WO2024056979A1 - Molécule hybride comprenant un fragment fc d'anticorps et au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, et ses utilisations - Google Patents

Molécule hybride comprenant un fragment fc d'anticorps et au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, et ses utilisations Download PDF

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WO2024056979A1
WO2024056979A1 PCT/FR2023/051404 FR2023051404W WO2024056979A1 WO 2024056979 A1 WO2024056979 A1 WO 2024056979A1 FR 2023051404 W FR2023051404 W FR 2023051404W WO 2024056979 A1 WO2024056979 A1 WO 2024056979A1
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WO
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seq
peptide
fragment
spacer
hybrid molecule
Prior art date
Application number
PCT/FR2023/051404
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English (en)
Inventor
Christian Jorgensen
Eve COMBES
Jennifer LAMBOUR
Original Assignee
Universite Toulouse III – Paul Sabatier
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Centre Hospitalier Universitaire De Toulouse
Centre Hospitalier Universitaire De Montpellier
Universite De Montpellier
Arthritis Recherche & Developpement
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/02—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11) with H2O2 as acceptor, one oxygen atom of which is incorporated into the product (1.11.2)
    • C12Y111/02002—Myeloperoxidase (1.11.2.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • Hybrid molecule comprising an antibody Fc fragment and at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis, and its uses
  • the present invention relates to a hybrid molecule comprising at least one Fc antibody fragment covalently linked to at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis, the uses of such hybrid molecule, as well as its production process.
  • Said auto-reactive lymphocyte receptor is a membrane receptor on the surface of a B lymphocyte (BCR) or on the surface of a T lymphocyte (TCR).
  • Autoimmune vasculitides are rare diseases characterized by inflammation of the wall of the body's small vessels, particularly linked to the production of autoantibodies by the body and/or pro-inflammatory cytokines secreted by the T lymphocytes.
  • Said autoantibodies are directed in particular against certain white blood cells: polynuclear neutrophils and can therefore sometimes be called ANCA (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies).
  • ANCA anti-neutrophil cytoplasmic antibodies
  • the antigenic targets of these autoantibodies involved in autoimmune vasculitis have been characterized and can be found in the IEDB database, Immune Epitope DataBase and analysis resource, http://www.iedb.org/home_v3.php .
  • Said autoantibodies are in particular directed specifically against proteinase 3 (PR3), or specifically against myeloperoxidase (MPO) or against the small nuclear ribonucleoprotein SmD1 (“small nuclear ribonucleoprotein”).
  • PR3 proteinase 3
  • MPO myeloperoxidase
  • SmD1 small nuclear ribonucleoprotein
  • Autoimmune vasculitides mainly include three diseases: granulomatosis with polyangiitis (sometimes called Wegener's disease), eosinophilic granulomatosis with polyangiitis (sometimes called Churg syndrome). and Strauss) and micropolyangiitis.
  • Granulomatosis with polyangiitis is characterized by inflammatory necrosis of small and medium-sized vessels (capillaries, venules and arterioles) which leads to tissue ischemia.
  • Eosinophilic granulomatosis with polyangiitis is defined as a systemic vasculitis of small vessels which is also characterized by asthma, blood and tissue eosinophilia, and micropolyangiitis is defined as a systemic necrotizing inflammatory vasculitis which mainly affects the small caliber vessels of multiple organs (small arteries, arterioles, capillaries, Venules).
  • Treatments generally consist of the administration of corticosteroids, or even immunosuppressive drugs, which can cause serious side effects.
  • Anti-CD20 antibodies can also be used, but these are not specific for the B lymphocytes causing the auto-reactive antibodies and have no effect on the auto-reactive T lymphocytes.
  • An object of the present invention is thus to provide more targeted treatment of autoimmune vasculitis.
  • the present invention thus aims to provide a more effective treatment. specific.
  • the present invention is based on the inventors' research showing that it is possible to target auto-reactive lymphocyte receptors which recognize self-peptides involved in the development of autoimmune vasculitis. More particularly, the present invention is based on the inventors' research showing that it is possible to target B lymphocyte clones expressing lymphocyte receptors involved in autoimmune vasculitis and/or auto-reactive T lymphocytes (by binding of a peptide of self involved in the development of autoimmune TCR vasculitis), and to eliminate them using a hybrid molecule comprising (i) at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in auto vasculitis -immune and (ii) an Fc fragment of human immunoglobulin.
  • hybrid molecules will specifically target B lymphocyte clones expressing autoantibodies responsible for autoimmune vasculitis and/or auto-reactive T lymphocytes (using said peptide, which is recognized by said B and/or T receptors). expressed by said B and/or T lymphocytes) which will then be eliminated, after fixation of the Fc fragment on the Fc receptors, by macrophages (via phagocytosis) and/or NK cells (via antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC) , and/or by activation of the complement cascade.
  • the hybrid molecules of the invention thus aim to make these “pathogenic” autoantibodies disappear from the patients’ bodies. Presentation of the invention
  • the invention in a first aspect, relates to a hybrid molecule comprising at least one Fc antibody fragment covalently linked to at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis, at minus one spacer optionally being present between said Fc fragment and said peptide.
  • the diagram of such a construction is presented in Figure 1.
  • hybrid molecule means a molecule having at least two components of different nature, in this case the antibody Fc fragment and said peptide.
  • an “Fc fragment” of an antibody means the constant region of an immunoglobulin excluding the first immunoglobulin constant region domain (i.e. CH1-CL).
  • the Fc fragment refers to a homodimer, each monomer comprising the last two constant domains of IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 and CH3), or the last three constant domains of IgE and IgM (i.e. CH2, CH3 and CH4).
  • covalently linked means a covalent bond, that is to say a chemical bond in which two atoms share two electrons. Said covalent bond may be polar or non-polar.
  • a “spacer” is a binding agent which makes it possible to covalently bind an Fc fragment of an antibody to said peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis, while moving said Fc fragment away from said peptide (thus reducing possible steric hindrance). It can be any molecule, and in particular a peptide or a polypeptide. Preferably, the spacer does not modify the physicochemical properties of the hybrid molecule.
  • the presence of at least one spacer is advantageous: it makes it possible to facilitate the independent accessibility of the two partners of the hybrid molecule (the Fc fragment is more easily accessible to bind to the Fc receptors, just as said peptide is more easily accessible to bind to self-reactive lymphocytes), and/or to stabilize the hybrid molecule, and/or increase the solubility of the hybrid molecule.
  • the hybrid molecule according to the invention may comprise one or more spacers.
  • the hybrid molecule comprises one or two spacers.
  • said Fc fragment when at least one spacer is present in said hybrid molecule of the invention, said Fc fragment is covalently linked to a spacer, said spacer itself being covalently linked to said peptide.
  • said Fc fragment when at least two spacers are present in said hybrid molecule of the invention, said Fc fragment is linked covalently to a first spacer, said first spacer itself being linked covalently to a second spacer and the second spacer is itself covalently linked to said peptide.
  • the bond between the Fc fragment and the peptide can therefore be direct, or indirect in the presence of spacers.
  • the hybrid molecule according to the invention may comprise at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis.
  • the Fc fragment can be linked to one or two peptides.
  • the Fc fragment comprises two monomers, and the Fc fragment can thus be covalently linked to a peptide on only one of the two monomers, or the Fc fragment can be covalently linked to a peptide on each monomer.
  • the two peptides are identical.
  • said spacer is a polymer containing one or more repeating units containing the ether group.
  • said spacer is polyethylene glycol of formula PEG-n, in which n represents an integer between 1 and 100, preferably between 1 and 10, and in particular 1, 2, 3, 4 or 8.
  • said polyethylene glycol can be functionalized, for example with an amine group (PEG-n-amine such as PEG-NH2).
  • PEG-n-amine such as PEG-NH2
  • an integer between 1 and 100 represents all integer values between 1 and 100, i.e.; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
  • auto-reactive lymphocyte receptor involved in autoimmune vasculitis means a receptor on the surface of a T lymphocyte and/or a B lymphocyte which recognizes a self peptide involving the activation of cells leading to autoimmune vasculitis through inappropriate production of autoantibodies or pro-inflammatory cytokines. More particularly, said lymphocyte receptor is a B lymphocyte receptor (BCR) and/or a T lymphocyte receptor (TCR). The binding of the peptide to the BCR and/or the TCR is thus involved in the development of autoimmune vasculitis.
  • the self peptide involved may comprise all or part of proteinase 3.
  • an “autoantibody responsible for autoimmune vasculitis” means a “self -anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ACPN or ANCA in English).
  • ACPN self -anti-neutrophil cytoplasmic antibody
  • ANCA cytoplasmic antibody
  • auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis means a lymphocyte expressing on its surface a receptor which recognizes a self-peptide involving the activation of cells leading to auto-immune vasculitis. immune by production inappropriate autoantibodies or pro-inflammatory cytokines.
  • it is a T lymphocyte and/or a B lymphocyte.
  • an autoantibody according to the invention means an autoantibody directed against proteinase 3 (anti-PR3), an autoantibody directed against myeloperoxidase (anti-MPO ) and/or an autoantibody directed against the small nuclear ribonucleoprotein SmD1 (anti-SmD1).
  • the autoantibodies are anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies such as anti-PR3 (c-ANCA for cytoplasmic-ANCA) or anti-MPO (p-ANCA for perinuclear-ANCA).
  • an autoantibody according to the invention means an autoantibody directed against proteinase 3 (anti-PR3), and the autoantibodies are anti-cytoplasm autoantibodies.
  • neutrophils such as anti-PR3 (c-ANCA for cytoplasmic-ANCA).
  • autoimmune vasculitis means more particularly necrotizing inflammation of small vessels, with little or no deposits of immune complexes, and the frequent presence of circulating antibodies directed against proteinase 3 ( PR3) and/or against myeloperoxidase (anti-MPO) and/or against the anti-SmD1 small nuclear ribonucleoprotein SmD1).
  • the expression “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis” means a peptide comprising all or part of the polypeptide sequence of proteinase 3, all or part of the polypeptide sequence of myeloperoxidase and/or all or part of the polypeptide sequence of the small nuclear ribonucleoprotein SmD1, preferably a peptide comprising all or part of the polypeptide sequence of proteinase 3.
  • the expression “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis” means a peptide comprising all or part of the proteinase 3 polypeptide sequence.
  • said proteinase 3 polypeptide sequence is represented by SEQ ID NO: 28.
  • the expression “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis” means a peptide comprising all or part of the myeloperoxidase polypeptide sequence.
  • said myeloperoxidase polypeptide sequence is represented by SEQ ID NO: 29.
  • the expression “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis” means a peptide comprising all or part of the polypeptide sequence of the small nuclear ribonucleoprotein SmD1.
  • said polypeptide sequence of said SmDl is represented by SEQ ID NO: 30.
  • a “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis” means a peptide recognized by an autoantibody directed against proteinase 3, against myeloperoxidase and/or against small ribonucleoprotein nuclear SmD1.
  • Such peptides can be obtained from fragments of proteinase, myeloperoxidase and/or the small nuclear ribonucleoprotein SmD1, whether these fragments are natural, recombinant or synthetic.
  • Such peptides can also be directly synthesized.
  • the amino acids constituting the peptide can be of L or D series, preferably of L series.
  • a peptide according to the invention binds to an autoantibody directed against proteinase 3, against myeloperoxidase and/or against small nuclear ribonucleoprotein SmD1, and the connection between said peptide and the autoantibody can for example be verified using an ELISA test. See also, for example, Csernok, E., Moosig, F. Current and emerging techniques for ANCA detection in vasculitis. Nat Rev Rheumatol 10, 494-501 (2014). https://doi.org/10.1038/nrrheum.2014.78.
