WO2024047073A1 - Toxin-bindemittel für die hämodialyse - Google Patents

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WO2024047073A1
WO2024047073A1 PCT/EP2023/073733 EP2023073733W WO2024047073A1 WO 2024047073 A1 WO2024047073 A1 WO 2024047073A1 EP 2023073733 W EP2023073733 W EP 2023073733W WO 2024047073 A1 WO2024047073 A1 WO 2024047073A1
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apoferritin
nanoparticles
toxin
amino acid
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PCT/EP2023/073733
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Tobias Beck
Hendrik Böhler
Joachim Jankowski
Setareh ORTH-ALAMPOUR
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Universität Hamburg
Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the invention relates to new toxin binding agents for hemodialysis.
  • the toxins bind to plasma proteins (e.g. serum albumin), which prevents efficient diffusion through the pores of the dialysis membranes [ 12, 13], which is why they are also referred to as protein-bound uremic toxins (PBUT).
  • plasma proteins e.g. serum albumin
  • PBUT protein-bound uremic toxins
  • Intravenous supplements are intended to displace the toxins from the binding sites of the plasma proteins and thus increase their soluble proportion that can be separated by dialysis. This can be achieved, for example, with ibuprofen ((A5)-2-(4-isobutylphenyl)propionic acid) [15], mesna (sodium 2-sulfanylethanesulfonate) [16] or acetylcysteine [17].
  • ibuprofen ((A5)-2-(4-isobutylphenyl)propionic acid) [15]
  • mesna sodium 2-sulfanylethanesulfonate
  • acetylcysteine acetylcysteine
  • Oral supplements such as the carbon-based AST-120 (Kremezin®) adsorb the toxins produced by microbial processes in the intestine before they are absorbed into the bloodstream [18] or inhibit the production of corresponding toxins, such as the synbiotic NatuREN G [19], in a systematic comparison of all studies on the reduction of protein-bound uremic toxins up to January 2, 2020 [20], the methods mentioned above showed a reduction rate for the toxins IS and pCS of up to 44% [18], however, significantly higher reduction rates between 71 and 78% were achieved with a combination of fractionated plasma separation, adsorption and dialysis ( FPAD) [20, 21], This shows that direct adsorption of protein-bound toxins is one of the most effective methods for toxin reduction in patients' plasma.
  • the disadvantage of this system is the complex plasma separation and filtration to separate the albumin from the remaining components of the blood, which must not come into contact with the adsorption materials [22], which makes routine use very expensive.
  • DE 10 2016 108 017 A1 describes charged protein containers for building nanostructured materials, the protein containers being formed from ferritin complexes, in the interior of which nanoparticles can be enclosed. Ferritin complexes containing such nanoparticles can also be used in dialysis to remove hydrophobic toxins. However, no corresponding experiments have been described.
  • WO 2004/001019 A1 describes nanoparticles that include protein cages, for example bacterial ferritin-like protein cages, which are loaded inside with at least one guest material, for example metals.
  • the object of the present invention is to provide an adsorbent for the separation of protein-bound uremic toxins, PBUTs, during dialysis, which has the highest possible affinity for PBUTs, but has sufficient bio- and hemocompatibility to come into direct contact with the blood to be brought.
  • the present invention provides, in a first aspect, an apoferritin nanoparticle for use as a toxin binder in hemodialysis, wherein the apoferritin nanoparticle comprises apoferritin subunits which, when assembled to form the apoferritin nanoparticle, form an internal cavity, and wherein the apoferritin nanoparticle does not contain any nanoparticles in its inner cavity.
  • apoferritin nanoparticles are well suited for use as adsorbents for toxins in the blood, for example for the separation of protein-bound uremic toxins (PBUTs).
  • PBUTs protein-bound uremic toxins
  • the apoferritin nanoparticles according to the invention have an internal cavity (hereinafter also referred to as a cavity) in which toxins can be bound and also have high biocompatibility and hemocompatibility.
  • toxins such as PBUTs or other toxins such as heavy metals
  • the protein shell of the apoferritin nanoparticles according to the invention has channels or pores through which small molecules such as PBUTs can enter the interior of the particle, while larger macromolecules such as protein or cells are retained.
  • the affinity of the ferritin nanoparticles according to the invention to the toxins to be bound can be specifically adjusted and optimized, for example by changing the amino acid sequence of at least one of the subunits in the area of the internal cavity, so that, for example, a suitable number of hydrophobic amino acid residues or a suitable mixture from hydrophobic and hydrophilic amino acid residues, or by functionalizing one or more amino acid residues with chemical groups.
  • the mass transport in the ferritin nanoparticles can be improved by increasing or changing the surface charge in the area of the pores, for example by selectively replacing sterically demanding or charged amino acids with smaller hydrophobic amino acids.
  • the inner surface and pore area of the nanoparticles can thus be altered by sequence modification or chemical functionalization to increase the affinity towards toxins and/or to facilitate the transport of toxins into the nanoparticles without compromising assembly or biocompatibility affect.
  • the protein cages can also be assembled into a well-defined crystalline material with evenly distributed solvent channels. This ensures a high level of purity of the material, makes it easier to handle and use as a sorption material, and is also helpful for material characterization.
  • Ftn is a globular protein complex (spheroprotein) that is made up of 24 protein subunits that form a hollow nanocage and that naturally binds iron.
  • the terms “apoferritin” or “apoferritin nanoparticles” refer to the protein complex that is not bound to iron.
  • the protein complex has an inner cavity of about 6-8 nm in diameter, while the outer diameter is about 12-13 nm (see for example [28], [29]).
  • Apoferritin can be composed of identical subunits, for example exclusively from the so-called heavy chain (H chain), or from varying proportions of a light (L chain) and a heavy chain (H chain).
  • the H chain (abbreviated hFTN-H, HFt or FTH) of human ferritin is encoded by the FTHl gene and is a naturally occurring protein of approximately 21 kDa and 183 amino acids (see UniProtKB No. P02794, 2007-01-23 v2 ; NCBI NP 002023.2).
  • the light L chain (abbreviated hFTN-L, LFt or FTL) of human ferritin is encoded by the FTL gene and is a naturally occurring protein of around 19.5 kDa and 175 amino acids (see UniProtKB No. P02792, 2007-01- 23 v2; NCBI NP_000137.2).
  • Both the light chain and the heavy chain have a tertiary structure with a bundle of four alpha helices (A, B, C and D), with the B and C helix having a non-helical loop consisting of 18 amino acids (BC loop) are connected to each other.
  • A, B, C and D alpha helices
  • B and C helix having a non-helical loop consisting of 18 amino acids (BC loop) are connected to each other.
