성산소종 생성방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 광감응제는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 활성산소종 생성방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 활성산소종 생성방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 2)단계에서의 활성산소종은 상기 1)단계에서 300-1,000 ㎼/㎠ 광조사에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 활성산소종 생성방법.
  14. 고분자물질에 광감응제가 도입된 고분자 담체에 광조사하고, 이로부터 생성된 활성산소종을 통해 세포의 증식이 촉진되어 이루어진 혈관구성세포.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 광감응 담체는 상기 고분자물질 100 중량부에 대하여 광감응제가 0.0025-0.02 중량부로 도입되는 것을 특징으로 하는 혈관구성세포.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 혈관구성세포는 혈관내피세포인 것을 특징으로 하는 혈관구성세포.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 고분자물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈관구성세포.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 광감응제는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈관구성세포.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈관구성세포.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 활성산소종은 300-1,000 ㎼/㎠ 광조사에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 혈관구성세포.
  21. 1) 고분자물질에 광감응제가 도입되어 이루어진 고분자 담체에 광조사하는 단계;
    2) 상기 1)단계에서의 광조사에 의하여 활성산소종이 생성되는 단계; 및
    3) 상기 2)단계에서 생성된 활성산소종에 의해 혈관구성세포의 증식이 촉진되는 단계;
    를 포함하는 혈관구성세포의 증식 촉진방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 고분자 담체는 상기 고분자물질 100 중량부에 대하여 광감응제가 0.0025-0.02 중량부로 도입되는 것을 특징으로 하는 혈관구성세포의 증식 촉진방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 혈관구성세포는 혈관내피세포인 것을 특징으로 하는 혈관구성세포의 증식 촉진방법.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 고분자물질은 폴리우레탄(PU), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PET(polyethylene terephthalate) 및 폴리케톤(PK)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈관구성세포의 증식 촉진방법.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 광감응제는 헤마토포피린(Hp), 아미노 레뷰리닉산(ALA, 5-Aminolevulinic Acid) 및 클로린(Chlorin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈관구성세포의 증식 촉진방법.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 활성산소종은 과산화수소, 슈퍼옥사이드, 하이드록실라디칼, 1중항 산소, 하이드로젠 퍼옥사이드 및 산화질소(NO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈관구성세포의 증식 촉진방법.
  27. 제21항에 있어서,
    상기 2)단계에서의 활성산소종은 상기 1)단계에서 300-1,000 ㎼/㎠ 광조사에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 혈관구성세포의 증식 촉진방법.

KR1020150028874A 2015-03-02 2015-03-02 광감응제가 도입된 고분자 담체 및 이를 이용한 혈관구성세포의 증식 촉진방법 KR101765871B1 (ko)

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