  • said peptide comprises all or part of the polypeptide sequence of proteinase 3, all or part of the polypeptide sequence of myeloperoxidase and/or all or part of the polypeptide sequence of the small nuclear ribonucleoprotein SmD1, and said proteinase 3, myeloperoxidase and/or SmD1 comes from mammals and is preferably of human origin.
  • said peptide comprises all or part of the polypeptide sequence of proteinase 3, all or part of the polypeptide sequence of myeloperoxidase or all or part of the polypeptide sequence of the small nuclear ribonucleoprotein SmD1, and said proteinase 3, myeloperoxidase or SmD1 comes from mammals and is preferably of human origin.
  • the peptide in said hybrid molecule according to the invention, has a size of at least 2 consecutive amino acids, 3 consecutive amino acids, 4 consecutive amino acids, preferably at least 5 consecutive amino acids . According to one embodiment, said peptide has a size of between 5 and 70 amino acids.
  • “between 5 and 70” means all the values: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70
  • the peptide has a size comprised of 5 and 15 consecutive amino acids, preferably between 5 and 10.
  • the peptide is linear.
  • the peptide in said hybrid molecule according to the invention, can be modified so as to improve its reactivity with respect to autoantibodies.
  • the peptides can be cyclized, the peptides can be of the retro type (the amino acids of the L series are chained together in a sequence inverse to that of the peptide to be reproduced), or of the retro-inverso type (the amino acids are of type D instead of the natural L series and are chained together in a sequence opposite to that of the peptide to be reproduced).
  • the terminal carboxyl function (COOH) of said peptide is replaced by a carboxamide function (CONH2).
  • the peptide in said hybrid molecule according to the invention, can be modified so as to facilitate its synthesis and/or improve its stability, for example by alkylation.
  • the terminal amine function (NH2) of said peptide is acetylated.
  • the amine and carboxyl functions of the peptide can be in the form of the salt corresponding to the acid or the base.
  • said peptide is chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:
  • said peptide is chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55.
  • said peptide is chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:
  • said peptide is chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 (PR3).
  • said peptide is chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 , SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55 (PR3).
  • said peptide is chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37 (SmD1).
  • said peptide is chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51 (MPO).
  • said Fc fragment is a human Fc fragment, in particular of IgG, more particularly of IgGI.
  • IgGI can correspond to any allotype variant, for example G1 m3 or nG1 m17.
  • the Fc fragment of IgGI is represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 (Fc+Qtag) or SEQ ID NO: 26 (Fc+Qtag bis).
  • said Fc fragment is wild type or mutated.
  • the mutation(s) may aim to increase the plasma half-life, decrease it, or modify the effector functions of the Fc fragment.
  • said mutated Fc fragment comprises at least the following mutations:
  • said mutated Fc fragment comprises at least the GASDIE, GASDALIE, or SDH mutations.
  • said Fc fragment has a fucosylation rate of between 0% to 100% of the glycosylated forms.
  • “between 0% and 100%” represents all integer values between 0 and 100, ie; 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
  • said Fc fragment has a fucosylation rate of between 0% to 60% of the glycosylated forms, in particular 50%, 40%, 30%, 20%, 10% or 0%.
  • the fucosylation rate is defined as the average proportion of fucose carried by the Fc fragment, relative to the maximum quantity of fucose that an Fc fragment can carry.
  • the Fc fragment and the peptide each have N- and C-terminal ends.
  • the Fc fragment can therefore be linked via its N- or C-terminal end to the N- or C-terminal end of the peptide.
  • said covalent bond is located between the C-terminal end of said Fc fragment and the N-terminal end of said peptide, or between the N-terminal end of said Fc fragment and the N-terminal end of said peptide.
  • the spacer when a spacer is present, the spacer can be linked to the Fc fragment via its N- or C-terminal end.
  • the first spacer when two spacers are present, the first spacer can be linked to the Fc fragment via its N- or C-terminal end and the second spacer can be linked to the peptide via its N- or C-terminal end, notably N-terminal.
  • said covalent bond between said Fc fragment and said peptide (optionally in the presence of one or more spacers) can be created on all or part of the Fc fragment.
  • all or part of the Fc fragment means that different amino acids constituting the Fc fragment can be involved in a covalent bond with said peptide.
  • this when at least one spacer is present in said hybrid molecule of the invention, this makes it possible to link the Fc fragment to an azide or to an alkyne which will itself be involved in the covalent bond with said peptide. According to one embodiment, when at least one spacer is present in said hybrid molecule of the invention, this can also make it possible to link the peptide to an alkyne or to an azide which will itself be involved in the covalent bond with the Fc fragment.
  • the hybrid molecule according to the invention comprises at least two spacers: a first spacer which makes it possible to link the Fc fragment to an azide or to an alkyne and a second spacer which makes it possible to link the peptide to an azide (when the Fc fragment is linked to an alkyne) or to an alkyne (when the Fc fragment is linked to an azide).
  • said Fc fragment: - is coupled to at least one azide or to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, or
  • - is linked to at least one spacer which is itself coupled to an azide or an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, and said peptide is:
  • the Fc fragment is coupled to at least one azide and said peptide is coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, or
  • the Fc fragment is coupled to at least one alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, and said peptide is coupled to an azide, the covalent bond between said Fc fragment and said peptide being created between the azide and alkyne.
  • alkyne such as a cyclooctyne, and in particular DBCO
  • the Fc fragment is coupled to at least one azide and said peptide is linked to a spacer, itself coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO or
  • the Fc fragment is coupled to at least one alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, and said peptide is linked to a spacer, itself coupled to an azide or
  • the Fc fragment is linked to at least one spacer, itself coupled to an azide, and said peptide is coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO or
  • the Fc fragment is linked to at least one spacer, itself coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, and said peptide is coupled to an azide or
  • the Fc fragment is linked to at least one spacer, itself coupled to an azide, and said peptide is linked to a spacer, itself coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO or
  • the Fc fragment is linked to at least one spacer, itself coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, and said peptide is linked to a spacer, itself coupled to an azide, the covalent bond between said Fc fragment and said peptide, in the presence of one or more spacers, being created between the azide and the alkyne.
  • an alkyne such as a cyclooctyne, and in particular DBCO
  • the creation of the covalent bond between the azide and the alkyne corresponds to a so-called “chemistry-click” step, the N3 part of the azide reacting with an alkyne.
  • Azide means salts of hydrogen azide HN3, or organic azides in which one of the nitrogen atoms is covalently bonded to a carbon atom of an organic compound (e.g. example methyl azide CH3N3).
  • the azide is represented by the formula N3.
  • Alkyne refers to molecules having the general formula C n H2n-2, and which are characterized by the presence of at least one triple bond.
  • the alkyne is a cyclooctyne, even more preferably dibenzocyclooctyne (DBCO).
  • the Fc fragment, said peptide and optionally said spacer(s), are coupled to the alkyne or azide by any conventionally used molecular coupling technique (such as conjugation). . Any technique can also be used to covalently link the Fc fragment to the spacer and/or the peptide to the spacer.
  • a conjugation technique means an enzymatic conjugation or a chemical conjugation.
  • Enzymatic conjugation means, for example, conjugation using a transglutaminase which catalyzes the formation of covalent bonds between free amine groups and glutamine or lysine residues or using a transpeptidase such as sortase.
  • a transglutaminase which catalyzes the formation of covalent bonds between free amine groups and glutamine or lysine residues or using a transpeptidase such as sortase.
  • the transglutaminase substrate is for example a peptide comprising a glutamyl residue (a Qtag), as represented by SEQ ID NO: 27 (LLQG).
  • a chemical conjugation means, for example, a covalent bond between a cysteine isolated or participating in a disulfide bridge after reduction thereof and for example a maleimide.
  • An example of such a conjugation is shown in Figure 4.
  • the Fc fragment comprises a Qtag peptide and said Fc fragment is linked to a spacer (itself coupled to an azide), thanks to the action of the transglutaminase which will create a covalent bond between the glutamyl residue of Qtag and the NH2 group carried by the PEGn spacer.
  • the term “coupled” or “molecular coupling” means the establishment of a covalent bond, thus the Fc fragment and/or the peptide and/or the spacer is linked in such a manner. covalent to an alkyne or azide.
  • the term “bonded” also means a covalent bond.
  • the expression “the Fc fragment is coupled to an azide and said peptide is linked to a spacer, itself coupled to an alcycne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO” can also read “the Fc fragment is covalently linked to an azide and said peptide is covalently linked to a spacer, said spacer itself being covalently linked to an alcycne, such as a cyclooctyne, and in particular the DBCO”.
  • the present invention also relates to a hybrid molecule as defined above, for its use as a drug.
  • said hybrid molecules are intended to target and lyse in the body of patients, by ADCC and/or phagocytosis and/or complement activation, all cells expressing self-lymphocyte receptors.
  • autoimmune vasculitis reactive in the context of autoimmune vasculitis: namely B cells (lymphocytes) expressing on their surface BCRs recognizing at least one of the peptides of the invention (autoantibodies responsible for autoimmune vasculitis, binding to at least one peptide according to the invention) and the T lymphocytes expressing on their surface the TCRs recognizing at least one of the peptides according to the invention.
  • the hybrid molecule according to the invention binds to these cells thanks to the peptide: it is the epitope target of said auto-reactive lymphocyte receptor.
  • the hybrid molecule according to the invention also binds to cells making it possible to destroy B and/or T lymphocytes expressing on their surface the auto-reactive lymphocyte receptors involved in autoimmune vasculitis thanks to its Fc fragment, a natural ligand for Fc receptors.
  • Fc fragment a natural ligand for Fc receptors.
  • FcyR Fc-gamma receptor
  • NK Natural Killers
  • the invention relates to a hybrid molecule, as defined above, for its use in the treatment of autoimmune vasculitis, in particular granulomatosis with polyangiitis, eosinophilic granulomatosis with polyangiitis and micropolyangiitis.
  • the invention relates to a hybrid molecule, as defined above, for its use in the treatment of granulomatosis with polyangiitis.
  • the invention relates to a hybrid molecule as defined above and comprising a peptide chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:
  • the invention relates to a hybrid molecule as defined above and comprising a peptide chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO: 41,
  • the invention relates to a hybrid molecule as defined above and comprising a peptide chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55, for its use in the treatment of autoimmune vasculitis.
  • the invention relates to a hybrid molecule as defined above and comprising a peptide chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55, for its use in the treatment of granulomatosis with polyangiitis (sometimes called Wegener's disease), eosinophilic granulomatosis with polyangiitis (sometimes called Churg and Strauss syndrome) or micropolyangiitis.
  • polyangiitis sometimes called Wegener's disease
  • eosinophilic granulomatosis with polyangiitis sometimes called Churg and Strauss syndrome
  • micropolyangiitis sometimes called Churg and Strauss syndrome
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a hybrid molecule according to any one of the preceding claims, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle means any formulation making the composition suitable for administration to a patient, in any dosage form.
  • the present invention also relates to a method of treating autoimmune vasculitis, in particular granulomatosis with polyangiitis, comprising the administration of a therapeutically effective quantity of a hybrid molecule according to the invention.
  • the invention also relates to the use of a hybrid molecule according to the invention for the preparation of a medicament intended for the treatment of autoimmune vasculitis, in particular granulomatosis with polyangiitis.
