FR3139831A1 - METHOD FOR CHARACTERIZING THE DEGRADATION OF AN ORGAN - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un kit et un procédé in vitro de détection et de caractérisation de la dégradation d’un organe ou d’un tissu particulier, fondé sur l’analyse de la présence d’au moins un ADN acellulaire méthylé spécifique dans un échantillon biologique. Plus particulièrement, l’invention a pour objet un kit et un procédé de détection et de caractérisation de la dégradation d’un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein, et/ou d’un tissu présent dans cet organe. L’invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro d’une pathologie ou d’une condition impliquant la lyse d’un organe ou d’un tissu. Figure à publier avec l’abrégé : Figure 1The subject of the present invention is a kit and an in vitro method for detecting and characterizing the degradation of a particular organ or tissue, based on the analysis of the presence of at least one specific methylated cell-free DNA in a biological sample. More particularly, the subject of the invention is a kit and a method for detecting and characterizing the degradation of an organ chosen from: the brain, the lung and the kidney, and/or of a tissue present in this organ. The invention also relates to a method for in vitro diagnosis of a pathology or condition involving the lysis of an organ or tissue. Figure to be published with the abstract: Figure 1
Description
La présente invention a pour objet un kit et un procédéin vitrode détection et de caractérisation de la dégradation d’un organe ou d’un tissu particulier, fondé sur l’analyse de la présence d’au moins un ADN acellulaire méthylé spécifique dans un échantillon biologique. Plus particulièrement, l’invention a pour objet un kit et un procédé de détection et de caractérisation de la dégradation d’un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein, et/ou d’un tissu présent dans cet organe. L’invention a également pour objet un procédé de diagnosticin vitrod’une pathologie ou d’une condition impliquant la lyse d’un organe ou d’un tissu.The subject of the present invention is a kit and an in vitro method for detecting and characterizing the degradation of a particular organ or tissue, based on the analysis of the presence of at least one specific methylated cell-free DNA in a biological sample. More particularly, the subject of the invention is a kit and a method for detecting and characterizing the degradation of an organ chosen from: the brain, the lung and the kidney, and/or of a tissue present in this organ. The invention also relates to a method for in vitro diagnosis of a pathology or a condition involving the lysis of an organ or tissue.
La présente invention se situe donc dans le domaine de la biologie moléculaire appliquée au diagnostic médical.The present invention therefore lies in the field of molecular biology applied to medical diagnosis.
Lors de la prise en charge d’un patient atteint d’une pathologie en phase aiguë, une analyse par imagerie médicale, telle qu’un scanner, une radiographie ou une IRM, est réalisée afin d’établir de façon globale le niveau de souffrance et d’atteinte lésionnelle du patient. Ce type d’examen ne permet pourtant pas de distinguer la lyse organique elle-même d’une atteinte de type inflammatoire. Pourtant, le pronostic et l’intervention thérapeutique réalisés par le personnel médical sont très différents selon la nature de l’atteinte de l’organe ou du tissu. De plus, en cas de phase aigüe, des décisions de prise en charge doivent être prises dans un délai extrêmement court.When treating a patient suffering from an acute pathology, an analysis by medical imaging, such as a scanner, an x-ray or an MRI, is carried out in order to generally establish the level of suffering. and injury to the patient. However, this type of examination does not make it possible to distinguish organic lysis itself from an inflammatory type of attack. However, the prognosis and therapeutic intervention carried out by medical personnel are very different depending on the nature of the damage to the organ or tissue. In addition, in the event of an acute phase, treatment decisions must be made within an extremely short period of time.
Certaines pathologies aigües et relativement répandues ont pour caractéristique commune d’impliquer une lyse tissulaire massive.Certain acute and relatively widespread pathologies have the common characteristic of involving massive tissue lysis.
C’est le cas notamment de l’accident vasculaire cérébral (AVC), dans lequel le tissu cérébral est dégradé, du syndrome de détresse respiratoire aigüe, dans lequel le tissu pulmonaire est dégradé, et de l’insuffisance rénale aigue d’un rein natif ou transplanté, dans lequel le tissu rénal est dégradé.This is particularly the case for stroke, in which brain tissue is damaged, acute respiratory distress syndrome, in which lung tissue is damaged, and acute renal failure of one kidney. native or transplanted, in which kidney tissue is degraded.
Par ailleurs, dans le cas de la transplantation rénale ou pulmonaire, il est essentiel de surveiller l’éventuelle survenue d’un rejet/dysfonctionnement du greffon. Actuellement, le suivi post-opératoire des patients greffés implique une surveillance douloureuse et lourde pour le patient.Furthermore, in the case of kidney or lung transplantation, it is essential to monitor the possible occurrence of graft rejection/dysfunction. Currently, post-operative follow-up of transplant patients involves painful and burdensome monitoring for the patient.
Du fait de l’incidence de l’ensemble de ces pathologies parmi la population, il existe un besoin d’outils permettant de détecter de façon fiable, rapide, simple et peu coûteuse l’éventuelle lyse organique ou tissulaire dans le cadre d’une pathologie aigüe.Due to the incidence of all of these pathologies among the population, there is a need for tools to reliably, quickly, simply and inexpensively detect possible organic or tissue lysis in the context of a acute pathology.
L’ADN acellulaire circulant, également désigné par « ADN libre » est connu de façon générale en tant que marqueur tumoral, mais aussi marqueur d’inflammation et marqueur de stress tissulaire. Les cellules immunitaires contribuent majoritairement à l’élévation de la quantité totale d’ADN circulant.Circulating cell-free DNA, also referred to as “free DNA”, is generally known as a tumor marker, but also an inflammation marker and a tissue stress marker. Immune cells mainly contribute to the increase in the total quantity of circulating DNA.
Il a été montré que l’ADN circulant peut éventuellement être utilisé comme biomarqueur potentiel de maladies auto-immunes de type lupus érythémateux systémique ou la polyarthrite rhumatoïde (Duvvuriet al., «Cell-free DNA as a biomarker in autoimmune rheumatic diseases», Front. Immunol. 10, 2019).It has been shown that circulating DNA can potentially be used as a potential biomarker of autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis (Duvvuri et al ., “ Cell-free DNA as a biomarker in autoimmune rheumatic diseases ”, Front. Immunol. 10, 2019).
L’utilisation, chez un sujet sain, de la caractérisation du profil de méthylation de l’ADN circulant pour identifier l’origine tissulaire dudit ADN circulant a été décrite (Mosset al«Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease», Nat. Commun., 9, 1-12, 2018).The use, in a healthy subject, of the characterization of the methylation profile of circulating DNA to identify the tissue origin of said circulating DNA has been described (Moss et al “ Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell -free DNA in health and disease ”, Nat. Commun., 9, 1-12, 2018).
L’augmentation de la proportion d’ADN circulant issu des hépatocytes chez des patients atteints de maladie inflammatoire du foie a été décrite, les cellules immunitaires contribuant majoritairement à la quantité d’ADN circulant totale (Liuet al(«Comprehensive DNA methylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing», Clin. Epigenetics, 11, 93 2019).The increase in the proportion of circulating DNA from hepatocytes in patients with inflammatory liver disease has been described, with immune cells contributing the majority to the total circulating DNA quantity (Liu et al (“ Comprehensive DNA methylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing ”, Clin. Epigenetics, 11, 93 2019).
WO 2021/216985 «Methods for detecting tissue damage, graft versus host disease and infections using cell-free DNA profiling» divulgue la détection de la dégradation d’un tissu par l’établissement d’un profil de l’ADN circulant dans le cadre de la transplantation de cellules hématopoïétiques allogènes.WO 2021/216985 “ Methods for detecting tissue damage, graft versus host disease and infections using cell-free DNA profiling ” discloses the detection of tissue degradation by establishing a profile of the DNA circulating in the frame of allogeneic hematopoietic cell transplantation.
Le document CN 113999901 «Myocardial specific methylation marker» décrit l’identification et l’utilisation d’un marqueur cardiaque spécifique de l’ADN cellulaire méthylé pour le diagnostic d’un infarctus aigu du myocarde, à partir d’un échantillon de plasma.Document CN 113999901 “ Myocardial specific methylation marker ” describes the identification and use of a cardiac marker specific to methylated cellular DNA for the diagnosis of acute myocardial infarction, from a plasma sample.
Les inventeurs ont mis au point un kit et un procédé de détection spécifique de l’ADN acellulaire méthylé circulant présent dans un échantillon biologique d’un individu et spécifique du cerveau, du poumon ou du rein. Un procédé selon l’invention permet de détecter spécifiquement l’existence d’une lyse massive d’un organe ou d’un tissu particulier. De plus, ce procédé permet de distinguer la lyse d’un organe d’un phénomène inflammatoire d’origine immunitaire. Cette différence physiopathologique est majeure pour le diagnostic du patient et ne peut être discriminée par imagerie médicale.The inventors have developed a kit and a method for specific detection of circulating methylated cell-free DNA present in a biological sample of an individual and specific to the brain, lung or kidney. A method according to the invention makes it possible to specifically detect the existence of massive lysis of a particular organ or tissue. In addition, this process makes it possible to distinguish the lysis of an organ from an inflammatory phenomenon of immune origin. This pathophysiological difference is major for the patient's diagnosis and cannot be discriminated by medical imaging.
