WO2024061826A1 - Method for characterizing the degradation of an organ - Google Patents

Method for characterizing the degradation of an organ Download PDF

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WO2024061826A1
WO2024061826A1 PCT/EP2023/075645 EP2023075645W WO2024061826A1 WO 2024061826 A1 WO2024061826 A1 WO 2024061826A1 EP 2023075645 W EP2023075645 W EP 2023075645W WO 2024061826 A1 WO2024061826 A1 WO 2024061826A1
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WO
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seq
sequence
identity
presenting
cell
Prior art date
Application number
PCT/EP2023/075645
Other languages
French (fr)
Inventor
Geoffroy POULET
Pierre GALICHON
Dany ANGLICHEAU
Valérie TALY
Hélène PÉRÉ
David VEYER
Pierre Laurent-Puig
Guillaume BEINSE
Original Assignee
Cgenetix
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Assistance Publique Hôpitaux De Paris
Sorbonne Université
Université Paris Cité
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the subject of the present invention is a kit and an in vitro method for detecting and characterizing the degradation of a particular organ or tissue, based on the analysis of the presence of at least one acellular DNA. specific methylated ire in a biological sample. More particularly, the subject of the invention is a kit and a method for detecting and characterizing the degradation 1) of the brain during an episode of stroke, 2) of the lung during an episode of acute respiratory distress syndrome and 3) of the kidney during an episode of acute renal failure and/or an episode of rejection and/or dysfunction of the renal graft. The invention also relates to a method for in vitro diagnosis of a pathology or a condition involving the lysis of an organ or tissue.
  • the present invention therefore lies in the field of molecular biology applied to medical diagnosis.
  • CVA cerebrovascular accident
  • AKI acute respiratory distress syndrome
  • AKI acute renal failure
  • kidney transplantation it is essential to monitor the possible occurrence of graft rejection/dysfunction.
  • post-operative follow-up of transplant patients involves painful and burdensome monitoring for the patient.
  • Circulating cell-free DNA also referred to as “free DNA,” is generally known as a tumor marker, but also an inflammation marker and a tissue stress marker. Immune cells mainly contribute to the increase in the total quantity of circulating DNA.
  • WO 2021/216985 “Methods for detecting tissue damage, graft versus host disease and infections using cell-free DNA profiling” discloses the detection of tissue degradation by establishing a profile of circulating DNA in the context of transplantation of allogeneic hematopoietic cells.
  • WO2019012544 “DUAL-PROBE DIGITAL DROPLET PCR STRATEGY FOR SPECIFIC DETECTION OF TISSUE-SPECIFIC CIRCULATING DNA MOLECULES” describes a droplet digital PCR method making it possible to analyze the methylation state of methylation sites of a double-stranded DNA molecule that includes at least two methylation sites per single strand of the double-stranded DNA molecule from a sample of a biological fluid such as plasma or urine
  • WO2019012543 “DNA TARGETS AS TISSUE-SPECIFIC METHYLATION MARKERS” describes a general method for determining the state of degradation of a tissue during a pathological process based on the study of methylation sites of a DNA molecule circulating from a biological fluid such as plasma or urine.
  • the inventors have developed a kit and a method for specific and targeted detection of circulating methylated cell-free DNA present in a biological sample of an individual and specific to the brain, lung or kidney.
  • a method according to the invention makes it possible to specifically detect the existence of massive lysis of one of these organs or of a particular tissue which composes it at the level of its vascular or epithelial fraction.
  • this process makes it possible to distinguish the lysis of an organ from an inflammatory phenomenon of immune origin.
  • epithelial or vascular damage as well as the identification of organic lysis rather than an inflammatory phenomenon of purely immune origin is essential for the diagnosis of the patient and cannot be discriminated by medical imaging.
  • the inventors have in fact selected, among different specifically hypermethylated or hypomethylated regions of circulating DNA, at least one region making it possible to develop a sensitive and specific test of the degradation of said organ.
  • the inventors For one of these organs, namely the kidney, the inventors have further selected, from different specifically hypermethylated or hypomethylated fractions of circulating DNA, at least three fractions differentially methylated in the renal epithelium, the renal endothelium and the total kidney, these regions can be designated respectively by “total kidney”, the “renal vascular fraction” and the “renal epithelial fraction” making it possible to develop a sensitive and specific test for the degradation of said organ. [19] The inventors have thus designed, for each of these regions, a pair of selective amplification primers, amplification conditions and a probe specifically detecting the amplification product generated using said pair of primers.
  • the inventors have also identified, around each of the nucleotide sequences selectively amplified by a pair of primers as described above, a genetic region of interest including the amplified nucleotide sequence, said genetic region being of size greater than that of the marker.
  • the present invention describes said “genetic regions of interest”.
  • the invention also relates to a kit and a method allowing the detection of at least one marker specific to the lysis of an organ.
  • the invention further relates to a kit and a method allowing the simultaneous detection of at least two markers for specific detection of lysis of an organ, thus making it possible to further improve the specificity and sensitivity of the test.
  • a test according to the invention also has a strong diagnostic performance.
  • the subject of the invention is therefore a kit and a method for detecting the lysis of an organ chosen from the brain, the lung and the kidney, from a biological sample of a patient.
  • a kit and a method for detecting brain lysis can be used in particular for the in vitro diagnosis of stroke. This kit and this method are based on the detection of at least one marker chosen from “APC2” and “NBR1”. ".
  • the marker chosen from “APC2” and “NBR1”.
  • NBR1 is a marker also designated “KRT33B”.
  • the invention also relates to a kit and a method for detecting lung lysis, usable in particular for the in vitro diagnosis of acute respiratory distress or possible lung graft rejection.
  • This kit and method are based on the detection of the “SYNE1” marker.
  • the “SYNE1” marker is a marker also designated “LINC00336”.
  • the invention also relates to a kit and a method for detecting renal lysis, usable in particular for the in vitro diagnosis of acute renal failure and, in the case of a transplant patient, rejection of renal lysis. graft.
  • This kit and this method are based on the detection of at least one marker chosen from: PAX2, PDE4D, CTDP1, ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2, LINC01599, FLJ12825, ACSL5.
  • the invention also relates to a kit and a method for detecting renal lysis, based on the combination of multiplex detection of at least:
  • total kidney marker chosen from CTDP1
  • Vascular type marker chosen from the markers ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2 and LINC01599 and
  • an “epithelial” type marker chosen from the markers FLJ12825, ACSL5, PAX2 and PDE4D.
  • Solid biopsy, or renal puncture is the gold standard for diagnosing graft rejection. It makes it possible to study certain anatomical structures of the graft at the level of the renal cortex, located on the periphery of the kidney. Depending on the Banff score, graft lesions can be segmented by “vascular” or
  • a kit and a method according to the invention therefore have the great advantage of offering a minimally invasive test, because it is carried out from a biological sample that is easily collected, reliable, rapid and inexpensive. Due to its minimally invasive nature, a method according to the invention can easily, if necessary, be repeated at different stages of the pathology, which allows reliable monitoring of the evolution of said pathology and ensures appropriate medical care. at each of these stages.
  • a kit and a method according to the invention present a major challenge for specialists and pathologists, because the typology of organ lesions, in particular the typology of kidney graft lesions, conditions the final diagnosis and therapeutic management of the patient.
  • the invention also relates to the use of methylated cell-free DNA as a marker of brain, kidney or lung degradation, or of brain, kidney or lung tissue degradation. .
  • the invention also relates to the primers and probes which can be used in a kit and a method according to the invention.
  • the invention aims to:
  • a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19 , SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 52, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences;
  • an antisense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20 , SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50 or SEQ ID No. 53 or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences;
  • a probe optionally labeled, comprising or consisting of a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID N °45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 and SEQ ID No. 54, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences.
  • the subject of the invention is an in vitro method for detecting a pathology or a condition chosen from: stroke, acute respiratory distress syndrome, renal failure and transplant rejection, including rejection of a kidney transplant or lung transplant.
  • the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of at least one target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for an organ chosen from: the brain, lung and kidney or a tissue present in the brain, lung or kidney, said kit comprising at least one pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising, or consisting of in, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA to selectively amplify a sequence of methylated cell-free DNA specific to said organ or tissue.
  • the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of at least one target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said kit comprising at least:
  • each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with at least one nucleotide sequence of said cell-free DNA to selectively amplify a DNA sequence acellular methylated cell specific for said organ or tissue, and
  • a probe comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with the amplified DNA target nucleotide sequence.
  • biological sample we mean an element from the body, human or animal, in particular for example: blood, urine, saliva, plasma or an organ fragment.
  • Said probe called “detection probe” is preferably associated with a marker whose detection is well known to a person skilled in the art. When more than one pair of probes is used (multiplex test), the combination of markers is chosen in order to distinguish the different amplified nucleotide sequences.
  • the present invention relates to a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a cell type of an organ chosen from: the brain, the lung and the kidney, said kit comprising: i) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the brain, at least: a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 5, or a sequence nucleotide presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 5.
  • a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No.
  • an antisense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8, and iii) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in the kidney, at least:
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 10, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 10 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. ll, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. ll, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 13, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 13 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 14, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 14, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 19, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 19 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 20, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 20, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 22, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 22 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 23, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 23, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 25, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 25 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 26, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 26, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 28, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 28 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 29, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 29, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 31, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 31 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 32, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 32, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 34, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 34 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 35, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 35, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 37, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 37 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 38, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 38, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 40, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 40 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 41, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 41, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 43, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 43 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 44, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 44, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 46, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 46 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 47, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 47, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 49, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 49 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 50, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 50, and/or
  • a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 52, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 52 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 53, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 53.
  • a kit according to the invention comprises at least:
  • a kit according to the invention comprises a primer
  • “sense” comprising or consisting of, a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID N °46, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 52, or a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with one of said sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7 , SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No.
  • SEQ ID No. 22 SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 49 or SEQ ID No. 52.
  • a kit according to the invention comprises an “antisense” primer comprising or consisting of, a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50 or SEQ ID No. 53, or a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with one of said nucleotide sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No.
  • SEQ ID No. 8 SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 26 , SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50 or SEQ ID No. 53.
  • a kit according to the invention comprises a probe comprising or consisting of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. °12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39 , SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 and SEQ ID No. 54, or a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with one of said nucleotide sequences chosen from SEQ ID No. 3, SEQ ID No.
  • At least 80% identity we mean that said sequences present at least 80% identity after optimal global alignment, that is to say by global alignment between two sequences giving the highest percentage of identity. identity between them.
  • the optimal overall alignment of two sequences can in particular be carried out according to the Needleman-Wunsch algorithm, well known to those skilled in the art (Needleman & Wunsch, “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins”, J. Mol. Biol., 48(3):443-53).
  • a nucleotide sequence according to the invention comprises, or is constituted by a nucleotide sequence having at least 80%, advantageously at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with the reference nucleotide sequence after optimal global alignment.
  • a nucleotide sequence according to the invention comprises, or is constituted by a nucleotide sequence having at least 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6% , 99.7%, 99.8% or 99.9% identity with the reference nucleotide sequence after optimal global alignment.
  • a nucleotide sequence according to the invention comprising, or consisting of, a sequence having at least 80% identity with the reference nucleotide sequence is functional, that is to say it is capable of hybridizing to the target nucleotide sequence with sufficient stability to allow the amplification or detection of said target nucleotide sequence.
  • nucleotide sequences of a first group of primers are designated as indicated in Table 1 below:
  • nucleotide sequences of a first group of probes are designated as indicated in Table 2 below:
  • the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the brain, said kit comprising at least:
  • a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1
  • an antisense primer comprising, or consisting of, a sequence nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2, and/or
  • a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer, comprising, or consisting of, a sequence nucleotide SEQ ID No. 5, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 5.
  • the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the lung, said kit comprising at least one sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 7 and an antisense primer, comprising , or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8.
  • nucleotide sequences of the primers specific for a cell type present in the kidney are designated as indicated in Table 3 below:
  • nucleotide sequences of the probes specific to a cell type present in the kidney are designated as indicated in Table 4 below:
  • the subject of the invention is a kit which contains the necessary reagents (primers and probes) for the amplification of at least one PCR amplicon of less than ⁇ 85 bp (preferably ⁇ 70 bp ) in a genomic region included among the nucleotide sequences SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70 and SEQ ID No. 71 according to the methylation status of said genomic region.
  • markers used in a kit and a method according to the invention are therefore likely to be classified into markers:
  • vascular type chosen from the markers ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2 and LINC01599,
  • epidermal type chosen from the markers FLJ 12825, ACSL5, PAX2 and PDE4D,
  • total kidney type chosen from CTDP1.
  • the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the kidney, said kit comprising at least:
  • -a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “total kidney type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “total kidney type” marker, and or
  • a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “vascular type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “vascular type” marker, and/ Or
  • a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting an “epithelial type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting an “epithelial type” marker.
  • the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the kidney, said kit comprising at least:
  • -a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “total kidney type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “total kidney type” marker total kidney", said marker being CTDP1 and
  • a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “vascular type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “vascular type” marker, said marker being chosen from GATA2, TNS2-AS1 and
  • a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting an “epithelial type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting an “epithelial type” marker, said marker being chosen from: PAX2, ACSL5 or PDE4D.
  • markers used in a kit and a method according to the invention will now be described in more detail.
  • the names of the markers correspond to the name of the gene on which these markers are located.
  • the “PDE4D” genetic region designates a sequence coding for a protein of the phosphodiesterase family. Its DNA sequence is located on chromosome 5 at position 58,969,038-60,522,128, more specifically at the 5qll.2-ql2.1 locus. It contains 42 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000005.10. It is transcribed into the sequence NM_006203.5.
  • the inventors have identified the DNA region included in chromosome 5 position 59,039,300-59,039,420 (SEQ ID No. 55), as being specifically hyper-methylated in the epithelial fraction. They propose using this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method in particular for diagnosing or identifying kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the “PAX2” genetic region designates a coding sequence for a protein of the box-paired 2 family. Its DNA sequence is located on chromosome 10 at position 100,735,396-100,829,944, more specifically at the 10q24.31 locus. It contains 14 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000010.11. It is transcribed into the sequence NM_000278.5.
  • the inventors have identified the DNA region included in chromosome 10 position 100,828,800-100,829,020 (SEQ ID No. 56), as being specifically hyper-methylated in the epithelial fraction. They propose in particular to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method for diagnosing or identifying renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the genetic region “FLJ12825” designates a complete genomic molecule not coding for proteins. It allows the transcription of long non-coding RNAs and is present at the uncharacterized locus LOC440101 of the FLJ12825 gene. Its DNA sequence is located on chromosome 12 at position 54,058,254-54,122,234, more specifically at the level of the 12ql3.13 locus in an intronic sequence. Its DNA sequence is referred to as NC_000012.12. It is transcribed into 1 RNA variant named NR_026655.1.
  • the present inventors have identified the DNA region included in chromosome 12: Position 54,106,357-54,106,526 (SEQ ID No. 57), as being specifically hyper-methylated in the renal epithelial fraction. They propose in particular to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method for diagnosing or identifying kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the “ALDH1A1” genetic region designates a complete genomic molecule encoding a protein of the type 1 aldehyde dehydrogenase family (Al member). Its DNA sequence is located on chromosome 9 at position 72,900,671-72,953,063, more specifically at locus 9q21.13. It contains 13 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_005224.3. It is transcribed into 1 RNA variant named NM_005224.3. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 9:
  • Position 72,952,933-72,953,059 (SEQ ID No. 58), as being specifically hypermethylated in the renal vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the “ARID3A” genetic region designates a complete genomic molecule encoding a protein from the ARID (AT-rich interaction domain) family of DNA binding proteins. Its DNA sequence is located on chromosome 19 at position 925,732-975,939, more specifically at the 19pl3.3 locus. It contains 12 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000019.10. It is transcribed into 1 RNA variant named NM_000689.5. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 19:
  • Position 940,667-941,160 (SEQ ID No. 59), as being specifically hyper-methylated in the renal vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the genetic region “ACSL5” designates a coding sequence for a protein of the ligase family. Its DNA sequence is located on chromosome 10 at position 112,374,116-112,428,376, more specifically at the 10q25.2 locus. It contains 23 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000010.11. It is transcribed into the sequence NM_016234.4.
  • the gifts inventors have identified the DNA region included in chromosome 10 position 112,376,275-112,376,398 (SEQ ID No. 60), as being specifically hyper-methylated in the epithelial fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a useful kit for such purposes.
  • the “CTDP1” genetic region designates an uncharacterized intronic sequence located between the CTDP1 and KCNG2 gene. Its DNA sequence is located on chromosome 18 between the positions of the CTDP1 (chrl8: 79,756,625-79,787,722) and KCNG2 (chrl8: 79,797,938-79,900,100) genes. It contains 0 exons. Its DNA sequence is not referenced in the NCBI. There is no transcript identified.
  • the present inventors have identified the DNA region included in chromosome 18 position 79,791,700-79,791,820 (SEQ ID No. 61), as being specifically hypermethylated in the total kidney fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the genetic region "GATA2" designates a coding sequence for a protein of the family of zinc finger DNA transcription factors. Its DNA sequence is located on chromosome 3 at position 128,479,422-128,493,201, more specifically at the 3q21.3 locus. It contains 8 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000003.12. It is transcribed into the sequence NM_032638.5.
  • the present inventors have identified the DNA region included in chromosome 3 position 128,491,794-128,492,245 (SEQ ID No. 62), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the genetic region “LOC124903692” designates an uncharacterized and non-protein coding sequence. Its DNA sequence is located on chromosome 16 at position 54,936,014-54,938,671, more specifically at the 16ql2.2 locus. It contains 3 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000016.10. It is transcribed into the sequence XR_007065074.1.
  • the present inventors have identified the DNA region included in chromosome 16 position 54,937,300-54,937,500 (SEQ ID No. 63), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive method, sensitive and reliable for in particular diagnosing or identifying renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the “NRN1” genetic region designates a coding sequence for a protein of the neuritin family. Its DNA sequence is located on chromosome 6 at position 5,997,999-6,007,518, more specifically at the locus
  • NC_000006.12 It is transcribed into the sequence NM_016588.3.
  • the present inventors have identified the DNA region included in chromosome 6 position 5,998,924-5,999,075 (SEQ ID No. 64), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the genetic region “SEPT5-GP1BB” designates a non-coding sequence for proteins. Its DNA sequence is located on chromosome 22 at position 19,717,220-19,724,774, more specifically at the 22qll.21 locus. It contains 12 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000022.11. It is transcribed into the sequence NR_037611.1.
  • the present inventors have identified the DNA region included in chromosome 22 position 19,724,235-19,724,340 (SEQ ID No. 65), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the genetic region “TNS2-AS1” designates a non-coding sequence for proteins. Its DNA sequence is located on chromosome 12 at position 53,043,189-53,054,438, more specifically at the 12ql3.13 locus. It contains 4 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000012.12. It is transcribed into the sequence NR_033854.1.
  • the inventors have identified the DNA region included in chromosome 12 position 53,054,207-53,054,329 (SEQ ID No. 66), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the “RHBDF2” genetic region designates a coding sequence for a protein making it possible to activate the protein transporter activity. Its DNA sequence is located on chromosome 17 at position 76,470,893-76,501,427, more specifically at the 17q25.1 locus. It contains 21 exons. Its DNA sequence is referred as NC_000017.11. It is transcribed into the sequence NM_024599.5.
  • the inventors have identified the DNA region included in chromosome 17 position 76,500,822 -76,500,937 (SEQ ID No. 67), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the genetic region “LINC01599” designates a sequence allowing the transcription of intergenic RNAs not coding for proteins. Its DNA sequence is located on chromosome 14 at position 50,007,313-50,105,043, more specifically at the 14q21.3 locus. It contains 9 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000014.9. It is transcribed into the sequence NR_131171.1.
  • the inventors have identified the DNA region included in chromosome 14 position 50,056,666-50,056,758 (SEQ ID No. 68), as being specifically hypomethylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
  • the “APC2” genetic region designates a complete genomic molecule sequence coding for a protein of the APC family of regulators of the Wnt pathway. Its DNA sequence is located on chromosome 19 at position 1,446,230-1,473,244, more specifically at the 19pl3.3 locus. It contains 17 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000019.10. It is transcribed into the sequence NM_005883.3. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 19 position 1,467,853-1,468,054 (SEQ ID No. 69), as being specifically hypermethylated in neurons.
  • the “NBR1” genetic region designates a complete genomic molecule coding for a protein of the family of specific autophagy receptors. Its DNA sequence is located on chromosome 17 at position 43,170,409-43,211,900, more specifically at the 17q21.31 locus. It contains 23 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000017.11. It is transcribed into the sequence NM_005899.5. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 17 position 43,211,655-43,211,856 (SEQ ID No.
  • the “SYNE1” genetic region designates a complete genomic molecule coding for a nuclear envelope protein containing spectrin repeat sequences. Its DNA sequence is located on chromosome 6 at position 152,121,687-152,637,362, more specifically at the 6p25.2 locus. It contains 153 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000006.12. It is transcribed into the sequence NM_033071.5.
  • the inventors have identified the DNA region included in chromosome 6 position 152,302,152-152,302,353 (SEQ ID No. 71), as being specifically hyper-methylated in pulmonary pneumocytes/alveoli. They therefore propose using this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method, in particular to diagnose or identify ARDS, or in a kit useful for such purposes.
  • a kit according to the invention optionally comprises one or more pairs of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, intended to detect the presence of a control element in the biological sample.
  • This control element can be any appropriate element chosen by a person skilled in the art. Said control element may in particular be albumin.
  • a kit according to the invention may comprise a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 16, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 16 and a primer antisense, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 17, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 17.
  • the subject of the invention is a method for identifying a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in a first organ chosen from: the lung, the brain and the kidney, the method comprising at least the following steps: a) Determination, in at least one genomic DNA methylation database, of the position and degree of methylation of CpG islands of sequences specific to said cell type of said organ, b) Identification, in the genomic DNA of said cell type of said healthy organ, of specifically hypermethylated CpG islands, c) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of a second cell type, different from the first cell type, d) Selection of the CpG islands only hypermethylated in the genomic DNA of said cell type of said first organ after comparison carried out in step c), e) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ
  • the invention also relates to a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA identified by means of a method according to the invention, for its use in the detection of the lysis of an organ chosen from the brain, the lung and kidney, from a biological sample from a patient.
  • the subject of the invention is a method for detecting, in a biological sample, a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for an organ chosen from: the lung , the brain and the kidney, or a tissue present in the brain, the lung or the kidney, said method comprising at least the following steps: a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, b) Amplification reaction of said target sequence, c) Detection of the presence of the amplified sequence during step b).
