WO2024076109A1 - 형질전환 카트리지, 형질전환 장치, 이를 포함하는 형질전환 시스템 및 이를 이용하는 형질전환 방법 - Google Patents

형질전환 카트리지, 형질전환 장치, 이를 포함하는 형질전환 시스템 및 이를 이용하는 형질전환 방법 Download PDF

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cell
transformation
cartridge
solution
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이상현
최주현
박준권
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주식회사 펨토바이오메드
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a transformation cartridge, a transformation device, a transformation system including the same, and a transformation method using the same.
  • a viral method using a virus as a transporter (viral vector-based transfer method) and a nonviral delivery technique using synthetic phospholipids or synthetic cationic polymers are widely used. It is known.
  • viruses live as parasites by inserting their DNA into the nucleus of other cells, so they can be viewed as a very efficient DNA delivery system.
  • the gene to be delivered is placed inside a virus that cannot replicate.
  • the advantage of this technology is that it is quite efficient in performing transformation.
  • this technology has several disadvantages. Although it uses an inactivated virus, it can cause an immune response, making it difficult to use multiple times due to its unique characteristics. There are problems such as the limited amount of substances that can be delivered and the difficulty of injecting a certain amount of substances into cells.
  • a method that opens the phospholipid bilayer by applying an electric shock while a substance is placed around the cell can be used.
  • a special buffer e.g., RNase-free buffer
  • the culture medium is removed from the cells using methods such as centrifugation. (cell washing) pretreatment is required.
  • the cell survival rate may decrease significantly, and there is a problem in that a large amount of cells are lost during the pretreatment process. Additionally, there is a problem that the special buffer used is very expensive and is not economical. Additionally, there is a problem that tasks such as preprocessing are difficult to perform in a closed environment, making automation difficult and hygienically controlling the working environment.
  • the present invention was devised to solve these problems, and includes a transformation cartridge that allows transformation to occur by electroporation simply by adding a cell solution and a material solution, a transformation device, a transformation system including the same, and a transformation system using the same. To provide a transformation method.
  • a transformation cartridge includes a main body in which a cell flow path, a material flow path, and a resultant flow path that meet each other are formed; and an electric field forming unit including an electrode coupled to the main body to generate an electric field in the resulting flow path, wherein the cell flow path and the material flow path are formed in a shape that converges into the resulting flow path, and the resulting flow path is, and a mixing passage extending from a location connected to the cell passage and the substance passage, wherein the thickness of the mixing passage is smaller than the thickness of the cell passage.
  • a transformation cartridge includes a main body in which a cell flow path, a material flow path, and a resultant flow path that meet each other are formed; and an electric field forming unit coupled to the main body and including an electrode disposed at an inlet of the material flow path and an outlet of the resultant flow path, wherein the cell flow path and the material flow path are formed in a shape that converges into the resultant flow path, , the resulting flow path includes a mixing flow path extending from a location connected to the cell flow path and the material flow path, and is equal to the thickness of the cell flow path divided by the sum of the thickness of the cell flow path and the thickness of the material flow path.
  • the value multiplied by the thickness of the mixing passage is smaller than the diameter of the cells flowing in the cell passage.
  • a transformation device includes a pump unit provided to pump a cell solution and a material solution into the cell flow path and the material flow path, respectively, of the transformation cartridge;
  • a power application unit provided to be connected to a terminal of the transformation cartridge to apply power to the electrodes of the transformation cartridge; and a processor electrically connected to the power application unit and the pump unit, wherein the processor controls the pump unit based on information on the transformation cartridge, a preset flow rate ratio, and a preset exposure time.
  • the transformation system includes a main body in which cell channels, material channels, and resultant channels meet each other; an electric field forming unit coupled to the main body and including an electrode disposed at an inlet of the material flow path and an outlet of the resultant flow path; a pump unit provided to pump a cell solution and a material solution into the cell flow path and the material flow path, respectively; and a processor electrically connected to the pump unit, wherein the cell flow path and the material flow path are formed in a shape that converges into the resultant flow path, and the resultant flow path is connected to the cell flow path and the material flow path. and a mixing passage extending from the processor, wherein the processor: controls the pump unit so that the thickness of the solution flowing into the mixing passage through the cell passage is smaller than the diameter of the cells included in the cell solution. do.
  • the transformation method includes preparing a cartridge in which a cell flow path, a material flow path, and a mixed flow path are formed that meet each other; Injecting a cell solution containing cells into the cell channel; and injecting a material solution containing a material for transformation of the cells into the material flow path, wherein the flow rate of the injected cell solution and the flow rate ratio of the material solution are determined by the mixing flow path between the cells and the material. This is the value that allows transformation to occur.
  • transformation can occur through electroporation simply by adding a cell solution and a material solution.
  • Transformation can occur even if the substance solution and the cell solution are not mixed.
  • Pretreatment processes such as cell washing can be omitted for cells or transformed materials, increasing the cell survival rate in the process and significantly reducing cell and material loss.
  • the transformation process can be completed simply by injecting the solution in a sealed and controlled environment, making it possible to maintain a hygienic working environment, which is advantageous from various regulations.
  • Figure 1 is a perspective view of a transformation cartridge according to a first embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is an exploded perspective view of the transformation cartridge according to the first embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a plan view of the transformation cartridge according to the first embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a conceptual diagram of the main body of the transformation cartridge according to the first embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a conceptual diagram of the main body of the transformation cartridge according to the second embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a conceptual diagram of the main body of the transformation cartridge according to the third embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a perspective view of a transformation cartridge according to a fourth embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is an exploded perspective view of a transformation cartridge according to a fourth embodiment of the present invention.
  • Figure 9 is a diagram showing a transformation system including a transformation cartridge and a transformation device according to the first embodiment of the present invention.
  • Figure 10 is a diagram showing a transformation system including a transformation cartridge and a transformation device according to a fourth embodiment of the present invention.
  • Figure 11 is a diagram expressing cell sedimentation that occurs in the transformation cartridge according to the first embodiment of the present invention.
  • Figure 12 is a diagram expressing cell sedimentation that occurs in the transformation cartridge according to the third embodiment of the present invention.
  • Figure 13 shows the results of an experiment confirming the transfection efficiency of mRNA using the Neon TM Transfection System (ThermoFisher) and the transfection cartridge of the present invention.
  • Figure 14 shows the effect of the flow rate ratio between the two solutions in the mixing passage on the delivery efficiency of substances such as mRNA in the process of performing transformation by separately supplying the cell solution and the material solution using the transformation cartridge of the present invention. It shows the results of an experiment that confirmed .
  • Figure 15 shows the results of an experiment repeated three times to determine whether the transformation cartridge of the present invention can be delivered with high efficiency to primary cells collected from the human body.
  • Figure 16 shows the results of an experiment confirming the production efficiency (transduction efficiency) (A) and the degree of killing of cancer cells (B) of CAR-NK cells produced using the transformation cartridge of the present invention.
  • first, second, A, B, (a), and (b) may be used. These terms are only used to distinguish the component from other components, and the nature, sequence, or order of the component is not limited by the term.
  • a component is described as being “connected,” “coupled,” or “connected” to another component, that component may be directly connected or connected to that other component, but there is no need for another component between each component. It should be understood that may be “connected,” “combined,” or “connected.”
  • Figure 1 is a perspective view of a transformation cartridge 1 according to a first embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is an exploded perspective view of the transformation cartridge 1 according to the first embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a plan view of the transformation cartridge 1 according to the first embodiment of the present invention.
  • the transformation cartridge 1 includes a main body 10 and an electric field forming part 20.
  • the UP, DOWN, LEFT, RIGHT, and FRONT directions are orthogonal to each other used for convenience of explanation, and the transformation cartridge ( 1) It is a relative direction that can change depending on the arrangement status.
  • the electric field forming unit 20 is a component that forms an electric field in the main body 10.
  • the electric field forming unit 20 is coupled to the main body 10 and disposed at the inlet 130 of the material flow path 13 and the outlet 140 of the resulting flow path 14 to generate an electric field in the resulting flow path 14.
  • the electric field forming unit 20 may be a printed circuit board, but its type is not limited thereto.
  • the electric field forming unit 20 may include a plate-shaped electric field forming body 21.
  • the electric field generating body 21 may be made of multi-layer epoxy resin, but the material is not limited thereto. Electrodes may be formed on the electric field forming body 21, and each electrode may be formed in an annular shape to surround each hole formed in the electric field forming part 20 to correspond to each flow path of the main body 10.
  • the electrodes 22, 23, and 24 may be formed of a conductor such as metal.
  • the electrode may be formed by coating the electric field forming body 21 with copper.
  • the electrodes of the electrode electric field forming unit 20 may include a cell electrode 22, a material electrode 23, and a resultant electrode 24.
  • the electric field forming unit 20 may include terminals 26 and 27 that are electrically connected to each electrode 22, 23, and 24 and that can be connected to a power source.
  • the terminals 26 and 27 may be formed of the same material as the electrodes 22, 23, and 24.
  • the transformation cartridge 1 according to the first embodiment of the present invention includes a material terminal 26 electrically connected to the material electrode 23 and a resultant terminal 27 electrically connected to the resultant electrode 24. can do.
  • Each terminal 26 and 27 may be disposed on the outside of the electric field forming body 21 to facilitate connection to a power source.
  • the electric field forming unit may be configured to include electrodes arranged inside the main body to surround each flow path and coupled to the main body. These electrodes can also be placed in the mixing flow path.
  • the electric field forming unit 20 can form an electric field using a simple direct current power source, but can also form an electric field using a pulse-type power source.
  • the processor 201 of the transformation device (2 in FIG. 9), which will be described later, can control the electric field forming unit 20 using a PWM control method using the power applying unit 203 electrically connected thereto.
  • the frequency of the pulse may be between 1 kHz and 100 kHz, and the duty ratio may be between 10% and 90%.
  • the electric field forming unit 20 can be formed by changing the size of the electric field.
  • the electric field size may change and decrease by up to 50% of the maximum value of the electric field size formed by the electric field forming unit 20.
  • the transformation cartridge 1 may include a sealing sheet 30.
  • the sealing sheet 30 is located between the main body 10 and the lower mount 63, which will be described later, to prevent shock from being directly transmitted from the lower mount 63 to the main body 10 and to maintain the main body 10. It can be supported stably.
  • the sealing sheet 30 may be made of a material containing silicone, but the material is not limited thereto.
  • a hole is formed at a position on the sealing sheet 30 corresponding to the lower side of the inlet of each passage 12, 13, and 14, so that the state of each passage 12, 13, and 14 can be checked from the bottom upward.
  • the transformation cartridge 1 may include an O-ring portion 40.
  • the O-ring portion 40 is composed of elastic annular O-rings 42, 43, and 44, and is located between the electric field forming portion 20 and the guide portion 50, which will be described later, to form the electric field forming portion 20 and the guide portion 50. Watertightness between the guide parts 50 can be maintained, and the needle inserted into the guide part 50 can be held to ensure stable injection of the solution.
  • the O-ring portion 40 may be formed of a material containing silicone, but the material is not limited thereto.
  • the O-ring portion 40 includes a cell O-ring 42 located between the cell electrode 22 and the cell guide 52, a material O-ring 43 located between the material electrode 23 and the material guide 53, and a resulting electrode. It may include a resulting O-ring (44) located between (24) and the resulting guide (54).
  • the transformation cartridge 1 may include a guide portion 50.
  • the guide portion 50 may serve as an inlet and outlet of the solution.
  • the guide unit 50 may include a plate-shaped guide body 51, a cell guide 52, a material guide 53, and a resultant guide 54 coupled to the guide body 51.
  • Each guide (52, 53, 54) may be formed in a pipe shape extending upward from the guide body (51).
  • Each guide (52, 53, 54) has a top and bottom penetration shape and is disposed at a position corresponding to each electrode (22, 23, 24) and the flow path (12, 13, 14), so that the needle moves through the guides (52, 53).
  • each guide (52, 53, and 54) if the liquid is discharged in a way such as by being inserted into the pump and connected to the pump, the discharged liquid can be delivered to each channel through each electrode.
  • a needle can be stably inserted into each guide (52, 53, and 54) to enable discharge of liquid at an appropriate location.
  • O-rings 42, 43, and 44 may be disposed on the lower side of each guide 52, 53, and 54, and the electric field forming portion 20 may be located on the lower side of the guide body 51.
  • the guide portion 50 may be formed of a material including polycarbonate, but the material is not limited thereto.
  • the transformation cartridge 1 may include an upper mount 61 and a lower mount 63.
  • the upper mount 61 may be located above the guide portion 50, and the lower mount 63 may be located below the sealing sheet 30.
  • the upper mount 61 and the lower mount 63 are fastened to each other using fasteners such as bolts, and the sealing sheet 30, body part 10, electric field forming part 20, and O-ring part 40 are located between them. ) and the guide portion 50 can be fixed in a stacked state. The components therebetween are pressed by the upper mount 61 and the lower mount 63, so that sealing can occur effectively.
  • a hole through which the guide can pass may be formed in the upper mount 61, and a hole may be formed in the lower mount 63 at a position corresponding to the hole of the sealing sheet 30.
  • the upper mount 61 and the lower mount 63 may be made of a material containing aluminum, and the aluminum may be anodized aluminum, but the material is not limited thereto.
  • the transformation cartridge 1 may include a body mount 62.
  • the main body mount 62 includes a hole in the center into which the main body 10 is inserted, allowing the main body 10 to be placed in an appropriate position and aligned with other components.
  • the body mount 62 is located between the upper mount 61 and the lower mount 63 and can be further coupled through a fastener.
  • the body mount 62 may be made of a material containing aluminum, and the aluminum may be anodized aluminum, but the material is not limited thereto.
  • Figure 4 is a conceptual diagram of the main body 10 of the transformation cartridge 1 according to the first embodiment of the present invention.
  • a cell flow path 12, a material flow path 13, and a resultant flow path 14 that meet each other are formed in the main body 10. These channels 12, 13, and 14 may be formed by penetrating the main body 11.
  • the main body 11 may be formed of a material containing glass, and the glass may be borosilicate glass, but the material is not limited thereto.
  • the inlet 120, 130 or outlet 140 of each flow path 12, 13, or 14 may be disposed on the upper surface of the main body 11.
  • the inlet 130 of the material flow path 13, the inlet 120 of the cell flow path 12, and the outlet 140 of the resultant flow path 14 move forward, which is the reference direction, and the inlet 130 of the material flow path 13 ), the inlet 120 of the cell flow path 12, and the outlet 140 of the resulting flow path 14.
  • a cell solution (SC) may be introduced into the inlet 120 of the cell flow path 12
  • SM material solution
  • the resulting flow path 14 may be injected into the cell solution (SC).
  • the resulting solution may be discharged through the outlet 140.
  • the cell passage 12 is a passage through which the cell solution (SC) flows.
  • Cell solution (SC) may be composed of a culture medium containing cells (C0) or an electrolyte.
  • the cells (C0) contained in the cell solution (SC) may be blood cells among somatic cells, and among them, they may be immune cells.
  • the immune cells can be used without limitation as long as they are cells that can induce immunity and cause the desired therapeutic effect, for example, natural killer cells (NK cells), T cells, natural killer T cells (NKT cells), and cytotoxic cells. It may be any one selected from the group consisting of cytokine induced killer cells (CIK), macrophages, and dendritic cells, but is not limited thereto.
