WO2024076121A1 - Cd5를 표적하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포 - Google Patents

Cd5를 표적하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포 Download PDF

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WO2024076121A1
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cells
car
mcb
amino acid
fusion protein
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김승민
이은솔
선현승
김한솔
조성림
정미영
민보경
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주식회사 지씨셀
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to an immune cell expressing a chimeric antigen receptor that specifically recognizes CD5 and IL-15; and a method of treating CD5 positive tumors using the same.
  • Natural Killer (NK) cells are lymphoid cells that make up approximately 10% of blood cells and play an important role in immune responses. NK cells are important members of innate immune defense and are suitable for adaptive cellular immunotherapy, which kills cancer cells or cells infected with exogenous pathogens.
  • CAR chimeric antigen receptors
  • T cells T cells
  • CAR chimeric antigen receptors
  • CAR is an artificial receptor designed to deliver antigen specificity to immune cells and includes an extracellular antigen binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain selected to activate immune cells such as T cells and provide specific immunity.
  • the extracellular antigen binding domain may contain a single-chain variable fragment (scFv) targeting an identified tumor antigen, thereby triggering cancer cell-specific activation of immune cells expressing the tumor antigen.
  • scFv single-chain variable fragment
  • OX40 ligand (CD252) is a protein belonging to the TNFR superfamily and is expressed in antigen-presenting cells (APC), some natural killer cells, and B cells, and is expressed within hours to days after activation of these cells. It is known that OX40 (CD134), a receptor for OX40 ligand, is expressed on T cells and is known to be expressed on T cells activated by CD28. Expression of OX40 further strengthens the T cell response by CD28 activation, thereby increasing T cell proliferation, cytokine secretion, and survival.
  • APC antigen-presenting cells
  • CD134 a receptor for OX40 ligand
  • CD5 is a type I glycoprotein and a member of the scavenger-receptor family. CD5 is expressed by thymocytes, mature T cells, and mature B cells and is known to be involved in the regulation of lymphocyte activation and differentiation processes. CD5 relaxes the BCR's activation signal, allowing B-1 cells to be activated only by very strong stimuli (such as bacterial proteins) rather than normal tissue proteins. CD5 is highly expressed in various blood cancers, including acute T lymphocytic leukemia and peripheral T-cell lymphoma, and solid cancers such as breast cancer and thymic cancer, and its expression is suppressed in normal cells, so it is being actively studied as a therapeutic target for these tumors. .
  • the present inventors have made extensive research efforts to develop efficient immune cell treatments for various CD5-positive tumors, including lymphocytic leukemia.
  • a fusion protein combining IL-15 and a chimeric antigen receptor containing OX40L as an intracellular signaling domain is expressed in immune cells, the survival rate, in vitro proliferation rate, and antitumor activity of immune cells are all significantly improved, leading to therapeutic potential.
  • the present invention was completed by discovering that not only an effective amount of cells can be easily obtained, but also that they can be used as an efficient cell therapy agent that exhibits excellent anticancer effects against CD5-positive tumors even at a low dose.
  • an object of the present invention is a chimeric antigen receptor comprising an intracellular signaling domain comprising an OX40 ligand and an extracellular antigen binding domain that binds to CD5; and providing a fusion protein containing IL-15.
  • Another object of the present invention is to provide immune cells expressing the fusion protein and a composition for preventing or treating CD5 positive tumors containing the same as an active ingredient.
  • the present invention provides a fusion protein comprising:
  • OX40L OX40 ligand
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present inventors have made extensive research efforts to develop efficient immune cell treatments for various CD5-positive tumors, including lymphocytic leukemia.
  • a fusion protein combining IL-15 and a chimeric antigen receptor containing OX40L as an intracellular signaling domain is expressed in immune cells, the survival rate, in vitro proliferation rate, and antitumor activity of immune cells are all significantly improved, leading to therapeutic potential.
  • OX40L chimeric antigen receptor containing OX40L
  • fusion protein refers to a recombinant protein molecule in which an amino acid sequence derived from a specific protein or domain is fused with another amino acid sequence derived from a different protein or domain.
  • Each amino acid sequence having a different origin may be connected directly within the fusion protein, or may be connected through a linker sequence, tag sequence, self-cleaving sequence, or a combination thereof.
  • the amino acid sequence of the chimeric antigen receptor (CAR) and the amino acid sequence of the IL-15 protein may be linked directly or indirectly through a linker, tag, self-cleavage sequence, or a combination thereof, and are known in the art. It can be produced by advanced recombinant technology or expressed in target cells.
  • extracellular antigen binding domain means that when a chimeric antigen receptor is expressed in a target cell (e.g., an immune cell), it is located in the extracellular portion and specifically recognizes the target antigen, thereby causing immunity. It is a domain for specifically activating the cell death activity of target cells (e.g., cancer cells), such as antigen binding of antibodies such as Fc receptors and single-chain variable fragments (single-chain variable fragment, ScFv). It may be a short story. Accordingly, in the present invention, the term “extracellular antigen binding domain” is used with the same meaning as “extracellular domain,” “antigen recognition fragment,” or “antigen binding fragment.”
  • the extracellular antigen binding domain is an antigen binding fragment of an anti-CD5 antibody.
  • antibody refers to an antibody against the CD5 protein that specifically recognizes and binds to a specific epitope thereof, and includes not only the full-length antibody form but also an antigen-binding fragment of the antibody molecule (antibody fragment). It means.
  • a complete antibody has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, with each light chain connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types and is subclassed as gamma1 ( ⁇ 1), gamma2 ( ⁇ 2), and gamma3 ( ⁇ 3). ), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1), and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • antigen-binding fragment of an antibody refers to a fragment that retains the antigen-antibody binding function within the entire antibody molecule, specifically Fab fragment, F(ab') fragment, and F(ab')2. fragment and Fv fragment.
  • Fab has a structure that includes variable regions of the light and heavy chains, a constant region of the light chain, and the first constant region (C H1 ) of the heavy chain, and has one antigen binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain.
  • F(ab')2 antibody is produced when cysteine residues in the hinge region of Fab' form a disulfide bond.
  • Fv is the minimum antibody fragment containing only the heavy chain variable region and light chain variable region.
  • Double-chain Fv (two-chain Fv) is a single-chain Fv (ScFv) in which the heavy chain variable region and light chain variable region are linked non-covalently. ) is generally covalently connected to the variable region of the heavy chain and the variable region of the short chain through a peptide linker or directly connected at the C-terminus, so that it can form a dimer-like structure like double-chain Fv.
  • These antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab')2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), and gene It can also be produced through recombinant technology.
  • the antigen-binding fragment of the antibody used in the present invention is the ScFv of the anti-CD5 antibody.
  • the term “heavy chain” refers to a full-length variable region domain including an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen, V H , and three constant region domains C H1 , C H2 , and C H3. refers to both heavy chains and fragments thereof.
  • the term “complementarity determining region (CDR)” refers to the amino acid sequence of the hypervariable region of immunoglobulin heavy and light chains.
  • the heavy chain (HCDR1, HCDR2, and HCDR3) and light chain (LCDR1, LCDR2, and LCDR3) each contain three CDRs, which provide key contact residues for the antibody to bind to the antigen or epitope.
  • antibodies or antibody fragments of the present invention includes variants with conservative amino acid substitutions in the CDR regions.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention may include variants of the amino acid sequence described in the attached sequence list within the range that can specifically recognize phosphorylated PLC ⁇ 2.
  • additional changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the antibody.
  • Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody. These amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
  • Amino acid exchanges in proteins that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/ Exchanges between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly.
  • the antigen recognition fragment of the antibody of the present invention or the nucleic acid molecule encoding the same is interpreted to include sequences showing substantial identity with the sequences listed in the sequence listing.
  • the above substantial identity is at least 80% when aligning the sequence of the present invention and any other sequence to correspond as much as possible and analyzing the aligned sequence using an algorithm commonly used in the art.
  • Homology according to one specific example, 85% homology, according to another specific example, 90% homology, according to another specific example, 95% homology, and according to another specific example, 99% homology. It means sequence. Alignment methods for sequence comparison are known in the art (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math . (1981) 2:482; Huang et al . Comp. Appl. BioSci . (1992) 8:155-65 and Pearson et al . Meth. Mol. Biol . (1994) 24:307-31).
  • the extracellular antigen binding domain is HCDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • HCDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26
  • HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28
  • HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • HCDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26
  • HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28
  • HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • the heavy chain variable region includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32.
  • the extracellular antigen binding domain includes LCDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, LCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and LCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38. It additionally contains a light chain variable region containing LCDR3.
  • the light chain variable region includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
  • extracellular antigen binding domain used in the present invention includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the intracellular signaling domain additionally includes one or more domains selected from the group consisting of CD28, CD3-zeta, OX40, and 4-1BB. More specifically, the intracellular signaling domain additionally includes CD28 and CD3-zeta.
  • the intracellular signaling domains include CD28, OX40L and CD3-zeta in that order from the cell membrane to the intracellular direction.
  • the fusion protein additionally includes a self-cleaving peptide located between the chimeric antigen receptor and the IL-15. More specifically, the self-cleaving peptide includes the amino acid sequence of sequence 21 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of sequence number 21 is the amino acid sequence of the T2A self-cleaving peptide.
  • T2A self-cleaving peptide is a type of 2A-self-cleaving peptide that cleaves a full-length protein into short peptide fragments by inducing ribosomal skipping during the intracellular protein translation process, and contains 18 amino acids in sequence number 21 (EGRGSLLTCGDVEENPGP).
  • a GSG (Gly-Ser-Gly) sequence may be added to the N-terminus to enhance the self-cleavage activity of the amino acid sequence of sequence 21 of the sequence listing.
  • the chimeric antigen receptor and IL-15 of the present invention can be cleaved and expressed by the T2A self-cleaving peptide of the present invention.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the above-described fusion protein of the present invention.
  • nucleic acid molecule is meant to comprehensively include DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic structural units in nucleic acid molecules, include not only natural nucleotides but also analogs with modified sugar or base sites. (analogue) is also included (Scheit, Nucleotide Analogs , John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90:543-584 (1990)).
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be inserted into a gene delivery system and introduced into the target cell in order to express the above-described fusion protein of the present invention in target cells, such as immune cells.
  • the term “express” means causing a target cell to express an exogenous gene or artificially introducing it using a gene delivery system to increase the natural expression level of an endogenous gene, thereby allowing the gene to enter the target cell. This means that replication becomes possible as an extrachromosomal factor or through completion of chromosomal integration. Accordingly, the term “expression” has the same meaning as “transformation,” “transfection,” or “transduction.”
  • gene carrier or “gene delivery system” refers to any means for transporting a gene into a cell, and gene delivery has the same meaning as transduction of a gene into a cell. At the cellular or tissue level, gene transfer is synonymous with gene spread. Accordingly, the gene delivery system of the present invention can be described as a gene penetration system and a gene diffusion system.
  • the nucleotide sequence of the present invention is preferably operably linked to a suitable expression control sequence within a suitable expression construct.
  • a suitable expression control sequence e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional factor binding sites
  • the promoter linked to the gene of interest of the present invention operates specifically in animal cells, more specifically in mammalian cells, and most specifically in immune cells, and is capable of regulating transcription of the gene of interest, derived from a mammalian virus.
  • Promoters and promoters derived from the genome of mammalian cells such as the CMV (mammalian cytomegalovirus) promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, tk promoter of HSV, RSV promoter, EF1 Alpha promoter, metallothionein promoter, beta-actin promoter, promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene and promoter of human GM-CSF gene. Includes, but is not limited to.
  • the nucleotide sequence of the target gene can be applied to all gene delivery systems used for conventional gene introduction, such as plasmids, adenoviruses (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080 (1997) ), Adeno-associated viruses (AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), retroviruses (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors) . Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest.
  • the gene delivery vehicle used in the present invention is a viral vector. More specifically, the virus is selected from the group consisting of lentivirus, adenovirus, Adeno-associated viruses (AAV), retrovirus, herpes simplex virus and vaccinia virus, most specifically lentivirus. It's a virus.
  • the present invention provides an immune cell expressing the nucleic acid molecule of the present invention described above.
  • immune cell refers to all cells involved in the process of initiating or promoting an immune response, and more specifically, refers to an immune effector cell.
  • Immune cells include, but are not limited to, T cells, B cells, natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and mast cells. More specifically, the immune cells are natural killer cells.
  • the present invention provides an immune cell expressing:
  • OX40L OX40 ligand
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the immune cell of the present invention may express the chimeric antigen receptor and IL-15 in the form of a single fusion protein in which the chimeric antigen receptor and IL-15 are combined together, and as in the present embodiment, the chimeric antigen receptor and IL-15 -15 can also be expressed as individual protein molecules without binding.
  • the chimeric antigen receptor and IL-15 may be co-transformed into immune cells by inserting the nucleic acid molecules encoding them into individual gene carriers, or they may be inserted together into one gene carrier and transformed.
  • the immune cells used in the present invention are natural killer cells, and more specifically, the natural killer cells are 23 to 35 days, more specifically 25 to 33 days, and most specifically, 23 to 35 days. These are natural killer cells that have been frozen and thawed after culturing for 28 to 30 days.
  • culture refers to inducing cells to grow and proliferate while maintaining biological activity in an in vitro environment such as a culture medium.
  • culture medium refers to a mixture for efficiently inducing and promoting the growth and proliferation of cells in vitro , which contains essential elements for the growth and proliferation of cells such as sugars, amino acids, minerals and other nutrients. It has an inclusive meaning.
  • Cell culture media can be optimized depending on the type of specific cell and its phenotype and culture characteristics, for example, basic culture media prepared to support cell growth, culture media prepared to promote recombinant production of proteins from cells. , there is a concentrated medium made by concentrating nutrients to a high concentration.
  • freezes refers to stably maintaining cells for a short or long period of time at a low temperature, specifically at an ultra-low temperature of -80°C to -200°C. .
  • Cells generally mutate at a rate of about 1 in 10,000 during the culture process, and if cell passage continues for a long period of time, they may degenerate into a cell population different from the original cell population or lose their unique biological activities and functions. Since it can be lost and the risk of infection by mycoplasma etc. increases in proportion to the period, the method of freezing cells is widely used to preserve the unique characteristics of cells.
  • the present inventors have found that the gene transfer rate and cell death rate are greatly improved when culturing immune cells, especially natural killer cells with low gene introduction efficiency using lentiviral vectors, for an appropriate period of time followed by a freezing process. Therefore, the freezing step performed in the present invention may be performed only for a short period of time, unlike cryopreservation, which is performed for the purpose of long-term preservation of cells.
  • Freezing of cells can be performed by treating them with a cryoprotectant that can minimize damage to cells due to the formation of ice crystals and ionic and osmotic pressure imbalance that inevitably accompany the freezing and thawing process.
  • Freezing medium may include, for example, dextran, albumin and/or DMSO to improve the safety and stability of cells while they are frozen.
  • the term “thawing” refers to the process of increasing the temperature of frozen or cryopreserved cells until they become living cells in a soft state in order to resume life activities. Thawing can usually be done quickly by taking ultra-low-temperature frozen cells out of a liquid nitrogen tank and placing them in a 37°C constant temperature water bath.
  • the freezing and thawing process of the present invention is aimed at improving the gene introduction efficiency of cells and enhancing the killing activity of pathogenic cells, rather than long-term storage of cells, the freezing and thawing process is started immediately after freezing is completed without a time interval. Or, if necessary, an appropriate time gap can be left between the freezing process and the thawing process.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating CD5 positive tumors comprising the above-described immune cells of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating CD5 positive tumors, comprising administering the above-described immune cells of the present invention to a subject.
  • treatment refers to (a) inhibiting the development of a disease, condition or symptom; (b) alleviation of a disease, condition or symptom; or (c) means eliminating a disease, condition or symptom.
  • the immune cells introduced with the target gene of the present invention a chimeric antigen receptor-encoding nucleic acid molecule that specifically recognizes CD5
  • they induce the death of CD5-positive cancer cells, thereby preventing various CD5-positive tumors, including lymphocytic leukemia. It plays a role in suppressing the development of symptoms, eliminating them, or alleviating them.
  • composition of the present invention may itself be a cell therapy composition for the disease, or may be administered together with other pharmacological ingredients and applied as a treatment adjuvant for the disease.
  • treatment or “therapeutic agent” includes the meaning of “therapeutic aid” or “therapeutic aid.”
  • administer refers to directly injecting a therapeutically effective amount of the composition of the present invention into a subject so that the same amount is formed in the subject's body.
  • the term “therapeutically effective amount” refers to the content of the composition contained in a sufficient amount to provide a therapeutic or prophylactic effect to the individual to whom the composition of the present invention is to be administered, and includes “prophylactically effective amount”. It means.
  • the term “subject” includes, without limitation, humans, mice, rats, guinea pigs, dogs, cats, horses, cattle, pigs, monkeys, chimpanzees, baboons, or rhesus monkeys. Specifically, the subject of the present invention is a human.
  • CD5 positive tumor refers to a solid tumor or blood cancer in which CD is measurably highly expressed compared to normal cells or CD5 negative tumors.
  • CD5 is expressed in 85% of acute T-lineage acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) and 75% of peripheral T-cell lymphomas, including mantle cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). It is a transmembrane receptor protein highly expressed in leukemia and hairy cell leukemia, and its expression is suppressed in normal cells, making it an effective treatment and diagnostic target for tumors.
  • T-ALL acute T-lineage acute lymphoblastic leukemia
  • B-CLL chronic lymphocytic leukemia
  • CD5-positive tumors that can be prevented or treated with the composition of the present invention include, but are not limited to, blood cancers such as leukemia, lymphoma, and multiple myeloma, and solid cancers such as breast cancer and thymic cancer, and CD5 can be measured on the surface of tumor cells. It includes all malignant tumors that can be specifically recognized by the immune cells of the present invention by expressing them at a level.