  • E alpha helix
  • the N-terminus and the A and C helix lie on the outside of the ferritin, while the B and D helix face the inside of the ferritin.
  • Ferritin has channels or pores in its protein shell that connect the internal cavity with the external environment ([28]).
  • triple channels triple axis channels
  • quadruple channels fourfold channels, quadruple axis channels
  • An apoferritin nanoparticle composed of 24 subunits usually comprises 8 triple channels and 6 quadruple channels (see, for example, [28]).
  • human H-chain ferritin or “human heavy chain ferritin”, abbreviated HuHF, refer to a human ferritin whose subunits consist exclusively of the human heavy chain, and not of a mixture of a heavier (H-chain ) and lighter chain (L chain).
  • HuHF refers to a human ferritin whose subunits consist exclusively of the human heavy chain, and not of a mixture of a heavier (H-chain ) and lighter chain (L chain).
  • the term also includes variants with H chains whose amino acid sequence differs from the wild-type sequence of the H chain (see UniProtKB No. P02794, 2007-01-23 v2; NCBI NP_002023.2 for the amino acid sequence of the heavy chain of human ferritin). are modified.
  • toxin binder in relation to the apoferritin nanoparticles means that the apoferritin nanoparticles bind a toxin in their cavity, i.e. the inner cavity, so that it is bound to the apoferritin nanoparticle from, for example, a body fluid, for example blood , can be removed.
  • the bond between the toxin and the apoferritin nanoparticle is preferably noncovalent and can occur, for example, through hydrophobic interactions, electrostatic interactions or hydrogen bonds.
  • Possible toxins include, for example, protein-bound uremic toxins such as indoxyl sulfate (IS) and para-cresyl sulfate (pCS), organic heavy metal compounds, heavy metal ions and other chemical substances and compounds that have properties that allow binding, preferably via non-covalent binding. However, a covalent bond cannot be ruled out either.
  • protein-bound uremic toxins or “protein-bound uremic toxins,” PBUTs, refer to generally poorly water-soluble (hydrophobic) chemical compounds that are present bound to protein in serum.
  • IS indoxyl sulfate
  • p-cresyl sulfate also p-cres
  • Hemodialysis is an extracorporeal treatment of the blood in which metabolic waste products (e.g. urea, uric acid, creatinine, excess phosphate, etc.) and/or excess fluid are removed from the blood. Hemodialysis is used regularly when a person's kidneys no longer function adequately, for example in the case of chronic kidney disease (CKD).
  • CKD chronic kidney disease
  • the expression “for use in hemodialysis” includes use in the context of hemapharesis, in particular whole blood apharesis.
  • Hemapharesis is understood to be a procedure for the extracorporeal removal of certain blood components or pathogenic substances, microorganisms or the like from blood (see e.g. “Standard of Therapeutic Apheresis 2019, March 29, 2019, German Society for Nephrology).
  • chronic kidney disease refers to a chronic disease of the kidney that causes a gradual and long-term (>3 months) impairment of kidney function up to permanent or complete kidney failure Kidney failure includes (ICD-10 code N18).
  • the term refers here in particular to chronic kidney disease in stage 5 (ICD-10 code N18.5), in which a kidney replacement procedure is required to purify the blood with a glomerular filtration rate (GFR) of ⁇ 15 mL/min.
  • GFR glomerular filtration rate
  • chronic kidney disease may be used here synonymously with the term “chronic kidney disease”.
  • the expression according to which the apoferritin nanoparticle contains “no nanoparticles in its internal cavity” means that the internal cavity of the apoferritin nanoparticles is empty, i.e. does not include any separate nanoparticles that are designed, for example, to bind toxins.
  • the term “in the area of the internal cavity” in relation to an apoferritin subunit means here the part of the apoferritin subunit, in particular the amino acid residues of this apoferritin subunit, which is directed towards the internal cavity of the apoferritin nanoparticle.
  • these are mainly the B-helix (in the heavy chain of human apoferritin, amino acids 50-77), the D-helix (in the heavy chain of human apoferritin, amino acids 128-159), the E-helix (in the heavy chain of human apoferritin the amino acids 165-174) and the C-terminal region (175-183) following the E-helix towards the C-terminus.
  • the term “in the area of a triple channel” in relation to an apoferritin subunit means here the part of the apoferritin subunit, in particular the amino acid residues of this apoferritin subunit, which are located in an assembled apoferritin nanoparticle on a triple channel of the apoferritin nanoparticle, or Amino acid residues that have a direct influence on the transport of a toxin into the interior of the apoferritin nanoparticle, ie whose exchange leads to a facilitation of the toxin transport into the interior of the apoferritin nanoparticle.
  • ⁇ can be, for example, the amino acids at the end of the C helix and the beginning of the D helix (in the heavy chain of human apoferritin, for example, amino acids 118 to 141, preferably 120-140).
  • the term also includes amino acids on the outside of the apoferritin subunit.
  • “Facilitated toxin transport” means here that when incubated with a given toxin concentration under suitable conditions within a given period of time with a changed apoferritin in the area of the triple channel Compared to an apoferritin nanoparticle that has not been modified in the area of the triple channel, a larger number of toxin molecules enter the cavity.
  • the term “pore” may also be used here as a synonym.
  • a quadruple channel in relation to an apoferritin subunit means here the part of the apoferritin subunit, in particular the amino acid residues of this apoferritin subunit, which are located on a quadruple channel of the apoferritin nanoparticle.
  • the amino acids M 158, L 165, Y 168, L 169, H 173 in the area of the quadruple channel, for example, there are the amino acids M 158, L 165, Y 168, L 169, H 173 (see e.g. [41]).
  • the term includes amino acid residues of the respective subunit that are located in an assembled apoferritin nanoparticle at a quadruple channel of the apoferritin nanoparticle, for example in an assembled apoferritin nanoparticle that line the quadruple channel or are located at the openings of the channel, or amino acid residues that have an immediate have an influence on the shape, for example the diameter, or the physico-chemical properties of the channel.
  • redesigned apoferritin nanoparticle or “redesigned apoferritin subunit” are used herein in connection with an apoferritin nanoparticle or an apoferritin subunit with an amino acid sequence changed from the wild-type sequence.
  • the term includes an apoferritin nanoparticle or an apoferritin subunit with an altered amino acid sequence, in which part or all of the replaced amino acid residues are additionally functionalized with chemical groups.
  • the term “functionalized” means that an additional chemical moiety or connecting residue is covalently linked to a suitable amino acid residue, for example cysteine.
  • a suitable amino acid residue for example cysteine.