  • the cell passage 12 may include a cell inflow passage 121 extending from the inlet 120 of the cell passage 12.
  • the cell inflow passage 121 may extend downward from the inlet 120 of the cell passage 12.
  • the material flow path 13 is a flow path through which the material solution SM is introduced.
  • the material solution (SM) may be water or a buffer containing the transformation material (M).
  • the transforming material (M) is intended to be introduced into the interior of the cell (C0), such as the cytoplasm or nucleus, to exert a function in the cell (C0), and is a material that can exert a function within the cell (C0).
  • C0 the transformation material
  • the transformation material (M) may be a nucleic acid, particularly mRNA.
  • the material flow path 13 may include a material inlet flow path 131 extending from the inlet 130 of the material flow path 13.
  • the material inflow passage 131 may extend downward from the inlet 130 of the material passage 13.
  • the material flow path 13 may include a mass transfer flow path 132 extending from the bottom of the material inlet flow path 131 toward the resulting flow path 14.
  • the mass transfer passage 132 may extend forward in a horizontal direction. Accordingly, the material flow path 13 may be bent at a location where the material inflow flow path 131 and the mass transfer flow path 132 meet, and the bending angle may be 90 degrees.
  • the cell flow path 12 and the material flow path 13 may meet in a state where the cell flow path 12 is located above the material flow path 13.
  • the lower end of the cell inflow passage 121 may be located above the front end of the mass transfer passage 132. Accordingly, at the point where the material flow path 13 and the cell flow path 12 meet, the cell solution SC may flow into the resulting flow path 14 while being positioned above the material solution SM.
  • the resulting flow path 14 is a flow path through which the resulting solution containing the transformed cells (C1) flows.
  • the resulting solution may be discharged through the outlet 140 of the resulting flow path 14.
  • the cell flow path 12 and the material flow path 13 are formed to converge into the resulting flow path 14. Therefore, the cell solution (SC) and the material solution (SM) are combined to form the resulting solution.
  • the resulting flow path 14 includes a mixing flow path 141 extending from a location connected to the cell flow path 12 and the material flow path 13.
  • the mixing passage 141 may extend horizontally forward from the above location.
  • the resulting flow path 14 may include a resulting discharge flow path 142 connecting the end of the mixing flow path 141 and the outlet 140 of the resulting flow path 14.
  • the resulting discharge passage 142 may extend upward from the front end of the mixing passage 141.
  • the flow of the cell solution (SC) is bent at the meeting point.
  • the cell solution (SC) can be bent 90 degrees. Since the direction in which the cell solution (SC) flows changes at the point where the flow paths meet, the cells (C0) settle downward due to the resulting centrifugal acceleration and can easily meet the substance (M).
  • the electric field forming unit 20 may use each electrode 22, 23, and 24 to form an electric field along the solution flowing in each passage 12, 13, and 14.
  • the electric field forming unit 20 may form an electric field in the material flow path 13 and the resultant flow path 14 using the material electrode 23 and the resultant electrode 24.
  • the electric field forming unit 20 may form an electric field in the cell flow path 12 and the resulting flow path 14 using the cell electrode 22 and the resulting electrode 24.
  • the electric field formed in the direction starting from the cell flow path 12 or the material flow path 13 and exiting through the resultant flow path 14 is indicated by a dotted line in the drawing.
  • the transformation material (M) of the material solution (SM) may enter the interior of the cell (C0) of the cell solution (SC) in the mixing passage 141.
  • the phospholipid bilayer of the cell (C0) is locally opened by the electric field applied to the mixing channel (141), so that the transformation material (M) can enter the cell (C0).
  • the thickness (T11 + T21) of the mixing passage 141 may be smaller than the thickness (T10) of the cell passage 12.
  • the thickness of the flow paths 12, 13, and 14 refers to the solution (SC) in the flow paths 12, 13, and 14 in a cross section of each flow path 12, 13, and 14 in a plane perpendicular to the left and right directions as shown in FIG. 4.
  • SM means the extent to which the boundaries of each flow path (12, 13, 14) are spread in a direction perpendicular to the flow direction.
  • the thickness of the flow path (12, 13, and 14) may be the inner diameter of the flow path (12, 13, and 14).
  • the thickness (T11+T21) of the mixing passage 141 may be smaller than the thickness (T20) of the material passage 13.
  • the thickness of the mixing passage 141 may be 6 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less.
  • the thickness (T11 + T21) of the mixing passage 141 is smaller than the thickness (T10) of the cell passage 12 converging to the resultant passage 14 or the thickness (T20) of the material passage 13, so that the mixing passage 141
  • the thickness T11 of the cell solution SC may be smaller than the thickness T10 of the cell channel 12, which is the thickness occupied by the cell solution SC within the cell channel 12.
  • the thickness T21 of the material solution SM within the mixing channel 141 may be smaller than the thickness T20 of the material solution SM 13, which is the thickness occupied by the material solution SM within the mixing channel 13.
  • the thickness (T11) of the cell solution (SC) in the mixing passage 141 is smaller than the diameter of the cell (C0)
  • a portion of the cell (C0) is exposed to the material solution (SM) and the transformation material (You may be in a situation where you can meet M).
  • the transformation material (M) can enter the cell (C0) to form a transformed cell (C1). Since a portion of the cells (C0) are exposed to the material solution (SM), transformation can occur even if the material solution (SM) and the cell solution (SC) are not mixed.
  • the thickness of the cell passage 12 divided by the sum of the thickness of the cell passage 12 and the thickness of the material passage 13 is multiplied by the thickness of the mixing passage 141, which is the cell It may be smaller than the diameter of the cell (C0) flowing in the flow path (12).
  • the thickness T11 of the cell solution (SC) flowing in the mixing passage 141 may be determined by controlling the flow rate at which each solution is injected.
  • the processor 201 determines that the cell solution (SC), which is a solution flowing into the mixing passage 141 through the cell passage 12, has a thickness (T11) within the mixing passage 141 such that the cells included in the cell solution (SC) are
  • the pump unit 202 can be controlled to be smaller than the diameter of . In a situation where other conditions are the same, if the pressure or flow rate at which the pump unit 202 pumps the cell solution (SC) increases, the thickness (T11) of the cell solution (SC) in the mixing passage 141 may increase. .
  • the above-described cell passage 12 may meet each other while being located on the upper side of the material passage 13. Due to this flow path arrangement, the cell solution (SC) will be located on the upper side of the material solution (SM) within the mixing flow path 141, so the cells (C0) carried by the cell solution (SC) will be moved to the lower side under the influence of gravity. This is because it moves toward the material solution (SM) and can be better exposed to the material solution (SM).
  • transformation can occur simply by injecting the cells or the transformation material (M) into the main body 10 and applying an electric field without separately performing pretreatment on the cells or the transformation material (M).
  • transformed cells (C1) can be obtained. Therefore, pretreatment processes such as cell washing can be omitted, and cell and material loss during the process can be significantly reduced.
  • a separate special buffer does not need to be used, an economical process configuration is possible.
  • the process can be configured simply by making the solution injectable in a sealed and controlled environment, thereby maintaining a hygienic working environment, which is advantageous from various regulations. Since simply injecting a culture medium and material solution containing cells and applying an electric field are all required for transformation, it is easy to automate the process.
  • Figure 5 is a conceptual diagram of the main body 10b of the transformation cartridge according to the second embodiment of the present invention.
  • the transformation cartridge according to the second embodiment of the present invention is the same as the transformation cartridge 1 according to the first embodiment except that it further has a second material flow path 1302b, so the differences will be described in more detail. As for the remaining components, the description of the transformation cartridge 1 according to the first embodiment can be applied as is.
  • a portion for a second material flow path 1302b is formed in the electric field forming portion, guide, O-ring portion, etc. of the transformation cartridge according to the second embodiment.
  • the material flow path 13b formed in the main body 11b includes a first material flow path 1301b through which a first material solution SM1 containing the first transformation material M1 flows, and a second transformation material. It includes a second material flow path 1302b through which a second material solution SM2 containing (M2) flows.
  • the first transformation material (M1) and the second transformation material (M2) may be different from each other.
  • the first material flow path 1301b may be the same as the material flow path 13 according to the first embodiment. Therefore, the first material flow path 1301b is considered to be the same as the material flow path 13 in the first embodiment, and the second material flow path 1302b will be described further.
  • the first material passage 1301b may meet the cell passage 12b, and on the other side of the cell passage 12b, the second material passage 1302b may meet the cell passage 12.
  • the first material passage 1301b may meet the cell passage 12b at the lower side of the cell passage 12, and the second material passage 1302b may meet the cell passage 12b at the upper side of the cell passage 12b. . Therefore, the first material solution SM1 can flow to the upper side of the cell solution SC and the second material solution SM2 can flow to the lower side through the same effect as described in the first embodiment in the resulting flow path 14b,
  • Cells may be exposed to a first material solution (SM1) and a second material solution (SM2). Cells exposed to each substance solution (SM) are opened by an electric field, allowing the first transformation material (M1) and the second transformation material (M2) to enter the cell and cause transformation.
  • a plurality of different types of transformation materials (M1, M2) can be simultaneously injected into cells using one transformation cartridge to form transformed cells (C2).
  • the transformation cartridge according to the third embodiment of the present invention is the same as the transformation cartridge 1 according to the first embodiment except for the shape of the flow paths 12c, 13c, and 14c formed in the main body 10c. , the parts with differences will be further explained, and the description of the transformation cartridge 1 according to the first embodiment can be applied as is to the remaining components.
  • the appearance of the main body 11c according to the third embodiment may be the same as that of the main body 11 according to the first embodiment.
  • the material flow path 13c according to the third embodiment may have the shape of an arc convex downward.
  • the material flow path 13c and the resulting flow path 14c may have the shape of a continuous circular arc that is convex downward. That is, the material flow path 13c and the resultant flow path 14c may be connected by drawing a continuous circular arc convex downward.
  • the cell flow path 12c is also shown to have a curved profile, such as having a circular arc shape, but the cell flow path 12c may also have a shape extending downward. When the cell flow path 12c has an arc shape, the radius of curvature of the cell flow path 12c may be smaller than the radius of curvature of the material flow path 13c.
  • the material flow path 13c has an arc shape, centrifugal acceleration is applied to the transformation material introduced into the material flow path 13c, making it easier for the transformation material to meet cells.
  • the arc-shaped flow path as in the third embodiment can also be applied to the first material flow path 1301b and the second material flow path 1302b of the second embodiment.
  • Figure 7 is a perspective view of the transformation cartridge (1d) according to the fourth embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is an exploded perspective view of the transformation cartridge (1d) according to the fourth embodiment of the present invention.
  • the transformation cartridge (1d) according to the fourth embodiment of the present invention has the same configuration as the main body portion (10), O-ring portion (40), and sealing sheet (30) of the transformation cartridge (1) according to the first embodiment. Since there are some differences in shape between the elements and the remaining components, the parts with differences will be further explained, and the description of the transformation cartridge 1 according to the first embodiment will be applied as is for the corresponding components. You can.
  • the guide portion 50d of the transformation cartridge 1d can receive and mix a plurality of solutions and deliver them to the material flow path of the main body portion 10d.
  • the guide portion 50d may include a plurality of material guides 53d. Different material solutions are injected into each material guide (53d), and while the different material solutions are delivered to the entrance of the material flow path through the guide portion (50d), they are integrated into one flow path and are transferred to each other during the flow process. can be mixed
  • the guide unit 50d may discharge the resulting solution into a plurality of guides.
  • the result guide 54d may include a main result guide 541d and an auxiliary result guide 542d.
  • the main result guide 541d may have a pipe shape that extends upward and is bent to the left.
  • the auxiliary result guide 542d may have a pipe shape extending upward.
  • the resultant solution discharged from the resultant flow path may be divided into a main resultant guide (541d) and an auxiliary resultant guide (542d) in the guide portion (50d) and discharged separately.
  • the guide portion 50d may include a power application guide 55d.
  • a plurality of power application guides 55d may be formed.
  • the power application guide 55d allows each terminal (25d, 26d, 27d) of the electric field forming part 20d located on the lower side of the guide body 51d to be exposed to the outside of the guide part 50d, and each terminal The connection port for connection to (25d, 26d, 27d) can be stably contacted and fixed to each terminal (25d, 26d, 27d).
  • the power application guide 55d may also be formed in a pipe shape extending upward from the guide body 51d.
  • the electric field forming portion 2d0 is electrically connected to a material terminal 26d electrically connected to the material electrode 23d, a resultant terminal 27d electrically connected to the resultant electrode 24d, and a cell electrode 22d. It may include a cell terminal (25d). Each terminal (25d, 26d, 27d) may be disposed at a position corresponding to the power application guide (55d) on the electric field generating body (21d).
  • the electric field forming part 20d may be coupled to the guide part 50d through a fastener.
  • the main body mount 62d includes a hole in the center into which the main body 10d is inserted, allowing the main body 10d to be positioned at an appropriate position and aligned with other components. However, a step is formed in the hole of the main body mount 62d, so that the main body part 10d and the sealing sheet 30d can be inserted but not separated downward.
  • the body mount 62d may be coupled to the electric field forming portion 20d through a fastener.
  • Figure 9 is a diagram showing a transformation system 100 including a transformation cartridge 1 and a transformation device 2 according to the first embodiment of the present invention.
  • Figure 10 is a diagram showing a transformation system (100d) including a transformation cartridge (1d) and a transformation device (2d) according to a fourth embodiment of the present invention.
  • transformation systems (100, 100d) include transformation cartridges (1, 1d) and transformation devices (2, 2d).
  • the transformation system (100, 100d) may include a syringe (3). Since there is a difference between the first and fourth embodiments only in the number of syringes 3, the number of pumps, the number of guides, etc., the transformation method for cells of the present invention will be described with reference to FIG. 9 as a representative example. Explain.
  • Transformation may occur by injecting each solution into the transformation cartridge 1 by the transformation device 2.
  • a syringe (3) containing a cell solution and a substance solution, respectively, can be inserted into the guide portion (50) of the transformation cartridge (1).
  • the transformation cartridge (1) into which the syringe (3) is inserted can be introduced into the interior of the transformation device (2).
  • the transformation device 2 includes a pump unit 202 and a processor 201.
  • the transformation device 2 may include an input unit 204 and a power application unit 203.
  • the pump unit 202 is provided to pump the cell solution (SC) and the material solution (SM) into the cell flow path 12 and the material flow path 13, respectively. Therefore, the pump unit 202 may include a plurality of pumps for pumping each solution.
  • the pumps of the pump unit can deliver the solutions from the reservoir containing each solution to each flow path of the main body 10, which will be described later, through each pipe.
  • Each pump may be a syringe pump that contacts the syringe (3) and can push the piston of the syringe (3) at a desired speed. Therefore, when the transformation cartridge (1) with the syringe (3) inserted into the transformation device (2) enters, the pump approaches and contacts the piston of the syringe (3) and starts operation, pushing the syringe (3). Fluid can be pumped by giving.
  • the pump is not limited to a syringe pump, and the pump may be configured in such a way that piping is directly coupled to each passage of the cartridge and pumps fluid.
  • the pump unit 202 may contact the piston with a pressure member to push the piston. At this time, the pump unit 202 can measure the distance moved by the pressurizing member and allow the processor 201 to calculate the volume of the solution stored in the syringe 3.
  • the processor 201 is electrically connected to the pump unit 202 and can control at least one of the pressure or flow rate at which the pump unit 202 pumps each solution.