  • the CD5 positive tumor is T lymphocytic leukemia, and more specifically, acute T lymphocytic leukemia.
  • Immune cells, specifically natural killer cells, of the present invention may be included in an amount of 10 to 95% by weight based on the total weight of the composition for preventing or treating CD5-positive tumors containing them as an active ingredient.
  • the composition of the present invention may be formulated to further include one or more anticancer pharmacological ingredients that exhibit the same or similar functions in addition to natural killer cells, which are pharmacological ingredients.
  • the dosage of the composition is determined by the type of CD5-positive tumor, the severity of the disease, the type and content of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation, and the patient's age, weight, general health, gender and diet, and administration time. , can be adjusted according to various factors, including the route of administration and secretion rate of the composition, treatment period, and concurrently used drugs.
  • the dosage of natural killer cells according to the present invention may be, for example, 0.01 x 10 7 cells/kg to 1.0 x 10 9 cells/kg, and 0.5 x 10 7 cells/kg to 1.0 x It may be 10 8 cells/kg.
  • composition of the present invention can be administered to an individual by various cell therapy injection methods known in the art.
  • the route of administration can be appropriately selected by a person skilled in the art considering the administration method, volume of body fluid, viscosity, etc.
  • the composition of the present invention can be administered parenterally, specifically intravenously, subcutaneously, or intraperitoneally, and most specifically intravenously.
  • the present invention provides an immune cell co-expressing a chimeric antigen receptor containing an OX40 ligand as an intracellular signaling domain and IL-15, and a composition for preventing or treating cancer containing the same as an active ingredient.
  • the immune cells of the present invention not only exhibit synergistic tumor cell killing activity through co-expression of the chimeric antigen receptor and IL-15, but also significantly improve the survival rate and in vitro proliferation rate, making them useful as an efficient anticancer cell therapy agent. You can.
  • the immune cells of the present invention when the immune cells of the present invention express a chimeric antigen receptor targeting CD5, they can be used as an effective treatment composition for various CD5-positive tumors, including lymphocytic leukemia.
  • Figure 1 is a diagram showing the composition of the chimeric antigen receptor (CAR) used in the present invention, including a control group containing only GFP, a third-generation CAR structure containing CD28, OX40L, and CD3 ⁇ as signaling domains, and a control group containing only GFP, and a third-generation CAR structure lacking the signaling domain. and a schematic diagram of a structure containing only the IL-15 domain and a 4th generation CAR structure in which an IL-15 domain is additionally coupled to the 3rd generation CAR structure are shown.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Figure 2 is a diagram showing the results of measuring the survival rate and fold expansion of 3rd generation CAR-NK cells and 4th generation CAR-NK cells in the absence of IL-2 cytokine.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of measuring the tumor cell killing ability of 3rd generation CAR-NK cells and 4th generation CAR-NK cells against HER2-positive tumor cell lines HCC1954 and SKOV.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of observing changes in the amount of IFN- ⁇ secretion by 3rd generation CAR-NK cells and 4th generation CAR-NK cells in contact with HER2-positive tumor cell lines HCC1954 and SKOV.
  • Figure 5 is a schematic diagram summarizing the NK cell culture process in the present invention.
  • Figure 6 shows natural killer cells (MCB) frozen after culturing from day 28 to day 30 of culture through the upper process of Figure 5, and natural killer cells (MCB) frozen after culture from day 42 to day 44 of culture through the bottom process of Figure 1 ( This is the result of measuring the CD5 CAR expression pattern in DP).
  • Figure 7 shows the results of cell phenotype analysis based on the expression patterns of each surface marker of MCB and DP.
  • Figure 8 shows the results of FACS analysis measuring CD5 protein expression in each tumor cell line: K562, NALM6, CCRF-CEM, RPMI-8402_Luc, NALM6-NucLight, CCRF-CEM-NucLight, and RPMI-8402-NucLight.
  • Figure 10 is a diagram showing a culture schematic diagram for confirming the tumor cell killing ability of CD5 CAR transduced cells.
  • Figure 11 shows the results of confirming the killing ability of NK cells against CD5 positive and CD negative tumor cells.
  • Figure 12 shows the results of measuring the average secretion amount of IFN- ⁇ (pg/mL) from three donors.
  • Figure 13 shows the results of measuring the average IL-15 secretion amount (pg/mL) of NK cells co-cultured with each target cell.
  • Figure 14 shows the results of confirming the long-term tumor cell killing ability after co-culturing CD5 positive and CD5 negative tumor cells with CD5 CAR-NK cells for 96 hours.
  • Figure 15 shows the results of measuring the survival rate (%) up to 140 days according to each administered substance after tumor transplantation in each experimental group.
  • Figure 16 shows animal bio-imaging results up to 112 days after tumor transplantation following injection of NK cells of the present invention.
  • Figure 17 shows the results of measuring the image signal level (photon/s) over time until the 35th day after tumor transplantation.
  • Figure 18 shows the results of measuring the survival rate (%) up to 133 days after tumor transplantation into experimental animals following injection of NK cells of the present invention.
  • Figure 19 shows the results of biological imaging up to 126 days after tumor transplantation into an experimental animal and injection of NK cells of the present invention.
  • Example 1 Construction of CAR-NK cells expressing 3rd generation chimeric antigen receptor (CAR) and 4th generation CAR-NK cells simultaneously expressing 3rd generation chimeric antigen receptor and IL-15 domain
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the HER2 CAR (3rd generation) produced to confirm the synergistic effect of co-expression of the OX40L-containing CAR of the present invention and IL-15 includes the signal sequence domain of CD8a (890-952 nucleotides, GenBank NM 001768.6); anti-HER2 scFv sequence (VH-(GGGGS)3-VL domain); Hinge domain from human CD8 ⁇ (nucleotides 1292-1435, GenBank NM 001768.6); Transmembrane and intracellular signaling domain from CD28 (nucleotides 679-882, GenBank NM 006139.3); Intracellular signaling domain from CD252 (141-206 nucleotides, GenBank NM 003326.4); It has a structure in which the CD3z-derived intracellular signaling domain (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3) and the stop codon TGA are sequentially linked.
  • HER2 CAR(t)-IL-15 has a CD8 ⁇ signal sequence domain (890 -952 nucleotides, GenBank NM 001768.6); anti-HER2 scFv sequence (VH-(GGGGS)3-VL domain); Hinge domain from human CD8 ⁇ (nucleotides 1292-1435, GenBank NM 001768.6); Transmembrane domain from CD28 (nucleotides 679-759, GenBank NM 006139.3); T2A self-cleaving peptide sequence linked glycine (G)-serine (S)-glycine (G); It has a structure in which the human IL-15 sequence (375-860 nucleotides, GenBank NM000585.4) and the stop codon TGA are linked sequentially.
  • HER2 CAR-IL-15 (4th generation) contains the signal sequence domain of CD8 ⁇ (nucleotides 890-952, GenBank NM 001768.6); anti-HER2 scFv sequence (VH-(GGGGS)3-VL domain); Hinge domain from human CD8 ⁇ (nucleotides 1292-1435, GenBank NM 001768.6); Transmembrane and intracellular signaling domain from CD28 (nucleotides 679-882, GenBank NM 006139.3); Intracellular signaling domain from CD252 (141-206 nucleotides, GenBank NM 003326.4); and an intracellular signaling domain from CD3z (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3); T2A self-cleaving peptide sequence linked G-S-G; It has a structure in which the human IL-15 sequence (375-860 nucleotides, GenBank NM000585.4) and the stop codon TGA
  • CD5 CAR (4th generation) contains the signal sequence of CD8 ⁇ (nucleotides 890-952, GenBank NM 001768.6); anti-CD5 scFv domain (VH-(GGGGS)3 linker-VL); Hinge domain from CD8 ⁇ (nucleotides 1292-1435, GenBank NM 001768.6); Transmembrane and intracellular signaling domain from CD28 (nucleotides 679-882, GenBank NM 006139.3); Intracellular signaling domain from CD252 (141-206 nucleotides, GenBank NM 003326.4); Intracellular signaling domain from CD3z (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3); T2A self-cleaving peptide sequence linked G-S-G; It has a structure in which the human IL-15 sequence (375-860 nucleotides, GenBank NM000585.4) and the stop codon TGA are linked sequentially.
  • CD8a nucleotide Signal sequence of CD8a (890-952 nucleotides, GenBank NM 001768.6) 2 CD8a nucleotide codon optimization Codon optimized sequence of SEQ ID NO: 1 3 CD8a amino acid Amino acid sequences corresponding to SEQ ID NOs: 1 and 2 4 Anti-HER2 scFv nucleotides Anti-HER2 scFv sequence VH-(GGGGS)3 linker-VL domain 5 Anti-HER2 scFv amino acids Amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 4 6 Anti-CD5 scFv (VH-GS3-VL) nucleotides anti-CD5 scFv sequence VH-(GGGGS)3 linker-VL domain 7 Anti-CD5 scFv (VH-GS3-VL) Amino Acids Amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 6 8 CD8a nucleotide H
  • IL-15 is known to be a cytokine that activates NK cells and contributes to their survival and proliferation. Accordingly, to determine whether co-expression of IL-15 in NK cells expressing a chimeric antigen receptor improves survival and persistence in the body, the present inventors developed a chimera containing an scFv fragment and signaling domain that specifically recognizes HER2. A soluble form of IL-15 protein was introduced into the antigen receptor and its efficacy was evaluated (Figure 1).
  • NK cells expressing a bicistronic chimeric antigen receptor were created by connecting the anti-HER2 scFv fragment and signaling domain with the soluble IL-15 domain through the T2A system, and these were referred to as “4th generation CAR-NK cells.” It was named (“d” in Figure 1). As a control, third-generation CAR-NK cells (“b” in Figure 1) expressing anti-HER2 scFv fragment and a chimeric antigen receptor that expresses the signaling domain but does not contain the IL-15 domain, expressed anti-HER2 scFv fragment.
  • NK cells (“c” in Figure 1, named CAR(t)-IL-15-NK cells) that do not have an intracellular signaling domain and express the IL-15 domain were also produced.
  • a gene expressing GFP was used as a control (“a” in Figure 1).
  • Example 2 Survival and growth results of 3rd and 4th generation CAN-NK cells
  • NK cells derived from umbilical cord blood were cultured and each gene was introduced on the 7th day. From the 22nd day of culture, cells were cultured without adding IL-2 to the culture medium and cell survival and growth were observed.
  • the survival rate of cell groups excluding 4th generation CAR-NK cells and CAR(t)-NK cells decreased significantly from the time IL-2 was not added, no longer grew, and most cells died on the 41st day of culture ( Figure 2). Only CAR-NK cells with a structure containing the IL-15 domain maintained survival and growth, and it was confirmed that secreted IL-15 contributed to the survival and proliferation of NK cells.
  • Example 3 Comparison of efficacy of 3rd and 4th generation CAR-NK cells and synergistic effect by IL-15 domain
  • NK cells To confirm the efficacy of 4th generation CAR-NK cells, we attempted to confirm the cytotoxicity of NK cells by co-culturing them with a tumor cell line expressing HER2.
  • Two tumor cell lines (HCC1954, SKOV3) expressing HER2 were used as targets, and RFP was expressed so that the fluorescence signal disappeared upon cell death.
  • HCC1954, SKOV3 Two tumor cell lines (HCC1954, SKOV3) expressing HER2 were used as targets, and RFP was expressed so that the fluorescence signal disappeared upon cell death.
  • HER2 CAR-NK cells secreting IL-15 in both tumor cell lines, HCC1954 and SKOV3, showed excellent cytotoxicity by inhibiting the proliferation of tumor cell lines, 3rd generation HER2 CAR-NK cells and HER2 CAR(t )-NK cells showed relatively low cytotoxicity (Figure 3).
  • Third-generation HER2 CAR-NK is thought to have failed to effectively inhibit the formation of tumor cells due to the absence of additional cytokines such as IL-2, and HER2 CAR(t)-NK cells do not have a signaling domain, so they have a cytotoxic effect. It could be assumed that it was observed to be low.
  • Example 4 Cultivation of NK cells and cell freezing at different time points of culture
  • Frozen cells were rapidly thawed in a preheated 37°C constant temperature water bath. In a 90% or more thawed state, the cells were transferred to a 50 mL tube on a biological safety cabinet, and 10 times (v/v) ACD buffer was slowly added. Afterwards, the supernatant was removed by centrifugation at 1200 rpm and 4°C for 10 minutes, suspended in CellGro medium, and the number of cells was measured.
  • composition of each solution for lentiviral vector transduction mixed liquid solution Storage capacity final concentration
  • One Lentivirus vectors Not applicable 20 MOI/1 ⁇ 10 6 cells
  • Mixtures 1 and 2 were prepared separately and then slowly added to the culture vessel.
  • CBNK that does not undergo lentiviral vector transduction
  • Political culture was cultivated.
  • CellGro mixed medium and IL-21 corresponding to the same volume of the 10th day of culture based on 6-well were added at a concentration of 20 ng/mL.
  • cells were recovered and CellGro mixed medium was added without separate dilution to adjust to 1 x 10 6 /mL.
  • NK cells expressing CD5 CAR On the 16th day of culture, CD5 positive cells were isolated to obtain NK cells expressing CD5 CAR. For this purpose, all NK cells were recovered, centrifuged at 1200 rpm at 4°C for 5 minutes, the supernatant was removed, suspended in MACS buffer, the number of cells was measured, and MACS buffer was added to reach 1.0 x 10 7 /mL. Afterwards, biotin-tagged recombinant human CD5 protein (His & AVI tag) (250 ⁇ g/mL) was added at 1 ⁇ L/ 106 cells, mixed well, and reacted at 4°C for 30 minutes.
  • His & AVI tag biotin-tagged recombinant human CD5 protein
  • MACS buffer 10 times the volume of the first reaction was added, centrifuged at 340 g for 10 minutes at 4°C, and the supernatant was removed. After suspending in MACS buffer to 1.0 10 times the volume of MACS buffer was added, centrifuged at 340 g for 10 minutes at 4°C, and the supernatant was removed. After adding MACS buffer at 1.0 x 10 8 cells/500 ⁇ L, the cells were well released by pipetting several times. An LS column (Miltenyi Biotec) was mounted on a QuadroMACS TM Separator (Miltenyi Biotec), and the column was activated by flowing 3 mL of MACS buffer.
  • the cells that reacted with the beads were well dissolved by pipetting, and then 500 ⁇ L was added to each column and waited for all of the cell suspension to go down.
  • 3 mL of MACS buffer was flowed through and washed a total of three times.
  • 5 mL of MACS buffer was added and the CD5 CAR positive cells were recovered by lowering the column with a plunger.
  • CellGro mixed medium was added to the separated cells to 1 On the 19th day of culture, the same amount of CellGro mixed medium as the culture volume on the 16th day of culture was added.
  • Culture 21 Primary cells were recovered, cell number was measured without separate dilution, and CellGro mixed medium was added to adjust the cell count to 1 Culture was performed to maintain the /mL concentration. After all NK cells were recovered on days 28 to 30 of culture, the cells were frozen. Hereinafter, cells frozen after culture from day 28 to day 30 are referred to as “MCB.” For the remaining cells, CellGro medium was added to 1.0 Afterwards, CellGro mixed medium was added for 14 days to maintain a concentration of 1 x 10 6 /mL. After all NK cells were recovered on days 42 to 44 of culture, the cells were frozen, and the frozen cells were named “DP.”
  • the cells were suspended in PBS, the freezing medium mixture was mixed 1:1, dispensed at 100 x 10 6 /mL per freezing container, and the cells were frozen in an automated cell freezer (CRF).
  • CRF automated cell freezer
  • NK cells were suspended in FACS buffer at a concentration of 1.0-2.5 x 10 6 /mL, and then 100 ⁇ L was dispensed onto the antibody mixture plate. Pipeting was performed several times to ensure that the cells and antibodies were well mixed.
  • the composition of the antibody mixture is shown in Table 6 below, and PE antibodies corresponding to each phenotype were added.
  • NK cells were gated in the following order: singlets ⁇ lymphocytes ⁇ living cells (7-AAD-) ⁇ NK cells (CD56+, CD3-), and the expression of each marker was calculated based on subtype antibodies.
  • NK cells To analyze the characteristics of NK cells, the expression of 18 types of surface markers was analyzed by flow cytometry, and the MCB and DP of CD5 CAR-NK were compared with the MCB and DP of CBNK. As a result, there was no significant difference in the expression of each surface marker in CD5 CAR-NK compared to CBNK, and there was no significant difference between MCB and DP (Figure 7, Table 7).
  • Frozen K562, NALM6, CCRF-CEM, RPMI-8402_Luc, NALM6-NucLight, CCRF-CEM-NucLight, and RPMI-8402-NucLight cells were quickly thawed in a 37°C water bath, diluted in 10 mL of culture medium, and centrifuged. After removing the supernatant, 1 mL of medium was added and the number of cells was measured. 1-2 x 10 6 cells were placed in a T75 flask and cultured in a CO 2 incubator for 2-3 days.
  • NucLight-labeled tumor cell lines 8 ⁇ g/mL polybrene (Santa Cruz, CA, USA) was used to transduce the cell lines with Incucyte ® NuclightRed lentivirus (Sartorius, Gottingen, Germany), followed by puromycin treatment 4 days later. (Gibco, USA) at 0.5, 1, 1.5, and 2 ⁇ g/mL. Seven days after puromycin treatment, the lowest concentration that killed 100% of tumor cells was selected, and only cells expressing red fluorescent protein were selected and cultured.