  • An example is a cysteine residue to which an N-phenylacetamide residue is bound via its thiol group (SH group).
  • organic compound residue refers to carbon-containing chemical side groups or molecules that are covalently linked, for example to a cysteine residue. It can be an aliphatic or aromatic compound residue, the terms here not being limited to pure hydrocarbon compounds, but also including heteroaliphatic or heteroaromatic compound residues, ie compound residues with heteroatoms such as nitrogen, oxygen, phosphorus or sulfur.
  • aromatic compound residue is understood to mean any compound residue that has an aromatic or heteroaromatic group.
  • aliphatic compound residue is understood to mean any aliphatic or heteroaliphatic compound residue, ie any organic compound residue that does not contain an aromatic group.
  • aliphatic compound residue includes cyclic or acyclic linear (straight chain) or branched, saturated or unsaturated carbon compound residues that are not aromatic residues.
  • heteroaliphatic residue refers to aliphatic residues in whose carbon skeleton one or more carbon atoms are replaced by heteroatoms, for example oxygen, sulfur, nitrogen or phosphorus.
  • aromatic compound residue refers to chemical groups with aromaticity, including multi-membered single ring aromatic groups and multicyclic systems with at least one aromatic ring.
  • aromatic compound residues include benzyl and phenyl.
  • Heteroaromatic compound residue also “heteroaryl” is understood to mean aromatic compound residues in whose carbon skeleton one or more carbon atoms are replaced by heteroatoms, for example oxygen, sulfur, nitrogen or phosphorus.
  • dialyzer refers to a replaceable blood purification unit of a dialysis system.
  • a dialyzer can, for example, be a hollow fiber membrane module, in which biocompatible semi-permeable polymer membranes in the form of hollow fibers are arranged in a housing, so that, for example, blood flows through the hollow fibers and a dialysate flows through the interior of the housing along the outer sides of the hollow fibers (for example in countercurrent to the Bloodstream) can flow, and preferably low molecular weight compounds such as salts, protein or nucleic acid fragments from the blood can diffuse across the membrane into the dialysate and thus be transported away.
  • Amino acids are indicated here in the form of their three-letter or one-letter code, where applicable.
  • a list of amino acids with their corresponding codes is presented in the following list:
  • the apoferritin nanoparticle for use as a toxin binder in hemodialysis can have an amino acid sequence in the area of the inner cavity that is changed compared to the wild-type sequence, for example have cysteine residues at positions where no cysteine residue is present in the wild-type sequence.
  • the cysteine residues can be further functionalized.
  • the apoferritin nanoparticle for use as a toxin binder in hemodialysis in the area of a triple channel or quadruple channel can have an amino acid sequence that is changed compared to the wild-type sequence, for example an amino acid exchange, which facilitates the transport of a toxin into the cavity of the apoferritin nanoparticle leads.
  • At least one of the apoferritin subunits of the apoferritin nanoparticle in the area of the inner cavity has an amino acid sequence that is changed compared to the wild-type sequence.
  • the at least one of the apoferritin subunits with a changed amino acid sequence is a subunit from the heavy chain, this is changed compared to the wild-type sequence of the heavy chain. If the at least one of the apoferritin subunits with a changed amino acid sequence is a subunit from the light chain, this is compared to the Wild-type light chain sequence changed.
  • the corresponding reference is the wild-type sequence of the respective human subunit (see UniProtKB No. P02794, 2007-01-23 v2 or NCBI NP_002023.2 for the heavy chain, UniProtKB No.
  • the wild-type sequence of the human heavy chain is also shown in the present application as a sequence with SEQ ID NO: 1
  • the wild-type sequence of the human light chain is also shown as a sequence with SEQ ID NO: 2, here, unlike the database mentioned above - Sequences the N-terminal methionine was omitted because it is not part of the sequence of the finished protein.
  • SEQ ID NO: 1 Human ferritin heavy chain. TTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES
  • SEQ ID NO: 2 Human ferritin light chain.
  • the at least one apoferritin subunit has an amino acid sequence that is changed compared to the wild-type sequence in the area of the cavity in its amino acid sequence changed compared to the wild-type sequence, that the apoferritin nanoparticle has a higher binding affinity towards a toxin compared to an apoferritin nanoparticle made of apoferritin subunits with an amino acid sequence that is unchanged compared to the wild-type sequence.
  • the change in the amino acid sequence in at least one of the apoferritin subunits in the area of the inner cavity is preferably designed in such a way that the binding affinity of an apoferritin nanoparticle with the at least one subunit whose amino acid sequence has changed compared to one from blood toxin to be removed is higher than with an apoferritin nanoparticle with subunits whose amino acid sequence is unchanged compared to the wild-type sequence.
  • the change may, for example, provide for an increase in the number of hydrophobic amino acid residues.
  • amino acids with a hydrophobic amino acid residue are alanine, valine, methionine, leucine, isoleucine, proline, tryptophan and phenylalanine.
  • amino acids with polar/neutral amino acid residues include tyrosine, threonine, glutamine, glycine, serine, cysteine and asparagine.
  • acidic amino acids are glutamic acid and aspartic acid.
  • basic amino acids are lysine or arginine.
  • PBUTs correspondingly modified apoferritin nanoparticles compared to unchanged apoferritin nanoparticles
  • the binding affinity towards toxins, for example PBUTs, of correspondingly modified apoferritin nanoparticles compared to unchanged apoferritin nanoparticles can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the at least one apoferritin subunit with an amino acid sequence that is changed compared to the wild-type sequence has in the area of the inner cavity at least one additional cysteine residue compared to the wild-type sequence or a cysteine residue on another Position in the sequence, whereby the at least one apoferritin subunit is changed compared to the wild-type sequence
  • Amino acid sequence is functionalized or can be functionalized by covalent binding of an organic compound residue, for example an aliphatic or aromatic compound residue, to the cysteine residue.
  • Functionalization preferably serves to increase the binding affinity of the apoferritin nanoparticle according to the invention towards toxins to be removed from the blood, for example protein-bound uremic toxins.
  • any cysteine residues naturally present in the area of the inner cavity are replaced by other amino acid residues, for example by alanine residues. This allows targeted positioning of the cysteine residues to be introduced and thus of the sites at which the apoferritin subunit according to the invention can be functionalized.
  • any cysteine residues present in the area of the inner cavity are preferably replaced by a different amino acid residue, for example an alanine residue, and at least one cysteine residue is introduced at one position in the area of the inner cavity , where no cysteine residue is present in the native protein.
