WO2024090341A1 - アンチエイジング剤 - Google Patents

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WO2024090341A1
WO2024090341A1 PCT/JP2023/037984 JP2023037984W WO2024090341A1 WO 2024090341 A1 WO2024090341 A1 WO 2024090341A1 JP 2023037984 W JP2023037984 W JP 2023037984W WO 2024090341 A1 WO2024090341 A1 WO 2024090341A1
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WO
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ulvan
alkali metal
type
aging
mol
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PCT/JP2023/037984
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English (en)
French (fr)
Inventor
歩武 恩田
卓司 難波
Original Assignee
国立大学法人高知大学
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an anti-aging agent that exhibits excellent effects such as mitochondrial activation.
  • phenotypes of aging due to aging include cognitive decline, muscle weakness, osteoporosis, increased visceral fat, decreased cardiovascular function, and insomnia.
  • alginic acid produced by brown algae has the property of gelling in the presence of divalent metal ions such as calcium and magnesium ions, and is therefore used in the food, medical and industrial fields as a thickener, stabilizer, gelling agent and dietary fiber material.
  • Ulva miana a large green algae of the Ulva genus, has one of the fastest growth rates of all plants, and is expected to be utilized as a biomass resource. Ulva miana contains about 5-15% starch and cellulose per dry weight of the algae, as well as about 20-30% of a polysaccharide called ulvan.
  • ulvan is being considered for use in combination with hyaluronic acid to combat signs of skin aging and for the treatment and healing of skin wounds (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 only describes experimental data that shows that the combination of Ascophyscient (registered trademark), a fucoidan-rich crude extract product derived from the yellow algae Ascophyllum nodosum, and hyaluronic acid significantly promotes the proliferation of fibroblasts.
  • Fibroblasts are cells that constitute connective tissue, and produce dermal components such as collagen, elastin, and hyaluronic acid, but it is unclear whether the components that promote the proliferation of fibroblasts actually improve the firmness of skin, and of course it is unclear whether they suppress aging in general. Therefore, an object of the present invention is to provide an anti-aging agent that exhibits excellent effects such as mitochondrial activation effect.
  • the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems, and as a result have found that a specific derivative of natural ulvan exhibits objectively superior anti-aging effects, thereby completing the present invention.
  • the present invention will now be described.
  • An anti-aging agent comprising H-type ulvan or an alkali metal ion salt of ulvan as an active ingredient.
  • [8] Use of H-type ulvan or an alkali metal ion salt of ulvan to inhibit aging.
  • a method for inhibiting aging in an animal comprising: Administering to said animal H-type ulvan or an alkali metal ion salt of ulvan.
  • [24] Use of H-type ulvan or an alkali metal ion salt of ulvan for producing a medicament for inhibiting aging.
  • H-type ulvan or an alkali metal ion salt of ulvan for inhibiting aging [32] The H-type ulvan or alkali metal ion salt of ulvan according to [31], wherein the alkali metal is Na and/or K. [33] The H-type ulvan or alkali metal ion salt of the ulvan according to [31], in which 15 mol % or more of the carboxyl groups and sulfate groups of the H-type ulvan are protonated.
  • the anti-aging agent of the present invention exhibits objective and excellent anti-aging effects, such as reducing aging markers, promoting collagen production, promoting the expression of antioxidant enzymes, and activating mitochondria.
  • the ulvan derivative which is the active ingredient of the anti-aging agent of the present invention, is a polysaccharide formed by polymerizing glucuronic acid, sulfated rhamulose, etc., and is considered to be highly safe. Therefore, the present invention is extremely excellent from an industrial perspective as a technology related to an excellent anti-aging agent.
  • FIG. 1 shows enlarged photographs of stained senescent ⁇ -galactosidase, an aging marker, in human skin fibroblasts cultured in media containing (1) a control (distilled water only), (2) natural ulvan, (3) H-type ulvan, (4) 41 mol% alkali metal ion (AMI) salt of ulvan, and (5) 93 mol% AMI salt of ulvan.
  • FIG. 2 is a graph showing the percentage of human dermal fibroblasts per 50 cells cultured in medium containing control (distilled water only), native ulvan, H-type ulvan, or ulvan AMI salt that contain senescent ⁇ -galactosidase, a marker of senescence.
  • FIG. 1 shows enlarged photographs of stained senescent ⁇ -galactosidase, an aging marker, in human skin fibroblasts cultured in media containing (1) a control (distilled water only), (2) natural ulvan, (3) H-type ulvan, (4) 41
  • FIG. 3 is a graph showing the relative amounts of collagen produced by human dermal fibroblasts cultured in media containing control (distilled water only), native ulvan, H-type ulvan, or ulvan AMI salt.
  • FIG. 4 is a photograph of a gel containing ⁇ -actin and mitochondrial SOD2 bands from polyacrylamide electrophoresis analyzing proteins contained in human skin fibroblasts cultured in medium containing control (distilled water only), native ulvan, H-type ulvan, or ulvan AMI salt.
  • FIG. 4 is a photograph of a gel containing ⁇ -actin and mitochondrial SOD2 bands from polyacrylamide electrophoresis analyzing proteins contained in human skin fibroblasts cultured in medium containing control (distilled water only), native ulvan, H-type ulvan, or ulvan AMI salt.
  • FIG. 5 is a photograph of a gel showing the bands of serine/threonine kinase (Total-AKT) and phosphorylated AKT (P-AKT) from polyacrylamide electrophoresis analyzing proteins contained in human skin fibroblasts cultured in medium containing native ulvan or H-type ulvan.
  • FIG. 6 is a graph showing mitochondrial membrane potential, indicating mitochondrial activity of human skin fibroblasts cultured in medium containing control (distilled water only), native ulvan, H-type ulvan, or ulvan AMI salt.
  • FIG. 1 is a photograph of a gel showing the bands of serine/threonine kinase (Total-AKT) and phosphorylated AKT (P-AKT) from polyacrylamide electrophoresis analyzing proteins contained in human skin fibroblasts cultured in medium containing native ulvan or H-type ulvan.
  • FIG. 6 is a graph showing mitochondrial membrane potential, indicating mitochondrial activity of human skin
  • FIG. 7 is a graph showing the amount of ATP produced by human skin fibroblasts cultured in medium containing control (distilled water only), native ulvan, H-type ulvan, or ulvan AMI salt.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of antioxidant protein SOD produced by human skin fibroblasts cultured in medium containing control (distilled water only), native ulvan, or H-type ulvan.
  • FIG. 9 is a graph showing the relative amounts of mRNA for filaggrin, an epidermal defense factor produced by human epidermal keratinocytes cultured in medium containing a control (distilled water only), natural ulvan, H-type ulvan, or ulvan AMI salt, and the mitochondrial antioxidant enzyme SOD2.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of antioxidant protein SOD produced by human skin fibroblasts cultured in medium containing control (distilled water only), native ulvan, or H-type ulvan.
  • FIG. 9 is a graph showing the relative amounts of mRNA for
  • FIG. 10 is a graph showing the relative amount of mRNA for the mitochondrial antioxidant enzyme SOD2 produced by human epidermal keratinocytes cultured in medium containing control (distilled water only), natural ulvan, H-type ulvan, or ulvan AMI salt.
  • FIG. 11 is a graph showing the relative amount of mRNA for the mitochondrial antioxidant enzyme SOD2 produced by human epidermal keratinocytes cultured in medium containing control (distilled water only), natural ulvan, or K-type ulvan AMI salt.
  • the anti-aging agent of the present invention contains H-type ulvan or an alkali metal salt of ulvan as an active ingredient.
  • Ulvans are polysaccharides produced by green algae of the genus Enteromorpha (such as Enteromorpha mianensis) and green algae of the genus Ulva (such as Ulva mianensis), and are sulfated anionic polysaccharides that contain uronic acids such as glucuronic acid and iduronic acid, and rhamnose, galactose, xylose, glucose, etc., which have sulfate groups. Approximately 2/3 to 3/4 of the ulvan is made up of alternating polymerized uronic acids and sulfated rhamnose, etc., and the remaining parts are mainly polymerized with sulfated rhamnose, etc. Below, naturally derived ulvans may be referred to as natural ulvans.
  • Natural ulvan mainly contains magnesium ions, calcium ions, sodium ions, and potassium ions, with magnesium ions being the most abundant of all cations. However, compared to alginic acid, ulvan is less likely to gel, and even if it contains a large amount of magnesium ions, it is often in a sol state.
  • Natural ulvan can be extracted by standard methods from algae that contain ulvan, such as Enteromorpha aurea. For example, since ulvan is water-soluble, after the raw algae is micronized, water or other solvent is added and extraction is carried out at a temperature of 80°C or higher and 120°C or lower. Since ulvan is insoluble in general organic solvents, it will precipitate if a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, or 2-propanol is added to the extraction liquid. The precipitated ulvan can be separated from the solvent by filtration or centrifugation, and then dried.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, or 2-propanol
  • the H-type ulvan which is an active ingredient of the anti-aging agent according to the present invention, refers to an ulvan in which at least a part of its carboxyl groups and sulfate groups are protonated, i.e., in the state of -CO2H and -OSO3H .
  • carboxyl groups and sulfate groups in an ulvan may be collectively referred to as acidic groups.
  • an ulvan in which the ratio of the total molar number of protonated carboxyl groups ( -CO2H ) and protonated sulfate groups ( -OSO3H ) to the total molar number of acidic groups contained in the ulvan is 10 mol% or more.
  • the ratio is preferably 15 mol% or more, more preferably 19 mol% or more, 20 mol% or more or 30 mol% or more, and even more preferably 35 mol% or more or 40 mol% or more.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited and may be 100 mol%, but since it may be difficult to protonate all of the carboxy groups and sulfate groups of natural ulvan, the ratio is preferably 95 mol% or less or 90 mol% or less, and more preferably 80 mol% or less or 70 mol% or less.
  • the acid dissociation constant pKa of formic acid is 3.75
  • the pKa of sulfuric acid is -3.0
  • the Ka of sulfuric acid is 10 6.75 times that of formic acid, so that sulfate groups are stronger acids than carboxy groups, and therefore it is considered that carboxy groups are preferentially protonated over sulfate groups in H-type ulvan.
  • the ratio of protonated acid groups can be determined, for example, by quantifying the cations contained in an ulvan sample by inductively coupled plasma (ICP) atomic emission spectrometry, estimating the amount of protons from the obtained data, and assuming that all cations and protons are present in acid groups.