  • Tumor cells were recovered and 1 - 5 x 10 5 cells were transferred to a FACS tube. After centrifugation, 1 ⁇ L of anti-human CD5 PE was added to 100 ⁇ L of FACS buffer, mixed, and reacted at 4°C for 30 minutes, protected from light. After adding 1 mL of FACS buffer and centrifuging, the supernatant was discarded, 200 ⁇ L of BD cytofix solution was added, mixed, and FACS analysis was performed. As a result of the analysis, the gray shade shows the subtype control, the blue solid line shows the result of anti-human CD5 antibody staining, and the numbers represent the expression rate (%) compared to the subtype control.
  • NK cells and target tumor cell lines were each suspended at 2.5 x 10 6 /mL in RPMI-1640 + 10% FBS (hereinafter referred to as assay medium).
  • assay medium RPMI-1640 + 10% FBS
  • CCRF-CEM and RPMI-8402_Luc were used as CD5 positive tumor cell lines
  • NALM-6 was used as CD5 negative tumor cell line.
  • Golgistop (1.3 ⁇ /mL) and Golgiplug (2 ⁇ /mL) were added and mixed to prevent the cytokines produced within NK cells from being secreted outside.
  • APC anti-human CD107a antibody (1 ⁇ L) was dispensed into the (-) well and target well of a 96-well round bottom plate.
  • CD107 ⁇ , IFN- ⁇ , and TNF- ⁇ Average expression values of CD107 ⁇ w/o target K562 NALM6 CCRF-CEM RPMI-8402_ Luc CBNK (MCB) average 5.59 55.57 10.26 18.19 7.87 STDs 8.48 14.85 11.58 8.79 7.99 CD5 CAR-NK (MCB) average 7.97 48.55 9.15 45.37 30.6 STDs 7.68 3.14 7.05 7.17 13.82 CBNK(MCB) vs.
  • CD5CAR-NK(MCB) ns ns ns 0.0149 0.0643 CBNK (DP) average 4.14 46.69 7.96 19.82 5.72 STDs 5.44 5.19 3.23 3.02 4.07 CD5 CAR-NK (DP) average 7.56 47.51 9.87 43.15 24.4 STDs 9.53 6.79 4.41 7.19 8.56 CBNK(DP) vs.
  • NK cells (CBNK, CD5 CAR-NK) were recovered and centrifuged at room temperature and 1200 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed, suspended in 1 mL assay medium, and the number of cells was measured. The transduced cells were suspended in the assay medium and added to a 5 mL FACS tube according to the E (NK cell):T (target cell) ratio.
  • NK cells are as follows: 10:1 ratio is 1 x 10 5 cells/ 100 ⁇ L , 3:1 ratio is 3 x 10 4 cells/100 ⁇ L, 1:1 ratio is 1 It was prepared to be 3 x 10 3 cells/100 ⁇ L.
  • the target cell line was fixed to a 96-well round bottom plate at 1
  • 100 ⁇ L of target cells and 100 ⁇ L of assay medium were added, and the value measured at this time was taken as the minimum emission value.
  • 100 ⁇ L of target cells and 100 ⁇ L of 2% Triton To correct for the lowering of the fluorescence value by Triton After culturing in an incubator at 37°C for 4 hours under light blocking, the culture was centrifuged at 4°C and 2000 rpm for 3 minutes.
  • ELISA was performed to quantify IFN- ⁇ .
  • ‘200 x capture antibody’ was diluted in ‘1x coating buffer A’, then 100 ⁇ L was added to a 96-well plate and incubated at 2-8°C for 16-18 hours.
  • the plate was washed four times using washing buffer, and 200 ⁇ L of ‘1 x Assay Diluent A’ was added to each well to inhibit non-specific binding. The plate was sealed and left on a plate shaker for 1 hour.
  • Standards were prepared by stepwise dilution (500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 0 pg/mL) of ‘Interferon Gamma Standard Stock Solution’ in ‘1x Assay Diluent A’. Afterwards, the supernatant stored at -20°C was melted and diluted 1/10 in ‘1 x Assay Diluent A’ to prepare a sample. 100 ⁇ L of the standard and diluted samples were dispensed into each well, the plate was sealed, and the mixture was incubated on a plate shaker at room temperature for 2 hours. The plate was washed four times using wash buffer.
  • CD5 CAR-NK ⁇ was secreted, and the amount of IFN- ⁇ secreted by CD5 CAR-NK was about 8 to 9 times higher than that of CBNK.
  • CBNK MCB, DP
  • CD5 CAR-NK MCB, DP
  • CBNK (MCB, DP) secreted 70-120 pg/mL and CD5 CAR-NK (MCB, DP) secreted 600-1300 pg/mL of IFN- ⁇ , with CD5 CAR-NK secreting 8 ⁇ 120 pg/mL compared to CBNK. Secreted 10 times more IFN- ⁇ .
  • CD5 CAR-NK secreted 10 times more IFN- ⁇ .
  • IFN- ⁇ secretion capacity for 3 donors (pg/mL) IFN-g K562 NALM6 CCRF-CEM RPMI-8402_Luc CBNK (MCB) average 357.54 31.32 45.56 37.56 STDs 365.59 21.42 37.40 27.52 CD5 CAR-NK (MCB) average 386.74 76.47 646.38 556.69 STDs 146.29 30.05 285.06 156.63 p-value for CBNK (MCB) vs CD5 CAR-NK (MCB) ns 0.0021 ⁇ 0.0001 ⁇ 0.0001 CBNK (DP) average 304.12 37.84 54.67 45.59 STDs 228.44 25.69 46.72 37.87 CD5 CAR-NK (DP) average 303.88 59.91 707.42 581.36 STDs 142.75 9.07 443.92 194.58 p-value for CBNK(DP) vs CD5 CAR
  • ELISA analysis was performed using the IL-15 ELISA kit.
  • the microplate strip was inserted into the plate frame, and 100 ⁇ L of the assay diluent RD1-19 was dispensed into each well.
  • IL-15 standard and the stored supernatant were dispensed at 50 ⁇ L each on a plate and reacted at room temperature for 3 hours on a shaker.
  • the plate was washed four times using wash buffer.
  • ‘200 ⁇ L of IL-15 conjugate was added to each well and reacted on a shaker at room temperature for 45 minutes. After washing the plate four times using washing buffer, 200 ⁇ L of ‘Substrate solution’ was added each, and a light-blocking reaction was carried out at room temperature for 30 minutes.
  • CBNK (MCB, DP) secreted similar levels of IL-15 as the CD5 negative cell lines
  • CD5 CAR-NK MCB, DP
  • donor 2024P had 25 Secretion of IL-15 increased to -60 pg/mL, 8 to 13 pg/mL in donor 2044P, and 20 to 50 pg/mL in donor 605463P, showing statistically significant results for both MCB and DP in CD5 CAR-NK compared to CBNK.
  • There was no statistical significance between CD5 CAR-NK (MCB) and CD5 CAR-NK (DP) ( Figure 13, *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ns: not significant).
  • a tumor cell line expressing red fluorescent protein was co-cultured with CD5 CAR cells from three donors for 96 hours to confirm the tumor cell line killing ability.
  • Tumor cells were suspended at a concentration of 1 x 10 5 cells/mL using assay medium (RPMI 1640 (Gibco, 11875093) containing 10% FBS).
  • the red fluorescence intensity (All Brightfield Object Total Red Integrated Intensity, RCU ) was analyzed using.
  • the graph shows the values by normalizing the red fluorescence intensity of the co-cultured wells at each time point to the red fluorescence intensity of the wells containing only tumor cells.
  • the tumor killing ability of NK cells isolated and produced from three donors against CD5-negative NALM6 cells was similar to that of CBNK cells.
  • CD5 CAR-NK cells For CCRF-CEM, a CD5 positive tumor cell, CD5 CAR-NK cells (MCB, DP) consistently suppressed the growth of tumor cells compared to CBNK cells (MCB, DP), and CD5 CAR-NK cells from MCB and DP of donor 1 had a similar ability to inhibit tumor cell proliferation.
  • CD5 CAR-NK cells in donors 2 and 3, the tumor cell killing ability of CD5 CAR-NK cells (MCB) was higher than that of CD5 CAR-NK cells (DP) when co-cultured with CCRF-CEM.
  • CD5 CAR-NK cells For RPMI-8402, a CD5 positive tumor cell, in the case of two donors (donors 1 and 3), the tumor cell killing ability of CD5 CAR-NK cells (MCB) was higher than that of CD5 CAR-NK cells (DP) compared to CBNK cells (MCB, DP). Although higher, CD5 CAR-NK cells (DP) from donor 2 did not show tumor killing ability ( Figure 14), and significance was confirmed through two-tailed t- test (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, *** ⁇ 0.001, ns: not significant). In conclusion, the long-term tumor cell killing ability of CD5 CAR NK cells against CD5 positive tumor cells was confirmed, and CD5 CAR-NK (MCB) cells showed higher killing ability than CD5 CAR-NK (DP) cells (Table 13).
  • Example 7 CD5 CAR transduced cells In vivo Efficacy evaluation
  • the RPMI-8402-Luc cell line which was constructed by inserting the CML-Luc lentiviral vector into RPMI-8402, a human T-cell acute lymphoblastic leukemia cancer cell line, was cultured.
  • the cancer cell line culture medium uses IMDM medium (ATCC) containing 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS) (Gibco) and 2.0 ⁇ g/mL puromycin (Gibco), and when culturing cancer cell lines, the cells The concentration was adjusted to 1 x 10 5 cells/mL and cultured in a culture vessel of appropriate capacity.
  • IMDM medium ATCC
  • FBS fetal bovine serum
  • Gibco 2.0 ⁇ g/mL puromycin
  • concentration was adjusted to 1 x 10 5 cells/mL and cultured in a culture vessel of appropriate capacity.
  • cancer cell line culture medium containing 20% DMSO (Avantor) was used and Mr. It was stored within a week in an ultra-low temperature freezer using Frosty (Ther
  • a cell suspension of tumor cell lines was prepared at a concentration of 5 x 10 6 cells/mL. 0.2 mL of the prepared cell suspension per mouse for each experimental group was injected into the tail vein, and cancer cells were transplanted at 1 x 10 6 cells/head. Starting 3 days after transplantation, CBNK (MCB) and CD5 CAR-NK (MCB) cells were administered as (A) a single dose; (B) administered 3 times at intervals of 2 times a week; and (C) consisted of a total of 3 test groups administered 3 times at weekly intervals (Table 14).
  • NK cells were administered twice a week on days 3, 7, and 10, and once a week on days 3, 10, and 17.
  • the dose of CD5 CAR-NK (MCB) was divided into 2 x 10 6 , 5 x 10 6 , and 1 x 10 7 cells/head.
  • an experimental group administered only PBS and a Tumor only experimental group administered only 1 x 10 6 cells/head of the cancer cell line were added, and each experimental group included 3 or 5 subjects.
  • a cell suspension of the tumor cell line was prepared at a concentration of 1.5 x 10 7 cells/mL. 0.2 mL of the prepared cell suspension per mouse for each experimental group was injected into the tail vein, and cancer cells were transplanted at 3 x 10 6 cells/head. Starting 3 days after transplantation, CBNK (MCB) and CD5 CAR-NK (MCB, DP) cells were administered at a single dose of 1 x 10 7 cells/head (Table 15).
  • CBNK MCB
  • MCB, DP CD5 CAR-NK
  • NK cell administration conditions (1 Comparison according to number of administrations and dosage) group administered substance Dosage (cells/head) Dosing interval Number of doses population control group PBS N/A N/A N/A 3 Tumor only N/A N/A N/A 5 (A) CBNK (MCB) 1 x 10 7 1 time 1 time 5 CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 10 7 1 time 1 time 5 (B) CBNK (MCB) 1 x 10 7 2 times a week 3rd time 5 CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 10 7 2 times a week 3rd time 5 (C) CBNK (MCB) 1 x 10 7 Once a week 3rd time 5 CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 10 7 Once a week 3rd time 5 CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 10 7 Once a week 3rd time 5 CD5 CAR-NK (MCB) 5 x 10 6 Once a week 3rd time 5 CD5 CAR
  • NK cell administration conditions (2 Comparison according to culture period (MCB, DP)) group administered substance Dosage (cells/head) Dosing interval Number of doses population control group PBS N/A N/A N/A 3 Tumor only N/A N/A N/A 5 experimental group CBNK (MCB) 1 x 10 7 Once a week 3rd time 4 CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 10 7 Once a week 3rd time 7 CD5 CAR-NK (DP) 1 x 10 7 Once a week 3rd time 7
  • the Tumor only group and the CBNK (MCB) administration group began to lose weight around day 37, and all subjects died on day 56 and 53, respectively. As the disease progressed, weight decreased and then death tended to occur. In the case of the CD5 CAR-NK (MCB) administered group, there were cases where death occurred without significant weight loss.
  • the image signal level of the CBNK (MCB) administered group increased from day 21, while the CD5 CAR-NK (MCB) administered group showed a similar level to the tumor administration day by day 35 in both the single and three dose groups.
  • the level was maintained ( Figure 16). Even on day 112, the final imaging observation time, it was confirmed that the tumorigenesis inhibition ability was maintained in the surviving subjects of the CD5 CAR-NK (MCB) administration group, and statistical significance was confirmed through one-way analysis of variance (ANOVA) (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, *** ⁇ 0.001, **** ⁇ 0.0001, ns: not significant).
  • Imaging signal value results according to the number of doses after tumor administration
  • a (photon/s) D0 D7 D14 D21 D28 D35 CBNK (single injection) average 242000 460000 2220000 4530000 38400000 49600000 SD 19500 132000 940000 1850000 10800000 20100000 CAR-NK (single injection) average 243000 459000 2020000 559000 1860000 475000 SD 22300 150000 874000 81500 848000 88400 p value ns ns ns 0.0047 ⁇ 0.0001 0.0005 CBNK (3 times, 2 times a week) average 243000 436000 2210000 5270000 31800000 60800000 SD 19000 108000 826000 2070000 7340000 30700000 p value ns ns ns ns ns ns CAR-NK (3 times, 2 times a week) average 243000 421000 2080000 489000 2330000 559000 SD 38900 114000 902000 25
  • Imaging signal value results according to administered dose after tumor administration B (photon/s) D0 D7 D14 D21 D28 D35 CBNK (10M/head) average 243000 433000 1860000 6230000 32400000 66300000 SD 26900 102000 503000 3050000 4060000 18900000 CAR-NK (2M/head) average 243000 349000 2040000 732000 2580000 673000 SD 29600 110000 869000 115000 1330000 148000 p value ns ns ns 0.0001 ⁇ 0.0001 ⁇ 0.0001 CAR-NK (5M/head) average 243000 422000 2670000 542000 2230000 669000 SD 25900 117000 1230000 58900 893000 128000 p value ns ns ns ⁇ 0.0001 ⁇ 0.0001 CAR-NK (10M/head) average 242000 340000 1850000 689000 2760000 509000 SD 23200 110000 835000 75400 1420000 23900
  • Example 7-3 Through the same process as in Example 7-3, general symptoms and body weight changes were measured for all animals twice a week during the test period, median survival time was calculated, and survival rates (MCB, DP) according to culture period were compared. Starting from the date of cancer cell transplantation, images were taken once a week for a total of 17 times (days 0, 7, 14, 27, 35, 42, 49, 56, 65, 72, 78, 86, 94, 100, 107, 118, and 126 from the date of transplantation). Filmed.
  • CD5 CAR-NK MCB
  • CD5 CAR-NK DP
  • MCB CD5 CAR-NK
  • DP CD5 CAR-NK
  • Imaging measurements in the case of Tumor only and CBNK (MCB) administration groups, imaging signals were measured near the hindquarters of mice from day 14, while imaging signals were not measured in all CD5 CAR-NK (MCB) administration groups, showing a notable tumorigenicity inhibition effect. This could be confirmed ( Figure 19).
  • imaging signals began to be observed on the 35th day after tumor cell administration, and in the case of CD5 CAR-NK (MCB), imaging signals began to be observed a week later, on day 42.

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Abstract

본 발명은 세포내 신호전달 도메인으로 OX40 리간드를 포함하는 키메라 항원 수용체와 IL-15를 공발현하는 면역세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역세포는 상기 키메라 항원 수용체와 IL-15의 공발현을 통해 상승적인 종양세포 사멸 활성을 나타낼 뿐 아니라 생존률과 체외 증식률 또한 현저히 개선되어, 효율적인 항암 세포치료제로 유용하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명의 면역세포는 CD5를 타겟팅하는 키메라 항원 수용체를 발현할 경우 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양의 효과적인 치료 조성물로 활용될 수 있다.

Description

CD5를 표적하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포
본 발명은 CD5를 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체와 IL-15를 발현하는 면역세포; 및 이를 이용한 CD5 양성 종양의 치료 방법에 관한 것이다.
자연살해(Natural Killer, NK) 세포는 혈구세포의 약 10% 정도를 차지하고, 면역반응에 중요한 역할을 하는 림프구계 세포이다. NK 세포는 선천면역방어(innate immune defense)에서의 중요한 구성원으로서 암세포나 외인성 병원균에 감염된 세포를 사멸시키는 면역세포 치료(adoptive cellular immunotherapy)에 적합하다. 또 다른 면역세포인 T 세포를 이용한 세포치료 분야에서 특정 종양 항원을 발현하는 암세포에 대한 특이적인 사멸 효과가 증대되도록 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)를 T 세포에 도입하는 기술이 활발하게 연구되고 있다. CAR는 면역세포에 항원 특이성을 전달하도록 설계된 인공 수용체로서 T 세포 등의 면역세포를 활성화시켜 특이적 면역성을 제공하도록 선택된 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포외 항원 결합 도메인은 확인된 종양 항원을 표적으로 하는 단일 사슬 가변 단편(single-chain variable fragment; scFv)을 포함함으로서 종양 항원을 발현하는 암 세포 특이적-면역세포 활성화를 유발할 수 있다.