  • the hybrid molecule according to the invention can be coupled to at least one radioisotope or to at least one fluorochrome, such as A488 or A647.
  • Such molecules can advantageously be used as tracer molecular tools.
  • the invention thus relates to the in vitro or ex vivo use of a hybrid molecule comprising at least one Fc antibody fragment covalently linked to at least one peptide binding to a auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis, at least one spacer optionally being present between said Fc fragment and said peptide, as a molecular tool.
  • a hybrid molecule comprising at least one Fc antibody fragment covalently linked to at least one peptide binding to a auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis, at least one spacer optionally being present between said Fc fragment and said peptide, as a molecular tool.
  • Such constructions can in particular be used to analyze the binding of hybrid molecules to autoantibodies and Fc receptors of macrophages and cells.
  • NK as well as to analyze the reactivity of macrophages and NK cells to the fixation of the hybrids followed by the bridging of these by the autoantibodies....
  • the invention also relates to a process making it possible to obtain a hybrid molecule as defined above.
  • the invention thus relates to a process for producing a hybrid molecule as defined above, comprising the following steps:
  • step (i) can be carried out before or after step (ii), or concomitantly.
  • the invention thus relates to a process for producing a hybrid molecule as defined above, comprising the following steps:
  • step (i) can be carried out before or after step (ii), or concomitantly.
  • the invention thus relates to a process for producing a hybrid molecule as defined above, comprising the following steps:
  • step (i) can be carried out before or after step (ii), or concomitantly.
  • the hybrid molecules according to the invention can also be obtained by bioproduction methods and encoded by a recombinant DNA encoding the peptide according to the invention and the Fc fragment, said peptide and said Fc fragment being optionally separated by a polypeptide linker.
  • the peptide of the hybrid molecule is unmodified (eg non-cyclized, non-retro, non-retro-inverso), and perhaps N-terminal or C-terminal oriented.
  • the peptide may be C-terminal or N-terminal of the Fc fragment, the cDNA including its nucleotide coding sequence upstream or downstream of the Fc cDNA.
  • FIG. 1 represents the diagram of an example of a hybrid molecule according to the invention.
  • a spacer (which is optional) is represented between the Fc antibody fragment and the peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune vasculitis (called “peptide according to the invention”).
  • FIG. 2 represents a B lymphocyte expressing on its surface transmembrane BCRs/autoantibodies linked to a hybrid molecule according to the invention, said hybrid molecule itself being linked by the Fc fragment to an NK cell.
  • the NK cell will thus be able to destroy the B lymphocyte by ADCC. More specifically, this figure shows a B cell (or B lymphocyte) which expresses on its surface a BCR (the ANCA autoantibody) which interacts specifically with the peptide according to the invention carried by the hybrid molecule.
  • BCR the ANCA autoantibody
  • the engagement of the Fc fragment carried by the same hybrid molecule with FcyRIIIa (CD16a) expressed on the surface of an NK cell will activate the ADCC and induce the specific destruction of the “ANCA positive” B lymphocyte (which expresses an ANCA).
  • ADCC Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity
  • BCR B-Cell Receptor
  • FcyR Fc-gamma Receptor
  • NK cell Natural Killer cell
  • Nb a similar representation could be achieved by replacing the B lymphocyte with a T lymphocyte, and the BCR with a TCR (T-Cell Receptor).
  • FIG. 3 represents a B lymphocyte expressing on its surface transmembrane BCRs linked to a hybrid molecule according to the invention, said hybrid molecule itself being linked by the Fc fragment to a macrophage.
  • the macrophage will thus be able to destroy the B lymphocyte by phagocytosis. More specifically, this Figure shows B cells (or B lymphocytes) which express on their surface a BCR (the ANCA autoantibody) and which interact specifically with peptides according to the invention carried by the hybrid molecules.
  • ADCP Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis
  • BCR B-Cell Receptor
  • FcyR Fc-gamma Receptor
  • Nb a similar representation could be achieved by replacing the B lymphocyte with a T lymphocyte, and the BCR with a TCR (T-Cell Receptor).
  • FIG. 4 represents a process for manufacturing a hybrid molecule according to the invention, comprising the scheme for derivation and conjugation of the Fc fragments.
  • FIG. 5 represents the reactivity of sera from patients suffering from micropolyangiitis in the presence of peptides.
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 80 is presented in Figure 5A
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 81 is presented in Figure 5B
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 82 is presented in Figures 5C and 5H
  • the reactivity of sera in the presence of peptide 83 is presented in Figure 5D
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 84 is presented in Figures 5E and 5I
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 85 is presented in Figure 5F
  • the reactivity of the sera in presence of peptide 86 is presented in Figure 5G.
  • the ordinate represents the OD measured at 450 nm and the abscissa represents the serum tested.
  • the serum is diluted 1/25.
  • FIG. 6 represents the reactivity of sera from patients suffering from Wegener's disease in the presence of peptides.
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 80 is presented in Figure 6A
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 81 is presented in Figure 6B
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 82 is presented in Figure 6C
  • the reactivity of the sera in presence of peptide 83 is presented in Figure 6D
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 84 is presented in Figure 6E
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 85 is presented in Figures 6F and 6H
  • the reactivity of the sera in the presence of Peptide 86 is shown in Figure 6G.
  • the ordinate represents the OD measured at 450 nm and the abscissa represents the serum tested.
  • the serum is diluted 1/25.
  • FIG. 7 represents the reactivity of sera from patients suffering from Churg and Strauss syndrome in the presence of peptides.
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 80 is presented in Figure 7A
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 81 is presented in Figure 7B
  • the reactivity of sera in the presence of peptide 82 is presented in Figure 7C
  • reactivity of sera in the presence of peptide 83 is presented in Figure 7D
  • reactivity of sera in the presence of peptide 84 is presented in Figure 7E
  • reactivity of sera in the presence of peptide 85 is presented in Figure 7F
  • the reactivity of the sera in the presence of peptide 86 is presented in Figure 7G.
  • the ordinate represents the OD measured at 450 nm and the abscissa represents the serum tested.
  • the serum is diluted 1/25.
  • FIG. 8 represents the reactivity of healthy patient sera in the presence of peptides.
  • the reactivity of serum HD6 in the presence of peptides 80-86 is presented in Figure 8A
  • the reactivity of serum HD7 in the presence of peptides 80-86 is presented in Figure 8B
  • the reactivity of serum HD8 in the presence of peptides 80-86 is presented in Figure 8C
  • the reactivity of serum HD9 in the presence of peptides 80-86 is presented in Figure 8D
  • the reactivity of serum HD10 in the presence of peptides 80-86 is presented in Figure 8E.
  • the ordinate represents the OD measured at 450 nm
  • the abscissa represents the peptide tested.
  • the serum is diluted 1/25.
  • Example 1 Example of production of a hybrid molecule according to the invention
  • the hybrid molecule described here comprises the following construction: an Fc fragment covalently linked to at least one PEGn spacer, itself coupled to an azide, said azide being covalently linked to an alkyne, which is itself even coupled to a PEGn spacer linked to a peptide according to the invention.
  • Such a molecule can be read: Fc-PEGn-Ns-DBCO-PEGn-peptide.
  • the two PEGn may be identical or different (for example the first PEGn is PEG3 and the second PEGn is PEG2).
  • an Fc-PEGn-DBCO and an Ns-PEGn-peptide can be obtained, then coupled to obtain Fc-PEGn-DBCO-Ns-PEGn-peptide.
  • an Fc-PEGn-DBCO and an Ns-peptide can be obtained, or an Fc-PEGn-Ns and a DBCO-peptide, then coupled to obtain respectively Fc-PEGn-DBCO-Ns-peptide or Fc -PEGn-Ns-DBCO-peptide.
  • Example 2 Reactivity of sera from patients suffering from autoimmune vasculitis towards the hybrid molecules according to the invention
  • the sera used are sera from patients suffering from autoimmune vasculitis, more particularly granulomatosis with polyangiitis, which contain specific autoantibodies.
  • ELISA microtiter plate wells were coated by passive adsorption using 100 ⁇ L of a solution containing either a peptide chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 , SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 1,
  • a molecule hybrid according to the invention of which the Fc fragment is wild (WT) or the Fc fragment comprises the GASDIE mutation.
  • a hybrid molecule is for example “FcWT-PEG-SEQ ID NO: 1-23/31-51”, “FcLALAPG-PEG-SEQ ID NO: 1-23/31-51” or “FcGASDIE-PEG-SEQ ID NO: 1-23/31-51”.
  • FcWT-PEG-SEQ ID NO: 1-23/31-51 represents a wild-type Fc fragment that is linked to at least one PEGn spacer that is itself coupled to an azide covalently linked to a cyclooctyne DBCO coupled to a PEGn spacer which is itself linked to a peptide represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 51
  • “FcWT-LALAPG- SEQ ID NO: 1-23/31-51” represents an Fc fragment comprising the mutations L234A, L235A and P329G which is linked to at least one PEGn spacer which is itself coupled to an azide covalently linked to a cyclooctyne DBCO coupled to a PEGn spacer which is itself linked to a peptide represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO:
  • results are expressed in A DO (Delta-Optical Density), corresponding to the OD obtained with a scramble peptide hybrid or with the hybrid molecule constructed with said peptide.
  • DO Delta-Optical Density
  • results show a dose-dependent reactivity of the serums on the peptides with respect to the hybrid molecules. They show that included in the different hybrids, the peptides remain perfectly reactive to sera comprising autoantibodies.
  • Human macrophages differentiated in vitro in the presence of M-CSF (100 ng/mL) from CD14+ monocytes isolated from the peripheral blood of a healthy subject, were incubated at 500,000 cells/well, in the presence of hybrid molecules. at 5 pg/MI.
  • the hybrid molecules are for example those described in [Example 2.
  • the hybrid molecules are incubated for 2 hours, 8 hours, 16 hours, 24 hours and 48 hours at 37°C.
  • the attachment of the hybrid molecules to the surface of the macrophages is demonstrated and quantified by cytofluorimetry (FACS Canto II) after incubation of the macrophages with an anti-Fc antibody coupled to FITC, used 1/1000.
  • NM and ANTI FC respectively represent the well containing the macrophages incubated without antibodies or with the anti-Fc antibody alone.
  • Wt and “LALAPG” respectively represent the well containing the hybrid molecule with the wild-type Fc fragment or with the LALAPG mutation or with the GASDIE mutation.
  • Human B lymphocytes freshly purified from the peripheral blood of healthy donors by CD19+ magnetic sorting, were labeled with PKH-67 green (Paul Karl Horan / fluorescent lipid marker) then incubated with sera from patients suffering from autovasculitis. -immune at a concentration of 5 pg/mL for 30 min at 37°C. Subsequently, the cells were washed and then brought into contact with the hybrid according to the invention comprising a wild Fc fragment (Wt) or comprising the GASDIE mutations.
  • the hybrid molecules are for example those described in Example 2. The cells were brought into contact with the hybrids at 10 pg/mL for 30 min at 37°C.
  • the cells were placed in contact with macrophages (marked PKH-26 red), at a rate of 1 B lymphocyte for 1 macrophage, for 2 hours at 37°C.
  • the cells were then detached and analyzed by flow cytometry.
  • the cells showing double fluorescence correspond to macrophages which have phagocytosed lymphocytes.
  • the different cell populations are expressed as a percentage of the total cell population: percentage of phagocytosis and percentage of B lymphocytes.