  • ICP inductively coupled plasma
  • the ulvan alkali metal ion salt which is an active ingredient of the anti-aging agent according to the present invention, refers to an ulvan in which at least a portion of the divalent metal ions, such as calcium ions and magnesium ions, which form salts with the carboxyl groups or sulfate groups of natural ulvan, have been replaced with alkali metal ions. Specifically, it refers to an ulvan in which the ratio of the number of moles of divalent ions to the number of moles of total acidic groups contained in the ulvan is 30 mol% or less, and the ratio of the number of moles of alkali metal ions is 20 mol% or more.
  • the above ratio of divalent ions is preferably 20 mol% or less, and more preferably 10 mol% or less.
  • the above ratio of alkali metal ions is preferably 30 mol% or more, and more preferably 40 mol% or more. There is no particular upper limit to the ratio, and it may be 100 mol%, but since it may be difficult to convert all of the acidic groups of natural ulvan into alkali metal ion salts, the ratio is preferably 95 mol% or less or 90 mol% or less, and more preferably 80 mol% or less.
  • the ratio of the number of moles of protons and alkali metal ions to the number of moles of total acidic groups in the H-type ulvan and alkali metal ion salt of ulvan according to the present invention can be determined, for example, by inductively coupled plasma (ICP) atomic emission spectrometry.
  • ICP inductively coupled plasma
  • the number of moles of total acidic groups and the number of moles of protons in the target ulvan sample can be estimated by the following procedure, and the ratio of protons and alkali metal ions to acidic groups can be calculated: (1) thoroughly wash the target ulvan sample to remove free cations, (2) treat the washed target ulvan sample using an ion exchange resin or the like so that all acidic groups become metal ion salts, (3) subject the washed target ulvan sample and the target ulvan sample salted with metal ions to ICP atomic emission spectrometry, and (4) compare the two analytical data.
  • the active ingredient of the present invention may be an H-type ulvan, or a part of the acidic groups may be an alkali metal salt and/or an alkaline earth metal salt, or an ulvan alkali metal ion salt, or a part of the acidic groups may be protonated.
  • the active ingredient of the present invention may be one in which the acidic groups are sufficiently protonated and converted to an alkali metal salt, and which can be called either an H-type ulvan or an alkali metal salt.
  • alkali metal ion examples include lithium ion, sodium ion, potassium ion, rubidium ion, and cesium ion.
  • One or more alkali metal ions selected from the group consisting of lithium ion, sodium ion, and potassium ion are preferred, sodium ion and/or potassium ion are more preferred, and sodium ion is even more preferred.
  • the molecular weight of H-type ulvan and ulvan alkali metal ion salt, which are the active ingredients of the anti-aging agent according to the present invention is not particularly limited, but can be, for example, 10,000 or more.
  • the molecular weight is preferably 100,000 or more, more preferably 200,000 or more, and even more preferably 500,000 or more.
  • the molecular weight is preferably 2,000,000 or less, more preferably 1,500,000 or less, and even more preferably 1,000,000 or less.
  • H-type ulvan and ulvan alkali metal ion salts can be produced by replacing cations contained in natural ulvan with protons (H + ) or alkali metal ions according to a conventional method.
  • an OH-type anion exchange resin is added to an aqueous solution of natural ulvan, and the solution is treated at 0° C. or higher and 100° C. or lower for 10 minutes or longer and 1 hour or shorter, and the anion exchange resin is then removed by filtration or centrifugation to adsorb and remove anions such as sulfate ions and chloride ions contained in natural ulvan.
  • an alkali ion-type cation exchange resin is added to the ulvan solution, and the solution is treated at 0° C. or higher and 100° C. or lower for 10 minutes or longer and 1 hour or shorter, and the cation exchange resin is then removed by filtration or centrifugation to produce an alkali metal ion salt of ulvan.
  • an H-type cation exchange resin can be added to an aqueous solution of ulvan alkali metal ion salts, and the solution is treated at 0° C. or higher and 100° C. or lower for 10 minutes or longer and 1 hour or shorter, and the cation exchange resin is then removed by filtration or centrifugation to produce an H-type ulvan.
  • H-type ulvan and ulvan alkali metal ion salts can be isolated by freeze-drying, etc.
  • H-type ulvan and ulvan alkali metal ion salts may be collectively referred to as ulvan derivatives.
  • the ulvan derivatives of the present invention activate mitochondria.
  • Mitochondria are responsible for the metabolism of carbohydrates, proteins, lipids, etc., and produce the energy substance ATP and heat. Therefore, the ulvan derivatives of the present invention may contribute to the supply of energy to maintain constant vital activity through mitochondrial activation, and may also promote the secretion of 4-aminobutyric acid (GABA), which brings mental stability, and insulin, which lowers blood sugar levels.
  • GABA 4-aminobutyric acid
  • the inventors' experimental findings have revealed that the ulvan derivatives of the present invention promote the gene expression and biosynthesis of antioxidant enzymes in mitochondria.
  • Active oxygen in the body originally plays an important role in protecting the body by attacking bacteria and viruses that have invaded the body, but excessive active oxygen can attack normal cells as well, and lipid peroxides produced by active oxygen can lead to a vicious cycle in which more active oxygen is produced.
  • Antioxidant enzymes break down and neutralize excess active oxygen, so for example, the ulvan derivatives of the present invention are thought to activate mitochondria through the activation of antioxidant enzymes in mitochondria, as well as contribute to maintaining health and the condition of the skin.
  • the inventors have experimentally demonstrated that the ulvan derivative of the present invention promotes collagen biosynthesis.
  • Collagen is a fibrous protein that constitutes skin, tendons, cartilage, etc., but it is known that with aging, the enzyme that produces collagen from its precursors decreases, causing a decrease in the amount of collagen biosynthesis, which leads to the development of wrinkles and loss of skin firmness. Therefore, it is believed that the ulvan derivative of the present invention will improve skin conditions, such as the development of wrinkles and loss of skin firmness due to aging.
  • the anti-aging agent of the present invention contains an ulvan derivative as an active ingredient.
  • the active ingredient refers to a component that exerts an anti-aging effect among the components contained in the anti-aging agent of the present invention.
  • the anti-aging agent of the present invention contains an amount of ulvan derivative that exerts an anti-aging effect.
  • the proportion of ulvan derivative in the anti-aging agent of the present invention can be 10% by mass or more and 100% by mass or less.
  • the proportion of ulvan derivative can be 0.1% by mass or more and 10% by mass or less.
  • the method for inhibiting aging in an animal according to the present invention includes a step of administering to the animal an anti-aging agent according to the present invention, which contains H-type ulvan or an alkali metal ion salt of ulvan as an active ingredient.
  • an anti-aging agent according to the present invention which contains H-type ulvan or an alkali metal ion salt of ulvan as an active ingredient.
  • H-type ulvan or the alkali metal ion salt of ulvan both H-type ulvan and the alkali metal ion salt of ulvan may be administered, or either H-type ulvan or the alkali metal ion salt of ulvan may be administered.
  • the frequency and dosage of the anti-aging agent of the present invention may be adjusted as appropriate depending on the age, sex, condition, etc. of the subject, and an amount that can exert an anti-aging effect is administered to the subject.
  • the daily dosage of the anti-aging agent may be 1 mg/kg body weight or more and 1 g/kg body weight or less.
  • the daily application amount of the anti-aging agent may be 0.1 mg or more and 10 mg or less. There are no particular limitations on the number of times the agent is administered or applied per day, and the agent may be administered or applied in a single dose or in several doses within the desired dosage range.
  • the anti-aging agent of the present invention can be administered not only to humans but also to animals other than humans.
  • animals to which the agent can be administered include livestock such as horses, cows, pigs, sheep, goats, camels, and llamas; sports animals such as racehorses; pets such as dogs and cats; laboratory animals such as mice, rats, guinea pigs, and rabbits; and poultry such as chickens, ducks, turkeys, and ostriches.
  • the dosage form of the anti-aging agent of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, the ulvan derivative itself, a composition in combination with other ingredients, or a solution or suspension of these.
  • the dosage form of the anti-aging agent of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include tablets, powders, capsules, sugar-coated tablets, granules, liquids, and topical preparations.
  • Pharmaceutically acceptable additives may be used in the anti-aging agent of the present invention according to the dosage form. Examples of such additives include excipients, disintegrants, lubricants, binders, antioxidants, colorants, sweeteners, anti-aggregating agents, preservatives, agents for aiding the dissolution of active ingredients, and stabilizers.
  • the ulvan derivatives of the present invention exhibit objective and excellent anti-aging effects, such as mitochondrial activation, antioxidant effects, and collagen biosynthesis enhancement effects. Furthermore, the ulvan derivatives of the present invention are algae-derived polysaccharides in free form or alkali metal ion salt form, and are therefore considered to be highly safe. Therefore, the anti-aging agent of the present invention may be able to be taken regularly as a health food with excellent anti-aging effects.
  • the ulvan derivative according to the present invention can be used as an anti-aging agent in general foods and beverages.
  • the foods and beverages to which the ulvan derivative according to the present invention is added are not particularly limited, and examples thereof include beverages such as milk drinks, soft drinks, sports drinks, nutritional drinks, beauty drinks, and liquid nutrients; confectioneries such as chewing gum, chocolate, candy, jelly, cakes, biscuits, and crackers; frozen desserts such as ice cream and frozen desserts; noodles such as udon, Chinese noodles, spaghetti, and instant noodles; paste products such as kamaboko, chikuwa, and half pieces; seasonings such as dressings, mayonnaise, and sauces; bread, ham, porridge, rice, soup, various retort foods, and various frozen foods.
  • the foods and beverages containing the ulvan derivative according to the present invention can be used for so-called health foods, supplements, functional foods, functional foods, nutritional supplements, foods for specified health uses, nutritional functional foods, nursing care foods, smile care foods, chewing and swallowing supplements, thick liquid foods, and foods for the sick.
  • Example 1 Production of ulvan AMI salt (1) Production of natural extract ulvan After thoroughly washing and freeze-drying, Minami Aonori was pulverized in a blender. Distilled water (20 mL) was added to the obtained dry powder (1 g) and hot water extraction was performed at 90°C. The supernatant was collected, and distilled water (20 mL) was added to the residue and hot water extraction was performed again. This operation was repeated twice. The collected aqueous solution (about 60 mL) was concentrated, and ethanol was added to adjust the ethanol concentration to 75%, to precipitate ulvan. The resulting precipitate was collected by centrifugation and freeze-dried to obtain natural extract ulvan.