  • Cell-free DNA is extracted using a commercial kit, well known to those skilled in the art and requires the presence of at least 0.15 ng/mL of target DNA in the urine or plasma sample.
  • the amplification reaction is carried out using any technique or protocol well known to those skilled in the art. Among the non-limiting examples of these techniques, we can cite: amplification by PCR, amplification by digital PCR (dPCR), next generation sequencing.
  • dPCR digital PCR
  • the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the brain.
  • the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the brain, said method comprising at least the following steps: a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers constituted by a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 1 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1) and an antisense primer SEQ ID No.
  • a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 4 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4) and a antisense primer SEQ ID No. 5 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No.
  • each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or else brought into contact, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, b) Amplification reaction of said target sequence, c) Detection of the presence of the amplified sequence during the step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 6, respectively depending on the primer pairs used.
  • the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the lung, said method comprising at least the following steps:
  • a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 7 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 7) and an antisense primer SEQ ID No. 8 (or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No.
  • each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable to hybridize with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or brought into contact, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, b) Amplification reaction of said target sequence, c) Detection of the presence of the sequence amplified during step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 9.
  • the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the kidney, said method comprising at least the following steps:
  • a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 10 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 10) and an antisense primer SEQ ID No. 11 (or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. ll), or else
  • a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 13 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 13) and an antisense primer SEQ ID No. 14 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 14), each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or else implemented presence, under conditions suitable for amplification of nucleic acids,
  • step b Detection of the presence of the sequence amplified during step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 12 or SEQ ID No. 15, respectively depending on the pairs of primers used .
  • the diagnostic tests described are part of an analytical process composed of 2 preliminary steps: extraction of circulating DNA and epigenetic conversion (by bisulfite, enzymatic reaction).
  • the diagnostic tests are compatible with various circulating DNA extraction kits such as the QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID: 55114 (Qiagen); EZ1&2 ccfDNA Kit (48)Cat. No. I ID: 954854 (Qiagen); MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit (Reference: A29319, Thermofisher); Automated High-Throughput Extraction of Cell-Free DNA from Plasma, Serum, Urine and CSF (Ref: A6030, Promega).
  • the cell-free DNAs are assayed by Qubit 4.0TM fluorimetry (InvitrogenTM kit HS dsDNA assay kits QubitTM (Reference: Q32851)) then undergo a bisulfite conversion with the commercial Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) or enzymatic equivalent (NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Conversion Module (Reference E7125S / E7125L)).
  • the samples are then analyzed by droplet digital PCR (Naica System (STILLA Technologies)) (also compatible with commercial equivalents such as the QIAcuity Digital PCR System - QIAGEN and QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).
  • droplet digital PCR Naica System (STILLA Technologies)
  • ddPCR Droplet Digital PCR
  • the inventors determine typical metrological parameters, including repeatability, reproducibility and sensitivity of the test. To quantify renal degradation, at least 1 of the markers is required. Detection with two markers reinforces the biological data.
  • the detection of several markers per category among the “whole kidney”, “vascular type” and “epithelial type” markers strengthens the biological data.
  • the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of brain degradation and/or for in vitro diagnosis and /or the prognosis, and/ormonitoring the evolution of a stroke and/or therapeutic optimization of the stroke patient.
  • the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of lung degradation and/or for in vitro diagnosis and /or the prognosis, and/or the monitoring of the evolution of an acute respiratory distress syndrome and/or the therapeutic optimization of the patient suffering from an acute respiratory distress syndrome.
  • the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of kidney degradation and/or for in vitro diagnosis and /or prognosis, and/or screening and/or monitoring of the evolution of a kidney transplant rejection/dysfunction and/or an episode of acute renal failure and/or therapeutic optimization of the patient suffering from renal graft rejection/dysfunction and/or acute renal failure.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence chosen from:
  • a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19 , SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 52, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences;
  • an antisense primer comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. °23, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47 , SEQ ID No. 50 and SEQ ID No. 53, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences; And
  • a probe comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 and SEQ ID No. 54, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences.
  • the invention aims to diagnose, or monitor the deterioration of an organ chosen from the brain, the lung and the kidney, comprising the following steps:
  • Figure 1 shows the proportion of neurons labeled when using the anti-NeuN marker (left), the APC2 marker (center), and the NBR1 marker (right).
  • Figure 2 represents the normalized data of the mean of the NBR1 and APC2 markers, on a logarithmic scale in the case of TIA (left), and stroke (right).
  • Figure 3 represents the quantity of renal markers in plasma (in ng/ml) in the case of patients at high risk of graft rejection (left histograms) or at low risk of graft rejection (right histograms ), for the markers PDE4D (white) and PAX2 (black).
  • Figure 4 represents the fraction of circulating DNA of renal origin, out of the total DNA circulating in plasma (in %) in the case of patients at high risk of graft rejection (left histograms) or at low risk of graft rejection (right histograms), for the markers PDE4D (white) and PAX2 (black).
  • Figure 5 represents the quantity of renal markers in ng/ml of urine in the case of patients with graft rejection (left histograms) or without graft rejection (right histograms), for PDE4D markers (white ) and PAX2 (black).
  • Figure 6 represents the correlation between the histological marking TTF-1 (x-axis) and the use of the SYNE1 marker (y-axis) according to the invention.
  • Figure 7 shows the discrimination between subgroups of patients with moderate ARDS (left), severe ARDS (center), or critical ARDS (right) based on the results obtained with the SYNE1 marker (ordinate).
  • Figures 8A and 8B respectively represent: (A) the detection of the markers SEPT5/GATA2, PDE4D, CTDP1, PAX2 and TNS2-AS1/ACSL5 in 100% methylated DNA; (B) detection of the markers SEPT5/GATA2, PDE4D, CTDP1, PAX2 and TNS2-AS1/ACSL5 in unmethylated DNA, i.e. the negative control, the results showing an absence of detection in the Unmethylated DNA.
  • Figure 9 represents the relative quantification of the markers SEPT5, GATA2, TNS2-AS1, PDE4D, ACSL5, PAX2 and CTDP1, with normalization by the ubiquitous marker albumin (internal control corresponding to the number of total genomes present in the sample) in genomic DNA (gDNA) samples extracted from healthy tissues: kidney, liver, white blood cells, circulating plasma DNA and circulating urinary DNA.
  • CD10 is a histological marker of the renal epithelium.
  • PAX2 and ACSL5 are molecular markers specifically targeting the renal epithelium.
  • Figure 13 represents the significant difference in quantification of the CTDP1 marker in urine between patients with graft rejection and those without renal graft rejection (left histogram) and a logistic regression model compiling the data quantitative biomarkers CTDP1, PAX2, PDE4D, ACSL5 and SEPT5 to predict the presence or absence of graft rejection (right graph)
  • Figure 14 represents the significant difference in quantification of the CTDP1 biomarker in plasma between patients with graft rejection (with tissue damage on the graft) and those without renal graft rejection (without tissue damage on the graft).
  • graft (left histogram) and a logistic regression model compiling quantitative data for the biomarkers CTDP1, GATA2, TNS2-AS1, PAX2 and PDE4D to predict the presence or absence of graft rejection (right graph).
  • Figure 15 represents the significant difference in quantification of the GATA2 biomarker in plasma between patients with vascular graft lesions and those without vascular graft lesions (left graph) and a logistic regression model compiling the data quantitative biomarkers CTDP1, GATA2, and TNS2-ASl to predict the presence or absence of vascular lesions on the graft (right graph).
  • the inventors selected unmethylated positions in the DNA from white blood cells, PBMCs and immune cells, based on an analysis of data from whole blood.
  • the inventors then detected hypermethylated and/or hypomethylated CpG islands in healthy tissue, in a database established from healthy lung tissue. This data was separated into a discovery (“training”) dataset and a validation (“test”) dataset.
  • EXAMPLE 2 Validation of biomarkers of neuronal degradation in the management of stroke in the acute phase [120]
  • the validation of the biomarkers according to the invention comprises the following steps:
  • the cell-free DNA is first extracted by a commercial extraction process dedicated to cell-free DNA via QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Reference Cat. No. I ID: 55114, Qiagen).
  • the cell-free DNA is assayed by Qubit 4.0TM fluorometry (InvitrogenTM HS QubitTM dsDNA Assay Kits (Reference: Q32851)) then undergoes a bisulfite conversion with the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031). ) or commercial equivalent.
  • the samples are then analyzed by droplet digital PCR (System Naica (STILLA Technologies)).
  • the plates are read according to the following acquisition setting: 120 ms FAM channel (blue) - 180 ms HEX/VIC channel (green) - 38 ms Cy5 channel (Red)) for reading with the STILLA Naica system Technology.
  • Validation of the digital PCR test The digital PCR test is then validated on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA.
  • Step 1 Bisulfite conversion by the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then Step 2: Analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers NBR1 and APC2.
  • results on the 100% methylated DNA controls show that the epigenetic markers targeted on the NBR1 and APC2 genes are well detected and quantifiable by the test according to the invention.
  • results on the unmethylated DNA controls show that the developed NBR1 and APC2 markers are indeed detectable if and only if the targeted regions are hypermethylated. There is no detection of markers in unmethylated DNA controls.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the DNA samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers NBR1 and APC2 according to the invention described.
  • the results show very low biological noise in genomic DNA tissues other than tissues of brain origin. If the two biomarkers APC2 and NBR1 are taken into account, the biological noise is less than 2%.
  • the results of the test for the epigenetic markers tested show that it presents negligible or even absent biological noise at the level of the genomic DNA from the different tissue sections (other than the brain).
  • a positive control is carried out on genomic DNA samples from tissue sections of healthy brain tissue, by comparison with anti-NeuN histological staining.
  • the neuronal cells marked by the anti-NeuN antibody were counted by the “HALO® image analysis” precision software.
  • the genomic DNAs from the tissue chips of brain origin were extracted using the “Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit” (50) (Cat. No. / ID: 56604).
  • the DNA samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers NBR1 and APC2 according to the invention described.
  • the neuronal markers APC2 and NBR1 are identified in 12 samples out of 12 samples tested.
  • a test according to the invention makes it possible to stratify patients suffering from stroke according to its severity index.
  • Results show an elevation in the quantitative mean of APC2 and NBR1 markers in patients with acute ischemic stroke (CVA) compared to patients with ischemic stroke transient (AIT) (respective average of 11.32 copies/ml of plasma for AIT versus 75 copies/ml of plasma for AIA).
  • CVA acute ischemic stroke
  • AIT ischemic stroke transient
  • EXAMPLE 3 Validation of a first group of biomarkers of renal degradation in the management of kidney transplant patients [140]
  • the validation of the biomarkers PDE4D and PAX2 includes the molecular analysis of the conversion of DNA to PCR tests droplet digitalis, the design of the Taqman-mgb primers and probes (Reference: PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 and PB-MGBEH-006, Eurogentec) are identical to that described in example 2 (see: Methodology common part analysis).
  • the implementation of the PCR amplification reaction includes the preparation of the specific primer-probe cocktail is presented in the following Table 12.
  • the inventors determine typical metrological parameters, including test repeatability and sensitivity.
  • the test is repeatable with a coefficient of variation of 4.5% and 0.6% for the Pax2 and PDE4D markers respectively.
  • the test is sensitive to 0.01% and allows quantification up to a limit of 0.15 ng and 0.3 ng of DNA respectively for the PDE4D and Pax2 markers.
  • the samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the renal markers PDE4D and Pax2 according to the invention described.
  • the negative results of the test for the epigenetic markers PDE4D and Pax2 show that these were not detected in the genomic DNAs from tissue sections other than the kidney, confirming the absence of biological noise.
  • a positive control is carried out on genomic DNA samples from tissue sections of healthy kidney tissue. 12 healthy kidney tissue samples were collected from the pathology department of the Nursings Civils de Lyon Sud et Est. Genomic DNAs from the tissue chips were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the renal markers PDE4D and Pax2 according to the invention described.
  • the renal markers PDE4D and Pax2 are identified in 12 samples out of 12 samples tested. Thus, this work confirms the renal specificity of the PDE4D and Pax2 digital PCR test described.
  • EXAMPLE 4 Validation of the SYNE1 biomarker of pulmonary degradation in the management of acute respiratory failure
  • Step 1 Bisulfite conversion using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then Step 2: System Naica digital PCR analysis of the lung marker SYNE1.
  • results on the 100% methylated DNA controls show that the epigenetic marker targeted on the SYNE1 gene is indeed detected and quantifiable by a test according to the invention using this marker.
  • results on the unmethylated DNA controls show that the developed SYNE1 marker is indeed detectable if and only if the targeted regions are hypermethylated. There is no detection of the marker in the unmethylated DNA controls.
  • genomic DNA from PBMC white blood cells
  • 10 genomic DNA samples were extracted from white blood cell pellets of healthy subjects using the Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID: 51104.
  • the samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker SYNE1 according to the invention described.
  • the marker is not detected when analyzing genomic DNA from PBMCs
  • the samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker SYNE1 according to the invention described.
  • the negative results of the test for the epigenetic marker SYNE1 show that it was not detected in the genomic DNAs from tissue sections other than the lung, confirming the absence of biological noise.
  • the genomic DNAs from the 8 ⁇ m thick tissue chips prepared in paraffin were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604).
  • the samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker SYNE1 according to the invention described.
  • results of the test according to the invention make it possible to monitor the pulmonary condition of a patient suffering from ARDS with correlation indicators between the quantitative result of the hypermethylated target SYNE1 and the ventilatory markers 02 max / FiO2 / PAO2 (Pearson correlation coefficient of 0.44, 0.29 and 0.29, respectively).
  • EXAMPLE 5 Validation of a second group of biomarkers of renal degradation in the management of kidney transplant patients
  • SEPT5 markers glomerular endothelial marker
  • PDE4D / PAX2 / ACSL5 tubular epithelial marker
  • CTDP1 total kidney marker
  • GATA2 markers renal endothelial marker
  • TNS2-AS1 renal capillary endothelial marker
  • PDE4D renal capillary endothelial marker
  • PAX2 tubular epithelial marker
  • CTDP1 total kidney marker
  • the “Albumin” marker is used as a ubiquitous marker quantifying all the genomes present in the sample.
  • the biological samples were obtained through hospital partners from the nephrology departments of Necker and the Tenon-Pitié-Salpêtrière hospital.
  • Genomic DNA from the liver as well as white blood cells are controls evaluated in the design of this test and this methodology because they are contributors to circulating urinary and plasma DNA in healthy subjects.
  • N 20 genomic DNA samples extracted from cell pellets of healthy subjects
  • N 30 plasma DNA samples from healthy subjects
  • N 15 urinary DNA samples from healthy subjects
  • N 5 genomic DNA samples extracted from tissue sections (5 liver gDNA).
  • gDNAs have been mentioned as potential low-noise contributors to circulating DNA in healthy subjects: respectively urinary cf-DNA and plasma cf-DNA 5.
  • the “total kidney” marker CTDP1 makes it possible to quantify the endothelial and epithelial fractions of the kidney. It is found in higher quantities in kidney genomic DNA compared to markers targeting only the epithelial and endothelial fraction. Likewise, the markers targeting the endothelial fraction of the kidney (GATA2) are found in greater quantities than the markers TNS2-AS1 and SEPT5 targeting respectively smaller vascular fractions (restricted respectively to the glomerulus and the tubule).
  • Example 6 Validation of the specificity of renal epithelial markers: Comparison of molecular markers (PAX2/ACSL5) and the histological marker of renal epithelium CD10
  • TCMR cellular type graft rejection
  • Figure 13 shows the significant difference in quantification of the CTDP1 biomarker in urine between patients with graft rejection and those without renal graft rejection (left graph).
  • Logistic regression model compiling quantitative data for biomarkers CTDP1, PAX2, PDE4D, ACSL5 and SEPT5 to predict the presence or absence of graft rejection (right graph).
  • Example 8 Analysis on plasma samples from kidney transplant patients

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Abstract

The present invention relates to a kit and an in vitro method for detecting and characterizing the degradation of a particular organ or tissue, on the basis of the analysis of the presence of at least one specific methylated cell-free DNA in a biological sample. More particularly, the invention relates to a kit and a method for detecting and characterizing the degradation of an organ selected from: the brain, the lung and the kidney, and/or of a tissue present in this organ. The invention also relates to a method for the in vitro diagnosis of a disease or condition involving the lysis of an organ or tissue.

Description

DESCRIPTION DESCRIPTION
Titre : PROCEDE DE CARACTERISATION DE LA DEGRADATION D'UN ORGANE Title: METHOD FOR CHARACTERIZING THE DEGRADATION OF AN ORGAN
Domaine de l'invention Field of the invention
[1] La présente invention a pour objet un kit et un procédé in vitro de détection et de caractérisation de la dégradation d'un organe ou d'un tissu particulier, fondé sur l'analyse de la présence d'au moins un ADN acellula ire méthylé spécifique dans un échantillon biologique. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un kit et un procédé de détection, et de caractérisation de la dégradation 1) du cerveau au cours d'un épisode d'accident vasculaire cérébral, 2) du poumon au cours d'un épisode de syndrome de détresse respiratoire aiguë et 3) du rein au cours d'un épisode d'insuffisance rénale aiguë et/ou un épisode de rejet et/ou de dysfonctionnement du greffon rénal. L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une pathologie ou d'une condition impliquant la lyse d'un organe ou d'un tissu. [1] The subject of the present invention is a kit and an in vitro method for detecting and characterizing the degradation of a particular organ or tissue, based on the analysis of the presence of at least one acellular DNA. specific methylated ire in a biological sample. More particularly, the subject of the invention is a kit and a method for detecting and characterizing the degradation 1) of the brain during an episode of stroke, 2) of the lung during an episode of acute respiratory distress syndrome and 3) of the kidney during an episode of acute renal failure and/or an episode of rejection and/or dysfunction of the renal graft. The invention also relates to a method for in vitro diagnosis of a pathology or a condition involving the lysis of an organ or tissue.
[2] La présente invention se situe donc dans le domaine de la biologie moléculaire appliquée au diagnostic médical. [2] The present invention therefore lies in the field of molecular biology applied to medical diagnosis.
Etat de la technique State of the art
[3] Lors de la prise en charge d'un patient atteint d'une pathologie en phase aiguë, une analyse par imagerie médicale, telle qu'un scanner, une radiographie ou une IRM, est réalisée afin d'établir de façon globale le niveau de souffrance et d'atteinte lésionnelle du patient. Ce type d'examen ne permet pourtant pas de distinguer la lyse organique elle-même d'une atteinte de type inflammatoire. Pourtant, le pronostic et l'intervention thérapeutique réalisés par le personnel médical sont très différents selon la nature de l'atteinte de l'organe ou du tissu. De plus, en cas de phase aigüe, des décisions de prise en charge doivent être prises dans un délai extrêmement court. [3] When treating a patient suffering from a pathology in the acute phase, an analysis by medical imaging, such as a CT scan, an x-ray or an MRI, is carried out in order to globally establish the level of suffering and injury to the patient. However, this type of examination does not make it possible to distinguish organic lysis itself from an inflammatory type of attack. However, the prognosis and therapeutic intervention carried out by medical personnel are very different depending on the nature of the damage to the organ or tissue. In addition, in the event of an acute phase, treatment decisions must be made within an extremely short period of time.
[4] Certaines pathologies aigües et relativement répandues ont pour caractéristique commune d'impliquer une lyse tissulaire massive. [4] Certain acute and relatively widespread pathologies have the common characteristic of involving massive tissue lysis.
[5] C'est le cas notamment de l'accident vasculaire cérébral (AVC), dans lequel le tissu cérébral est dégradé, du syndrome de détresse respiratoire aigüe, dans lequel le tissu pulmonaire est dégradé, de l'insuffisance rénale aigue (IRA) d'un rein natif et d'un rein transplanté lors de l'apparition d'un rejet de greffe ou d'un dysfonctionnement du greffon rénal, dans lequel le tissu rénal est dégradé. [6] Par ailleurs, dans le cas de la transplantation rénale, il est essentiel de surveiller l'éventuelle survenue d'un rejet/dysfonctionnement du greffon. Actuellement, le suivi post-opératoire des patients greffés implique une surveillance douloureuse et lourde pour le patient. [5] This is particularly the case for cerebrovascular accident (CVA), in which brain tissue is degraded, acute respiratory distress syndrome, in which lung tissue is degraded, and acute renal failure (AKI). ) of a native kidney and a transplanted kidney when graft rejection or kidney graft dysfunction occurs, in which kidney tissue is degraded. [6] Furthermore, in the case of kidney transplantation, it is essential to monitor the possible occurrence of graft rejection/dysfunction. Currently, post-operative follow-up of transplant patients involves painful and burdensome monitoring for the patient.
[7] Du fait de l'incidence de l'ensemble de ces pathologies parmi la population, il existe un besoin d'outils permettant de détecter de façon fiable, rapide, simple et peu coûteuse l'éventuelle tissulaire dans le cadre de ces différentes pathologies aigües. [7] Due to the incidence of all of these pathologies among the population, there is a need for tools to reliably, quickly, simply and inexpensively detect possible tissue damage in the context of these different acute pathologies.
[8] L'ADN acellulaire circulant, également désigné par « ADN libre » est connu de façon générale en tant que marqueur tumoral, mais aussi marqueur d'inflammation et marqueur de stress tissulaire. Les cellules immunitaires contribuent majoritairement à l'élévation de la quantité totale d'ADN circulant. [8] Circulating cell-free DNA, also referred to as “free DNA,” is generally known as a tumor marker, but also an inflammation marker and a tissue stress marker. Immune cells mainly contribute to the increase in the total quantity of circulating DNA.
[9] Il a été montré que l'ADN circulant peut éventuellement être utilisé comme biomarqueur potentiel de maladies auto-immunes de type lupus érythémateux systémique ou la polyarthrite rhumatoïde (Duvvuri et al., « Cell-free DNA as a biomarker in autoimmune rheumatic diseases », Front. Immunol. 10, 2019). [9] It has been shown that circulating DNA can potentially be used as a potential biomarker for autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis (Duvvuri et al., “Cell-free DNA as a biomarker in autoimmune rheumatic diseases”, Front. Immunol. 10, 2019).
[10] L'utilisation, chez un sujet sain, de la caractérisation du profil de méthylation de l'ADN circulant pour identifier l'origine tissulaire dudit ADN circulant a été décrite (Moss et al « Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease », Nat. Commun., 9, 1-12, 2018). [10] The use, in a healthy subject, of the characterization of the methylation profile of circulating DNA to identify the tissue origin of said circulating DNA has been described (Moss et al “Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease”, Nat. Commun., 9, 1-12, 2018).