Pour chacun de ces organes, les inventeurs ont en effet sélectionné, parmi les régions spécifiquement hyperméthylées de l’ADN circulant, au moins deux régions permettant de développer un test sensible et spécifique de la dégradation dudit organe.For each of these organs, the inventors have in fact selected, among the specifically hypermethylated regions of circulating DNA, at least two regions making it possible to develop a sensitive and specific test for the degradation of said organ.
Les inventeurs ont ainsi conçu, pour chacune de ces régions, une paire d’amorces d’amplification sélective, des conditions d’amplification et une sonde détectant spécifiquement le produit d’amplification généré. Pour chacun des marqueurs, un kit de détection et un procédé de détection sont ainsi fournis. L’invention a aussi pour objet un kit et un procédé permettant la détection d’au moins un marqueur spécifique de la lyse d’un organe. L’invention a de plus pour objet un kit et un procédé permettant la détection simultanée d’au moins deux marqueurs de détection spécifique de la lyse d’un organe, permettant ainsi d’améliorer encore la spécificité et la sensibilité du test. Un test selon l’invention présente également une forte performance diagnostique.The inventors have thus designed, for each of these regions, a pair of selective amplification primers, amplification conditions and a probe specifically detecting the amplification product generated. For each of the markers, a detection kit and a detection method are thus provided. The invention also relates to a kit and a method allowing the detection of at least one marker specific to the lysis of an organ. The invention further relates to a kit and a method allowing the simultaneous detection of at least two markers for specific detection of lysis of an organ, thus making it possible to further improve the specificity and sensitivity of the test. A test according to the invention also has strong diagnostic performance.
L’invention a donc pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse d’un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, à partir d’un échantillon biologique d’un patient. Un kit et un procédé de détection de la lyse cérébrale sont utilisables notamment pour le diagnosticin vitrode l’AVC. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection d’au moins un marqueur choisi parmi « APC2 » et « KRT33B ».The subject of the invention is therefore a kit and a method for detecting the lysis of an organ chosen from the brain, the lung and the kidney, from a biological sample of a patient. A kit and a method for detecting brain lysis can be used in particular for the in vitro diagnosis of stroke. This kit and this method are based on the detection of at least one marker chosen from “APC2” and “KRT33B”.
L’invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse pulmonaire, utilisables notamment pour le diagnosticin vitrode la détresse respiratoire aigüe ou d’un éventuel rejet de greffon pulmonaire. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection du marqueur « LINC00336 ».The invention also relates to a kit and a method for detecting lung lysis, usable in particular for the in vitro diagnosis of acute respiratory distress or possible lung graft rejection. This kit and this method are based on the detection of the marker “LINC00336”.
L’invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse rénale, utilisables notamment pour le diagnosticin vitrode l’insuffisance rénale aigue et, dans le cas d’un patient greffé, du rejet de la greffe. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection d’au moins un marqueur choisi parmi « PDE4D » et « PAX2 ».The invention also relates to a kit and a method for detecting renal lysis, usable in particular for the in vitro diagnosis of acute renal failure and, in the case of a transplant patient, rejection of the graft. This kit and this method are based on the detection of at least one marker chosen from “PDE4D” and “PAX2”.
Un kit et un procédé selon l’invention présentent donc le grand avantage d’offrir un test peu invasif, car il est réalisé à partir d’un échantillon biologique aisément prélevé, fiable, rapide et peu coûteux. Du fait de sa nature peu invasive, un procédé selon l’invention peut aisément, si nécessaire, être renouvelé à différents stades de la pathologie, ce qui permet un suivi fiable de l’évolution de ladite pathologie et assure une prise en charge médicale adaptée à chacun de ces stades.A kit and a method according to the invention therefore have the great advantage of offering a minimally invasive test, because it is carried out from a biological sample that is easily collected, reliable, rapid and inexpensive. Due to its minimally invasive nature, a method according to the invention can easily, if necessary, be repeated at different stages of the pathology, which allows reliable monitoring of the evolution of said pathology and ensures appropriate medical care. at each of these stages.
La sensibilité et la spécificité du test de la présence de chacun des marqueurs ont été vérifiés. Un kit et un procédé selon l’invention présentent en outre l’avantage d’être reproductibles, rapides et peu coûteux.The sensitivity and specificity of the test for the presence of each marker were verified. A kit and a method according to the invention also have the advantage of being reproducible, rapid and inexpensive.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’ADN acellulaire méthylé en tant que marqueur de la dégradation du cerveau, du rein ou du poumon, ou de la dégradation d’un tissu du cerveau, du rein ou du poumon.The invention also relates to the use of methylated cell-free DNA as a marker of degradation of the brain, kidney or lung, or of degradation of brain, kidney or lung tissue.
L’invention a aussi pour objet les amorces et les sondes utilisables dans un kit et un procédé selon l’invention. En particulier, l’invention a pour objet :
- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ; une amorce antisens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ;
- et une sonde, optionnellement marquée, comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences.The invention also relates to the primers and the probes which can be used in a kit and a method according to the invention. In particular, the invention aims to:
- a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with said sequences; an antisense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, or a nucleotide sequence presenting at less than 80% identity with said sequences;
- and a probe, optionally labeled, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences.
L’invention a enfin pour objet un procédéin vitrode détection d’une pathologie ou d’une condition choisie parmi : l’accident vasculaire cérébral (AVC), le syndrome de détresse respiratoire aigüe, l’insuffisance rénale et le rejet de greffe, notamment le rejet de greffe rénale ou de greffe pulmonaire.Finally, the subject of the invention is an in vitro method for detecting a pathology or a condition chosen from: stroke, acute respiratory distress syndrome, renal failure and graft rejection. , notably kidney transplant or lung transplant rejection.
Selon un premier aspect, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein ou d’un tissu présent dans le cerveau, le poumon ou le rein, ledit kit comprenant au moins une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d’ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu.According to a first aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for an organ chosen from: the brain, the lung and the kidney or a tissue present in the brain, lung or kidney, said kit comprising at least one pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA to selectively amplify a methylated cell-free DNA sequence specific to said organ or tissue.
Selon un mode de réalisation de ce premier aspect, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ledit kit comprenant au moins :
- une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d’ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu, et
- une sonde comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec la séquence nucléotidique cible d’ADN amplifiée.According to one embodiment of this first aspect, the invention relates to a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said kit comprising at least:
- a pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA to selectively amplify a methylated cell-free DNA sequence specific to said organ or tissue, and
- a probe comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with the amplified DNA target nucleotide sequence.
Ladite sonde, dite « sonde de détection » est de préférence associée à un marqueur dont la détection est bien connue par une personne du métier. Lorsque plus d’une paire de sonde est utilisée (test multiplexe), la combinaison des marqueurs est choisie afin de distinguer les différentes séquences nucléotidiques amplifiées.Said probe, called “detection probe” is preferably associated with a marker whose detection is well known to a person skilled in the art. When more than one pair of probes is used (multiplex test), the combination of markers is chosen in order to distinguish the different amplified nucleotide sequences.
Selon un aspect plus particulier, un kit selon l’invention comprend une amorce « sens » comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences nucléotidiques SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13.According to a more particular aspect, a kit according to the invention comprises a “sense” primer comprising or consisting of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, or a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with said nucleotide sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13.
Selon un autre aspect plus particulier, un kit selon l’invention comprend une amorce « antisens » comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences nucléotidiques SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14.According to another more particular aspect, a kit according to the invention comprises an “antisense” primer comprising or consisting of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. °11, SEQ ID No. 14, or a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with said nucleotide sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14.
Par « au moins 80 % d’identité » on entend que lesdites séquences présentent au moins 80% d’identité après alignement global optimal, c’est-à-dire par alignement global entre deux séquences donnant le plus fort pourcentage d’identité entre elles. L’alignement global optimal de deux séquences peut notamment être réalisé selon l’algorithme de Needleman-Wunsch, bien connu de l’homme du métier (Needleman & Wunsch, «A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins»,J. Mol. Biol., 48(3) :443-53). Une séquence nucléotidique selon l’invention comprend, ou est constituée par une séquence nucléotidique présentant au moins 80%, avantageusement au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d’identité avec la séquence nucléotidique de référence après alignement global optimal. Avantageusement, une séquence nucléotidique selon l’invention comprend, ou est constituée par une séquence nucléotidique présentant au moins 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d’identité avec la séquence nucléotidique de référence après alignement global optimal.By “at least 80% identity” we mean that said sequences present at least 80% identity after optimal global alignment, that is to say by global alignment between two sequences giving the highest percentage of identity between they. The optimal overall alignment of two sequences can in particular be carried out according to the Needleman-Wunsch algorithm, well known to those skilled in the art (Needleman & Wunsch, “ A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins ”, J. Mol. Biol ., 48(3):443-53). A nucleotide sequence according to the invention comprises, or is constituted by a nucleotide sequence having at least 80%, advantageously at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with the reference nucleotide sequence after optimal global alignment. Advantageously, a nucleotide sequence according to the invention comprises, or is constituted by a nucleotide sequence having at least 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6% , 99.7%, 99.8% or 99.9% identity with the reference nucleotide sequence after optimal global alignment.