  • the at least one apoferritin subunit with an amino acid sequence that is changed compared to the wild-type sequence in the apoferritin nanoparticle according to the invention for use as a toxin binder in hemodialysis has two, three or four cysteine residues in the area of the inner cavity compared to the wild-type sequence, to which respectively an organic compound residue is or can be bound covalently.
  • any cysteine residues of the native protein are preferably in the inner region Cavity is each replaced by, for example, alanine residues, and at least one of the introduced cysteine residues is introduced at a position at which no cysteine residue is present in the native protein.
  • the functionalization sites present in an apoferritin nanoparticle according to the invention can be functionalized identically or differently, that is, functionalized with the same or different chemical groups.
  • the organic compound residue can be a hydrophobic, hydrophilic or an amphiphilic compound residue.
  • Hydrophobic compound residues are preferred for binding, for example, hydrophobic uremic toxins.
  • it can also be advantageous to provide an amphiphilic connecting residue for the functionalization, or to functionalize different cysteine residues in the area of the inner cavity with different connecting residues, for example with a mixture of hydrophilic and hydrophobic connecting residues.
  • the adjustment of the hydrophobicity or hydrophilicity of a compound residue is known to those skilled in the art and can, if necessary, be determined by routine tests.
  • the hydrophobicity of a compound residue can be influenced by the size or length of a hydrocarbon residue, and the hydrophilicity can be influenced by the provision of polar or charged residues.
  • the organic compound residue can be, for example, an acetamidyl compound of the general structure -CH2-C(0)-NH-R.
  • the radical R can be an aliphatic, heteroaliphatic, aromatic or heteroaromatic radical.
  • a maximum chain length ie a maximum number of atoms constituting the compound residue, of 35 atoms is preferred, particularly preferably a maximum chain length of 34, 33, 32, 31 or 30 atoms.
  • aromatic and heteroaromatic residues electron-poor aromatic systems are preferred, which allow effective 7t-7t interactions with electron-rich aromatic systems of the toxins.
  • electron-poor aromatic radicals examples include 3,4,5-trinitrophenyl-, 3,4,5-trihalogenyl- (e.g. 3,4,5-trifluorophenyl-) or 3,4,5- tris(trihalomethyl)phenyl residue (e.g. 3,4,5-tris(trifluoromethyl)phenyl residues).
  • electron-poor heteroaromatic groups are pyridine, quinoline or isoquinoline, whose electron-poor character can be further enhanced with electron-withdrawing substituents such as nitro groups, tertiary amino groups, positively charged groups or halogen atoms.
  • aromatic and heteroaromatic radicals a molecular size of a maximum of 45, preferably a maximum of 44, 43, 42, 41 or 40 atoms is preferred, ie radicals which consist of a maximum of 45, preferably a maximum of 44, 43, 42, 41 or 40 atoms, including heteroatoms. are composed. Further preferred for aromatic and heteroaromatic radicals is a molecular size of a maximum of 39 atoms, particularly preferably a maximum of 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 or 30 atoms. Since the majority of PBUTs carry a negative formal charge under physiological conditions, amphiphilic compound residues with a combination of hydrophobic groups with positively charged groups are preferred.
  • groups that are positively charged under physiological conditions are primary, secondary, tertiary and quaternary amines.
  • these groups are included in the chain.
  • these groups could also be incorporated alternately into the chain, preferably not exceeding a maximum chain length of 35 atoms, particularly preferably 34, 33, 32, 31 or 30 atoms.
  • the charged groups are preferably arranged in suitable symmetry to the aromatic or heteroaromatic system.
  • a maximum molecular size of the compound residue is not exceeded, preferably a molecular size of 45, preferably 44, 43, 42, 41 or 40 atoms, more preferably a molecular size of 39 atoms, particularly preferably 38, 37, 36 , 35, 34, 33, 32, 31 or 30 atoms is not exceeded.
  • l-amino-2-phenylethyl or l,l-diamino-2-phenylethyl residues are suitable for toxins such as cresyl sulfate or phenylacetic acid.
  • Preferred connecting residues for binding protein-bound uremic toxins which can be or are bound covalently to the at least one additional cysteine residue or located at a different position in the sequence, are selected from the group consisting of N-phenylacetamidyl, N-decylacetamidyl, N-(l -amino-2 -phenylethyl)acetamidyl, N-( l -amino-2 -phenylpropyl)acetamidyl, N-( l -amino-2 -phenylbutyl)acetamidyl, N-(l, 1- di ami no-2-phenyl ethyl )acetamidyl, N-(l, l-diamino-2-phenylpropyl)acetamidyl, N-(l, 1-diamino-2-phenylbutyl)acetamidyl, N-(3,4,5- tris(trifluoro
  • the compounds mentioned are preferably covalently bound to the cysteine residue via the acetamide group.
  • halogenated acetamide derivatives can be used, which react with the thiol group of cysteine.
  • suitable coupling groups for example haloalkyl or maleimide derivatives, for binding to the thiol group.
  • the organic compound residue can also be, for example, a chelating agent that binds heavy metals such as lead, antimony, arsenic, cadmium, nickel, mercury, thallium or uranium.
  • chelating agents are ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), dimercaptosuccinic acid (DMSA) or dimercaptopropanesulfonic acid (DMPS).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • DMSA dimercaptosuccinic acid
  • DMPS dimercaptopropanesulfonic acid
  • the term “Schwerin etall” includes heavy metal ions.
  • the at least one apoferritin subunit with an amino acid sequence changed compared to the wild-type sequence - alternatively or in addition to a change in the amino acid sequence in the area of the inner cavity - is in the area of a
  • the amino acid sequence of the triple channel is changed compared to the wild-type sequence, so that the transport of a toxin into the cavity of the apoferritin nanoparticle through the triple channel is facilitated compared to an apoferritin nanoparticle with an unchanged amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of at least one apoferritin subunit can be changed compared to the wild-type sequence only in the area of a triple channel, for example in order to simply facilitate transport into the apoferritin nanoparticle, without there being any changes to the amino acid sequence in the area of the inner cavity , or the amino acid sequence of at least one apoferritin subunit can be compared to the Wild-type sequence may also be changed in the region of a triple channel, in addition to a change in the amino acid sequence in the region of the inner cavity. It is preferred that at least one change in the amino acid sequence in the area of the triple channel is present on at least two, preferably three, apoferritin subunits forming a triple channel.
  • amino acid changes can be present on one, two or three of the apoferritin subunits forming a triple channel.
  • Changes to two or three of the apoferritin subunits may be identical or different for each subunit, but are preferably identical.