  • Example 5 Stability of the fixation of Fc-GASDIE A488 and Fc-GASDIE peptide hybrids, on NK cells after 30 min, 24 h and 48 h, at physiological temperature
  • NK cells were incubated for 30 min, 24 hours or 48 hours at 37°C in the presence of FcGASDIE-N3-DBCO-A488 (an Fc fragment comprising the G236A, S239D and I332E mutations which is linked to at least one PEGn spacer which is itself coupled to an azide covalently linked to a DBCO, the molecule being labeled with fluorochrome A488) or FcGASDIE-N3-DBCO-PEG3-peptide-lysineA488 (an Fc fragment comprising the mutations G236A, S239D and I332E which is linked to at least one PEGn spacer which is itself coupled to an azide covalently linked to a DBCO which is coupled to a PEGn spacer linked to a peptide according to the invention (represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 51) the molecule being label
  • NM represents unlabeled NK cells, without antibodies.
  • the peptides used here are the peptides of SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO : 7, as indicated in Table 1 above.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 52 corresponds to the peptide named peptide 80 in the examples.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 53 corresponds to the peptide named peptide 81 in the examples.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 54 corresponds to the peptide named peptide 82 in the examples.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to the peptide named peptide 83 in the examples.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 31 corresponds to the peptide named peptide 84 in the examples.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 55 corresponds to the peptide named peptide 85 in the examples.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 7 corresponds to the peptide named peptide 86 in the examples.
  • ELISA microtiter plate wells were coated by passive adsorption using 100 pL of a solution containing a peptide represented by SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 55 or SEQ ID NO: 7.
  • the results express the optical density (OD) obtained with each serum and each peptide tested.

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Abstract

L'invention concerne une molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d'anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, les utilisations d'une telle molécule hybride, ainsi que son procédé de production.

Description

Titre : Molécule hybride comprenant un fragment Fc d’anticorps et au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, et ses utilisations
[0001] La présente invention concerne une molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d’anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, les utilisations d’une telle molécule hybride, ainsi que son procédé de production. Ledit récepteur lymphocytaire auto-réactif est un récepteur membranaire à la surface d’un lymphocyte B (BCR) ou à la surface d’un lymphocyte T (TCR).
Contexte de l’invention
[0002] Les vascularites auto-immunes sont des maladies rares caractérisées par une inflammation de la paroi des petits vaisseaux de l’organisme, notamment liées à la production d’autoanticorps par l’organisme et/ou de cytokines pro-inflammatoires secrétées par les lymphocytes T.
[0003] Lesdits auto-anticorps sont notamment dirigés contre certains globules blancs : les polynucléaires neutrophiles et peuvent donc parfois être parfois nommés ANCA (anticorps anticytoplasme des polynucléaires neutrophiles).
[0004] Ces auto-anticorps sont bien souvent utilisés pour établir le diagnostic des vascularites auto-immunes et leur rôle dans la pathogénèse de la maladie a été étudié (e.g. Bruner BF, Vista ES, Wynn DM, Harley JB, James JA. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies target sequential functional proteinase 3 epitopes in the sera of patients with Wegener’s granulomatosis. Clin Exp Immunol. 2010 Nov;162(2):262-70. doi: 10.1111/j.1365-2249.2010.04251.x. PMID: 21077276; PMCID: PMC2996593 ; ou encore Van Der Geld YM, Simpelaar A, Van Der Zee R, Tervaert JW, Stegeman CA, Limburg PC, Kallenberg CG. Antineutrophil cytoplasmic antibodies to proteinase 3 in Wegener's granulomatosis: epitope analysis using synthetic peptides. Kidney Int. 2001 Jan;59(1 ):147-59. doi: 10.1046/j.1523-1755.2001.00475.x. PMID: 11135067). Ces auto-anticorps représentent donc une cible thérapeutique de choix.
[0005] Les cibles antigéniques de ces auto-anticorps impliqués dans les vascularites autoimmunes ont été caractérisées et peuvent être retrouvées dans la base de données IEDB, Immune Epitope DataBase and analysis resource, http://www.iedb.org/home_v3.php. Lesdits auto-anticorps sont notamment dirigés spécifiquement contre la protéinase 3 (PR3), ou spécifiquement contre la myélopéroxidase (MPO) ou contre la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 (« small nuclear ribonucleoprotein »).
[0006] Les vascularites auto-immunes (ou « vascularites ANCA-positives » ou vascularites associées aux ANCA) regroupent principalement trois maladies : la granulomatose avec polyangéite (parfois appelée maladie de Wegener), la granulomatose éosinophilique avec polyangéite (parfois appelée syndrome de Churg et Strauss) et la micropolyangéite. La granulomatose avec polyangéite est caractérisée par une nécrose inflammatoire des vaisseaux de petit et moyen calibre (capillaires, veinules et artérioles) qui entraîne une ischémie tissulaire. La granulomatose éosinophilique avec polyangéite est définie comme une vascularite systémique des petits vaisseaux qui est aussi caractérisée aussi de l'asthme, une éosinophilie sanguine et tissulaire, et la micropolyangéite est définie comme une vascularite inflammatoire nécrosante systémique qui touche principalement les vaisseaux de petit calibre de multiples organes (petites artères, artérioles, capillaires, veinules).
[0007] A ce jour il n’existe pas de traitement spécifique de ces vascularites auto-immunes. Les traitements consistent généralement en l'administration de corticoïdes, voire des médicaments immunosuppresseurs, qui peuvent provoquer des effets secondaires graves. Des anticorps anti- CD20 peuvent également être utilisés, mais ces derniers ne sont pas spécifiques des lymphocytes B à l’origine des anticorps auto-réactifs et sont sans effet sur les lymphocytes T auto-réactifs.
[0008] Un objet de la présente invention est ainsi de fournir un traitement plus ciblé des vascularites auto-immunes. En ciblant les cellules B à l’origine des anticorps auto-réactifs (autoanticorps) associés aux vascularites auto-immunes, et/ou les lymphocytes T auto-réactifs sources de cytokines pro-inflammatoires, la présente invention vise ainsi à fournir un traitement plus spécifique.
[0009] La présente invention repose sur les recherches des Inventeurs montrant qu’il est possible de cibler les récepteurs lymphocytaires auto-réactifs qui reconnaissent les peptides du soi impliqués dans le développement d’une vascularite auto-immune. Plus particulièrement, la présente invention repose sur les recherches des Inventeurs montrant qu’il est possible de cibler les clones lymphocytaires B exprimant les récepteurs lymphocytaires impliqués dans une vascularite autoimmune et/ou les lymphocytes T auto-réactifs (par liaison d’un peptide du soi impliqué dans le développement d’une vascularite auto-immune au TCR), et de les éliminer à l’aide d’une molécule hybride comprenant (i) au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune et (ii) un fragment Fc d’immunoglobuline humaine. Ces molécules hybrides cibleront spécifiquement les clones lymphocytaires B exprimant des auto-anticorps responsables d’une vascularite auto-immune et/ou les lymphocytes T auto-réactifs (à l’aide dudit peptide, qui est reconnu par lesdits récepteurs B et/ou T exprimés par lesdits lymphocytes B et/ou T) qui seront ensuite éliminés, après fixation du fragment Fc sur les récepteurs Fc, par des macrophages (via phagocytose) et/ou des cellules NK (via cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps - ADCC), et/ou par activation de la cascade du complément.
[00010] En ciblant les clones lymphocytaires B exprimant des auto-anticorps responsables d’une vascularite auto-immune et les cellules qui se différencient en plasmocytes qui sécrètent eux-mêmes lesdits auto-anticorps et/ou les lymphocytes T auto-réactifs sources de cytokines pro-inflammatoires, les molécules hybrides de l’invention visent ainsi à faire disparaître ces auto-anticorps « pathogènes » de l’organisme des patients. Exposé de l’invention
[00011 ] Molécule hybride selon l’invention
[00012] Dans un premier aspect, l’invention concerne une molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d’anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, au moins un espaceur étant optionnellement présent entre ledit fragment Fc et ledit peptide. Le schéma d’une telle construction est présenté en Figure 1.
[00013] Selon l’invention, une « molécule hybride » s’entend d’une molécule ayant au moins deux composants de nature différente, en l’espèce le fragment Fc d’anticorps et ledit peptide.
[00014] Selon l’invention, un « fragment Fc » d’anticorps s’entend de la région constante d'une immunoglobuline à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (i.e. CH1- CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4).
[00015] Selon l’invention, l’expression « lié de façon covalente » s’entend d’une liaison covalente, c’est-à-dire une liaison chimique dans laquelle deux atomes se partagent deux électrons. Ladite liaison covalente peut être polaire ou non-polaire.
[00016] Selon l’invention, un « espaceur » est un agent de liaison qui permet de lier de façon covalente un fragment Fc d’anticorps audit peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, tout en éloignant ledit fragment Fc dudit peptide (diminuant ainsi un éventuel encombrement stérique). Il peut s’agir de toute molécule, et notamment d’un peptide ou d’un polypeptide. De manière préférée, l’espaceur ne modifie pas les propriétés physico-chimiques de la molécule hybride.
[00017] La présence d’au moins un espaceur est avantageuse : elle permet de faciliter l’accessibilité indépendante des deux partenaires de la molécule hybride (le fragment Fc est plus facilement accessible pour se lier aux récepteurs Fc, de même que ledit peptide est plus facilement accessible pour se lier aux lymphocytes auto-réactifs), et/ou de stabiliser la molécule hybride, et/ou augmenter la solubilité de la molécule hybride.
[00018] Selon un mode de réalisation, la molécule hybride selon l’invention peut comprendre un ou plusieurs espaceurs. De préférence, la molécule hybride comprend un ou deux espaceurs. Selon un mode de réalisation, lorsqu’au moins un espaceur est présent dans ladite molécule hybride de l’invention, ledit fragment Fc est lié de façon covalente à un espaceur, ledit espaceur étant lui-même lié de façon covalente audit peptide. Selon un autre mode de réalisation, lorsqu’au moins deux espaceurs sont présents dans ladite molécule hybride de l’invention, ledit fragment Fc est lié de façon covalente à un premier espaceur, ledit premier espaceur étant lui-même lié de façon covalente à un deuxième espaceur et le deuxième espaceur est lui-même lié de façon covalente audit peptide. La liaison entre le fragment Fc et le peptide peut donc être directe, ou bien indirecte en présence d’espaceurs.
[00019] Selon un mode de réalisation, la molécule hybride selon l’invention peut comprendre au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune. Cela signifie que le fragment Fc peut être lié à un ou deux peptides. En effet, le fragment Fc comprend deux monomères, et le fragment Fc peut ainsi être lié de façon covalente à un peptide sur un seul des deux monomères, ou bien le fragment Fc peut être lié de façon covalente à un peptide sur chaque monomère. De préférence, lorsque deux peptides sont liés sur le fragment Fc, les deux peptides sont identiques.
[00020] Selon un mode de réalisation, ledit espaceur est un polymère contenant un ou plusieurs motifs de répétition contenant le groupe éther. Selon un mode de réalisation particulier, ledit espaceur est le polyéthylène glycol de formule PEG-n, dans laquelle n représente un nombre entier compris entre 1 et 100, préférentiellement entre 1 et 10, et notamment 1 , 2, 3, 4 ou 8. Selon l’invention ledit polyéthylène glycol peut être fonctionnalisé, par exemple avec un groupement amine (PEG-n-amine tel que PEG-NH2). Selon l’invention « un nombre entier compris entre 1 et 100 » représente toutes les valeurs entières comprises entre 1 et 100, i.e. ; 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63,
64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 et 100.