  • the treatment with the OH-type anion exchange resin and the collection of the supernatant were repeated five times in total to remove sulfate (SO 4 2- ) and chloride ions (Cl - ) contaminated in the aqueous ulvan solution.
  • the resulting aqueous ulvan solution (approximately 100 g) was treated with a Na-type cation exchange resin (Amberlite TM IR120BNa, manufactured by Organo Corporation) (0.5 g) to partially exchange the cations in the cationic sites of the ulvan with Na ions, followed by freeze-drying.
  • the molecular weight of the obtained ulvan AMI salt was measured by gel permeation chromatography (GPC).
  • the cation concentration contained in the obtained ulvan AMI salt was measured by inductively coupled plasma (ICP) emission spectroscopy.
  • the results are shown in Table 1.
  • Example 2 Preparation of H-type ulvan
  • OH-type anion exchange resin 0.5 g
  • a 0.5% aqueous solution 100 g
  • naturally extracted ulvan 100 g
  • the supernatant was collected, and fresh OH-type anion exchange resin was added again and treated in the same manner.
  • the treatment with the OH-type anion exchange resin and the collection of the supernatant were repeated five times in total to remove sulfate (SO 4 2- ) and chloride ions (Cl - ) contaminated in the aqueous ulvan solution.
  • H-type cation exchange resin (Amberlite TM IR120BNa, Organo Corporation) (0.45 g) was added and stirred at room temperature for 30 minutes to partially exchange the cations at the cationic sites of ulvan with H ions, followed by lyophilization.
  • the obtained H-type ulvan was analyzed in the same manner as in Example 1(2). The results are shown in Table 1. In the obtained H-type ulvan, the ratio of protons to acidic groups was 38 to 42 mol %, and the ratio of alkali metal ions was 10 mol %.
  • Example 3 Production of ulvan AMI salt
  • the OH-type anion exchange resin (0.5 g) was added to a 0.5% aqueous solution (100 g) of naturally extracted ulvan, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The supernatant was collected, and fresh OH-type anion exchange resin was added again and treated in the same manner. The treatment with the OH-type anion exchange resin and the collection of the supernatant were repeated five times in total to remove free sulfate ions (SO 4 2- ) and chloride ions (Cl - ) contaminated in the aqueous ulvan solution.
  • H-type cation exchange resin (Amberlite TM IR120BH, Organo Corporation) (0.5 g) was added, the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, the resin was removed, and the mixture was stirred again for 30 minutes. Furthermore, most of the cations at the cation sites of ulvan were exchanged with Na ions using Na-type cation exchange resin (Amberlite TM IR120BNa, Organo Corporation) (47.3 g) from the supernatant (94.6 mL), and then the mixture was freeze-dried.
  • the obtained ulvan AMI salt was analyzed in the same manner as in Example 1 (2). The results are shown in Table 1. Since the obtained ulvan Na salt contains almost no protons, the ratio of alkali metal ions (AMI) to acidic groups can be said to be 93 mol %.
  • Example 4 Measurement of Senescent ⁇ -galactosidase Activity as a Senescence Marker Human dermal fibroblasts (NB1RGB cells) were cultured for 80 to 89 days in a medium containing MEM ⁇ medium supplemented with 10% FBS, 100 ⁇ g/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin to prepare senescent cells. Natural ulvan, ulvan AMI salt of Example 1, H-type ulvan of Example 2, or ulvan AMI salt of Example 3 was added to the medium at a concentration of 500 ⁇ g/mL, and the human dermal fibroblast senescent cells were further cultured for 24 hours at 37° C. For comparison, culture was performed in the same manner except that no ulvans were added.
  • the cells after culture were fixed with a fixative and stained according to the manufacturer's protocol to measure the activity of senescence beta-galactosidase, a marker for senescence.
  • Cells with senescence beta-galactosidase activity (senescent cells) were stained blue. The number of cells stained blue was counted among 50 cultured cells. A magnified photograph of the stained cells is shown in FIG. 1, and the number of stained cells is shown in FIG. 2.
  • "**" indicates a significant difference compared to the control group (control) at p ⁇ 0.01 by Tukey's test following two-way analysis of variance.
  • Example 5 Collagen production ability test Using a medium containing natural ulvan, ulvan AMI salt of Example 1, H-type ulvan of Example 2, or ulvan AMI salt of Example 3 at a ratio of 500 ⁇ g/mL, human dermal fibroblast senescent cells were further cultured at 37° C. for 72 hours to obtain samples. For comparison, a sample was obtained by culturing in the same manner except that no ulvans were added. A cell lysate was prepared from the obtained sample, and the amount of collagen in the cell layer per 25 ⁇ L of the cell lysate containing the same protein concentration was evaluated using a collagen quantification kit (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.) according to the manufacturer's protocol.
  • a collagen quantification kit manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.
  • "*" indicates that there is a significant difference compared to the control group (control) at p ⁇ 0.05 by two-way analysis of variance followed by Tukey's test
  • "**" indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.01 by two-way analysis of variance followed by Tukey's test.
  • Example 6 Analysis of the amount of SOD2 biosynthesis The amount of SOD2 biosynthesis was analyzed using an anti-SOD2 antibody (Cell Signaling Technology) and anti- ⁇ -actin (Sigma). Specifically, human dermal fibroblast senescent cells were further cultured at 37°C for 72 hours using a medium containing ulvan AMI salt of Example 1, H-type ulvan of Example 2, or ulvan AMI salt of Example 3 at a ratio of 500 ⁇ g/mL to obtain a sample. A protein solution was prepared from the sample, subjected to polyacrylamide electrophoresis, and then transferred to a membrane.
  • an anti-SOD2 antibody Cell Signaling Technology
  • anti- ⁇ -actin Sigma
  • the anti-SOD2 antibody product was diluted 1000 times, and the anti- ⁇ -actin antibody was diluted 10000 times, and the membrane was immersed in the diluted solution, incubated at 4°C for 18 hours, and then washed.
  • HRP-labeled anti-rabbit and anti-mouse secondary antibody products (manufactured by Promega) were diluted 5000 times, and the membrane was immersed in the diluted solution, incubated at room temperature for 1 hour, and then washed.
  • the membrane was immersed in a luminol reaction solution, incubated at room temperature for 5 to 10 minutes until it emitted light, and then exposed to an X-ray film for development.
  • the fluorescence intensity of the SOD2 band was corrected by the fluorescence intensity of the ⁇ -actin band in each sample. The results are shown in Figure 4. "Intensity" in Figure 4 indicates the above corrected value.
  • Ulvan AMI salt and H-type Ulvan can increase the amount of SOD2 biosynthesis produced in mitochondria, which is one of the SODs (superoxide dismutases) that dismutate reactive oxygen species, which are the cause of aging due to oxidative stress, into oxygen and hydrogen peroxide.
  • Example 7 Analysis of activated AKT (phosphorylation) Activation of serine/threonine kinase (AKT) was analyzed using anti-phosphorylated AKT antibody (Cell Signaling Technology) and anti-AKT antibody (Cell Signaling Technology). Specifically, human dermal fibroblast senescent cells were further cultured at 37°C for the indicated time in a medium containing 100 ⁇ g/mL of natural ulvan or H-type ulvan, to obtain samples. A protein solution was prepared from the sample, subjected to polyacrylamide electrophoresis, and then transferred to a membrane.
  • AKT phosphorylation
  • the anti-phosphorylated AKT antibody product was diluted 1000-fold, and the anti-AKT antibody was diluted 1000-fold, the membrane was immersed, incubated at 4°C for 18 hours, and then washed.
  • an HRP-labeled anti-rabbit secondary antibody product (manufactured by Promega) was diluted 5000-fold, the membrane was immersed, incubated at room temperature for 1 hour, and then washed.
  • the membrane was immersed in a luminol reaction solution, incubated at room temperature for 5 to 10 minutes until it emitted light, and then exposed to X-ray film for development. The results are shown in Figure 5.
  • H-type ulvan promotes cell proliferation that declines with aging. Furthermore, since natural ulvan does not have the ability to activate AKT, this effect is only expressed by converting it to H-type ulvan.
  • Example 8 Mitochondrial Activity Test Natural ulvan, ulvan AMI salt of Example 1, H-type ulvan of Example 2, or ulvan AMI salt of Example 3 was added to the medium at a rate of 500 ⁇ g/mL, and the human dermal fibroblast senescent cells were further cultured for 24 hours at 37° C. For comparison, the cells were cultured in the same manner except that no ulvans were added. Mitochondrial activity was then measured by TMRM staining using a mitochondrial membrane potential detection reagent ("TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)" manufactured by Thermo) according to the manufacturer's protocol.
  • TMRM mitochondrial membrane potential detection reagent
  • TMRM a low molecular weight fluorescent dye
  • mitochondrial activity can be measured as the fluorescence intensity at wavelengths measured at 535 nm/590 nm.
  • FIG. 6 The results are shown in FIG. 6 as the ratio of the ulvan or other treatment examples to the control example.
  • "*" indicates a significant difference at p ⁇ 0.05 by two-way analysis of variance followed by Tukey's test.
  • "**" indicates a significant difference at p ⁇ 0.01 by two-way analysis of variance followed by Tukey's test.
  • H-type ulvan and ulvan AMI salts can significantly improve mitochondrial activity, which is related to energy production and, ultimately, cell activity.
  • Example 9 ATP production Natural ulvan, ulvan AMI salt of Example 1, H-type ulvan of Example 2, or ulvan AMI salt of Example 3 was added to the medium at a rate of 500 ⁇ g/mL, and the human dermal fibroblast senescent cells were further cultured at 37° C. for 24 hours to obtain samples. For comparison, the cells were cultured in the same manner except that no ulvans were added. The amount of ATP production was then measured using CellTiter-Glo® 2.0 Assay (Promega) according to the manufacturer's protocol. Luminescence was measured using a Promega GloMax 20/20 Luminometer. The results are shown in FIG. 7 as the ratio of the ulvan and other treatment examples to the control example. "*" indicates a significant difference at p ⁇ 0.05 by two-way ANOVA followed by Tukey's test. "**” indicates that there is a significant difference of p ⁇ 0.01 according to two-way analysis of variance followed by Tukey's test.