  • an apoferritin nanoparticle for use as a toxin binder in hemodialysis which is composed of identical subunits, each of which has identical changes to the amino acid sequence compared to the wild-type sequence in the region of a triple channel, for example at least one, two, three, four , five, six, seven, eight, nine, ten, eleven or twelve positions of amino acids in the area of the triple channel.
  • these changes can occur alone or in combination with a change in amino acids in the area of the internal cavity.
  • the toxin to be bound during hemodialysis with the aid of the apoferritin nanoparticle according to the invention is preferably a protein-bound uremic toxin, which is preferably selected from the group consisting of indoxyl sulfate, para-cresyl sulfate, phenyl acetate and p-hydroxyhippuric acid.
  • the apoferritin nanoparticles according to the invention for use as a toxin binder in hemodialysis preferably have at least two, more preferably at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight, at least nine or at least 10, more preferably at least 12 , at least 14, at least 16, at least 18, at least 20 or at least 22, particularly preferably all 24 subunits have an amino acid sequence that is changed compared to the wild-type sequence in the area of the inner cavity and / or in the area of a triple channel and / or in the area of a quadruple channel.
  • the subunits that make up the Apoferritin nanoparticles according to the invention are composed identically in terms of their amino acid sequence.
  • an apoferritin nanoparticle according to the invention as described above is modified according to one embodiment by introducing cysteine residues that are functionalized with suitable chemical compound residues, preferably at least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight, at least nine or at least 10, more preferably at least 12, at least 14, at least 16, at least 18, at least 20 or at least 22, particularly preferably all 24 subunits are modified and functionalized in the same way.
  • the apoferritin nanoparticle has a modified amino acid sequence in the region of a triple channel, be it alone or in combination with a modified amino acid sequence in the region of the internal cavity, preferably at least two, more preferably at least three, at least four, at least five , at least six, at least seven, at least eight, at least nine or at least 10, more preferably at least 12, at least 14, at least 16, at least 18, at least 20 or at least 22, particularly preferably all 24 subunits that are changed from the wild-type sequence in the area of a triple channel Amino acid sequence.
  • an apoferritin nanoparticle according to the invention for use as a toxin binder in hemodialysis preferably at least two, more preferably at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight, at least nine or at least 10, further preferably at least 12, at least 14, at least 16, at least 18, at least 20 or at least 22, particularly preferably all 24 subunits have an amino acid sequence that is changed compared to the wild-type sequence in the area of the inner cavity and / or in the area of a triple channel and / or in the area of a quadruple channel , which is selected from one of the amino acid sequences according to SEQ ID NO: 13-24.
  • the subunits with an amino acid sequence that is changed compared to the wild-type sequence each have the same sequence.
  • an apoferritin nanoparticle according to the invention for use as a toxin binder in hemodialysis contains 24 subunits with a sequence opposite to the wild-type sequence in the area of the internal cavity and/or in the area of a triple channel and / or in the area of a quadruple channel changed amino acid sequence
  • the 24 subunits preferably have the same amino acid sequence, for example the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 24.
  • the subunits preferably have an amino acid sequence, which is selected from one of the amino acid sequences according to SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, or SEQ ID NO: 24.
  • the apoferritin nanoparticle according to the invention is composed exclusively of subunits consisting of the heavy chain, particularly preferably the human heavy chain.
  • the chain can also be changed in terms of the amino acid sequence of the protein regions on the outside (e.g. helices A and C) compared to the wild-type sequence, for example to produce a specific external charge, for example a negative or positive charge.
  • the apoferritin nanoparticle according to the invention has no cysteine residues on the outside of the nanoparticles, but possibly only in the inner cavity, so that functionalization with an organic compound residue takes place exclusively on the cysteine residues in the inner cavity.
  • Functionalization can occur by disassembling the apoferritin nanoparticle into its subunits under suitable conditions and then functionalizing the individual subunits. After the original conditions have been restored, the subunits automatically reconstitute the apoferritin nanoparticle. Suitable conditions are known to those skilled in the art and are described, for example, in [31], [38], [39] and further below.
  • the invention also relates to a composition for use as a toxin binder in hemodialysis, comprising several apoferritin nanoparticles according to the invention for use as a toxin binder in hemodialysis according to the first aspect of the invention described above.
  • a composition can be advantageously used as an adsorption material for binding toxins in the blood, for example, to bind protein-bound uremic toxins (PBUTs) or to bind heavy metals.
  • PBUTs protein-bound uremic toxins
  • the several apoferritin nanoparticles according to the invention for use as a toxin binder in hemodialysis can be present in amorphous form or in a defined arrangement, for example in a crystalline form.
  • a composition of apoferritin nanoparticles present in amorphous form is understood here to mean a composition of apoferritin nanoparticles in which the apoferritin nanoparticles are only connected to one another to form a disordered or indeterminate, in particular non-crystalline, structure.
  • a defined, for example crystalline, arrangement of apoferritin nanoparticles according to the invention can be achieved in a manner known to those skilled in the art (see for example [31]).
  • the apoferritin nanoparticles contained in the arrangement are preferably cross-linked to one another for use as toxin binders in hemodialysis.
  • Such an adsorption material has apoferritin nanoparticles according to the invention as protein cages, which are assembled into a defined crystalline material with uniformly distributed solvent channels. This is not only advantageous for achieving a high purity of the material, but also for handling when used as a sorption material.
  • the apoferritin nanoparticles which are cross-linked to form a crystalline structure, can be handled as a whole and separated from blood, for example.
  • the shape of the crystal can be adapted, for example, to the shape of the cavity of a sorption cartridge.
  • the several apoferritin nanoparticles according to the invention can be present for use as toxin binders in hemodialysis, for example in water or an aqueous solution, for example a suitable aqueous buffer solution.
  • the aqueous solution is preferably a biocompatible or pharmaceutically acceptable solution in which the nanoparticles are stable.
  • the present invention also relates to a sorption cartridge having in its interior several apoferritin nanoparticles for use as toxin binders in hemodialysis according to the first aspect of the invention or a composition for use as toxin binders in hemodialysis according to the second Aspect of the invention includes.
  • a sorption cartridge according to the invention can, for example, be designed so that it can be integrated into a dialysis system.
  • the sorption cartridge preferably has an entrance for supplying blood and an exit for exporting the blood.
  • the sorption cartridge is preferably designed in such a way that the several apoferritin nanoparticles, or the composition comprising several apoferritin nanoparticles, are retained in the sorption cartridge by suitable means in the sorption cartridge.
  • the plurality of apoferritin nanoparticles or the composition can be contained in a first compartment within the sorption cartridge, which is separated from a second compartment within the sorption cartridge via one or more membranes, the membrane or membranes being for unbound toxin molecules and/or for proteins with toxin molecules bound to them are permeable, but not for the apoferritin nanoparticles.