  • the processor 201 is a component that includes elements capable of logical operations that perform control commands, and may include a CPU (Central Processing Unit), etc.
  • the processor 201 is connected to various components of the transformation device 2 according to an embodiment of the present invention, can transmit signals according to control commands to each component, and is connected to various sensors or acquisition units. The information obtained can be transmitted in the form of a signal. Since the processor 201 can be electrically connected to each component, it can be connected with a conductive wire or can communicate with each other through a communication module capable of wireless communication.
  • the transformation device 2 further includes a storage medium, so that control commands performed by the processor can be stored and utilized in the storage medium.
  • the storage medium may be a device such as a hard disk drive (HDD), solid state drive (SSD), server, volatile media, or non-volatile media, but the type is not limited thereto.
  • data needed by the processor 201 to perform tasks may be further stored in the storage medium.
  • the transformation device 2 can receive necessary information through the input unit 204.
  • the input unit 204 can receive information using means such as buttons, switches, and touch screens, and can also receive information by scanning symbols, including barcodes, QR codes, and RFID scanners.
  • Information about the transformation cartridge 1 entering the transformation device 2 can be input through the input unit 204.
  • Information input to the input unit 204 is transmitted to the processor 201.
  • the processor 201 may determine the flow rate of each solution delivered by the pump unit to the transformation cartridge 1 using the input information and preset and stored information.
  • the processor 201 may determine the flow rate of each solution to a value that allows transformation to occur when the cells (C0) and the material (M) meet in the mixing passage 141.
  • the processor 201 knows which material solution (SM) and which cell solution (SC) will be used, the optimal flow rate ratio corresponding to the corresponding material solution (SM) and cell solution (SC) can be retrieved from the stored data.
  • Processor 201 may retrieve the optimal exposure time for transformation treatment from the stored data as well.
  • the processor 201 combines the obtained flow rate ratio and exposure time with the input information of the transformation cartridge 1 (channel length of the cartridge, flow path shape, etc.) to determine the flow rate of the cell solution (SC) and the flow rate of the material solution (SM). It can be set, and the pump unit 202 can operate according to the determined flow rate to push the syringe (3).
  • the flow rate ratio determines what proportion of the total thickness of the mixing passage 141 the material solution (SM) and the cell solution (SC) will occupy within the mixing passage 141.
  • the optimal exposure time means sufficient time for cells (C0) and substances (M) to pass through the mixing passage 141 and for transformation to occur.
  • the flow rate ratio may be a value that allows transformation to occur when the cells (C0) and the material (M) meet in the mixing passage 141.
  • the flow rate ratio may be a value such that the thickness (T11) of the solution flowing into the mixing passage (141) through the cell passage (11) within the mixing passage (141) is 3 times or less than the diameter of the cell (C0), and is preferable. In other words, it may be a value that is smaller than the diameter of the cell (C0).
  • the pump unit 202 operates according to the determined flow rate ratio and flow rate value to inject the cell solution (SC) into the cell passage 12 and the material solution (SM) into the material passage 13.
  • SC cell solution
  • SM material solution
  • the power application unit 203 is electrically connected to the processor 201 and connects the terminal 26 to apply power to the electrodes 22, 23, and 24 included in the electric field forming unit 20 of the transformation cartridge 1. , 27).
  • the connection arm of the power application unit 203 approaches and contacts the terminals 26 and 27, thereby making electrical connection.
  • the power application unit 203 generates an electric field. Power may be applied to the forming part 20. The solution is supplied and an electric field is formed, so that transformation occurs in the mixing passage 141, and the solution containing the transformed cells (C1) can be discharged through the outlet 140 of the resultant passage 14.
  • Figure 11 is a diagram expressing sedimentation of cells (C0) occurring in the transformation cartridge 1 according to the first embodiment of the present invention.
  • the flow rate of the solution that the transformation device 2 can provide when the transformation cartridge 1 according to the first embodiment of the present invention is provided to the transformation device 2 will be explained.
  • the flow of the cell solution (SC) flowing in the cell passage 12 may be bent at a right angle, and the cell solution (SC) may be bent at a right angle.
  • the flow can be approximated as circular motion around a corner.
  • S S the distance at which the cell (C0) sinks downward due to the centrifugal force of the circular motion described above in the mixing passage 141, can be expressed as follows using an equation related to centrifugation.
  • S S may be 1 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less.
  • V S is the speed of the cell (C0) facing downward as shown
  • t S is the time required to pass the corner when the corner is approximated as a quadrant
  • r is the radius of the approximate quadrant
  • d is the cell (C0 )
  • ⁇ is the viscosity of the cell solution (SC)
  • ⁇ is the density difference between the cell (C0) and the cell solution (SC)
  • ⁇ is the angular velocity of the cell (C0)
  • V c is the cell (C0) This is the horizontal velocity within the mixing passage 141.
  • the transformation device (2) transfers the cell solution (SC) and the material solution (SM) to the transformation cartridge (1) at a flow rate ratio that makes the thickness of the cell solution (SC) smaller in the mixing passage 141 than the above-mentioned S S. can be provided to.
  • Each solution is provided at this flow rate ratio, so that the cells (C0) meet the substance (M) in the mixing passage 141 and can be transformed.
  • Figure 12 is a diagram expressing cell sedimentation that occurs in the transformation cartridge according to the third embodiment of the present invention.
  • the flow rate of the solution that the transformation device 2 can provide when the transformation cartridge according to the third embodiment of the present invention is provided to the transformation device 2 is explained. Since the mixing passage, which is part of the resulting passage 14c, may have the shape of an arc as shown, the flow of the cell solution may approximate circular motion. At this time, S S , the distance at which cells sink downward due to the centrifugal force of the circular motion described above in the mixing passage, can be expressed as follows. S S may be 2 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • L E is the length of the mixing passage
  • R is the radius of curvature of the mixing passage
  • the transformation device 2 can provide the cell solution and the material solution to the transformation cartridge at a flow rate ratio that makes the thickness of the cell solution within the mixing passage smaller than that of S S described above. When each solution is provided at this flow rate ratio, cells can meet the substances in the mixing flow path and undergo transformation.
  • a material solution containing the same eGFP mRNA used in the production process of the transformants of the experimental group was used instead of R-buffer, a buffer solution exclusively for the Neon TM Transfection System.
  • the same cell culture medium used in the production process of the transformants of the experimental group was mixed with a cell solution containing NK-92 cells, and the remaining details were obtained according to the manufacturer's instructions, and this was used as a positive control. It was done as follows. And, as a negative control, a cell solution containing NK-92 cells that did not introduce mRNA was used.
  • Flow cytometric analysis was performed on each of the experimental groups, positive and negative controls obtained as above, and based on the signal value of the top 1% of the negative control, cells with stronger fluorescence were classified as successful expression cells, and expression efficiency (eTX) was calculated. was analyzed, and cell survival rate was measured using Texas Red fluorescence staining technique.
  • the negative control group and the experimental group produced using the transformation cartridge of the present invention showed a high cell survival rate of about 95%, and the positive control group produced with the Neon TM Transfection System using cells in the culture medium without pretreatment. It was also confirmed to have a high cell survival rate of approximately 90%.
  • the expression efficiency (eTX) was 0.78%, and it was confirmed that there were almost no transformants expressing GFP fluorescence (left graph of FIG. 13), whereas the trait of the present invention
  • the expression efficiency (eTX) was 98.3%, confirming that almost all cells were actually transformants expressing GFP fluorescence (right graph of FIG. 13).
  • mRNA is easily destroyed in cell culture media containing various components necessary for cell growth, in existing mixed delivery technologies such as the Neon TM Transfection System, cells to be transformed must be washed before being transferred to a dedicated buffer (Neon TM Transfection). In the case of System, it must be transferred to R-buffer and mixed with mRNA in that state.
  • NK-92 cells were used as they were contained in the cell culture medium without using R-buffer, a buffer solution exclusively for the Neon TM Transfection System, so that eGFP mRNA and NK-92 cells It is believed that the transformant itself, in which eGFP mRNA was introduced into NK-92 cells, was not manufactured because all eGFP mRNA was destroyed in the mixture state. From the above results, in the case of existing mixed delivery technologies such as the Neon TM Transfection System, it is virtually impossible to directly deliver mRNA to cells in the culture medium without pretreatment such as washing the cells or using a dedicated buffer solution. It can be seen that
  • NK-92 cells are used as they are contained in the cell culture medium, the cell solution and the material solution containing eGFP mRNA are supplied through separate channels. Therefore, eGFP mRNA can be delivered to NK-92 cells without being destroyed by components in the cell culture medium, and as a result, eGFP mRNA can be introduced into almost all NK-92 cells and transformants can be produced with high efficiency. From the above results, it can be seen that mRNA can be delivered directly to cells on the culture medium by using the transformation cartridge of the present invention.
  • the flow of fluid within the mixing flow path is a laminar flow and has a parabolic velocity profile in the form of a quadratic function depending on the depth.
  • the velocity is maximum at the center of the flow path, and the velocity is 0 at the top and bottom surfaces. . Therefore, depending on the flow rate ratio of the cell solution and the material solution, the velocity profile of each flow may change, affecting the transfer efficiency of the material.
  • the height of the flow becomes smaller as the flow rate decreases due to the fixed height of the mixed flow path. Therefore, in the case of cell flow, the fluid thickness of the cell flow can be adjusted according to the cell size by controlling the flow rate. You can. The basic tendency is that the smaller the thickness of the cellular fluid flow, the more effectively it interacts with the material flow into the cells, resulting in higher efficiencies.
  • the flow rate ratio (material flow rate/cell flow rate) was varied to 0.5, 1, and 2, and the delivery and expression efficiency of eGFP mRNA was measured.
  • 1 mL of a cell solution containing NK-92 cells (ATCC CAT# CRL-2407) at a concentration of 4x10 7 cells/mL in cell culture medium was added to the cell passage, and A material solution containing eGFP mRNA (RiboPro, CAT# RB-079) at a concentration of 200 ⁇ g/mL was injected into each material channel, and then an electric field of 1200 V was applied between the material channel inlet and the resulting discharge channel, while the cells
  • the eGFP mRNA is introduced into NK-92 cells as the solution and substance solution pass through a mixing channel (depth 30 ⁇ m, width 3mm, length 24mm) with an electric field applied at flow rate ratios of 2, 1, and 0.5 (substance flow rate/cell flow rate).
  • the mass transfer process within the mixing passage of the transformation cartridge of the present invention allows the cells in the cell solution to effectively move toward and contact the substance solution, thereby enabling mass transfer even if mixing between the two fluids does not occur effectively. You can see that it can happen. That is, in the case of fluid flow in the laminar flow region, there is no fluid mixing effect due to the inertial force that occurs in the turbulent flow region, so two or more separately introduced fluid flows cannot be effectively mixed within a short time, but the transformation cartridge of the present invention As in, even under laminar flow conditions where the cell solution and the material solution cannot be directly mixed, effective intracellular material transfer and transformation can be achieved by setting the cells in the cell solution to move directly toward the material solution and immediately contact the material solution.
  • the material when transformation is performed using the transformation cartridge of the present invention, the material is directly applied to cells on the cell culture medium without pretreatment such as cell washing or use of a dedicated buffer solution. Because it can be delivered, it is expected that substances can be delivered with high efficiency to primary cells collected from the human body.
  • hPBMC human peripheral blood monoclonal cells
  • the cell solution and the material solution pass through a mixing channel (depth 30 ⁇ m, width 3mm, length 24mm) to which the electric field is applied at a flow rate of 2:1, thereby introducing the eGFP mRNA into hPBMC. Transformants were obtained, and these were used as the experimental group.
  • the expression efficiency of eGFP (eTX) and cell survival rate were measured in the same manner as in Example 1.
  • the transformants of the experimental group which were hPBMCs into which eGFP mRNA was introduced using the transfection cartridge of the present invention, showed an equivalent level of cell survival.
  • the expression efficiency reached a level of up to 98% or more.
  • the material when transformation is performed using the transformation cartridge of the present invention, the material can be directly delivered to cells on the cell culture medium without pretreatment such as cell washing or use of a dedicated buffer solution, It is possible to effectively transfer intracellular substances without causing cell damage that leads to cell death, and this advantage makes it possible to deliver substances with high efficiency even to primary cells collected from the human body. .
  • the maximum expression efficiency can be shown after about a week, so when applied as a cell therapy, it can be seen that the drug effect can last for more than a week. This is an excellent effect that could not be achieved with existing mixed delivery technologies such as the Neon TM Transfection System.
  • the transformation cartridge of the present invention was used in the process of using human harvested cells, where the number of cells that can be used is inevitably extremely limited. It is clear that transformation techniques can be very useful.
  • CAR CAR-NK cells were produced by introducing chimeric antigen receptor (mRNA).
  • NK cells are one of the most difficult cells to transform using various transformation technologies currently being applied to cell manipulation, so there is great difficulty in producing CAR-NK.
  • the proportion of NK cells among blood cells is less than 5%, which means that not only is the absolute amount that can be obtained by collecting from the human body low, but the transformation efficiency due to viral infection is known to be less than 1%. Therefore, when producing transformants from human harvested NK cells using existing mixed delivery technologies such as the Neon TM Transfection System, it is known that the production process is significantly poor due to cell loss and cell damage that occurs during the cell washing process. .
  • a cell solution containing NK-92 cells ATCC CAT# CRL-2407
  • a concentration of 1.0x10 7 cells/mL in cell culture medium was added to the cell channel.
  • a material solution containing 500 ⁇ g/mL concentration of CD19 CAR mRNA (RiboPro, CAT# RB-073-3) was injected into each material channel, and then an electric field of 1200V was applied between the material channel inlet and the resulting discharge channel.
  • the cell solution and the material solution pass through a mixing channel (depth 30 ⁇ m, width 3mm, length 24mm) to which an electric field is applied at a flow rate of 2:1, thereby introducing the CD19 CAR mRNA into NK-92 cells.
  • a transformant was obtained, which was designated NKL-CD19-500.
  • the expression efficiency (eTX) of the CD19 CAR was measured using an anti-FMC63-PE antibody, and the transformant and the CD19 overexpressing cancer cell line Nalm6 (ATCC CAT# CRL-3273) were measured.
  • the cytotoxicity of Nalm6 cancer cells was measured while mixing and culturing at a ratio of 2:1 (CAR-NK cells: Nalm6 cells).
  • the material when transformation is performed using the transformation cartridge of the present invention, the material can be directly delivered to cells on the cell culture medium without pretreatment such as cell washing or use of a dedicated buffer solution, It can be seen that efficient production of transformants using human harvested NK cells, which was virtually impossible with existing mixed delivery technologies such as the Neon TM Transfection System, is possible. This is an excellent effect that could not be achieved with existing mixed delivery technologies such as the Neon TM Transfection System, and through this experimental example, there is great potential for the development and production of CAR-NK anti-cancer immune cell therapy, which is expected to provide technological innovation in the treatment of solid tumors. It was confirmed that the transformation technology using the transformation cartridge of the present invention can be very useful in the field of anti-cancer immune cell therapy based on human harvested NK cells, with high production performance that had not been reported in existing NK cell transformation technologies. Able to know.