  • Example 10 Antioxidant activity measurement Natural ulvan and ulvan H were added to the medium in the ratios shown in Fig. 8, and the human dermal fibroblast senescent cells were further cultured at 37°C for 48 hours to obtain samples. For comparison, a sample was obtained by culturing in the same manner except that ulvan, etc. were not added. The antioxidant activity of the obtained samples was evaluated using an antioxidant capacity measurement kit ("SOD Assay Kit-WST" manufactured by Dojindo Molecular Technologies) according to the manufacturer's protocol. Fluorescence was measured using a fluorescence microplate reader ("Infinite M200" manufactured by TECAN) equipped with a 380 nm/485 nm filter pair. The results are shown in FIG. 8. In FIG.
  • Example 11 Analysis of mRNA Expression Using a medium containing ulvan, H-type ulvan, or ulvan 93 mol% AMI salt at a ratio of 500 ⁇ g/mL, human epidermal keratinocytes (NHEK cells (AD: adult)) (Kurabo Industries, Ltd.) were further cultured at 37° C. for 24 hours, and samples were collected 24 hours after the start of culture.
  • NHEK cells AD: adult
  • samples were collected 24 hours after the start of culture.
  • SOD2 superoxide dismutase 2
  • Example 12 Preparation of H-type ulvan
  • the natural ulvan of Example 1(1) and the H-type ulvan of Example 2 (H + ratio: 38-42 mol%) were mixed to prepare an H-type ulvan having a proton ratio of 19-21 mol% relative to acidic groups and an alkali metal ion ratio of 15 mol%.
  • Example 13 Preparation of ulvan AMI salt
  • the natural ulvan of Example 1(1) and the ulvan AMI salt of Example 1 (AMI ratio: 41 mol %) were mixed to prepare ulvan AMI salt having a ratio of alkali metal ions to acidic groups of 30 mol %.
  • Example 14 Analysis of mRNA Expression
  • SOD2 superoxide dismutase 2
  • Example 15 Preparation of K-type ulvan AMI salt
  • H-type cation exchange resin (“Amberlite TM IR120BH” manufactured by Organo Corporation, 0.5 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The resin was removed, and the mixture was stirred again for 30 minutes.
  • potassium nitrate was used to exchange H + of an H-type cation exchange resin ("Amberlite TM IR120BH" manufactured by Organo Corporation) for K + to prepare a K-type cation exchange resin.
  • K-type cation exchange resin 1.0 g was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes to exchange the cations at the cationic sites of the ulvan for potassium ions. The resin was removed, and the mixture was stirred again for 30 minutes, and then freeze-dried to obtain a K-type ulvan AMI salt.
  • the resulting K-type ulvan AMI salt was analyzed in the same manner as in Example 1(2), and the ratio of alkali metal ions to acidic groups was found to be 59 mol %. The analysis results are shown in Table 3.
  • Example 16 Production of K-type ulvan AMI salt
  • K-type ulvan AMI salt was obtained in the same manner as in Example 12, except that the amount of K-type cation exchange resin used was changed from 1.0 g to 2.5 g.
  • the resulting K-type ulvan AMI salt was analyzed in the same manner as in Example 1(2), and the ratio of alkali metal ions to acidic groups was found to be 69 mol %. The analysis results are shown in Table 3.
  • Example 17 Analysis of mRNA Expression
  • SOD2 superoxide dismutase 2
  • Ulban AMI salt which has a relatively high potassium ion content, can also significantly increase the expression of SOD2, and the greater the proportion of AMI, the greater the effect tends to be.

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Abstract

本発明は、ミトコンドリア活性化作用などの優れた作用を示すアンチエイジング剤を提供することを目的とする。本発明に係るアンチエイジング剤は、Ｈ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩を有効成分として含有することを特徴とする。

Description

アンチエイジング剤
　本発明は、ミトコンドリア活性化作用などの優れた作用を示すアンチエイジング剤に関するものである。
　日本における平均寿命は２０世紀後半に著しい伸長を遂げ、世界有数の長寿国となった。その一方で、加齢による問題も健在化してきている。例えば、加齢による老化の表現型としては、認知力の低下、筋力の衰え、骨粗鬆症、内臓脂肪の増加、心血管機能の低下、不眠などが挙げられる。
　かつては加齢のプロセスは非常に複雑で、介入など不可能であると思われていた。しかし近年、科学の進歩により、加齢は細胞生物学的なプロセスの一つとして介入の可能性があることが明らかにされ、加齢という生物学的プロセスに介入し、加齢に伴う動脈硬化やがんといった加齢関連疾患の発症確率を下げ、生活の質（ＱＯＬ：Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｏｆ　Ｌｉｆｅ）を維持しつつ健康長寿をめざすアンチエイジング技術が検討されている。
　ところで、藻類の中には光合成により多糖類を生合成し、多量に蓄積するものがある。例えば褐藻類が産生するアルギン酸は、カルシウムイオンやマグネシウムイオン等の二価金属イオンによりゲル化するといった性質から、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、食物繊維素材などとして、食品分野、医療分野、工業分野で利用されている。
　また、例えばアオサ属の大型緑藻類であるミナミアオノリは、全植物の中でもトップクラスの成長速度を有し、バイオマス資源としての利活用が期待されている。ミナミアオノリは、藻体乾燥重量あたり５～１５％程度のデンプンやセルロースを含む他、約２０～３０％のウルバンという多糖類を含む。
　例えばウルバンは、ヒアルロン酸と組み合わせて、皮膚加齢の兆候への対処や、皮膚創傷の処置および治療に使用することが検討されている（特許文献１）。
特表２０１７－５１４８２５号公報
　上述したように、藻類から得られるウルバンをヒアルロン酸と組み合わせて皮膚加齢の兆候への対処などに用いることは既に検討されている（特許文献１）。
　しかし、特許文献１には、黄藻植物であるＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｎｏｄｏｓｕｍ由来のフコイダンリッチ粗抽出物製品であるＡｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（登録商標）とヒアルロン酸との組み合わせが、繊維芽細胞の増殖を有意に促進することを示す実験データが記載されているのみである。繊維芽細胞は、結合組織を構成する細胞であり、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸といった真皮成分を産生するものではあるが、繊維芽細胞の増殖を促進する成分が実際に肌のハリ等を改善するか否かは不明であるし、また、老化一般を抑制するか否かは勿論不明である。
　そこで本発明は、ミトコンドリア活性化作用などの優れた作用を示すアンチエイジング剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、天然ウルバンの特定の誘導体が、客観的に優れたアンチエイジング作用を示すことを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　Ｈ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩を有効成分として含有することを特徴とするアンチエイジング剤。
　［２］　前記アルカリ金属がＮａおよび／またはＫである前記［１］に記載のアンチエイジング剤。
　［３］　前記Ｈ型ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の１５ｍｏｌ％以上がプロトン化されている前記［１］に記載のアンチエイジング剤。
　［４］　前記ウルバンのアルカリ金属イオン塩のカルボキシ基および硫酸基の３０ｍｏｌ％以上がアルカリ金属イオンと塩を形成している前記［１］または［２］に記載のアンチエイジング剤。
　［５］　ミトコンドリア活性化作用を示す前記［１］～［４］のいずれかに記載のアンチエイジング剤。
　［６］　抗酸化作用を示す前記［１］～［４］のいずれかに記載のアンチエイジング剤。
　［７］　コラーゲン生合成増強作用を示す前記［１］～［４］のいずれかに記載のアンチエイジング剤。
　［８］　老化を抑制するためのＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩の使用。
　［９］　前記アルカリ金属がＮａおよび／またはＫである前記［８］に記載の使用。