한편, OX40 리간드(CD252)는 TNFR superfamily에 속하는 단백질로서, 항원 전달 세포(antigen-presenting cell, APC), 일부 자연살해세포 및 B세포에서 발현되며, 이들 세포의 활성화 후 수 시간에서 수일 내에 발현되는 것으로 알려져 있다. OX40 리간드의 수용체인 OX40(CD134)는 T 세포에서 발현되며, CD28에 의해 활성화된 T 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. OX40의 발현은 CD28 활성화에 의한 T 세포 반응을 더욱 강화하여 T 세포의 증식, 사이토카인 분비 및 생존을 증대시킨다.
CD5는 타입Ⅰ 당단백질로서 스캐빈저(scavenger)-수용체 패밀리의 일원이다. CD5는 가슴샘세포, 성숙 T 세포, 및 성숙 B 세포에 의해 발현되고, 림프구 활성화의 조절 및 분화 과정과 관련된 것으로 알려졌다. CD5는 BCR의 활성화 신호를 완화하여 B-1 세포가 정상 조직 단백질이 아닌 매우 강한 자극(박테리아 단백질 등)에 의해서만 활성화될 수 있도록 한다. CD5는 급성 T 림프구성 백혈병과 말초 T-세포 림프종을 비롯한 다양한 혈액암과 유방암, 흉선암 등의 고형암에서 고발현되고 정상 세포에서는 발현이 억제되어, 이들 종양에 대한 치료 타겟으로 활발하게 연구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양에 대한 효율적인 면역세포 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, OX40L를 세포내 신호전달 도메인으로 포함하는 키메라 항원 수용체와 IL-15가 결합된 융합단백질을 면역세포에서 발현시킬 경우 면역세포의 생존률, 체외 증식률 및 항종양 활성이 모두 현저히 증진되어 치료적 유효량의 세포가 용이하게 확보될 뿐 아니라 적은 투여량으로도 CD5 양성 종양에 대한 우수한 항암 효과를 발휘하는 효율적인 세포치료제로 이용될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 OX40 리간드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인과 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체; 및 IL-15를 포함하는 융합단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 발현하는 면역세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 융합단백질을 제공한다:
(a) OX40 리간드(OX40L)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR); 및
(b) IL(Interleukin)-15.
본 발명자들은 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양에 대한 효율적인 면역세포 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, OX40L를 세포내 신호전달 도메인으로 포함하는 키메라 항원 수용체와 IL-15가 결합된 융합단백질을 면역세포에서 발현시킬 경우 면역세포의 생존률, 체외 증식률 및 항종양 활성이 모두 현저히 증진되어 치료적 유효량의 세포가 용이하게 확보될 뿐 아니라 적은 투여량으로도 CD5 양성 종양에 대한 우수한 항암 효과를 발휘하는 효율적인 세포치료제로 이용될 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“융합단백질(fusion protein)”은 특정 단백질 또는 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열이 상이한 단백질 또는 도메인으로부터 유래된 또 다른 아미노산 서열과 융합된 재조합 단백질 분자를 의미한다. 상이한 유래를 가지는 각 아미노산 서열은 융합단백질 내에서 직접 연결될 수도 있고 링커서열, 태그(tag)서열, 자가절단서열(self-cleaving sequence) 또는 이들의 조합을 통해 연결될 수도 있다. 본 발명의 융합단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)의 아미노산 서열과 IL-15 단백질의 아미노산 서열이 직접 결합하거나 링커, 태그, 자가절단서열 또는 이들의 조합에 의해 간접적으로 연결될 수 있으며, 당업계에 공지된 재조합 기술에 의해 제작되거나 목적 세포에서 발현될 수 있다.
본 명세서에서 용어“세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)”은 키메라 항원 수용체가 대상 세포(예를 들어 면역세포)에서 발현될 경우 세포 외 부분에 위치하여 목적 항원을 특이적으로 인식함으로써 면역세포의 세포사멸 활성을 타겟 세포(예를 들어 암세포) 특이적으로 활성화시키기 위한 도메인이며, 예컨대 Fc 수용체(Fc receptor), 단일사슬항체절편(single-chain variable fragment, ScFv)과 같은 항체의 항원결합 단편일 수 있다. 따라서, 본 발명의 용어“세포외 항원 결합 도메인”은 "세포외 도메인(extracellular domain)”, “항원 인식 단편”또는“항원 결합 단편”과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항-CD5 항체의 항원 결합 단편이다.
본 명세서에서 용어“항체(antibody)”는 CD5 단백질에 대한 항체로서, 이의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합하며, 완전한 전장 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(항체 단편)을 포함하는 의미이다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 명세서에서 용어“항체의 항원 결합 단편”은 전체 항체 분자 내에서 항원-항체 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 구체적으로는 Fab 단편, F(ab')단편, F(ab')2 단편 및 Fv 단편을 포함한다.
항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이며 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, ScFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
보다 구체적으로는 본 발명에서 이용되는 항체의 항원 결합 단편은 항-CD5 항체의 ScFv이다.
본 명세서에서 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 본 명세서에서, 용어“CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, 이들 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 범위에는 CDR 영역에 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은, 인산화된 PLCγ2를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체의 항원인식단편 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에 따르면 85%의 상동성, 다른 특정예에 따르면 90%의 상동성, 또 다른 특정예에 따르면 95%의 상동성, 또 다른 특정예에 따르면 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Huang et al. Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al. Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31).
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제26서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR1, 서열목록 제28서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR2 및 서열목록 제30서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제32서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제34서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR1, 서열목록 제36서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR2 및 서열목록 제38서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제40서열의 아미노산 서열을 포함한다.
가장 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제9서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28, CD3-zeta, OX40 및 4-1BB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28 및 CD3-zeta를 추가적으로 포함한다.
가장 구체적으로는, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28, OX40L 및 CD3-zeta가 세포막으로부터 세포내 방향으로 순서대로 포함된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 융합단백질은 상기 키메라 항원 수용체와 상기 IL-15 사이에 위치하는 자가절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 자가절단 펩타이드는 서열목록 제21서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제21서열의 아미노산 서열은 T2A 자가절단 펩타이드의 아미노산 서열이다. T2A 자가절단 펩타이드는 세포 내 단백질 번역과정에서 리보솜 스키핑(ribosomal skipping)을 유도함으로서 전장 단백질을 짧은 펩타이드 절편으로 절단하는 2A-자가절단 펩타이드의 일종으로, 서열목록 제21서열의 18개 아미노산(EGRGSLLTCGDVEENPGP)을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제21서열의 아미노산 서열에 의한 자가 절단 활성을 증진시키기 위해 N-말단에 GSG(Gly-Ser-Gly) 서열이 추가될 수 있다. 본 발명의 T2A 자가절단 펩타이드에 의해 본 발명의 키메라 항원 수용체와 IL-15는 절단되어 발현될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 융합단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 핵산 분자는 전술한 본 발명의 융합단백질을 대상 세포, 예를 들어 면역세포에서 발현시키기 위해 유전자 전달체에 삽입되어 목적세포로 도입될 수 있다.
본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상 세포가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질주입(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달체”또는“유전자 전달 시스템(gene delivery system)”은 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 세포 또는 조직 수준에서, 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에서 적합한 발현조절서열에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 목적 유전자에 결합된 프로모터는, 구체적으로는 동물세포, 보다 구체적으로는 포유동물 세포, 가장 구체적으로는 면역세포에서 작동하여 목적 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
표적 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 도입에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 예를 들어 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Methods in Molecular Biology, 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 유전자 전달체는 바이러스 벡터이다. 보다 구체적으로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 구체적으로는 렌티바이러스이다.
본 발명의 융합단백질 전체 또는 이를 구성하는 각 도메인을 인코딩하는 핵산 분자의 염기서열 목록은 하기 표 2에 정리되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 핵산 분자를 발현하는 면역세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어“면역세포”는 면역반응의 개시 또는 촉진 과정에 관여하는 모든 세포를 의미하며, 보다 구체적으로는 면역 작동세포(immune effector cell)를 의미한다. 면역세포는 예를 들어 T 세포, B 세포, 자연살해(NK)세포, 자연살해 T(NKT) 세포 및 비만 세포(mast cell)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 상기 면역세포는 자연살해세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 발현하는 면역세포를 제공한다:
(a) OX40 리간드(OX40L)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR); 및
(b) IL(Interleukin)-15.
본 발명에서 이용되는 면역세포는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 면역세포는 전술한 본 발명의 일 양태에서 설명한 바와 같이 키메라 항원 수용체 및 IL-15를 이들이 서로 결합된 단일 융합단백질의 형태로 발현할 수도 있고, 본 양태에서와 같이 키메라 항원 수용체와 IL-15가 결합되지 않은 개별적인 각각의 단백질 분자로서 발현할 수도 있다. 이 경우, 키메라 항원 수용체와 IL-15는 각각 이들을 인코딩하는 핵산분자가 개별적인 유전자 전달체에 삽입되어 면역세포에 공-형질전환될 수도 있고, 하나의 유전자 전달체에 함께 삽입되어 형질전환될 수도 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 면역세포는 자연살해세포이며, 보다 구체적으로는 상기 자연살해세포는 23일 내지 35일, 보다 더 구체적으로는 25일 내지 33일, 가장 구체적으로는 28일 내지 30일간 배양 후 동결 및 해동된 자연살해세포이다.
본 명세서에서 용어“배양”이란 세포가 배양배지 등의 인 비트로 환경에서 생물학적 활성을 유지한 채로 생장 및 증식하도록 유도하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“배양배지”는 당, 아미노산, 무기질 기타 영양물질과 같이 세포의 생장 및 증식에 필수적인 요소를 포함하는, 인 비트로 내에서 세포의 성장 및 증식을 효율적으로 유도 및 촉진하기 위한 혼합물을 포괄하는 의미이다. 세포 배양배지는 특정 세포의 종류와 그 표현형 및 배양 특성에 따라 최적화될 수 있으며, 예를 들어 세포 생장의 지지를 위해 조제된 기본 배양배지, 세포로부터 단백질의 재조합적 생산을 촉진하도록 조제된 배양배지, 영양소들을 고농도로 농축시켜 만든 농축 배지가 있다.
본 명세서에서 용어“동결(freezing)”또는“동결보존(cryopreservation)”은 저온 상태, 구체적으로는 -80℃ 내지 -200℃의 초저온 상태에서 단기간 혹은 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 것을 의미한다. 세포는 일반적으로 배양과정에서 일만 개 중에 한 개 정도의 비율로 돌연변이가 일어나며, 장기간에 걸쳐 세포의 계대를 계속하면 본래의 세포집단과는 다른 세포집단으로 변성되거나, 세포 고유의 생물학적 활성 및 기능이 소실될 수 있고, 기간에 비례하여 마이코플라스마 등에 의한 감염 위험성도 증가하므로 세포의 고유한 특성을 보존하고자 세포를 동결시키는 방법이 널리 사용된다. 본 발명자들은 면역세포, 특히 렌티바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입 효율이 저조한 자연살해세포에서 적절한 시간 동안 배양 후 동결 과정이 선행될 경우 유전자 전달율 및 세포 사멸율이 크게 개선된다는 점을 규명하였다. 따라서, 본 발명에서 수행되는 동결 단계는 세포의 장기간 보전 목적 하에 수행되는 동결보존(cryopreservation)과 달리 단기간 동안만 수행될 수도 있다.
세포의 동결은 동결과 해동과정에서 필연적으로 동반되는 얼음 결정의 형성과 이온 및 삼투압의 불균형에 따른 세포의 손상을 최소화할 수 있는 동결억제제를 처리함으로써 수행될 수 있다. 동결 배지에는 세포가 동결되는 동안의 안전성 및 안정성을 향상시키기 위해 예를 들어 덱스트란, 알부민 및/또는 DMSO가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어“해동(thawing)”은 동결 또는 동결보존된 세포가 생명활동을 다시 재개하도록 하기 위해 연질(soft) 상태의 살아있는 세포가 될 때까지 온도를 상승시키는 과정을 의미한다. 해동은 통상적으로 액체질소탱크 등에서 초저온 동결된 세포를 꺼내어 37℃ 항온 수조에 넣어 빠르게 진행할 수 있다.
본 발명의 동결 및 해동 과정은 세포의 장기간 보관이 아닌 세포의 유전자 도입효율 개선 및 병원성 세포의 사멸활성 증진에 그 목적이 있으므로, 동결 및 해동은 시간적 간격 없이 동결이 완료된 후 바로 해동 과정이 개시될 수도 있고, 필요에 따라 동결 과정과 해동 과정 간에 적절한 시간차를 둘 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 면역세포를 유효성분으로 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 면역세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적 유전자(CD5를 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체-코딩 핵산분자)가 도입된 면역세포가 대상체에 투여되면 CD5 양성 암세포의 사멸을 유도함으로써 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 질환의 세포 치료제 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 주입함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 용어“CD5 양성 종양”은 정상 세포 또는 CD5 음성 종양에 비하여 CD가 측정 가능한 정도로 고발현되는 고형암 또는 혈액암을 의미한다. CD5는 85%의 급성 T 림프구성 백혈병(T-lineage Acute Lymphoblastic Leukemia, T-ALL)와 75%의 말초 T-세포 림프종에서 발현되며, 맨틀세포 림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL(Chronic lymphocytic leukemia) 및 털세포 백혈병(hairy cell leukemia)에서 고발현되는 막관통 수용체 단백질로서, 정상 세포에서는 발현이 억제되어 유효한 종양의 치료 및 진단 타겟으로 이용되고 있다.
본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 CD5 양성 종양은 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 혈액암과, 유방암 및 흉선암 등의 고형암을 포함하나, 이에 제한되지 않고 종양 세포 표면에서 CD5를 측정 가능한 수준으로 발현함으로서 본 발명의 면역세포가 특이적으로 인식할 수 있는 악성 종양을 모두 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 CD5 양성 종양은 T 림프구성 백혈병이며, 보다 구체적으로는 급성 T 림프구성 백혈병이다.
본 발명의 면역세포, 구체적으로는 자연살해세포는 이를 유효성분으로 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료용 조성물의 총 중량에 대하여 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 약리성분인 자연살해세포 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 항암 약리성분을 1종 이상 추가로 포함되어 제제화할 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 CD5 양성 종양의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 포함된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 자연살해세포의 투여량은 예를 들어 0.01 x 107 cells/kg 내지 1.0 x 109 cells/kg일 수 있고, 0.5 x 107 cells/kg 내지 1.0 x 108 cells/kg일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 세포치료제 주입 방법에 의해 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 조성물은 비경구로 투여되며, 구체적으로는 정맥, 피하 또는 복강투여될 수 있으며, 가장 구체적으로는 정맥투여될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 세포내 신호전달 도메인으로 OX40 리간드를 포함하는 키메라 항원 수용체와 IL-15를 공발현하는 면역세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 면역세포는 상기 키메라 항원 수용체와 IL-15의 공발현을 통해 상승적인 종양세포 사멸 활성을 나타낼 뿐 아니라 생존률과 체외 증식률 또한 현저히 개선되어, 효율적인 항암 세포치료제로 유용하게 이용될 수 있다.
(c) 특히 본 발명의 면역세포는 CD5를 타겟팅하는 키메라 항원 수용체를 발현할 경우 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 CD5 양성 종양의 효과적인 치료 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용된 키메라 항원 수용체(CAR)의 구성을 보여주는 그림으로, GFP만 포함된 대조군, CD28, OX40L 및 CD3ζ를 신호전달 도메인으로 포함하는 3세대 CAR 구조물, 신호전달 도메인이 결핍되어 있고 IL-15 도메인만이 포함된 구조물 및 상기 3세대 CAR 구조물에 IL-15 도메인이 추가적으로 결합된 4세대 CAR 구조물에 대한 모식도를 각각 보여준다.
도 2는 IL-2 사이토카인 부재 시 3세대 CAR-NK 세포와 4세대 CAR-NK 세포의 생존율 및 증식(fold expansion)을 측정한 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 HER2양성 종양 세포주인 HCC1954와 SKOV에 대해 3세대 CAR-NK 세포 및 4세대 CAR-NK 세포의 종양세포 살해능을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 HER2양성 종양 세포주인 HCC1954와 SKOV에 접촉한 3세대 CAR-NK 세포 및 4세대 CAR-NK 세포의 IFN-γ 분비량 변화를 관찰한 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명에서의 NK 세포 배양과정을 요약한 모식도이다.
도 6은 상기 도 5의 상단 과정을 통해 배양 28 내지 30일차까지 배양 후 동결한 자연살해세포(MCB)와, 도 1의 하단 과정을 통해 배양 42 내지 44일차까지 배양 후 동결한 자연살해세포(DP)에서의 CD5 CAR 발현 양상을 측정한 결과이다.
도 7은 MCB와 DP의 각 표면마커 발현 양상에 기반하여 세포 표현형을 분석한 결과이다.
도 8은 K562, NALM6, CCRF-CEM, RPMI-8402_Luc, NALM6-NucLight, CCRF-CEM-NucLight 및 RPMI-8402-NucLight의 각 종양 세포주에서 CD5 단백질 발현을 측정한 FACS 분석 결과이다.
도 9는 다양한 종양 세포주와 공배양한 CBNK 또는 CD5 CAR-NK에서 CD107a, IFN-γ 및 TNFα(n=3) 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 CD5 CAR 형질도입 세포의 종양세포 살해능 확인을 위한 배양 모식도를 보여주는 그림이다.