[00021] L’expression « récepteur lymphocytaire auto-réactif impliqué dans une vascularite autoimmune » s’entend d’un récepteur à la surface d’un lymphocyte T et/ou d’un lymphocyte B qui reconnaît un peptide du soi impliquant l’activation des cellules conduisant à la vascularite autoimmune par une production inappropriée d’auto-anticorps ou de cytokines pro-inflammatoires. Plus particulièrement, ledit récepteur lymphocytaire est un récepteur de lymphocyte B (BCR) et/ou un récepteur d’un lymphocyte T (TCR). La liaison du peptide au BCR et/ou au TCR est ainsi impliqué dans le développement d’une vascularite auto-immune. Par exemple, et selon un mode de réalisation, le peptide du soi impliqué peut comprendre tout ou partie de la protéinase 3. et/ou un « auto-anticorps responsable d’une vascularite auto-immune » s’entend d’un « auto-anticorps anticytoplasme des polynucléaires neutrophiles (ACPN ou ANCA en anglais). Typiquement, la fixation de ces ACPN à leur cible conduit à l’activation des neutrophiles avec augmentation de l’adhésion à l’endothélium vasculaire, production de radicaux libres de l’oxygène et libération d’enzymes à l’origine des dommages tissulaires.
[00022] L’expression « lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune » s’entend d’un lymphocyte exprimant à sa surface un récepteur qui reconnaît un peptide du soi impliquant l’activation des cellules conduisant à la vascularite auto-immune par une production inappropriée d’auto-anticorps ou de cytokines pro-inflammatoires. De préférence, il s’agit d’un lymphocyte T et/ou d’un lymphocyte B.
[00023] Selon un mode de réalisation préféré, un auto-anticorps selon l’invention s’entend d’un auto-anticorps dirigé contre la protéinase 3 (anti-PR3), un auto-anticorps dirigé contre la myélopéroxidase (anti-MPO) et/ou un auto-anticorps dirigé contre la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 (anti-SmD1 ). De préférence, les auto-anticorps sont des auto-anticorps anticytoplasme des polynucléaires neutrophiles tels que des anti-PR3 (c-ANCA pour cytoplasmique- ANCA) ou des anti-MPO (p-ANCA pour périnucléaire-ANCA). Selon un mode de réalisation encore plus préféré, un auto-anticorps selon l’invention s’entend d’un auto-anticorps dirigé contre la protéinase 3 (anti-PR3), et les auto-anticorps sont des auto-anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles tels que des anti-PR3 (c-ANCA pour cytoplasmique-ANCA).
[00024] L’expression « vascularite auto-immune » s’entend plus particulièrement d’une inflammation nécrosante des petits vaisseaux, avec peu ou pas de dépôts de complexes immuns, et la présence fréquente d’anticorps circulants dirigés contre la protéinase 3 (PR3) et/ou contre la myélopéroxidase (anti-MPO) et/ou contre la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 anti-SmD1 ).
[00025] Selon un mode de réalisation, l’expression « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune » s’entend d’un peptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique de la protéinase 3, tout ou partie de la séquence polypeptidique de la myélopéroxidase et/ou tout ou partie de la séquence polypeptidique de la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 , de préférence un peptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique de la protéinase 3.
[00026] Selon un mode de réalisation, l’expression « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune » s’entend d’un peptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique de la protéinase 3. De préférence, ladite séquence polypeptidique de la protéinase 3 est représentée par la SEQ ID NO : 28.
[00027] Selon un mode de réalisation, l’expression « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune » s’entend d’un peptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique de la myélopéroxidase. De préférence, ladite séquence polypeptidique de la myélopéroxidase est représentée par SEQ ID NO : 29.
[00028] Selon un mode de réalisation, l’expression « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune » s’entend d’un peptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique de la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1. De préférence, ladite séquence polypeptidique de ladite SmDlest représentée par SEQ ID NO : 30.
[00029] Selon un mode de réalisation, un « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune » s’entend d’un peptide reconnu par un auto-anticorps dirigé contre la protéinase 3, contre la myélopéroxidase et/ou contre la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 . De tels peptides peuvent être obtenus à partir de fragments de la protéinase, de la myélopéroxidase et/ou de la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 , que ces fragments soient naturels, recombinants ou de synthèse. De tels peptides peuvent également être directement synthétisés. Les acides aminés constituant le peptide peuvent être de série L ou D, de préférence de série L. Un peptide selon l’invention se lie à un auto-anticorps dirigé contre la protéinase 3, contre la myélopéroxidase et/ou contre la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 , et la liaison entre ledit peptide et l’auto-anticorps peut par exemple être vérifiée à l’aide d’un test ELISA. Voir également, par exemple, Csernok, E., Moosig, F. Current and emerging techniques for ANCA detection in vasculitis. Nat Rev Rheumatol 10, 494-501 (2014). https://doi.org/10.1038/nrrheum.2014.78.
[00030] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique de la protéinase 3, tout ou partie de la séquence polypeptidique de la myélopéroxidase et/ou tout ou partie de la séquence polypeptidique de la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 , et ladite protéinase 3, myélopéroxidase et/ou SmD1 est issue de mammifère et est de préférence d’origine humaine. Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique de la protéinase 3, tout ou partie de la séquence polypeptidique de la myélopéroxidase ou tout ou partie de la séquence polypeptidique de la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1 , et ladite protéinase 3, myélopéroxidase ou SmD1 est issue de mammifère et est de préférence d’origine humaine.
[00031] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide a une taille d’au moins 2 acides aminés consécutifs, 3 acides aminés consécutifs, 4 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 5 acides aminés consécutifs. Selon un mode de réalisation, ledit peptide a une taille comprise entre 5 et 70 acides aminés. Selon l’invention, « entre 5 et 70 » s’entend de toutes les valeurs : 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70. Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide a une taille comprise en 5 et 15 acides aminés consécutifs, de préférence entre 5 et 10.
[00032] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide est linéaire.
[00033] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide peut être modifié de façon à améliorer sa réactivité vis-à-vis des auto-anticorps. A titre d’exemple, les peptides peuvent être cyclisés, les peptides peuvent être de type rétro (les acides aminés de série L sont enchainés selon une séquence inverse de celle du peptide à reproduire), ou de type rétro-inverso (les acides aminés sont de type D au lieu de la série naturelle L et sont enchainés selon une séquence inverse de celle du peptide à reproduire). Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, la fonction carboxyle (COOH) terminale dudit peptide est remplacée par une fonction carboxamide (CONH2).
[00034] Selon un autre mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide peut être modifié de façon à faciliter sa synthèse et/ou améliorer sa stabilité, par exemple par alkylation. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, la fonction amine (NH2) terminale dudit peptide est acétylée.
[00035] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, les fonctions amine et carboxyle du peptide peuvent être sous forme du sel correspondant à l’acide ou à la base.
[00036] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO :
14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID
NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO :
44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID
NO : 50 et SEQ ID NO : 51.
[00037] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO : 55.
[00038] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO :
14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID
NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO :
44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID
NO : 50, SEQ ID NO : 51 , SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO : 55.
[00039] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35 (PR3).
[00040] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO : 55 (PR3).
[00041] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37 (SmD1 ).
[00042] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO : 51 (MPO).
[00043] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit fragment Fc est un fragment Fc humain, notamment d’IgG, plus particulièrement d’IgGI . L’IgGI peut correspondre à n’importe quel variant allotypique par exemple G1 m3 ou nG1 m17. A titre d’exemple, le fragment Fc d’IgGI est représenté par SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25(Fc+Qtag) ou SEQ ID NO : 26 (Fc+Qtag bis).
[00044] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit fragment Fc est de type sauvage ou muté. La ou les mutations peuvent viser à augmenter la demi-vie plasmatique, la diminuer, modifier les fonctions effectrices du fragment Fc. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, ledit fragment Fc muté comprend au moins les mutations suivantes :
- L234A et L235A (LALA), ou
- L234A, L235A et P329G (LALAPG), ou
- G236A, S239D et I332E (GASDIE), ou
- G236A, S239D, A330L et I332E (GASDALIE), ou
- S239D, H268F, S324T et I332E (SDHFSTIE ou SDH), la numérotation étant indiquée dans la séquence d’une lgG1 humaine selon l’index EU. De telles mutations sont notamment décrites dans l’article Bruhns and Jonsson, Immunol Rev. 2015 Nov;268(1 ):25-51. De préférence, lorsque la molécule hybride est utilisée en thérapie, ledit fragment Fc muté comprend au moins les mutations GASDIE, GASDALIE, ou SDH. [00045] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit fragment Fc présente un taux de fucosylation compris entre 0% à 100% des formes glycosylées. Selon l’invention « entre 0% et 100% » représente toutes les valeurs entières comprises entre 0 et 100, i.e ; 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,
81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 et 100%. Une faible fucosylation du fragment Fc provoque une forte réponse ADCC. C’est pourquoi selon un mode de réalisation particulier, ledit fragment Fc présente un taux de fucosylation compris entre 0% à 60% des formes glycosylées, notamment 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 0%. Selon l’invention, le taux de fucosylation est défini comme la proportion moyenne de fucose portée par le fragment Fc, par rapport à la quantité maximale de fucose que peut porter un fragment Fc.
[00046] Le fragment Fc et le peptide ont chacun des extrémités N- et C-terminale. Le fragment Fc peut donc être lié via son extrémité N- ou C-terminale à l’extrémité N- ou C-terminale du peptide. Selon un mode de réalisation préféré, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ladite liaison covalente se situe entre l’extrémité C-terminale dudit fragment Fc et l’extrémité N-terminale dudit peptide, ou entre l’extrémité N-terminale dudit fragment Fc et l’extrémité N-terminale dudit peptide. Selon un mode de réalisation, lorsqu’un espaceur est présent, l’espaceur peut être lié au fragment Fc via son extrémité N- ou C-terminale. Selon un autre mode de réalisation, lorsque deux espaceurs sont présents, le premier espaceur peut être lié au fragment Fc via son extrémité N- ou C-terminale et le deuxième espaceur peut être lié au peptide via son extrémité N- ou C-terminale, notamment N- terminale. Alternativement, ladite liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide (éventuellement en présence d’un ou plusieurs espaceurs) peut être créée sur tout ou partie du fragment Fc. Selon l’invention « tout ou partie du fragment Fc » signifie que différents acides aminés constituant le fragment Fc peuvent être impliqués dans une liaison covalente avec ledit peptide.
[00047] Selon un mode de réalisation préféré, lorsqu’au moins un espaceur est présent dans ladite molécule hybride de l’invention, celui-ci permet de lier le fragment Fc à un azoture ou à un alcyne qui sera lui-même impliqué dans la liaison covalente avec ledit peptide. Selon un mode de réalisation, lorsqu’au moins un espaceur est présent dans ladite molécule hybride de l’invention, celui-ci peut également permettre de lier le peptide à un alcyne ou à un azoture qui sera lui-même impliqué dans la liaison covalente avec le fragment Fc. Selon un mode de réalisation préféré, la molécule hybride selon l’invention comprend au moins deux espaceurs : un premier espaceur qui permet de lier le fragment Fc à un azoture ou à un alcyne et un deuxième espaceur qui permet de lier le peptide à un azoture (lorsque le fragment Fc est lié à un alcyne) ou à un alcyne (lorsque le fragment Fc est lié à un azoture).