　［１０］　前記Ｈ型ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の１５ｍｏｌ％以上がプロトン化されている前記［８］に記載の使用。
　［１１］　前記ウルバンのアルカリ金属イオン塩のカルボキシ基および硫酸基の３０ｍｏｌ％以上がアルカリ金属イオンと塩を形成している前記［８］または［９］に記載の使用。
　［１２］　ミトコンドリアを活性化することにより老化を抑制する前記［８］～［１１］のいずれかに記載の使用。
　［１３］　抗酸化作用により老化を抑制する前記［８］～［１１］のいずれかに記載の使用。
　［１４］　コラーゲン生合成を増強することにより老化を抑制する前記［８］～［１１］のいずれかに記載の使用。
　［１５］　動物の老化を抑制するための方法であって、
　Ｈ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩を前記動物に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
　［１６］　前記アルカリ金属がＮａおよび／またはＫである前記［１５］に記載の方法。
　［１７］　前記Ｈ型ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の１５ｍｏｌ％以上がプロトン化されている前記［１５］に記載の方法。
　［１８］　前記ウルバンのアルカリ金属イオン塩のカルボキシ基および硫酸基の３０ｍｏｌ％以上がアルカリ金属イオンと塩を形成している前記［１５］または［１６］に記載の方法。
　［１９］　前記動物がヒトである前記［１５］～［１８］のいずれかに記載の方法。
　［２０］　前記動物がヒト以外の動物である前記［１５］～［１８］のいずれかに記載の方法。
　［２１］　ミトコンドリアを活性化することにより老化を抑制する前記［１５］～［１８］のいずれかに記載の方法。
　［２２］　抗酸化作用により老化を抑制する前記［１５］～［１８］のいずれかに記載の方法。
　［２３］　コラーゲン生合成を増強することにより老化を抑制する前記［１５］～［１８］のいずれかに記載の方法。
　［２４］　老化を抑制するための医薬を製造するためのＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩の使用。
　［２５］　前記アルカリ金属がＮａおよび／またはＫである前記［２４］に記載の使用。
　［２６］　前記Ｈ型ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の１５ｍｏｌ％以上がプロトン化されている前記［２４］に記載の使用。
　［２７］　前記ウルバンのアルカリ金属イオン塩のカルボキシ基および硫酸基の３０ｍｏｌ％以上がアルカリ金属イオンと塩を形成している前記［２４］または［２５］に記載の使用。
　［２８］　ミトコンドリアを活性化することにより老化を抑制する前記［２４］～［２７］のいずれかに記載の使用。
　［２９］　抗酸化作用により老化を抑制する前記［２４］～［２７］のいずれかに記載の使用。
　［３０］　コラーゲン生合成を増強することにより老化を抑制する前記［２４］～［２７］のいずれかに記載の使用。
　［３１］　老化を抑制するためのＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩。
　［３２］　前記アルカリ金属がＮａおよび／またはＫである前記［３１］に記載のＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩。
　［３３］　前記Ｈ型ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の１５ｍｏｌ％以上がプロトン化されている前記［３１］に記載のＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩。
　［３４］　前記ウルバンのアルカリ金属イオン塩のカルボキシ基および硫酸基の３０ｍｏｌ％以上がアルカリ金属イオンと塩を形成している前記［３１］または［３２］に記載のＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩。
　［３５］　ミトコンドリアを活性化することにより老化を抑制する前記［３１］～［３４］のいずれかに記載のＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩。
　［３６］　抗酸化作用により老化を抑制する前記［３１］～［３４］のいずれかに記載のＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩。
　［３７］　コラーゲン生合成を増強することにより老化を抑制する前記［３１］～［３４］のいずれかに記載のＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩。
　本発明に係るアンチエイジング剤は、老化マーカーの低減、コラーゲンの産生促進、抗酸化酵素の発現の促進、ミトコンドリアの活性化など、客観的で且つ優れたアンチエイジング作用を示す。また、本発明に係るアンチエイジング剤の有効成分であるウルバン誘導体は、グルクロン酸や硫酸化されたラムロース等が重合した多糖類であり、安全性は高いと考えられる。よって本発明は、優れたアンチエイジング剤に関する技術として、産業上非常に優れている。
図１は、（１）対照（蒸留水のみ）、（２）天然ウルバン、（３）Ｈ型ウルバン、（４）ウルバン４１ｍｏｌ％アルカリ金属イオン（ＡＭＩ）塩、（５）ウルバン９３ｍｏｌ％ＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト皮膚繊維芽細胞に含まれる老化マーカーである老化βガラクトシダーゼを染色した拡大写真である。 図２は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、Ｈ型ウルバン、又はウルバンＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト皮膚繊維芽細胞５０あたりの、老化マーカーである老化βガラクトシダーゼを含むものの割合を示すグラフである。 図３は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、Ｈ型ウルバン、又はウルバンＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト皮膚繊維芽細胞が産生するコラーゲンの相対量を示すグラフである。 図４は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、Ｈ型ウルバン、又はウルバンＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト皮膚繊維芽細胞に含まれるタンパク質を分析したポリアクリルアミド電気泳動のβアクチンおよびミトコンドリアＳＯＤ２のバンドを含むゲルの写真である。 図５は、天然ウルバンまたはＨ型ウルバンを含む培地で培養したヒト皮膚繊維芽細胞に含まれるタンパク質を分析したポリアクリルアミド電気泳動のセリン／スレオニンキナーゼ（Ｔｏｔａｌ－ＡＫＴ）およびリン酸化ＡＫＴ（Ｐ－ＡＫＴ）のバンドを含むゲルの写真である。 図６は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、Ｈ型ウルバン、又はウルバンＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト皮膚繊維芽細胞のミトコンドリアの活性を示すミトコンドリア膜電位を示すグラフである。 図７は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、Ｈ型ウルバン、又はウルバンＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト皮膚繊維芽細胞が産生するＡＴＰの量を示すグラフである。 図８は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、又はＨ型ウルバンを含む培地で培養したヒト皮膚繊維芽細胞が産生する抗酸化タンパク質ＳＯＤの量を示すグラフである。 図９は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、Ｈ型ウルバン、又はウルバンＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト表皮角化細胞が産生する表皮防御因子であるＦｉｌａｇｇｒｉｎとミトコンドリアの抗酸化酵素ＳＯＤ２のｍＲＮＡの相対量を示すグラフである。 図１０は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、Ｈ型ウルバン、又はウルバンＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト表皮角化細胞が産生するミトコンドリアの抗酸化酵素ＳＯＤ２のｍＲＮＡの相対量を示すグラフである。 図１１は、対照（蒸留水のみ）、天然ウルバン、又はＫ型ウルバンＡＭＩ塩を含む培地で培養したヒト表皮角化細胞が産生するミトコンドリアの抗酸化酵素ＳＯＤ２のｍＲＮＡの相対量を示すグラフである。
　本発明に係るアンチエイジング剤は、有効成分としてＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属塩を含有する。
　ウルバンは、ミナミアオノリ等のアオノリ属（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ　ｓｐ．）緑藻類や、ミナミアオサ等のアオサ属（Ｕｌｖａ　ｓｐ．）緑藻類が産生する多糖類であり、グルクロン酸やイズロン酸などのウロン酸と、硫酸基を有するラムノース、ガラクトース、キシロース、グルコース等を含む硫酸化アニオン性多糖類である。ウルバン中、ウロン酸と硫酸化ラムノース等が交互重合している部分が約２／３～３／４あり、その他の部分では硫酸化ラムノース等が主に重合している。以下、天然由来のウルバンを天然ウルバンという場合がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　天然ウルバンの主な構造単位としては、以下の２つがある：
　・１→４型結合によってβ－Ｄ－グルクロン酸と３－サルフェートα－Ｌ－ラムノースが連結しているウルバノビウロン酸３－サルフェート型Ａ；
　・１→４型結合によってα－Ｌ－イズロン酸と３－サルフェートα－Ｌ－ラムノースが結合しているウルバノビウロン酸３－サルフェート型Ｂ。
　天然ウルバンは、主にマグネシウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、及びカリウムイオンを含み、カチオンの内マグネシウムイオンを最も多く含む。但し、アルギン酸などに比べてウルバンはゲル化し難く、マグネシウムイオンを多く含んでいてもゾル状態にあることが多い。
　天然ウルバンは、ミナミアオノリ等、ウルバンを含む藻類から常法により抽出することができる。例えば、ウルバンは水溶性であるので、原料藻類を微細化した後、溶媒として水などを加え、８０℃以上、１２０℃以下程度で抽出すればよい。ウルバンは一般的な有機溶媒に対して不溶性を示すため、抽出液にメタノール、エタノール、２－プロパノール等の水混和性有機溶媒を加えれば析出沈殿する。沈殿したウルバンを濾過や遠心分離などで溶媒から分離し、乾燥すればよい。
　本発明に係るアンチエイジング剤の有効成分であるＨ型ウルバンは、そのカルボキシ基および硫酸基の少なくとも一部がプロトン化、即ち－ＣＯ2Ｈおよび－ＯＳＯ3Ｈの状態にあるウルバンをいう。以下、ウルバンにおけるカルボキシ基および硫酸基を合わせて酸性基という場合がある。具体的には、ウルバンに含まれる総酸性基のモル数に対するプロトン化カルボキシ基（－ＣＯ2Ｈ）およびプロトン化硫酸基（－ＯＳＯ3Ｈ）の合計モル数の割合が、１０ｍｏｌ％以上であるウルバンをいう。当該割合としては、１５ｍｏｌ％以上が好ましく、１９ｍｏｌ％以上、２０ｍｏｌ％または以上３０ｍｏｌ％以上がより好ましく、３５ｍｏｌ％以上または４０ｍｏｌ％以上がより更に好ましい。当該割合の上限は特に制限されず、１００ｍｏｌ％であってもよいが、天然ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の全てをプロトン化することは難しい場合があるため、当該割合としては９５ｍｏｌ％以下または９０ｍｏｌ％以下が好ましく、８０ｍｏｌ％以下または７０ｍｏｌ％以下がより好ましい。なお、例えば、蟻酸の酸解離定数ｐＫａは３．７５であるが、硫酸のｐＫａは－３．０であり、硫酸のＫａは蟻酸の１０6.75倍である等、カルボキシ基に比べて硫酸基の方が酸として強いため、Ｈ型ウルバンでは硫酸基よりもカルボキシ基が優先的にプロトン化されていると考えられる。また、プロトン化されている酸性基の割合は、例えば誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）発光分光分析によりウルバン試料に含まれるカチオンを定量し、得られたデータからプロトン量も推定し、カチオンおよびプロトンが全て酸性基に存在していると仮定して求めることができる。