[11] L'augmentation de la proportion d'ADN circulant issu des hépatocytes chez des patients atteints de maladie inflammatoire du foie a été décrite, les cellules immunitaires contribuant majoritairement à la quantité d'ADN circulant totale (Liu et al [11] The increase in the proportion of circulating DNA from hepatocytes in patients with inflammatory liver disease has been described, with immune cells contributing the majority to the total circulating DNA quantity (Liu et al
(« Comprehensive DNA methylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing », Clin. Epigenetics, 11, 93 2019). (“Comprehensive DNA methylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing”, Clin. Epigenetics, 11, 93 2019).
[12] WO 2021/216985 « Methods for detecting tissue damage, graft versus host disease and infections using cell-free DNA profiling » divulgue la détection de la dégradation d'un tissu par l'établissement d'un profil de l'ADN circulant dans le cadre de la transplantation de cellules hématopoïétiques allogènes. [12] WO 2021/216985 “Methods for detecting tissue damage, graft versus host disease and infections using cell-free DNA profiling” discloses the detection of tissue degradation by establishing a profile of circulating DNA in the context of transplantation of allogeneic hematopoietic cells.
[13] Le document CN 113999901 « Myocardial specific methylation marker » décrit l'identification et l'utilisation d'un marqueur cardiaque spécifique de l'ADN cellulaire méthylé pour le diagnostic d'un infarctus aigu du myocarde, à partir d'un échantillon de plasma. [14] WO2019012544 (Al) « DUAL-PROBE DIGITAL DROPLET PCR STRATEGY FOR SPECIFIC DETECTION OF TISSUE-SPECIFIC CIRCULATING DNA MOLECULES" décrit une méthode de PCR digitale en gouttelettes permettant d'analyser l'état de méthylation de sites de méthylation d'une molécule d'ADN double brin qui comprend au moins deux sites de méthylation par simple brin de la molécule d'ADN double brin à partir d'un échantillon d'un fluide biologique comme le plasma ou l'urine [13] Document CN 113999901 “Myocardial specific methylation marker” describes the identification and use of a cardiac marker specific for methylated cellular DNA for the diagnosis of an acute myocardial infarction, from a sample of plasma. [14] WO2019012544 (Al) “DUAL-PROBE DIGITAL DROPLET PCR STRATEGY FOR SPECIFIC DETECTION OF TISSUE-SPECIFIC CIRCULATING DNA MOLECULES” describes a droplet digital PCR method making it possible to analyze the methylation state of methylation sites of a double-stranded DNA molecule that includes at least two methylation sites per single strand of the double-stranded DNA molecule from a sample of a biological fluid such as plasma or urine
[15] WO2019012543 (Al) « DNA TARGETS AS TISSUE-SPECIFIC METHYLATION MARKERS" décrit une méthode générale permettant de déterminer l’état de dégradation d'un tissu au cours d'un processus pathologique à partir de l'étude des sites de méthylation d’une molécule d’ADN circulant à partir d'un fluide biologique comme le plasma ou l'urine. [15] WO2019012543 (Al) “DNA TARGETS AS TISSUE-SPECIFIC METHYLATION MARKERS” describes a general method for determining the state of degradation of a tissue during a pathological process based on the study of methylation sites of a DNA molecule circulating from a biological fluid such as plasma or urine.
Exposé de l'invention Presentation of the invention
[16] Les inventeurs ont mis au point un kit et un procédé de détection spécifique et ciblé de l'ADN acellulaire méthylé circulant présent dans un échantillon biologique d'un individu et spécifique du cerveau, du poumon ou du rein. Un procédé selon l'invention permet de détecter spécifiquement l'existence d'une lyse massive d'un de ces organes ou d'un tissu particulier qui le compose au niveau de sa fraction vasculaire ou épithéliale. De plus, ce procédé permet de distinguer la lyse d'un organe d'un phénomène inflammatoire d'origine immunitaire. La distinction d'une atteinte épithéliale ou vasculaire ainsi que l'identification d'une lyse organique plutôt qu'un phénomène inflammatoire d'origine purement immunitaire est majeure pour le diagnostic du patient et ne peut être discriminée par imagerie médicale. [16] The inventors have developed a kit and a method for specific and targeted detection of circulating methylated cell-free DNA present in a biological sample of an individual and specific to the brain, lung or kidney. A method according to the invention makes it possible to specifically detect the existence of massive lysis of one of these organs or of a particular tissue which composes it at the level of its vascular or epithelial fraction. In addition, this process makes it possible to distinguish the lysis of an organ from an inflammatory phenomenon of immune origin. The distinction between epithelial or vascular damage as well as the identification of organic lysis rather than an inflammatory phenomenon of purely immune origin is essential for the diagnosis of the patient and cannot be discriminated by medical imaging.
[17] Pour deux de ces organes, à savoir le poumon et le cerveau, les inventeurs ont en effet sélectionné, parmi différentes régions spécifiquement hyperméthylées ou hypométhylées de l'ADN circulant, au moins une région permettant de développer un test sensible et spécifique de la dégradation dudit organe. [17] For two of these organs, namely the lung and the brain, the inventors have in fact selected, among different specifically hypermethylated or hypomethylated regions of circulating DNA, at least one region making it possible to develop a sensitive and specific test of the degradation of said organ.
[18] Pour un de ces organes, à savoir le rein, les inventeurs ont en outre sélectionné, parmi différentes fractions spécifiquement hyperméthylées ou hypométhylées de l'ADN circulant, au moins trois fractions différentiellement méthylées dans l'épithélium rénal, l'endothélium rénal et le rein total, ces régions peuvent être désignées respectivement par « rein total », la « fraction vasculaire rénale » et la « fraction épithéliale rénale » permettant de développer un test sensible et spécifique de la dégradation dudit organe. [19] Les inventeurs ont ainsi conçu, pour chacune de ces régions, une paire d'amorces d'amplification sélective, des conditions d'amplification et une sonde détectant spécifiquement le produit d'amplification généré en utilisant ladite paire d'amorces. [18] For one of these organs, namely the kidney, the inventors have further selected, from different specifically hypermethylated or hypomethylated fractions of circulating DNA, at least three fractions differentially methylated in the renal epithelium, the renal endothelium and the total kidney, these regions can be designated respectively by “total kidney”, the “renal vascular fraction” and the “renal epithelial fraction” making it possible to develop a sensitive and specific test for the degradation of said organ. [19] The inventors have thus designed, for each of these regions, a pair of selective amplification primers, amplification conditions and a probe specifically detecting the amplification product generated using said pair of primers.
[20] Les inventeurs ont également identifié, autour de chacune des séquences nucléotidiques sélectivement amplifiée par une paire d'amorces telle que décrite ci- dessus, une région génétique d'intérêt incluant la séquence nucléotidique amplifiée, ladite région génétique étant de taille supérieure à celle du marqueur. La présente invention décrit lesdites « régions génétiques d'intérêt ». [20] The inventors have also identified, around each of the nucleotide sequences selectively amplified by a pair of primers as described above, a genetic region of interest including the amplified nucleotide sequence, said genetic region being of size greater than that of the marker. The present invention describes said “genetic regions of interest”.
[21] Pour chacun des marqueurs, un kit de détection et un procédé de détection sont ainsi fournis. [21] For each of the markers, a detection kit and a detection method are thus provided.
[22] L'invention a aussi pour objet un kit et un procédé permettant la détection d'au moins un marqueur spécifique de la lyse d'un organe. L'invention a de plus pour objet un kit et un procédé permettant la détection simultanée d'au moins deux marqueurs de détection spécifique de la lyse d'un organe, permettant ainsi d'améliorer encore la spécificité et la sensibilité du test. Un test selon l'invention présente également une forte performance diagnostique. [22] The invention also relates to a kit and a method allowing the detection of at least one marker specific to the lysis of an organ. The invention further relates to a kit and a method allowing the simultaneous detection of at least two markers for specific detection of lysis of an organ, thus making it possible to further improve the specificity and sensitivity of the test. A test according to the invention also has a strong diagnostic performance.
[23] L'invention a donc pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse d'un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, à partir d'un échantillon biologique d'un patient. Un kit et un procédé de détection de la lyse cérébrale sont utilisables notamment pour le diagnostic in vitro de l'AVC. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection d'au moins un marqueur choisi parmi « APC2 » et « NBR1 ». ». Le marqueur[23] The subject of the invention is therefore a kit and a method for detecting the lysis of an organ chosen from the brain, the lung and the kidney, from a biological sample of a patient. A kit and a method for detecting brain lysis can be used in particular for the in vitro diagnosis of stroke. This kit and this method are based on the detection of at least one marker chosen from “APC2” and “NBR1”. ". The marker
« NBR1 » est un marqueur également désigné par « KRT33B ». “NBR1” is a marker also designated “KRT33B”.
[24] L'invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse pulmonaire, utilisables notamment pour le diagnostic in vitro de la détresse respiratoire aigüe ou d'un éventuel rejet de greffon pulmonaire. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection du marqueur « SYNE1 » ». Le marqueur « SYNE1 » est un marqueur également désigné par « LINC00336 ». [24] The invention also relates to a kit and a method for detecting lung lysis, usable in particular for the in vitro diagnosis of acute respiratory distress or possible lung graft rejection. This kit and method are based on the detection of the “SYNE1” marker. The “SYNE1” marker is a marker also designated “LINC00336”.
[25] L'invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse rénale, utilisables notamment pour le diagnostic in vitro de l'insuffisance rénale aigue et, dans le cas d'un patient greffé, du rejet de la greffe. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection d'au moins un marqueur choisi parmi : PAX2, PDE4D, CTDP1, ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2, LINC01599, FLJ12825, ACSL5. [26] Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse rénale, fondés sur la combinaison de la détection en multiplexage d'au moins : [25] The invention also relates to a kit and a method for detecting renal lysis, usable in particular for the in vitro diagnosis of acute renal failure and, in the case of a transplant patient, rejection of renal lysis. graft. This kit and this method are based on the detection of at least one marker chosen from: PAX2, PDE4D, CTDP1, ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2, LINC01599, FLJ12825, ACSL5. [26] According to a particular embodiment, the invention also relates to a kit and a method for detecting renal lysis, based on the combination of multiplex detection of at least:
- un marqueur « rein total » : choisi parmi CTDP1 - a “total kidney” marker: chosen from CTDP1
- un marqueur de type « Vasculaire » : choisi parmi les marqueurs ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2 et LINC01599 et- a “Vascular” type marker: chosen from the markers ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2 and LINC01599 and
- un marqueur de type « épithélial » : choisi parmi les marqueurs FLJ12825, ACSL5, PAX2 et PDE4D. - an “epithelial” type marker: chosen from the markers FLJ12825, ACSL5, PAX2 and PDE4D.
[27] L'augmentation du nombre de marqueurs détectés simultanément par une analyse en multiplexage garantit une meilleure performance clinique du test en matière de diagnostic, de dépistage, d'optimisation thérapeutique et de suivi du patient. [27] Increasing the number of markers detected simultaneously by multiplex analysis guarantees better clinical performance of the test in terms of diagnosis, screening, therapeutic optimization and patient monitoring.
[28] La biopsie solide, ou ponction rénale, est la méthode de référence pour diagnostiquer le rejet de greffe. Elle permet d'étudier certaines structures anatomiques du greffon au niveau du cortex rénal, situé en périphérie du rein. En fonction du score de Banff, les lésions du greffon peuvent être segmentées par typologie « vasculaire » ou[28] Solid biopsy, or renal puncture, is the gold standard for diagnosing graft rejection. It makes it possible to study certain anatomical structures of the graft at the level of the renal cortex, located on the periphery of the kidney. Depending on the Banff score, graft lesions can be segmented by “vascular” or
« épithéliale ». L'étude de ces lésions combinées à l'observation d'infiltrats immunitaires permettent de poser le diagnostic typologique de rejet de greffe rénal comme suit : « pas de rejet », « Rejet de type cellulaire médié par les lymphocytes (TCMR) », « Rejet de type humoral médié par les anticorps (ABMR) » et « Rejet mixte combinant les deux types de rejet ». En fonction de la typologie du rejet, les options thérapeutiques sont différentes. “epithelial”. The study of these lesions combined with the observation of immune infiltrates makes it possible to make the typological diagnosis of renal transplant rejection as follows: “no rejection”, “Lymphocyte-mediated cell type rejection (TCMR)”, “ Antibody-mediated humoral rejection (ABMR)” and “Mixed rejection combining both types of rejection”. Depending on the type of rejection, the therapeutic options are different.
[29] Des tests diagnostiques du rejet de greffe sont commercialisés, il s'agit de l'Allosure (CareDX) et du ProsperaTM (Natera). Les nouvelles méthodologies de détection du rejet de greffe articulent leur proposition uniquement sur la prédiction du rejet ou du dysfonctionnement du greffon rénal, sans être capables de caractériser et diagnostiquer la nature de celui-ci. Aussi, l'utilisation de la ponction rénale reste toujours d'actualité. [29] Diagnostic tests for graft rejection are marketed, these are Allosure (CareDX) and ProsperaTM (Natera). New methodologies for detecting graft rejection base their proposal solely on the prediction of rejection or dysfunction of the kidney graft, without being capable of characterizing and diagnosing its nature. Also, the use of renal puncture still remains relevant.
[30] Un kit et un procédé selon l'invention présentent donc le grand avantage d'offrir un test peu invasif, car il est réalisé à partir d'un échantillon biologique aisément prélevé, fiable, rapide et peu coûteux. Du fait de sa nature peu invasive, un procédé selon l'invention peut aisément, si nécessaire, être renouvelé à différents stades de la pathologie, ce qui permet un suivi fiable de l'évolution de ladite pathologie et assure une prise en charge médicale adaptée à chacun de ces stades. [30] A kit and a method according to the invention therefore have the great advantage of offering a minimally invasive test, because it is carried out from a biological sample that is easily collected, reliable, rapid and inexpensive. Due to its minimally invasive nature, a method according to the invention can easily, if necessary, be repeated at different stages of the pathology, which allows reliable monitoring of the evolution of said pathology and ensures appropriate medical care. at each of these stages.
[31] Un kit et un procédé selon l'invention présentent un enjeu majeur pour les spécialistes et anatomopathologistes, car la typologie des lésions d'organe, notamment la typologie des lésions du greffon rénal, conditionne le diagnostic final et la prise en charge thérapeutique du patient. [31] A kit and a method according to the invention present a major challenge for specialists and pathologists, because the typology of organ lesions, in particular the typology of kidney graft lesions, conditions the final diagnosis and therapeutic management of the patient.
[32] La sensibilité et la spécificité du test de la présence de chacun des marqueurs ont été vérifiés. Un kit et un procédé selon l'invention présentent en outre l'avantage d'être reproductibles, rapides et peu coûteux. [32] The sensitivity and specificity of the test for the presence of each marker were verified. A kit and a method according to the invention also have the advantage of being reproducible, rapid and inexpensive.
[33] L'invention a également pour objet l'utilisation d'ADN acellulaire méthylé en tant que marqueur de la dégradation du cerveau, du rein ou du poumon, ou de la dégradation d'un tissu du cerveau, du rein ou du poumon. [33] The invention also relates to the use of methylated cell-free DNA as a marker of brain, kidney or lung degradation, or of brain, kidney or lung tissue degradation. .
[34] L'invention a aussi pour objet les amorces et les sondes utilisables dans un kit et un procédé selon l'invention. En particulier, l'invention a pour objet : [34] The invention also relates to the primers and probes which can be used in a kit and a method according to the invention. In particular, the invention aims to:
- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49, SEQ ID N°52,ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ;- a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19 , SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 52, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences;
- une amorce antisens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 ou SEQ ID N°53 ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ;- an antisense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20 , SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50 or SEQ ID No. 53 or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences;
- et une sonde, optionnellement marquée, comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences. - and a probe, optionally labeled, comprising or consisting of a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID N °45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 and SEQ ID No. 54, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences.
[35] L'invention a enfin pour objet un procédé in vitro de détection d'une pathologie ou d'une condition choisie parmi : l'accident vasculaire cérébral (AVC), le syndrome de détresse respiratoire aigüe, l'insuffisance rénale et le rejet de greffe, notamment le rejet de greffe rénale ou de greffe pulmonaire. [35] Finally, the subject of the invention is an in vitro method for detecting a pathology or a condition chosen from: stroke, acute respiratory distress syndrome, renal failure and transplant rejection, including rejection of a kidney transplant or lung transplant.
Description détaillée de l'invention Detailed description of the invention
[36] Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'au moins une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein ou d'un tissu présent dans le cerveau, le poumon ou le rein, ledit kit comprenant au moins une paire d'amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d'ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu. [36] According to a first aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of at least one target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for an organ chosen from: the brain, lung and kidney or a tissue present in the brain, lung or kidney, said kit comprising at least one pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising, or consisting of in, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA to selectively amplify a sequence of methylated cell-free DNA specific to said organ or tissue.
[37] Selon un mode de réalisation de ce premier aspect, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'au moins une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ledit kit comprenant au moins : [37] According to one embodiment of this first aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of at least one target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said kit comprising at least:
- une paire d'amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec au moins une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d'ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu, et - a pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with at least one nucleotide sequence of said cell-free DNA to selectively amplify a DNA sequence acellular methylated cell specific for said organ or tissue, and
- une sonde comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec la séquence nucléotidique cible d'ADN amplifiée. - a probe comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with the amplified DNA target nucleotide sequence.
[38] Par « échantillon biologique » on entend un élément issu du corps, humain ou animal, notamment par exemple : le sang, l'urine, la salive, le plasma ou un fragment d'organe. [38] By “biological sample” we mean an element from the body, human or animal, in particular for example: blood, urine, saliva, plasma or an organ fragment.
[39] Ladite sonde, dite « sonde de détection » est de préférence associée à un marqueur dont la détection est bien connue par une personne du métier. Lorsque plus d'une paire de sonde est utilisée (test multiplexe), la combinaison des marqueurs est choisie afin de distinguer les différentes séquences nucléotidiques amplifiées. [39] Said probe, called “detection probe” is preferably associated with a marker whose detection is well known to a person skilled in the art. When more than one pair of probes is used (multiplex test), the combination of markers is chosen in order to distinguish the different amplified nucleotide sequences.
[40] Selon un premier aspect particulier, la présente invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type cellulaire d'un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein, ledit kit comprenant : i) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°l, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°2, et/ou - une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°5. ii) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, au moins : une amorce sens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°8, et iii) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, au moins : [40] According to a first particular aspect, the present invention relates to a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a cell type of an organ chosen from: the brain, the lung and the kidney, said kit comprising: i) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the brain, at least: a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2, and/or - a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 5, or a sequence nucleotide presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 5. ii) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the lung, at least: a sense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 7 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8, and iii) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in the kidney, at least:
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°10, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°ll, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°ll, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 10, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 10 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. ll, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. ll, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°13, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°14, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°14, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 13, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 13 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 14, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 14, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°19, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°19 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°20, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°20, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 19, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 19 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 20, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 20, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°22, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°22 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°23, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°23, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 22, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 22 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 23, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 23, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°25, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°25 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°26, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°26, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 25, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 25 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 26, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 26, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°28, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°28 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°29, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°29, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 28, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 28 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 29, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 29, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°31, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°31 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°32, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°32, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 31, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 31 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 32, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 32, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°34, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°34 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°35, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°35, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 34, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 34 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 35, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 35, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°37, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°37 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°38, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°38, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 37, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 37 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 38, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 38, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°40, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°40 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°41, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°41, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 40, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 40 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 41, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 41, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°43, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°43 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°44, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°44, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 43, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 43 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 44, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 44, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°46, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°46 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°47, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°47, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 46, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 46 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 47, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 47, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°49, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°49 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°50, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°50, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 49, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 49 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 50, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 50, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°52, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°52 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°53, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°53. - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 52, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 52 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 53, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 53.
Selon un aspect plus particulier, un kit selon l'invention comprend au moins : According to a more particular aspect, a kit according to the invention comprises at least:
- une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze, seize, dix-sept, dix-huit, dix-neuf ou vingt paires d'amorces, chacune étant constituée par une amorce sens selon l'invention et une amorce antisens selon l'invention. [41] Selon un aspect plus particulier, un kit selon l'invention comprend une amorce- one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen or twenty pairs of primers , each consisting of a sense primer according to the invention and an antisense primer according to the invention. [41] According to a more particular aspect, a kit according to the invention comprises a primer
« sens » comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49, SEQ ID N°52, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d'identité avec l'une desdites séquences SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49 ou SEQ ID N°52. “sense” comprising or consisting of, a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID N °46, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 52, or a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with one of said sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7 , SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 49 or SEQ ID No. 52.
[42] Selon un autre aspect plus particulier, un kit selon l'invention comprend une amorce « antisens » comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 ou SEQ ID N°53, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d'identité avec l'une desdites séquences nucléotidiques SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 ou SEQ ID N°53. [42] According to another more particular aspect, a kit according to the invention comprises an “antisense” primer comprising or consisting of, a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50 or SEQ ID No. 53, or a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with one of said nucleotide sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 26 , SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50 or SEQ ID No. 53.
[43] Selon un autre aspect plus particulier, un kit selon l'invention comprend une sonde comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d'identité avec l'une desdites séquences nucléotidiques choisie parmi SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54. [43] According to another more particular aspect, a kit according to the invention comprises a probe comprising or consisting of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. °12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39 , SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 and SEQ ID No. 54, or a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with one of said nucleotide sequences chosen from SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 and SEQ ID No.54.
[44] Par « au moins 80 % d'identité » on entend que lesdites séquences présentent au moins 80% d'identité après alignement global optimal, c'est-à-dire par alignement global entre deux séquences donnant le plus fort pourcentage d'identité entre elles. L'alignement global optimal de deux séquences peut notamment être réalisé selon l'algorithme de Needleman-Wunsch, bien connu de l'homme du métier (Needleman & Wunsch, « A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins », J. Mol. Biol., 48(3) :443-53). Une séquence nucléotidique selon l'invention comprend, ou est constituée par une séquence nucléotidique présentant au moins 80%, avantageusement au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité avec la séquence nucléotidique de référence après alignement global optimal. [44] By “at least 80% identity” we mean that said sequences present at least 80% identity after optimal global alignment, that is to say by global alignment between two sequences giving the highest percentage of identity. identity between them. The optimal overall alignment of two sequences can in particular be carried out according to the Needleman-Wunsch algorithm, well known to those skilled in the art (Needleman & Wunsch, “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins”, J. Mol. Biol., 48(3):443-53). A nucleotide sequence according to the invention comprises, or is constituted by a nucleotide sequence having at least 80%, advantageously at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with the reference nucleotide sequence after optimal global alignment.