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Abstract

본 발명에 따른 형질전환 카트리지는, 서로 만나는 세포 유로, 물질 유로 및 결과물 유로가 형성되는 본체부; 및 상기 결과물 유로에 전기장을 생성하도록 상기 본체부에 결합되는 전극을 포함하는 전기장형성부를 포함하고, 상기 세포 유로와 상기 물질 유로는, 상기 결과물 유로로 수렴하는 형태로 형성되고, 상기 결과물 유로는, 상기 세포 유로 및 상기 물질 유로에 연결되는 개소로부터 연장되는 혼합유로를 포함하고, 상기 혼합유로의 두께는, 상기 세포 유로의 두께보다 작다.

Description

형질전환 카트리지, 형질전환 장치, 이를 포함하는 형질전환 시스템 및 이를 이용하는 형질전환 방법
본 발명은 형질전환 카트리지, 형질전환 장치, 이를 포함하는 형질전환 시스템 및 이를 이용하는 형질전환 방법에 관한 것이다.
형질전환을 위한 유전자 전달 기술로서, 바이러스를 수송체로 사용하는 바이러스성 방법(viral vector-based transfer method)과, 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(nonviral delivery technique)이 널리 알려져 있다.
바이러스는 그 자체의 생활 메커니즘상 다른 세포의 핵에 자신의 DNA를 넣은 상태로 기생하여 살기 때문에 아주 효율적인 DNA전달 체계로 볼 수 있다. 즉, 바이러스를 이용한 DNA전달 체계에서는 복제가 불가능한 바이러스 내부에 전달하고자 하는 유전자를 넣어서 이를 이용한다. 이러한 기술은 형질전환을 시키는데 상당히 효율적인 것이 장점이다. 그러나 이런 기술은 여러 가지 단점이 있는데, 본질적인 측면에서 보면 비활성화 바이러스를 사용하였다고는 하지만 RCV(Recombination Competent Virus)의 출현이 가능하다는 문제 및 면역 반응을 일으켜서 여러 번 사용이 힘들다는 문제, 고유 특성에 의해 전달할 수 있는 물질이 한정된다는 문제, 세포에 일정한 양의 물질이 주입되기 어렵다는 문제 등이 있다.
바이럴벡터를 사용하지 않기 위해, 세포의 주변에 물질이 위치하는 상태에서 전기충격을 주어 인지질이중막을 열어주는 방식(전기천공, electroporation)이 사용될 수 있다. 다만 전달하고자 하는 물질의 성질 때문에 일반적인 전기천공시에는 배양액이 아닌 특수한 버퍼(예 : RNase-free buffer)에 세포가 놓여야 되는 상황이 발생하는데, 이를 위해 원심분리 등의 방법으로 세포로부터 배양액을 닦아내는(cell washing) 전처리가 필요하다.
이러한 일반적인 전기천공 방식을 사용할 경우, 세포 생존률이 크게 떨어질 수 있으며, 전처리 과정에서 많은 양의 세포 손실이 발생한다는 문제가 있다. 또한 사용되는 특수한 버퍼가 매우 비싸 경제적이지 않다는 문제가 있다. 그리고 전처리 등의 작업이 폐쇄된 환경에서 이루어지기 어려워, 자동화가 어렵고 작업환경을 위생적으로 통제하기가 어렵다는 문제가 있다.
본 발명은 이와 같은 문제들을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 세포 용액과 물질 용액의 투입만으로도 전기천공에 의해 형질전환이 일어날 수 있도록 하는 형질전환 카트리지, 형질전환 장치, 이를 포함하는 형질전환 시스템 및 이를 이용하는 형질전환 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 형질전환 카트리지는, 서로 만나는 세포 유로, 물질 유로 및 결과물 유로가 형성되는 본체부; 및 상기 결과물 유로에 전기장을 생성하도록 상기 본체부에 결합되는 전극을 포함하는 전기장형성부를 포함하고, 상기 세포 유로와 상기 물질 유로는, 상기 결과물 유로로 수렴하는 형태로 형성되고, 상기 결과물 유로는, 상기 세포 유로 및 상기 물질 유로에 연결되는 개소로부터 연장되는 혼합유로를 포함하고, 상기 혼합유로의 두께는, 상기 세포 유로의 두께보다 작다.
본 발명의 실시예에 따른 형질전환 카트리지는, 서로 만나는 세포 유로, 물질 유로 및 결과물 유로가 형성되는 본체부; 및 상기 본체부에 결합되고 상기 물질 유로의 입구 및 상기 결과물 유로의 출구에 배치되는 전극을 포함하는 전기장형성부를 포함하고, 상기 세포 유로와 상기 물질 유로는, 상기 결과물 유로로 수렴하는 형태로 형성되고, 상기 결과물 유로는, 상기 세포 유로 및 상기 물질 유로에 연결되는 개소로부터 연장되는 혼합유로를 포함하고, 상기 세포 유로의 두께와 상기 물질 유로의 두께를 합한 값으로 상기 세포 유로의 두께를 나눈 값에 상기 혼합유로의 두께를 곱한 값은, 상기 세포 유로에서 유동하는 세포의 직경보다 작다.
본 발명의 실시예에 따른 형질전환 장치는, 형질전환 카트리지의 세포 유로 및 물질 유로에 각각 세포 용액과 물질 용액을 압송하도록 마련되는 펌프부; 상기 형질전환 카트리지의 전극에 전력을 인가하기 위해 상기 형질전환 카트리지의 단자에 연결되도록 마련되는 전력인가부; 및 상기 전력인가부 및 상기 펌프부와 전기적으로 연결되는 프로세서를 포함하고, 상기 프로세서는: 상기 형질전환 카트리지의 정보, 기 설정된 유량비 및 기 설정된 노출 시간에 기초하여 상기 펌프부를 제어한다.
본 발명의 실시예에 따른 형질전환 시스템은, 서로 만나는 세포 유로, 물질 유로 및 결과물 유로가 형성되는 본체부; 상기 본체부에 결합되고 상기 물질 유로의 입구 및 상기 결과물 유로의 출구에 배치되는 전극을 포함하는 전기장형성부; 상기 세포 유로 및 상기 물질 유로에 각각 세포 용액과 물질 용액을 압송하도록 마련되는 펌프부; 및 상기 펌프부와 전기적으로 연결되는 프로세서를 포함하고, 상기 세포 유로와 상기 물질 유로는, 상기 결과물 유로로 수렴하는 형태로 형성되고, 상기 결과물 유로는, 상기 세포 유로 및 상기 물질 유로에 연결되는 개소로부터 연장되는 혼합유로를 포함하고, 상기 프로세서는: 상기 세포 유로를 통해 상기 혼합유로로 유입되는 용액이 상기 혼합유로 내에서 가지는 두께가 상기 세포 용액에 포함되는 세포의 직경보다 작도록 상기 펌프부를 제어한다.
본 발명의 실시예에 따른 형질전환 방법은, 서로 만나는 세포 유로, 물질 유로 및 혼합유로가 형성된 카트리지를 준비하는 단계; 상기 세포 유로에 세포를 포함하는 세포 용액을 주입하는 단계; 및 상기 물질 유로에 상기 세포의 형질전환을 위한 물질을 포함하는 물질 용액을 주입하는 단계를 포함하고, 주입되는 상기 세포 용액의 유량과 상기 물질 용액의 유량비는, 상기 혼합유로에서 상기 세포와 상기 물질이 만나 형질전환이 일어나도록 하는 값이다.
이에 따라, 세포 용액과 물질 용액의 투입만으로도 전기천공에 의해 형질전환이 일어날 수 있다.
물질 용액과 세포 용액이 섞이지 않더라도 형질전환이 일어날 수 있다.
세포나 형질전환 물질에 대해 셀 워싱 등의 전처리 과정이 생략될 수 있어 해당 과정에서의 세포 생존률이 높아지고, 세포 및 물질 손실이 대폭 줄어들 수 있다.
별도의 특수한 버퍼가 사용되지 않아도 되므로 경제적인 형질전환 공정 구성이 가능하다.
전처리가 필요하지 않아 밀폐되고 통제된 환경에 용액을 주입할 수 있도록 만들어주는 것 만으로도 형질전환 공정을 구성할 수 있기 때문에, 위생적인 작업환경을 유지할 수 있어 각종 규제로부터 유리하다.
단순히 세포를 포함하는 배양액과 물질 용액을 주입하고 전기장을 걸어주는 것이 형질전환을 위해 필요한 과정의 전부이므로, 공정의 자동화가 용이하게 이루어질 수 있다.
도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 사시도이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 분해사시도이다.
도 3은 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 평면도이다.
도 4는 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 본체부의 개념도이다.
도 5는 본 발명의 제2 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 본체부의 개념도이다.
도 6은 본 발명의 제3 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 본체부의 개념도이다.
도 7은 본 발명의 제4 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 사시도이다.
도 8은 본 발명의 제4 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 분해사시도이다.
도 9는 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지와 형질전환 장치를 포함하는 형질전환 시스템을 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 제4 실시예에 따른 형질전환 카트리지와 형질전환 장치를 포함하는 형질전환 시스템을 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지에서 일어나는 세포의 침강을 표현한 도면이다.
도 12는 본 발명의 제3 실시예에 따른 형질전환 카트리지에서 일어나는 세포의 침강을 표현한 도면이다.
도 13은 NeonTM Transfection System(ThermoFisher社)을 이용한 mRNA의 형질전환 효율과, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용한 mRNA의 형질전환 효율을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 세포 용액과 물질 용액을 분리 공급하여 형질전환을 수행하는 과정에서, 혼합 유로 내에서 상기 두 용액 간의 유량 비율이 mRNA 등과 같은 물질의 전달 효율에 미치는 영향을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하는 경우에, 인체에서 채취한 세포(primary cells)에도 높은 효율로 물질을 전달할 수 있는지 여부를 3회에 걸쳐 반복하여 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 제작한 CAR-NK 세포의 제작 효율(형질도입 효율)(A)과 암세포에 대한 살상정도(B)를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
또한, 본 발명의 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 어떤 구성 요소가 다른 구성요소에 "연결", "결합" 또는 "접속"된다고 기재된 경우, 그 구성 요소는 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되거나 접속될 수 있지만, 각 구성 요소 사이에 또 다른 구성 요소가 "연결", "결합" 또는 "접속"될 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
제1 실시예
도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)의 사시도이다. 도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)의 분해사시도이다. 도 3은 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)의 평면도이다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)는, 본체부(10)와 전기장형성부(20)를 포함한다. 본 발명의 명세서에서 상(UP)하(DOWN), 좌(LEFT)우(RIGHT), 전(FRONT)후(BACK)방향은 설명의 편의를 위해 사용되는 서로 직교하는 방향이며, 형질전환 카트리지(1)의 배치 상태에 따라서 변화할 수 있는 상대적인 방향이다.
전기장형성부(20)는 본체부(10)에 전기장을 형성하는 구성요소이다. 전기장형성부(20)는 본체부(10)에 결합되고, 결과물 유로(14)에 전기장을 생성하도록 물질 유로(13)의 입구(130) 및 결과물 유로(14)의 출구(140)에 배치되는 전극을 포함한다. 전기장형성부(20)는 인쇄회로기판일 수 있으나, 그 종류가 이에 제한되지는 않는다.
전기장형성부(20)는 판형의 전기장형성 몸체(21)를 포함할 수 있다. 전기장형성 몸체(21)는 다층의 에폭시 수지로 구성될 수 있으나 그 재질이 이에 제한되지 않는다. 전기장형성 몸체(21)에는 전극이 형성될 수 있고, 각 전극은 환형으로 형성되어 본체부(10)의 각 유로에 대응되도록 전기장형성부(20)에 형성된 각각의 구멍을 둘러쌀 수 있다.
전극(22, 23, 24)은 금속 등의 도전체로 형성될 수 있다. 전극은 구리가 전기장형성 몸체(21)에 코팅되어 형성될 수 있다. 전극 전기장형성부(20)의 전극은 세포 전극(22), 물질 전극(23) 및 결과물 전극(24)을 포함할 수 있다. 전기장형성부(20)는 각 전극(22, 23, 24)과 전기적으로 연결되고 전력원과 연결될 수 있는 단자(26, 27)를 포함할 수 있다. 단자(26, 27)는 전극(22, 23, 24)과 동일한 소재로 형성될 수 있다. 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)는 물질 전극(23)과 전기적으로 연결되는 물질 단자(26)와, 결과물 전극(24)과 전기적으로 연결되는 결과물 단자(27)를 포함할 수 있다. 각각의 단자(26, 27)는 전력원과 연결되기 용이하도록 전기장형성 몸체(21)의 외측에 배치될 수 있다.
전기장형성부는 본체부의 내측에 각 유로를 둘러싸도록 배치되어 본체부와 결합되는 전극들을 포함하여 구성될 수도 있다. 이러한 전극은 혼합유로에도 배치될 수 있다.
전기장형성부(20)는 단순 직류전원을 이용해 전기장을 형성할 수 있으나, 펄스 형태의 전원을 이용한 전기장을 형성할 수도 있다. 후술할 형질전환 장치(도 9의 2)의 프로세서(201)가, 이에 전기적으로 연결된 전력인가부(203)를 이용하여 전기장형성부(20)를 PWM 제어 방식으로 제어할 수 있다. 펄스의 주파수는 1kHz 이상 100kHz 이하일 수 있고, 듀티 비는 10% 이상 90% 이하일 수 있다. 전기장형성부(20)는 전기장의 크기를 변화시키며 형성할 수 있다. 전기장 크기는 전기장형성부(20)가 형성하는 전기장 크기의 최대값의 50%까지 감소하며 변화할 수 있다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)는 실링 시트(30)를 포함할 수 있다. 실링 시트(30)는 본체부(10)와 후술할 하부 마운트(63) 사이에 위치하여, 하부 마운트(63)로부터 본체부(10)로 충격이 바로 전달되지 않도록 하고, 본체부(10)를 안정적으로 지지할 수 있다. 실링 시트(30)는 실리콘(silicone)을 포함하는 재질로 형성될 수 있으나 그 재질이 이에 제한되지는 않는다. 각 유로(12, 13, 14)의 입구의 하측에 대응되는 실링 시트(30) 상의 위치에 구멍이 형성되어, 하측으로부터 상방으로 각 유로(12, 13, 14)의 상태를 확인할 수 있다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)는 오링부(40)를 포함할 수 있다. 오링부(40)는 탄성을 가지는 환형의 오링들(42, 43, 44)로 구성되고, 전기장형성부(20)와 후술할 가이드부(50) 사이에 위치하여, 전기장형성부(20)와 가이드부(50) 사이의 수밀을 유지할 수 있고, 가이드부(50)로 삽입되는 바늘을 잡아 안정적으로 용액의 투입이 이뤄지도록 할 수 있다. 오링부(40)는 실리콘(silicone)을 포함하는 재질로 형성될 수 있으나 그 재질이 이에 제한되지는 않는다. 오링부(40)는 세포 전극(22)과 세포 가이드(52) 사이에 위치하는 세포 오링(42), 물질 전극(23)과 물질 가이드(53) 사이에 위치하는 물질 오링(43), 결과물 전극(24)과 결과물 가이드(54) 사이에 위치하는 결과물 오링(44)을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)는 가이드부(50)를 포함할 수 있다. 가이드부(50)는 용액의 입구 및 출구 역할을 할 수 있다. 가이드부(50)는 판형의 가이드 몸체(51)와, 가이드 몸체(51)에 결합되는 세포 가이드(52), 물질 가이드(53) 및 결과물 가이드(54)를 포함할 수 있다. 각 가이드(52, 53, 54)는 가이드 몸체(51)로부터 상방으로 연장된 파이프형으로 형성될 수 있다. 각 가이드(52, 53, 54)는 상하로 관통된 형상을 가지며 각 전극(22, 23, 24)과 유로(12, 13, 14)에 대응되는 위치에 배치되므로, 바늘이 가이드(52, 53, 54)로 삽입되어 펌프와 연결되는 등의 방식으로 액체를 토출하면 토출한 액체가 각 전극을 거쳐 각 유로로 전달될 수 있도록 할 수 있다. 각 가이드(52, 53, 54)에는 바늘이 안정적으로 삽입되어 적절한 위치에 액체의 토출이 가능하도록 할 수 있다. 각 가이드(52, 53, 54)의 하측에 오링(42, 43, 44)이 배치될 수 있고, 가이드 몸체(51)의 하측에 전기장형성부(20)가 위치할 수 있다. 가이드부(50)는 폴리카보네이트를 포함하는 재질로 형성될 수 있으나 그 재질이 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)는 상부 마운트(61)와 하부 마운트(63)를 포함할 수 있다. 상부 마운트(61)는 가이드부(50)의 상측에 위치하고, 하부 마운트(63)는 실링 시트(30)의 하측에 위치할 수 있다. 상부 마운트(61)와 하부 마운트(63)가 서로 볼트 등의 체결구에 의해 체결되어, 그 사이에 위치한 실링 시트(30), 본체부(10), 전기장형성부(20), 오링부(40) 및 가이드부(50)를 적층된 상태로 고정시킬 수 있다. 상부 마운트(61)와 하부 마운트(63)에 의해 그 사이의 구성요소들이 가압되어, 실링이 효과적으로 일어날 수 있다. 상부 마운트(61)에는 가이드가 통과할 수 있는 구멍이 형성될 수 있고, 하부 마운트(63)에는 실링 시트(30)의 구멍에 대응되는 위치에 구멍이 형성될 수 있다. 상부 마운트(61)와 하부 마운트(63)는 알루미늄을 포함하는 재질로 구성될 수 있고, 이러한 알루미늄은 양극산화 된 알루미늄(anodized aluminium)일 수 있으나 그 재질이 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)는 본체 마운트(62)를 포함할 수 있다. 본체 마운트(62)는 중심에 본체부(10)가 삽입되는 구멍을 포함하여, 본체부(10)가 적절한 위치에 배치된 상태로 다른 구성요소들과 정렬되도록 할 수 있다. 본체 마운트(62)는 상부 마운트(61)와 하부 마운트(63) 사이에 위치하고 체결구를 통해 더 결합될 수 있다. 본체 마운트(62)는 알루미늄을 포함하는 재질로 구성될 수 있고, 이러한 알루미늄은 양극산화 된 알루미늄(anodized aluminium)일 수 있으나 그 재질이 이에 제한되지는 않는다.