[00048] Selon un mode de réalisation selon l’invention, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit fragment Fc : - est couplé à au moins un azoture ou à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, ou
- est lié à au moins un espaceur qui est lui-même couplé à un azoture ou à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est :
- soit couplé à un azoture ou à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO,
- soit lié à un espaceur qui est lui-même couplé à un azoture ou à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, la liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide, éventuellement en présence d’un ou plusieurs espaceurs, étant créée entre l’azoture et l’alcyne.
[00049] Selon un mode de réalisation selon l’invention, dans ladite molécule hybride selon l’invention,
- le fragment Fc est couplé à au moins un azoture et ledit peptide est couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est couplé à un azoture, la liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide étant créée entre l’azoture et l’alcyne.
[00050] Selon un mode de réalisation selon l’invention, dans ladite molécule hybride selon l’invention :
- le fragment Fc est couplé à au moins un azoture et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un azoture ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un azoture, et ledit peptide est couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est couplé à un azoture ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un azoture, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un azoture, la liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide, en présence d’un ou plusieurs espaceurs, étant créée entre l’azoture et l’alcyne.
[00051] Selon l’invention, la création de la liaison covalente entre l’azoture et l’alcyne correspond à une étape dite de « chimie-click », la partie N3 de l’azoture réagissant avec un alcyne. L’azoture s’entend des sels de l'acide azothydrique HN3, ou des azotures organiques dans lesquels un des atomes d'azote est lié de façon covalente avec un atome de carbone d'un composé organique (par exemple l’azoture de méthyle CH3N3). Préférentiellement l’azoture est représenté par la formule N3. L’alcyne s’entend des molécules ayant pour formule générale CnH2n-2, et qui sont caractérisées par la présence d’au moins une triple liaison. Préférentiellement l’alcyne est un cyclooctyne, encore plus préférentiellement le dibenzocyclooctyne (DBCO).
[00052] Le fragment Fc, ledit peptide et éventuellement le(s)dit(s) espaceur(s), sont couplés à l’alcyne ou à l’azoture par toute technique de couplage moléculaire classiquement utilisée (telle qu’une conjugaison). Toute technique peut également être utilisée pour lier de façon covalente le fragment Fc à l’espaceur et/ou le peptide à l’espaceur.
[00053] Plus particulièrement, une technique de conjugaison s’entend d’une conjugaison enzymatique ou d’une conjugaison chimique. Une conjugaison enzymatique s’entend par exemple d’une conjugaison à l’aide d’une transglutaminase qui catalyse la formation de liaisons covalentes entre des groupes amines libres et des résidus de glutamine ou de lysine ou encore à l’aide d’une transpeptidase telle que la sortase. Pour de plus amples informations concernant la conjugaison enzymatique, voir par exemple la demande de brevet US20160361434 ou US20170313787, ou encore la publication Ohtsuka et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume 64, 2000 - Issue 12, Comparison of Substrate Specificities of Transglutaminases Using Synthetic Peptides as Acyl donors. Le substrat de la transglutaminase est par exemple un peptide comportant un résidu glutamyl (un Qtag), tel que représenté par SEQ ID NO : 27 (LLQG). Une conjugaison chimique s’entend par exemple d’une liaison covalente entre une cystéine isolée ou participant à un pont disulfure après réduction de celui-ci et par exemple un maléimide. Un exemple d’une telle conjugaison est représenté en Figure 4. Dans cet exemple, le fragment Fc comprend un peptide Qtag et ledit fragment Fc est lié à un espaceur (lui-même couplé à un azoture), grâce à l’action de la transglutaminase qui va créer une liaison covalente entre le résidu glutamyl du Qtag et le groupe NH2 porté par l’espaceur PEGn.
[00054] Selon l’invention, le terme « couplé » ou « couplage moléculaire » s’entend de l’établissement d’une liaison covalente, ainsi le fragment Fc et/ou le peptide et/ou l’espaceur est lié de façon covalente à un alcyne ou un azoture. Le terme « lié » s’entend également d’une liaison covalente. Ainsi, à titre d’exemple, l’expression « le fragment Fc est couplé à un azoture et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un alcycne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO » peut également se lire « le fragment Fc est lié de façon covalente à un azoture et ledit peptide est lié de façon covalente à un espaceur, ledit espaceur étant lui-même lié de façon covalente à un alcycne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ».
[00055] Utilisation des molécules hybrides selon l’invention
[00056] Dans un second aspect, la présente invention concerne également une molécule hybride telle que définie précédemment, pour son utilisation comme médicament. [00057] Plus particulièrement, selon l’invention, lesdites molécules hybrides sont destinées à cibler et à lyser dans l’organisme des patients, par ADCC et/ou phagocytose et/ou activation du complément, toutes les cellules exprimant des récepteurs lymphocytaires auto-réactifs dans le cadre d’une vascularite auto-immune : à savoir les cellules B (lymphocytes) exprimant à leur surface les BCR reconnaissant au moins un des peptides de l’invention (auto-anticorps responsables d’une vascularite auto-immune, se liant à au moins un peptide selon l’invention) et les lymphocytes T exprimant à leur surface les TCR reconnaissant au moins un des peptides selon l’invention. En effet, la molécule hybride selon l’invention se lie à ces cellules grâce au peptide : il s’agit de la cible épitopique dudit récepteur lymphocytaire auto-réactif. La molécule hybride selon l’invention se lie aussi aux cellules permettant de détruire les lymphocytes B et/ou T exprimant à leur surface les récepteurs lymphocytaires auto-réactifs impliqués dans une vascularite auto-immune grâce à son fragment Fc, ligand naturel des récepteurs Fc (par exemple Fc-gamma récepteur (FcyR) si le fragment Fc est issu d’une IgG), présents notamment à la surface des macrophages mais aussi des cellules NK (“Natural Killers”).
[00058] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride, telle que définie précédemment, pour son utilisation dans le traitement d’une vascularite auto-immune, en particulier la granulomatose avec polyangéite, la granulomatose éosinophilique avec polyangéite et la micropolyangéite. Selon un mode de réalisation préféré, l’invention concerne une molécule hybride, telle que définie précédemment, pour son utilisation dans le traitement d’une granulomatose avec polyangéite.
[00059] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO : 51 , pour son utilisation dans le traitement d’une vascularite auto-immune, de préférence la granulomatose avec polyangéite.
[00060] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51 , SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO : 55, pour son utilisation dans le traitement d’une vascularite auto-immune.
[00061] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO : 55, pour son utilisation dans le traitement d’une vascularite auto-immune. Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO : 55, pour son utilisation dans le traitement d’une granulomatose avec polyangéite (parfois appelée maladie de Wegener), d’une granulomatose éosinophilique avec polyangéite (parfois appelée syndrome de Churg et Strauss) ou d’une micropolyangéite.
[00062] Selon un mode de réalisation, l’invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[00063] Selon l’invention « un véhicule pharmaceutiquement acceptable » s’entend de toute formulation rendant la composition apte à être administrée à un patient, sous n’importe quelle forme galénique.
[00064] La présente invention concerne également une méthode de traitement d’une vascularite auto-immune, en particulier la granulomatose avec polyangéite, comprenant l’administration d’une quantité thérapeutiquement efficace d’une molécule hybride selon l’invention.
[00065] L’invention concerne également l’utilisation d’une molécule hybride selon l’invention pour la préparation d’un médicament destiné au traitement d’une vascularite auto-immune, en particulier la granulomatose avec polyangéite.
[00066] Selon un autre mode de réalisation, la molécule hybride selon l’invention peut être couplée à au moins un radioisotope ou à au moins un fluorochrome, tels que A488 ou A647. De telles molécules peuvent avantageusement être utilisées comme outils moléculaires traceurs.
[00067] Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne ainsi l’utilisation in vitro ou ex vivo d’une molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d’anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, au moins un espaceur étant optionnellement présent entre ledit fragment Fc et ledit peptide, comme outil moléculaire. De telles constructions peuvent notamment être utilisées pour analyser la fixation des molécules hybrides aux auto-anticorps et aux récepteurs Fc des macrophages et des cellules NK, ainsi que pour analyser la réactivité des macrophages et des cellules NK à la fixation des hybrides suivie du pontage de ceux-ci par les auto-anticorps.... Les radioisotopes et/ou fluorochromes sont de préférence couplés sur le fragment Fc, encore plus particulièrement au niveau du Qtag (si présent) ou au niveau des lysines.
[00068] Procédé de production des molécules hybrides selon l’invention
[00069] Dans un autre aspect, l’invention concerne également un procédé permettant d’obtenir une molécule hybride telle que définie précédemment.
[00070] Selon un mode de réalisation, l’invention concerne ainsi un procédé de production d’une molécule hybride telle que définie précédemment, comprenant les étapes suivantes :
- (i) obtention d’un azoture couplé à un fragment Fc ou obtention d’un alcyne couplé à un fragment Fc,
- (ii) obtention d’un alcyne couplé à un peptide ou obtention d’un azoture couplé à un peptide,
- (iii) réalisation de la liaison covalente entre l’azoture et l’alcyne,
- l’étape (i) pouvant être réalisée avant ou après l’étape (ii), ou bien de façon concomitante.
[00071] Selon un mode de réalisation, l’invention concerne ainsi un procédé de production d’une molécule hybride telle que définie précédemment, comprenant les étapes suivantes :
- (i) couplage d’au moins un azoture et d’un fragment Fc, éventuellement en présence d’au moins un espaceur, ou couplage d’au moins un alcyne et d’au moins un fragment Fc, éventuellement en présence d’un espaceur,
- (ii) couplage d’un alcyne et d’un peptide, éventuellement en présence d’un espaceur, ou couplage d’un azoture et d’un peptide, éventuellement en présence d’un espaceur,
- (iii) réalisation de la liaison covalente entre l’azoture et l’alcyne,
- l’étape (i) pouvant être réalisée avant ou après l’étape (ii), ou bien de façon concomitante.
[00072] Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne ainsi un procédé de production d’une molécule hybride telle que définie précédemment, comprenant les étapes suivantes :
- (i) couplage d’au moins un azoture sur chaque monomère du fragment Fc, éventuellement en présence d’au moins un espaceur, ou couplage d’au moins un alcyne sur chaque monomère du fragment Fc, éventuellement en présence d’un espaceur,
- (ii) couplage d’un alcyne et d’un peptide, éventuellement en présence d’un espaceur, ou couplage d’un azoture et d’un peptide, éventuellement en présence d’un espaceur,
- (iii) réalisation de la ou les liaison(s) covalente(s) entre l’azoture et l’alcyne,
- l’étape (i) pouvant être réalisée avant ou après l’étape (ii), ou bien de façon concomitante.
[00073] Selon un mode de réalisation, les molécules hybrides selon l’invention peuvent également être obtenues par des méthodes de bioproduction et codées par un ADN recombinant codant le peptide selon l’invention et le fragment Fc, ledit peptide et ledit fragment Fc étant optionnellement séparés par un linker polypeptidique. Dans un tel cas, le peptide de la molécule hybride est non- modifié (e.g. non cyclisé, non rétro, non rétro-inverso), et peut-être orienté N-terminal ou C-terminal. Le peptide peut être en C-terminal ou en N-terminal du fragment Fc, l’ADNc incluant sa séquence codante nucléotidique en amont ou en aval de l’ADNc du Fc.
[00074] Les séquences de l’invention sont représentées dans le Tableau 1 ci-après.
[00075] [Tableau 1]
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
;00076] [Tableau 1]. Tableau récapitulatif des séquences de l’invention
[00077] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées et des exemples qui illustrent l’invention et ne visent en aucun cas à la limiter.
Brève description des Figures
Fig. 1
[00078] [Fig. 1] représente le schéma d’un exemple de molécule hybride selon l’invention.