Avantageusement, une séquence nucléotidique selon l'invention comprend, ou est constituée par une séquence nucléotidique présentant au moins 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité avec la séquence nucléotidique de référence après alignement global optimal. Advantageously, a nucleotide sequence according to the invention comprises, or is constituted by a nucleotide sequence having at least 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6% , 99.7%, 99.8% or 99.9% identity with the reference nucleotide sequence after optimal global alignment.
[45] Selon cet aspect, une séquence nucléotidique selon l'invention comprenant, ou constituée, d'une séquence présentant au moins 80% d'identité avec la séquence nucléotidique de référence est fonctionnelle, c'est-à-dire qu'elle est capable de s'hybrider sur la séquence nucléotidique cible avec une stabilité suffisante pour permettre l'amplification ou la détection de ladite séquence nucléotidique cible. [45] According to this aspect, a nucleotide sequence according to the invention comprising, or consisting of, a sequence having at least 80% identity with the reference nucleotide sequence is functional, that is to say it is capable of hybridizing to the target nucleotide sequence with sufficient stability to allow the amplification or detection of said target nucleotide sequence.
[46] Les séquences nucléotidiques d'un premier groupe d'amorces sont désignées comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous : [46] The nucleotide sequences of a first group of primers are designated as indicated in Table 1 below:
Tableau 1
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Table 1
Figure imgf000013_0001
[47] Les séquences nucléotidiques d'un premier groupe de sondes sont désignées comme indiqué dans le tableau 2 ci-dessous : [47] The nucleotide sequences of a first group of probes are designated as indicated in Table 2 below:
Tableau 2
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[48] Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, ledit kit comprenant au moins : Table 2
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[48] According to another more particular aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the brain, said kit comprising at least:
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°l, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°2, et/ou - a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1 and an antisense primer, comprising, or consisting of, a sequence nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2, and/or
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°5. - a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer, comprising, or consisting of, a sequence nucleotide SEQ ID No. 5, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 5.
[49] Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, ledit kit comprenant au moins une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°8. [49] According to another more particular aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the lung, said kit comprising at least one sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 7 and an antisense primer, comprising , or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8.
[50] Les séquences nucléotidiques des amorces spécifiques d'un type de cellules présent dans le rein, sont désignées comme indiqué dans le tableau 3 ci-dessous : [50] The nucleotide sequences of the primers specific for a cell type present in the kidney are designated as indicated in Table 3 below:
Tableau 3 Table 3
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[51] Les séquences nucléotidiques des sondes spécifiques d'un type de cellules présent dans le rein, sont désignées comme indiqué dans le tableau 4 ci-dessous : [51] The nucleotide sequences of the probes specific to a cell type present in the kidney are designated as indicated in Table 4 below:
Tableau 4
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Table 4
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[52] Parmi les tissus présents dans le rein, on peut notamment citer : le tissu, épithélial rénal et le tissu vasculaire rénal [52] Among the tissues present in the kidney, we can notably cite: renal epithelial tissue and renal vascular tissue
[53] Les marqueurs dédiés au suivi de l'état de souffrance rénale sont caractérisés comme indiqué dans le tableau 5 ci-dessous : [53] The markers dedicated to monitoring the state of renal distress are characterized as indicated in Table 5 below:
Tableau 5
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[54] Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit qui contient les réactifs nécessaire (amorces et sondes) à l’amplification d’au moins un amplicon de PCR inférieur à < 85 pb (préférentiellement < 70 pb) dans une région génomique comprise parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 65, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 70 et SEQ ID N° 71 selon le statut de méthylation de ladite région génomique. Table 5
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[54] According to another more particular aspect, the subject of the invention is a kit which contains the necessary reagents (primers and probes) for the amplification of at least one PCR amplicon of less than < 85 bp (preferably < 70 bp ) in a genomic region included among the nucleotide sequences SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70 and SEQ ID No. 71 according to the methylation status of said genomic region.
[55] Les marqueurs utilisés dans un kit et un procédé selon l'invention sont donc susceptibles d'être classés en marqueurs : [55] The markers used in a kit and a method according to the invention are therefore likely to be classified into markers:
- « de type vasculaire » : choisi parmi les marqueurs ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2 et LINC01599, - “vascular type”: chosen from the markers ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2 and LINC01599,
- « de type épithélial » : choisi parmi les marqueurs FLJ 12825, ACSL5, PAX2 et PDE4D,- “epithelial type”: chosen from the markers FLJ 12825, ACSL5, PAX2 and PDE4D,
- « de type rein total » : choisi parmi CTDP1. - “total kidney type”: chosen from CTDP1.
[56] Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, ledit kit comprenant au moins : [56] According to another more particular aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the kidney, said kit comprising at least:
-une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type rein total » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type rein total », et/ou -a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “total kidney type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “total kidney type” marker, and or
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type vasculaire » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type vasculaire », et/ou - a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “vascular type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “vascular type” marker, and/ Or
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type épithélial » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type épithélial ». - a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting an “epithelial type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting an “epithelial type” marker.
[57] De préférence, selon cet aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, ledit kit comprenant au moins : [57] Preferably, according to this more particular aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the kidney, said kit comprising at least:
-une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type rein total » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marquer « de type rein total », ledit marqueur étant CTDP1 et -a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “total kidney type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “total kidney type” marker total kidney", said marker being CTDP1 and
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type vasculaire » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type vasculaire », ledit marqueur étant choisi parmi GATA2, TNS2-AS1 et - a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “vascular type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting a “vascular type” marker, said marker being chosen from GATA2, TNS2-AS1 and
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type épithélial » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type épithélial », ledit marqueur étant choisi parmi : PAX2, ACSL5 ou PDE4D. - a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting an “epithelial type” marker and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of detecting an “epithelial type” marker, said marker being chosen from: PAX2, ACSL5 or PDE4D.
[58] Les marqueurs utilisés dans un kit et un procédé selon l'invention seront maintenant décrits de façon plus détaillée. Les noms des marqueurs correspondent au nom du gène sur lesquels ces marqueurs sont localisés. [58] The markers used in a kit and a method according to the invention will now be described in more detail. The names of the markers correspond to the name of the gene on which these markers are located.
[59] La région génétique "PDE4D" selon l'invention désigne une séquence codant pour une protéine de la famille des phosphodiestérases. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 5 en position 58,969,038-60,522,128, de manière plus spécifique au niveau du locus 5qll.2-ql2.1. Il contient 42 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000005.10. Il est transcrit en la séquence NM_006203.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 5 position 59,039,300- 59,039,420 (SEQ ID N° 55), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction épithéliale. Ils proposent d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable notamment pour diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [59] The “PDE4D” genetic region according to the invention designates a sequence coding for a protein of the phosphodiesterase family. Its DNA sequence is located on chromosome 5 at position 58,969,038-60,522,128, more specifically at the 5qll.2-ql2.1 locus. It contains 42 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000005.10. It is transcribed into the sequence NM_006203.5. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 5 position 59,039,300-59,039,420 (SEQ ID No. 55), as being specifically hyper-methylated in the epithelial fraction. They propose using this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method in particular for diagnosing or identifying kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[60] La région génétique « PAX2 » selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine de la famille des box-paired 2. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 10 en position 100,735,396-100,829,944, de manière plus spécifique au niveau du locus 10q24.31. Il contient 14 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000010.11. Il est transcrit en la séquence NM_000278.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 10 position 100,828,800- 100,829,020 (SEQ ID N° 56), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction épithéliale. Ils proposent d'utiliser notamment ce gène dans une méthode non- invasive, sensible et fiable pour diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [60] The “PAX2” genetic region according to the invention designates a coding sequence for a protein of the box-paired 2 family. Its DNA sequence is located on chromosome 10 at position 100,735,396-100,829,944, more specifically at the 10q24.31 locus. It contains 14 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000010.11. It is transcribed into the sequence NM_000278.5. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 10 position 100,828,800-100,829,020 (SEQ ID No. 56), as being specifically hyper-methylated in the epithelial fraction. They propose in particular to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method for diagnosing or identifying renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[61] La région génétique « FLJ12825 » selon l'invention désigne une molécule génomique complète non codante pour des protéines. Il permet la transcription d'ARN longs non codants et est présent sur le locus non caractérisé LOC440101 du gène FLJ12825. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 12 en position 54,058,254-54,122,234, de manière plus spécifique au niveau du locus 12ql3.13 dans une séquence intronique. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000012.12. Il est transcrit en 1 variant d'ARN nommé NR_026655.1. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 12 : Position 54,106,357- 54,106,526 (SEQ ID N° 57), comme étant spécifiquement hyper-méthylé dans la fraction épithéliale rénale. Ils proposent notamment d'utiliser ce gène dans une méthode non- invasive, sensible et fiable pour diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [61] The genetic region “FLJ12825” according to the invention designates a complete genomic molecule not coding for proteins. It allows the transcription of long non-coding RNAs and is present at the uncharacterized locus LOC440101 of the FLJ12825 gene. Its DNA sequence is located on chromosome 12 at position 54,058,254-54,122,234, more specifically at the level of the 12ql3.13 locus in an intronic sequence. Its DNA sequence is referred to as NC_000012.12. It is transcribed into 1 RNA variant named NR_026655.1. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 12: Position 54,106,357-54,106,526 (SEQ ID No. 57), as being specifically hyper-methylated in the renal epithelial fraction. They propose in particular to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method for diagnosing or identifying kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[62] La région génétique « ALDH1A1 » selon l'invention désigne une molécule génomique complète codante pour une protéine de la famille des aldéhydes déshydrogénase de type 1 (membre Al). Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 9 en position 72,900,671-72,953,063, de manière plus spécifique au niveau du locus 9q21.13. Il contient 13 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_005224.3. Il est transcrit en 1 variants à d'ARN nommé NM_005224.3. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 9 : [62] The “ALDH1A1” genetic region according to the invention designates a complete genomic molecule encoding a protein of the type 1 aldehyde dehydrogenase family (Al member). Its DNA sequence is located on chromosome 9 at position 72,900,671-72,953,063, more specifically at locus 9q21.13. It contains 13 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_005224.3. It is transcribed into 1 RNA variant named NM_005224.3. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 9:
Position 72,952,933-72,953,059 (SEQ ID N° 58), comme étant spécifiquement hyper- méthylé dans la fraction vasculaire rénale. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. Position 72,952,933-72,953,059 (SEQ ID No. 58), as being specifically hypermethylated in the renal vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[63] La région génétique « ARID3A » selon l'invention désigne une molécule génomique complète codante pour une protéine de la famille des protéines de liaison à ADN ARID (AT-rich interaction domain). Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 19 en position 925,732-975,939, de manière plus spécifique au niveau du locus 19pl3.3. Il contient 12 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000019.10. Il est transcrit en 1 variants à ARN nommé NM_000689.5. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 19 : [63] The “ARID3A” genetic region according to the invention designates a complete genomic molecule encoding a protein from the ARID (AT-rich interaction domain) family of DNA binding proteins. Its DNA sequence is located on chromosome 19 at position 925,732-975,939, more specifically at the 19pl3.3 locus. It contains 12 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000019.10. It is transcribed into 1 RNA variant named NM_000689.5. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 19:
Position 940,667-941,160 (SEQ ID N° 59), comme étant spécifiquement hyper-méthylé dans la fraction vasculaire rénale. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. Position 940,667-941,160 (SEQ ID No. 59), as being specifically hyper-methylated in the renal vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[64] La région génétique « ACSL5 » selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine de la famille des ligases. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 10 en position 112,374,116-112,428,376, de manière plus spécifique au niveau du locus 10q25.2. Il contient 23 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000010.11. Il est transcrit en la séquence NM_016234.4. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 10 position 112,376,275-112,376,398 (SEQ ID N° 60), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction épithéliale. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non- invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins [64] The genetic region “ACSL5” according to the invention designates a coding sequence for a protein of the ligase family. Its DNA sequence is located on chromosome 10 at position 112,374,116-112,428,376, more specifically at the 10q25.2 locus. It contains 23 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000010.11. It is transcribed into the sequence NM_016234.4. The gifts inventors have identified the DNA region included in chromosome 10 position 112,376,275-112,376,398 (SEQ ID No. 60), as being specifically hyper-methylated in the epithelial fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a useful kit for such purposes.
[65] La région génétique "CTDP1" selon l'invention désigne une séquence non caractérisée intronique située entre le gène CTDP1 et KCNG2. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 18 entre les positions des gènes CTDP1 (chrl8 : 79,756,625-79,787,722) et KCNG2 (chrl8 : 79,797,938-79,900,100). Il contient 0 exons. Sa séquence d'ADN n'est pas référencée dans le NCBI. Il n'y a pas de transcrit identifié. [65] The “CTDP1” genetic region according to the invention designates an uncharacterized intronic sequence located between the CTDP1 and KCNG2 gene. Its DNA sequence is located on chromosome 18 between the positions of the CTDP1 (chrl8: 79,756,625-79,787,722) and KCNG2 (chrl8: 79,797,938-79,900,100) genes. It contains 0 exons. Its DNA sequence is not referenced in the NCBI. There is no transcript identified.
Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 18 position 79,791,700-79,791,820 (SEQ ID N° 61), comme étant spécifiquement hyper- méthylée dans la fraction totale du rein. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 18 position 79,791,700-79,791,820 (SEQ ID No. 61), as being specifically hypermethylated in the total kidney fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[66] La région génétique "GATA2" selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine de la famille des facteurs de transcription de l’ADN à doigts de zinc. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 3 en position 128,479,422-128,493,201, de manière plus spécifique au niveau du locus 3q21.3. Il contient 8 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000003.12. Il est transcrit en la séquence NM_032638.5. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 3 position 128,491,794-128,492,245 (SEQ ID N° 62), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [66] The genetic region "GATA2" according to the invention designates a coding sequence for a protein of the family of zinc finger DNA transcription factors. Its DNA sequence is located on chromosome 3 at position 128,479,422-128,493,201, more specifically at the 3q21.3 locus. It contains 8 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000003.12. It is transcribed into the sequence NM_032638.5. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 3 position 128,491,794-128,492,245 (SEQ ID No. 62), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[67] La région génétique « LOC124903692 » selon l'invention désigne une séquence non caractérisée et non codante pour des protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 16 en position 54,936,014-54,938,671, de manière plus spécifique au niveau du locus 16ql2.2. Il contient 3 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000016.10. Il est transcrit en la séquence XR_007065074.1. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 16 position 54,937,300- 54,937,500 (SEQ ID N° 63), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [67] The genetic region “LOC124903692” according to the invention designates an uncharacterized and non-protein coding sequence. Its DNA sequence is located on chromosome 16 at position 54,936,014-54,938,671, more specifically at the 16ql2.2 locus. It contains 3 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000016.10. It is transcribed into the sequence XR_007065074.1. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 16 position 54,937,300-54,937,500 (SEQ ID No. 63), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive method, sensitive and reliable for in particular diagnosing or identifying renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[68] La région génétique "NRN1" selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine de la famille des neuritines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 6 en position 5,997,999-6,007,518, de manière plus spécifique au niveau du locus[68] The “NRN1” genetic region according to the invention designates a coding sequence for a protein of the neuritin family. Its DNA sequence is located on chromosome 6 at position 5,997,999-6,007,518, more specifically at the locus
6p25.1. Il contient 7 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000006.12. Il est transcrit en la séquence NM_016588.3. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 6 position 5,998,924-5,999,075 (SEQ ID N° 64), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. 6p25.1. It contains 7 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000006.12. It is transcribed into the sequence NM_016588.3. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 6 position 5,998,924-5,999,075 (SEQ ID No. 64), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[69] La région génétique "SEPT5-GP1BB " selon l'invention désigne une séquence non codante pour des protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 22 en position 19,717,220-19,724,774, de manière plus spécifique au niveau du locus 22qll.21. Il contient 12 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000022.11. Il est transcrit en la séquence NR_037611.1. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 22 position 19,724,235- 19,724,340 (SEQ ID N° 65), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [69] The genetic region “SEPT5-GP1BB” according to the invention designates a non-coding sequence for proteins. Its DNA sequence is located on chromosome 22 at position 19,717,220-19,724,774, more specifically at the 22qll.21 locus. It contains 12 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000022.11. It is transcribed into the sequence NR_037611.1. The present inventors have identified the DNA region included in chromosome 22 position 19,724,235-19,724,340 (SEQ ID No. 65), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify renal transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[70] La région génétique "TNS2-AS1" selon l'invention désigne une séquence non codante pour des protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 12 en position 53,043,189-53,054,438, de manière plus spécifique au niveau du locus 12ql3.13. Il contient 4 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000012.12. Il est transcrit en la séquence NR_033854.1. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 12 position 53,054,207-53,054,329 (SEQ ID N° 66), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [70] The genetic region “TNS2-AS1” according to the invention designates a non-coding sequence for proteins. Its DNA sequence is located on chromosome 12 at position 53,043,189-53,054,438, more specifically at the 12ql3.13 locus. It contains 4 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000012.12. It is transcribed into the sequence NR_033854.1. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 12 position 53,054,207-53,054,329 (SEQ ID No. 66), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[71] La région génétique "RHBDF2" selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine permettant d’activer l'activité de transporteur de protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 17 en position 76,470,893-76,501,427, de manière plus spécifique au niveau du locus 17q25.1. Il contient 21 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000017.11. Il est transcrit en la séquence NM_024599.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 17 position 76,500,822 -76,500,937 (SEQ ID N° 67), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non- invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [71] The “RHBDF2” genetic region according to the invention designates a coding sequence for a protein making it possible to activate the protein transporter activity. Its DNA sequence is located on chromosome 17 at position 76,470,893-76,501,427, more specifically at the 17q25.1 locus. It contains 21 exons. Its DNA sequence is referred as NC_000017.11. It is transcribed into the sequence NM_024599.5. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 17 position 76,500,822 -76,500,937 (SEQ ID No. 67), as being specifically hyper-methylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[72] La région génétique « LINC01599 » selon l'invention désigne une séquence permettant la transcription d'ARN intergéniques non codants pour les protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 14 en position 50,007,313-50,105,043, de manière plus spécifique au niveau du locus 14q21.3. Il contient 9 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000014.9. Il est transcrit en la séquence NR_131171.1. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 14 position 50,056,666-50,056,758 (SEQ ID N° 68), comme étant spécifiquement hypo- méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins. [72] The genetic region “LINC01599” according to the invention designates a sequence allowing the transcription of intergenic RNAs not coding for proteins. Its DNA sequence is located on chromosome 14 at position 50,007,313-50,105,043, more specifically at the 14q21.3 locus. It contains 9 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000014.9. It is transcribed into the sequence NR_131171.1. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 14 position 50,056,666-50,056,758 (SEQ ID No. 68), as being specifically hypomethylated in the vascular fraction. They therefore propose to use this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method to in particular diagnose or identify kidney transplant rejection in kidney transplant patients, or in a kit useful for such purposes.
[73] La région génétique « APC2 » selon l'invention désigne une séquence molécule génomique complète codante pour une protéine de la famille des régulateurs APC de la voie Wnt. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 19 en position 1,446,230- 1,473,244, de manière plus spécifique au niveau du locus 19pl3.3. Il contient 17 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000019.10. Il est transcrit en la séquence NM_005883.3. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 19 position 1,467,853-1,468,054 (SEQ ID N°69), comme étant spécifiquement hyper- méthylée dans les neurones. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer un AVC, ou dans un kit utile à de telles fins. La région génétique « NBR1 » selon l'invention désigne une molécule génomique complète codante pour une protéine de la famille des récepteurs spécifiques de l’autophagie. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 17 en position 43,170,409-43,211,900, de manière plus spécifique au niveau du locus 17q21.31. Il contient 23 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000017.11. Il est transcrit en la séquence NM_005899.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 17 position 43,211,655-43,211,856 (SEQ ID N° 70), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans les neurones. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer un AVC, ou dans un kit utile à de telles fins. [74] La région génétique « SYNE1 » selon l'invention désigne une molécule génomique complète codante pour une protéine de l'enveloppe nucléaire contenant des séquences répétées de spectrine. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 6 en position 152,121,687-152,637,362, de manière plus spécifique au niveau du locus 6p25.2. Il contient 153 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000006.12. Il est transcrit en la séquence NM_033071.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 6 position 152,302,152-152,302,353 (SEQ ID N°71), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans les pneumocytes/alvéoles pulmonaires. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un SDRA, ou dans un kit utile à de telles fins. [73] The “APC2” genetic region according to the invention designates a complete genomic molecule sequence coding for a protein of the APC family of regulators of the Wnt pathway. Its DNA sequence is located on chromosome 19 at position 1,446,230-1,473,244, more specifically at the 19pl3.3 locus. It contains 17 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000019.10. It is transcribed into the sequence NM_005883.3. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 19 position 1,467,853-1,468,054 (SEQ ID No. 69), as being specifically hypermethylated in neurons. They therefore propose using this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method, in particular to diagnose a stroke, or in a kit useful for such purposes. The “NBR1” genetic region according to the invention designates a complete genomic molecule coding for a protein of the family of specific autophagy receptors. Its DNA sequence is located on chromosome 17 at position 43,170,409-43,211,900, more specifically at the 17q21.31 locus. It contains 23 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000017.11. It is transcribed into the sequence NM_005899.5. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 17 position 43,211,655-43,211,856 (SEQ ID No. 70), as being specifically hyper-methylated in neurons. They therefore propose using this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method, in particular to diagnose a stroke, or in a kit useful for such purposes. [74] The “SYNE1” genetic region according to the invention designates a complete genomic molecule coding for a nuclear envelope protein containing spectrin repeat sequences. Its DNA sequence is located on chromosome 6 at position 152,121,687-152,637,362, more specifically at the 6p25.2 locus. It contains 153 exons. Its DNA sequence is referred to as NC_000006.12. It is transcribed into the sequence NM_033071.5. The inventors have identified the DNA region included in chromosome 6 position 152,302,152-152,302,353 (SEQ ID No. 71), as being specifically hyper-methylated in pulmonary pneumocytes/alveoli. They therefore propose using this gene in a non-invasive, sensitive and reliable method, in particular to diagnose or identify ARDS, or in a kit useful for such purposes.
[75] Un kit selon l'invention comprend, de façon optionnelle une ou plusieurs paires d'amorces constituées par une amorce sens et une amorce antisens, destinées à détecter la présence d'un élément contrôle dans l'échantillon biologique. Cet élément contrôle peut être tout élément approprié choisi par une personne du métier. Ledit élément contrôle peut notamment être l'albumine. Plus particulièrement, un kit selon l'invention peut comprendre une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°16, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°16 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°17, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°17. [75] A kit according to the invention optionally comprises one or more pairs of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, intended to detect the presence of a control element in the biological sample. This control element can be any appropriate element chosen by a person skilled in the art. Said control element may in particular be albumin. More particularly, a kit according to the invention may comprise a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 16, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 16 and a primer antisense, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 17, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 17.