  • blood that is to be purified of toxin molecules, such as PBUTs can be passed through the second compartment.
  • Toxin molecules present in the blood in free form or optionally also bound to protein, can reach the first compartment across the membrane(s), for example by diffusion, and be bound there by the apoferritin nanoparticles according to the invention.
  • the plurality of apoferritin nanoparticles or the composition are arranged in the sorption cartridge in such a way that during operation, for example in a dialysis system, there is direct contact with the blood to be purified.
  • a crystalline or non-crystalline (amorphous) composition of the apoferritin nanoparticles is located within the sorption cartridge or at least within a compartment within the sorption cartridge, whereby blood can be contacted directly with the composition within the sorption cartridge.
  • the invention forms Sorption material is an insoluble (amorphous or crystalline) solid that is significantly larger than the components of the blood (e.g. erythrocytes with approx. 2.5 pm). The difference in size makes separation easy.
  • the sorption material can be retained by relatively coarse filters while the blood flows through the sorption cartridge.
  • the biocompatibility of the material according to the invention proves to be particularly advantageous, since it is not necessary to separate the sorption material from the blood, which not only enables closer contact between the sorption material and the toxins to be separated, but also facilitates integration into existing dialysis systems .
  • the invention in a fourth aspect, relates to a dialysis system comprising a dialyzer and at least one sorption cartridge according to the third aspect of the invention.
  • the at least one sorption cartridge can be arranged a) upstream of the dialyzer, b) downstream or c) in a secondary circuit to the dialysis circuit in the flow direction of the blood to be dialyzed.
  • the invention also relates to a method for dialysis of blood, preferably human blood, comprising the step of bringing the blood into contact with an apoferritin nanoparticle according to the invention according to the first aspect of the invention or with a composition according to the second aspect of the invention.
  • the step of bringing into contact preferably takes place over a time and under conditions that are sufficient to bind a toxin contained in the blood, for example a PBUT or a heavy metal, to the apoferritin nanoparticles according to the invention or the composition.
  • the composition may comprise the apoferritin nanoparticles in amorphous or cross-linked (crystalline) form.
  • the term “bringing into contact” here includes in particular bringing blood into direct contact with the apoferritin nanoparticles or the composition, ie without separation through, for example, a semipermeable membrane.
  • the dialysis method according to the invention is particularly advantageous for treating chronic kidney disease (CNK) and/or for alleviating the consequences of chronic kidney disease (CNK).
  • the invention therefore also relates to a method for the therapeutic treatment of a patient with chronic kidney disease (CNK) and/or for the therapeutic alleviation of the consequences of chronic kidney disease (CNK), comprising a method for dialysis of blood according to the fifth aspect above the invention.
  • Figure 1 Schematic representation of embodiments of the apoferritin nanoparticle according to the invention.
  • A Schematic representation of an apoferritin nanoparticle according to the invention with a change in the amino acid sequence in the area of the inner cavity;
  • B Schematic representation of an apoferritin nanoparticle with modification of the amino acid sequence in the area of the inner cavity with functionalized cysteine residues;
  • C Schematic representation of an apoferritin nanoparticle with amino acid sequence change in the region of a triple channel;
  • D Schematic representation of an apoferritin nanoparticle with a change in the amino acid sequence in the region of the internal cavity (with functionalization of a cysteine residue), and with an additional change in the amino acid sequence in the region of a triple channel.
  • Figure 2 Schematic representation of a crystal-like arrangement (lower part of the figure) of several apoferritin nanoparticles according to the invention, composed of apoferritin nanoparticles from Figure 1 (upper part of the figure).
  • FIG. 3 Schematic representation of embodiments of a dialysis system according to the invention.
  • Figure 4 Results of adsorption experiments with functionalized apoferritin nanoparticles to bind PBUTs.
  • f Relative concentration of TMF a mRNA in endothelial cells.
  • Ftn (neg) -Phe Ftn (neg) functionalized with 2-iodo-N-phenylacetamide (Phe) apoferritin nanoparticles
  • Ftn (neg) -C10 Ftn (neg) functionalized with 2-bromo-N-decylacetamide (CIO) Apoferritin nanoparticles.
  • Figure 5 Adsorption capacity of genetically modified ferritin variants towards indoxyl sulfate.
  • Ftn (neg) -Dock variant with toxin binding site (sequence: Ftn (neg) -dock03, SEQ ID NO: 21);
  • Ftn (neg) -Ap variant with reduced negative surface charge on the inner surface (sequence: Ftn (neg) -Ap4, SEQ ID NO: 17);
  • Ftn (neg) -Ap channel variant with reduced negative surface charge on the inner surface and in the area of the triple channel (sequence: Ftn (neg) -Ap4-3A, SEQ ID NO: 18).
  • b) Indoxyl sulfate and its interactions with three side chains in a designed toxin binding site (computer model).
  • FIG. 6 Adsorption capacity of crystalline (left) and non-crystalline (right) genetically modified ferritin variants according to the invention towards indoxyl sulfate (IS).
  • Ftn (neg) apoferritin nanoparticle variant with increased negative charge on the outer surface (SEQ ID NO: 12);
  • Ftn (neg) -Ap4 variant with 4 mutations compared to Ftn (neg) and thereby changed reduced negative surface charge on the inner surface (SEQ ID NO: 17);
  • Ftn(neg)-Apl6 Variant with 16 mutations compared to Ftn (neg) and thereby altered reduced negative surface charge on the inner surface (SEQ ID NO: 20).
  • Ftn (neg) -03 ( Ftn (neg) -dock03, SEQ ID NO:
  • FIG. 9 Adsorption capacity of a crystalline genetically modified ferritin variant according to the invention (Ftn (neg) -Ap4-3A-dock43; SEQ ID NO: 24) with combined sequence modifications towards indoxyl sulfate (IS) in comparison to Ftn (neg) and the variants Ftn (neg) -Ap4 (SEQ ID NO: 17), Ftn (neg) -Ap4-3A (SEQ ID NO: 18) and Ftn (neg) - dock43 (SEQ ID NO: 23).
  • Ftn (neg) -43 Ftn (neg) -dock43;
  • Ftn (neg) -Ap4-3A-43 Ftn (neg) -Ap4-3A- dock43.
  • Figure 1 shows a highly simplified and schematic representation of embodiments of apoferritin nanoparticles 1 according to the invention for use as toxin binders in hemodialysis.