도 4는 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)의 본체부(10)의 개념도이다.
본체부(10)에는 서로 만나는 세포 유로(12), 물질 유로(13) 및 결과물 유로(14)가 형성된다. 이러한 유로들(12, 13, 14)은 본체부 몸체(11)가 관통되어 형성될 수 있다. 본체부 몸체(11)는 유리를 포함하는 재질로 형성될 수 있고, 이러한 유리는 붕규산 유리(borosilicate glass)일 수 있으나 그 재질이 이에 제한되지는 않는다.
본체부 몸체(11)의 상면에는 각 유로(12, 13, 14)의 입구(120, 130) 또는 출구(140)가 배치될 수 있다. 물질 유로(13)의 입구(130), 세포 유로(12)의 입구(120) 및 결과물 유로(14)의 출구(140)는, 기준방향인 전방으로 가면서, 물질 유로(13)의 입구(130), 세포 유로(12)의 입구(120) 및 결과물 유로(14)의 출구(140)의 순서로 나열될 수 있다. 세포 유로(12)의 입구(120)로 세포 용액(SC)이 투입될 수 있고, 물질 유로(13)의 입구(130)로 물질 용액(SM)이 투입될 수 있고, 결과물 유로(14)의 출구(140)로 결과물 용액이 배출될 수 있다.
세포 유로(12)는 세포 용액(SC)이 투입되어 유동하는 유로이다. 세포 용액(SC)은 세포(C0)를 포함하는 배양액 또는 전해질로 구성될 수 있다. 세포 용액(SC)이 포함하는 세포(C0)는 체세포 중 혈구세포일 수 있고, 그 중에서도 면역세포일 수 있다. 상기 면역세포는 면역을 유도하여 목적하는 치료 효과를 유발할 수 있는 세포라면 제한 없이 이용될 수 있으며, 예를 들어, 자연살해 세포(NK cell), T 세포, 자연살해 T 세포(NKT cell), 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell; CIK), 마크로파지 및 수지상세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 세포 유로(12)는 세포 유로(12)의 입구(120)로부터 연장되는 세포 유입유로(121)를 포함할 수 있다. 세포 유입유로(121)는 세포 유로(12)의 입구(120)로부터 하방으로 연장될 수 있다.
물질 유로(13)는 물질 용액(SM)이 투입되어 유동하는 유로이다. 물질 용액(SM)은 형질전환 물질(M)이 포함된 물 또는 버퍼일 수 있다. 형질전환 물질(M)은 상기 세포(C0)의 내부, 예컨대 세포질 또는 핵 내부로 도입되어 상기 세포(C0)에서 기능을 발휘하도록 하기 위한 것으로서, 상기 세포(C0) 내에서 기능을 발휘할 수 있는 물질이라면 단백질, 펩타이드, 핵산 등 어떠한 형태이든 제한되지 않는다. 특히 상기 형질전환 물질(M)은 핵산, 그 중에서 mRNA일 수 있다. 물질 유로(13)는 물질 유로(13)의 입구(130)로부터 연장되는 물질 유입유로(131)를 포함할 수 있다. 물질 유입유로(131)는 물질 유로(13)의 입구(130)로부터 하방으로 연장될 수 있다. 물질 유로(13)는 물질 유입유로(131)의 하단으로부터 결과물 유로(14)를 향해 연장되는 물질 전달유로(132)를 포함할 수 있다. 물질 전달유로(132)는 수평한 방향인 전방으로 연장될 수 있다. 따라서 물질 유로(13)는 물질 유입유로(131)와 물질 전달유로(132)가 만나는 위치에서 꺾일 수 있고, 꺾이는 각도는 90도일 수 있다.
세포 유로(12)가 물질 유로(13)의 상측에 위치하는 상태로 세포 유로(12)와 물질 유로(13)가 만날 수 있다. 물질 전달유로(132)의 전단의 상측에 세포 유입유로(121)의 하단이 위치할 수 있다. 따라서 물질 유로(13)와 세포 유로(12)가 만나는 개소에서, 세포 용액(SC)이 물질 용액(SM)의 상측에 위치한 상태로 결과물 유로(14)로 유입될 수 있다.
결과물 유로(14)는 형질전환된 세포(C1)를 포함하는 결과물 용액이 유동하는 유로이다. 결과물 유로(14)의 출구(140)를 통해 결과물 용액이 배출될 수 있다. 세포 유로(12)와 물질 유로(13)가 결과물 유로(14)로 수렴하는 형태로 형성된다. 따라서 세포 용액(SC)과 물질 용액(SM)이 합쳐져 결과물 용액이 된다.
결과물 유로(14)는 세포 유로(12) 및 물질 유로(13)와 연결되는 개소로부터 연장되는 혼합유로(141)를 포함한다. 혼합유로(141)는 상기 개소로부터 수평한 전방으로 연장될 수 있다. 결과물 유로(14)는 혼합유로(141)의 단부와 결과물 유로(14)의 출구(140)를 연결하는 결과물 배출유로(142)를 포함할 수 있다. 결과물 배출유로(142)는 혼합유로(141)의 전단으로부터 상방으로 연장될 수 있다.
세포 유로(12)가 물질 전달유로(132) 및 혼합유로(141)와 서로 나란하지 않은 상태로 만나므로, 만나는 지점에서 세포 용액(SC)의 흐름은 꺾이게 된다. 세포 용액(SC)은 90도로 꺾일 수 있다. 세포 용액(SC)이 유동하는 방향이 유로가 만나는 지점에서 변화하므로, 이에 따른 원심가속도에 의해 세포(C0)가 하방으로 침강하여 물질(M)과 용이하게 만날 수 있다.
전기장형성부(20)는 각 전극(22, 23, 24)을 이용하여 각 유로(12, 13, 14)에서 유동하는 용액을 따라 전기장을 형성할 수 있다. 전기장형성부(20)는 물질 전극(23)과 결과물 전극(24)을 이용해 물질 유로(13)와 결과물 유로(14)에 전기장을 형성할 수 있다. 전기장형성부(20)는 세포 전극(22)과 결과물 전극(24)을 이용해 세포 유로(12)와 결과물 유로(14)에 전기장을 형성할 수 있다. 세포 유로(12) 또는 물질 유로(13)로부터 출발하여 결과물 유로(14)를 통해 나가는 방향으로 형성되는 전기장은 도면에서 점선으로 표시되었다. 전기장을 형성함으로써 각 용액(SC, SM)의 유로(12, 13, 14) 내 흐름 방향을 형성할 수 있고, 후술할 혼합유로(141)에서 전기천공에 의한 형질전환이 일어나도록 할 수 있다.
혼합유로(141)에서 세포 용액(SC)의 세포(C0)의 내부로 물질 용액(SM)의 형질전환 물질(M)이 진입할 수 있다. 혼합유로(141)에 걸린 전기장에 의해 세포(C0)의 인지질이중막이 국소적으로 개방되므로, 형질전환 물질(M)이 세포(C0) 내로 진입할 수 있다.
혼합유로(141)의 두께(T11+T21)는 세포 유로(12)의 두께(T10)보다 작을 수 있다. 여기서 유로(12, 13, 14)의 두께란, 각 유로(12, 13, 14)를 도 4와 같이 좌우방향에 직교하는 평면으로 자른 단면에서, 유로(12, 13, 14) 내 용액(SC, SM)이 유동하는 방향과 직교하는 방향으로 각 유로(12, 13, 14)의 경계가 벌어진 정도를 의미한다. 각 유로(12, 13, 14)가 원통을 연장한 파이프형으로 형성될 경우, 유로(12, 13, 14)의 두께는 유로(12, 13, 14)의 내경일 수 있다. 혼합유로(141)의 두께(T11+T21)는 물질 유로(13)의 두께(T20)보다 작을 수 있다. 혼합유로(141)의 두께는 6㎛ 이상 400㎛ 이하일 수 있다.
혼합유로(141)의 두께(T11+T21)가 결과물 유로(14)로 수렴되는 세포 유로(12)의 두께(T10) 또는 물질 유로(13)의 두께(T20)보다 작아, 혼합유로(141) 내에서 세포 용액(SC)의 두께(T11)는 세포 유로(12) 내에서 세포 용액(SC)이 차지하는 두께인 세포 유로(12)의 두께(T10)보다 작을 수 있다. 마찬가지로 혼합유로(141) 내에서 물질 용액(SM)의 두께(T21)는 물질 유로(13) 내에서 물질 용액(SM)이 차지하는 두께인 물질 유로(13)의 두께(T20)보다 작을 수 있다. 이 때 혼합유로(141) 내에서의 세포 용액(SC)의 두께(T11)가 세포(C0)의 직경보다 작을 경우, 세포(C0)의 일부분이 물질 용액(SM)으로 노출되어 형질전환 물질(M)과 만날 수 있는 상태에 놓일 수 있다. 전기장이 혼합유로(141)에 형성되면서 세포(C0) 내로 형질전환 물질(M)이 진입해 형질전환된 세포(C1)를 형성할 수 있다. 물질 용액(SM)에 세포(C0)의 일부가 노출되므로, 물질 용액(SM)과 세포 용액(SC)이 섞이지 않더라도 형질전환이 일어날 수 있다.
위와 같은 유동이 가능하도록, 세포 유로(12)의 두께와 물질 유로(13)의 두께를 합한 값으로 세포 유로(12)의 두께를 나눈 값에 혼합유로(141)의 두께를 곱한 값은, 세포 유로(12)에서 유동하는 세포(C0)의 직경보다 작을 수 있다.
각 용액이 주입되는 유량을 제어하여 혼합유로(141) 내에서 유동하는 세포 용액(SC)의 두께(T11)를 결정할 수도 있다. 프로세서(201)는 세포 유로(12)를 통해 혼합유로(141)로 유입되는 용액인 세포 용액(SC)이 혼합유로(141) 내에서 가지는 두께(T11)가 세포 용액(SC)에 포함되는 세포의 직경보다 작도록 펌프부(202)를 제어할 수 있다. 다른 조건이 동일한 상황에서 펌프부(202)가 세포 용액(SC)을 압송하는 압력 또는 유량이 증가하면, 혼합유로(141) 내에서 세포 용액(SC)이 가지는 두께(T11)가 증가할 수 있다.
혼합유로(141)에서 세포(C0)가 물질 용액(SM)으로 용이하게 노출될 수 있도록, 상술한 것과 세포 유로(12)가 물질 유로(13)의 상측에 위치하는 상태로 서로 만날 수 있다. 이러한 유로 배치에 의해 혼합유로(141) 내에서 세포 용액(SC)이 물질 용액(SM)의 상측에 위치할 것이므로, 세포 용액(SC)이 운반한 세포(C0)가 중력의 영향을 받아 하측의 물질 용액(SM) 쪽으로 이동해 보다 물질 용액(SM)에 잘 노출될 수 있기 때문이다.
상술한 본체부(10)의 구조에 의해 별도로 세포나 형질전환 물질(M)에 대해 전처리를 수행하지 않고도, 단순히 이를 본체부(10)에 주입하고 전기장을 걸어주는 것 만으로도 형질전환이 일어날 수 있고, 형질전환된 세포(C1)를 얻을 수 있다. 따라서 셀 워싱등의 전처리 과정이 생략될 수 있어 해당 과정에서의 세포 및 물질 손실이 대폭 줄어들 수 있다. 또한 별도의 특수한 버퍼가 사용되지 않아도 되므로 경제적인 공정 구성이 가능하다. 또한 전처리가 필요하지 않아 밀폐되고 통제된 환경에 용액을 주입할 수 있도록 만들어주는 것 만으로도 공정을 구성할 수 있어, 위생적인 작업환경을 유지할 수 있어 각종 규제로부터 유리하다. 단순히 세포를 포함하는 배양액과 물질 용액을 주입하고 전기장을 걸어주는 것이 형질전환을 위해 필요한 과정의 전부이므로, 공정을 자동화 하는 것이 용이하다.
제2 실시예
도 5는 본 발명의 제2 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 본체부(10b)의 개념도이다.
본 발명의 제2 실시예에 따른 형질전환 카트리지는, 제2 물질 유로(1302b)를 더 가지는 것을 제외하면 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)와 동일하므로, 차이가 있는 부분에 대해 더 설명하고, 나머지 구성요소에 대해서는 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다. 제2 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 전기장형성부, 가이드, 오링부 등에는 제2 물질 유로(1302b)를 위한 부분이 형성된다.
본체부 몸체(11b)에 형성되는 물질 유로(13b)는 제1 형질전환 물질(M1)을 포함하는 제1 물질 용액(SM1)이 유동하는 제1 물질 유로(1301b)와, 제2 형질전환 물질(M2)을 포함하는 제2 물질 용액(SM2)이 유동하는 제2 물질 유로(1302b)를 포함한다. 제1 형질전환 물질(M1)과 제2 형질전환 물질(M2)은 서로 상이할 수 있다. 제1 물질 유로(1301b)는 제1 실시예에 따른 물질 유로(13)와 동일할 수 있다. 따라서 제1 물질 유로(1301b)는 제1 실시예의 물질 유로(13)와 동일한 것으로 생각하고, 제2 물질 유로(1302b)에 대해 더 설명한다.