　本発明に係るアンチエイジング剤の有効成分であるウルバンアルカリ金属イオン塩は、天然ウルバンのカルボキシ基または硫酸基と塩を形成しているカルシウムイオンやマグネシウムイオン等の二価金属イオンの少なくとも一部が、アルカリ金属イオンに置換されているウルバンをいう。具体的には、ウルバンに含まれる総酸性基のモル数に対する二価イオンのモル数の割合が３０ｍｏｌ％以下であり、且つアルカリ金属イオンのモル数の割合が２０ｍｏｌ％以上であるウルバンをいう。二価イオンの上記割合としては２０ｍｏｌ％以下が好ましく、１０ｍｏｌ％以下がより好ましい。アルカリ金属イオンの上記割合としては３０ｍｏｌ％以上が好ましく、４０ｍｏｌ％以上がより好ましい。当該割合の上限は特に制限されず、１００ｍｏｌ％であってもよいが、天然ウルバンの酸性基の全てをアルカリ金属イオン塩にすることは難しい場合があるため、当該割合としては９５ｍｏｌ％以下または９０ｍｏｌ％以下が好ましく、８０ｍｏｌ％以下がより好ましい。本発明に係るＨ型ウルバンとウルバンのアルカリ金属イオン塩における総酸性基のモル数に対するプロトンおよびアルカリ金属イオンのモル数の割合は、例えば、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）発光分光分析により求めることができる。ＩＣＰ発光分光分析は、空気や試料中の水に含まれるＣ、Ｏ、Ｎ、Ｈは測定できないが、以下の手順により対象ウルバン試料の総酸性基のモル数やプロトンのモル数を推定することができ、また、酸性基に対するプロトンやアルカリ金属イオンの割合を算出することが可能になる：（１）遊離カチオンを除去するために、対象ウルバン試料を十分に洗浄し、（２）酸性基が全て金属イオン塩となるように、イオン交換樹脂などを使って洗浄した対象ウルバン試料を処理し、（３）洗浄した対象ウルバン試料と、金属イオン塩化した対象ウルバン試料をＩＣＰ発光分光分析に付し、（４）両分析データを比較する。
　本発明の有効成分は、Ｈ型ウルバンであっても、酸性基の一部がアルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩であってもよいしウルバンアルカリ金属イオン塩であっても、酸性基の一部がプロトン化されていてもよい。即ち、本発明の有効成分は、酸性基が十分にプロトン化およびアルカリ金属塩化しており、Ｈ型ウルバンともアルカリ金属塩ともいえるものであってもよい。
　アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン等が挙げられ、リチウムイオン、ナトリウムイオン、及びカリウムイオンからなる群から選択される１以上のアルカリ金属イオンが好ましく、ナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンがより好ましく、ナトリウムイオンがより更に好ましい。
　本発明に係るアンチエイジング剤の有効成分であるＨ型ウルバンおよびウルバンアルカリ金属イオン塩の分子量は、特に制限されないが、例えば１０，０００以上とすることができる。当該分子量としては、１００，０００以上が好ましく、２００，０００以上がより好ましく、５００，０００以上がより更に好ましい。当該分子量の上限は特に制限されないが、分子量が過剰に大きいと取り扱いが難しい場合があり得るので、当該分子量としては２，０００，０００以下が好ましく、１，５００，０００以下がより好ましく、１，０００，０００以下がより更に好ましい。
　Ｈ型ウルバンおよびウルバンアルカリ金属イオン塩は、常法に従って、天然ウルバンに含まれるカチオンをプロトン（Ｈ+）またはアルカリ金属イオンに置換することで製造することができる。例えば、天然ウルバンの水溶液にＯＨ型陰イオン交換樹脂を加え、０℃以上、１００℃以下で１０分間以上、１時間以下処理した後、濾過や遠心分離により陰イオン交換樹脂を除去することにより、天然ウルバンに含まれる硫酸イオンや塩化物イオン等のアニオンを吸着除去する。次に、ウルバン溶液にアルカリイオン型陽イオン交換樹脂を加え、０℃以上、１００℃以下で１０分間以上、１時間以下処理した後、濾過や遠心分離により陽イオン交換樹脂を除去することにより、ウルバンのアルカリ金属イオン塩を製造することができる。更に、ウルバンアルカリ金属イオン塩の水溶液にＨ型陽イオン交換樹脂を加え、０℃以上、１００℃以下で１０分間以上、１時間以下処理した後、濾過や遠心分離により陽イオン交換樹脂を除去することにより、Ｈ型ウルバンを製造することができる。Ｈ型ウルバンおよびウルバンアルカリ金属イオン塩の水溶液から、凍結乾燥などにより、Ｈ型ウルバンおよびウルバンアルカリ金属イオン塩を単離することができる。以下、Ｈ型ウルバンおよびウルバンアルカリ金属イオン塩をまとめてウルバン誘導体という場合がある。
　本発明に係るウルバン誘導体は、ミトコンドリアを活性化することが本発明者らの実験により見出されている。ミトコンドリアは、糖質、タンパク質、脂質などの代謝をつかさどり、エネルギー物質であるＡＴＰや熱を産生する。よって、本発明に係るウルバン誘導体は、ミトコンドリアの活性化を通じて、恒常的な生命活動を維持するためのエネルギーの供給に寄与したり、また、精神的な安定をもたらす４－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）や血糖値を低下させるインスリンの分泌を促進することも考えられる。
　また、本発明に係るウルバン誘導体は、本発明者らの実験的知見により、ミトコンドリアの抗酸化酵素の遺伝子発現と生合成を促進することが明らかにされている。生体内の活性酸素は、本来は体内に侵入した細菌やウイルスを攻撃して生体を保護する重要な働きを有するが、過剰な活性酸素は正常な細胞まで攻撃したり、また、活性酸素により生じた過酸化脂質が更に活性酸素を生じるという悪循環に陥ることがある。抗酸化酵素は、過剰な活性酸素を分解して無害化するものであるため、例えば、本発明に係るウルバン誘導体は、ミトコンドリアの抗酸化酵素の活性化を通じてミトコンドリアを活性化する他、健康の維持や肌の状態の維持に寄与することが考えられる。
　更に、本発明者らは、本発明に係るウルバン誘導体がコラーゲンの生合成を促進することを実験的に証明している。コラーゲンは、皮膚、腱、軟骨などを構成する繊維状のタンパク質であるが、加齢によりその前駆体からコラーゲンを生成する酵素が減少し、コラーゲンの生合成量が低下して、シワの発生や肌の張りの減少などに繋がることが知られている。よって、本発明に係るウルバン誘導体により、加齢によるシワの発生や肌の張りの減少など、肌の状態が改善されることが考えられる。
　本発明に係るアンチエイジング剤は、有効成分としてウルバン誘導体を含有する。有効成分とは、本発明に係るアンチエイジング剤に含まれる成分のうちアンチエイジング効果を発揮する成分をいい、換言すれば、本発明に係るアンチエイジング剤は、アンチエイジング効果が発揮される量のウルバン誘導体を含む。具体的には、特に制限されないが、例えば、本発明に係るアンチエイジング剤におけるウルバン誘導体の割合を１０質量％以上、１００質量％以下とすることができる。また、本発明に係るアンチエイジング剤が外用剤である場合には、ウルバン誘導体の割合を０．１質量％以上、１０質量％以下にすることもできる。
　本発明に係る動物の老化の抑制方法は、Ｈ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩を有効成分として含む本発明に係るアンチエイジング剤を前記動物に投与する工程を含む。Ｈ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩は、Ｈ型ウルバンおよびウルバンのアルカリ金属イオン塩の両方を投与してもよいし、Ｈ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩の一方を投与してもよい。
　本発明に係るアンチエイジング剤の投与頻度や投与量は、投与対象の年齢、性別、状態などに応じて適宜調整すればよく、アンチエイジング効果を発揮できる量を投与対象へ投与する。例えば、１日当たりのアンチエイジング剤の投与量としては１ｍｇ／ｋｇ体重以上、１ｇ／ｋｇ体重以下とすることができる。また、本発明に係るアンチエイジング剤が外用剤である場合には、一日当たりのアンチエイジング剤の塗布量としては０．１ｍｇ以上、１０ｍｇ以下とすることもできる。１日当たりの投与回数や塗布回数は特に限定されず、所望の投与範囲内において、単回または数回に分けて投与または塗布すればよい。
　本発明に係るアンチエイジング剤は、ヒトに限らず、ヒト以外の動物にも投与可能である。投与対象動物としては、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜；競走馬などの競技動物；イヌ、ネコなどの愛玩動物；マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物；ニワトリ、アヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽などが挙げられる。
　本発明に係るアンチエイジング剤の剤形は特に制限されず、例えば、ウルバン誘導体自体であってもよいし、他の成分と組み合わせた組成物であってもよいし、これらの溶液または懸濁液であってもよい。本発明に係るアンチエイジング剤の剤形としては、特に制限されないが、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、糖衣錠、顆粒剤、液剤、外用剤などを挙げることができる。本発明に係るアンチエイジング剤には、剤形に合わせ、薬学上許容される添加剤を用いてもよい。かかる添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料、凝集防止剤、防腐剤、有効成分の溶解補助剤、安定化剤などを挙げることができる。
　本発明に係るウルバン誘導体は、以下の実施例の通り、ミトコンドリアの活性化、抗酸化作用、コラーゲンの生合成の増強作用、コラーゲンの生合成の増強作用など、客観的で且つ優れたアンチエイジング作用を示す。また、本発明に係るウルバン誘導体は、藻類由来の多糖類をフリー体にしたりアルカリ金属イオン塩にしたものであるので、安全性は高いと考えられる。よって本発明に係るアンチエイジング剤は、アンチエイジング効果に優れた健康食品などとして恒常的に摂取することも可能であり得る。
　例えば、本発明に係るウルバン誘導体は、アンチエイジング剤として、一般的な飲食品とすることも可能である。本発明に係るウルバン誘導体を添加する飲食品は特に限定されないが、例えば、乳飲料、清涼飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンク、美容ドリンク、液体栄養剤などの飲料；チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ケーキ、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；蒲鉾、竹輪、半片などの練り製品；ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料；パン、ハム、雑炊、米飯、スープ、各種レトルト食品、各種冷凍食品などが挙げられる。本発明に係るウルバン誘導体を含有する飲食品は、いわゆる健康食品、サプリメント、機能性食品、機能性表示食品、栄養補助食品、特定保健用食品、栄養機能食品、介護食品、スマイルケア食、咀嚼・嚥下補助食品、濃厚流動食品、病者用食品などの用途に用いることができる。
　本願は、２０２２年１０月２５日に出願された日本国特許出願第２０２２－１７０７８９号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０２２年１０月２５日に出願された日本国特許出願第２０２２－１７０７８９号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１：　ウルバンＡＭＩ塩の製造
　（１）天然抽出ウルバンの製造
　ミナミアオノリをよく洗い凍結乾燥させた後、ブレンダーで粉砕した。得られた乾燥粉末（１ｇ）に蒸留水（２０ｍＬ）を加え、９０℃で熱水抽出した。上澄み液を回収し、残渣に蒸留水（２０ｍＬ）を加えて再度熱水抽出する操作を２回繰り返した。回収した水溶液（約６０ｍＬ）を濃縮後、エタノールを加えてエタノール濃度を７５％に調整し、ウルバンを沈殿させた。生じた沈殿を遠心分離で回収し、凍結乾燥することにより、天然抽出ウルバンを得た。
　（２）ウルバンＡＭＩ塩の製造
　ＮａＯＨ水溶液を用いて、Ｃｌ型陰イオン交換樹脂（「ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTM　ＩＲＡ４１０Ｃｌ」オルガノ社製）をＯＨ型陰イオン交換樹脂にした。天然抽出ウルバンの０．５％水溶液（１００ｇ）に、得られたＯＨ型陰イオン交換樹脂（０．５ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌した。上澄み液を回収し、再度、新たなＯＨ型陰イオン交換樹脂を加えて同様に処理した。ＯＨ型陰イオン交換樹脂による処理と上澄み液の回収を計５回繰り返し、ウルバン水溶液に混入する硫酸塩（ＳＯ4 2-）や塩化物イオン（Ｃｌ-）を除去した。