Selon cet aspect, une séquence nucléotidique selon l’invention comprenant, ou constituée, d’une séquence présentant au moins 80% d’identité avec la séquence nucléotidique de référence est fonctionnelle, c’est-à-dire qu’elle est capable de s’hybrider sur la séquence nucléotidique cible avec une stabilité suffisante pour permettre l’amplification ou la détection de ladite séquence nucléotidique cible.According to this aspect, a nucleotide sequence according to the invention comprising, or consisting of, a sequence having at least 80% identity with the reference nucleotide sequence is functional, that is to say it is capable of hybridize to the target nucleotide sequence with sufficient stability to allow amplification or detection of said target nucleotide sequence.
Les séquences nucléotidiques des amorces sont désignées comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous :The nucleotide sequences of the primers are designated as shown in Table 1 below:
Les séquences nucléotidiques des sondes sont désignées comme indiqué dans le tableau 2 ci-dessous :The nucleotide sequences of the probes are designated as shown in Table 2 below:
Selon un autre aspect plus particulier, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, ledit kit comprenant au moins :
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2, et/ou
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5.According to another more particular aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the brain, said kit comprising at least:
- a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1 and an antisense primer, comprising, or consisting of, a sequence nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2, and/or
- a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer, comprising, or consisting of, a sequence nucleotide SEQ ID No. 5, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 5.
Parmi les types cellulaires présents dans le cerveau, on peut notamment citer : les cellules neuronales, endothéliales vasculaires cérébrales, péricytes, gliales et dendritiques.Among the cell types present in the brain, we can notably cite: neuronal, cerebral vascular endothelial, pericyte, glial and dendritic cells.
Selon un autre aspect plus particulier, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, ledit kit comprenant au moins une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8.According to another more particular aspect, the subject of the invention is a kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the lung, said kit comprising at least one sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 7 and an antisense primer, comprising, or consisting in, a nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8.
Parmi les types cellulaires présents dans le poumon, on peut notamment citer : les cellules pneumocytaires (I et II), cellules mésenchymateuse (souches), cellules fibroblastiques pulmonaires, épithéliales pulmonaires, endothéliales et péricytes pulmonaires.Among the cell types present in the lung, we can notably cite: pneumocyte cells (I and II), mesenchymal (stem) cells, pulmonary fibroblastic cells, pulmonary epithelial cells, endothelial cells and pulmonary pericytes.
Selon un autre aspect plus particulier, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, ledit kit comprenant au moins :
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°10, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°11, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11, et/ou
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14
- a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 10, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 10 and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 11, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 11, and/or
- a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 13, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 13 and an antisense primer, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 14, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 14
Parmi les tissus présents dans le rein, on peut notamment citer : le tissu fibroblastique rénal, tissu interstitiel rénal, épithélial, vasculaire rénal et les cellules fibroblastiques rénales, glomérulaires, tubulaires, épithéliales rénales, endothéliales et péricytes rénaux, cellules souches rénales.Among the tissues present in the kidney, we can notably cite: renal fibroblastic tissue, renal interstitial tissue, epithelial, renal vascular and renal fibroblastic, glomerular, tubular, renal epithelial, endothelial and renal pericyte cells, renal stem cells.
Un kit selon l’invention comprend, de façon optionnelle une ou plusieurs paires d’amorces constituées par une amorce sens et une amorce antisens, destinées à détecter la présence d’un élément contrôle dans l’échantillon biologique. Cet élément contrôle peut être tout élément approprié choisi par une personne du métier. Ledit élément contrôle peut notamment être l’albumine. Plus particulièrement, un kit selon l’invention peut comprendre une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°16, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°16 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°17, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°17.A kit according to the invention optionally comprises one or more pairs of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, intended to detect the presence of a control element in the biological sample. This control element can be any appropriate element chosen by a person skilled in the art. Said control element may in particular be albumin. More particularly, a kit according to the invention may comprise a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 16, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 16 and a primer antisense, comprising, or consisting of, a nucleotide sequence SEQ ID No. 17, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 17.
Selon un deuxième aspect, l’invention a pour objet un procédé d’identification d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans un premier organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, le procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Détermination, dans au moins une base de données de méthylation de l’ADN génomique, de la position et du degré de méthylation des ilots CpG de séquences spécifiques dudit type cellulaire dudit organe,
b) Identification, dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit organe sain, des ilots CpG spécifiquement hyperméthylés,
c) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG d’un deuxième type cellulaire, différent du premier type cellulaire,
d) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape c),
e) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des organes autres dudit premier organe,
f) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des globules blancs sains,
g) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN acellulaire toutes matrices biologiques confondues issus de sujets sains,
h) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape e, f et g)
i) Identification d’une ou plusieurs séquences hyperméthylée cible d’ADN acellulaire spécifique dudit type cellulaire du premier organe à partir de la comparaison réalisée lors de l’étape h).According to a second aspect, the subject of the invention is a method for identifying a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in a first organ chosen from: the lung, the brain and the kidney, the process comprising at least the following steps:
a) Determination, in at least one genomic DNA methylation database, of the position and degree of methylation of CpG islands of sequences specific to said cell type of said organ,
b) Identification, in the genomic DNA of said cell type of said healthy organ, of specifically hypermethylated CpG islands,
c) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of a second cell type, different from the first cell type,
d) Selection of CpG islands only hypermethylated in the genomic DNA of said cell type of said first organ after comparison carried out in step c),
e) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the genomic DNA of other organs of said first organ,
f) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the genomic DNA of healthy white blood cells,
g) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of cell-free DNA from all biological matrices taken together from healthy subjects,
h) Selection of CpG islands only hypermethylated in the genomic DNA of said cell type of said first organ after comparison carried out in steps e, f and g)
i) Identification of one or more hypermethylated cell-free DNA target sequences specific to said cell type of the first organ based on the comparison carried out during step h).
L’invention a également pour objet une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé identifiée au moyen d’un procédé selon l’invention, pour son utilisation dans la détection de la lyse d’un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, à partir d’un échantillon biologique d’un patient.The invention also relates to a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA identified by means of a method according to the invention, for its use in the detection of the lysis of an organ chosen from the brain, the lung and the kidney, from a biological sample of a patient.
Selon un troisième aspect, l’invention a pour objet un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, ou d’un tissu présent dans le cerveau, le poumon ou le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b).According to a third aspect, the subject of the invention is a method for detecting, in a biological sample, a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for an organ chosen from: the lung, the brain and the kidney, or a tissue present in the brain, the lung or the kidney, said method comprising at least the following steps:
a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence,
b) Amplification reaction of said target sequence,
c) Detection of the presence of the amplified sequence during step b).
L’ADN acellulaire est extrait en utilisant un kit commercial, bien connu de la personne du métier et nécessite la présence d’au moins 0,15 ng/mL d’ADN cible dans l’échantillon urinaire ou plasmatique.Cell-free DNA is extracted using a commercial kit, well known to those skilled in the art and requires the presence of at least 0.15 ng/mL of target DNA in the urine or plasma sample.
La réaction d’amplification est réalisée au moyen de toute technique ou protocole bien connu par la personne du métier. Parmi les exemples non limitatifs de ces techniques, on peut citer : l’amplification par PCR, l’amplification par PCR digitale (dPCR), le séquençage nouvelle génération.The amplification reaction is carried out using any technique or protocol well known to those skilled in the art. Among the non-limiting examples of these techniques, we can cite: amplification by PCR, amplification by digital PCR (dPCR), next generation sequencing.
Plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau.More particularly, the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific to a type of cells present in the brain.
Encore plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°1 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1) et une amorce antisens SEQ ID N°2 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2), ou bien une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°4 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4) et une amorce antisens SEQ ID N°5 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°6, respectivement selon les paires d’amorces utilisées.Even more particularly, the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the brain, said method comprising at least the following steps:
a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers constituted by a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID N °1 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1) and an antisense primer SEQ ID No. 2 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2 ), or a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 4 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4) and an antisense primer SEQ ID No. 5 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 5), each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or well placed in the presence, under conditions suitable for amplification of nucleic acids,
b) Amplification reaction of said target sequence,
c) Detection of the presence of the sequence amplified during step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 6, respectively depending on the pairs of primers used.
Encore plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°7 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7) et une amorce antisens SEQ ID N°8 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8),
chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°9.Even more particularly, the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the lung, said method comprising at least the following steps:
- Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers constituted by
- a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 7 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 7) and an antisense primer SEQ ID No. 8 (or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 8),
each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or brought into contact, under conditions suitable for amplification of nucleic acids,
b) Amplification reaction of said target sequence,
c) Detection of the presence of the sequence amplified during step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 9.