  • the apoferritin nanoparticles 1 have a generally spherical shape, with a protein shell formed by apoferritin subunits 2, which encloses an internal cavity 4, and in which channels 3 at the interfaces between the apoferritin subunits 2 are formed, through which toxins from the external environment reach the inner cavity 4, for example by diffusion, and can be bound there, for example by hydrophobic interaction.
  • Four individual apoferritin nanoparticles 1 are shown schematically in FIG.
  • any native cysteine residues present were first replaced by alanine and then four amino acids were replaced at four sequence modification sites 5 by cysteine, which has a organic compound residue covalently bound to it (here, for example, an N-phenylacetamidyl residue) was functionalized.
  • an organic compound residue covalently bound to it here, for example, an N-phenylacetamidyl residue
  • four cysteine residues are functionalized with a hydrophobic organic compound residue for binding uremic toxins.
  • Figure IC shows schematically an embodiment of an apoferritin nanoparticle 1 for use as a toxin binder in hemodialysis, in which only sequence modification sites 5 are provided in the area of a triple channel, ie an amino acid sequence that is only changed in the area of a triple channel compared to the wild-type sequence is present.
  • FIG 5 is shown as a functionalized sequence modification site 5.
  • apoferritin nanoparticles 1 show schematically the assembly of apoferritin nanoparticles 1 according to the invention (upper part of the figure) into a crystal-like arranged composition 100 (lower part of the figure).
  • the apoferritin nanoparticles 1 can be assembled under appropriate conditions into a well-defined macroscopic crystalline material with uniformly distributed solvent channels. This ensures high purity of the material as well as easy handling and is also helpful for material characterization.
  • the apoferritin nanoparticles 1 can optionally be cross-linked with one another.
  • a dialysis system 200 according to the invention is shown schematically in various embodiments in FIG. Figure 2A shows an embodiment in which a sorption cartridge 201 is in a dialyzer 202, here a hollow fiber membrane module
  • the flow direction of the blood indicated by the arrows is upstream.
  • the flow direction is determined by a corresponding pump, which is not shown here.
  • the body boundary is indicated here schematically by the dashed line 203.
  • Blood is conveyed to the sorption cartridge 201 via a line 205, for example a hose.
  • the sorption cartridge 201 contains an adsorption material according to the invention, for example a composition 100 in the form of a crystalline arrangement according to the second aspect of the invention.
  • the blood can be brought into direct contact with the composition 100 containing the apoferritin nanoparticles 1 according to the invention.
  • Any uremic toxins contained in the blood for example bound to proteins, can be bound by the adsorption material.
  • the blood which has been freed of toxins or at least depleted, is returned to the dialyzer 202 and further into the patient's body via a line 204 leading to the body.
  • a dialysate circuit 206 can provide an exchange or counterflow of dialysate.
  • FIG. 3B shows a dialysis system 200 according to the invention, in which the sorption cartridge 201 according to the invention is connected downstream of the dialyzer 202 in the direction of flow of the blood.
  • the dialysis system 200 in this embodiment corresponds to the embodiment shown in FIG. 3 A, so that reference is made to the statements there for further details.
  • the blood to be freed from or depleted of toxins comes into direct contact with the apoferritin nanoparticles 1 or a composition 100 comprising the apoferritin nanoparticles 1 in the sorption cartridge 201.
  • 3C shows a dialysis system 200 according to the invention, in which the sorption cartridge 201 according to the invention with apoferritin nanoparticles 1 according to the invention is arranged in a secondary circuit 207 to the blood circulation.
  • adsorption material can be fed into the dialyzer 202 in order to bind toxins that escape from the blood via the membranes of the hollow fibers.
  • the blood to be purified does not come into direct contact with the apoferritin nanoparticles 1 or a composition 100 comprising the apoferritin nanoparticles 1. Examples
  • Apoferritin nanoparticles according to an embodiment of the invention were prepared by chemically modifying the inner surface with small hydrophobic molecules.
  • the protein was genetically modified so that the amino acid cysteine is only present in certain exposed areas on the inner surface.
  • This amino acid is the only amino acid in the inner cavity to have a thiol group in its side chain, which was used as an anchor point for the reaction with hydrophobic molecules.
  • the protein container can be fragmented into its subunits under acidic conditions (pH of 2).
  • the inner cysteines can then be functionalized with the hydrophobic molecules.
  • the molecules 2-iodo-N-phenylacetamide and 2-bromo-N-decylacetamide were used, which can bind to the thiol group as a result of a substitution reaction. Since a thiol group only occurs in cysteine and the modified protein only contains it within the cavity, only the inner surface is selectively modified with hydrophobic groups. Complete functionalization can be verified by a significant increase in the mass of the protein using ESI-MS measurements. In this way it can also be determined whether each cysteine has been functionalized. Up to now, up to 96 hydrophobic molecules can be incorporated into each nanoparticle. After functionalization, an increased adsorption capacity for the IS and pCS as well as for phenyl acetate can be measured, as can be seen from Fig. 3a.
  • cysteine anchoring sites was carried out by multiple cycles of QuikChangeTM site-directed mutagenesis using a two-step polymerase chain reaction (PCR) protocol [30].
  • PCR polymerase chain reaction
  • reaction buffer lOx 100 mM KCl, 100 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 200 mM Tris-HCl pH 8.8, 20 mM MgSO 4 , 1% Triton® X-100, 1 mg mL 1 nuclease-free bovine serum albumin (BS
  • a PCR thermal cycler (Eppendorf Mastercycler Nexus PCR Cycler) was prepared by an initial Heating step for 30 s at 95 °C.
  • the first step of the PCR protocol consisted of 3 cycles of 30 s denaturation at 95 °C, annealing for 1 min at 61 °C, followed by elongation for 6 min at 68 °C. After the first 3 cycles, the separate mixtures with the forward and reverse primers were combined and the PCR was continued for 16 additional cycles with the same parameters as the first 3 cycles, followed by a final elongation phase for 10 min at 68 °C to complete the PCR.
  • Digestion of the parental plasmid is carried out by adding 1 pL DpnI (10 U pL 1 ) and incubating overnight at 37 °C. Dpnl is deactivated by heating at 80°C for 20 min and the mixture is purified using the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-Up Kit according to the manufacturer's instructions. Calcium-competent E. coli DH5a cells were incubated with 200 ng of the purified plasmid for 30 min on ice, followed by heat shock for 45 s at 42 °C.
  • the cells were incubated for 1 h in Super Otimal Broth (SOB) medium, centrifuged at 1000 g, resuspended in 100 pL medium, plated on an LB agar plate, and incubated at 37 °C for 16 h. A single colony was picked and incubated overnight at 37 °C and 250 rpm in 5 mL sterile LB medium supplemented with 150 pg mL 1 ampicillin. The next day, plasmids were extracted using the NucleoSpin® Plasmid Miniprep kit according to the manufacturer's instructions.