[76] Selon un deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé d'identification d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans un premier organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, le procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Détermination, dans au moins une base de données de méthylation de l'ADN génomique, de la position et du degré de méthylation des ilôts CpG de séquences spécifiques dudit type cellulaire dudit organe, b) Identification, dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit organe sain, des ilôts CpG spécifiquement hyperméthylés, c) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG d'un deuxième type cellulaire, différent du premier type cellulaire, d) Sélection des îlots CpG uniquement hyperméthylés dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape c), e) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN génomique des organes autres dudit premier organe, f) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN génomique des globules blancs sains, g) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN acellulaire toutes matrices biologiques confondues issus de sujets sains, h) Sélection des îlots CpG uniquement hyperméthylés dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape e, f et g) i) Identification d'une ou plusieurs séquences hyperméthylée cible d'ADN acellulaire spécifique dudit type cellulaire du premier organe à partir de la comparaison réalisée lors de l'étape h). [76] According to a second aspect, the subject of the invention is a method for identifying a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in a first organ chosen from: the lung, the brain and the kidney, the method comprising at least the following steps: a) Determination, in at least one genomic DNA methylation database, of the position and degree of methylation of CpG islands of sequences specific to said cell type of said organ, b) Identification, in the genomic DNA of said cell type of said healthy organ, of specifically hypermethylated CpG islands, c) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of a second cell type, different from the first cell type, d) Selection of the CpG islands only hypermethylated in the genomic DNA of said cell type of said first organ after comparison carried out in step c), e) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the genomic DNA of organs other than said first organ, f) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the genomic DNA of healthy white blood cells, g) Comparison of the degree of methylation of hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of cell-free DNA from all biological matrices taken together from healthy subjects, h) Selection of CpG islands only hypermethylated in the DNA genomics of said cell type of said first organ after comparison carried out in step e, f and g) i) Identification of one or more hypermethylated cell-free DNA target sequences specific to said cell type of the first organ from the comparison carried out during the step h).
[77] L'invention a également pour objet une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé identifiée au moyen d'un procédé selon l'invention, pour son utilisation dans la détection de la lyse d'un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, à partir d'un échantillon biologique d'un patient. [77] The invention also relates to a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA identified by means of a method according to the invention, for its use in the detection of the lysis of an organ chosen from the brain, the lung and kidney, from a biological sample from a patient.
[78] Selon un troisième aspect, l'invention a pour objet un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, ou d'un tissu présent dans le cerveau, le poumon ou le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d'ADN acellulaire, b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b). [78] According to a third aspect, the subject of the invention is a method for detecting, in a biological sample, a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for an organ chosen from: the lung , the brain and the kidney, or a tissue present in the brain, the lung or the kidney, said method comprising at least the following steps: a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, b) Amplification reaction of said target sequence, c) Detection of the presence of the amplified sequence during step b).
[79] L'ADN acellulaire est extrait en utilisant un kit commercial, bien connu de la personne du métier et nécessite la présence d'au moins 0,15 ng/mL d'ADN cible dans l'échantillon urinaire ou plasmatique. [79] Cell-free DNA is extracted using a commercial kit, well known to those skilled in the art and requires the presence of at least 0.15 ng/mL of target DNA in the urine or plasma sample.
[80] La réaction d'amplification est réalisée au moyen de toute technique ou protocole bien connu par la personne du métier. Parmi les exemples non limitatifs de ces techniques, on peut citer : l'amplification par PCR, l'amplification par PCR digitale (dPCR), le séquençage nouvelle génération. [81] Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau. [80] The amplification reaction is carried out using any technique or protocol well known to those skilled in the art. Among the non-limiting examples of these techniques, we can cite: amplification by PCR, amplification by digital PCR (dPCR), next generation sequencing. [81] More particularly, the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the brain.
[82] Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°1 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°l) et une amorce antisens SEQ ID N°2 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°2), ou bien une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°4 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°4) et une amorce antisens SEQ ID N°5 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°5), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d'ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b), au moyen d'une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°6, respectivement selon les paires d'amorces utilisées. [82] Even more particularly, the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the brain, said method comprising at least the following steps: a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers constituted by a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 1 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1) and an antisense primer SEQ ID No. 2 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2), or a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 4 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4) and a antisense primer SEQ ID No. 5 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 5), each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or else brought into contact, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, b) Amplification reaction of said target sequence, c) Detection of the presence of the amplified sequence during the step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 6, respectively depending on the primer pairs used.
[83] Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : [83] Even more particularly, the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the lung, said method comprising at least the following steps:
- Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par - Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers constituted by
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°7 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°7) et une amorce antisens SEQ ID N°8 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°8), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d'ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b), au moyen d'une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°9. - a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 7 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 7) and an antisense primer SEQ ID No. 8 (or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 8), each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable to hybridize with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or brought into contact, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, b) Amplification reaction of said target sequence, c) Detection of the presence of the sequence amplified during step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 9.
[84] Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : [84] Even more particularly, the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the kidney, said method comprising at least the following steps:
- a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par - a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers constituted by
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°10 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°10) et une amorce antisens SEQ ID N°ll (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°ll), ou bien - a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 10 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 10) and an antisense primer SEQ ID No. 11 (or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. ll), or else
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°13 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°13) et une amorce antisens SEQ ID N°14 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°14), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d'ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, - a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 13 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 13) and an antisense primer SEQ ID No. 14 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 14), each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or else implemented presence, under conditions suitable for amplification of nucleic acids,
- b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, - b) Amplification reaction of said target sequence,
- c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b), au moyen d'une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°12 ou SEQ ID N°15, respectivement selon les paires d'amorces utilisées. - c) Detection of the presence of the sequence amplified during step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 12 or SEQ ID No. 15, respectively depending on the pairs of primers used .
[85] Les tests diagnostiques décrits s'inscrivent dans un processus analytique composé de 2 étapes préliminaires : l'extraction de l'ADN circulant et la conversion épigénétique (par bisulfite, réaction enzymatique). Les tests diagnostiques sont compatibles avec différents kits d'extractions de l'ADN circulant tels que le QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID: 55114 (Qiagen) ; EZ1&2 ccfDNA Kit (48)Cat. No. I ID: 954854 (Qiagen) ; Kit d'isolement d'ADN acellulaire MagMAX™ (Référence: A29319, Thermofisher) ; Automated High-Throughput Extraction of Cell-Free DNA from Plasma, Serum, Urine and CSF (Ref : A6030, Promega). Les ADNs acellulaires une fois extraits sont dosés par fluorimétrie Qubit 4.0™ (kit Invitrogen™ Kits de dosage d'ADN db HS Qubit™ (Référence : Q32851)) puis subissent une conversion bisulfite avec le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) ou équivalent enzymatique (NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Conversion Module (Référence E7125S / E7125L)) commercial. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR digitale en gouttelettes (System Naica (STILLA Technologies)) (compatible également avec des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System - QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad). [85] The diagnostic tests described are part of an analytical process composed of 2 preliminary steps: extraction of circulating DNA and epigenetic conversion (by bisulfite, enzymatic reaction). The diagnostic tests are compatible with various circulating DNA extraction kits such as the QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID: 55114 (Qiagen); EZ1&2 ccfDNA Kit (48)Cat. No. I ID: 954854 (Qiagen); MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit (Reference: A29319, Thermofisher); Automated High-Throughput Extraction of Cell-Free DNA from Plasma, Serum, Urine and CSF (Ref: A6030, Promega). Once extracted, the cell-free DNAs are assayed by Qubit 4.0™ fluorimetry (Invitrogen™ kit HS dsDNA assay kits Qubit™ (Reference: Q32851)) then undergo a bisulfite conversion with the commercial Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) or enzymatic equivalent (NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Conversion Module (Reference E7125S / E7125L)). The samples are then analyzed by droplet digital PCR (Naica System (STILLA Technologies)) (also compatible with commercial equivalents such as the QIAcuity Digital PCR System - QIAGEN and QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).
[86] Les tests diagnostiques décrits sont compatibles avec l'ensemble des plateformes de PCR digital sur le marché (microgouttelettes et/ou micro-compartiments). Parmi elles, nous trouvons des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System - QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad). [86] The diagnostic tests described are compatible with all digital PCR platforms on the market (microdroplets and/or micro-compartments). Among them, we find commercial equivalents such as the QIAcuity Digital PCR System - QIAGEN and QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).
[87] Les inventeurs déterminent les paramètres métrologiques types, notamment la répétabilité, la reproductibilité et la sensibilité du test. Pour quantifier la dégradation rénale, il faut au moins 1 des marqueurs. La détection avec deux marqueurs renforce la donnée biologique. [87] The inventors determine typical metrological parameters, including repeatability, reproducibility and sensitivity of the test. To quantify renal degradation, at least 1 of the markers is required. Detection with two markers reinforces the biological data.
[88] De préférence, pour quantifier la dégradation rénale, il est préférable de détecter au moins un marqueur "rein entier", un marqueur de "type vasculaire" et un marqueur de "type épithélial" quantifié dans un test en multiplexage. Plus on augmente le nombre de marqueurs dans chacun de ces catégories, plus on augmente la performance clinique du test. La détection de plusieurs marqueurs par catégorie parmi les marqueurs « rein entier », « type vasculaire » et « type épithélial » renforce la donnée biologique. [88] Preferably, to quantify renal degradation, it is preferable to detect at least one "whole kidney" marker, a "vascular type" marker and an "epithelial type" marker quantified in a multiplexing test. The more we increase the number of markers in each of these categories, the more we increase the clinical performance of the test. The detection of several markers per category among the “whole kidney”, “vascular type” and “epithelial type” markers strengthens the biological data.
[89] Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation d'un kit ou d'un procédé selon l'invention, pour la détection spécifique de la dégradation du cerveau et/ou pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic, et/oule suivi de l'évolution d'un AVC et/ou l'optimisation thérapeutique du patient atteint d'AVC. [89] According to another aspect, the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of brain degradation and/or for in vitro diagnosis and /or the prognosis, and/ormonitoring the evolution of a stroke and/or therapeutic optimization of the stroke patient.
[90] Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation d'un kit ou d'un procédé selon l'invention, pour la détection spécifique de la dégradation du poumon et/ou pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic, et/ou le suivi de l'évolution d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë et/ou l'optimisation thérapeutique du patient atteint d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë. [90] According to another aspect, the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of lung degradation and/or for in vitro diagnosis and /or the prognosis, and/or the monitoring of the evolution of an acute respiratory distress syndrome and/or the therapeutic optimization of the patient suffering from an acute respiratory distress syndrome.
[91] Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation d'un kit ou d'un procédé selon l'invention, pour la détection spécifique de la dégradation du rein et/ou pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic, et/ou le dépistage et/ou le suivi de l'évolution d'un d'un rejet/dysfonctionnement de greffe rénal et/ou d'un épisode d'insuffisance rénale aiguë et/ou l'optimisation thérapeutique du patient atteint d'un rejet/dysfonctionnement de greffe rénale et/ou d'une insuffisance rénale aiguë. [91] According to another aspect, the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of kidney degradation and/or for in vitro diagnosis and /or prognosis, and/or screening and/or monitoring of the evolution of a kidney transplant rejection/dysfunction and/or an episode of acute renal failure and/or therapeutic optimization of the patient suffering from renal graft rejection/dysfunction and/or acute renal failure.
[92] Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet une séquence nucléotidique choisie parmi : [92] According to another aspect, the invention also relates to a nucleotide sequence chosen from:
- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49, SEQ ID N°52,ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ;- a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19 , SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 52, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences;
- une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 et SEQ ID N°53, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ; et - an antisense primer comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. °23, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47 , SEQ ID No. 50 and SEQ ID No. 53, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences; And
- une sonde comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences. - a probe comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 and SEQ ID No. 54, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences.
[93] Selon un autre aspect, l'invention a pour objet de diagnostic, ou de suivi de la dégradation d'un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, comprenant les étapes suivantes : [93] According to another aspect, the invention aims to diagnose, or monitor the deterioration of an organ chosen from the brain, the lung and the kidney, comprising the following steps:
- Extraction de l'ADN acellulaire méthylé d'un échantillon biologique d'un individu - Extraction of methylated cell-free DNA from a biological sample of an individual
- Conversion de l'ADN acellulaire méthylé (bisulfite et/ou conversion enzymatique)- Conversion of methylated cell-free DNA (bisulfite and/or enzymatic conversion)
- Mise en présence de l'ADN et d'une paire d'amorces appropriée dans des conditions permettant l'hybridation, - Bringing together the DNA and an appropriate pair of primers under conditions allowing hybridization,
- Amplification de ladite séquence, - Amplification of said sequence,
- Détection de la séquence amplifiée, au moyen de la sonde de détection appropriée. - Detection of the amplified sequence, using the appropriate detection probe.
Description des figures et modes de réalisation Description of the figures and embodiments
[94] D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de réalisation nullement limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels : [94] Other advantages and characteristics will appear on examination of the detailed description of a non-limiting embodiment, and the accompanying drawings, in which:
[95] La Figure 1 représente la proportion de neurones marqués lors de l'utilisation du marqueur anti-NeuN (gauche), du marqueur APC2 (centre) et du marqueur NBR1 (droite). [96] La Figure 2 représente les données normalisées de la moyenne des marqueurs NBR1 et APC2, sur une échelle logarithmique dans le cas de l'AIT (gauche), et de l'AVC (droite). [95] Figure 1 shows the proportion of neurons labeled when using the anti-NeuN marker (left), the APC2 marker (center), and the NBR1 marker (right). [96] Figure 2 represents the normalized data of the mean of the NBR1 and APC2 markers, on a logarithmic scale in the case of TIA (left), and stroke (right).
[97] La Figure 3 représente la quantité de marqueurs rénaux dans le plasma (en ng/ml) dans le cas de patients à haut risque de rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou à faible risque de rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir). [97] Figure 3 represents the quantity of renal markers in plasma (in ng/ml) in the case of patients at high risk of graft rejection (left histograms) or at low risk of graft rejection (right histograms ), for the markers PDE4D (white) and PAX2 (black).
[98] La Figure 4 représente la fraction d'ADN circulant d'origine rénale, sur le total d'ADN circulant dans le plasma (en %) dans le cas de patients à haut risque de rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou à faible risque de rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir). [98] Figure 4 represents the fraction of circulating DNA of renal origin, out of the total DNA circulating in plasma (in %) in the case of patients at high risk of graft rejection (left histograms) or at low risk of graft rejection (right histograms), for the markers PDE4D (white) and PAX2 (black).
[99] La Figure 5 représente la quantité de marqueurs rénaux en ng/ml d'urine dans le cas de patients avec rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou sans rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir). [99] Figure 5 represents the quantity of renal markers in ng/ml of urine in the case of patients with graft rejection (left histograms) or without graft rejection (right histograms), for PDE4D markers (white ) and PAX2 (black).
[100] La Figure 6 représente la corrélation entre le marquage histologique TTF-1 (axe des abscisses) et l'utilisation du marqueur SYNE1 (axe des ordonnées) selon l'invention. [100] Figure 6 represents the correlation between the histological marking TTF-1 (x-axis) and the use of the SYNE1 marker (y-axis) according to the invention.
[101] La Figure 7 représente la discrimination entre les sous-groupes de patients avec SDRA modérée (gauche), SDRA sévère (centre) ou SDRA critique (droite) fondée sur les résultats obtenus avec le marqueur SYNE1 (ordonnées). [101] Figure 7 shows the discrimination between subgroups of patients with moderate ARDS (left), severe ARDS (center), or critical ARDS (right) based on the results obtained with the SYNE1 marker (ordinate).
[102] Les Figures 8A et 8B représentent respectivement : (A) la détection des marqueurs SEPT5/GATA2, PDE4D, CTDP1, PAX2 et TNS2-AS1/ACSL5 dans de l'ADN 100% méthylé ; (B) la détection des marqueurs SEPT5/GATA2, PDE4D, CTDP1, PAX2 et TNS2-AS1/ACSL5 dans de l'ADN non méthylé, c'est-à-dire le contrôle négatif, les résultants montrant une absence de détection dans l'ADN non méthylé. [102] Figures 8A and 8B respectively represent: (A) the detection of the markers SEPT5/GATA2, PDE4D, CTDP1, PAX2 and TNS2-AS1/ACSL5 in 100% methylated DNA; (B) detection of the markers SEPT5/GATA2, PDE4D, CTDP1, PAX2 and TNS2-AS1/ACSL5 in unmethylated DNA, i.e. the negative control, the results showing an absence of detection in the Unmethylated DNA.
[103] La Figure 9 représente la quantification relative des marqueurs SEPT5, GATA2, TNS2-AS1, PDE4D, ACSL5, PAX2 et CTDP1, avec normalisation par le marqueur ubiquitaire albumine (contrôle interne correspondant au nombre de génomes totaux présents dans l'échantillon) dans des échantillons d’ADN génomique (ADNg) extraits de tissus sains : rein, foie, globules blancs, ADN circulant plasmatique et ADN circulant urinaire. [103] Figure 9 represents the relative quantification of the markers SEPT5, GATA2, TNS2-AS1, PDE4D, ACSL5, PAX2 and CTDP1, with normalization by the ubiquitous marker albumin (internal control corresponding to the number of total genomes present in the sample) in genomic DNA (gDNA) samples extracted from healthy tissues: kidney, liver, white blood cells, circulating plasma DNA and circulating urinary DNA.
[104] La Figure 10 représente la corrélation (R2 = 0,5) entre les quantifications relatives normalisées (via un marqueur interne albumine) des marqueurs PAX2 et ACSL5 dans n = 22 ADNg rénaux. [105] La Figure 11 représente la corrélation (R2 = 0,8087) entre les quantifications relatives normalisées (via un marqueur interne Albumine) des marqueurs PAX2 et ACSL5 dans n = 15 cf-ADN urinaire. [104] Figure 10 represents the correlation (R 2 = 0.5) between the normalized relative quantifications (via an internal marker albumin) of the PAX2 and ACSL5 markers in n = 22 renal gDNAs. [105] Figure 11 represents the correlation (R 2 = 0.8087) between the normalized relative quantifications (via an internal marker Albumin) of the PAX2 and ACSL5 markers in n = 15 urinary cf-DNA.
[106] Les Figures 12A et 12 B) représentent respectivement la comparaison de 2 méthodes quantitatives de la fraction épithéliale rénale sur n = 22 échantillons de rein sain. CD10 est un marqueur histologique de l'épithélium rénal. PAX2 et ACSL5 sont des marqueurs moléculaires ciblant spécifiquement l'épithélium rénal. [106] Figures 12A and 12B) respectively represent the comparison of 2 quantitative methods of the renal epithelial fraction on n = 22 healthy kidney samples. CD10 is a histological marker of the renal epithelium. PAX2 and ACSL5 are molecular markers specifically targeting the renal epithelium.
[107] La Figure 13 représente la différence significative de quantification du marqueur CTDP1 dans les urines entre des patients présentant un rejet de greffe et ceux ne présentant pas de rejet de greffe rénal (histogramme de gauche) et un modèle de régression logistique compilant les données quantitatives des biomarqueurs CTDP1, PAX2, PDE4D, ACSL5 et SEPT5 pour prédire la présence ou l'absence d'un rejet de greffe (graphique de droite) [107] Figure 13 represents the significant difference in quantification of the CTDP1 marker in urine between patients with graft rejection and those without renal graft rejection (left histogram) and a logistic regression model compiling the data quantitative biomarkers CTDP1, PAX2, PDE4D, ACSL5 and SEPT5 to predict the presence or absence of graft rejection (right graph)
[108] La Figure 14 représente la différence significative de quantification du biomarqueur CTDP1 dans les plasmas entre des patients présentant un rejet de greffe (avec lésions tissulaires sur le greffon) et ceux ne présentant pas de rejet de greffe rénal (sans lésions tissulaires sur le greffon) (histogramme de gauche) et un modèle de régression logistique compilant les données quantitatives des biomarqueurs CTDP1, GATA2, TNS2-AS1, PAX2 et PDE4D pour prédire la présence ou l'absence d'un rejet de greffe (graphique de droite). [108] Figure 14 represents the significant difference in quantification of the CTDP1 biomarker in plasma between patients with graft rejection (with tissue damage on the graft) and those without renal graft rejection (without tissue damage on the graft). graft) (left histogram) and a logistic regression model compiling quantitative data for the biomarkers CTDP1, GATA2, TNS2-AS1, PAX2 and PDE4D to predict the presence or absence of graft rejection (right graph).
[109] La Figure 15 représente la différence significative de quantification du biomarqueur GATA2 dans les plasmas entre des patients présentant des lésions vasculaires du greffon et ceux ne présentant pas de lésions vasculaires du greffon (graphique de gauche) et unmodèle de régression logistique compilant les données quantitatives des biomarqueurs CTDP1, GATA2, et TNS2-ASl pour prédire la présence ou l'absence de lésions vasculaires sur le greffon (graphique de droite). [109] Figure 15 represents the significant difference in quantification of the GATA2 biomarker in plasma between patients with vascular graft lesions and those without vascular graft lesions (left graph) and a logistic regression model compiling the data quantitative biomarkers CTDP1, GATA2, and TNS2-ASl to predict the presence or absence of vascular lesions on the graft (right graph).