[00079] Un espaceur (qui est optionnel) est représenté entre le fragment Fc d’anticorps et le peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune (dénommé « peptide selon l’invention »).
Fig. 2
[00080] [Fig. 2] représente un lymphocyte B exprimant à sa surface des BCR/auto-anticorps transmembranaires liés à une molécule hybride selon l’invention, ladite molécule hybride étant elle- même liée par le fragment Fc à une cellule NK.
[00081] La cellule NK va ainsi pouvoir détruire le lymphocyte B par ADCC. Plus spécifiquement, cette figure montre une cellule B (ou lymphocyte B) qui exprime à sa surface un BCR (l’auto-anticorps ANCA) qui interagit spécifiquement avec le peptide selon l’invention porté par la molécule hybride. L’engagement du fragment Fc porté par la même molécule hybride au FcyRIIIa (CD16a) exprimé à la surface d’une cellule NK va activer l’ADCC et induire la destruction spécifique du lymphocyte B « ANCA positif » (qui exprime un ANCA). (ADCC, Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity; BCR, B- Cell Receptor; FcyR, Fc-gamma Receptor; NK cell, Natural Killer cell).
[00082] Nb : une représentation similaire pourrait être réalisée en remplaçant le lymphocyte B par un lymphocyte T, et le BCR par un TCR (T-Cell Receptor).
Fig. 3
[00083] [Fig. 3] représente un lymphocyte B exprimant à sa surface des BCR transmembranaires liés à une molécule hybride selon l’invention, ladite molécule hybride étant elle-même liée par le fragment Fc à un macrophage. [00084] Le macrophage va ainsi pouvoir détruire le lymphocyte B par phagocytose. Plus spécifiquement, cette Figure montre des cellules B (ou lymphocytes B) qui expriment à leur surface un BCR (l’auto-anticorps ANCA) et qui interagissent spécifiquement avec des peptides selon l’invention portés par les molécules hybrides. L’engagement des fragments Fc portés par ces mêmes molécules hybrides à différents FcyRs exprimés à la surface d’un macrophage va activer l’ADCP, c’est-à-dire la phagocytose, et induire la destruction spécifique des lymphocytes B « ANCA positifs ». (ADCP, Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis; BCR, B-Cell Receptor; FcyR, Fc-gamma Receptor).
[00085] Nb : une représentation similaire pourrait être réalisée en remplaçant le lymphocyte B par un lymphocyte T, et le BCR par un TCR (T-Cell Receptor).
Fig. 4
[00086] [Fig. 4] représente un procédé de fabrication d’une molécule hybride selon l’invention, comprenant le schéma de dérivation et de conjugaison des fragments Fc.
Fig. 5
[00087] [Fig. 5] représente la réactivité des sérums de patients atteints de micropolyangéite en présence de peptides. La réactivité des sérums en présence du peptide 80 est présentée en Figure 5A, la réactivité des sérums en présence du peptide 81 est présentée en Figure 5B, la réactivité des sérums en présence du peptide 82 est présentée en Figures 5C et 5H, la réactivité des sérums en présence du peptide 83 est présentée en Figure 5D, la réactivité des sérums en présence du peptide 84 est présentée en Figures 5E et 5I, la réactivité des sérums en présence du peptide 85 est présentée en Figure 5F, et la réactivité des sérums en présence du peptide 86 est présentée en Figure 5G. Sur les graphes, l’ordonnée représente la DO mesurée à 450 nm et l’abscisse représente le sérum testé. Le sérum est dilué au 1/25.
Fig. 6
[00088] [Fig. 6] représente la réactivité des sérums de patients atteints de la maladie de Wegener en présence de peptides. La réactivité des sérums en présence du peptide 80 est présentée en Figure 6A, la réactivité des sérums en présence du peptide 81 est présentée en Figure 6B, la réactivité des sérums en présence du peptide 82 est présentée en Figure 6C, la réactivité des sérums en présence du peptide 83 est présentée en Figure 6D, la réactivité des sérums en présence du peptide 84 est présentée en Figure 6E, la réactivité des sérums en présence du peptide 85 est présentée en Figures 6F et 6H, et la réactivité des sérums en présence du peptide 86 est présentée en Figure 6G. Sur les graphes, l’ordonnée représente la DO mesurée à 450 nm et l’abscisse représente le sérum testé. Le sérum est dilué au 1/25.
Fig. 7
[00089] [Fig. 7] représente la réactivité des sérums de patients atteints du syndrome de Churg et Strauss en présence de peptides. La réactivité des sérums en présence du peptide 80 est présentée en Figure 7A, la réactivité des sérums en présence du peptide 81 est présentée en Figure 7B, la réactivité des sérums en présence du peptide 82 est présentée en Figure 7C, la réactivité des sérums en présence du peptide 83 est présentée en Figure 7D, la réactivité des sérums en présence du peptide 84 est présentée en Figure 7E, la réactivité des sérums en présence du peptide 85 est présentée en Figure 7F, et la réactivité des sérums en présence du peptide 86 est présentée en Figure 7G. Sur les graphes, l’ordonnée représente la DO mesurée à 450 nm et l’abscisse représente le sérum testé. Le sérum est dilué au 1/25.
Fig. 8
[00090] [Fig. 8] représente la réactivité des sérums de patients sains en présence de peptides. La réactivité du sérum HD6 en présence des peptides 80-86 est présentée en Figure 8A, la réactivité du sérum HD7 en présence des peptides 80-86 est présentée en Figure 8B, la réactivité du sérum HD8 en présence des peptides 80-86 est présentée en Figure 8C, la réactivité du sérum HD9 en présence des peptides 80-86 est présentée en Figure 8D, et la réactivité du sérum HD10 en présence des peptides 80-86 est présentée en Figure 8E. Sur les graphes, l’ordonnée représente la DO mesurée à 450 nm et l’abscisse représente le peptide testé. Le sérum est dilué au 1/25.
[00091] Exemples
[00092] Exemple 1 : Exemple de production d’une molécule hybride selon l’invention
[00093] La molécule hybride ici décrite comprend la construction suivante : un fragment Fc lié de façon covalente à au moins un espaceur PEGn, lui-même couplé à un azoture, ledit azoture étant lié de façon covalente à un alcyne, qui est lui-même couplé à un espaceur PEGn lié à un peptide selon l’invention. Une telle molécule peut se lire : Fc-PEGn-Ns-DBCO-PEGn-peptide. Les deux PEGn peuvent être identiques ou bien différents (par exemple le premier PEGn est PEG3 et le deuxième PEGn est PEG2).
[00094] 1. Synthèse d’un NH2-PEGn-N3 (i.e. un espaceur couplé à un azoture à une extrémité et possédant une fonction amine libre à une autre extrémité).
[00095] 2. Mise en présence du NFL-PEGn-Ns, avec un fragment Fc possédant un Qtag, et une transglutaminase, de préférence pendant 16h à 37°C. Cette étape dite « de dérivation » est par exemple réalisée avec 20 fois plus de moles de NFL-PEGn-Ns que de moles de fragment Fc. La transglutaminase est utilisée, par exemple à hauteur de 15U/pmol par Qtag présent (sur un ou sur les deux monomères). Eventuellement un dessalage peut être réalisé pour retirer l’excédent d’espaceur non lié au fragment Fc à l’issue de l’étape. Un Fc-PEGn-Ns est ainsi obtenu. Si le fragment Fc comporte 2Qtag (un porté sur chaque monomère), alors le fragment Fc peut porter deux PEGn-N3.
[00096] 3. Synthèse d’un Cys-PEGn-peptide (i.e. un espaceur lié à un peptide à une extrémité et possédant une cystéine libre à une autre extrémité). Un alcyne, par exemple un DBCO est ensuite couplé au Cys-PEGn-peptide au niveau de la cystéine, et un DBCO-PEGn-peptide est ainsi obtenu. [00097] 4. Réalisation du « click » : couplage entre le N3 et le DBCO. Le DBCO-PEGn-peptide est mis en présence du Fc-PEGn-Ns avec, de préférence, 10 fois plus de moles de DBCO-PEGn-peptide que de moles de Fc-PEGn-Ns. La réaction du click se déroule notamment à température ambiante et est presque complète au bout de 4h.
[00098] 5. Obtention de la molécule hybride : Fc-PEGn-Ns-DBCO-PEGn-peptide. Ce mode de réalisation est illustré en Figure 4.
[00099] De façon similaire un Fc-PEGn-DBCO et un Ns-PEGn-peptide peuvent être obtenus, puis couplés pour obtenir Fc-PEGn-DBCO-Ns-PEGn-peptide.
[000100] De façon similaire un Fc-PEGn-DBCO et un Ns-peptide peuvent être obtenus, ou un Fc- PEGn-Ns et un DBCO-peptide, puis couplés pour obtenir respectivement Fc-PEGn-DBCO-Ns- peptide ou Fc-PEGn-Ns-DBCO-peptide.
[000101] Exemple 2 : Réactivité de sérums de patients atteints de vascularites auto-immunes vis-à-vis des molécules hybrides selon l’invention
[000102] Les sérums utilisés sont des sérums de patients atteints de vascularite auto-immune, plus particulièrement de granulomatose avec polyangéite, qui contiennent des auto-anticorps spécifiques.
[000103] Des puits de plaque de microtitration ELISA ont été revêtus par adsorption passive à l’aide de 100 pL d’une solution contenant soit un peptide choisi parmi SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO : 51 , soit une molécule hybride selon l’invention, dont le fragment Fc est sauvage (WT) ou le fragment Fc comprend la mutation GASDIE. Une telle molécule hybride est par exemple « FcWT-PEG-SEQ ID NO : 1-23/31-51 », « FcLALAPG-PEG-SEQ ID NO : 1-23/31-51 » ou « FcGASDIE-PEG-SEQ ID NO : 1-23/31-51 ». « FcWT-PEG-SEQ ID NO : 1-23/31-51 » représente un fragment Fc de type sauvage qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui- même lié à un peptide représenté par l’une quelconque des SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 23 ou SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 51 , « FcWT-LALAPG-SEQ ID NO : 1-23/31-51 » représente un fragment Fc comprenant les mutations L234A, L235A et P329G qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui-même lié à un peptide représenté par l’une quelconque des SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 23 ou SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 51 , et « FcGASDIE-PEG-SEQ ID NO : 1-23/31-51 » représente un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui-même lié à un peptide représenté par l’une quelconque des SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 23 ou SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 51. Dans les constructions, n représente un nombre entre 1 et 10 lorsqu’un espaceur PEGn est utilisé, de préférence 1 , 2, 3, 4 ou 8.
[000104] Ces solutions ont été utilisées chacune à la concentration de 5 pg/mL en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) et incubées pendant une nuit à 4°C. Les peptides choisis et les molécules hybrides construites avec lesdits peptides synthétisés en séquence aléatoire (scramble) ont été utilisés à la même concentration comme contrôles négatifs. Après lavage en PBS Tween 0.05% les puits ont ensuite été saturés par du lait à 5%, pendant 1 h à température ambiante. Après lavages, les sérums ont été incubés en dilution sérielle en tampon PBS + lait 5% pendant 1 h à température ambiante. Après lavages, la réactivité des sérums a été détectée à l’aide d’un anticorps de détection anti-Fab d’IgG humaines couplé HRP dilué au 1/2500 en tampon PBS 5% lait incubé également 1 h à température ambiante. Après lavage, la présence d’auto-anticorps reconnus par la molécule hybride est révélée par ajout de TMB et arrêt de la réaction enzymatique par ajout d’H2SO4 et une lecture au spectrophotomètre à 450nm.