도 11은 CD5 양성 및 CD 음성 종양세포에 대한 NK 세포의 살해능을 확인한 결과이다.
도 12는 공여자 3명의 IFN-γ 평균 분비량(pg/mL)을 측정한 결과이다.
도 13은 각 표적 세포와 공배양한 NK 세포의 IL-15 평균 분비량(pg/mL)을 측정한 결과이다.
도 14는 CD5 양성 및 CD5 음성 종양세포를 CD5 CAR-NK 세포와 96시간 동안 공배양한 후 장시간 종양세포 살해능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 각 실험군에서 종양 이식 후 각 투여물질에 따라 140일까지의 생존율(%)을 측정한 결과는 보여준다.
도 16은 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 112일까지의 동물 생체 이미징 결과를 나타낸다.
도 17은 종양 이식 후 35일째 까지 영상 신호 수치(photon/s)를 시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타낸다.
도 18은 실험동물에 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 133일까지의 생존율(%)을 측정한 결과이다.
도 19는 실험동물에 종양 이식 후 본 발명의 NK 세포 주입에 따른 126일까지의 생체 이미징 결과이다.
실시예
실시예 1: 3세대 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 CAR-NK와 3세대 키메라 항원 수용체 및 IL-15 도메인을 동시에 발현하는 4세대 CAR-NK 세포의 제작
본 발명에서 이용되는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)의 구조를 하기 표 1에 요약하였다.
CAR
종류		 약칭 신호
서열		 ECD 힌지 TM 신호-1 신호-2 신호-3 2A펩타이드
3세대 HER2 CAR CD8α 항-HER2 scFv CD8α CD28 CD28 OX40L CD3z - -
Truncated HER2 CAR(t)-IL-15 CD8α 항-HER2 scFv CD8α CD28 - - - T2A IL-
15
4세대 HER2 CAR-IL-15 CD8α 항-HER2 scFv CD8α CD28 CD28 OX40L CD3z T2A IL-
15
4세대 CD5 CAR CD8α 항-CD5 scFv CD8α CD28 CD28 OX40L CD3z T2A IL-
15
본 발명의 OX40L 포함 CAR와 IL-15의 공발현에 의한 상승효과를 확인하기 위해 제작된 HER2 CAR (3세대)는 CD8a의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 항-HER2 scFv 서열(VH-(GGGGS)3-VL 도메인); 인간 CD8α 유래의 힌지 도메인(1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD28 유래의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인(679-882 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3); CD252 유래의 세포내 신호전달 도메인(141-206 뉴클레오타이드, GenBank NM 003326.4); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 종결 코돈인 TGA가 순차적으로 연결된 구조를 가진다.HER2 CAR(t)-IL-15는 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 항-HER2 scFv 서열(VH-(GGGGS)3-VL 도메인); 인간 CD8α 유래의 힌지 도메인 (1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD28 유래의 막관통 도메인(679-759 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3); 글라이신(G)-세린(S)-글라이신(G)와 연결된 T2A 자가 절단 펩티드 서열; 인간 IL-15 서열(375-860 뉴클레오타이드, GenBank NM000585.4)과 종결코돈인 TGA가 순차적으로 연결된 구조를 가진다.
HER2 CAR-IL-15(4세대)는 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 항-HER2 scFv 서열(VH-(GGGGS)3-VL 도메인); 인간 CD8α 유래의 힌지도메인(1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD28 유래의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인(679-882 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3); CD252 유래의 세포내 신호전달 도메인(141-206 뉴클레오타이드, GenBank NM 003326.4); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3); G-S-G와 연결된 T2A 자가절단 펩타이드 서열; 인간 IL-15 서열(375-860 뉴클레오타이드, GenBank NM000585.4)과 종결코돈인 TGA가 순차적으로 연결된 구조를 가진다.
CD5 CAR (4세대)는 CD8α의 신호서열(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 항-CD5 scFv 도메인(VH-(GGGGS)3 linker-VL); CD8α 유래의 힌지 도메인 (1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD28 유래의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인(679-882 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3); CD252 유래의 세포내 신호전달 도메인(141-206 뉴클레오타이드, GenBank NM 003326.4); CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3); G-S-G와 연결된 T2A 자가절단 펩타이드 서열; 인간 IL-15 서열(375-860 뉴클레오타이드, GenBank NM000585.4)과 종결코돈인 TGA가 순차적으로 연결된 구조를 가진다.
본 발명에서 제작된 키메라 항원 수용체에 포함된 각 도메인들의 염기서열 및 아미노산 서열을 아래 표 2에 정리하였다.
서열번호 서열이름 서열에 대한 설명
1 CD8a 뉴클레오타이드 CD8a의 신호서열 (890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6)
2 CD8a 뉴클레오타이드 코돈 최적화 서열번호 1의 코돈 최적화된 서열
3 CD8a 아미노산 서열번호1및 2에 대응하는 아미노산 서열
4 항-HER2 scFv 뉴클레오타이드 항- HER2 scFv 서열 VH-(GGGGS)3 링커-VL 도메인
5 항-HER2 scFv 아미노산 서열번호 4에 대응하는 아미노산 서열
6 항-CD5 scFv (VH-GS3-VL) 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv 서열 VH-(GGGGS)3 링커-VL 도메인
7 항-CD5 scFv (VH-GS3-VL) 아미노산 서열번호 6에 대응하는 아미노산 서열
8 CD8a 뉴클레오타이드 인간 CD8a 유래의 힌지 도메인 (1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6)
9 CD8a 뉴클레오타이드 코돈 최적화 서열번호 8의 코돈 최적화된 서열
10 CD8a 아미노산 서열번호 8 및 9의 아미노산 서열
11 CD28 뉴클레오타이드 CD28 유래의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인 (679-882 뉴클레오타이드, GenBank NM 006139.3)
12 CD28 뉴클레오타이드 코돈 최적화 서열번호 11의 코돈 최적화된 서열
13 CD28 아미노산 서열번호 11 및 12의 아미노산 서열
14 CD252 뉴클레오타이드 CD252 유래의 세포내 신호전달 도메인 (141-206 뉴클레오타이드, GenBank NM 003326.4)
15 CD252 뉴클레오타이드 코돈 최적화 서열번호 14의 코돈 최적화된 서열
16 CD252 아미노산 서열번호 14및 15의 아미노산 서열
17 CD3z 뉴클레오타이드 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)
18 CD3z 뉴클레오타이드 코돈 최적화 서열번호 17의 코돈 최적화된 서열
19 CD3z 아미노산 서열번호 17 및 18의 아미노산 서열
20 T2A 뉴클레오타이드 T2A 자가 절단 펩티드 서열
21 T2A 아미노산 서열번호 20의 아미노산 서열
22 IL-15 뉴클레오타이드 인간 IL-15 서열 (375-860 뉴클레오타이드, GenBank NM000585.4)
23 IL-15 뉴클레오타이드 코돈 최적화 서열번호 22의 코돈 최적화된 서열
24 IL-15 아미노산 서열번호 22 및 23의 아미노산 서열
25 항-CD5 scFv HCDR1 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv의 HCDR1 코딩 뉴클레오타이드
26 항-CD5 scFv HCDR1 아미노산 서열번호 25의 아미노산 서열
27 항-CD5 scFv HCDR2 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv의 HCDR2 코딩 뉴클레오타이드
28 항-CD5 scFv HCDR2 아미노산 서열번호 27의 아미노산 서열
29 항-CD5 scFv HCDR3 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv의 HCDR3 코딩 뉴클레오타이드
30 항-CD5 scFv HCDR3 아미노산 서열번호 29의 아미노산 서열
31 항-CD5 scFv 중쇄 가변영역 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv의 전체 중쇄가변영역 코딩 뉴클레오타이드
32 항-CD5 scFv 중쇄 가변영역 아미노산 서열번호 31의 아미노산 서열
33 항-CD5 scFv LCDR1 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv의 LCDR1 코딩 뉴클레오타이드
34 항-CD5 scFv LCDR1 아미노산 서열번호 33의 아미노산 서열
35 항-CD5 scFv LCDR2 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv의 LCDR2 코딩 뉴클레오타이드
36 항-CD5 scFv LCDR2 아미노산 서열번호 35의 아미노산 서열
37 항-CD5 scFv LCDR3 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv의 LCDR3 코딩 뉴클레오타이드
38 항-CD5 scFv LCDR3 아미노산 서열번호 37의 아미노산 서열
39 항-CD5 scFv 경쇄 가변영역 뉴클레오타이드 항-CD5 scFv의 전체 경쇄가변영역 코딩 뉴클레오타이드
40 항-CD5 scFv 경쇄 가변영역 아미노산 서열번호 39의 아미노산 서열
IL-15는 NK 세포를 활성화시키고 이의 생존 및 증식에 기여하는 사이토카인으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 키메라 항원 수용체를 발현하는 NK 세포에서 IL-15를 공발현시킬 경우 생존 및 체내 지속성이 개선되는지 여부를 확인하기 위해 HER2를 특이적으로 인식하는 scFv 절편 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체에 수용성(soluble) 형태의 IL-15 단백질을 도입하여 그 효능을 평가하였다(도 1). 항-HER2 scFv 절편 및 신호전달 도메인과 수용성 IL-15 도메인을 T2A 시스템으로 연결하여 바이시스트로닉(bicistronic) 형태의 키메라 항원 수용체를 발현하는 NK 세포를 제작하고 이를“4세대 CAR-NK 세포”로 명명하였다(도 1의“d”). 대조군으로 항-HER2 scFv 절편 및 신호전달 도메인은 발현하지만 IL-15 도메인을 포함하지 않는 키메라 항원 수용체를 발현하는 3세대 CAR-NK 세포(도 1의 “b”), 항-HER2 scFv 절편은 발현하지만 세포내 신호전달 도메인은 없고 IL-15 도메인을 발현하는 NK 세포(도 1의“c”, CAR(t)-IL-15-NK 세포로 명명)도 함께 제작하였다. GFP를 발현하는 유전자는 대조군(도 1의“a”)으로 사용하였다.
실시예 2: 3세대와 4세대 CAN-NK 세포의 생존율 및 성장성 결과
제대혈 유래의 NK 세포를 배양하고 7일 째에 각 유전자를 도입하였으며 배양 22일차부터 IL-2를 배양 배지에 첨가하지 않고 배양하며 세포 생존율 및 성장을 관찰하였다. 4세대 CAR-NK 세포와 CAR(t)-NK 세포를 제외한 세포군은 IL-2를 첨가하지 않은 시점부터 생존율이 현저히 감소하고 더 이상 성장이 되지 않았으며 배양 41일째 대부분의 세포가 사멸하였다(도 2). IL-15 도메인이 포함된 구조의 CAR-NK 세포만 생존 및 성장성을 유지하였으며 분비된 IL-15이 NK 세포의 생존 및 증식에 기여하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 3세대와 4세대 CAR-NK 세포의 효능 비교 및 IL-15 도메인에 의한 시너지 효과
3-1) 종양세포 살해능 평가
4세대 CAR-NK 세포의 효능을 확인하기 위해 HER2를 발현하는 종양 세포주와 공배양하여 NK 세포의 세포 독성을 확인하고자 하였다. HER2를 발현하는 2종의 종양 세포주(HCC1954, SKOV3)를 타겟으로 사용하였으며 RFP를 발현시켜 세포 사멸시 형광 신호가 소멸되도록 하였다. 배양 22일부터 IL-2를 첨가하지 않고 배양한 다양한 종류의 NK 세포군과 종양 세포주를 E: T = 0.3:1 비율로 6일 동안 공배양한 후 종양세포의 증식 여부를 관찰하였다. HCC1954와 SKOV3, 2종의 종양 세포주 모두에서 IL-15를 분비하는 4세대 HER2 CAR-NK 세포가 종양 세포주의 증식을 억제하여 뛰어난 세포 독성을 보인 반면 3세대 HER2 CAR-NK 세포 및 HER2 CAR(t)-NK 세포는 상대적으로 낮은 세포 독성을 나타냈다(도 3). 3세대 HER2 CAR-NK는 IL-2와 같은 추가적인 사이토카인의 부재로 인해 종양 세포의 형성을 효과적으로 억제하지 못했을 것으로 생각되고 HER2 CAR(t)-NK 세포는 신호전달도메인이 없기 때문에 세포 독성 효과가 낮게 관찰된 것으로 추정할 수 있었다.
3-2) IFN-γ 분비능 평가
NK 세포가 타겟 종양세포와 접촉하였을 때 분비하는 기능성 사이토카인 중 하나인 IFN-γ 분비량을 측정한 결과, 3세대 HER2 CAR-NK 세포와 HER2 CAR(t)-NK 세포는 IFN-γ를 거의 분비하지 않는 반면 4세대 CAR-NK 세포는 IFN-γ를 매우 높은 수준으로 분비함을 관찰하였다(도 4). 이를 통해 생존 및 증식이 원활하지 않은 3세대 CAR-NK 세포와 달리 4세대 CAR-NK 세포는 OX40L를 신호 도메인으로 포함하는 본 발명의 키메라 항원 수용체와 IL-15의 공발현으로 인해 상승적인 항종양 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 4: NK 세포의 배양 및 배양 시점 별 세포 동결
4-1) 세포 해동
동결된 세포를 미리 예열한 37℃ 항온 수조에서 빠르게 해동하였다. 90% 이상 해동된 상태에서 생물안전작업대 상에서 50 mL 튜브에 세포를 옮기고 10 배 (v/v)의 ACD 완충액을 천천히 첨가하였다. 이후 1200 rpm, 4℃로 10 분간 원심분리하여 상층액을 모두 제거 후 CellGro 배지에 현탁하고 세포수를 측정하였다.
4-2) NK 세포 배양 및 렌티바이러스 벡터를 이용한 형질도입
배양 0일차 1.0 x 106/mL의 NK 세포와 2.5 x 106/mL의 지지세포, CellGro 배지를 각각 1:1:1 비율로 섞어 주고, 37℃ CO2 배양기에서 정치배양하였다. 이때 전체 부피에 해당되는 만큼의 IL-2(1,000 IU/mL), 인간혈장(2%) 및 OKT3(10μg/mL)가 첨가된 Cellgro 배지를 사용하였다. 배양 4일차에 IL-2(1,000 IU/mL) 및 인간혈장(1%)을 포함하는 CellGro 혼합배지를 전체부피의 동량만큼 추가하였다. 배양 7일차 전체 세포를 회수한 후, 별도의 희석 없이 세포수를 측정하여 0.66 x 106/mL이상이면 세포를 동결하였다. 배양 7일차에 동결한 세포를 해동한 원료세포를 CellGro 배지에 현탁 후 세포수를 측정하여 1.0 x 106/mL 농도로 희석된 세포를 배양하였다. 배양 10일차에 1.0 x 106/mL의 세포에 20 MOI의 렌티바이러스 벡터를 처리하기 위해 6.6 x 108 TU/mL의 렌티바이러스 벡터 30μL를 혼합액과 함께 처리 하였으며, 렌티바이러스 벡터 형질도입을 위한 혼합액 조성은 아래 표 3과 같다.
렌티바이러스 벡터 형질도입을 위한 각 용액의 조성
혼합액 용액 보관용량 최종 농도
1 렌티바이러스 벡터 해당 없음 20 MOI/1ⅹ106 cells
Protransduzin RUO DMSO에 10 mg/mL 10μg/mL
2 IL-21 PBS에 100μg/mL 20 ng/mL
인간혈장 해당없음 1%
IL-2 2,500,000 IU/mL 1,000 IU/mL
Glutamine 200 mM 2%
CellGro 배지 해당 없음 해당없음
혼합액 1과 2를 각각 제조한 후 배양용기에 천천히 넣어주었다. 렌티바이러스 벡터 형질도입을 하지 않는 CBNK에는 1 mL의 CellGro 배지에 인간혈장(1%)과 IL-2(1,000 IU)를 섞은 혼합배지(이하 CellGro 혼합배지)를 넣어준 후 37℃ CO2배양기에서 정치배양하였다. 배양 11일차에는 6-웰 기준 배양 10일차 부피의 동량에 해당하는 CellGro 혼합배지와 IL-21를 20 ng/mL의 농도로 추가하였다. 배양 13일차에는 세포를 회수하여 별도의 희석없이 CellGro 혼합배지를 추가하여 1 x 106/mL로 맞춰주었다. 배양 16일차에는 CD5 CAR를 발현하는 NK 세포를 얻기 위해 CD5 양성세포를 분리하였다. 이를 위해 NK 세포를 모두 회수하여 1200 rpm, 4℃로 5분간 원심분리 후 상층액을 제거 한 뒤 MACS 완충액에 현탁 후 세포수를 측정하여 1.0 x 107/mL이 되게 MACS 완충액을 추가하였다. 이후 바이오틴이 태그된 재조합 인간 CD5 단백질(His & AVI tag)(250μg/mL)를 1μL/106 cells로 넣고 잘 섞은 뒤 4℃에서 30분간 반응시켰다. 1차 반응시킨 부피의 10배의 MACS 완충액을 넣어 340g, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 1.0 x 108/mL이 되도록 MACS 완충액으로 현탁 후 항-바이오틴 비드(Miltenyi Biotec, 130-092-357)를 37.5μL/40 x 106 cells로 넣고 4℃에서 15 분간 반응시켰다. 10배 부피의 MACS 완충액을 넣어 340g, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 1.0 x 108 cells/500μL로 MACS 완충액을 넣은 후 여러 번 파이페팅하여 세포를 잘 풀어주었다. QuadroMACSTM Separator(Miltenyi Biotec)에 LS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 장착하고 3 mL의 MACS 완충액을 흘려주어 컬럼을 활성화시켰다. 비드와 반응한 세포를 파이페팅으로 잘 풀어준 뒤 컬럼당 500μL씩 담아 세포 현탁액이 모두 내려가길 기다렸다. 컬럼 세척을 위해 위해 3 mL의 MACS 완충액을 흘려 보내주며 총 3회 세척하였다. 컬럼을 QuadroMACSTM Separator에서 분리한 후 MACS 완충액 5 mL을 넣고 플런저(plunger)로 내려 CD5 CAR 양성세포를 회수하였다. 분리된 세포는 원심분리 후 1 x 106/mL이 되게 CellGro 혼합배지를 추가하고, 배양 0일차와 동일한 방법으로 지지세포를 이용한 재자극을 진행 한 후 37℃ CO2 배양기에서 정치배양하였다. 배양 19 일차에는 배양 16일차 배양부피와 동량의 CellGro 혼합배지를 추가하였다. 배양 21 일차 세포를 회수하여 별도의 희석없이 세포 수를 측정하고 CellGro 혼합배지를 추가하여 1 x 106/mL로 맞춰 주며, 이후 배양 28일~ 30일차까지 CellGro 혼합배지를 추가하여 1 x 106/mL 농도를 유지하도록 배양하였다. 배양 28일 ~ 30일차 NK 세포를 모두 회수한 후 세포를 동결하였다. 이하 배양 28일~30일차까지 배양 후 동결한 세포를“MCB”라고 명명한다. 나머지 세포는 1.0 x 106/mL이 되도록 CellGro 배지를 추가한 후 배양 16일차와 같이 지지세포를 이용한 재자극을 진행 하고 37℃ CO2 배양기에서 정치배양하였다. 이후 14일간 CellGro 혼합배지를 추가하여 1 x 106/mL농도를 유지하도록 배양하였다. 배양 42일 ~ 44일차 NK 세포를 모두 회수한 후 세포를 동결하였으며 이와 같이 동결한 세포를“DP”라고 명명한다.