Encore plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°10 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10) et une amorce antisens SEQ ID N°11 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11), ou bien
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°13 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13) et une amorce antisens SEQ ID N°14 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
- b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
- c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°12 ou SEQ ID N°15, respectivement selon les paires d’amorces utilisées.Even more particularly, the subject of the invention is a method for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a type of cells present in the kidney, said method comprising at least the following steps:
- a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, the cell-free DNA previously extracted from said biological sample and a pair of primers constituted by
- a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 10 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 10) and an antisense primer SEQ ID No. 11 (or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 11), or else
- a sense primer comprising or consisting of a nucleotide sequence SEQ ID No. 13 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 13) and an antisense primer SEQ ID No. 14 (or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 14), each of the primers comprising, or consisting of, a nucleotide sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence of said cell-free DNA target sequence, or else implemented presence, under conditions suitable for amplification of nucleic acids,
- b) Amplification reaction of said target sequence,
- c) Detection of the presence of the sequence amplified during step b), by means of a probe comprising, or consisting of, SEQ ID No. 12 or SEQ ID No. 15, respectively depending on the pairs of primers used .
Les tests diagnostiques décrits s’inscrivent dans un processus analytique composé de 2 étapes préliminaires : l’extraction de l’ADN circulant et la conversion épigénétique (par bisulfite, réaction enzymatique). Les tests diagnostiques sont compatibles avec différents kits d’extractions de l’ADN circulant tels que le QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID: 55114 (Qiagen) ; EZ1&2 ccfDNA Kit (48)Cat. No. / ID: 954854 (Qiagen) ; Kit d’isolement d’ADN acellulaire MagMAX™ (Référence: A29319, Thermofisher) ; Automated High-Throughput Extraction of Cell-Free DNA from Plasma, Serum, Urine and CSF (Ref : A6030, Promega). Les ADNs acellulaires une fois extraits sont dosés par fluorimétrie Qubit 4.0™ (kit Invitrogen™ Kits de dosage d’ADN db HS Qubit™ (Référence : Q32851)) puis subissent une conversion bisulfite avec le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) ou équivalent commercial. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR digitale en gouttelettes (System Naica (STILLA Technologies)) (compatible également avec des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System – QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).The diagnostic tests described are part of an analytical process composed of 2 preliminary steps: extraction of circulating DNA and epigenetic conversion (by bisulfite, enzymatic reaction). The diagnostic tests are compatible with various circulating DNA extraction kits such as the QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID: 55114 (Qiagen); EZ1&2 ccfDNA Kit (48)Cat. No. / ID: 954854 (Qiagen); MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit (Reference: A29319, Thermofisher); Automated High-Throughput Extraction of Cell-Free DNA from Plasma, Serum, Urine and CSF (Ref: A6030, Promega). The cell-free DNAs, once extracted, are assayed by Qubit 4.0™ fluorometry (Invitrogen™ kit HS Qubit™ dsDNA assay kits (Reference: Q32851)) then undergo a bisulfite conversion with the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit ( Reference D5031) or commercial equivalent. The samples are then analyzed by droplet digital PCR (Naica System (STILLA Technologies)) (also compatible with commercial equivalents such as the QIAcuity Digital PCR System – QIAGEN and QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System – Bio-Rad).
Les tests diagnostiques décrits sont compatibles avec l’ensemble des plateformes de PCR digital sur le marché (microgouttelettes et/ou micro compartiments). Parmi elles, nous trouvons des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System – QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).The diagnostic tests described are compatible with all digital PCR platforms on the market (microdroplets and/or micro compartments). Among them, we find commercial equivalents such as the QIAcuity Digital PCR System – QIAGEN and QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System – Bio-Rad).
Les inventeurs déterminent les paramètres métrologiques types, notamment la répétabilité, la reproductibilité et la sensibilité du test. Pour quantifier la dégradation rénale, il faut au moins 1 des marqueurs. La détection avec deux marqueurs renforce la donnée biologique. Pour chaque cellule d’intérêt spécifique du rein, il faut au moins 1 des marqueurs. La détection avec deux marqueurs renforce la donnée biologique.The inventors determine typical metrological parameters, including repeatability, reproducibility and sensitivity of the test. To quantify renal degradation, at least 1 of the markers is required. Detection with two markers reinforces the biological data. For each kidney-specific cell of interest, at least 1 marker is required. Detection with two markers reinforces the biological data.
Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet l’utilisation d’un kit ou d’un procédé selon l’invention, pour la détection spécifique de la dégradation du cerveau et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi de l’évolution d’un AVC.According to another aspect, the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of brain degradation and/or for in vitro diagnosis or monitoring of the development of a stroke.
Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet l’utilisation d’un kit ou d’un procédé selon l’invention, pour la détection spécifique de la dégradation du poumon et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi de l’évolution d’un syndrome de détresse respiratoire ou de rejet de greffon pulmonaire.According to another aspect, the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of lung degradation and/or for in vitro diagnosis or monitoring of the development of respiratory distress syndrome or lung graft rejection.
Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet l’utilisation d’un kit ou d’un procédé selon l’invention, pour la détection spécifique de la dégradation du rein et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi de l’évolution d’une insuffisance rénale ou d’un rejet de greffon rénal.According to another aspect, the invention also relates to the use of a kit or a method according to the invention, for the specific detection of kidney degradation and/or for in vitro diagnosis or monitoring of the development of renal failure or renal graft rejection.
Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet une séquence nucléotidique choisie parmi :
- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ;
- une amorce antisens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ; et
- une sonde comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences.According to another aspect, the invention also relates to a nucleotide sequence chosen from:
- a sense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with said sequences;
- an antisense primer comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with said sequences; And
- a probe comprising, or consisting of, a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with said sequences.
Selon un autre aspect, l’invention a pour objet de diagnostic, ou de suivi de la dégradation d’un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, comprenant les étapes suivantes :
- Extraction de l’ADN acellulaire méthylé d’un échantillon biologique d’un individu,
- Mise en présence de l’ADN et d’une paire d’amorces appropriée dans des conditions permettant l’hybridation,
- Amplification de ladite sequence,
- Détection de la séquence amplifiée, au moyen de la sonde de détection appropriée.According to another aspect, the invention aims to diagnose, or monitor the deterioration of an organ chosen from the brain, the lung and the kidney, comprising the following steps:
- Extraction of methylated cell-free DNA from a biological sample of an individual,
- Bringing together the DNA and an appropriate pair of primers under conditions allowing hybridization,
- Amplification of said sequence,
- Detection of the amplified sequence, using the appropriate detection probe.
D’autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l’examen de la description détaillée d’un mode de réalisation nullement limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels :Other advantages and characteristics will appear on examination of the detailed description of a non-limiting embodiment, and the accompanying drawings, in which:
La
La
La
La
La
La
La
Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits par la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l’invention ne comprenant qu’une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l’invention par rapport à de l’état de la technique antérieur. La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l’invention et non pour en limiter la portée.It is of course understood that the embodiments which will be described subsequently are in no way limiting. In particular, it will be possible to imagine variants of the invention comprising only a selection of characteristics described subsequently isolated from the other characteristics described, if this selection of characteristics is sufficient to confer a technical advantage or to differentiate the invention compared to other the prior art. The present invention will be better understood on reading the following examples, which are given to illustrate the invention and not to limit its scope.
Les îlots CpG présents au niveau des promoteurs de certains gènes se retrouvent à différents niveaux de méthylation selon la nature du tissu. A partir d’exploitation de bases de données de méthylation TCGA (The Cancer Genome Atlas) et DeepBlue (Epigenomic Data Server – DeepBlue), les positions et les degrés de méthylation d’un grand nombre d’îlots CpG sont répertoriés pour de nombreux types de tissus différents, incluant les sous-types de pneumocytes pulmonaires (poumon), les neurones (cerveau) et les cellules rénales (rein) (Mosset al.Nat Commun. déc 2018;9(1):5068. ; Liu Xet al.Clin Epigenetics. déc 2019;11(1):93 ; Silva TCet al.Bioinformatics. 1 juin 2019;35(11):1974‑7 ; Zhou Wet al. Nucleic Acids Res. 24 oct 2016;gkw967. ; Albrecht Fet al.Nucleic Acids Res. 8 juill 2016;44(W1):W581‑6). Par traitement bio-informatique, les inventeurs ont identifié différentes positions hyperméthylées dans les tissus sains de cerveau, de poumon et de rein. Cette identification comporte 5 étapes et est décrite ci-dessous dans l’exemple de la détection de la dégradation pulmonaire.The CpG islands present at the promoters of certain genes are found at different levels of methylation depending on the nature of the tissue. Using the TCGA (The Cancer Genome Atlas) and DeepBlue (Epigenomic Data Server – DeepBlue) methylation databases, the positions and degrees of methylation of a large number of CpG islands are listed for numerous types. from different tissues, including subtypes of pulmonary pneumocytes (lung), neurons (brain) and renal cells (kidney) (Moss et al. Nat Commun. Dec 2018;9(1):5068.; Liu al. Clin Epigenetics. Dec 2019;11(1):93; Silva TC et al. Bioinformatics. June 1, 2019;35(11):1974‑7; Zhou W et al . Nucleic Acids Res. Oct 24, 2016;gkw967. ; Albrecht F et al. Nucleic Acids Res. Jul 8, 2016;44(W1):W581‑6). Using bioinformatics processing, the inventors identified different hypermethylated positions in healthy brain, lung and kidney tissues. This identification involves 5 steps and is described below in the example of detecting pulmonary degradation.