세포 유로(12b)의 일측에서 제1 물질 유로(1301b)가 세포 유로(12b)와 만나고, 세포 유로(12b)의 타측에서 제2 물질 유로(1302b)가 세포 유로(12)와 만날 수 있다. 제1 물질 유로(1301b)는 세포 유로(12)의 하측에서 세포 유로(12b)와 만나고, 제2 물질 유로(1302b)는 세포 유로(12b)의 상측에서 상기 세포 유로(12b)와 만날 수 있다. 따라서 결과물 유로(14b)에서 제1 실시예에서 설명한 것과 같은 작용에 의해 세포 용액(SC)의 상측으로 제1 물질 용액(SM1)이, 하측으로 제2 물질 용액(SM2)이 유동할 수 있고, 세포가 제1 물질 용액(SM1)과 제2 물질 용액(SM2)에 노출될 수 있다. 각 물질 용액(SM)에 노출된 세포가 전기장에 의해 개방되어 제1 형질전환 물질(M1)과 제2 형질전환 물질(M2)이 세포 내로 진입해 형질전환이 일어날 수 있다.
따라서 제2 실시예에 따르면, 서로 상이한 종류의 복수의 형질전환 물질(M1, M2)을 하나의 형질전환 카트리지를 이용해 동시에 세포에 주입하여 형질전환된 세포(C2)를 형성할 수 있다.
제3 실시예
도 6은 본 발명의 제3 실시예에 따른 형질전환 카트리지의 본체부(10c)의 개념도이다.
본 발명의 제3 실시예에 따른 형질전환 카트리지는, 본체부(10c)에 형성되는 유로(12c, 13c, 14c)의 형상을 제외하면 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)와 동일하므로, 차이가 있는 부분에 대해 더 설명하고, 나머지 구성요소에 대해서는 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.
제3 실시예에 따른 본체부 몸체(11c)의 외관은 제1 실시예에 따른 본체부 몸체(11)의 외관과 동일할 수 있다. 제3 실시예에 따른 물질 유로(13c)는 하방으로 볼록한 형태의 원호의 형상을 가질 수 있다. 물질 유로(13c)와 결과물 유로(14c)는, 하방으로 볼록한 형태의 연속된 원호의 형상을 가질 수 있다. 즉 물질 유로(13c)와 결과물 유로(14c)가 아래로 볼록한 연속된 원호를 그리며 연결될 수 있다. 세포 유로(12c) 역시 원호의 형상을 가지는 것과 같이 곡선형의 프로파일을 가지도록 도시되었으나, 세포 유로(12c)는 하방으로 연장된 형상을 가질 수도 있다. 세포 유로(12c)가 원호 형상을 가질 경우, 세포 유로(12c)의 곡률반경은 물질 유로(13c)의 곡률반경보다 작을 수 있다.
물질 유로(13c)가 원호 형상을 가지므로, 물질 유로(13c)로 투입되는 형질전환 물질에 원심가속도가 가해져 형질전환 물질이 세포와 만나는 것이 보다 용이해질 수 있다.
제3 실시예에서와 같은 원호형의 유로는 제2 실시예의 제1 물질 유로(1301b) 및 제2 물질 유로(1302b)에도 적용될 수 있다.
제4 실시예
도 7은 본 발명의 제4 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1d)의 사시도이다. 도 8은 본 발명의 제4 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1d)의 분해사시도이다.
본 발명의 제4 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1d)는, 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)의 본체부(10), 오링부(40) 및 실링 시트(30)와 동일한 구성요소를 가지고, 나머지 구성요소에 있어 일부 형상상의 차이가 있으므로, 차이가 있는 부분에 대해 더 설명하고, 대응되는 구성요소에 대해서는 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.
제4 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1d)의 가이드부(50d)는, 복수의 용액을 주입받아 섞어 본체부(10d)의 물질 유로로 전달할 수 있다. 이를 위해 가이드부(50d)는 복수의 물질 가이드(53d)를 포함할 수 있다. 각각의 물질 가이드(53d)에 서로 다른 물질 용액이 주입되고, 서로 다른 물질 용액이 가이드부(50d)를 통해 물질 유로의 입구로 전달되는 동안 하나의 유로로 통합되어 전달되므로, 유동하는 과정에서 서로 섞일 수 있다.
가이드부(50d)는 결과물 용액을 복수의 가이드로 배출할 수 있다. 따라서 결과물 가이드(54d)는 메인 결과물 가이드(541d)와 보조 결과물 가이드(542d)를 포함할 수 있다. 메인 결과물 가이드(541d)는 상방으로 연장된 뒤 좌측으로 구부러진 파이프 형상을 가질 수 있다. 보조 결과물 가이드(542d)는 상방으로 연장된 파이프 형상을 가질 수 있다. 결과물 유로로부터 배출된 결과물 용액이 가이드부(50d)에서 메인 결과물 가이드(541d)와 보조 결과물 가이드(542d)로 갈라져 각각 배출될 수 있다.
가이드부(50d)는 전원인가 가이드(55d)를 포함할 수 있다. 전원인가 가이드(55d)는 복수 개 형성될 수 있다. 전원인가 가이드(55d)는 가이드 몸체(51d)의 하측에 위치하는 전기장형성부(20d)의 각 단자(25d, 26d, 27d)가 가이드부(50d)의 외부로 노출될 수 있도록 하고, 각 단자(25d, 26d, 27d)에 연결되기 위한 접속구가 안정적으로 각 단자(25d, 26d, 27d)에 접촉하며 고정되도록 할 수 있다. 전원인가 가이드(55d) 역시 가이드 몸체(51d)로부터 상방으로 연장된 파이프형으로 형성될 수 있다.
전기장형성부(2d0)는 물질 전극(23d)과 전기적으로 연결되는 물질 단자(26d)와, 결과물 전극(24d)과 전기적으로 연결되는 결과물 단자(27d)와, 세포 전극(22d)과 전기적으로 연결되는 세포 단자(25d)를 포함할 수 있다. 각각의 단자(25d, 26d, 27d)는 전기장형성 몸체(21d) 상에서 전원인가 가이드(55d)와 대응되는 위치에 배치될 수 있다. 전기장형성부(20d)는 가이드부(50d)와 체결구를 통해 결합될 수 있다.
본체 마운트(62d)는 중심에 본체부(10d)가 삽입되는 구멍을 포함하여, 본체부(10d)가 적절한 위치에 배치된 상태로 다른 구성요소들과 정렬되도록 할 수 있다. 다만 본체 마운트(62d)의 구멍에는 단차가 형성되어, 본체부(10d)와 실링 시트(30d)가 삽입되면서도 하방으로 이탈하지 않도록 할 수 있다. 본체 마운트(62d)는 전기장형성부(20d)에 체결구를 통해 결합될 수 있다.
도 9는 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)와 형질전환 장치(2)를 포함하는 형질전환 시스템(100)을 나타낸 도면이다. 도 10은 본 발명의 제4 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1d)와 형질전환 장치(2d)를 포함하는 형질전환 시스템(100d)을 나타낸 도면이다.
도면을 참조하면, 본 발명의 제1 실시예 및 제4 실시예에 따른 형질전환 시스템(100, 100d)은, 형질전환 카트리지(1, 1d), 형질전환 장치(2, 2d)를 포함한다. 형질전환 시스템(100, 100d)은 시린지(3)를 포함할 수 있다. 시린지(3)의 개수, 펌프의 개수, 가이드의 개수 등에 있어서만 제1 실시예와 제4 실시예 사이에 차이가 있으므로, 도 9를 대표로 참조하여 본 발명의 세포에 대한 형질전환 방법에 대해 설명한다.
형질전환 장치(2)에 의해 형질전환 카트리지(1)에 각각의 용액이 주입되어 형질전환이 일어날 수 있다. 세포 유로(12), 물질 유로(13) 및 결과물 유로(14)가 형성된 형질전환 카트리지(1)를 준비한다. 즉 형질전환 방법은 형질전환 카트리지(1)를 준비하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 형질전환 카트리지(1)의 가이드부(50)에 세포 용액 및 물질 용액이 각각 포함된 시린지(3)를 꽂을 수 있다. 시린지(3)가 꽂힌 형질전환 카트리지(1)를 형질전환 장치(2)의 내부로 진입시킬 수 있다.
본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 장치(2)는 펌프부(202)와 프로세서(201)를 포함한다. 형질전환 장치(2)는 입력부(204)를 포함할 수 있고, 전력인가부(203)을 포함할 수 있다.
펌프부(202)는 세포 유로(12) 및 물질 유로(13)에 각각 세포 용액(SC)과 물질 용액(SM)을 압송하도록 마련된다. 따라서 펌프부(202)는 각각의 용액을 압송하기 위한 복수의 펌프를 포함할 수 있다. 펌프부의 펌프들은 각각의 배관을 통해 각각의 용액이 수용된 저장조로부터 용액을 후술할 본체부(10)의 각각의 유로로 전달할 수 있다.
각 펌프는 시린지(3)에 접촉하여 시린지(3)의 피스톤을 원하는 속도로 밀어줄 수 있는 시린지 펌프일 수 있다. 따라서 형질전환 장치(2)의 내부로 시린지(3)가 꽂힌 형질전환 카트리지(1)가 진입하면, 펌프가 시린지(3)의 피스톤에 접근하여 접촉하고 작동이 시작됨에 따라 시린지(3)를 밀어주는 방식으로 유체를 압송할 수 있다. 그러나 펌프가 시린지 펌프에 제한되지는 않고, 배관이 카트리지의 각 유로에 직접적으로 결합되고 유체를 압송하는 방식으로 펌프가 구성될 수도 있다.
펌프부(202)는 형질전환 카트리지(1)가 형질전환 장치(2)의 내부로 진입했을 때, 피스톤을 밀어주기 위한 가압부재를 피스톤에 접촉시킬 수 있다. 이 때 펌프부(202)는 가압부재가 이동한 거리를 측정하여, 시린지(3)에 저장된 용액의 부피가 얼마나 되는지를 프로세서(201)가 산출하도록 할 수 있다.
프로세서(201)는 펌프부(202)와 전기적으로 연결되어, 펌프부(202)가 각 용액을 압송하는 압력 또는 유량 중 적어도 하나를 제어할 수 있다. 프로세서(201)는 제어명령을 수행하는 논리 연산이 가능한 소자를 포함하는 구성요소로, CPU(Central Processing Unit) 등을 포함할 수 있다. 프로세서(201)는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 장치(2)의 각종 구성요소들에 연결되어, 제어명령에 따른 신호를 각 구성요소들에 전달할 수 있고, 각종 센서 또는 획득부들에 연결되어 획득된 정보를 신호의 형태로 전달받을 수 있다. 프로세서(201)는 각각의 구성요소들과 전기적으로 연결될 수 있으므로, 도선으로 연결되거나, 무선으로 통신 가능한 통신 모듈을 가져 상호 통신할 수도 있다.
형질전환 장치(2)는 저장매체를 더 포함하여, 프로세서가 수행하는 제어명령들이 저장매체에 저장되어 활용될 수 있다. 저장매체는 HDD(Hard Disk Drive), SSD(Solid State Drive), 서버, 휘발성 매체, 비휘발성 매체 등과 같은 장치일 수 있으나, 그 종류가 이에 제한되지는 않는다. 저장매체에는 이 밖에도 프로세서(201)가 작업을 수행하기 위해 필요로 하는 데이터 등이 더 저장될 수 있다.
형질전환 장치(2)는 입력부(204)를 통해서 필요한 정보를 입력받을 수 있다. 입력부(204)는 버튼, 스위치, 터치스크린 등의 수단을 포함하여 정보를 입력받을 수 있고, 바코드, QR 코드, RFID 스캐너를 포함하여 부호 등을 스캔하는 방식으로 정보를 입력받을 수도 있다. 입력부(204)를 통해 형질전환 장치(2)로 진입하는 형질전환 카트리지(1)에 대한 정보를 입력받을 수 있다. 입력부(204)로 입력된 정보는 프로세서(201)로 전달된다.
프로세서(201)는 입력된 정보와 기 설정되어 저장된 정보들을 이용하여 펌프부가 형질전환 카트리지(1)로 전달하는 각 용액의 유량을 결정할 수 있다. 프로세서(201)는 각 용액의 유량을, 혼합유로(141)에서 세포(C0)와 물질(M)이 만나 형질전환이 일어나도록 하는 값으로 결정할 수 있다. 프로세서(201)는 어떠한 물질 용액(SM)과 어떠한 세포 용액(SC)이 사용될 것인지를 알게 되면, 해당 물질 용액(SM) 및 세포 용액(SC)에 대응되는 최적의 유량비를 저장된 자료로부터 가져올 수 있다. 프로세서(201)는 형질전환 처리를 위한 최적의 노출 시간을 마찬가지로 저장된 자료로부터 가져올 수 있다. 프로세서(201)는 가져온 유량비와 노출 시간을 입력된 형질전환 카트리지(1)의 정보(카트리지의 유로 길이, 유로 형상 등)와 조합하여 세포 용액(SC)의 유량과 물질 용액(SM)의 유량을 정할 수 있고, 결정된 유량에 따라 펌프부(202)가 작동하여 시린지(3)를 밀어주도록 할 수 있다. 여기서 유량비는 물질 용액(SM)와 세포 용액(SC)이 혼합유로(141) 내에서 전체 혼합유로(141)의 두께 중 얼마만큼의 비율을 차지할 것인지를 결정한다. 최적의 노출 시간이란, 혼합유로(141)를 세포(C0)와 물질(M)이 통과하며 형질전환이 일어나기에 충분한 시간을 의미한다.
상기 유량비는, 혼합유로(141)에서 세포(C0)와 물질(M)이 만나 형질전환이 일어나도록 하는 값일 수 있다. 유량비는 세포 유로(11)를 통해 혼합유로(141)로 유입되는 용액이 혼합유로(141) 내에서 가지는 두께(T11)가 세포(C0)의 직경의 3배 이하가 되도록 하는 값일 수 있으며, 바람직하게는 세포(C0)의 직경보다 작도록 하는 값일 수 있다.
형질전환 방법은, 결정된 유량비와 유량값에 따라 펌프부(202)가 작동하여 세포 유로(12)에 세포 용액(SC)을 주입하고, 물질 유로(13)에 물질 용액(SM)을 주입하는 단계를 포함할 수 있다.
전력인가부(203)는 프로세서(201)와 전기적으로 연결되고, 형질전환 카트리지(1)의 전기장형성부(20)가 포함하는 전극(22, 23, 24)에 전력을 인가하기 위해 단자(26, 27)에 연결될 수 있다. 형질전환 카트리지(1)가 형질전환 장치(2)의 내부로 진입하면, 전력인가부(203)의 연결 암이 단자(26, 27)에 접근하여 접촉함으로써 전기적인 연결이 이루어질 수 있다. 펌프부(202)를 이용해 세포 유로(12)에 세포 용액(SC)을 주입하고, 물질 유로(13)에 물질 용액(SM)을 주입할 때, 전력인가부(203)가 전기장이 형성되도록 전기장형성부(20)에 전력을 인가할 수 있다. 용액이 공급되고 전기장이 형성되어, 혼합유로(141)에서 형질전환이 일어나고, 결과물 유로(14)의 출구(140)를 통해 형질전환된 세포(C1)를 포함하는 용액이 배출될 수 있다.