4-3) 세포 동결
원심 분리 후 PBS에 세포를 현탁 하여 동결배지 혼합액을 1:1로 섞어 동결용기 당 100 x 106/mL로 분주하고 자동세포동결기(CRF)로 세포를 동결하였다.
실시예 5: CD5 CAR 형질도입된 NK 세포의 특성
5-1) CD5 CAR 발현의 확인
1 - 5 x 105개의 세포를 수거하여 원심 후 상층액을 제거한 후 2 mL의 2% FBS가 첨가된 FACS 완충액에 부유켰다. 이후 원심분리하여 상층액을 제거하고 다시 100μL의 FACS 완충액과 바이오틴이 태그된 재조합 인간 CD5 단백질(His & AVI tag)(250μg/mL) 1 μL을 넣어서 4℃, 30분간 차광하여 반응시켰다. 이후 2mL의 FACS 완충액을 넣어 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 2차 염색을 위해 세척된 NK 세포에 100 μL 세포 완충액을 넣어준 뒤 분석에 사용될 항체를 첨가하고 4℃, 30분간 차광하여 반응시켰다.
CD5 CAR-NK 발현 확인을 위한 항체
항체 용량
스트랩타비딘-PE 0.5 μL
항-인간 CD56 APC 5 μL
항-인간 CD3-PE-Cy7 1 μL
7-AAD 5 μL
FACS 완충액 최대 100 μL
전체 용량 100 μL
이후 2mL의 FACS 완충액을 넣어 원심분리한 후 상층액을 제거하고 200 μL의 BD cytofix 용액을 넣고 잘 섞어준 뒤 LSRfortessa 장비를 이용하여 염색된 세포를 분석하였다. 미가공 데이터를 Flowjo 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 게이팅(Gating)은“singlet → 림프구 → 살아있는 세포(7-AAD-) → NK 세포(CD56+, CD3-) → CD5 CAR 발현“의 순서로 진행하였다. 해동 후 MCB의 CD5 CAR 발현율은 96.46±2.00(평균값±표준편차), DP의 CD5 CAR 발현율은 93.68±2.23(평균값±표준편차)로, MCB와 DP 모두 90% 이상의 세포가 CD5 CAR를 발현했으며(도 6) 해당 값은 양측 t-검정을 통해 통계적 유의성을 확인하였다(표 5, *p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음). 위의 결과를 통해서 배양기간이 늘어나도 CD5 CAR의 발현은 잘 유지되고 있었으며, 동결된 세포를 해동한 경우에도 CD5 CAR의 발현이 급격히 감소하지 않음을 확인하였다).
MCB와 DP의 CAR 발현율
CAR 발현 % MFI
CBNK (MCB) 평균 0.19 233.65
STD 0.08 101.10
CD5 CAR-NK (MCB) 평균 96.46 13437.68
STD 2.00 482.37
CBNK(MCB)vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 0.0001 0.0004
CBNK (DP) 평균 0.26 245.49
STD 0.14 136.91
CD5 CAR-NK (DP) 평균 93.68 10443.52
STD 2.23 2875.77
CBNK(DP)vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 0.0002 0.0232
CD5CAR-NK(MCB)vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 0.0093 ns
5-2) CD5 CAR 형질도입된 NK 세포의 표현형 확인
NK 세포를 1.0-2.5 x 106/mL 농도로 FACS 완충액에 현탁한 후, 항체 혼합액이 분주된 플레이트에 100μL씩 분주하였다. 세포와 항체가 잘 섞이도록 수회 파이페팅하였다. 항체 혼합액 조성은 하기 표 6과 같으며 각 표현형에 해당하는 PE 항체를 첨가하였다.
표현형 염색을 위한 항체 혼합액 조성
　 PE_Cy7 PE APC PerCP_Cy5.5 총 염색 용적
(μL)
PE_Cy7 용적 (μL) PE 용적(μL) APC 용적 (μL) PerCP_Cy5.5 용적(μL)
1 CD3 1 CD16 5 CD56 5 7-AAD 5 16
2 NKG2A 1 12
3 NKG2C 1 12
4 NKG2D 5 16
5 NKp30 1 12
6 NKp44 5 16
7 NKp46 5 16
8 CXCR3 5 16
9 DNAM-1 5 16
10 CD25 5 16
11 CD57 1 12
12 CD62L 1 12
13 CD69 5 16
14 PD-1 1 12
15 TIGIT 1 12
16 LAG3 1 12
17 TIM3 1 12
18 KLRG-1 1 12
19
(FMO1)		 mIgG1 5 16
20
(FMO2)		 mIgG2a 5 16
아형 mIgG1 1 mIgG1 5 mIgG1 5 16
4℃에서 30분간 반응시키고 FACS 완충액을 100μL씩 넣어 파이페팅으로 섞은 뒤 원심분리(2000 rpm, 3 분, 4℃)한 후 BD cytofix 용액을 각 웰에 200μL씩 분주하였다. LSRfortessa 장비를 이용하여 유세포분석 진행 후 결과를 분석한다. NK 세포는 singlets → 림프구 → 살아있는 세포(7-AAD-) → NK 세포(CD56+, CD3-) 의 순으로 게이팅하고, 각 마커의 발현은 아형 항체 기준으로 값을 계산하였다. NK 세포의 특성 분석을 위해서 18종의 표면 마커 발현을 유세포 분석기로 분석하였고, CD5 CAR-NK의 MCB, DP를 CBNK의 MCB, DP와 비교했다. 그 결과, CD5 CAR-NK에서 각 표면마커의 발현은 CBNK와 비교했을 때 큰 차이가 없었고, MCB와 DP간에도 유의미한 차이는 없었다(도 7, 표 7).
Figure PCTKR2023015186-appb-img-000001
실시예 6: CD5 CAR 형질도입 세포의 in vitro 효능 평가
6-1) 종양세포주의 제작 및 배양
동결된 K562, NALM6, CCRF-CEM, RPMI-8402_Luc, NALM6-NucLight, CCRF-CEM-NucLight 및 RPMI-8402-NucLight 세포를 37℃ 항온수조에서 빠르게 해동시킨 뒤 배양배지 10 mL에 희석하고 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음 배지 1 mL 넣어 세포수를 측정하였다. 1-2 x 106개의 세포를 T75 플라스크에 넣고 CO2 배양기에서 2-3일간 배양하였다. NucLight가 표지된 종양 세포주를 제작하기 위해 8μg/mL 폴리브렌(Santa cruz, CA, USA)을 사용하여 세포주에 Incucyte® NuclightRed 렌티바이러스(Sartorius, Gottingen, Germany)를 형질도입하고, 4일 후 퓨로마이신(Gibco, USA)을 0.5, 1, 1.5 및 2μg/mL로 처리하였다. 퓨로마이신 처리 7일 후 종양세포를 100% 사멸시킨 농도 중 가장 낮은 농도를 선택하여 적색 형광 단백질을 발현하고 있는 세포만 선별한 후 배양하였다.
6-2) 종양세포에서의 CD5 발현
종양세포를 회수하여 1 - 5 x 105개의 세포를 FACS 튜브에 옮겼다. 원심분리 후 FACS 완충액 100 μL에 항-인간 CD5 PE 1μL를 넣고 섞어주고 4℃, 30분간 차광하여 반응시켰다. 1mL의 FACS 완충액을 넣고 원심분리 한 후 상층액을 버리고 BD cytofix 용액 200 μL를 넣고 섞어준 후 FACS 분석을 진행하였다. 분석결과, 회색의 음영은 아형 대조군을, 파란색의 실선은 항-인간 CD5 항체를 염색한 결과를 보여주며, 숫자는 아형 대조군 대비 발현율(%)을 나타낸다. K562, NALM6, NALM6-Nuclight에서는 CD5를 거의 발현 하지 않는 반면에 CCRF-CEM, CCRF-CEM-Nuclight, RPMI-8402_Luc, RPMI-8402-Nuclight 및 Jurkat- Nuclight에서는 CD5를 높게 발현함을 확인하였다(도 8).
6-3) CD5 CAR 형질도입 세포의 CD107a 및 사이토카인 발현 확인
NK 세포와 타겟 종양 세포주를 각각 RPMI-1640 + 10% FBS(이하 어세이 배지)에 2.5 x 106/mL로 현탁하였다. CD5에 특이적인 세포 활성을 보이는지 확인하기 위하여 CD5 양성 종양 세포주로 CCRF-CEM과 RPMI-8402_Luc를 사용하였으며 CD5 음성 종양 세포주로 NALM-6를 사용하였다. NK 세포 내 생성된 사이토카인이 밖으로 분비되지 않도록 Golgistop(1.3μ/mL)과 Golgiplug(2μ/mL)를 넣고 섞어주었다. 96-웰 둥근바닥 플레이트에 (-)웰과 타겟 웰에 APC 항-인간 CD107a 항체 (1μL)을 분주하였다. 항체가 분주된 플레이트에 (-) 웰에는 NK 세포 자체의 사이토카인 발현을 확인 하고자 어세이 배지 100μL와 NK 세포 100μL를 넣어주고, 타겟 웰에는 NK 세포와 타겟 종양 세포주를 각 100μL씩 함께 넣어주었다. 96 웰 플레이트를 호일로 싸서 빛을 차단한 후 37℃ CO2배양기에서 4시간 동안 공배양하였다. 원심분리(2000rpm, 3분, 4℃) 후 상층액을 제거하고 200μL FACS 완충액을 넣은 후 섞어주고 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 웰당 FACS 완충액 100μL에 세포표면 염색을 위해 항-인간 CD3 PerCP-Cy5.5(1uL), 항-인간 CD56-APC-e780(1 uL) 그리고 7-AAD(4μL)를 넣고 4℃, 30분간 배양하였다. 100μL FACS 완충액을 첨가한 후 원심분리를 2회 진행한 후 상층액을 제거하고 200μL 고정/투과화 용액을 첨가한 뒤 4℃에서 30분 배양하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 200μL 1 x Perm 세척 완충액을 첨가한 후 원심분리하였다. 웰당 1 x Perm 세척 완충액 100 μL를 넣은 후 항-인간 IFN-η FITC(1μL), 항-인간 TNF-α PE-Cy7(1μL)를 넣고 4℃에서 30 분간 배양하였다. 100μL 1 x Perm 세척 완충액을 첨가한 후 원심분리 한 뒤 상층액을 제거하고 200μL 1 x Perm 세척 완충액을 첨가하여 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 200μL의 BD cytofix를 첨가하여 LSRFortessa FACS 장비를 통해 측정 후 FlowJo 분석 프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다. 그 결과, NK 세포의 활성을 평가할 때 사용되는 K562 세포주에 대한 CD107a의 발현과 사이토카인(IFN-γη, TNF-α)의 발현은 CBNK, CD5 CAR-NK에서 큰 차이 없이 높은 발현을 보였으며, 양성 세포주인 CCRF-CEM 및 RPMI-8402_Luc 세포주와 공배양한 경우에는 CBNK 대비 CD5 CAR-NK 그룹에서 2배 이상 높은 발현을 보인 반면 음성 세포주인 NALM-6에 대해서는 낮은 수준의 비슷한 발현을 보여 CD5 특이적으로 사이토카인을 발현하는 것을 확인하였다(도 9). 공여자 3명의 CD107a 발현량 사이토카인 2종 측정 결과는 양측 t-검정를 이용하여 통계적 유의성을 확인하였으며 표 8에 평균값±표준편차로 나타내었다(도 9, *p<0.05, **p<0.01, ns: 유의성 없음). CBNK 대비 CD5 CAR-NK에서 CD5 특이적으로 높은 CD107a의 발현과 사이토카인 발현 증가를 보였으며 MCB와 DP 사이의 통계적 유의성은 없었다.
CD107α, IFN-η 및 TNF-α의 평균 발현 값(n=3)
CD107α w/o 타겟 K562 NALM6 CCRF-CEM RPMI-8402_ Luc
CBNK (MCB) 평균 5.59 55.57 10.26 18.19 7.87
STD 8.48 14.85 11.58 8.79 7.99
CD5 CAR-NK (MCB) 평균 7.97 48.55 9.15 45.37 30.6
STD 7.68 3.14 7.05 7.17 13.82
CBNK(MCB) vs
CD5CAR-NK(MCB)의 p-값		 ns ns ns 0.0149 0.0643
CBNK (DP) 평균 4.14 46.69 7.96 19.82 5.72
STD 5.44 5.19 3.23 3.02 4.07
CD5 CAR-NK (DP) 평균 7.56 47.51 9.87 43.15 24.4
STD 9.53 6.79 4.41 7.19 8.56
CBNK(DP) vs
CD5CAR-NK(DP)의 p-값		 ns ns ns 0.0429 0.0251
CD5CAR-NK(MCB)vs
CD5CAR-NK(DP)의 p-값		 ns ns ns 0.0573 0.4914
IFN-γ w/o 타겟 K562 NALM6 CCRF-CEM RPMI-8402_ Luc
CBNK (MCB) 평균 3.3 56.51 4.66 9.89 3.76
STD 2.83 6.62 2.37 0.2 0.98
CD5 CAR-NK (MCB) 평균 7.65 50.99 7.8 54.7 45.47
STD 6.36 15.79 5.47 14.86 15.82
CBNK(MCB) vs
CD5CAR-NK(MCB)의 p-값		 ns ns ns 0.0344 0.05
CBNK (DP) 평균 5.17 49.83 5.96 13.65 4.23
STD 4.91 7.1 2.6 5.25 1.67
CD5 CAR-NK (DP) 평균 3.17 49.54 5.36 49.88 36.07
STD 1.07 8.15 1.71 5.35 3.91
CBNK(DP) vs
CD5CAR-NK(DP)의 p-값		 ns ns ns 0.0064 0.0072
CD5CAR-NK(MCB) vs
CD5CAR-NK(DP)의 p-값		 ns ns ns 0.4959 0.3298
TNF-α w/o 타겟 K562 NALM6 CCRF-CEM RPMI-8402_ Luc
CBNK (MCB) 평균 3.49 44.49 7.54 10.27 5.45
STD 4.78 18.61 8.03 6.53 5.91
CD5 CAR-NK (MCB) 평균 4.38 35.72 5.94 41.33 37.24
STD 3.9 3.09 4.5 3.76 5.18
CBNK(MCB) vs
CD5CAR-NK(MCB)의 p-값		 ns ns ns 0.0042 0.0024
CBNK (DP) 평균 3.82 41.66 6.83 12.94 5.14
STD 5.15 4 3.54 2.22 4.09
CD5 CAR-NK (DP) 평균 3.83 42.28 7.59 45.47 35.34
STD 4.47 5.3 3.61 0.46 2.81
CBNK(DP) vs
CD5CAR-NK(DP)의 p-값		 ns ns ns 0.0022 0.0018
CD5CAR-NK(MCB) vs
CD5CAR-NK(DP)의 p-값		 ns ns ns 0.2001 0.4893
6-4) CD5 CAR 형질도입 세포의 종양세포 살해능 평가
NK 세포(CBNK, CD5 CAR-NK)를 회수하여 상온, 1200 rpm 으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 1 mL 어세이 배지로 현탁 후 세포 수를 측정하였다. 5 mL FACS 튜브에 형질도입 세포를 E (NK 세포):T (타겟 세포) 비율에 맞게 어세이 배지에 현탁하여 첨가하였다. NK 세포는 다음과 같이 10:1 비율은 1 x 105 cells/100μL, 3:1 비율은 3 x 104 cells/100μL, 1:1 비율은 1 x 104 cells/100μL, 0.3:1 비율은 3 x 103 cells/100μL이 되게 준비하였다.