Dans le cas de la détection de la dégradation pulmonaire, les inventeurs ont sélectionné des positions non-méthylées dans l’ADN issu des globules blancs, PBMCs et cellules immunitaires, à partir d’une analyse de données issues du sang total.In the case of detecting pulmonary degradation, the inventors selected unmethylated positions in the DNA from white blood cells, PBMCs and immune cells, based on an analysis of data from whole blood.
Les inventeurs ont ensuite détecté les îlots CpG hyperméthylés dans le tissu sain, dans une base de données établie à partir de tissu pulmonaire sain. Ces données ont été séparées en un jeu de données de découverte (« training ») et un jeu de données de validation (« test »).The inventors then detected the hypermethylated CpG islands in healthy tissue, in a database established from healthy lung tissue. This data was separated into a discovery (“training”) dataset and a validation (“test”) dataset.
Des îlots CpG différentiellement méthylés du tissu pulmonaire par rapport aux îlots CpG de tissu sain d’autres organes (rein, cerveau, muscle, estomac, foie, cœur, intestin) ont ensuite été identifiés. Les positions les plus différentiellement méthylées ont été sélectionnées, 432 positions ont donc été retenues.Differentially methylated CpG islands from lung tissue compared to CpG islands from healthy tissue from other organs (kidney, brain, muscle, stomach, liver, heart, intestine) were then identified. The most differentially methylated positions were selected, 432 positions were therefore retained.
Parmi ces 432 positions, un affinage a été réalisé par une sélection manuelle. Des positions sont retenues en fonction de leur moyenne de méthylation dans les tissus pulmonaires et non pulmonaires. 4 positions candidates ont été sélectionnées.Among these 432 positions, refinement was carried out by manual selection. Positions are retained based on their average methylation in lung and non-lung tissues. 4 candidate positions were selected.
Les performances de ces quatre positions pour discriminer un tissu pulmonaire d’un tissu non pulmonaire ont été analysées, au moyen d’un modèle de régression logistique pénalisée selon la méthode LASSO. Le test statistique AUROC obtenu permet de conclure que plusieurs îlots CpG permettent d’identifier un tissu pulmonaire avec une forte performance prédictive.The performance of these four positions in discriminating lung tissue from non-lung tissue was analyzed using a penalized logistic regression model using the LASSO method. The AUROC statistical test obtained allows us to conclude that several CpG islands make it possible to identify lung tissue with strong predictive performance.
Le tableau 3 ci-dessous rassemble les marqueurs sélectionnés pour chacun des organes cibles.Table 3 below brings together the markers selected for each of the target organs.
Différents amplicons ont été générés afin de discriminer chacune des positions identifiées. Les caractéristiques techniques des amorces et sondes sont décrites dans le tableau 4 ci-dessous. Les températures d’hybridation des sondes ont été choisies entre 40° et 54°C pour les sondes et 52 et 60°C pour les amorces, la différence de température d’hybridation entre amorces et sondes est de 5 à 10°C.Different amplicons were generated in order to discriminate each of the identified positions. The technical characteristics of the primers and probes are described in Table 4 below. The hybridization temperatures of the probes were chosen between 40° and 54°C for the probes and 52 and 60°C for the primers, the difference in hybridization temperature between primers and probes is 5 to 10°C.
Pour chaque organe, un test en multiplexage a été construit. Un contrôle interne de la quantité d’ADN circulant total, détectant la quantité d’ADN codant pour l’albumine, est implémenté dans le test.
For each organ, a multiplex test was constructed. An internal control of the amount of total circulating DNA, detecting the amount of DNA encoding albumin, is implemented in the test.
EXEMPLE 2 : Validation des biomarqueurs de la dégradation neuronale dans la prise en charge de l’AVC en phase aigüeEXAMPLE 2: Validation of biomarkers of neuronal degradation in the management of stroke in the acute phase
La validation des biomarqueurs selon l’invention comprend les étapes suivantes :
- l’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, - la validation du test de PCR digitale sur de l’ADN synthétique 100 % méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial,
- la détermination des paramètres métrologiques,
- un contrôle négatif démontrant la spécificité du test,
- un contrôle positif sur des échantillons d’ADN génomique issu de coupes de tissus sains, et la comparaison avec le marquage histologique de référenceThe validation of the biomarkers according to the invention comprises the following steps:
- molecular analysis of DNA conversion to droplet digital PCR tests, - validation of the digital PCR test on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA,
- determination of metrological parameters,
- a negative control demonstrating the specificity of the test,
- a positive control on genomic DNA samples from healthy tissue sections, and comparison with the reference histological marking
L’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes est commune aux différents marqueurs. L’ADN acellulaire est d’abord extrait par un procédé d’extraction commercial dédis à l’ADN acellulaire via QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Référence Cat. No. / ID : 55114, Qiagen). L’ADN acellulaire est dosé par fluorimétrie Qubit 4.0™ (kit Invitrogen™ Kits de dosage d’ADN db HS Qubit™ (Référence : Q32851)) puis subit une conversion bisulfite avec le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) ou équivalent commercial. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR digitale en gouttelettes (System Naica (STILLA Technologies)).Molecular analysis of DNA conversion in droplet digital PCR tests is common to the different markers. The cell-free DNA is first extracted by a commercial extraction process dedicated to cell-free DNA via QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Reference Cat. No. / ID: 55114, Qiagen). The cell-free DNA is assayed by Qubit 4.0™ fluorometry (Invitrogen™ HS Qubit™ dsDNA Assay Kits (Reference: Q32851)) then undergoes a bisulfite conversion with the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031). ) or commercial equivalent. The samples are then analyzed by droplet digital PCR (System Naica (STILLA Technologies)).
Le design des amorces et sondes nécessaires à la réaction de PCR pour les cibles APC2 et KRT33B sont mentionnés dans le tableau 4. Des sondes de type Taqman-Mgb sont utilisées (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec). La mise en œuvre de la réaction d’amplification par PCR est effectuée en un procédé comprenant 3 étapes principales présentées ci-dessous, ce procédé est désigné « amplification par PCR selon l’invention » dans le reste du texte de la présente demande.The design of the primers and probes necessary for the PCR reaction for the APC2 and KRT33B targets are mentioned in Table 4. Taqman-Mgb type probes are used (Reference: PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 and PB -MGBEH-006, Eurogentec). The implementation of the PCR amplification reaction is carried out in a process comprising 3 main steps presented below, this process is designated “PCR amplification according to the invention” in the rest of the text of the present application.
La préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le Tableau 5 suivant.The preparation of the specific primer-probe cocktail is presented in the following Table 5.
La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le Tableau 6 suivant.The preparation of the PCR reaction mix is presented in the following Table 6.
La réaction de PCR est présentée dans le Tableau 7.The PCR reaction is presented in Table 7.
Les plaques sont lues selon le réglage d’acquisition suivant : 120 ms canal FAM (bleu) – 180 ms canal HEX/VIC (vert) – 38 ms canal Cy5 (Rouge)) pour une lecture avec le système Naica de STILLA Technologies.The plates are read according to the following acquisition setting: 120 ms FAM channel (blue) – 180 ms HEX/VIC channel (green) – 38 ms Cy5 channel (Red)) for reading with the Naica system from STILLA Technologies.
Validation du test de PCR digitale : Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l’ADN synthétique 100% méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d’ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d’ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2.Validation of the digital PCR test: The digital PCR test is then validated on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA. 3 synthetic DNA samples (100% methylated, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Reference: D5011) and 3 commercial genomic DNA samples (unmethylated, Promega G1521) were analyzed as follows: Step 1: Bisulfite conversion by the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then Step 2: Analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers KRT33B and APC2.
Les résultats sur les contrôles ADN 100% méthylés montrent que les marqueurs épigénétiques ciblés sur les gènes KRT33B et APC2 sont bien détectés et quantifiables par le test selon l’invention. Les résultats sur les contrôles ADN non méthylés montrent que les marqueurs KRT33B et APC2 développés sont bien détectables si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n’y a pas de détection des marqueurs dans des contrôles à ADN non méthylés.The results on the 100% methylated DNA controls show that the epigenetic markers targeted on the KRT33B and APC2 genes are well detected and quantifiable by the test according to the invention. The results on the unmethylated DNA controls show that the KRT33B and APC2 markers developed are indeed detectable if and only if the targeted regions are hypermethylated. There is no detection of markers in unmethylated DNA controls.
La spécificité du test a été vérifiée par un contrôle en présence d’ADN issu de cellules mononucléées de sang périphérique, dites « PBMC » (Peripheral Blood Monocyte Cells) de sujets sains.The specificity of the test was verified by a control in the presence of DNA from peripheral blood mononuclear cells, called “PBMC” (Peripheral Blood Monocyte Cells) from healthy subjects.