　得られたウルバン水溶液（約１００ｇ）に対して、Ｎａ型陽イオン交換樹脂（「ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTM　ＩＲ１２０ＢＮａ」オルガノ社製）（０．５ｇ）を用いて、ウルバンのカチオンサイトの陽イオンを部分的にＮａイオンと交換した後、凍結乾燥した。
　得られたウルバンＡＭＩ塩の分子量を、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）で測定した。また、得られたウルバンＡＭＩ塩に含まれるカチオン濃度を、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）発光分光分析により測定した。結果を表１に示す。なお、表１中、プロトンの濃度はＩＣＰ発光分光分析の結果に基づく推定値であり、「アルカリ金属イオン（ＡＭＩ）＋Ｈ+の割合」は、ＩＣＰ発光分光分析の結果から下記式により酸性基濃度を算出し、算出された酸性基濃度に対するアルカリ金属イオンとＨ+の割合として算出した。なお、得られたウルバンＮａ塩にプロトンはほとんど含まれていないため、酸性基に対するアルカリ金属イオンの割合は４１ｍｏｌ％であるといえる。
　　酸性基濃度＝（Ｎａ+濃度＋Ｋ+濃度＋Ｈ+濃度）＋２×（Ｃａ2+濃度＋Ｍｇ2+濃度）
　実施例２：　Ｈ型ウルバンの製造
　天然抽出ウルバンの０．５％水溶液（１００ｇ）に、前記ＯＨ型陰イオン交換樹脂（０．５ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌した。上澄み液を回収し、再度、新たなＯＨ型陰イオン交換樹脂を加えて同様に処理した。ＯＨ型陰イオン交換樹脂による処理と上澄み液の回収を計５回繰り返し、ウルバン水溶液に混入する硫酸塩（ＳＯ4 2-）や塩化物イオン（Ｃｌ-）を除去した。
　得られたウルバン水溶液（約１００ｇ）に対して、Ｎａ型陽イオン交換樹脂（「ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTM　ＩＲ１２０ＢＮａ」オルガノ社製）（０．５ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌した。更に、上澄み液（９０ｍＬ）にＨ型陽イオン交換樹脂（「ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTM　ＩＲ１２０ＢＨ」オルガノ社製）（０．４５ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌し、ウルバンのカチオンサイトの陽イオンを部分的にＨイオンと交換した後、凍結乾燥した。
　得られたＨ型ウルバンを、実施例１（２）と同様に分析した。結果を表１に示す。なお、得られたＨ型ウルバンにおいて酸性基に対するプロトンの割合は３８～４２ｍｏｌ％、アルカリ金属イオンの割合は１０ｍｏｌ％であった。
　実施例３：　ウルバンＡＭＩ塩の製造
　天然抽出ウルバンの０．５％水溶液（１００ｇ）に、前記ＯＨ型陰イオン交換樹脂（０．５ｇ）を加え、室温で３０分攪拌した。上澄み液を回収し、再度、新たなＯＨ型陰イオン交換樹脂を加えて同様に処理した。ＯＨ型陰イオン交換樹脂による処理と上澄み液の回収を計５回繰り返し、ウルバン水溶液に混入する遊離の硫酸イオン（ＳＯ4 2-）や塩化物イオン（Ｃｌ-）を除去した。
　次に、得られたウルバン水溶液（約１００ｇ）に対して、Ｈ型陽イオン交換樹脂（「ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTM　ＩＲ１２０ＢＨ」オルガノ社製）（０．５ｇ）を加え、室温で３０分攪拌し、樹脂を取り除き、再び３０分攪拌した。更に、上澄み液（９４．６ｍＬ）にＮａ型陽イオン交換樹脂（「ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTM　ＩＲ１２０ＢＮａ」オルガノ社製）（４７．３ｇ）を用いて、ウルバンのカチオンサイトの陽イオンのほとんどをＮａイオンと交換した後、凍結乾燥した。
　得られたウルバンＡＭＩ塩を、実施例１（２）と同様に分析した。結果を表１に示す。なお、得られたウルバンＮａ塩にプロトンはほとんど含まれていないため、酸性基に対するアルカリ金属イオン（ＡＭＩ）の割合は９３ｍｏｌ％であるといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例４：　老化マーカーである老化βガラクトシダーゼ活性の測定
　ＭＥＭα培地に、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを配合した培地を用い、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ細胞）を８０～８９日間培養することにより、老化細胞とした。
　天然ウルバン、実施例１のウルバンＡＭＩ塩、実施例２のＨ型ウルバン、又は実施例３のウルバンＡＭＩ塩を前記培地に５００μｇ／ｍＬの割合で添加し、前記ヒト皮膚線維芽老化細胞を更に３７℃で２４時間培養した。比較のために、別途、ウルバン類を添加しない以外は同様にして培養した。
　Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社製）を使って、製造元のプロトコルに従って培養後の細胞を固定液で固定して染色することにより、老化マーカーであるｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの活性を測定した。ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性がある細胞（老化細胞）は、青色に染色される。また培養した５０個の細胞のうち、青色で染色された細胞の数を計測した。染色細胞の拡大写真を図１に、染色細胞数を図２に示す。なお、図２中、「＊＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０１で対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べて有意差があることを示す。
　図１および図２に示される結果の通り、天然ウルバンを用いても、老化細胞の老化の指標となる老化βガラクトシダーゼの活性を有意に低下させることはできない。
　それに対して、カルボキシ基と結合するカウンターカチオンがプロトンおよび／またはナトリウムイオンに置換されているウルバンＡＭＩ塩およびＨ型ウルバンを用いれば、老化βガラクトシダーゼの活性を有意に低下できることが明らかとなった。
　実施例５：　コラーゲン産生能試験
　天然ウルバン、実施例１のウルバンＡＭＩ塩、実施例２のＨ型ウルバン、又は実施例３のウルバンＡＭＩ塩を５００μｇ／ｍＬの割合で添加した培地を用い、ヒト皮膚線維芽老化細胞を更に３７℃で７２時間培養し、試料を得た。比較のために、別途、ウルバン類を添加しない以外は同様に培養して試料を得た。得られた試料から細胞溶解液を調製し、含まれるタンパク質濃度を揃えた細胞溶解液２５μＬあたりの細胞層中のコラーゲンの量を、コラーゲン定量キット（コスモバイオ社製）を使用して、製造元のプロトコルに従って評価した。蛍光は、３８０ｎｍ／４８５ｎｍのフィルターペアを備えた蛍光マイクロプレートリーダー（「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００」ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。結果を図３に示す。図３中、「＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べて有意差があることを示し、「＊＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
　図３に示される結果の通り、天然ウルバンを用いても、皮膚の張り等に関係するコラーゲンの皮膚細胞による産生量を有意に増加させることはできない。
　それに対して、酸性基と結合するカウンターカチオンがアルカリ金属イオン（ＡＭＩ）に置換されているウルバンＡＭＩ塩、及びＨ型ウルバンを用いれば、皮膚細胞によるコラーゲンの産生量を有意に増加できることが明らかとなった。
　実施例６：　ＳＯＤ２生合成量の解析
　抗ＳＯＤ２抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と抗β－ａｃｔｉｎ（ｓｉｇｍａ社製）を用い、ＳＯＤ２生合成量を解析した。
　具体的には、実施例１のウルバンＡＭＩ塩、実施例２のＨ型ウルバン、又は実施例３のウルバンＡＭＩ塩を５００μｇ／ｍＬの割合で添加した培地を用い、ヒト皮膚線維芽老化細胞を更に３７℃で７２時間培養し、試料を得た。試料からタンパク質溶液を調製し、ポリアクリルアミド電気泳動に付した後、メンブレンに転写し、抗ＳＯＤ２抗体製品を１０００倍に、抗β－アクチン抗体を１００００倍に希釈し、メンブレンを浸漬し、４℃で１８時間インキュベートした後、洗浄した。次いで、ＨＲＰ標識抗ウサギおよび抗マウス二次抗体製品（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を５０００倍に希釈し、メンブレンを浸漬し、常温で１時間インキュベートした後、洗浄した。次に、メンブランをルミノール反応溶液に浸漬し、発光するまで常温で５～１０分間インキュベートした後、Ｘ線フィルムに感光させて現像した。
　ＳＯＤ２のバンドの蛍光強度を、各試料におけるβ－アクチンのバンドの蛍光強度で補正した。結果を図４に示す。図４中の「Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」は、上記補正値を示す。
　図４に示される結果の通り、ウルバンＡＭＩ塩およびＨ型ウルバンによれば、酸化ストレスにより老化の原因となる活性酸素種を酸素と過酸化水素に不均化するＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）のうち、ミトコンドリア内で産生されるＳＯＤ２の生合成量を増加できることが証明された。
　実施例７：　活性化ＡＫＴ（リン酸化）の解析
　抗リン酸化ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と抗ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用い、セリン／スレオニンキナーゼ（ＡＫＴ）の活性化を解析した。
　具体的には、天然ウルバンまたはＨ型ウルバンを１００μｇ／ｍＬの割合で添加した培地を用い、ヒト皮膚線維芽老化細胞を更に３７℃で表記の時間培養し、試料を得た。試料からタンパク質溶液を調製し、ポリアクリルアミド電気泳動に付した後、メンブレンに転写し、抗リン酸化ＡＫＴ抗体製品を１０００倍に、抗ＡＫＴ抗体を１０００倍に希釈し、メンブレンを浸漬し、４℃で１８時間インキュベートした後、洗浄した。次いで、ＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体製品（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を５０００倍に希釈し、メンブレンを浸漬し、常温で１時間インキュベートした後、洗浄した。次に、メンブランをルミノール反応溶液に浸漬し、発光するまで常温で５～１０分間インキュベートした後、Ｘ線フィルムに感光させて現像した。結果を図５に示す。
　ＡＫＴの活性化により細胞の増殖が促進されるため、老化により低下している細胞の増殖をＨ型ウルバンが促進している可能性がある。また、天然ウルバンにはＡＫＴを活性化する働きがないため、Ｈ型ウルバンにすることにより、この効果は初めて発現する。
　実施例８：　ミトコンドリア活性試験
　天然ウルバン、実施例１のウルバンＡＭＩ塩、実施例２のＨ型ウルバン、又は実施例３のウルバンＡＭＩ塩を前記培地に５００μｇ／ｍＬの割合で添加し、前記ヒト皮膚線維芽老化細胞を更に３７℃で２４時間培養した。比較のために、別途、ウルバン類を添加しない以外は同様にして培養した。
　次いで、ミトコンドリアの活性を、ミトコンドリア膜電位検出試薬（「ＴＭＲＭ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）」Ｔｈｅｒｍｏ社製）を使って、製造元のプロトコルに従って、ＴＭＲＭ染色により測定した。蛍光は、５３５ｎｍ／５９０ｎｍのフィルターペアを使用して、蛍光マイクロプレートリーダー（「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００」ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