[110] Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits par la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à de l'état de la technique antérieur. La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l'invention et non pour en limiter la portée. EXEMPLES [110] It is understood that the embodiments which will be described subsequently are in no way limiting. In particular, it will be possible to imagine variants of the invention comprising only a selection of characteristics described subsequently isolated from the other characteristics described, if this selection of characteristics is sufficient to confer a technical advantage or to differentiate the invention compared to other the prior art. The present invention will be better understood on reading the following examples, which are given to illustrate the invention and not to limit its scope. EXAMPLES
EXEMPLE 1 : Identification de biomarqueurs EXAMPLE 1: Identification of biomarkers
[111] Les îlots CpG présents au niveau des promoteurs de certains gènes se retrouvent à différents niveaux de méthylation selon la nature du tissu. A partir d'exploitation de bases de données de méthylation TCGA (The Cancer Genome Atlas) et DeepBlue (Epigenomic Data Server - DeepBlue) , Gene Expression Omnibus (ID : GSE186458)les positions et les degrés de méthylation d'un grand nombre d'îlots CpG sont répertoriés pour de nombreux types de tissus différents, incluant les sous-types de pneumocytes pulmonaires (poumon), les neurones (cerveau) et les cellules rénales (rein) (Moss et al. Nat Commun, déc 2018;9(l):5068. ; Liu X et al. Clin Epigenetics. déc 2019;ll(l):93 ; Silva TC et a/. Bioinformatics. 1 juin 2019;35(ll): 1974-7 ; Zhou W et a/. Nucleic Acids Res. 24 oct 2016;gkw967. ; Albrecht F et al. Nucleic Acids Res. 8 juill 2016;44(Wl):W581-6). Par traitement bio-informatique, les inventeurs ont identifié différentes positions hyperméthylées dans les tissus sains de cerveau, de poumon et de rein. Cette identification comporte 5 étapes et est décrite ci-dessous dans l'exemple de la détection de la dégradation pulmonaire. [111] The CpG islands present at the promoters of certain genes are found at different levels of methylation depending on the nature of the tissue. Based on the exploitation of methylation databases TCGA (The Cancer Genome Atlas) and DeepBlue (Epigenomic Data Server - DeepBlue), Gene Expression Omnibus (ID: GSE186458) the positions and degrees of methylation of a large number of CpG islands are listed for many different tissue types, including pulmonary (lung) pneumocyte subtypes, neurons (brain), and renal (kidney) cells (Moss et al. Nat Commun, Dec 2018;9(l ):5068. ; Liu Nucleic Acids Res. Oct 24, 2016;gkw967.; Albrecht F et al. Nucleic Acids Res. Jul 8, 2016;44(Wl):W581-6). Using bioinformatics processing, the inventors identified different hypermethylated positions in healthy brain, lung and kidney tissues. This identification involves 5 steps and is described below in the example of detecting pulmonary degradation.
[112] Dans le cas de la détection de la dégradation pulmonaire, les inventeurs ont sélectionné des positions non-méthylées dans l'ADN issu des globules blancs, PBMCs et cellules immunitaires, à partir d'une analyse de données issues du sang total. [112] In the case of detecting pulmonary degradation, the inventors selected unmethylated positions in the DNA from white blood cells, PBMCs and immune cells, based on an analysis of data from whole blood.
[113] Les inventeurs ont ensuite détecté les îlots CpG hyperméthylés et/ou hypométhylés dans le tissu sain, dans une base de données établie à partir de tissu pulmonaire sain. Ces données ont été séparées en un jeu de données de découverte (« training ») et un jeu de données de validation (« test »). [113] The inventors then detected hypermethylated and/or hypomethylated CpG islands in healthy tissue, in a database established from healthy lung tissue. This data was separated into a discovery (“training”) dataset and a validation (“test”) dataset.
[114] Des îlots CpG différentiellement méthylés du tissu pulmonaire par rapport aux îlots CpG de tissu sain d'autres organes (rein, cerveau, muscle, estomac, foie, cœur, intestin) ont ensuite été identifiés. Les positions les plus différentiellement méthylées ont été sélectionnées, 432 positions ont donc été retenues. [114] Differentially methylated CpG islands from lung tissue compared to CpG islands from healthy tissue from other organs (kidney, brain, muscle, stomach, liver, heart, intestine) were then identified. The most differentially methylated positions were selected, 432 positions were therefore retained.
[115] Parmi ces 432 positions, un affinage a été réalisé par une sélection manuelle. Des positions sont retenues en fonction de leur moyenne de méthylation dans les tissus pulmonaires et non pulmonaires. 4 positions candidates ont été sélectionnées. [115] Among these 432 positions, refinement was carried out by manual selection. Positions are retained based on their average methylation in lung and non-lung tissues. 4 candidate positions were selected.
[116] Les performances de ces quatre positions pour discriminer un tissu pulmonaire d'un tissu non pulmonaire ont été analysées, au moyen d'un modèle de régression logistique pénalisée selon la méthode LASSO. Le test statistique AUROC obtenu permet de conclure que plusieurs îlots CpG permettent d'identifier un tissu pulmonaire avec une forte performance prédictive. [116] The performance of these four positions in discriminating lung tissue from non-lung tissue was analyzed using a penalized logistic regression model using the LASSO method. The AUROC statistical test obtained allows to conclude that several CpG islands make it possible to identify lung tissue with strong predictive performance.
[117] Le tableau 6 ci-dessous rassemble les marqueurs sélectionnés pour chacun des organes cibles. Tableau 6
Figure imgf000032_0001
[117] Table 6 below brings together the markers selected for each of the target organs. Table 6
Figure imgf000032_0001
[118] Différents amplicons ont été générés afin de discriminer chacune des positions identifiées. Les caractéristiques techniques des amorces et sondes sont décrites dans le tableau 4 ci-dessous. Les températures d'hybridation des sondes ont été choisies entre 40° et 54°C pour les sondes et 52 et 60°C pour les amorces, la différence de température d'hybridation entre amorces et sondes est de 5 à 10°C. [118] Different amplicons were generated in order to discriminate each of the identified positions. The technical characteristics of the primers and probes are described in Table 4 below. The hybridization temperatures of the probes were chosen between 40° and 54°C for the probes and 52 and 60°C for the primers, the difference in hybridization temperature between primers and probes is 5 to 10°C.
Tableau 7
Figure imgf000032_0002
Table 7
Figure imgf000032_0002
[119] Pour chaque organe, un test en multiplexage a été construit. Un contrôle interne de la quantité d'ADN circulant total, détectant la quantité d'ADN codant pour l'albumine, est implémenté dans le test. [119] For each organ, a multiplex test was constructed. An internal control of the amount of total circulating DNA, detecting the amount of DNA encoding albumin, is implemented in the test.
EXEMPLE 2 : Validation des biomarqueurs de la dégradation neuronale dans la prise en charge de l'AVC en phase aigüe [120] La validation des biomarqueurs selon l'invention comprend les étapes suivantes :EXAMPLE 2: Validation of biomarkers of neuronal degradation in the management of stroke in the acute phase [120] The validation of the biomarkers according to the invention comprises the following steps:
- l'analyse moléculaire de la conversion de l'ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, - la validation du test de PCR digitale sur de l'ADN synthétique 100 % méthylé et sur de l'ADN génomique non méthylé commercial, - molecular analysis of DNA conversion to droplet digital PCR tests, - validation of the digital PCR test on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA,
- la détermination des paramètres métrologiques, - determination of metrological parameters,
- un contrôle négatif démontrant la spécificité du test, - a negative control demonstrating the specificity of the test,
- un contrôle positif sur des échantillons d'ADN génomique issu de coupes de tissus sains, et la comparaison avec le marquage histologique de référence - a positive control on genomic DNA samples from healthy tissue sections, and comparison with the reference histological marking
[121] L'analyse moléculaire de la conversion de l'ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes est commune aux différents marqueurs. L'ADN acellulaire est d'abord extrait par un procédé d'extraction commercial dédis à l'ADN acellulaire via QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Référence Cat. No. I ID : 55114, Qiagen). L'ADN acellulaire est dosé par fluorimétrie Qubit 4.0™ (kit Invitrogen™ Kits de dosage d'ADN db HS Qubit™ (Référence : Q32851)) puis subit une conversion bisulfite avec le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) ou équivalent commercial. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR digitale en gouttelettes (System Naica (STILLA Technologies)). [121] Molecular analysis of DNA conversion in droplet digital PCR assays is common to the different markers. The cell-free DNA is first extracted by a commercial extraction process dedicated to cell-free DNA via QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Reference Cat. No. I ID: 55114, Qiagen). The cell-free DNA is assayed by Qubit 4.0™ fluorometry (Invitrogen™ HS Qubit™ dsDNA Assay Kits (Reference: Q32851)) then undergoes a bisulfite conversion with the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031). ) or commercial equivalent. The samples are then analyzed by droplet digital PCR (System Naica (STILLA Technologies)).
[122] Le design des amorces et sondes nécessaires à la réaction de PCR pour les cibles APC2 et NBR1 sont mentionnés dans le Tableau 7. Des sondes de type Taqman-Mgb sont utilisées (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec). La mise en œuvre de la réaction d'amplification par PCR est effectuée en un procédé comprenant 3 étapes principales présentées ci-dessous, ce procédé est désigné [122] The design of the primers and probes necessary for the PCR reaction for the APC2 and NBR1 targets are mentioned in Table 7. Taqman-Mgb type probes are used (Reference: PB-MGBEF-006, PB-MGBEC- 006 and PB-MGBEH-006, Eurogentec). The implementation of the PCR amplification reaction is carried out in a process comprising 3 main steps presented below, this process is designated
« amplification par PCR selon l'invention » dans le reste du texte de la présente demande. “PCR amplification according to the invention” in the rest of the text of the present application.
[123] La préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le Tableau 8 suivant. [123] The preparation of the specific primer-probe cocktail is presented in the following Table 8.
Tableau 8
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Table 8
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[124] La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le Tableau 9 suivant. [124] The preparation of the PCR reaction mix is presented in the following Table 9.
Tableau 9
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Table 9
Figure imgf000034_0002
[125] La réaction de PCR est présentée dans le Tableau 10. Table 10
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[125] The PCR reaction is shown in Table 10. Table 10
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[126] Les plaques sont lues selon le réglage d'acquisition suivant : 120 ms canal FAM (bleu) - 180 ms canal HEX/VIC (vert) - 38 ms canal Cy5 (Rouge)) pour une lecture avec le système Naica de STILLA Technologies. [127] Validation du test de PCR digitale : Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l'ADN synthétique 100% méthylé et sur de l'ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d'ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d'ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2. [126] The plates are read according to the following acquisition setting: 120 ms FAM channel (blue) - 180 ms HEX/VIC channel (green) - 38 ms Cy5 channel (Red)) for reading with the STILLA Naica system Technology. [127] Validation of the digital PCR test: The digital PCR test is then validated on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA. 3 synthetic DNA samples (100% methylated, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Reference: D5011) and 3 commercial genomic DNA samples (unmethylated, Promega G1521) were analyzed as follows: Step 1: Bisulfite conversion by the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then Step 2: Analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers NBR1 and APC2.
[128] Les résultats sur les contrôles ADN 100% méthylés montrent que les marqueurs épigénétiques ciblés sur les gènes NBR1 et APC2 sont bien détectés et quantifiables par le test selon l'invention. Les résultats sur les contrôles ADN non méthylés montrent que les marqueurs NBR1 et APC2 développés sont bien détectables si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n'y a pas de détection des marqueurs dans des contrôles à ADN non méthylés. [128] The results on the 100% methylated DNA controls show that the epigenetic markers targeted on the NBR1 and APC2 genes are well detected and quantifiable by the test according to the invention. The results on the unmethylated DNA controls show that the developed NBR1 and APC2 markers are indeed detectable if and only if the targeted regions are hypermethylated. There is no detection of markers in unmethylated DNA controls.
[129] La spécificité du test a été vérifiée par un contrôle en présence d'ADN issu de cellules mononucléées de sang périphérique, dites « PBMC » (Peripheral Blood Monocyte Cells) de sujets sains. [129] The specificity of the test was verified by a control in the presence of DNA from peripheral blood mononuclear cells, called “PBMC” (Peripheral Blood Monocyte Cells) from healthy subjects.
[130] 10 échantillons d'ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 selon l'invention décrite. [130] 10 genomic DNA samples were extracted from white blood cell pellets of healthy subjects using the Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID: 51104. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers NBR1 and APC2 according to the invention described.
[131] Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que le test est spécifique car il ne présente pas de bruit biologique au niveau de l'ADN génomique issu des globules blancs. Par « bruit biologique » on entend un bruit de fond des marqueurs épigénétiques sur des échantillons considérés comme négatifs ou non méthylés. En d'autres termes, la détection des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 génère un signal négligeable sur des échantillons considérés comme non négatifs ou non méthylés. [131] The negative results of the test for the epigenetic markers tested show that the test is specific because it does not present biological noise at the level of genomic DNA from white blood cells. By “biological noise” we mean background noise of epigenetic markers on samples considered negative or unmethylated. In other words, the detection of the neurological markers NBR1 and APC2 generates a negligible signal on samples considered non-negative or non-methylated.
[132] La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d'ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d'ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID : 55114. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 selon l'invention décrite. Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que celui-ci ne présente pas de bruit biologique au niveau de l'ADN acellulaire/plasmatique issu du plasma de sujets sains. [132] The specificity of the test was also verified in the presence of plasma DNA from healthy subjects. 10 plasma DNA samples were extracted from 1 mL of plasma from healthy subjects using the Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID: 55114. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) followed by PCR analysis. digitale System Naica of the neurological markers NBR1 and APC2 according to the invention described. The negative results of the test for the epigenetic markers tested show that it does not present biological noise at the level of cell-free/plasma DNA from the plasma of healthy subjects.
[133] Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d'ADN génomique d'autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d'échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d'anatomopathologique des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est). Par échantillon, 3 copeaux de 8 pm d'épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d'origine cérébraux ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons d'ADN ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 selon l'invention décrite. Les résultats montrent un bruit biologique très faible dans les tissus d'ADN génomique autre que les tissus d'origine cérébrale. Si les deux biomarqueurs APC2 et NBR1 sont pris en compte, le bruit biologique est inférieur à 2%. Les résultats du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que celui-ci présente un bruit biologique négligeable voir absent au niveau de l'ADN génomique issu des différentes coupes tissulaires (autre que le cerveau). [133] Finally, the specificity of the test was determined in the presence of genomic DNA from other tissues. N = 27 healthy tissue samples were collected (Transmission of biological samples MTA No. CT 69HCL22_0234 from the anatomopathological service of the Hospices Civiles de Lyon Sud et Est). Per sample, 3 shavings of 8 μm thickness of tissues prepared in paraffin were given. The genomic DNAs of the tissue chips of brain origin were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The DNA samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers NBR1 and APC2 according to the invention described. The results show very low biological noise in genomic DNA tissues other than tissues of brain origin. If the two biomarkers APC2 and NBR1 are taken into account, the biological noise is less than 2%. The results of the test for the epigenetic markers tested show that it presents negligible or even absent biological noise at the level of the genomic DNA from the different tissue sections (other than the brain).
[134] Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d'ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus cérébraux sains, par comparaison avec le marquage histologique anti-NeuN. [134] A positive control is carried out on genomic DNA samples from tissue sections of healthy brain tissue, by comparison with anti-NeuN histological staining.
[135] 12 échantillons de tissus cérébraux sains ont été recueillis (Cession d'échantillons biologique MTA n° VAL 2022/2022-234/01 auprès du service d'anatomopathologie de l'hôpital Lariboisière du Pr Homa Adie Biassette). 1 échantillon = Lame blanche marquée par l'anticorps anti-neuN (anticorps neuronal, Ref ABN91, sigma Aldricht-Merck) et 3 copeaux de 8 pm d'épaisseur de tissus préparés en paraffine. [135] 12 samples of healthy brain tissue were collected (Transmission of biological samples MTA no. VAL 2022/2022-234/01 from the anatomopathology department of the Lariboisière hospital of Professor Homa Adie Biassette). 1 sample = White slide marked with the anti-neuN antibody (neuronal antibody, Ref ABN91, sigma Aldricht-Merck) and 3 shavings of 8 μm thickness of tissue prepared in paraffin.
[136] Les cellules neuronales marquées par l'anticorps anti-NeuN ont été comptées par le logiciel de précision « HALO® image analysis ». Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d'origine cérébraux ont été extraits via le kit « Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit » (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons d'ADN ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 selon l'invention décrite. [137] Les marqueurs neuronaux APC2 et NBR1 sont identifiés dans 12 échantillons sur 12 échantillons testés. Une proportion identique de neurones dans les coupes tissulaires cérébrales saines est observée entre le marqueur histologique anti-NeuN et les marqueurs épigénétiques APC2 et NBR1. Une corrélation entre les marqueurs épigénétiques APC2 / NBR1 et le marqueur histologique anti-NeuN est relevée (Coefficient R de Pearson = 0,44 et 0,46 respectivement pour les marquages épigénétiques APC2 et NBR1 par rapport au marquage anti-NeuN). Les résultats sont indiqués dans le tableau 11 ci-dessous et dans la Figure 1. [136] The neuronal cells marked by the anti-NeuN antibody were counted by the “HALO® image analysis” precision software. The genomic DNAs from the tissue chips of brain origin were extracted using the “Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit” (50) (Cat. No. / ID: 56604). The DNA samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers NBR1 and APC2 according to the invention described. [137] The neuronal markers APC2 and NBR1 are identified in 12 samples out of 12 samples tested. An identical proportion of neurons in healthy brain tissue sections is observed between the histological marker anti-NeuN and the epigenetic markers APC2 and NBR1. A correlation between the APC2/NBR1 epigenetic markers and the anti-NeuN histological marker is noted (Pearson's R coefficient = 0.44 and 0.46 respectively for the APC2 and NBR1 epigenetic markings compared to the anti-NeuN marking). The results are shown in Table 11 below and Figure 1.
Tableau 11
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Table 11
Figure imgf000037_0001
[138] Les données de la corrélation entre le dosage quantitatif des marqueurs cérébraux (neurones) et du marquage histologique Anti-NeuN (marqueur cellulaire neuronal) montrent une corrélation entre les marquages moléculaires et histologiques (coefficient de Pearson R = 0,46 et 0,44 respectivement pour NBR1 et APC2) confirmant la spécificité neuronale (cellules cérébrales) du test. [138] Data from the correlation between the quantitative dosage of brain markers (neurons) and histological Anti-NeuN marking (neuronal cell marker) show a correlation between molecular and histological markings (Pearson coefficient R = 0.46 and 0 .44 respectively for NBR1 and APC2) confirming the neuronal (brain cell) specificity of the test.
[139] Dans une application clinique, un test selon l'invention permet de stratifier les patients atteints d'AVC selon son indice de sévérité. Les résultats montrent une élévation de la moyenne quantitative des marqueurs APC2 et NBR1 chez les patients atteints d'un AVC ischémique aiguë (AVC) par rapport aux patients atteints d'un AVC ischémique transitoire (AIT) (moyenne respective de 11,32 copies/ml de plasma pour l'AIT versus 75 copies/mL de plasma pour l'AIA). Les résultats sont présentés dans la Figure 2. [139] In a clinical application, a test according to the invention makes it possible to stratify patients suffering from stroke according to its severity index. Results show an elevation in the quantitative mean of APC2 and NBR1 markers in patients with acute ischemic stroke (CVA) compared to patients with ischemic stroke transient (AIT) (respective average of 11.32 copies/ml of plasma for AIT versus 75 copies/ml of plasma for AIA). The results are presented in Figure 2.
EXEMPLE 3 : Validation d'un premier groupe biomarqueurs de la dégradation rénale dans la prise en charge du patient greffé du rein [140] La validation des biomarqueurs PDE4D et PAX2 comprend l'analyse moléculaire de la conversion de l'ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, le design des amorces et sondes Taqman-mgb (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec) sont identiques à celle décrite dans l'exemple 2 (cf : Méthodologie d'analyse partie commune). La mise en œuvre de la réaction d'amplification par PCR comprend la préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le tableau 12 suivant. EXAMPLE 3: Validation of a first group of biomarkers of renal degradation in the management of kidney transplant patients [140] The validation of the biomarkers PDE4D and PAX2 includes the molecular analysis of the conversion of DNA to PCR tests droplet digitalis, the design of the Taqman-mgb primers and probes (Reference: PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 and PB-MGBEH-006, Eurogentec) are identical to that described in example 2 (see: Methodology common part analysis). The implementation of the PCR amplification reaction includes the preparation of the specific primer-probe cocktail is presented in the following Table 12.
Tableau 12
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Table 12
Figure imgf000038_0001
[141] La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le tableau 13 suivant. Tableau 13
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[141] The preparation of the PCR reaction mix is presented in the following table 13. Table 13
Figure imgf000038_0002
[142] La réaction de PCR est réalisée comme indiqué dans le tableau 10 (exemple 2).[142] The PCR reaction is carried out as indicated in Table 10 (example 2).
Les plaques sont lues comme indiqué dans l'exemple 2. [143] Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l'ADN synthétique 100% méthylé et sur de l'ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d'ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d'ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2. Les résultats sur des ADN synthétiques montrent que : 1/ Sur les contrôles ADN 100% méthylés : les marqueurs épigénétiques ciblés sur les gènes PDE4D et Pax2 sont bien détectés et quantifiables par notre test. 2/ Sur les contrôles ADN non méthylés : Les marqueurs PDE4D et Pax2 développés sont bien détectables si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n'y a pas de détection des marqueurs dans des contrôles à ADN non méthylés. The plates are read as indicated in Example 2. [143] The digital PCR test is then validated on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA. 3 synthetic DNA samples (100% methylated, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Reference: D5011) and 3 commercial genomic DNA samples (unmethylated, Promega G1521) were analyzed as follows: Step 1: Bisulfite conversion by the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then Step 2: Analysis by System Naica digital PCR of the renal markers PDE4D and Pax2. The results on synthetic DNA show that: 1/ On the 100% methylated DNA controls: the epigenetic markers targeted on the PDE4D and Pax2 genes are well detected and quantifiable by our test. 2/ On unmethylated DNA controls: The PDE4D and Pax2 markers developed are detectable if and only if the targeted regions are hypermethylated. There is no detection of markers in unmethylated DNA controls.
[144] Les résultats montrent que les cibles PDE4D et PAX2 ne sont pas détectées dans de l'ADN non méthylé commercial. [144] The results show that PDE4D and PAX2 targets are not detected in commercial unmethylated DNA.
[145] Les inventeurs déterminent les paramètres métrologiques types, notamment la répétabilité et la sensibilité du test. Le test est répétable avec un coefficient de variation de 4,5% et de 0,6% respectivement pour les marqueurs Pax2 et PDE4D. Le test est sensible à 0,01% et permet une quantification jusqu'à une limite de respectivement 0,15 ng et 0,3 ng d'ADN pour les marqueurs PDE4D et Pax2. [145] The inventors determine typical metrological parameters, including test repeatability and sensitivity. The test is repeatable with a coefficient of variation of 4.5% and 0.6% for the Pax2 and PDE4D markers respectively. The test is sensitive to 0.01% and allows quantification up to a limit of 0.15 ng and 0.3 ng of DNA respectively for the PDE4D and Pax2 markers.
[146] La spécificité du test a été vérifiée en présence d'ADN issu de PBMC (globules blancs) de sujets sains. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l'analyse dans l'ADN des PBMCs. [146] The specificity of the test was verified in the presence of DNA from PBMC (white blood cells) from healthy subjects. The markers are not detected when analyzed in the DNA of PBMCs.
[147] 10 échantillons d'ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l'invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l'analyse des ADNs génomiques issus des culots de globules blancs de sujets sains (= absence de bruit de fond biologique). [147] 10 genomic DNA samples were extracted from white blood cell pellets of healthy subjects using the Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID: 51104. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the renal markers PDE4D and Pax2 according to the invention described. The markers are not detected during the analysis of genomic DNAs from white blood cell pellets from healthy subjects (= absence of biological background noise).