10 échantillons d’ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 selon l’invention décrite.10 genomic DNA samples were extracted from white blood cell pellets of healthy subjects using the Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID: 51104. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers KRT33B and APC2 according to the invention described.
Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que le test est spécifique car il ne présente pas de bruit biologique au niveau de l’ADN génomique issu des globules blancs. Par « bruit biologique » on entend un bruit de fond des marqueurs épigénétiques sur des échantillons considérés comme négatifs ou non méthylés. En d’autres termes, la détection des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 génère un signal négligeable sur des échantillons considérés comme non négatifs ou non méthylés.The negative results of the test for the epigenetic markers tested show that the test is specific because it does not present biological noise at the level of genomic DNA from white blood cells. By “biological noise” we mean background noise of epigenetic markers on samples considered negative or unmethylated. In other words, the detection of the neurological markers KRT33B and APC2 generates a negligible signal on samples considered non-negative or non-methylated.
La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d’ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d’ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID : 55114. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 selon l’invention décrite. Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que celui-ci ne présente pas de bruit biologique au niveau de l’ADN acellulaire/plasmatique issu du plasma de sujets sains.The specificity of the test was also verified in the presence of plasma DNA from healthy subjects. 10 plasma DNA samples were extracted from 1 mL of plasma from healthy subjects using the Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID: 55114. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers KRT33B and APC2 according to the invention described. The negative results of the test for the epigenetic markers tested show that it does not present biological noise at the level of cell-free/plasma DNA from the plasma of healthy subjects.
Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d’ADN génomique d’autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d’échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d’anatomopathologique des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est). Par échantillon, 3 copeaux de 8 µm d’épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d’origine cérébraux ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons d’ADN ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 selon l’invention décrite. Les résultats montrent un bruit biologique très faible dans les tissus d’ADN génomique autre que les tissus d’origine cérébrale. Si les deux biomarqueurs APC2 et KRT33B sont pris en compte, le bruit biologique est inférieur à 2%. Les résultats du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que celui-ci présente un bruit biologique négligeable voir absent au niveau de l’ADN génomique issu des différentes coupes tissulaires (autre que le cerveau).Finally, the specificity of the test was determined in the presence of genomic DNA from other tissues. N = 27 healthy tissue samples were collected (Transmission of biological samples MTA No. CT 69HCL22_0234 to the anatomopathological department of the Hospices Civiles de Lyon Sud et Est). Per sample, 3 shavings of 8 µm thickness of tissues prepared in paraffin were given. The genomic DNAs from the tissue chips of brain origin were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The DNA samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers KRT33B and APC2 according to the invention described. The results show very low biological noise in genomic DNA tissues other than tissues of brain origin. If the two biomarkers APC2 and KRT33B are taken into account, the biological noise is less than 2%. The results of the test for the epigenetic markers tested show that it presents negligible or even absent biological noise at the level of the genomic DNA from the different tissue sections (other than the brain).
Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d’ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus cérébraux sains, par comparaison avec le marquage histologique anti-NeuN.A positive control is carried out on genomic DNA samples from tissue sections of healthy brain tissue, by comparison with anti-NeuN histological marking.
12 échantillons de tissus cérébraux sains ont été recueillis (Cession d’échantillons biologique MTA n° VAL 2022/2022-234/01 auprès du service d’anatomopathologie de l’hôpital Lariboisière du Pr Homa Adle Biassette). 1 échantillon = Lame blanche marquée par l’anticorps anti-neuN (anticorps neuronal, Ref ABN91, sigma Aldricht-Merck) et 3 copeaux de 8 µm d’épaisseur de tissus préparés en paraffine.12 healthy brain tissue samples were collected (MTA biological sample transfer no. VAL 2022/2022-234/01 from the anatomopathology department of Lariboisière hospital of Professor Homa Adle Biassette). 1 sample = White slide marked with the anti-neuN antibody (neuronal antibody, Ref ABN91, sigma Aldricht-Merck) and 3 shavings of 8 µm thickness of tissue prepared in paraffin.
Les cellules neuronales marquées par l’anticorps anti-NeuN ont été comptées par le logiciel de précision « HALO® image analysis ». Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d’origine cérébraux ont été extraits via le kit « Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit » (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons d’ADN ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 selon l’invention décrite.The neuronal cells marked by the anti-NeuN antibody were counted using the “HALO® image analysis” precision software. The genomic DNAs from the tissue chips of brain origin were extracted using the “Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit” (50) (Cat. No. / ID: 56604). The DNA samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers KRT33B and APC2 according to the invention described.
Les marqueurs neuronaux APC2 et KRT33B sont identifiés dans 12 échantillons sur 12 échantillons testés. Une proportion identique de neurones dans les coupes tissulaires cérébrales saines est observée entre le marqueur histologique anti-NeuN et les marqueurs épigénétiques APC2 et KRT33B. Une corrélation entre les marqueurs épigénétiques APC2 / KRT33B et le marqueur histologique anti-NeuN est relevée (Coefficient R de Pearson = 0,44 et 0,46 respectivement pour les marquages épigénétiques APC2 et KRT33B par rapport au marquage anti-NeuN). Les résultats sont indiqués dans le tableau 8 ci-dessous et dans la
Les données de la corrélation entre le dosage quantitatif des marqueurs cérébraux (neurones) et du marquage histologique Anti-NeuN (marqueur cellulaire neuronal) montrent une corrélation entre les marquages moléculaires et histologiques (coefficient de Pearson R = 0,46 et 0,44 respectivement pour KRT33B et APC2) confirmant la spécificité neuronale (cellules cérébrales) du test.The data from the correlation between the quantitative dosage of brain markers (neurons) and the histological Anti-NeuN marking (neuronal cell marker) show a correlation between the molecular and histological markings (Pearson coefficient R = 0.46 and 0.44 respectively for KRT33B and APC2) confirming the neuronal (brain cell) specificity of the test.
Dans une application clinique, un test selon l’invention permet de stratifier les patients atteints d’AVC selon son indice de sévérité. Les résultats montrent une élévation de la moyenne quantitative des marqueurs APC2 et KRT33B chez les patients atteints d’un AVC ischémique aiguë (AIA) par rapport aux patients atteints d’un AVC ischémique transitoire (AIT) (moyenne respective de 11,32 copies/ml de plasma pour l’AIT versus 75 copies/mL de plasma pour l’AIA). Les résultats sont présentés dans la
In a clinical application, a test according to the invention makes it possible to stratify patients suffering from stroke according to its severity index. The results show an elevation in the quantitative mean of APC2 and KRT33B markers in patients with acute ischemic stroke (AIA) compared to patients with transient ischemic stroke (TIA) (respective mean of 11.32 copies/ ml of plasma for AIT versus 75 copies/mL of plasma for AIA). The results are presented in the
EXEMPLE 3 : Validation des biomarqueurs de la dégradation rénale dans la prise en charge du patient greffé du reinEXAMPLE 3: Validation of biomarkers of renal degradation in the management of kidney transplant patients
La validation des biomarqueurs PDE4D et PAX2 comprend l’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, le design des amorces et sondes Taqman-mgb (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec) sont identiques à celle décrite dans l’exemple 2 (cf : Méthodologie d’analyse partie commune). La mise en œuvre de la réaction d’amplification par PCR comprend la préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le Tableau 9 suivant.Validation of PDE4D and PAX2 biomarkers includes molecular analysis of DNA conversion to droplet digital PCR assays, design of Taqman-mgb primers and probes (Reference: PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 and PB-MGBEH-006, Eurogentec) are identical to that described in example 2 (see: Common part analysis methodology). The implementation of the PCR amplification reaction includes the preparation of the specific primer-probe cocktail is presented in the following Table 9.
La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le Tableau 10 suivant.The preparation of the PCR reaction mix is presented in the following Table 10.
La réaction de PCR est réalisée comme indiqué dans le Tableau 7 (exemple 2). Les plaques sont lues comme indiqué dans l’exemple 2.The PCR reaction is carried out as indicated in Table 7 (example 2). The plates are read as shown in Example 2.
Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l’ADN synthétique 100% méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d’ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d’ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2. Les résultats sur des ADN synthétiques montrent que : 1/ Sur les contrôles ADN 100% méthylés : les marqueurs épigénétiques ciblés sur les gènes PDE4D et Pax2 sont bien détectés et quantifiables par notre test. 2/ Sur les contrôles ADN non méthylés : Les marqueurs PDE4D et Pax2 développés sont bien détectables si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n’y a pas de détection des marqueurs dans des contrôles à ADN non méthylés.The digital PCR test is then validated on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA. 3 synthetic DNA samples (100% methylated, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Reference: D5011) and 3 commercial genomic DNA samples (unmethylated, Promega G1521) were analyzed as follows: Step 1: Bisulfite conversion by the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then Step 2: Analysis by System Naica digital PCR of the renal markers PDE4D and Pax2. The results on synthetic DNA show that: 1/ On the 100% methylated DNA controls: the epigenetic markers targeted on the PDE4D and Pax2 genes are well detected and quantifiable by our test. 2/ On unmethylated DNA controls: The PDE4D and Pax2 markers developed are detectable if and only if the targeted regions are hypermethylated. There is no detection of markers in unmethylated DNA controls.