　ミトコンドリアの活性が高い場合には膜電位差が維持され、低分子蛍光色素であるＴＭＲＭが集積して、より強い蛍光が発せられ、活性が低下すると膜電位差も低下し、ＴＭＲＭが集積せずに弱い蛍光が発せられる。よって、ミトコンドリアの活性は、５３５ｎｍ／５９０ｎｍで測定された波長の蛍光強度として測定できる。結果を、対照例に対するｕｌｖａｎ等の処理例の比として図６に示す。図６中、「＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で有意差があることを示す。「＊＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
　図６に示される結果の通り、Ｈ型ウルバンおよびウルバンＡＭＩ塩は、エネルギー生産、延いては細胞の活性に関係するミトコンドリアの活性を有意に改善できることが明らかとなった。
　実施例９：　ＡＴＰ産生量
　天然ウルバン、実施例１のウルバンＡＭＩ塩、実施例２のＨ型ウルバン、又は実施例３のウルバンＡＭＩ塩を前記培地に５００μｇ／ｍＬの割合で添加し、前記ヒト皮膚線維芽老化細胞を更に３７℃で２４時間培養し、試料を得た。比較のために、別途、ウルバン類を添加しない以外は同様にして培養した。次いでＡＴＰの産生量については、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０　Ａｓｓａｙ（ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使って、製造元のプロトコルに従って測定した。発光はＰｒｏｍｅｇａ　ＧｌｏＭａｘ　２０／２０　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒにより測定した。結果を、対照例に対するｕｌｖａｎ等の処理例の比として図７に示す。「＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で有意差があることを示す。「＊＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
　図７に示される結果の通り、天然ウルバンとウルバン４１ｍｏｌ％ＡＭＩ塩は、皮膚細胞における生体内化学反応のエネルギー伝達物質であるＡＴＰの産生量を有意に増加せしめることができ、Ｈ型ウルバンおよびウルバン９３ｍｏｌ％ＡＭＩ塩は、かかるＡＴＰ産生量を更に増加させることができることが明らかとなった。
　実施例１０：　抗酸化活性測定
　天然ウルバン、ウルバンＨを前記培地に図８に示される割合で添加し、前記ヒト皮膚線維芽老化細胞を更に３７℃で４８時間培養し、試料を得た。比較のために、別途、ウルバン等を添加しない以外は同様に培養して試料を得た。
　得られた試料の抗酸化活性を、抗酸化能測定キット（「ＳＯＤ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ－ＷＳＴ」Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、製造元のプロトコルに従って評価した。蛍光は、３８０ｎｍ／４８５ｎｍのフィルターペアを備えた蛍光マイクロプレートリーダー（「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００」ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。結果を図８に示す。図８中、「＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で有意差があることを示す。「＊＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
　図８に示される結果の通り、天然ウルバンでは抗酸化タンパク質量を有意には増加させることができないのに対して、Ｈ型ウルバンによれば、抗酸化タンパク質量を有意に増加できることが示された。
　実施例１１：　ｍＲＮＡの発現解析
　ウルバン、Ｈ型ウルバン、又はウルバン９３ｍｏｌ％ＡＭＩ塩を５００μｇ／ｍＬの割合で添加した培地を用い、ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞（ＡＤ：ａｄｕｌｔ））（クラボウ社製）を更に３７℃で２４時間培養し、培養開始から２４時間後に試料を採取し、高効率リアルタイムＰＣＲ用マスターミックス（「ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｎｅｘｔ　ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ」東洋紡社製）を使って、表皮防御因子であるＦｉｌａｇｇｒｉｎとミトコンドリアの抗酸化酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）の遺伝子発現を定量した。全ＲＮＡは、内部標準としてβ－アクチン相補ＤＮＡを使用して、各反応でノーマライズした。結果を図９に示す。図９中、「＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で有意差があることを示す。「＊＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
　図９に示される結果の通り、天然ウルバンでは表皮防御因子であるＦｉｌａｇｇｒｉｎとミトコンドリアの抗酸化酵素であるＳＯＤ２の発現を有意には促進させることができないのに対して、Ｈ型ウルバンおよびウルバン９３ｍｏｌ％ＡＭＩ塩によれば、ＦｉｌａｇｇｒｉｎとＳＯＤ２の発現を有意に増加できることが示された。
　実施例１２：　Ｈ型ウルバンの製造
　実施例１（１）の天然ウルバンと実施例２のＨ型ウルバン（Ｈ+割合：３８～４２ｍｏｌ％）を混合し、酸性基に対するプロトンの割合が１９～２１ｍｏｌ％、アルカリ金属イオンの割合が１５ｍｏｌ％であるＨ型ウルバンを調製した。
　実施例１３：　ウルバンＡＭＩ塩の製造
　実施例１（１）の天然ウルバンと実施例１のウルバンＡＭＩ塩（ＡＭＩ割合：４１ｍｏｌ％）を混合し、酸性基に対するアルカリ金属イオンの割合が３０ｍｏｌ％であるウルバンＡＭＩ塩を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１４：　ｍＲＮＡの発現解析
　実施例１１と同様にして、天然ウルバン、実施例２のＨ型ウルバン（Ｈ+割合：３８～４２ｍｏｌ％）、実施例１２のＨ型ウルバン（Ｈ+割合：１９～２１ｍｏｌ％）、実施例１のウルバンＡＭＩ塩（ＡＭＩ割合：４１ｍｏｌ％）および実施例１３のウルバンＡＭＩ塩（ＡＭＩ割合：３０ｍｏｌ％）を添加した培地におけるヒト表皮角化細胞由来のスーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）の遺伝子発現を定量した。Ｈ型ウルバンの結果を図１０（１）に、ウルバンＡＭＩ塩の結果を図１０（２）に示す。図１０中、「＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で有意差があることを示す。「＊＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
　図１０に示される結果の通り、天然ウルバンではミトコンドリアの抗酸化酵素であるＳＯＤ２の発現を有意には促進させることができないのに対して、プロトン割合が比較的低いＨ型ウルバンおよびＡＭＩ割合が比較的低いウルバンＡＭＩ塩であっても、ＳＯＤ２の発現を有意に増加できることが示された。
　実施例１５：　Ｋ型ウルバンＡＭＩ塩の製造
　実施例１（２）と同様にして得られたウルバン水溶液（約１００ｇ）に対して、Ｈ型陽イオン交換樹脂（「ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTM　ＩＲ１２０ＢＨ」オルガノ社製，０．５ｇ）を加え、室温で３０分攪拌した。樹脂を取り除き、再び３０分攪拌した。別途、硝酸カリウムを用い、Ｈ型陽イオン交換樹脂（「ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTM　ＩＲ１２０ＢＨ」オルガノ社製）のＨ+をＫ+に交換し、Ｋ型陽イオン交換樹脂を調製した。樹脂を取り除いたウルバン水溶液（９８ｍＬ）にＫ型陽イオン交換樹脂（１．０ｇ）を加え、室温で３０分攪拌してウルバンのカチオンサイトの陽イオンをカリウムイオンに交換した。樹脂を取り除き、再び３０分攪拌した後、凍結乾燥して、Ｋ型ウルバンＡＭＩ塩を得た。
　得られたＫ型ウルバンＡＭＩ塩を実施例１（２）と同様に分析したところ、酸性基に対するアルカリ金属イオンの割合は５９ｍｏｌ％であった。分析結果を表３に示す。
　実施例１６：　Ｋ型ウルバンＡＭＩ塩の製造
　Ｋ型陽イオン交換樹脂の使用量を１．０ｇから２．５ｇに変更した以外は実施例１２と同様にして、Ｋ型ウルバンＡＭＩ塩を得た。
　得られたＫ型ウルバンＡＭＩ塩を実施例１（２）と同様に分析したところ、酸性基に対するアルカリ金属イオンの割合は６９ｍｏｌ％であった。分析結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例１７：　ｍＲＮＡの発現解析
　実施例１１と同様にして、天然ウルバン、及び実施例１５，１６のＫ型ウルバンＡＭＩ塩を添加した培地におけるヒト表皮角化細胞由来のスーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）の遺伝子発現を定量した。結果を図１１に示す。図１１中、「＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で有意差があることを示す。「＊＊」は、二元配置分散分析に続くＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによりｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
　図１１に示される結果の通り、カリウムイオンが比較的多いウルバンＡＭＩ塩もＳＯＤ２の発現を有意に増加できることが示され、ＡＭＩの割合が大きいほど効果が高い傾向があることが示された。

Claims (23)

  1. 　Ｈ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩を有効成分として含有することを特徴とするアンチエイジング剤。
  2. 　前記アルカリ金属がＮａおよび／またはＫである請求項１に記載のアンチエイジング剤。
  3. 　前記Ｈ型ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の１５ｍｏｌ％以上がプロトン化されている請求項１に記載のアンチエイジング剤。
  4. 　前記ウルバンのアルカリ金属イオン塩のカルボキシ基および硫酸基の３０ｍｏｌ％以上がアルカリ金属イオンと塩を形成している請求項１に記載のアンチエイジング剤。
  5. 　ミトコンドリア活性化作用を示す請求項１に記載のアンチエイジング剤。
  6. 　抗酸化作用を示す請求項１に記載のアンチエイジング剤。
  7. 　コラーゲン生合成増強作用を示す請求項１に記載のアンチエイジング剤。
  8. 　老化を抑制するためのＨ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩の使用。
  9. 　前記アルカリ金属がＮａおよび／またはＫである請求項８に記載の使用。
  10. 　前記Ｈ型ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の１５ｍｏｌ％以上がプロトン化されている請求項８に記載の使用。
  11. 　前記ウルバンのアルカリ金属イオン塩のカルボキシ基および硫酸基の３０ｍｏｌ％以上がアルカリ金属イオンと塩を形成している請求項８に記載の使用。
  12. 　ミトコンドリアを活性化することにより老化を抑制する請求項８に記載の使用。
  13. 　抗酸化作用により老化を抑制する請求項８に記載の使用。
  14. 　コラーゲン生合成を増強することにより老化を抑制する請求項８に記載の使用。
  15. 　動物の老化を抑制するための方法であって、
    　Ｈ型ウルバンまたはウルバンのアルカリ金属イオン塩を前記動物に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
  16. 　前記アルカリ金属がＮａおよび／またはＫである請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記Ｈ型ウルバンのカルボキシ基および硫酸基の１５ｍｏｌ％以上がプロトン化されている請求項１５に記載の方法。
  18. 　前記ウルバンのアルカリ金属イオン塩のカルボキシ基および硫酸基の３０ｍｏｌ％以上がアルカリ金属イオンと塩を形成している請求項１５に記載の方法。
  19. 　前記動物がヒトである請求項１５に記載の方法。
  20. 　前記動物がヒト以外の動物である請求項１５に記載の方法。
  21. 　ミトコンドリアを活性化することにより老化を抑制する請求項１５に記載の方法。
  22. 　抗酸化作用により老化を抑制する請求項１５に記載の方法。
  23. 　コラーゲン生合成を増強することにより老化を抑制する請求項１５に記載の方法。
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