도 11은 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)에서 일어나는 세포(C0)의 침강을 표현한 도면이다.
도 11을 이용하여 본 발명의 제1 실시예에 따른 형질전환 카트리지(1)가 형질전환 장치(2)에 제공될 때 형질전환 장치(2)가 제공할 수 있는 용액의 유량을 설명한다. 세포 유로(12)와 물질 전달유로(132)가 만나 혼합유로(141)로 이어질 때, 세포 유로(12)에서 유동하는 세포 용액(SC)의 흐름은 직각으로 꺾일 수 있고, 세포 용액(SC)의 흐름은 마치 귀퉁이에서 원운동을 하는 것과 같이 근사할 수 있다. 이 때 세포(C0)가 혼합유로(141)에서 상술한 원운동의 원심력에 의해 하방으로 침강하는 거리인 SS는, 원심분리와 관련된 식을 이용하여 다음과 같이 표현할 수 있다. SS는 1㎛ 이상 20㎛ 이하일 수 있다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2023015094-appb-img-000001
여기서 VS는 도시된 것과 같이 하방을 향하는 세포(C0)의 속도이고, tS는 귀퉁이를 사분원으로 근사하였을 때 귀퉁이를 통과하는데 필요한 시간이고, r은 근사한 사분원의 반지름이고, d는 세포(C0)의 직경이고, μ는 세포 용액(SC)의 점도이고, Δρ는 세포(C0)와 세포 용액(SC)의 밀도차이고, ω는 세포(C0)의 각속도이고, Vc는 세포(C0)가 혼합유로(141) 내에서 가지는 수평방향 속도이다.
형질전환 장치(2)는 상술한 SS 보다 혼합유로(141) 내에서 세포 용액(SC)의 두께가 작아지도록 하는 유량비로 세포 용액(SC)과 물질 용액(SM)을 형질전환 카트리지(1)에 제공할 수 있다. 이러한 유량비로 각 용액이 제공되어, 세포(C0)는 혼합유로(141)에서 물질(M)을 만나 형질전환이 이루어질 수 있다.
도 12는 본 발명의 제3 실시예에 따른 형질전환 카트리지에서 일어나는 세포의 침강을 표현한 도면이다.
도 12를 이용하여 본 발명의 제3 실시예에 따른 형질전환 카트리지가 형질전환 장치(2)에 제공될 때 형질전환 장치(2)가 제공할 수 있는 용액의 유량을 설명한다. 결과물 유로(14c)의 일부분인 혼합유로는 도시된 것과 같이 원호의 형상을 가질 수 있으므로, 세포 용액의 흐름은 원운동을 하는 것과 같이 근사할 수 있다. 이 때 세포가 혼합유로에서 상술한 원운동의 원심력에 의해 하방으로 침강하는 거리인 SS는, 다음과 같이 표현할 수 있다. SS는 2㎛ 이상 30㎛ 이하일 수 있다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2023015094-appb-img-000002
여기서 LE는 혼합유로의 길이, R은 혼합유로의 곡률반경이다.
형질전환 장치(2)는 상술한 SS 보다 혼합유로 내에서 세포 용액의 두께가 작아지도록 하는 유량비로 세포 용액과 물질 용액을 형질전환 카트리지에 제공할 수 있다. 이러한 유량비로 각 용액이 제공되어, 세포는 혼합유로에서 물질을 만나 형질전환이 이루어질 수 있다.
실험예 1
먼저, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용한 mRNA의 형질전환 효율을 확인하였다.
이를 위해, 상술한 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여, 세포 배양 배지에 4x107개/mL 농도의 NK-92 세포(ATCC CAT# CRL-2407)가 포함된 세포 용액 1mL를 세포 유로에, 그리고 200㎍/mL 농도의 eGFP mRNA(RiboPro社, CAT# RB-079)가 포함된 물질 용액을 물질 유로에 각각 주입한 다음, 물질 유로 입구와 결과물 배출유로 사이에 1200V의 전기장을 인가하면서, 상기 세포 용액과 물질 용액이 1:2의 유량 비율로 전기장이 걸린 혼합 유로(깊이 30㎛, 폭 3mm, 길이 24mm)를 통과함으로써, 상기 eGFP mRNA가 NK-92 세포 내로 도입된 형질전환체를 수득하였고, 이를 실험군으로 하였다.
한편, NeonTM Transfection System(ThermoFisher社)을 이용하여, 상기 실험군의 형질전환체의 제조 과정에서 이용된 것과 동일한 eGFP mRNA가 포함된 물질 용액을, NeonTM Transfection System 전용 완충용액인 R-buffer가 아니라, 상기 실험군의 형질전환체의 제조 과정에서 이용된 것과 동일한 세포 배양 배지에 NK-92 세포가 포함된 세포 용액과 혼합하고, 나머지 사항은 제조사의 지시에 따라 형질전환체를 수득하였고, 이를 양성 대조군으로 하였다. 그리고, 음성 대조군으로는 mRNA를 도입하지 않은 NK-92 세포가 포함된 세포 용액을 이용하였다.
상기와 같이 얻어진 실험군, 양성 및 음성 대조군 각각에 대하여, 유세포 분석을 수행하였고, 음성 대조군의 상위 1% 시그널 값을 기준으로 이보다 강한 형광 발광이 있는 세포를 발현 성공 세포로 분류하여 발현 효율(eTX)을 분석하였고, 세포 생존률은 Texas Red 형광 염색기법으로 측정하였다.
그 결과, 음성 대조군과 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 제작된 실험군은 약 95% 수준의 높은 세포 생존률을 나타내었고, 전처리 없이 배양 배지상의 세포를 그대로 이용하여 NeonTM Transfection System로 제작한 양성 대조군 역시 약 90% 수준의 높은 세포 생존률을 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나, 도 13에 도시된 바와 같이, 양성 대조군에서는 발현 효율(eTX)이 0.78%로 GFP 형광을 발현하는 형질전환체가 거의 존재하지 않는 것으로 확인된 반면(도 13의 좌측 그래프), 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 제작된 실험군에서는 발현 효율(eTX)이 98.3%로 거의 모든 세포들이 사실상 GFP 형광을 발현하는 형질전환체인 것으로 확인되었다(도 13의 우측 그래프).
세포의 성장을 위해 필요한 여러 성분들이 포함되어 있는 세포 배양 배지에서는 mRNA가 쉽게 파괴되기 때문에, NeonTM Transfection System 등과 같은 기존의 혼합 전달 기술에서는 형질전환 대상 세포를 반드시 세척한 후에 전용 버퍼(NeonTM Transfection System의 경우, R-buffer)로 옮기고, 그 상태에서 mRNA와 혼합하여야 한다. 그럼에도 불구하고, 상기와 같은 양성 대조군에서는, NeonTM Transfection System 전용 완충용액인 R-buffer를 이용하지 않고 NK-92 세포를 세포 배양 배지에 포함된 그대로 이용하였기 때문에, eGFP mRNA와 NK-92 세포의 혼합물 상태에서 eGFP mRNA가 모두 파괴되어 버려 eGFP mRNA가 NK-92 세포 내로 도입된 형질전환체 자체가 제조되지 못한 것으로 판단된다. 상기와 같은 결과로부터, NeonTM Transfection System 등과 같은 기존의 혼합 전달 기술의 경우에는, 세포를 세척하는 과정이나 전용 완충용액을 이용하는 등의 전처리 없이, 배양 배지 상의 세포로 직접 mRNA를 전달하는 것이 사실상 불가능함을 알 수 있다.
그에 반해, 상술한 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하는 경우, NK-92 세포가 세포 배양 배지에 포함된 그대로 이용되기는 하지만, 세포 용액과 eGFP mRNA가 포함된 물질 용액을 각각 분리된 유로를 통해 공급하기 때문에 eGFP mRNA가 세포 배양 배지 내의 성분에 의해 파괴되지 않고 NK-92 세포에 전달될 수 있게 되고, 그로 인해 거의 모든 NK-92 세포에 eGFP mRNA가 도입되어 높은 효율로 형질전환체가 제조될 수 있다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용함으로써 배양 배지 상의 세포로 직접 mRNA를 전달할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하는 경우, 세포를 세척하는 과정이나 전용 완충용액을 이용하는 등의 전처리가 전혀 필요하지 않고, 그렇기 때문에 세포 세척 과정에서의 세포 소실이나 세포 손상이 유발되지 않고, 전용 완충용액 등과 같은 고가의 소모품을 이용하지 않아도 될 뿐만 아니라, 형질전환 공정 자체도 훨씬 단순화될 수 있음이, 본 실시예들 통해 명확히 확인되었다.
특히, 세포 소실이나 세포 손상을 유발하는 세포 세척 과정을 거친 다음, 전용 완충용액으로 옮겨 형질전환을 진행하는 기존의 혼합 전달 기술과 비교하여, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용한 형질전환의 경우에, 세포 내 물질 전달에서 중요한 두 가지 요소인 발현 효율과 세포 생존률 뿐만 아니라, 세포 치료제 제작 공정에서 가장 중요한 세 가지 요소인 공정 자동화율, 공정 밀폐화율 및 제작 수율의 측면에서도 훨씬 유리할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 2
다음으로, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 세포 용액과 물질 용액을 분리 공급하여 형질전환을 수행하는 과정에서, 혼합 유로 내에서 상기 두 용액 간의 유량 비율이 mRNA 등과 같은 물질의 전달 효율에 미치는 영향을 확인하였다.
혼합 유로 내에서 유체의 흐름은 층류 흐름으로 그 깊이에 따라 2차 함수 형태의 속도 구배(parabolic velocity profile)를 가지게 되는데, 유로 중앙에서 속도가 최대이고, 맨 위·아래 면에서는 속도가 0이 된다. 따라서 세포 용액과 물질 용액의 유량비에 따라서 각각 흐름의 속도 프로파일에 변화가 생겨 물질의 전달 효율에 영향을 미치게 될 수 있다. 또한, 기하학적 측면에서는 고정된 혼한 유로의 높이로 인해서 유량이 작아질수록 그 흐름의 높이가 작아지게 되기 때문에, 세포 흐름의 경우, 유량의 조절로 세포 흐름의 유체 두께를 조절하여 세포 크기에 따라 조절할 수 있다. 기본적인 경향은 세포 유체 흐름의 두께가 작아질수록 더 효과적으로 세포들에 물질 흐름과 상호 작용하기 때문에 더 높은 효율을 보이게 된다.
이를 측정하기 위해서, 유량비(물질 유량/세포 유량)를 0.5, 1 및 2로 달리하여, eGFP mRNA의 전달 및 발현 효율을 측정하였다. 구체적으로, 상술한 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여, 세포 배양 배지에 4x107개/mL 농도의 NK-92 세포(ATCC CAT# CRL-2407)가 포함된 세포 용액 1mL를 세포 유로에, 그리고 200㎍/mL 농도의 eGFP mRNA(RiboPro社, CAT# RB-079)가 포함된 물질 용액을 물질 유로에 각각 주입한 다음, 물질 유로 입구와 결과물 배출유로 사이에 1200V의 전기장을 인가하면서, 상기 세포 용액과 물질 용액이 2, 1 및 0.5의 유량비(물질 유량/세포 유량)로 전기장이 걸린 혼합 유로(깊이 30㎛, 폭 3mm, 길이 24mm)를 통과함으로써, 상기 eGFP mRNA가 NK-92 세포 내로 도입된 형질전환체를 수득하였고, 이를 각각 형질전환체 #1, #2 및 #3으로 하였다.
상기와 같이 얻어진 형질전환체 #1, #2 및 #3 각각에 대하여, 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 유세포 분석을 수행하여 전달 및 발현 효율을 분석하였다. 그 결과, 도 14에 도시된 바와 같이, 세포 흐름의 유량이 작을수록 높은 전달 효율을 보였는데, 평균 크기가 대략 15㎛ 정도인 NK-92세포의 경우, 세포 흐름의 두께가 각 혼합 비율에서 10㎛, 15㎛, 20㎛정도 형성되었을 것으로 분석이 되며, 평균 세포 지름 보다 작은 10㎛ 두께를 가지는 경우에 거의 모든 세포가 발현이 된 수준인 90% 이상의 발현율을 보였다. 세포의 지름과 유사한 두께의 세포 용액 흐름을 가지는 경우는 약 75%의 높은 발현율을 유지 하였으며, 세포 지름보다 두꺼운 경우, 40% 수준까지 발현 효율이 떨어짐을 알 수 있었다.
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 형질전환 카트리지의 혼합 유로 내에서의 물질 전달 과정이, 세포 용액 내 세포들이 물질 용액 쪽으로 효과적으로 이동하여 접촉할 수 있도록 함으로써 두 유체 간의 혼합이 효과적으로 일어나지 않더라도 물질 전달을 일으킬 수 있음을 알 수 있다. 즉, 층류의 영역의 유체 흐름의 경우, 난류 영역에서 일어나는 관성력에 의한 유체 혼합 효과가 없기 때문에, 분리하여 유입된 두 개 이상의 유체 흐름들이 짧은 시간 내 효과적을 섞일 수 없지만, 본 발명의 형질전환 카트리지에서와 같이 세포 용액과 물질 용액이 직접 혼합될 수 없는 층류 조건 하에서도, 세포 용액 내 세포들이 물질 용액쪽으로 직접 이동하여 물질 용액과 즉시 접촉하도록 설정함으로써 효과적인 세포 내 물질 전달 및 형질 전환이 가능해질 수 있는 것이다. 또한 본 실험예를 통해서 세포 지름 미만의 세포 유체 흐름 두께에서 거의 모든 세포들을 형질 전환 시킬 수 있음을 확인할 수 있으며, 세포 두께보다 두꺼운 세포 용액 흐름 조건에서는 일부의 세포에 대해서 형질 전환이 일어나며, 두께가 늘어날수록 형질 전환 세포의 비율이 낮아진다는 점도 알 수 있다.
실험예 3
나아가, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하는 경우에, 인체에서 채취한 세포(primary cells)에도 높은 효율로 물질을 전달할 수 있는지 여부를 확인하였다.
NeonTM Transfection System 등과 같은 기존의 혼합 전달 기술의 경우에는 세포 배양 배지를 제거하기 위하여 세포를 세척하는 과정에서 세포의 소실과 손상이 필연적으로 유발될 수 밖에 없었는데, 무한 증식이 가능하여 실험실에서 배양하여 사용할 수 있도록 세포주(cell line)로 확립된 세포들의 경우에는 그나마 세포 생존률이 양호한 것으로 알려져 있으나, 인간의 혈액이나 조직에서 채취한 세포(primary cells)의 경우는, 일반적으로 상기와 같은 세포주들에 비해 배양의 통한 증식이 더 어려울 뿐만 아니라, 세포 세척의 과정에서 더 많은 세포의 손상이 유발되기 때문에, 세포 치료제로서 이용될 형질전환체로 제작되는 과정에서의 수율이 크게 저하되는 문제가 있었다. 그러나, 상기 실시예 1에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 형질전환을 수행하는 경우에, 세포 세척 과정이나 전용 완충용액의 이용 등과 같은 전처리 없이 세포 배양 배지 상의 세포에 직접 물질을 전달할 수 있기 때문에, 인체에서 채취한 세포(primary cells)에도 높은 효율로 물질을 전달할 수 있을 것으로 예상된다.