[000105] Les résultats sont exprimés en A DO (Delta-Densité Optique), correspondant à la DO obtenue avec un hybride peptide scramble ou avec la molécule hybride construite avec ledit peptide.
[000106] Les résultats montrent une réactivité dose-dépendante des sérums sur les peptides vis-à- vis des molécules hybrides. Ils montrent qu’inclus dans les différents hybrides, les peptides restent parfaitement réactifs aux sérums comprenant les auto-anticorps.
[0001071 Exemple 3 : Cinétique de fixation des molécules hybrides sur macrophages, à température physiologique
[000108] Des macrophages humains, différenciés in vitro en présence de M-CSF (100 ng/mL) à partir de monocytes CD14+ isolés du sang périphérique d’un sujet sain ont été incubés à 500.000 cellules/puits, en présence de molécules hybrides à 5 pg/MI. Les molécules hybrides sont par exemple celles décrites dans [Exemple 2.
[000109] Les molécules hybrides sont incubées pendant 2h, 8h 16h, 24h et 48h à 37°C. La fixation des molécules hybrides à la surface des macrophages est mise en évidence et quantifiée par cytofluorimétrie (FACS Canto II) après incubation des macrophages avec un anticorps anti-Fc couplé au FITC, utilisé 1/1000.
[000110] « NM » et « ANTI FC » représentent respectivement le puits contenant les macrophages incubés sans anticorps ou avec l’anticorps anti-Fc seul. « Wt », « LALAPG » et « GASDIE » représentent respectivement le puits contenant la molécule hybride avec le fragment Fc sauvage ou avec la mutation LALAPG ou avec la mutation GASDIE.
[000111] Les résultats montrent que les molécules hybrides à la température physiologique de 37°C, se fixent à la membrane des macrophages. Ces résultats montrent également que la fixation de l’hybride comprenant un fragment Fc comprenant la mutation GASDIE est supérieure à celle de la forme sauvage. r000112l Exemple 4 : Phagocytose induite par l’hybride Fc-WT ou l’hybride Fc-GASDIE lorsqu’on arme les lymphocytes B via leurs FcyRIIb (CD32b) en présence des sérums
[000113] Des lymphocytes B humains fraîchement purifiés à partir de sang périphérique de donneurs sains par tri magnétique CD19+, ont été marqués au PKH-67 vert (Paul Karl Horan / marqueur lipidique fluorescent) puis incubés avec des sérums de patients atteints de vascularite auto-immune à une concentration de 5 pg/mL durant 30min à 37°C. Par la suite, les cellules ont été lavées puis mises en présence de l’hybride selon l’invention comprenant un fragment Fc sauvage (Wt) ou comprenant les mutations GASDIE. Les molécules hybrides sont par exemple celles décrites dans l’Exemple 2. Les cellules ont été mises en présence des hybrides à 10 pg/mL durant 30 min à 37°C. Après lavage, les cellules ont été mises au contact ées macrophages (marqués PKH-26 rouge), à raison de 1 lymphocyte B pour 1 macrophage, durant 2h à 37°C. Les cellules ont ensuite été décollées puis analysées par cytométrie en flux. Les cellules présentant la double fluorescence (PKH-67 vert/PKH-26 rouge) correspondent aux macrophages qui ont phagocyté des lymphocytes. Les différentes populations cellulaires sont exprimées en pourcentage de la population cellulaire totale : pourcentage de phagocytose et pourcentage de lymphocytes B.
[000114] Les résultats obtenus confirment que l’activité de phagocytose est majorée en présence des hybrides (augmentation de la phagocytose associée à une diminution de la population de lymphocytes B). En effet, une augmentation significative du pourcentage de phagocytose, toujours associée à une diminution significative de la population de lymphocytes B, a été observée lorsque les lymphocytes B étaient recouverts de l’hybride.
[000115] Exemple 5 : Stabilité de la fixation des Fc-GASDIE A488 et des hybrides Fc-GASDIE peptide, sur des cellules NK après 30min, 24h et 48h, à température physiologique
[000116] Les cellules NK ont été incubées 30min, 24h ou 48h à 37°C en présence de FcGASDIE- N3-DBCO-A488 (un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un DBCO, la molécule étant marquée avec le fluorochrome A488) ou de FcGASDIE-N3-DBCO-PEG3-peptide- lysineA488 (un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un DBCO qui est couplé à espaceur PEGn lié à un peptide selon l’invention (représentée par l’une quelconque des SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 23 ou SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 51 ) la molécule étant marquée avec le fluorochrome A488 qui est liée à la molécule via une lysine). La fixation de ces 2 sondes fluorescentes aux cellules NK a été analysée par cytofluorimétrie. Dans les constructions, n représente un nombre entre 1 et 10 lorsqu’un espaceur PEGn est utilisé, de préférence 1 , 2, 3, 4 ou 8.
[000117] Les résultats sont présentés à 30 minutes, à 24 heures et à 48 heures suivants. NM représente les cellules NK non marquées, sans anticorps.
[000118] Exemple 6 : Réactivité des sérums avec des peptides selon l’invention
[000119] Les peptides ici utilisés sont les peptides de SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 55 et SEQ ID NO : 7, tels qu’indiqués dans dans le Tableau 1 ci-dessus.
[000120] Le peptide représenté par SEQ ID NO : 52 correspond au peptide nommé peptide 80 dans les exemples. Le peptide représenté par SEQ ID NO : 53 correspond au peptide nommé peptide 81 dans les exemples. Le peptide représenté par SEQ ID NO : 54 correspond au peptide nommé peptide 82 dans les exemples. Le peptide représenté par SEQ ID NO : 2 correspond au peptide nommé peptide 83 dans les exemples. Le peptide représenté par SEQ ID NO : 31 correspond au peptide nommé peptide 84 dans les exemples. Le peptide représenté par SEQ ID NO : 55 correspond au peptide nommé peptide 85 dans les exemples. Le peptide représenté par SEQ ID NO : 7 correspond au peptide nommé peptide 86 dans les exemples.
[000121] Les peptides ont été synthétisés et leur réactivité a été testée avec le sérum de différents patients.
[000122] Les sérums ici utilisés sont indiqués dans le Tableau 2 ci-dessous.
[000123] [Tableau 2]
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
00124] [Tableau 2]. Sérums testés
[000125] Des puits de plaque de microtitration ELISA ont été revêtus par adsorption passive à l’aide de 100 pL d’une solution contenant un peptide représenté par SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 55 ou SEQ ID NO : 7.
[000126] Ces solutions ont été utilisées chacune à la concentration de 10 pg/mL en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) et incubées pendant une nuit à 4°C. Le lendemain les puits ont été saturés par un tampon de blocage avec 200 pg/mL par puit pendant 1 h à température ambiante. Après lavages, les sérums ont été incubés, dilués au 1/25ème avec un tampon comprenant du PBS. Ils ont été incubés à 100 pg/mL par puit pendant 2h30 à 4°C, sous agitation orbitale. Après lavages, la réactivité des sérums a été détectée à l’aide d’un anticorps de détection anti-Fc d’IgG humaines couplé à l’HRP, dilué 1/5000 en tampon PBS-2% BSA, et incubé également 1 h à 4°C sous agitation orbitale. Après lavage, la révélation est effectuée par ajout de TMB et arrêt de la réaction enzymatique par ajout d’acide sulfurique et une lecture au spectrophotomètre à 450 nm.
[000127] Les résultats expriment la densité optique (DO) obtenue avec chaque sérum et chaque peptide testé.
[000128] Le bruit de fond (background) a été obtenu en suivant le même protocole décrit ci-dessus mais sans la première étape de coating des peptides. Cela représente ainsi l’adhésion non spécifique des IgG présents dans le sérum des patients, cette valeur étant équivalente quelle que soit la pathologie.
[000129] La réactivité des peptides 80, 81 , 82, 83, 84, 85 et 86 avec les sérums des patients atteints de micropolyangéite (sérums 10, 24, 27, 29, 36 et 45) est présentée en Figure 5.
[000130] La réactivité des peptides 80, 81 , 82, 83, 84, 85 et 86 avec les sérums des patients atteints de la maladie de Wegener (sérums 2, 15, 18 et 36) est présentée en Figure 6.
[000131] La réactivité des peptides 80, 81 , 82, 83, 84, 85 et 86 avec les sérums des patients atteints du syndrome de Churg et Strauss (sérums 6, 38 et 79) est présentée en Figure 7. [000132] La réactivité des peptides 80, 81 , 82, 83, 84, 85 et 86 avec les sérums des patients sains (sérums HD6, HD7, HD8, HD9 et HD10) est présentée en Figure 8.
[000133] Les résultats confirment ainsi que les sérums de donneurs sains ne sont pas réactifs en présence des peptides testés. Au contraire, les sérums des patients atteints de micropolyangéite, de la maladie de Wegener ou du syndrome de Churg et Strauss réagissent en présence des peptides testés. Ces résultats illustrent ainsi que les peptides selon l’invention sont reconnus par les autoanticorps présents dans les sérums des patients atteints de micropolyangéite, de la maladie de Wegener ou du syndrome de Churg et Strauss.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d’anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une vascularite auto-immune, au moins un espaceur étant optionnellement présent entre ledit fragment Fc et ledit peptide.
[Revendication 2] Molécule hybride selon la revendication précédente, dans laquelle ledit peptide comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique de la protéinase 3, tout ou partie de la séquence polypeptidique de la myélopéroxidase et/ou tout ou partie de la séquence polypeptidique de la petite ribonucléoprotéine nucléaire SmD1.
[Revendication 3] Molécule hybride selon la revendication précédente, dans laquelle la séquence est d’origine humaine.
[Revendication 4] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit espaceur est un polymère contenant un ou plusieurs motifs de répétition contenant le groupe éther, ledit espaceur étant de préférence le polyéthylène glycol de formule PEGn, dans laquelle n représente un nombre entier compris entre 1 et 100, préférentiellement entre 1 et 10 et notamment 1 , 2, 3, 4 ou 8.
[Revendication 5] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51 , SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO : 55.
[Revendication 6] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit fragment Fc est un fragment Fc humain, notamment d’IgG, plus particulièrement d’IgG 1 .
[Revendication 7] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit fragment Fc est de type sauvage ou muté, ledit fragment Fc muté comprenant de préférence au moins les mutations suivantes :
- L234A et L235A, ou
- L234A, L235A et P329G, ou
- G236A, S239D et I332E, ou
- G236A, S239D, A330L et I332E, ou
- S239D, H268F, S324T et I332E, la numérotation étant indiquée dans la séquence d’une lgG1 humaine selon l’index EU.
[Revendication 8] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle :
- le fragment Fc est couplé à au moins un azoture et ledit peptide est couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est couplé à un azoture, ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un azoture et ledit peptide est lié à un espaceur lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est lié à un espaceur lui-même couplé à un azoture ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un azoture, et ledit peptide est couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est couplé à un azoture ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un azoture, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un azoture, la liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide, éventuellement en présence d’un ou plusieurs espaceurs, étant créée entre l’azoture et l’alcyne.
[Revendication 9] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation comme médicament, notamment pour son utilisation dans le traitement d’une vascularite auto-immune.
[Revendication 10] Molécule hybride pour son utilisation selon la revendication précédente, pour son utilisation dans le traitement d’une granulomatose avec polyangéite, d’une granulomatose éosinophilique avec polyangéite ou d’une micropolyangéite.
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