96-웰 둥근바닥 플레이트에 타겟 세포주를 1 x 104 cells/well(1 x 105 cells/mL, 100μL)로 고정하고 NK 세포를 E:T 비율에 맞게 100μL씩 넣어주었다. Calcein-AM으로 염색된 타겟 세포에서 스스로 방출되는 Calcein-AM에 대한 형광값을 보정해주기 위해 타겟 세포 100 μL와 어세이 배지 100 μL를 넣어주고 이때 측정된 값을 최소방출량 값으로 하였다. 타겟 세포에서 최대로 방출되는 Calcein-AM 형광 값을 측정하기 위해, 타겟 세포 100 μL와 2% 트리톤 X-100을 100μL을 넣어 세포를 전부 용해시키고 이 때 측정된 형광값을 최대방출량 값으로 하였다. 트리톤 X-100에 의해 형광값이 낮아지는 것을 보정하기 위해, MM 웰에는 어세이 배지 200 μL를 넣고 MT 웰에는 어세이 배지 100μL와 2% Triton X-100 100μL를 넣어주었다. 차광 하에 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양 후 4℃, 2000 rpm으로 3 분간 원심분리하였다. 상층액 100 μL를 검정 96-웰 납작바닥 플레이트에 옮겨 넣고 458 nm/535nm, 0.1s 조건에서 형광측정기를 이용하여 형광값을 측정하고 세포 살해능은 표 9의 계산식에 따라 계산하였다.
NK 세포의 살해능 계산 방법
NK 세포 살해능 계산 방법
MM 웰 평균 형광 값 - MT 웰 평균 형광 값 = 특이적 용해 비율 A% = [(시료 웰 평균 형광 값 - 최소방출량 웰 평균 형광 값) /(최대방출량 웰 평균 형광 값 + A) - 최소방출량 웰 평균 형광 값] x 100
3명의 공여자(2024P, 2044P, 605463P)에서 4 종의 타겟 세포에 대한 CBNK (MCB), CD5 CAR-NK(MCB), CBNK(DP), CD5 CAR-NK(DP)의 각 세포 살해능을 도 7에 나타내었으며, 각 세포 살해능 수치(%)는 하기 표 10에 요약하였다. 도 11 및 표 10에서 보는 바와 같이, CD5 양성세포주인 CCRF-CEM과 RPMI-8402-Luciferase 세포에 대한 CD5 CAR-NK 세포의 종양살해능이 CBNK 대비 높았으며 CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP) 간의 차이는 크지 않았다(양측 t-검정 *p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음).
공여자 3명(2024P, 2044P, 605463P)에서의 세포 살해능(%)
K562 10:1 3:1 1:1 0.3:1
CBNK (MCB) 평균 82.65 74.02 45.16 18.80
STD 2.96 4.81 6.25 6.08
CD5 CAR-NK
(MCB)		 평균 82.53 71.45 39.17 14.13
STD 7.87 4.24 4.08 5.14
CBNK(MCB) vs CD5 CAR-NK(MCB)의 p-값 ns ns ns ns
CBNK (DP) 평균 82.13 57.72 25.43 8.28
STD 6.74 3.83 4.27 2.65
CD5 CAR-NK
(DP)		 평균 92.76 65.25 30.27 8.26
STD 6.61 7.40 8.32 5.59
CBNK(DP) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 ns ns ns ns
CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 ns ns ns 0.0264
NALM6 10:1 3:1 1:1 0.3:1
CBNK (MCB) 평균 15.60 9.48 5.31 3.54
STD 4.27 4.44 4.25 2.93
CD5 CAR-NK
(MCB)		 평균 6.75 2.91 0.43 -0.75
STD 3.14 3.04 3.89 2.95
CBNK(MCB) vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 0.0286 0.0226 0.0242 0.0291
CBNK (DP) 평균 6.96 3.11 3.80 6.78
STD 7.68 3.66 2.79 2.59
CD5 CAR-NK
(DP)		 평균 13.51 3.45 1.75 3.95
STD 14.69 5.43 2.19 2.60
CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 ns ns 0.045 0.0017
CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 ns ns ns ns
CCRF-CEM 10:1 3:1 1:1 0.3:1
CBNK (MCB) 평균 29.68 18.56 10.86 4.83
STD 7.08 4.96 3.05 1.64
CD5 CAR-NK
(MCB)		 평균 59.04 48.76 29.66 11.09
STD 2.83 2.59 3.54 2.43
CBNK(MCB) vs CD5CAR-NK(MCB)의 p-값 0.0345 0.0182 0.0378 ns
CBNK (DP) 평균 24.91 11.53 5.16 2.98
STD 7.86 4.65 0.74 0.74
CD5 CAR-NK
(DP)		 평균 74.20 50.30 20.90 6.86
STD 7.06 7.02 4.33 3.68
CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 0.0002 0.0063 0.0237 ns
CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 ns ns 0.0437 ns
RPMI-8402 루시퍼라제 10:1 3:1 1:1 0.3:1
CBNK (MCB) 평균 15.27 8.13 5.17 3.52
STD 5.29 3.71 2.66 4.91
CD5 CAR-NK
(MCB)		 평균 61.76 36.60 13.97 3.29
STD 2.37 3.78 2.73 4.45
CBNK(MCB) vs CD5 CAR-NK(MCB)의 p-값 0.0082 0.0044 0.0051 ns
CBNK (DP) 평균 6.44 2.26 2.09 4.90
STD 0.77 2.60 3.48 3.61
CD5 CAR-NK
(DP)		 평균 60.12 27.42 9.28 4.86
STD 11.07 3.84 2.82 3.38
CBNK(DP) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 0.0129 0.0144 0.0028 ns
CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP) ns 0.0025 ns ns
6-5) CD5 CAR 형질도입 세포의 IFN-γ 분비능 확인
타겟세포를 어세이 배지에 희석하여 1 x 105/mL로 준비하고 NK 세포를 어세이 배지에 희석하여 3 x 105/mL 농도로 준비한 뒤 각각 100μL씩 96 웰 둥근바닥 플레이트에 분주하여 E:T = 3:1 비율로 공배양하였다. 이후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후 상층액을 취하여 -20℃에서 보관하였다.
IFN-γ 정량을 위해 ELISA를 수행하였다. 실험 하루전‘1x 코팅 완충액 A’에‘200 x 포집 항체’를 희석한 뒤 96-웰 플레이트에 100μL를 넣어 2-8℃에서 16-18시간 배양하였다. 실험 당일 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척하고‘1 x 어세이 희석액 A’를 200μL씩 각 웰에 넣어 비특이적 결합을 억제하였다. 플레이트를 밀봉한 뒤 플레이트 셰이커에서 1 시간 방치하였다. ‘1x 어세이 희석액 A’에‘인터페론 감마 스탠다드 저장용액’을 단계적으로 희석(500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 0 pg/mL)하여 스탠다드를 제작하였다. 이후 -20℃에 보관해 두었던 상층액을 녹여 1/10로‘1 x 어세이 희석액 A’에 희석하여 샘플을 제작하였다. 스탠다드와 희석한 샘플을 웰에 100μL씩 분주하고 플레이트를 밀봉 한 뒤 플레이트 셰이커에서 상온에서 2 시간 반응시켰다. 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척하였다. ‘1 x 검출 항체’를 100μL씩 각 웰에 넣고 플레이트를 밀봉한 뒤 플레이트 셰이커에서 상온에서 1시간 반응하였다. 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척하였다. ‘1 x Avidin-HRP’를 100μL씩 각 웰에 넣고 플레이트를 밀봉한 뒤 플레이트 셰이커에서 상온에서 30분간 반응시켰다. 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 5회 세척한 뒤‘TMB Substrate’를 100μL씩 웰에 넣고 상온에서 20분간 차광 하에 반응시켰다. ‘Stop 용액’을 100μL씩 넣어 반응을 종료하고, 분광광도계를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, CD5 음성 세포주인 K562와 NALM6에서는 공여자 3명(2024P, 2044P, 605463P)의 CBNK(MCB, DP)와 CD5 CAR-NK(MCB, DP)간의 IFN-γ 분비의 차이는 있지만 모든 공여자의 결과를 종합해서 분석했을 때 유의미한 차이는 없었다. CD5 양성 세포주인 CCRF-CEM과 RPMI-8402-Luciferase에서는 공여자 2024P에서 CBNK(MCB, DP)는 40-60 pg/mL, CD5 CAR-NK(MCB, DP)는 350-550 pg/mL의 IFN-γ를 분비하였고, CBNK 대비 CD5 CAR-NK의 IFN-γ의 분비량이 약 8~9배 높았다. 공여자 2044P에서는 CBNK(MCB, DP)는 45-55 pg/mL, CD5 CAR-NK(MCB, DP)에서는 250-350 pg/mL의 IFN-γ를 분비하여 CBNK 대비 CD5 CAR-NK가 약 5~6배 많이 IFN-γ를 분비했다. 공여자 605463P에서는 CBNK(MCB, DP)는 70-120 pg/mL, CD5 CAR-NK (MCB, DP)는 600-1300 pg/mL의 IFN-γ를 분비하여 CD5 CAR-NK가 CBNK에 비해서 8~10배 많은 IFN-γ를 분비했다. 종합적으로 공여자 3명 모두 CD5 CAR-NK에서 CD5 양성세포주 특이적으로 향상된 IFN-γ 분비능을 나타냈고, 통계적으로 의미 있는 결과를 보였다(도 12, *p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ****<0.0001, ns: 유의성 없음). CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP) 사이의 통계적 유의성은 없었다.
공여자 3명에 대한 IFN-γ 분비능 (pg/mL)
IFN-g K562 NALM6 CCRF-CEM RPMI-8402_Luc
CBNK (MCB) 평균 357.54 31.32 45.56 37.56
STD 365.59 21.42 37.40 27.52
CD5 CAR-NK
(MCB)		 평균 386.74 76.47 646.38 556.69
STD 146.29 30.05 285.06 156.63
CBNK(MCB) vs CD5 CAR-NK(MCB)의 p-값 ns 0.0021 <0.0001 <0.0001
CBNK (DP) 평균 304.12 37.84 54.67 45.59
STD 228.44 25.69 46.72 37.87
CD5 CAR-NK
(DP)		 평균 303.88 59.91 707.42 581.36
STD 142.75 9.07 443.92 194.58
CBNK(DP) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 ns 0.0272 0.0005 <0.0001
CD5 CAR-NK(MCB) vs CD5 CAR-NK(DP)의 p-값 ns ns ns ns
6-6) CD5 CAR 형질도입 세포의 IL-15 분비능 확인
타겟 세포와 NK 세포를 어세이 배지에 희석하여 타겟 세포는 2 x 106/mL, NK세포는 6 x 106/mL 농도로 준비하였다. 각각 100μL씩 96 웰 둥근바닥 플레이트에 분주하여 E:T = 1:3의 비율로 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 공배양한 후 상층액을 얻어 -20℃로 보관하였다.
IL-15 ELISA kit를 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다. 마이크로 플레이트 스트립을 플레이트 틀에 끼우고 어세이 희석액 RD1-19를 각 웰에 100μL씩 분주하였다. IL-15 스탠다드와 보관해 두었던 상층액을 플레이트에 50μL씩 분주하고, 상온에서 3시간, 셰이커에서 반응시켰다. 세척 완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척하였다. ‘IL-15 컨쥬게이트를 각 웰에 200μL씩 넣고, 상온에서 45분간 셰이커에서 반응시켰다. 세척완충액을 이용하여 플레이트를 4회 세척한 뒤‘Substrate 용액’을 200μL씩 넣고, 상온에서 30분간 차광 반응하였다. ‘Stop 용액’50μL씩 넣어 반응을 종료하고, 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 13 및 하기 표 12에서 보는 바와 같이 타겟 세포 없이 NK 세포만 배양한 조건 (effector only)에서는 3명의 공여자에서 CBNK(MCB, DP) 4-6 pg/mL, CD5 CAR-NK (MCB, DP) 5-17 pg/mL 수준의 IL-15을 분비하였다. CD5 음성 세포주인 K562와 NALM6에서는 3명의 공여자의 CBNK(MCB, DP)와 CD5 CAR-NK(MCB, DP)에서 NK 세포만 배양한 그룹(effector only)과 비슷한 수준의 IL-15을 분비하였다. CD5 양성 세포주인 CCRF-CEM과 RPMI-8402-Luciferase에 대해 CBNK(MCB, DP)는 CD5 음성 세포주와 비슷한 수준의 IL-15을 분비하였으며, CD5 CAR-NK(MCB, DP)에서는 공여자 2024P는 25-60pg/mL, 공여자 2044P에서는 8~13 pg/mL, 공여자 605463P 20-50pg/mL로 IL-15의 분비가 증가하여 CBNK 대비 CD5 CAR-NK에서 MCB, DP 모두 통계적으로 의미있는 결과를 보였다. CD5 CAR-NK(MCB)가 CD5 CAR-NK(DP) 사이의 통계적 유의성은 없었다(도 13, *p<0.05, **p<0.01, ns:유의성 없음).
MCB 와 DP (pg/mL)에서 IL-15 분비량
IL-15 Effector only K562 NALM6 CCRF-CEM RPMI-8402_Luc
CBNK (MCB) 평균 4.97 5.88 4.98 5.06 5.81
STD 0.24 0.59 0.24 0.28 0.29
CD5 CAR-NK (MCB) 평균 12.21 11.80 8.41 39.97 20.95
STD 5.00 3.78 2.23 21.81 8.32
CBNK(MCB) vs CD5 CAR-NK(MCB)의 p-값 0.0053 0.0036 0.0038 0.0029 0.0012
CBNK (DP) 평균 4.97 4.99 4.95 4.86 5.58
STD 0.41 0.16 0.12 0.25 0.20
CD5 CAR-NK (DP) 평균 7.65 8.55 6.59 19.85 13.27
STD 1.86 2.89 1.58 11.39 5.98
CBNK(DP) vs CD5CAR-NK(DP)의 p-값 0.0063 0.0131 0.0302 0.0092 0.0103
CD5CAR-NK(MCB) vs
CD5CAR-NK(DP)의 p-값		 ns ns ns ns ns
6-7) CD5 CAR 유전자 도입한 NK 세포의 장시간 종양 세포주 살해능 분석시험
CD5 CAR 유전자를 도입한 NK 세포의 장시간 종양 세포주 살해능을 평가하기 위해 적색 형광단백질을 발현하는 종양 세포주를 3명 공여자의 CD5 CAR 세포와 96시간동안 공배양하여 종양 세포주 살해능을 확인하고자하였다. CD5 음성 B 세포 유래 암세포인 NALM6와 CD5 양성 급성 T 림프구성 백혈병 세포주인 CCRF-CEM 및 RPMI-8402를 실험에 사용하였다. 어세이 배지(10% FBS가 포함된 RPMI 1640 (Gibco, 11875093))를 사용하여 종양세포를 1 x 105 cells/mL의 농도로 부유시켰다. 종양 세포주를 스페로이드 형태로 만들기 위해 96-웰 ULA(ultra-low attachment) 플레이트(Corning)에 웰 당 100 μL씩 넣어 준 후 125g, 4℃, 10분간 원심분리 하였다. NALM6, RPMI-8402와 공배양하는 NK 세포는 1 x 105cells/mL의 농도(E:T 비율=1:1)로 준비하였고 CCRF-CEM과 공배양하는 NK 세포는 0.3 x 105 cells/mL의 농도(E:T 비율= 0.3:1)로 어세이 배지를 사용하여 부유시킨 후 종양 세포를 넣어준 웰에 100 μL씩 첨가하였다. 종양 세포 단독 대조군은 NK 세포 대신 어세이 배지 100 μL를 종양 세포 100 μL와 넣어 주었다. Incucyte S3 기기 (Sartorius)에 플레이트를 넣고 96시간 동안 공배양하여 얻어진 종양 세포의 스페로이드 내 적색 형광강도(All Brightfield Object Total Red Integrated Intensity, RCU x μm2/Image)를 Oncocyte 스페로이드 분석 소프트웨어(v2019B)를 사용하여 분석하였다. 그래프는 각 시간대 공배양한 웰의 적색 형광강도를 종양세포만 넣은 웰의 적색 형광강도로 정규화(normalization)하여 수치를 나타내었다. 도 10에서 보는 바와 같이, 3명의 공여자에서 분리하여 제작한 NK 세포의 CD5 음성 NALM6 세포에 대한 종양 살해능은 CBNK 세포 대비 유사하였다. CD5 양성 종양세포인 CCRF-CEM에 대해 CBNK 세포(MCB, DP) 대비 CD5 CAR-NK 세포(MCB, DP)는 지속적으로 종양세포의 성장을 억제하였고 공여자 1의 MCB와 DP의 CD5 CAR-NK 세포는 종양세포 증식 저해능이 유사하였다. 반면에, 공여자 2와 3에서는 CCRF-CEM과 공배양시 CD5 CAR-NK 세포(DP)보다 CD5 CAR-NK 세포(MCB)의 종양세포 살해능이 더 높았다. CD5 양성 종양세포인 RPMI-8402에 대해 두 공여자(공여자 1 및 3)의 경우 CBNK 세포(MCB, DP) 대비 CD5 CAR-NK 세포(MCB)의 종양세포 살해능이 CD5 CAR-NK 세포(DP)보다 더 높았으나, 공여자 2의 CD5 CAR-NK 세포(DP)는 종양살해능을 보이지 않았으며(도 14), 양측 t-검정을 통해 유의성을 확인하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음). 결론적으로, CD5 양성 종양세포에 대한 CD5 CAR NK 세포의 장시간 종양세포 살해능을 확인하였으며 CD5 CAR-NK(DP) 세포보다 CD5 CAR-NK(MCB) 세포가 높은 살해능을 보였다(표 13).