[148] La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d'ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d'ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1,5 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID : 55114. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l'invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l'analyse dans l'ADN plasmatique (ADN cellulaire) de sujets sains. [148] The specificity of the test was also verified in the presence of plasma DNA from healthy subjects. 10 plasma DNA samples were extracted from 1.5 mL of plasma from healthy subjects using the Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID: 55114. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) followed by PCR analysis. digitale System Naica of the renal markers PDE4D and Pax2 according to the invention described. The markers are not detected when analyzed in plasma DNA (cellular DNA) of healthy subjects.
[149] Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d'ADN génomique issus d'autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d'échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d'anatomopathologie des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est et de l'Hôpital Lariboisière). Par échantillon, 3 copeaux de 8 pm d'épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l'invention décrite. Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques PDE4D et Pax2 montrent que ceux-ci n'ont pas été détectés dans les ADN génomiques issus des coupes de tissus autres que le rein confirmant l'absence d'un bruit biologique. [149] Finally, the specificity of the test was determined in the presence of genomic DNA from other tissues. N = 27 healthy tissue samples were collected (Transmission of biological samples MTA No. CT 69HCL22_0234 to the anatomopathology department of the Hospices Civiles de Lyon Sud et Est and the Lariboisière Hospital). Per sample, 3 shavings of 8 μm thickness of tissues prepared in paraffin were given. Genomic DNAs from the tissue chips were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the renal markers PDE4D and Pax2 according to the invention described. The negative results of the test for the epigenetic markers PDE4D and Pax2 show that these were not detected in the genomic DNAs from tissue sections other than the kidney, confirming the absence of biological noise.
[150] Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d'ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus rénaux sains. 12 échantillons de tissus rénaux sains ont été recueillis auprès du service d'anatomopathologie des Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l'invention décrite. [150] A positive control is carried out on genomic DNA samples from tissue sections of healthy kidney tissue. 12 healthy kidney tissue samples were collected from the pathology department of the Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Genomic DNAs from the tissue chips were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the renal markers PDE4D and Pax2 according to the invention described.
[151] Les marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 sont identifiés dans 12 échantillons sur 12 échantillons testés. Ainsi, ces travaux confirment la spécificité rénale du test de digital PCR PDE4D et Pax2 décrit. [151] The renal markers PDE4D and Pax2 are identified in 12 samples out of 12 samples tested. Thus, this work confirms the renal specificity of the PDE4D and Pax2 digital PCR test described.
[152] La quantité d’ADN circulant d’origine rénal est plus élevée dans le plasma des patients présentant un haut risque de rejet de greffe versus le plasma des patients présentant un faible risque de rejet de greffe durant les premiers jours post-greffe rénale (Figure 3). [152] The quantity of circulating DNA of renal origin is higher in the plasma of patients with a high risk of graft rejection versus the plasma of patients with a low risk of graft rejection during the first days post-kidney transplant. (Figure 3).
[153] La fraction d’ADN circulant d’origine rénal est plus élevée dans le plasma des patients présentant un haut risque de rejet de greffe versus le plasma des patients présentant un faible risque de rejet de greffe durant les 1ers jours post-greffe rénale (Figure 4). [154] Le dosage quantitatif des marqueurs PD4ED et Pax2 dans les urines par le test décrit est plus élevé chez les patients avec un rejet de greffe confirmé par biopsie que chez des patients ne présentant pas de rejet de greffe. Ce dosage permet de stratifier les patients avec un rejet de greffe confirmé par biopsie et les patients ne présentant pas de rejet de greffe (Figure 5). [153] The fraction of circulating DNA of renal origin is higher in the plasma of patients with a high risk of graft rejection versus the plasma of patients with a low risk of graft rejection during the first days post-kidney transplant. (Figure 4). [154] The quantitative dosage of PD4ED and Pax2 markers in urine by the test described is higher in patients with graft rejection confirmed by biopsy than in patients without graft rejection. This assay makes it possible to stratify patients with biopsy-confirmed graft rejection and patients without graft rejection (Figure 5).
EXEMPLE 4 : Validation du biomarqueur SYNE1 de la dégradation pulmonaire dans la prise en charge de l'insuffisance respiratoire aigüe EXAMPLE 4: Validation of the SYNE1 biomarker of pulmonary degradation in the management of acute respiratory failure
[155] La méthodologie d'analyse moléculaire de la conversion de l'ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, le design des amorces et sondes Taqman-mgb (Référence : PB- MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec) sont identiques à celle décrite dans l'exemple 2. La mise en œuvre de la réaction d'amplification par PCR est effectuée comme suit. La préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le tableau 14 suivant. [155] The molecular analysis methodology of DNA conversion to droplet digital PCR tests, the design of Taqman-mgb primers and probes (Reference: PB- MGBEF-006, PB-MGBEC-006 and PB- MGBEH-006, Eurogentec) are identical to that described in Example 2. The implementation of the PCR amplification reaction is carried out as follows. The preparation of the specific primer-probe cocktail is presented in the following table 14.
Tableau 14
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Table 14
Figure imgf000041_0001
[156] La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le tableau 15 suivant. [156] The preparation of the PCR reaction mix is presented in the following table 15.
Tableau 15
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Table 15
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[157] La réaction de PCR est réalisée comme indiqué dans le tableau 10 (exemple 2). Les plaques sont lues comme indiqué dans l'exemple 2. [157] The PCR reaction is carried out as indicated in Table 10 (example 2). The plates are read as indicated in Example 2.
[158] Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l'ADN synthétique 100% méthylé et sur de l'ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d'ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d'ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1. [158] The digital PCR test is then validated on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA. 3 synthetic DNA samples (100% methylated, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Reference: D5011) and 3 commercial genomic DNA samples (unmethylated, Promega G1521) were analyzed as follows: Step 1: Bisulfite conversion using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then Step 2: System Naica digital PCR analysis of the lung marker SYNE1.
[159] Les résultats sur les contrôles ADN 100% méthylés montrent que le marqueur épigénétique ciblé sur le gène SYNE1 est bien détecté et quantifiable par un test selon l'invention mettant en œuvre ce marqueur. Les résultats sur les contrôles ADN non méthylés montrent que le marqueur SYNE1 développé est bien détectable si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n'y a pas de détection du marqueur dans les contrôles d'ADN non méthylés. [159] The results on the 100% methylated DNA controls show that the epigenetic marker targeted on the SYNE1 gene is indeed detected and quantifiable by a test according to the invention using this marker. The results on the unmethylated DNA controls show that the developed SYNE1 marker is indeed detectable if and only if the targeted regions are hypermethylated. There is no detection of the marker in the unmethylated DNA controls.
[160] La spécificité du test a été vérifiée en présence d'ADN génomique issu de PBMC (globules blancs) de sujets sains. 10 échantillons d'ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1 selon l'invention décrite. Le marqueur n'est pas détecté lors de l'analyse de l'ADN génomique issu des PBMCs [160] The specificity of the test was verified in the presence of genomic DNA from PBMC (white blood cells) of healthy subjects. 10 genomic DNA samples were extracted from white blood cell pellets of healthy subjects using the Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID: 51104. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker SYNE1 according to the invention described. The marker is not detected when analyzing genomic DNA from PBMCs
[161] La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d'ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d'ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1,5 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID : 55104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1 selon l'invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l'analyse dans l'ADN génomique de sujets sains. [161] The specificity of the test was also verified in the presence of plasma DNA from healthy subjects. 10 plasma DNA samples were extracted from 1.5 mL of plasma from healthy subjects using the Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID: 55104. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo kit Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker SYNE1 according to the invention described. The markers are not detected when analyzed in genomic DNA from healthy subjects.
[162] Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d'ADN génomique d'autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d'échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d'anatomopathologie des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est et de l'Hôpital Lariboisière). Par échantillon, 3 copeaux de 8 pm d'épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d'origine cérébraux ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1 selon l'invention décrite. Les résultats négatifs du test pour le marqueur épigénétique SYNE1 montrent que celui-ci n'est pas été détecté dans les ADN génomiques issus des coupes de tissus autres que le poumon confirmant l'absence d'un bruit biologique. [162] Finally, the specificity of the test was determined in the presence of genomic DNA from other tissues. N = 27 healthy tissue samples were collected (Transmission of biological samples MTA No. CT 69HCL22_0234 to the anatomopathology department of the Hospices Civiles de Lyon Sud et Est and the Lariboisière Hospital). Per sample, 3 shavings of 8 μm thickness of tissues prepared in paraffin were given. The genomic DNAs of the tissue chips of brain origin were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker SYNE1 according to the invention described. The negative results of the test for the epigenetic marker SYNE1 show that it was not detected in the genomic DNAs from tissue sections other than the lung, confirming the absence of biological noise.
[163] Contrôle positif : Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d'ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus pulmonaires sains, par comparaison avec le marquage histologique. 18 échantillons de tissus pulmonaires sains (1 lame blanche et 3 copeaux de 8 pm d'épaisseurs préparés en paraffine) ont été recueillis auprès du service d'anatomopathologie des Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Pour chaque échantillon, un marquage par un anticorps anti-TTFl sur les lames blanches a été effectuées (anticorps TTF1, Référence : DB089-0.5 Rabbit Monoclonal Anti-TTF-1 Clone (G21-G), DB Biotech) et chaque cellule marquée TTF1 (= pneumocytes pulmonaires) a été comptée au moyen du logiciel « HALO® image analysis ». Les échantillons ont été marqués par l'anticorps TTF1. En parallèle, les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires de 8 pm d'épaisseur préparé en paraffine ont été extrait via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1 selon l'invention décrite. [163] Positive control: A positive control is carried out on genomic DNA samples from tissue sections of healthy lung tissue, by comparison with the histological marking. 18 samples of healthy lung tissue (1 white slide and 3 shavings of 8 μm thickness prepared in paraffin) were collected from the anatomopathology department of the Hospices Civils de Lyon Sud et Est. For each sample, labeling with an anti-TTFl antibody on the blank slides was carried out (TTF1 antibody, Reference: DB089-0.5 Rabbit Monoclonal Anti-TTF-1 Clone (G21-G), DB Biotech) and each cell labeled TTF1 (= pulmonary pneumocytes) was counted using the “HALO® image analysis” software. The samples were labeled with the TTF1 antibody. In parallel, the genomic DNAs from the 8 μm thick tissue chips prepared in paraffin were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker SYNE1 according to the invention described.
[164] Les résultats montrent que la cible hyperméthylée SYNE1 est détectée et quantifiée uniquement dans de l'ADN génomique issu de coupes pulmonaires saines confirmant la spécificité pulmonaire. La corrélation entre le marquage histologique TTF1 (=pneumocytes pulmonaires) et le test pulmonaire décrit est de 0,6 (coefficient R- Pearson) démontrant la spécificité pulmonaire et pneumocytaire de l'analyse (Figure 6). [165] Dans une application clinique, un test selon l'invention permet de stratifier les patients atteints d'un syndrome de détresse respiratoire en phase aigüe (SDRA) selon un indice de sévérité désigné comme faible, sévère ou critique (classification de Berlin). Les résultats montrent que la cible hyperméthylée SYNE1 permet de discriminer chaque sous-groupe de patient (SDRA modéré, sévère, critique). Une différence significative a été observée entre ces 3 groupes (p-value = 0,0073, test Jonckheere-Terpstra). (Figure 7) [164] The results show that the hypermethylated target SYNE1 is detected and quantified only in genomic DNA from healthy lung sections confirming lung specificity. The correlation between the histological TTF1 marking (=pulmonary pneumocytes) and the pulmonary test described is 0.6 (R-Pearson coefficient) demonstrating the pulmonary and pneumocyte specificity of the analysis (Figure 6). [165] In a clinical application, a test according to the invention makes it possible to stratify patients suffering from acute respiratory distress syndrome (ARDS) according to a severity index designated as low, severe or critical (Berlin classification) . The results show that the hypermethylated SYNE1 target makes it possible to discriminate between each patient subgroup (moderate, severe, critical ARDS). A significant difference was observed between these 3 groups (p-value = 0.0073, Jonckheere-Terpstra test). (Figure 7)
[166] Par ailleurs, les résultats du test selon l'invention permettent de suivre l'état pulmonaire de patient atteint d'un SDRA avec des indicateurs de corrélation entre le résultat quantitatif de la cible hyperméthylée SYNE1 et les marqueurs ventilatoire 02 max / FiO2 / PAO2 (respectivement coefficient de corrélation de Pearson de 0,44, 0,29 et 0,29). [166] Furthermore, the results of the test according to the invention make it possible to monitor the pulmonary condition of a patient suffering from ARDS with correlation indicators between the quantitative result of the hypermethylated target SYNE1 and the ventilatory markers 02 max / FiO2 / PAO2 (Pearson correlation coefficient of 0.44, 0.29 and 0.29, respectively).
EXEMPLE 5 : Validation d'un deuxième groupe biomarqueurs de la dégradation rénale dans la prise en charge du patient greffé du rein EXAMPLE 5: Validation of a second group of biomarkers of renal degradation in the management of kidney transplant patients
[167] Deux types de tests diagnostiques ciblant le rejet de greffe rénale et la typologie des lésions rénales (total, vasculaire et épithélial) ont été développés en sélectionnant parmi les marqueurs identifiés par les inventeurs. [167] Two types of diagnostic tests targeting renal graft rejection and the typology of renal lesions (total, vascular and epithelial) were developed by selecting among the markers identified by the inventors.
[168] Selon le prototype 1, les marqueurs SEPT5 (marqueur endothélial glomérulaire) ; PDE4D / PAX2 / ACSL5 (marqueur épithélial tubulaire) ; CTDP1 (marqueur rein total) sont testés sur des échantillons urinaires. [168] According to prototype 1, the SEPT5 markers (glomerular endothelial marker); PDE4D / PAX2 / ACSL5 (tubular epithelial marker); CTDP1 (total kidney marker) are tested on urine samples.
[169] Selon le prototype 2, les marqueurs GATA2 (marqueur endothélial rénal) ; TNS2-AS1 (marqueur endothélial capillaires rénaux) / PDE4D / PAX2 (marqueur épithélial tubulaire) ; CTDP1 (marqueur rein total) sont testés sur des échantillons plasmatiques. [169] According to prototype 2, GATA2 markers (renal endothelial marker); TNS2-AS1 (renal capillary endothelial marker) / PDE4D / PAX2 (tubular epithelial marker); CTDP1 (total kidney marker) are tested on plasma samples.
[170] Pour les 2 prototypes, le marqueur « Albumine » est utilisé en tant que marqueur ubiquitaire quantifiant tous les génomes présents dans l'échantillon. Les échantillons biologiques ont été obtenus par l'intermédiaire de partenaires hospitaliers des services de néphrologie de Necker et de l'hôpital Tenon-Pitié-Salpêtrière. [170] For the 2 prototypes, the “Albumin” marker is used as a ubiquitous marker quantifying all the genomes present in the sample. The biological samples were obtained through hospital partners from the nephrology departments of Necker and the Tenon-Pitié-Salpêtrière hospital.
[171] Les concentrations des différents biomarqueurs associés en multiplex (ici sur un mix PCR) composant le kit dédié au suivi de l'état de la souffrance tissulaire rénal dans le cadre de la transplantation rénale au niveau de l'organe total, de sa fraction épithéliale et de sa fraction vasculaire sont utilisés selon les concentrations données dans le tableau 16 ci-dessous. [171] The concentrations of the different biomarkers associated in multiplex (here on a PCR mix) making up the kit dedicated to monitoring the state of renal tissue damage in the context of renal transplantation at the level of the total organ, its epithelial fraction and its vascular fraction are used according to the concentrations given in Table 16 below.
Tableau 16
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Table 16
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[172] Après validation de ces 2 prototypes au niveau métrologique (précision, répétabilité, reproductibilité), les 2 prototypes ont été testés sur différents contrôles biologiques dits « positifs » (ADN génomique issu de rein) et des contrôles dit « négatifs » (ADN génomique issu du foie, des globules blancs et d'ADN circulant plasmatique et urinaire issus de sujets sains) (Figure 9). L'ADN génomique du foie ainsi que des globules blancs sont des contrôles évalués dans le design de ce test et de cette méthodologie car ils sont des contributeurs de l'ADN circulant urinaire et plasmatique chez le sujet sain. [173] Ces analyses ont permis de confirmer l'absence de détection ou la détection à très bas bruit de nos biomarqueurs dans des échantillons biologiques de contrôles négatifs : N = 20 échantillons d'ADN génomiques extraits à partir de culots cellulaires de sujets sains, N = 30 échantillons d'ADN plasmatique de sujets sains, N = 15 échantillons d'ADN urinaire de sujets sains, N = 5 échantillons d'ADN génomiques extraits de coupes tissulaires (5 ADNg foie). [174] Ces ADNg ont été mentionnés comme potentiels contributeurs à bas bruit de l'ADN circulant chez le sujet sain : respectivement cf-DNA urinaire et cf-DNA plasmatique 5. [172] After validation of these 2 prototypes at the metrological level (precision, repeatability, reproducibility), the 2 prototypes were tested on different so-called “positive” biological controls (genomic DNA from kidney) and so-called “negative” controls (DNA genomics from the liver, white blood cells and circulating plasma and urinary DNA from healthy subjects) (Figure 9). Genomic DNA from the liver as well as white blood cells are controls evaluated in the design of this test and this methodology because they are contributors to circulating urinary and plasma DNA in healthy subjects. [173] These analyzes made it possible to confirm the absence of detection or the very low noise detection of our biomarkers in biological samples from negative controls: N = 20 genomic DNA samples extracted from cell pellets of healthy subjects, N = 30 plasma DNA samples from healthy subjects, N = 15 urinary DNA samples from healthy subjects, N = 5 genomic DNA samples extracted from tissue sections (5 liver gDNA). [174] These gDNAs have been mentioned as potential low-noise contributors to circulating DNA in healthy subjects: respectively urinary cf-DNA and plasma cf-DNA 5.
Résultats : Results :
[175]Les marqueurs cités ci-dessus marqueurs sont détectés dans 100% des ADN génomiques extraits à partir de coupes tissulaires rénales (N = 22). [175]The markers cited above are detected in 100% of genomic DNAs extracted from renal tissue sections (N = 22).
[176]Les marqueurs proposés dans ce prototype de test de diagnostic in vitro permettent de détecter de l'ADN rénal, de façon spécifique avec un très faible bruit biologique dans l'ADN génomique du foie et des globules blancs (principaux contributeurs de l'ADN circulant) (Figure 8). Dans l'ADN circulant plasmatique de sujets sains, il y a un bruit de fond biologique très faible (un peu plus haut pour le marqueur endothélial GATA2 (cohérent avec la littérature)). Concernant l'ADN circulant urinaire de sujets sains, les marqueurs épithéliaux rénaux et pan-rein sont retrouvés, correspondant probablement à la fraction rénale physiologiquement présente dans les urines, en accord avec la littérature. [176]The markers proposed in this prototype in vitro diagnostic test make it possible to detect renal DNA, specifically with very low biological noise in the genomic DNA of the liver and white blood cells (main contributors to the circulating DNA) (Figure 8). In the circulating plasma DNA of healthy subjects, there is a very low biological background (a little higher for the endothelial marker GATA2 (consistent with the literature)). Concerning the circulating urinary DNA of healthy subjects, renal and pan-kidney epithelial markers are found, probably corresponding to the renal fraction physiologically present in the urine, in agreement with the literature.
[177]Le marqueur « rein total » CTDP1 permet de quantifier les fractions endothéliales et épithéliales du rein. Il est retrouvé en plus haute quantité dans les ADN génomiques de rein par rapport aux marqueurs ciblant uniquement la fraction épithéliale et endothéliale. De même, les marqueurs ciblant la fraction endothéliale du rein (GATA2) sont retrouvés en plus grande quantité que les marqueurs TNS2-AS1 et SEPT5 ciblant respectivement des fractions vasculaires plus petites (restreintes respectivement au glomérule et au tubule). [177]The “total kidney” marker CTDP1 makes it possible to quantify the endothelial and epithelial fractions of the kidney. It is found in higher quantities in kidney genomic DNA compared to markers targeting only the epithelial and endothelial fraction. Likewise, the markers targeting the endothelial fraction of the kidney (GATA2) are found in greater quantities than the markers TNS2-AS1 and SEPT5 targeting respectively smaller vascular fractions (restricted respectively to the glomerulus and the tubule).
Exemple 6 : Validation de la spécificité des marqueurs épithéliaux rénaux : Comparaison des marqueurs moléculaires (PAX2 / ACSL5) et du marqueur histologique de l'épithélium rénal CD10 Example 6: Validation of the specificity of renal epithelial markers: Comparison of molecular markers (PAX2/ACSL5) and the histological marker of renal epithelium CD10
[178]Les inventeurs ont montré que les marqueurs PAX2 et ACSL5 ciblent spécifiquement l'épithélium rénal. Ces marqueurs ont donc été testés pour quantifier l'épithélium rénal. Dans l'ADNg de rein total (n=22) et dans l'ADN circulant plasmatique urinaire, ces marqueurs ont montré une corrélation bonne de respectivement R2 = 0,5 et R2 = 0,8, comme indiqué dans la Figure 10 et Figure 11. [178]The inventors have shown that the PAX2 and ACSL5 markers specifically target the renal epithelium. These markers were therefore tested to quantify the renal epithelium. In total kidney gDNA (n=22) and in circulating plasma urine DNA, these markers showed a good correlation of R 2 = 0.5 and R 2 = 0.8, respectively, as shown in Figure 10 and Figure 11.
[179]La publication de Erger et al. a montré qu'une fraction variant de 20 à 50% de l'ADN circulant urinaire total chez le sujet sain a une origine rénale (Erger et al. Genome Medicine, (2020), doi.org/10.1186/sl3073-020-00750-5) en proposant un modèle de déconvolution bio-informatique (cfNOMe) de l'ADN circulant urinaire par séquençage NGS. Cette proportion est confirmée par les présents résultat, suggérant une bonne spécificité des marqueurs en termes de détection de l'ADN circulant d'origine rénale. Par ailleurs, l'ADN circulant urinaire d'origine rénale est plutôt d'origine épithéliale (absence de détection de signal des marqueurs vasculaires ex : GATA2, TNS2-AS1 et SEPT-5 et détection des marqueurs PAX2, ACSL5 et PDE4D (R2 corrélation (PAX2/ACSL5) = 0,80 pour les n = 15 échantillons d'ADN circulant urinaire extraits de sujets sains). [179]The publication by Erger et al. showed that a fraction varying from 20 to 50% of the total circulating urinary DNA in healthy subjects has a renal origin (Erger et al. Genome Medicine, (2020), doi.org/10.1186/sl3073-020-00750 -5) by proposing a bioinformatics deconvolution model (cfNOMe) of circulating urinary DNA by NGS sequencing. This proportion is confirmed by the present results, suggesting a good specificity of markers in terms of detection of circulating DNA of renal origin. Furthermore, circulating urinary DNA of renal origin is rather of epithelial origin (absence of signal detection of vascular markers e.g. GATA2, TNS2-AS1 and SEPT-5 and detection of markers PAX2, ACSL5 and PDE4D (R 2 correlation (PAX2/ACSL5) = 0.80 for n = 15 circulating urinary DNA samples extracted from healthy subjects).