이를 확인하기 위하여, 상술한 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여, 세포 배양 배지에 5x107개/mL 농도의 인체 채취 hPBMC(human Peripheral Blood Monoclonal Cells)(Lonza社, CAT# CC-2702)가 포함된 세포 용액 1mL를 세포 유로에, 그리고 200㎍/mL 농도의 eGFP mRNA(RiboPro社, CAT# RB-079)가 포함된 물질 용액을 물질 유로에 각각 주입한 다음, 물질 유로 입구와 결과물 배출유로 사이에 1800V의 전기장을 인가하면서, 상기 세포 용액과 물질 용액이 2:1의 유량 비율로 전기장이 걸린 혼합 유로(깊이 30㎛, 폭 3mm, 길이 24mm)를 통과함으로써, 상기 eGFP mRNA가 hPBMC 내로 도입된 형질전환체를 수득하였고, 이를 실험군으로 하였다.
상기와 같이 얻어진 형질전환체에 대하여, 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 eGFP의 발현 효율(eTX)과 세포 생존률을 측정하였다. 그 결과, 도 15 에 도시된 바와 같이, 물질 전달을 하지 않은 음성 대조군과 비교하여, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 eGFP mRNA가 도입된 hPBMC인 실험군의 형질전환체가 동등한 수준의 세포 생존률을 나타낼 뿐만 아니라, 이러한 높은 세포 생존률을 나타내면서, 동시에 GFP의 발현이 일주일 이상 유지될 뿐만 아니라, 그 발현 효율이 최대 98% 이상의 수준에까지 도달되는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 형질전환을 수행하는 경우에, 세포 세척 과정이나 전용 완충용액의 이용 등과 같은 전처리 없이 세포 배양 배지 상의 세포에 직접 물질을 전달할 수 있기 때문에, 세포 사멸에 이르게 하는 수준의 세포 손상을 일으키지 않으면서 세포 내 물질 전달을 효과적으로 수행할 수 있고, 이러한 장점으로 인해 인체에서 채취한 세포(primary cells)에도 높은 효율로 물질을 전달할 수 있음을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 이렇게 제작된 인체 채취 세포의 형질전환체의 경우, 일주일 정도 경과한 시점에서 최대 발현 효율을 나타낼 수 있으므로, 세포 치료제로 적용될 경우 그 약효가 일주일 이상 지속될 수 있을 것임을 알 수 있다. 이는 NeonTM Transfection System 등과 같은 기존의 혼합 전달 기술에서는 달성되지 못했던 우수한 효과로서, 본 실험예를 통해, 사용할 수 있는 세포수가 극히 제한적일 수 밖에 없는 인체 채취 세포 이용 공정에서 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용한 형질전환 기술이 매우 유용할 수 있음을 분명히 알 수 있다.
실험예 4
상기 실시예들에서 확인된 세포주 및 인체 채취 세포 등 다양한 세포들에 대한 우수한 형질전환 효율에 기반하여, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 NK-92 세포(ATCC CAT# CRL-2407)에 CAR(chimeric antigen receptor)의 mRNA를 도입하여 CAR-NK 세포를 제작하였다.
NK 세포는 현재 세포 조작에 적용되고 있는 다양한 형질 전환 기술들로 형질 변형이 가장 힘든 세포 중 하나로 CAR-NK 제작에 큰 어려움이 있다. 일단 혈구 세포 중 NK 세포의 비율은 5% 미만으로 인체에서 채취하여 수득할 수 있는 절대적인 양 자체가 적을 뿐만 아니라, 바이러스 감염에 의한 형질전환 효율은 1% 미만으로 알려져 있다. 따라서 NeonTM Transfection System 등과 같은 기존의 혼합 전달 기술을 이용하여 인체 채취 NK 세포로 형질전환체를 제작하는 경우, 세포 세척 과정에서 발생하는 세포 소실과 세포 손상으로 인해 그 제작 수욜이 현저히 불량한 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 실시예들에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하는 경우에 세포 소실을 최소화 하고, 인체 유래 세포에서도 높은 생존률과 효율로 물질을 전달할 수 있음이 확인된바, 항암치료 효과가 증명된 CAR의 발현을 확인함으로써 CAR-NK 치료제 역시 높은 수율로 제작할 수 있을 것으로 예상된다.
이를 확인하기 위하여, 상술한 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여, 세포 배양 배지에 1.0x107개/mL 농도의 NK-92 세포(ATCC CAT# CRL-2407)가 포함된 세포 용액 1mL를 세포 유로에, 그리고 500㎍/mL 농도의 CD19 CAR mRNA(RiboPro社, CAT# RB-073-3)가 포함된 물질 용액을 물질 유로에 각각 주입한 다음, 물질 유로 입구와 결과물 배출유로 사이에 1200V의 전기장을 인가하면서, 상기 세포 용액과 물질 용액이 2:1의 유량 비율로 전기장이 걸린 혼합 유로(깊이 30㎛, 폭 3mm, 길이 24mm)를 통과함으로써, 상기 CD19 CAR mRNA가 NK-92 세포 내로 도입된 형질전환체를 수득하였고, 이를 NKL-CD19-500으로 하였다.
상기와 같이 얻어진 형질전환체에 대하여, 항-FMC63-PE 항체를 이용하여 상기 CD19 CAR의 발현 효율(eTX)을 측정하였고, 상기 형질전환체와 CD19 과발현 암세포주인 Nalm6(ATCC CAT# CRL-3273)를 2:1의 비율(CAR-NK 세포 : Nalm6 세포)로 혼합하여 배양하면서 Nalm6 암세포의 살상정도(cytotoxicity)를 측정하였다.
그 결과, 도 16에 도시된 바와 같이, 90% 이상의 세포에서 CD19 CAR가 발현되고 있는 것으로 확인되었고(도 16의 (A)), 하루 이내에 80%가 넘는 Nalm6 암세포가 사멸되는 것으로 확인되었다(도 16의 (B)).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용하여 형질전환을 수행하는 경우에, 세포 세척 과정이나 전용 완충용액의 이용 등과 같은 전처리 없이 세포 배양 배지 상의 세포에 직접 물질을 전달할 수 있기 때문에, NeonTM Transfection System 등과 같은 기존의 혼합 전달 기술에서는 사실상 불가능하였던 인체 채취 NK 세포를 이용한 형질전환체의 효율적인 제작이 가능함을 알 수 있다. 이는 NeonTM Transfection System 등과 같은 기존의 혼합 전달 기술에서는 달성되지 못했던 우수한 효과로서, 본 실험예를 통해, 고형암 치료에 획기적인 혁신을 줄 것으로 예상되는 CAR-NK 항암면역세포 치료제 개발과 제작에 큰 가능성을 확인한 것으로 기존의 NK 세포 형질 전환 기술들에서는 보고되지 못했었던 높은 제작 성능으로, 인체 채취 NK 세포 기반 항암면역세포 치료제 분야에서 본 발명의 형질전환 카트리지를 이용한 형질전환 기술이 매우 유용할 수 있음을 분명히 알 수 있다.
이상에서, 본 발명의 실시예를 구성하는 모든 구성 요소들이 하나로 결합하거나 결합하여 동작하는 것으로 설명되었다고 해서, 본 발명이 반드시 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 목적 범위 안에서라면, 그 모든 구성 요소들이 하나 이상으로 선택적으로 결합하여 동작할 수도 있다. 또한, 이상에서 기재된 "포함하다", "구성하다" 또는 "가지다" 등의 용어는, 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 해당 구성 요소가 내재할 수 있음을 의미하는 것이므로, 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 기술적이거나 과학적인 용어를 포함한 모든 용어들은, 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 사전에 정의된 용어와 같이 일반적으로 사용되는 용어들은 관련 기술의 문맥상의 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
[부호의 설명]
1, 1d : 형질전환 카트리지
2, 2d : 형질전환 장치
3 : 시린지
10, 10b, 10c, 10d : 본체부
11, 11b, 11c : 본체부 몸체
12, 12b, 12c : 세포 유로
13, 13b, 13c : 물질 유로
14, 14b, 14c : 결과물 유로
20, 20d : 전기장형성부
21, 21d : 전기장형성 몸체
22, 22d : 세포 전극
23, 23d : 물질 전극
24, 24d : 결과물 전극
25d : 세포 단자
26, 26d : 물질 단자
27, 27d : 결과물 단자
30, 30d : 실링 시트
40, 40d : 오링부
42 : 세포 오링
43 : 물질 오링
44 : 결과물 오링
50, 50d : 가이드부
51, 51d : 가이드 몸체
52, 52d : 세포 가이드
53, 53d : 물질 가이드
54, 54d : 결과물 가이드
55d : 전원인가 가이드
61 : 상부 마운트
62, 62d : 본체 마운트
63 : 하부 마운트
100, 100d : 형질전환 시스템
120 : 세포 유로의 입구
121 : 세포 유입유로
130 : 물질 유로의 입구
131 : 물질 유입유로
132 : 물질 전달유로
140 : 결과물 유로의 출구
141 : 혼합유로
142 : 결과물 배출유로
201 : 프로세서
202 : 펌프부
203 : 전력인가부
204 : 입력부
541d : 메인 결과물 가이드
542d : 보조 결과물 가이드
1301b : 제1 물질 유로
1302b : 제2 물질 유로
C0 : 형질전환 전의 세포
C1, C2 : 형질전환된 세포
M : 형질전환 물질
M1 : 제1 형질전환 물질
M2 : 제2 형질전환 물질
SC : 세포 용액
SM : 물질 용액
SM1 : 제1 물질 용액
SM2 : 제2 물질 용액

Claims (19)

  1. 서로 만나는 세포 유로, 물질 유로 및 결과물 유로가 형성되는 본체부; 및
    상기 결과물 유로에 전기장을 생성하도록 상기 본체부에 결합되는 전극을 포함하는 전기장형성부를 포함하고,
    상기 세포 유로와 상기 물질 유로는, 상기 결과물 유로로 수렴하는 형태로 형성되고,
    상기 결과물 유로는, 상기 세포 유로 및 상기 물질 유로에 연결되는 개소로부터 연장되는 혼합유로를 포함하고,
    상기 혼합유로의 두께는, 상기 세포 유로의 두께보다 작은, 형질전환 카트리지.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 유로가 상기 물질 유로의 상측에 위치하는 상태로 상기 세포 유로와 상기 물질 유로가 만나는, 형질전환 카트리지.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 유로는, 그 입구로부터 하방으로 연장되는 세포 유입유로를 포함하는, 형질전환 카트리지.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 혼합유로는, 상기 세포 유로 및 상기 물질 유로와 연결되는 개소로부터 수평한 일 방향으로 연장되는, 형질전환 카트리지.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 물질 유로는, 하방으로 볼록한 원호의 형상을 가지는, 형질전환 카트리지.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 물질 유로와 상기 결과물 유로는, 하방으로 볼록한 형태의 연속된 원호의 형상을 가지는, 형질전환 카트리지.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 물질 유로는, 그 입구로부터 하방으로 연장되는 물질 유입유로와, 상기 물질 유입유로의 하단으로부터 상기 결과물 유로를 향해 수평하게 연장되는 물질 전달유로를 포함하는, 형질전환 카트리지.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 물질 유로의 입구, 상기 세포 유로의 입구 및 상기 결과물 유로의 출구는, 기준방향을 따라, 상기 물질 유로의 입구, 상기 세포 유로의 입구 및 상기 결과물 유로의 출구의 순서로 나열되는, 형질전환 카트리지.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 물질 유로는,
    상기 세포 유로의 일측에서 상기 세포 유로와 만나는 제1 물질 유로; 및
    상기 세포 유로의 타측에서 상기 세포 유로와 만나는 제2 물질 유로를 포함하는, 형질전환 카트리지.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제1 물질 유로는 상기 세포 유로의 하측에서 상기 세포 유로와 만나고,
    상기 제2 물질 유로는 상기 세포 유로의 상측에서 상기 세포 유로와 만나는, 형질전환 카트리지.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 전기장형성부는, 펄스 형태의 전원을 이용한 전기장을 형성하도록 마련되는, 형질전환 카트리지.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 결과물 유로는,
    상기 혼합유로의 단부와 상기 결과물 유로의 출구를 연결하는 결과물 배출유로를 더 포함하는, 형질전환 카트리지.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 혼합유로의 두께는, 6㎛ 이상 400㎛ 이하인, 형질전환 카트리지.
  14. 형질전환 카트리지의 세포 유로 및 물질 유로에 각각 세포 용액과 물질 용액을 압송하도록 마련되는 펌프부;
    상기 형질전환 카트리지의 전극에 전력을 인가하기 위해 상기 형질전환 카트리지의 단자에 연결되도록 마련되는 전력인가부; 및
    상기 전력인가부 및 상기 펌프부와 전기적으로 연결되는 프로세서를 포함하고,
    상기 프로세서는:
    상기 형질전환 카트리지의 정보, 기 설정된 유량비 및 기 설정된 노출 시간에 기초하여 상기 펌프부를 제어하는, 형질전환 장치.
  15. 서로 만나는 세포 유로, 물질 유로 및 결과물 유로가 형성되는 본체부;
    상기 본체부에 결합되고 상기 물질 유로의 입구 및 상기 결과물 유로의 출구에 배치되는 전극을 포함하는 전기장형성부;
    상기 세포 유로 및 상기 물질 유로에 각각 세포 용액과 물질 용액을 압송하도록 마련되는 펌프부; 및
    상기 펌프부와 전기적으로 연결되는 프로세서를 포함하고,
    상기 세포 유로와 상기 물질 유로는, 상기 결과물 유로로 수렴하는 형태로 형성되고,
    상기 결과물 유로는, 상기 세포 유로 및 상기 물질 유로에 연결되는 개소로부터 연장되는 혼합유로를 포함하고,
    상기 프로세서는:
    상기 세포 유로를 통해 상기 혼합유로로 유입되는 용액이 상기 혼합유로 내에서 가지는 두께가 상기 세포 용액에 포함되는 세포의 직경보다 작도록 상기 펌프부를 제어하는, 형질전환 시스템.
  16. 서로 만나는 세포 유로, 물질 유로 및 혼합유로가 형성된 카트리지를 준비하는 단계;
    상기 세포 유로에 세포를 포함하는 세포 용액을 주입하는 단계; 및
    상기 물질 유로에 상기 세포의 형질전환을 위한 물질을 포함하는 물질 용액을 주입하는 단계를 포함하고,
    주입되는 상기 세포 용액의 유량과 상기 물질 용액의 유량비는, 상기 혼합유로에서 상기 세포와 상기 물질이 만나 형질전환이 일어나도록 하는 값인, 형질전환 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 유량비는, 상기 세포 유로를 통해 상기 혼합유로로 유입되는 용액이 상기 혼합유로 내에서 가지는 두께가, 상기 세포의 직경의 3배보다 작도록 하는 값인, 형질전환 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 유량비는, 상기 세포 유로를 통해 상기 혼합유로로 유입되는 용액이 상기 혼합유로 내에서 가지는 두께가, 상기 세포의 직경보다 작도록 하는 값인, 형질전환 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 유량비는, 상기 세포 유로를 통해 상기 혼합유로로 유입되는 용액이 상기 혼합유로 내에서 가지는 두께가, 상기 세포가 상기 혼합유로에서 하방으로 침강하는 거리보다 작도록 하는 값인, 형질전환 방법.
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