CD5 CAR NK 세포의 장시간 종양세포 살해능
　 NALM-6 (0.3:1) CCRF-CEM (0.3:1) RPMI-8402 (1:1)
타겟 only 평균 100 100 100
STD 0 0 0
CBNK (MCB) 평균 102.00 85.88 108.41
STD 7.71 5.47 5.44
CBNK(MCB)의 p-값 ns ns ns
CAR-NK (MCB) 평균 109.92 12.82 54.08
STD 12.05 6.51 23.27
CAR-NK(MCB)의 p-값 ns <0.0001 0.0063
CBNK (DP) 평균 108.50 88.07 106.36
STD 5.33 5.52 2.23
CBNK(DP)의 p-값 ns ns ns
CAR-NK (DP) 평균 114.07 30.45 79.49
STD 14.77 22.56 11.52
CAR-NK(DP)의 p-값 0.0157 <0.0001 ns
실시예 7: CD5 CAR 형질도입 세포의 인 비보 효능 평가
7-1) 종양세포 배양 및 동결
인체 유래 T세포성급성림프성백혈병 암세포주인 RPMI-8402에 CML-Luc 렌티바이러스 벡터를 삽입하여 제작한 RPMI-8402-Luc 세포주를 배양하였다. 암세포주 배양 배지는 10%(v/v)의 우태아혈청(FBS)(Gibco), 2.0 μg/mL의 퓨로마이신(Gibco)을 포함하는 IMDM 배지(ATCC)를 사용하며, 암세포주 배양시 세포 농도를 1 x 105 cells/mL로 조절하여 적절한 용량의 배양 용기에 배양하였다. 암세포주의 동결은 20% DMSO(Avantor)를 포함하는 암세포주 배양 배지를 사용하며 Mr. Frosty(동결용기)(Thermo Fisher)를 이용하여 초저온 냉동고에서 일주일 이내로 보관 후 초저온 액체질소탱크로 옮겨 보관하였다.
7-2) 종양세포주 이종이식 및 NK 세포 투여
실험동물의 경우 특정병원체 부재(SPF)NOD.Cg-PrkdcscidIL2γgtm1Sug/JicKoat(이하 NOG) 마우스(새론바이오 공급(제작: ㈜코아텍))로 6주령 암컷을 사용하였다. 마우스 종양이식에 사용할 암세포는 동결된 세포주를 해동한 후 3~4일에 한번씩 계대배양하여 준비했고, 마우스에 종양을 이식하는 당일 모든 암세포를 수거하여 원심분리하고 PBS를 이용해 재현탁하였다. 종양세포 및 NK 세포의 투여조건은 ①투여 횟수 및 투여량에 따른 비교(MCB), ② 배양 조건에 따른 비교(MCB, DP)로 나누어 실험을 진행하였다.
① 투여 횟수 및 투여량에 따른 비교의 경우 종양 세포주를 5 x 106 cells/mL의 농도로 세포 현탁액을 준비하였다. 준비한 세포 현탁액을 각 실험군별로 마우스 한 마리당 0.2 mL씩 꼬리 정맥에 주사하여 1 x 106 cells/head로 암세포를 이식하였다. 이식 3일 후부터 CBNK(MCB) 및 CD5 CAR-NK(MCB) 세포를 (A) 단회 투여; (B) 주 2회 간격으로 3회 투여; 및 (C) 주 1회 간격으로 3회 투여하는 총 3개의 시험군으로 구성하였다(표 14). 동결된 NK 세포를 해동한 후 동결배지를 이용하여 세포 현탁액의 농도를 실험조건에 맞게 재현탁한 뒤 0.2 mL씩 단회 혹은 총 3회 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 총 3회 투여는 주 2회 기준 3, 7, 10 일차에 NK 세포를 투여하였으며, 주 1회 기준 3, 10, 17 일차에 NK 세포를 투여하였다. 주 1회 총 3회 투여하는 시험군의 경우 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107 cells/head로 CD5 CAR-NK (MCB)의 투여 용량을 나누어 투여하였다. 대조군으로 PBS만을 투여하는 실험군과 암세포주 1 x 106 cells/head만을 투여하는 Tumor only 실험군을 추가했고, 각 실험군에는 3 또는 5 개체를 포함시켰다.
② 배양 기간에 따른 비교(MCB, DP)의 경우 종양 세포주를 1.5 x 107 cells/mL의 농도로 세포 현탁액을 준비하였다. 준비한 세포 현탁액을 각 실험군별로 마우스 한 마리당 0.2 mL씩 꼬리 정맥에 주사하여 3 x 106 cells/head로 암세포를 이식하였다. 이식 3일 후부터 CBNK (MCB) 및 CD5 CAR-NK (MCB, DP) 세포를 단회로 1 x 107 cells/head씩 투여하였다(표 15). 대조군으로 PBS만을 투여하는 실험군과 암세포주 3 x 106 cells/head만을 투여하는 Tumor only 실험군을 추가했고, 각 실험군에는 3 또는 5 개체를 포함시켰다.
NK 세포 투여 조건 (① 투여 횟수 및 투여량에 따른 비교)
그룹 투여물질 투여량(세포/head) 투여 간격 투여 횟수 개체수
대조군 PBS N/A N/A N/A 3
Tumor only N/A N/A N/A 5
(A) CBNK (MCB) 1 x 107 1회 1회 5
CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 107 1회 1회 5
(B) CBNK (MCB) 1 x 107 주 2회 3회 5
CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 107 주 2회 3회 5
(C) CBNK (MCB) 1 x 107 주 1회 3회 5
CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 107 주 1회 3회 5
CD5 CAR-NK (MCB) 5 x 106 주 1회 3회 5
CD5 CAR-NK (MCB) 2 x 106 주 1 회 3회 5
NK 세포 투여 조건 (② 배양 기간에 따른 비교 (MCB, DP))
그룹 투여물질 투여량(세포/head) 투여 간격 투여 횟수 개체수
대조군 PBS N/A N/A N/A 3
Tumor only N/A N/A N/A 5
실험군 CBNK (MCB) 1 x 107 주 1회 3회 4
CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 107 주 1회 3회 7
CD5 CAR-NK (DP) 1 x 107 주 1회 3회 7
7-3) 마우스에서 투여횟수 및 투여량에 따른 CD5 CAR-NK 세포의 효능 평가
모든 동물에 대하여 시험기간 중 하루 2회(주말 및 공휴일 1회) 일반증상 및 일주일에 3회 체중 변화를 측정하였고 암세포 이식 60일째부터는 일주일에 1회 체중 변화를 측정하였다. 사망 여부 또한 관찰한 뒤 GraphPad Prism을 이용하여 모든 군의 중앙 생존 기간(Median survival time)을 계산함으로써 생존율을 평가하였다. 15 mg/ml 농도의 D-루시페린(GOLDBIO)을 마우스의 복부 양쪽에 각각 50μL씩 복강투여한 후 2% 이소플루란으로 7분간 흡입마취하여 소동물 생체 이미징(Perkin Elmer, IVIS Spectrum Series)을 실시하였다. 암세포 이식일부터 주 1회씩 총 13회(이식일로부터 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 70, 84, 102, 112일) 영상을 촬영하였다. 그 결과, CBNK(MCB) 투여군에서 투여 횟수에 관계없이 모든 개체에서 40일 전후로 뒷다리 마비 증상을 확인하였고 증상 발현 후 2주 이내에 모든 개체가 사망하였으며 Tumor only 군에 비해 더 이른 시점에 사망하여 중앙생존기간이 48 - 50일로 측정되었다(표 16). CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 경우 단회 투여군에서는 뒷다리 마비 증상이 관찰되지 않았고 주 2회 간격으로 총 3회 투여군과 주 1회 간격으로 총 3회 투여군 중 일부의 개체에서만 뒷다리 마비 증상이 관찰되었다. 용량별 비교 결과, 저용량 투여시 더 많은 개체가 뒷다리 마비 증상을 보였다. 최종 관찰시점인 137일에 CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 중앙생존기간은 각각 단회 투여군 129일, 주 2회 간격으로 총 3회 투여 >137일, 주 1회 간격으로 총 3회 투여군의 경우 5 x 106, 1x107 cells/head 실험군 모두 >137일, 2 x 106 cells/head 실험군 100일로 tumor only 및 CBNK(MCB) 투여군의 중앙생존기간이 50일 전후인 데 반해 2배 이상의 생존기간 연장 효과를 보였다(표 16). 주 1회 총 3회 투여군을 통해 투여 용량과 횟수가 많을수록 생존 기간이 늘어나는 경향을 확인하였다(도 15)(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음).
체중변화의 경우 Tumor only 군과 CBNK(MCB) 투여군은 37일 전후로 체중 감소가 시작되었고 각각 56일과 53일째 모든 개체가 사망하였으며 질병의 진행에 따라 체중이 감소하다가 사망하는 경향을 보였다. CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 경우 뚜렷한 체중 감소가 관찰되지 않은 채 사망하는 경우도 있었다.
영상 측정 결과, 단회 및 3회 투여한 CBNK(MCB) 투여군의 경우 21일차부터 영상 신호가 측정되는 반면 모든 CD5 CAR-NK (MCB) 투여군은 영상 신호가 측정되지 않아 두드러진 종양 형성 억제능을 확인할 수 있었다(도 16). 56일째 CBNK(MCB) 투여군이 모두 사망한 시점에도 CD5 CAR-NK(MCB) 투여군은 2 x 106 cells/head 실험군 중 일부 개체를 제외하고 종양이 형성이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 영상신호수치(photon/s)를 측정 결과 21일차부터 CBNK(MCB) 투여군의 영상신호수치가 증가하는 반면 CD5 CAR-NK (MCB) 투여군은 단회 및 3회 투여군 모두에서 35일차까지 종양 투여일과 비슷한 수준을 유지하였다(도 16). 최종 영상관찰 시점인 112일에도 CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 생존 개체에서 종양형성 억제능이 유지되고 있음을 확인할 수 있었으며 일원 분산분석(ANOVA)을 통해 통계적 유의성을 확인하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ****<0.0001, ns: 유의성 없음).
중앙 생존기간
시험군 투여물질 투여량(마우스당 세포수) 중앙생존
기간		 P-값
대조군 PBS N/A >137일 ns
Tumor only N/A 51일 ns
(A) CBNK (MCB) 1 x 107 50일 0.0021 (CBNK 대비)
CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 107 129일
(B) CBNK (MCB) 1 x 107 48일 0.0018 (CBNK 대비)
CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 107 >137일
(C) CBNK (MCB) 1 x 107 48일 ns
CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 107 >137일 0.0036 (CBNK 대비)
CD5 CAR-NK (MCB) 5 x 106 >137일 0.0036 (CBNK 대비)
CD5 CAR-NK (MCB) 2 x 106 100일 0.0026 (CBNK 대비)
종양 투여 후 투여 횟수에 따른 영상신호 수치(광자/s) 결과
A (광자/s) D0 D7 D14 D21 D28 D35
CBNK
(단일주사)		 평균 242000 460000 2220000 4530000 38400000 49600000
SD 19500 132000 940000 1850000 10800000 20100000
CAR-NK
(단일주사)		 평균 243000 459000 2020000 559000 1860000 475000
SD 22300 150000 874000 81500 848000 88400
p 값 ns ns ns 0.0047 <0.0001 0.0005
CBNK
(3회, 주 2회)		 평균 243000 436000 2210000 5270000 31800000 60800000
SD 19000 108000 826000 2070000 7340000 30700000
p 값 ns ns ns ns ns ns
CAR-NK
(3회, 주 2회)		 평균 243000 421000 2080000 489000 2330000 559000
SD 38900 114000 902000 25500 1060000 56900
p 값 ns ns ns 0.004 <0.0001 0.0005
CBNK
(3회, 매주)		 평균 243000 433000 1860000 6230000 32400000 66300000
SD 26900 102000 503000 3050000 4060000 18900000
p 값 ns ns ns ns ns ns
CAR-NK
(3회, 매주)		 평균 242000 340000 1850000 689000 2760000 509000
SD 23200 110000 835000 75400 1420000 23900
p 값 ns ns ns 0.0063 <0.0001 0.0005
종양 투여 후 투여 용량에 따른 영상신호 수치(광자/s) 결과
B (광자/s) D0 D7 D14 D21 D28 D35
CBNK
(10M/head)		 평균 243000 433000 1860000 6230000 32400000 66300000
SD 26900 102000 503000 3050000 4060000 18900000
CAR-NK
(2M/head)		 평균 243000 349000 2040000 732000 2580000 673000
SD 29600 110000 869000 115000 1330000 148000
p 값 ns ns ns 0.0001 <0.0001 <0.0001
CAR-NK
(5M/head)		 평균 243000 422000 2670000 542000 2230000 669000
SD 25900 117000 1230000 58900 893000 128000
p 값 ns ns ns <0.0001 <0.0001 <0.0001
CAR-NK
(10M/head)		 평균 242000 340000 1850000 689000 2760000 509000
SD 23200 110000 835000 75400 1420000 23900
p 값 ns ns ns <0.0001 <0.0001 <0.0001
7-4) 마우스에서 배양 기간에 따른 CD5 CAR-NK 세포의 효능 평가
실시예 7-3과 동일한 과정을 통해 모든 동물에 대하여 시험기간 중 주 2회 일반증상 및 체중 변화를 측정하고 중앙생존기간을 계산하여 배양 기간에 따른(MCB, DP) 생존율을 비교하였다. 암세포 이식 일부터 주 1회씩 총 17회(이식일로부터 0, 7, 14, 27, 35, 42, 49, 56, 65, 72, 78, 86, 94 100, 107, 118, 126일) 영상을 촬영하였다. 그 결과, CBNK(MCB) 투여군에서 투여 횟수에 관계없이 모든 개체에서 40일 전후로 뒷다리 마비 증상을 확인할 수 있었고 증상 발현 이후 2주 이내에 모든 개체가 사망하였으며 중앙 생존기간이 49일로 Tumor only군과 동일하게 측정되었다(표 19). CD5 CAR-NK(MCB) 투여군의 경우 69일차에 처음으로 뒷다리 마비가 나타났고 72일차에 처음으로 마우스 1 마리가 사망하였다. CD5 CAR-NK(DP) 투여군의 경우 83일차에 처음으로 마우스 1 마리가 사망하였으며 사망 직전 뒷다리 마비 증상은 없었다. 이후 CBNK(MCB)와는 달리 CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP)의 일부 개체에서만 사망 전 뒷다리 마비 증상이 관찰되었다. 중앙생존기간의 경우 CD5 CAR-NK(DP)는 90일로 측정되었으나 CD5 CAR-NK(MCB)는 133일차까지 절반 이상의 마우스가 사망하지 않아 중앙생존기간을 계산할 수 없었다(도 18). 이에 CD5 CAR-NK(MCB)의 중앙생존기간이 CD5 CAR-NK(DP)보다 길었으나 통계적으로 유의한 값은 아니었다. 하지만 CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP) 모두 CBNK(MCB)에 비해 통계적으로 유의한 생존율 향상 효과를 보였으며 log-rank(mantel-cox) 검정을 통해 통계적 유의성을 확인하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ns: 유의성 없음).
영상 측정의 경우 Tumor only와 CBNK(MCB) 투여군의 경우 14일차부터 마우스의 뒷마리 부근에 영상신호가 측정된 반면 모든 CD5 CAR-NK(MCB) 투여군은 영상 신호가 측정되지 않아 두드러진 종양형성 억제능을 확인할 수 있었다(도 19). CD5 CAR-NK(DP) 투여군의 경우 종양세포 투여 후 35일차에 영상신호가 관측되기 시작했으며, CD5 CAR-NK(MCB)의 경우 일주일 뒤인 42일차에 영상신호가 관찰되기 시작했다. CBNK(MCB)가 모두 사망한 49일차에도 CD5 CAR-NK(MCB)와 CD5 CAR-NK(DP) 투여군은 일부 개체에서만 영상 신호가 관찰되어 통해 CBNK(MCB)에 비해 CD5 CAR-NK (MCB, DP) 투여군의 종양형성이 억제되었음을 알 수 있었다. 최종 영상관찰 시점인 126일에도 생존 개체에서는 종양 형성 억제능이 유지되고 있음을 확인하였으며 일원분산분석을 통해 통계적 유의성을 확인하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***<0.001, ****<0.0001, ns: 유의성 없음).
중앙생존기간
시험군 투여물질 투여량 중앙생존 기간 P-값
(마우스당 NK 세포수)
대조군 PBS N/A >133일 ns
Tumor only N/A 49일 ns
실험군 CBNK (MCB) 1 x 107 49일 ns
CD5 CAR-NK (MCB) 1 x 107 >133일 0.0016(CBNK 대비)
CD5 CAR-NK (DP) 1 x 107 90일 0.0016(CBNK 대비)
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 융합단백질:
    (a) OX40 리간드(OX40L)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR); 및
    (b) IL(Interleukin)-15.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항-CD5 항체의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제26서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR1, 서열목록 제28서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR2 및 서열목록 제30서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제32서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제34서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR1, 서열목록 제36서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR2 및 서열목록 제38서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열목록 제7서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28, CD3-zeta, OX40 및 4-1BB로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28 및 CD3-zeta를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD28, OX40L 및 CD3-zeta가 세포막으로부터 세포내 방향으로 순서대로 포함되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 키메라 항원 수용체와 상기 IL-15 사이에 위치하는 자가절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 자가절단 펩타이드는 서열목록 제21서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 융합단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
  15. 제 14 항의 핵산 분자를 발현하는 면역세포.
  16. 다음을 발현하는 면역세포:
    (a) OX40 리간드(OX40L)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain); 및 CD5에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR); 및
    (b) IL(Interleukin)-15.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 면역세포는 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 면역세포.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 자연살해세포는 23일 내지 35일간 배양 후 동결 및 해동된 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 면역세포.
  19. 제 15 항 또는 제 16 항의 면역세포를 유효성분으로 포함하는 CD5 양성 종양의 예방 또는 치료용 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 CD5 양성 종양은 림프구성 백혈병인 것을 특징으로 하는 조성물.
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