[180]Les résultats montrent que les marqueurs PAX2 & ACSL5 ciblent de manière spécifique l'épithélium rénal. Afin de renforcer les résultats obtenus, des comparaisons entre les données moléculaires des marqueurs PAX2 et ACSL5 et des données histologiques (marquage des cellules épithéliales rénales sur des lames blanches de rein par l'anticorps anti-CD10) ont été effectuées. Pour les n = 22 ADN génomique de rein sain pour lesquels PAX2 et ACSL5 ont été quantifiés, un marquage immunohistochimique des cellules épithéliales rénales via l'anticorps anti-CD10 sur lame blanche appariée a été effectuée. Le CD10 est un marqueur de surface ciblant de manière spécifique les cellules épithéliales au sein d'une coupe de rein. Les données histologiques et moléculaires montrent que la proportion de cellules épithéliales sur ces lames et ADNg appariés de rein varient entre 11 et 40% et qu'il n'y a pas de différence significative entre les marqueurs moléculaires et les marqueurs histologiques ciblant l'épithélium rénal (Figures 12A et 12B). [180]The results show that the PAX2 & ACSL5 markers specifically target the renal epithelium. In order to strengthen the results obtained, comparisons between the molecular data of the PAX2 and ACSL5 markers and histological data (marking of renal epithelial cells on white kidney slides by the anti-CD10 antibody) were carried out. For the n = 22 healthy kidney genomic DNA for which PAX2 and ACSL5 were quantified, immunohistochemical staining of renal epithelial cells via anti-CD10 antibody on paired white slide was performed. CD10 is a surface marker specifically targeting epithelial cells within a kidney slice. Histological and molecular data show that the proportion of epithelial cells on these slides and paired kidney gDNAs vary between 11 and 40% and that there is no significant difference between molecular markers and histological markers targeting the epithelium. renal (Figures 12A and 12B).
Exemple 7 : Analyse sur des échantillons urinaires de patients transplantés du rein Example 7: Analysis on urine samples from kidney transplant patients
[181]Afin de valider la pertinence clinique du premier prototype, une collaboration clinique en partenariat avec l'hôpital Necker et Tenon-Pitié Salpêtrière - Service de néphrologie / transplantation a permis d'analyser respectivement N = 50 échantillons urinaires de patients transplantés du rein avec / sans rejet de greffe, confirmé par analyse anatomopathologie de la biopsie solide, et n = 55 échantillons plasmatiques de patients transplantés du rein présentant des biopsies avec et sans lésions cellulaires, confirmées par l'analyse anatomopathologie. Ces biomarqueurs visent à détecter spécifiquement l'origine cellulaire de la lyse rénale, et ainsi le type de rejet en accord avec la classification du rejet de greffe rénal selon la classification de Banff. [181]In order to validate the clinical relevance of the first prototype, a clinical collaboration in partnership with the Necker hospital and Tenon-Pitié Salpêtrière - Nephrology/transplantation department made it possible to analyze respectively N = 50 urinary samples from kidney transplant patients with/without graft rejection, confirmed by pathology analysis of solid biopsy, and n = 55 plasma samples from kidney transplant patients showing biopsies with and without cell lesions, confirmed by pathology analysis. These biomarkers aim to specifically detect the cellular origin of renal lysis, and thus the type of rejection in accordance with the classification of renal graft rejection according to the Banff classification.
[182]50 échantillons biologiques (2 ml d'échantillons urinaires) de patients transplantés du rein, présentant ou non un rejet de greffe rénal (rejet confirmé par biopsie solide) ont été analysés. Parmi ces patients, 20 présentaient un rejet de greffe de type cellulaire (TCMR) et 30 ne présentaient pas de rejet de greffe. [182]50 biological samples (2 ml of urine samples) from kidney transplant patients, with or without kidney transplant rejection (rejection confirmed by solid biopsy) were analyzed. Of these patients, 20 had cellular type graft rejection (TCMR) and 30 did not have graft rejection.
[183]2mL d'urine ont été recueillis le jour de la biopsie rénale. L'ADN circulant a été extrait et l'ensemble des biomarqueurs (SEPT-5, ACSL5, PAX2, PDE4D, CTDP1) a été analysé, en simultané, par PCR digitale en multiplex (6 couleurs, un pour chaque marqueur et le contrôle interne albumine). [183]2mL of urine was collected on the day of kidney biopsy. Circulating DNA was extracted and all biomarkers (SEPT-5, ACSL5, PAX2, PDE4D, CTDP1) were analyzed, simultaneously, by multiplex digital PCR (6 colors, one for each marker and the albumin internal control).
[184]Une augmentation importante de la quantité des biomarqueurs a été observé dans les urines des patients présentant un rejet de type cellulaire (Wilcoxon test, p-value < 0,001). Un modèle de régression appliqué aux biomarqueurs a montré une bonne sensibilité et spécificité du test diagnostique de respectivement 0,83 et 0,85, avec un score AUC de 0.88. [184]A significant increase in the quantity of biomarkers was observed in the urine of patients with cellular type rejection (Wilcoxon test, p-value < 0.001). A regression model applied to biomarkers showed good sensitivity and specificity of the diagnostic test of 0.83 and 0.85 respectively, with an AUC score of 0.88.
[185]La Figure 13 montre la différence significative de quantification du biomarqueur CTDP1 dans les urines entre des patients présentant un rejet de greffe et ceux ne présentant pas de rejet de greffe rénal (graphique de gauche). Modèle de régression logistique compilant les données quantitatives des biomarqueurs CTDP1, PAX2, PDE4D, ACSL5 et SEPT5 pour prédire la présence ou l'absence d'un rejet de greffe (graphique de droite). [185] Figure 13 shows the significant difference in quantification of the CTDP1 biomarker in urine between patients with graft rejection and those without renal graft rejection (left graph). Logistic regression model compiling quantitative data for biomarkers CTDP1, PAX2, PDE4D, ACSL5 and SEPT5 to predict the presence or absence of graft rejection (right graph).
Exemple 8 : Analyse sur des échantillons plasmatiques de patients transplantés du rein Example 8: Analysis on plasma samples from kidney transplant patients
[186] 55 échantillons biologiques de patients transplantés du rein, présentant ou non un rejet de greffe rénal (rejet confirmé par biopsie solide avec des biopsies présentant des lésions du greffon de type glomérulaire (g), tubulaire (t), vasculaire (v) et capillaire (ptc)) ont été analysés. [186] 55 biological samples from kidney transplant patients, with or without renal graft rejection (rejection confirmed by solid biopsy with biopsies showing glomerular (g), tubular (t), vascular (v) graft lesions and capillary (ptc)) were analyzed.
[187]0,6 à 1,5 mL de plasma ont été recueillis le jour de la biopsie rénale. L'ADN circulant a été extrait et l'ensemble des biomarqueurs (GATA2, TNS2-AS1, PAX2, PDE4D, CTDP1) a été analysé, en simultané, par PCR digitale en multiplex (6 couleurs, un pour chaque marqueur + Contrôle interne Albumine). [187]0.6 to 1.5 mL of plasma was collected on the day of renal biopsy. The circulating DNA was extracted and all the biomarkers (GATA2, TNS2-AS1, PAX2, PDE4D, CTDP1) were analyzed, simultaneously, by multiplex digital PCR (6 colors, one for each marker + Albumin internal control ).
[188]Une augmentation importante de la quantité des biomarqueurs a également été observé dans les plasmas des patients transplantés présentant une dégradation du greffon rénal. Un modèle de régression appliqué aux biomarqueurs a montré une bonne sensibilité et spécificité du test diagnostique de respectivement 0,96 et 0,75, avec un score AUC de 0.82. Ces résultats soulignent la fiabilité du test dans l'analyse du rejet de greffe dans des échantillons plasmatique. Une augmentation importante de la quantité des biomarqueurs vasculaires (spécifiquement les marqueurs GATA2 et TNS2-AS1) a également été observé dans les plasmas des patients présentant des lésions vasculaires du greffon rénal comme attendu (Figure 14). [188]A significant increase in the quantity of biomarkers was also observed in the plasmas of transplanted patients with kidney graft degradation. A regression model applied to biomarkers showed good sensitivity and specificity of the diagnostic test of 0.96 and 0.75 respectively, with an AUC score of 0.82. These results underline the reliability of the test in the analysis of graft rejection in plasma samples. A significant increase in the quantity of vascular biomarkers (specifically the GATA2 and TNS2-AS1 markers) was also observed in the plasmas of patients with vascular lesions of the renal graft as expected (Figure 14).
[189]Un modèle de régression appliqué aux biomarqueurs « rein total » et « vasculaires » (spécifiquement les marqueurs CTDP1, GATA2 et TNS2-ASl) a montré une bonne sensibilité et spécificité du test diagnostique, avec un AUC de 0.878 (Figure 15). [190]Ensemble, ces résultats démontrent : [189]A regression model applied to “total kidney” and “vascular” biomarkers (specifically the CTDP1, GATA2 and TNS2-ASl markers) showed good sensitivity and specificity of the diagnostic test, with an AUC of 0.878 (Figure 15). . [190]Together, these results demonstrate:
-la fiabilité technique du test développé dans la détection des biomarqueurs d'intérêt dans les urines et le plasma des patients, -the technical reliability of the test developed in the detection of biomarkers of interest in the urine and plasma of patients,
- la sensibilité et la spécificité technique du test développé, - l'intérêt clinique du test développé dans la détection d'un rejet de greffe de rein,- the sensitivity and technical specificity of the test developed, - the clinical interest of the test developed in the detection of kidney transplant rejection,
- l'intérêt clinique du test développé dans la caractérisation des lésions, épithéliales et/ou vasculaires, du greffon rénal. - the clinical interest of the test developed in the characterization of epithelial and/or vascular lesions of the renal graft.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type cellulaire d'un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein, ledit kit comprenant : i) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°l, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°2, et/ou [Claim 1] Kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a cell type of an organ chosen from: the brain, the lung and the kidney, said kit comprising: i) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the brain, at least: a forward primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2, and/ Or
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°5. ii) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, au moins : une amorce sens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°8, et iii) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, au moins : - a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 5, or a sequence nucleotide presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 5. ii) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the lung, at least: a sense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 7 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8, and iii) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in the kidney, at least:
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°10, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°ll, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°ll, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 10, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 10 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. ll, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. ll, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°13, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°14, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°14, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 13, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 13 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 14, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 14, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°19, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°19 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°20, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°20, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 19, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 19 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 20, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 20, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°22, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°22 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°23, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°23, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 22, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 22 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 23, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 23, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°25, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°25 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°26, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°26, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 25, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 25 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 26, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 26, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°28, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°28 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°29, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°29, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 28, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 28 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 29, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 29, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°31, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°31 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°32, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°32, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 31, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 31 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 32, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 32, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°34, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°34 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°35, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°35, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 34, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 34 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 35, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 35, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°37, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°37 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°38, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°38, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 37, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 37 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 38, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 38, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°40, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°40 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°41, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°41, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 40, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 40 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 41, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 41, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°43, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°43 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°44, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°44, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 43, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 43 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 44, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 44, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°46, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°46 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°47, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°47, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 46, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 46 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 47, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 47, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°49, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°49 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°50, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°50, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 49, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 49 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 50, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 50, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°52, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°52 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°53, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°53. - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 52, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 52 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 53, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 53.
[Revendication 2] Kit selon la revendication 1, comprenant en outre une sonde comprenant : i) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6 et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°6, ii) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°9 et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°9, et iii) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51, SEQ ID N°54, et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 ou SEQ ID N°54. [Claim 2] Kit according to claim 1, further comprising a probe comprising: i) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in the brain, at least one nucleotide sequence chosen from : SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6 and a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 6, ii) for the detection of a DNA target sequence acellular specific for a type of cells present in the lung, at least one nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 9 and a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 9, and iii) for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in the kidney, at least one nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 54, and a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24 , SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 or SEQ ID No. 54.
[Revendication 3] Kit selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau. Revendication 4] Kit selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon. [Claim 3] Kit according to any one of claims 1 or 2 for the detection in a biological sample of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the brain. Claim 4] Kit according to any one of claims 1 or 2 for the detection in a biological sample of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the lung.
[Revendication 5] Kit selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le rein. [Claim 5] Kit according to any one of claims 1 or 2 for the detection in a biological sample of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the kidney.
[Revendication 6] Procédé d'identification d'un séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans un premier organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, le procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Détermination, dans au moins une base de données de méthylation de l'ADN génomique, de la position et du degré de méthylation des ilôts CpG de séquences spécifiques dudit type cellulaire dudit organe, b) Identification, dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit organe sain, des ilôts CpG spécifiquement hyperméthylés, c) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG d'un deuxième type cellulaire, différent du premier type cellulaire, d) Sélection des îlots CpG uniquement hyperméthylés dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape c), e) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN génomique des organes autres dudit premier organe, f) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN génomique des globules blancs sains, g) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN acellulaire toutes matrices biologiques confondues issus de sujets sains, h) Sélection des îlots CpG uniquement hyperméthylés dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape e, f et g) i) Identification d'une ou plusieurs séquences hyperméthylée cible d'ADN acellulaire spécifique dudit type cellulaire du premier organe à partir de la comparaison réalisée lors de l'étape h). [Claim 6] Method for identifying a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in a first organ chosen from: the lung, the brain and the kidney, the method comprising at least the following steps: a) Determination, in at least one genomic DNA methylation database, of the position and degree of methylation of sequence CpG islands specific to said cell type of said organ, b) Identification, in the genomic DNA of said cell type of said healthy organ, of specifically hypermethylated CpG islands, c) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of a second cell type, different from the first cell type, d) Selection of CpG islands only hypermethylated in the genomic DNA of said cell type of said first organ after comparison carried out in step c), e) Comparison of the degree of methylation of hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the genomic DNA of other organs of said first organ, f) Comparison of the degree of methylation of hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the genomic DNA of healthy white blood cells, g) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the cell-free DNA all biological matrices combined from healthy subjects, h) Selection of CpG islands only hypermethylated in the genomic DNA of said cell type of said first organ after comparison carried out in steps e, f and g) i) Identification of one or more target hypermethylated sequences cell-free DNA specific for said cell type of the first organ from the comparison carried out during step h).
[Revendication 7] Procédé de détection dans un échantillon biologique d'une séquence cible d'ADN acellulaire, ladite séquence étant spécifique d'un type de cellules présent dans un organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait d'un échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant : [Claim 7] Method for detecting in a biological sample a cell-free DNA target sequence, said sequence being specific for a type of cells present in an organ chosen from: the lung, the brain and the kidney, said method comprising at least the following steps: a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, cell-free DNA previously extracted from a biological sample and a pair of primers consisting of a sense primer and a antisense primer, each of the primers comprising:
- une amorce sens et une amorce antisens susceptible de s'hybrider avec une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°55, SEQ ID N°56, SEQ ID N°57, SEQ ID N°58, SEQ ID N°59, SEQ ID N°60, SEQ ID N°61, SEQ ID N°62, SEQ ID N°63, SEQ ID N°64, SEQ ID N°65, SEQ ID N°66, SEQ ID N°67, SEQ ID N°68, SEQ ID N°69, SEQ ID N°70 et SEQ ID N°71, b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b). [Revendication 8] Procédé de détection dans un échantillon biologique d'une séquence cible d'ADN acellulaire selon la revendication 7, ladite séquence étant spécifique d'un type de cellules présent dans un organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait d'un échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant : i) pour la détection d'une séquence cible spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, au moins : une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°l, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°2, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°2, et/ou - a sense primer and an antisense primer capable of hybridizing with a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70 and SEQ ID No. 71, b) Amplification reaction of said target sequence, c) Detection of the presence of the amplified sequence during step b) . [Claim 8] Method for detecting in a biological sample a cell-free DNA target sequence according to claim 7, said sequence being specific for a type of cells present in an organ chosen from: the lung, the brain and the kidney , said method comprising at least the following steps: a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, cell-free DNA previously extracted from a biological sample and a pair of primers constituted by a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising: i) for the detection of a target sequence specific to a type of cells present in the brain, at least: a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 1, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 2, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2, and/ Or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°4, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens comprenant une séquence SEQ ID N°5, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°5., ii) pour la détection d'une séquence cible spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, au moins : au moins une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°7, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens comprenant une séquence SEQ ID N°8, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°8, et iii) pour la détection d'une séquence cible spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, au moins : - une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°10, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°ll, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°ll, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 4, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer comprising a sequence SEQ ID No. 5, or a sequence having at least 80% % identity with SEQ ID No. 5., ii) for the detection of a target sequence specific to a type of cells present in the lung, at least: at least one sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 7 , or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 7 and an antisense primer comprising a sequence SEQ ID No. 8, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8, and iii) for the detection of a target sequence specific to a type of cells present in the kidney, at least: - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 10, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 10 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. ll, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. ll, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°13, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°14, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°14, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 13, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 13 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 14, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 14, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°19, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°19 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°20, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°20, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 19, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 19 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 20, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 20, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°22, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°22 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°23, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°23, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 22, or a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 22 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 23, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 23, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°25, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°25 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°26, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°26, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 25, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 25 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 26, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 26, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°28, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°28 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°29, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°29, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 28, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 28 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 29, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 29, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°31, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°31 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°32, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°32, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 31, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 31 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 32, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 32, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°34, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°34 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°35, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°35, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 34, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 34 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 35, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 35, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°37, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°37 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°38, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°38, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 37, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 37 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 38, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 38, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°40, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°40 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°41, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°41, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 40, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 40 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 41, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 41, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°43, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°43 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°44, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°44, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 43, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 43 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 44, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 44, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°46, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°46 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°47, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°47, et/ou - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 46, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 46 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 47, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 47, and/or
- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°49, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°49 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°50, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°50, et/ou - une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°52, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°52 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°53, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°53, - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 49, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 49 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 50, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 50, and/or - a sense primer comprising a sequence SEQ ID No. 52, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 52 and an antisense primer, comprising a sequence SEQ ID No. 53, or a sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 53,
5 b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b). 5 b) Amplification reaction of said target sequence, c) Detection of the presence of the amplified sequence during step b).
[Revendication 9] Procédé selon la revendication 7 ou 8 pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau. lQRevendication 10] Procédé selon la revendication 7 pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon. [Claim 9] Method according to claim 7 or 8 for the detection in a biological sample of a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in the brain. lQClaim 10] Method according to claim 7 for the detection in a biological sample of a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in the lung.
[Revendication 11] Procédé selon la revendication 7 ou 8 pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de 15 cellules présent dans le rein. [Claim 11] Method according to claim 7 or 8 for the detection in a biological sample of a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in the kidney.
[Revendication 12] Procédé selon la revendication précédente pour la détection du type de cellule rénale qui se dégrade, ledit type cellulaire étant choisi parmi les cellules épithéliales et les cellules vasculaires. [Claim 12] Method according to the preceding claim for detecting the type of renal cell which is deteriorating, said cell type being chosen from epithelial cells and vascular cells.
[Revendication 13] Procédé selon la revendication 11 ou 12 pour la détection d'un rejet 20 de greffe rénal chez un patient transplanté du rein. [Claim 13] Method according to claim 11 or 12 for detecting renal graft rejection in a kidney transplant patient.
[Revendication 14] Procédé selon la revendication 11 ou 12 pour le diagnostic in vitro de la typologie lésionnelle du rejet, ledit rejet étant de type épithélial ou vasculaire, en fonction des analyses histologiques de la biopsie solide du greffon rénal. [Claim 14] Method according to claim 11 or 12 for the in vitro diagnosis of the lesional typology of rejection, said rejection being of epithelial or vascular type, depending on the histological analyzes of the solid biopsy of the renal graft.
[Revendication 15] Utilisation d'un kit selon l'une des revendications 1 à 3, ou d'un 25 procédé selon la revendication 9, pour la détection spécifique de la dégradation du cerveau et/ou pour le diagnostic in vitro ou le suivi de l'évolution d'un AVC. [Claim 15] Use of a kit according to one of claims 1 to 3, or of a method according to claim 9, for the specific detection of brain degradation and/or for in vitro diagnosis or monitoring of the progression of a stroke.
[Revendication 16] Utilisation d'un kit selon l'une des revendications 1, 2 ou 4, ou d'un procédé selon la revendication 10, pour la détection spécifique de la dégradation du poumon et/ou pour le diagnostic in vitro ou le suivi de l'évolution d'un syndrome de[Claim 16] Use of a kit according to one of claims 1, 2 or 4, or of a method according to claim 10, for the specific detection of lung degradation and/or for in vitro diagnosis or monitoring the evolution of a syndrome of
30 détresse respiratoire. 30 respiratory distress.
[Revendication 17] Utilisation d'un kit selon l'une des revendications 1, 2 ou 5, ou d'un procédé selon la revendication 7, 8 ou 11, pour la détection spécifique de la dégradation du rein et/ou pour le diagnostic in vitro ou le suivi d'une insuffisance rénale ou d'un rejet de greffon. [Claim 17] Use of a kit according to one of claims 1, 2 or 5, or of a method according to claim 7, 8 or 11, for the specific detection of degradation of the kidney and/or for in vitro diagnosis or monitoring of renal failure or graft rejection.
[Revendication 18] Séquence nucléotidique pour son utilisation dans un kit selon l'une des revendications 1 à 5, dans un procédé selon l'une des revendications 7 à 11 ou pour une utilisation selon l'une des revendications 12 à 14, choisie parmi : [Claim 18] Nucleotide sequence for its use in a kit according to one of claims 1 to 5, in a method according to one of claims 7 to 11 or for use according to one of claims 12 to 14, chosen from :
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49 et SEQ ID N°52, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ; - a sense primer comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. °22, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 46 , SEQ ID No. 49 and SEQ ID No. 52, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences;
- une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 et SEQ ID N°53, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ; et - an antisense primer comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. °23, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 47 , SEQ ID No. 50 and SEQ ID No. 53, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences; And
- une sonde comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences. - a probe comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 51 and SEQ ID No. 54, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences.
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