Les résultats montrent que les cibles PDE4D et PAX2 ne sont pas détectées dans de l’ADN non méthylé commercial.The results show that PDE4D and PAX2 targets are not detected in commercial unmethylated DNA.
Les inventeurs déterminent les paramètres métrologiques types, notamment la répétabilité et la sensibilité du test. Le test est répétable avec un coefficient de variation de 4,5% et de 0,6% respectivement pour les marqueurs Pax2 et PDE4D. Le test est sensible à 0,01% et permet une quantification jusqu’à une limite de respectivement 0,15 ng et 0,3 ng d’ADN pour les marqueurs PDE4D et Pax2.The inventors determine typical metrological parameters, including test repeatability and sensitivity. The test is repeatable with a coefficient of variation of 4.5% and 0.6% for the Pax2 and PDE4D markers respectively. The test is sensitive to 0.01% and allows quantification up to a limit of 0.15 ng and 0.3 ng of DNA respectively for the PDE4D and Pax2 markers.
La spécificité du test a été vérifiée en présence d’ADN issu de PBMC (globules blancs) de sujets sains. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l’analyse dans l’ADN des PBMCs.The specificity of the test was verified in the presence of DNA from PBMC (white blood cells) from healthy subjects. The markers are not detected during analysis in the DNA of PBMCs.
10 échantillons d’ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques PDE4D et Pax2 selon l’invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l’analyse des ADNs génomiques issus des culots de globules blancs de sujets sains (= absence de bruit de fond biologique).10 genomic DNA samples were extracted from white blood cell pellets of healthy subjects using the Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID: 51104. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers PDE4D and Pax2 according to the invention described. The markers are not detected during the analysis of genomic DNAs from white blood cell pellets from healthy subjects (= absence of biological background noise).
La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d’ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d’ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1,5 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID : 55114. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques PDE4D et Pax2 selon l’invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l’analyse dans l’ADN plasmatique (ADN cellulaire) de sujets sains.The specificity of the test was also verified in the presence of plasma DNA from healthy subjects. 10 plasma DNA samples were extracted from 1.5 mL of plasma from healthy subjects using the Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID: 55114. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers PDE4D and Pax2 according to the invention described. The markers are not detected when analyzed in plasma DNA (cellular DNA) of healthy subjects.
Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d’ADN génomique issus d’autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d’échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d’anatomopathologie des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est et de l’Hôpital Lariboisière). Par échantillon, 3 copeaux de 8 µm d’épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques PDE4D et Pax2 selon l’invention décrite. Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques PDE4D et Pax2 montrent que ceux-ci n’ont pas été détectés dans les ADN génomiques issus des coupes de tissus autres que le rein confirmant l’absence d’un bruit biologique.Finally, the specificity of the test was determined in the presence of genomic DNA from other tissues. N = 27 healthy tissue samples were collected (Transmission of biological samples MTA No. CT 69HCL22_0234 to the anatomopathology department of the Hospices Civiles de Lyon Sud et Est and the Lariboisière Hospital). Per sample, 3 shavings of 8 µm thickness of tissues prepared in paraffin were given. Genomic DNAs from the tissue chips were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the neurological markers PDE4D and Pax2 according to the invention described. The negative results of the test for the epigenetic markers PDE4D and Pax2 show that these were not detected in the genomic DNAs from tissue sections other than the kidney, confirming the absence of biological noise.
Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d’ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus rénaux sains. 12 échantillons de tissus rénaux sains ont été recueillis auprès du service d’anatomopathologie des Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l’invention décrite.A positive control is carried out on genomic DNA samples from tissue sections of healthy kidney tissue. 12 healthy kidney tissue samples were collected from the pathology department of the Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Genomic DNAs from the tissue chips were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the renal markers PDE4D and Pax2 according to the invention described.
Les marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 sont identifiés dans 12 échantillons sur 12 échantillons testés. Ainsi, ces travaux confirment la spécificité rénale du test de digital PCR PDE4D et Pax2 décrit.The renal markers PDE4D and Pax2 are identified in 12 samples out of 12 samples tested. Thus, this work confirms the renal specificity of the PDE4D and Pax2 digital PCR test described.
La quantité d'ADN circulant d'origine rénal est plus élevée dans le plasma des patients présentant un haut risque de rejet de greffe versus le plasma des patients présentant un faible risque de rejet de greffe durant les premiers jours post-greffe rénale (
La fraction d'ADN circulant d'origine rénal est plus élevée dans le plasma des patients présentant un haut risque de rejet de greffe versus le plasma des patients présentant un faible risque de rejet de greffe durant les 1ers jours post-greffe rénale (
Le dosage quantitatif des marqueurs PD4ED et Pax2 dans les urines par le test décrit est plus élevé chez les patients avec un rejet de greffe confirmé par biopsie que chez des patients ne présentant pas de rejet de greffe. Ce dosage permet de stratifier les patients avec un rejet de greffe confirmé par biopsie et les patients ne présentant pas de rejet de greffe (
The quantitative dosage of PD4ED and Pax2 markers in urine by the test described is higher in patients with graft rejection confirmed by biopsy than in patients without graft rejection. This assay makes it possible to stratify patients with biopsy-confirmed graft rejection and patients without graft rejection (
EXEMPLE 4 : Validation du biomarqueur LINC00336 de la dégradation pulmonaire dans la prise en charge de l’insuffisance respiratoire aigüeEXAMPLE 4: Validation of the LINC00336 biomarker of pulmonary degradation in the management of acute respiratory failure
La méthodologie d’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, le design des amorces et sondes Taqman-mgb (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec) sont identiques à celle décrite dans l’exemple 2. La mise en œuvre de la réaction d’amplification par PCR est effectuée comme suit. La préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le Tableau 11 suivant.The molecular analysis methodology from DNA conversion to droplet digital PCR tests, the design of Taqman-mgb primers and probes (Reference: PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 and PB-MGBEH-006 , Eurogentec) are identical to that described in Example 2. The implementation of the PCR amplification reaction is carried out as follows. The preparation of the specific primer-probe cocktail is presented in the following Table 11.
(µM)(µM)
(µM)(µM)
(µM)(µM)
(µL)(µL)
La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le Tableau 12 suivant.The preparation of the PCR reaction mix is presented in the following Table 12.
La réaction de PCR est réalisée comme indiqué dans le Tableau 7 (exemple 2). Les plaques sont lues comme indiqué dans l’exemple 2.The PCR reaction is carried out as indicated in Table 7 (example 2). The plates are read as shown in Example 2.
Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l’ADN synthétique 100% méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d’ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d’ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336.The digital PCR test is then validated on 100% methylated synthetic DNA and on commercial unmethylated genomic DNA. 3 synthetic DNA samples (100% methylated, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Reference: D5011) and 3 commercial genomic DNA samples (unmethylated, Promega G1521) were analyzed as follows: Step 1: Bisulfite conversion by the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then Step 2: Analysis by System Naica digital PCR of the lung marker LINC00336.
Les résultats sur les contrôles ADN 100% méthylés montrent que le marqueur épigénétique ciblé sur le gène LINC00336 est bien détecté et quantifiable par un test selon l’invention mettant en œuvre ce marqueur. Les résultats sur les contrôles ADN non méthylés montrent que le marqueur LINC00336 développé est bien détectable si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n’y a pas de détection du marqueur dans les contrôles à ADN non méthylés.The results on the 100% methylated DNA controls show that the epigenetic marker targeted on the LINC00336 gene is indeed detected and quantifiable by a test according to the invention using this marker. The results on the unmethylated DNA controls show that the LINC00336 marker developed is indeed detectable if and only if the targeted regions are hypermethylated. There is no detection of the marker in the unmethylated DNA controls.
La spécificité du test a été vérifiée en présence d’ADN génomique issu de PBMC (globules blancs) de sujets sains. 10 échantillons d’ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336 selon l’invention décrite. Le marqueur n’est pas détecté lors de l’analyse de l’ADN génomique issu des PBMCsThe specificity of the test was verified in the presence of genomic DNA from PBMC (white blood cells) from healthy subjects. 10 genomic DNA samples were extracted from white blood cell pellets of healthy subjects using the Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID: 51104. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker LINC00336 according to the invention described. The marker is not detected during the analysis of genomic DNA from PBMCs
La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d’ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d’ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1,5 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID : 55104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336 selon l’invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l’analyse dans l’ADN génomique de sujets sains.The specificity of the test was also verified in the presence of plasma DNA from healthy subjects. 10 plasma DNA samples were extracted from 1.5 mL of plasma from healthy subjects using the Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID: 55104. The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker LINC00336 according to the invention described. The markers are not detected when analyzed in genomic DNA from healthy subjects.
Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d’ADN génomique d’autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d’échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d’anatomopathologie des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est et de l’Hôpital Lariboisière). Par échantillon, 3 copeaux de 8 µm d’épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d’origine cérébraux ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336 selon l’invention décrite. Les résultats négatifs du test pour le marqueur épigénétique LINC00336 montrent que celui-ci n’est pas été détecté dans les ADN génomiques issus des coupes de tissus autres que le poumon confirmant l’absence d’un bruit biologique.Finally, the specificity of the test was determined in the presence of genomic DNA from other tissues. N = 27 healthy tissue samples were collected (Transmission of biological samples MTA No. CT 69HCL22_0234 to the anatomopathology department of the Hospices Civiles de Lyon Sud et Est and the Lariboisière Hospital). Per sample, 3 shavings of 8 µm thickness of tissues prepared in paraffin were given. The genomic DNAs from the tissue chips of brain origin were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker LINC00336 according to the invention described. The negative results of the test for the epigenetic marker LINC00336 show that it is not detected in the genomic DNAs from tissue sections other than the lung, confirming the absence of biological noise.
Contrôle positif : Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d’ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus pulmonaires sains, par comparaison avec le marquage histologique. 18 échantillons de tissus pulmonaires sains (1 lame blanche et 3 copeaux de 8 µm d’épaisseurs préparés en paraffine) ont été recueillis auprès du service d’anatomopathologie des Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Pour chaque échantillon, un marquage par un anticorps anti-TTF1 sur les lames blanches a été effectuées (anticorps TTF1, Référence : DB089-0.5 Rabbit Monoclonal Anti-TTF-1 Clone (G21-G), DB Biotech) et chaque cellule marquée TTF1 (= pneumocytes pulmonaires) a été comptée au moyen du logiciel « HALO® image analysis ». Les échantillons ont été marqués par l’anticorps TTF1. En parallèle, les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires de 8 µm d’épaisseur préparé en paraffine ont été extrait via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336 selon l’invention décrite.Positive control: A positive control is carried out on genomic DNA samples from tissue sections of healthy lung tissue, by comparison with the histological marking. 18 samples of healthy lung tissue (1 white slide and 3 shavings of 8 µm thickness prepared in paraffin) were collected from the anatomopathology department of the Hospices Civils de Lyon Sud et Est. For each sample, labeling with an anti-TTF1 antibody on the blank slides was carried out (TTF1 antibody, Reference: DB089-0.5 Rabbit Monoclonal Anti-TTF-1 Clone (G21-G), DB Biotech) and each cell labeled TTF1 (= pulmonary pneumocytes) was counted using the “HALO® image analysis” software. The samples were labeled with the TTF1 antibody. In parallel, the genomic DNAs from the 8 µm thick tissue chips prepared in paraffin were extracted using the Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID: 56604). The samples then underwent a bisulfite conversion step using the Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Reference D5031) then an analysis by System Naica digital PCR of the lung marker LINC00336 according to the invention described.
Les résultats montrent que la cible hyperméthylée LINC00336 est détectée et quantifiée uniquement dans de l’ADN génomique issu de coupes pulmonaires saines confirmant la spécificité pulmonaire. La corrélation entre le marquage histologique TTF1 (=pneumocytes pulmonaires) et le test pulmonaire (avec une spécicité pneumocytaire) décrit est de 0,56 (coefficient R-Pearson) démontrant la spécificité pulmonaire et pneumocytaire de l’analyse (
Dans une application clinique, un test selon l’invention permet de stratifier les patients atteints d’un syndrome de détresse respiratoire en phase aigüe (SDRA) selon un indice de sévérité désigné comme faible, sévère ou critique (classification de Berlin). Les résultats montrent que la cible hyperméthylée LINC00336 permet de discriminer chaque sous-groupe de patient (SDRA modérée, sévère, critique). Une différence significative a été observée entre ces 3 groupes (p-value = 0,0073, test Jonckheere-Terpstra). (
Par ailleurs, les résultats du test selon l’invention permettent de suivre l’état pulmonaire de patient atteint d’un SDRA avec des indicateurs de corrélation entre le résultat quantitatif de la cible hyperméthylée LINC00336 et les marqueurs ventilatoire 02 max / FiO2 / PAO2 (respectivement coefficient de corrélation de Pearson de 0,44, 0,29 et 0,29).Furthermore, the results of the test according to the invention make it possible to monitor the pulmonary condition of a patient suffering from ARDS with correlation indicators between the quantitative result of the hypermethylated target LINC00336 and the ventilatory markers 02 max / FiO2 / PAO2 ( respectively Pearson correlation coefficient of 0.44, 0.29 and 0.29).
Claims (14)
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2, et/ou
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5.
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, au moins : une amorce sens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8, et
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°10, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°11, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11, et/ou
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14.Kit for the detection in a biological sample of a target nucleotide sequence of methylated cell-free DNA, said nucleotide sequence being specific for a cell type of an organ chosen from: the brain, the lung and the kidney, said kit comprising:
- for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the brain, at least: a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleotide sequence having at least 80% of identity with SEQ ID No. 1 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2, and/or
- a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 5, or a sequence nucleotide presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 5.
- for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the lung, at least: a sense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleotide sequence having at least 80 % identity with SEQ ID No. 7 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8, and
- for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the kidney, at least: a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 10, or a nucleotide sequence having at least 80% of identity with SEQ ID No. 10 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 11, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 11, and/or
- a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 13, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 13 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 14, or a sequence nucleotide presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 14.
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6 et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°6,
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°9 et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°9, et
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°12, SEQ ID N°15 et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°12 ou SEQ ID N°15.Kit according to claim 1, further comprising a probe comprising:
- for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the brain, at least one nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6 and a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 6,
- for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the lung, at least one nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 9 and a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 9, and
- for the detection of a cell-free DNA target sequence specific to a type of cells present in the kidney, at least one nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15 and a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 12 or SEQ ID No. 15.
a) Détermination, dans au moins une base de données de méthylation de l’ADN génomique, de la position et du degré de méthylation des ilots CpG de séquences spécifiques dudit type cellulaire dudit organe,
b) Identification, dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit organe sain, des ilots CpG spécifiquement hyperméthylés,
c) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG d’un deuxième type cellulaire, différent du premier type cellulaire,
d) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape c),
e) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des organes autres dudit premier organe,
f) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des globules blancs sains,
g) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN acellulaire toutes matrices biologiques confondues issus de sujets sains,
h) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape e, f et g)
i) Identification d’une ou plusieurs séquences hyperméthylée cible d’ADN acellulaire spécifique dudit type cellulaire du premier organe à partir de la comparaison réalisée lors de l’étape h).Method for identifying a cell-free DNA target sequence specific to a cell type present in a first organ chosen from: the lung, the brain and the kidney, the method comprising at least the following steps:
a) Determination, in at least one genomic DNA methylation database, of the position and degree of methylation of CpG islands of sequences specific to said cell type of said organ,
b) Identification, in the genomic DNA of said cell type of said healthy organ, of specifically hypermethylated CpG islands,
c) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of a second cell type, different from the first cell type,
d) Selection of CpG islands only hypermethylated in the genomic DNA of said cell type of said first organ after comparison carried out in step c),
e) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the genomic DNA of other organs of said first organ,
f) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of the genomic DNA of healthy white blood cells,
g) Comparison of the degree of methylation of the hypermethylated CpG islands of said cell type of said first organ with the degree of methylation of the same CpG islands of cell-free DNA from all biological matrices taken together from healthy subjects,
h) Selection of CpG islands only hypermethylated in the genomic DNA of said cell type of said first organ after comparison carried out in steps e, f and g)
i) Identification of one or more hypermethylated cell-free DNA target sequences specific to said cell type of the first organ based on the comparison carried out during step h).
a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait d’un échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant :
- pour la détection d’une séquence cible spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2, et/ou
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5.,
- pour la détection d’une séquence cible spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, au moins : au moins une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8, et
- pour la détection d’une séquence cible spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°10, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°11, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11, et/ou une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14.
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b).Method for detecting in a biological sample a cell-free DNA target sequence, said sequence being specific for a type of cells present in an organ chosen from: the lung, the brain and the kidney, said method comprising at least the steps following:
a) Bringing together, under conditions suitable for amplification of nucleic acids, cell-free DNA previously extracted from a biological sample and a pair of primers consisting of a sense primer and an antisense primer, each of the primers including:
- for the detection of a target sequence specific to a type of cells present in the brain, at least: a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 1 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2, and/or
- a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 4 and an antisense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 5, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 5.,
- for the detection of a target sequence specific to a type of cells present in the lung, at least: at least one sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleotide sequence presenting at least 80% of identity with SEQ ID No. 7 and an antisense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 8, and
- for the detection of a target sequence specific to a type of cells present in the kidney, at least: a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 10, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with SEQ ID No. 10 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 11, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 11, and/or a sense primer comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 13, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 13 and an antisense primer, comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 14, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 14.
b) Amplification reaction of said target sequence,
c) Detection of the presence of the amplified sequence during step b).
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ;
- une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ; et
- une sonde comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N° SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences.Nucleotide sequence for its use in a kit according to one of claims 1 to 5, or in a method according to one of claims 11 to 13, chosen from:
- a sense primer comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences;
- an antisense primer comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 14, or a nucleotide sequence having at least 80% identity with said sequences; And
- a probe comprising a nucleotide sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. SEQ ID No. 14, or a nucleotide sequence presenting at least 80% identity with said sequences.
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Also Published As
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