  • SOB Super Otimal Broth
  • the sequence was confirmed by mixing 500 ng of plasmid with 25 pmol of T7 forward or reverse primer in 10 pL of solution and submitting for DNA sequencing (Eurofins Genomics). Plasmids with the desired mutations were then used as stock plasmids for further Mutagenesis selected until all 5 mutations were present.
  • the cell pellet was resuspended in the remaining solution and streaked onto an LB agar plate with 150 pg ml-1 ampicillin and incubated overnight at 37 °C.
  • colonies of transformed E. coli BL21-Gold (DE3) cells were grown overnight in 5 ml of sterile LB-Miller medium supplemented with 150 pg ml' 1 sodium ampicillin at 37 ° C and Incubated at 180 rpm. Then 400 ml of Terrific Broth (TB) medium containing 150 pg ml' 1 sodium ampicillin were inoculated with 4 ml of the preculture.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • Cells from 400 ml culture were resuspended in 20 ml buffer (50 mM Tris, pH 7.5, 0.3 M NaCl).
  • Cell lysis was achieved by sonication (60% amplitude) for six times for 1 min on ice with 1 min rest in between using a Vibra-Cell VCX-130 ultrasonic processor (Sonics).
  • the resulting suspension was centrifuged at 14,000 g for 20 min to separate the cell debris from the soluble proteins. Denaturation of most E. coli proteins was achieved by heating the supernatant to 65 °C for 10 min in a water bath. The denatured proteins were separated by centrifugation at 14,000 g for 15 min.
  • Proteins remaining in the solution were precipitated with ammonium sulfate at a final concentration of 70% of its saturation concentration, followed by centrifugation at 14,000 g for 20 min. After re-puffing the pellet in 10 ml buffer (50 mM Tris, pH 7.5, 0.15 M NaCl), the ammonium sulfate precipitation was repeated. The resulting pellet was dissolved in 50 ml of IEC loading buffer (50 mM Tris, pH 7.5, 0.15 M NaCl) and analyzed by ion exchange chromatography (IEC) with a linear gradient from 0.15 to 1 M NaCl using a 5 ml HiTrapTM Q HP anion exchange column (Cytiva) purified.
  • IEC loading buffer 50 mM Tris, pH 7.5, 0.15 M NaCl
  • IEC ion exchange chromatography
  • Ftn (neg) -3xCys or Ftn (neg) -4xCys were incubated for 4 h in digestion buffer (10 mM phosphate; 50 mM NaCl, pH 2). After 3 /ih, 10 equivalents (eq.) (based on each cysteine) of tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP, Iris Biotech GmbH) from a 10 mg mL' 1 stock solution were added to the solution.
  • the solution was then made up to 15 mL with reassembly buffer (50 M Tris, 50 mM NaCl, pH 7.6) and concentrated to a final volume of 200 ⁇ l using a membrane filter (Sartorius Vivaspin Turbo 15; 30 kDa MWCO). Again 10 eq. TCEP was added and the solution was made up to a volume of 2 mL. The pH was adjusted to 7.6 with IM NaOH or HCl. Then 2 mL of ethanol with 20 eq. 2-Iodo-N-phenylacetamide (aber GmbH) was added to the solution and the mixture was stirred for 1 h at 300 rpm in the dark.
  • reassembly buffer 50 M Tris, 50 mM NaCl, pH 7.6
  • a membrane filter Sartorius Vivaspin Turbo 15; 30 kDa MWCO
  • the solution was then made up to a total volume of 30 ml with reassembly buffer. The protein reassembled overnight. Finally, the solution was concentrated to 2 ml and purified via gel filtration on a HiLoad 16/600 SuperdexTM 200 pg column. Protein-containing fractions were collected and stored at 4°C for further use.
  • the functionalization follows exactly the protocol for functionalization using 2-iodo-N-phenylacetamide.
  • the protein/TCEP solution was not made up to 2 mL but to 800 pL, and then 3.2 mL of ethanol containing 40 eq.
  • 2-Bromo-N-decylacetamide (Sigma-Aldrich) is added to the solution. All other steps were performed according to the 2-iodo-N-phenylacetamide protocol. Hanging drop crystallization
  • the stability of the crystals was increased.
  • they were fixed with the crosslinker Sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, Sigma-Aldrich).
  • Sulfo-SMCC sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, Sigma-Aldrich.
  • the crystals were centrifuged at 1000 g for 2 min.
  • the crystallization solution was removed until 246 pL remained.
  • 64 pL of a freshly prepared aqueous sulfo-SMCC solution containing 4.8 mg mL 1 was added, resulting in a final concentration of 1 mg mL 1 .
  • the mixture was 4 h Leave to stand at room temperature for a long time and then top up to 1 mL with ultrapure water.
  • the crystals were centrifuged at 1500 g for 2 min. The supernatant was removed and the crystals were then resuspended in ultrapure water. The procedure was repeated up to three times to wash the crystals free of residual crosslinking agent.
  • the material was stored at an ambient temperature of 20°C until further use. Crystals were photographed under a Leica S9D microscope with a FlexaCamCl.
  • the protein sample was buffered to ultrapure water using an Amicon® Ultra 0.5 ml (MWCO 30,000 Da) centrifugal filter.
  • the protein sample is made up to a volume of 500 pL with ultrapure water, concentrated to approximately 20 pL and topped up to 500 pL.
  • the rebuffering is repeated 5 times and the concentration was adjusted between 0.15 and 0.2 mg ml 1 .
  • the mass of the proteins was determined using electron spray ionization time-of-flight mass spectrometry (Agilent 6224 ESI-TOF). The measurement was carried out in positive mode.
  • a stock solution of the desired toxin is prepared with a concentration of 50 pg mL' 1 for pCS and IS and 500 pg mL' 1 for PheAc.
  • a calibration series with concentrations of 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.7 and 1 pg mL' 1 is prepared from the initial stock solutions for later determination of the absolute toxin concentrations in the samples.
  • the uremic toxin concentration was quantified by a reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) system with a C18 column (Zorbax Extend-C18, Agilent) coupled to an electron spray ionization quadrupole liner ion trap mass spectrometer (ESI-QTRAP). .
  • RP-HPLC reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • C18 column Zorbax Extend-C18, Agilent
  • EI-QTRAP electron spray ionization quadrupole liner ion trap mass spectrometer
  • the control was measured before each sample incubated with the crystals.
  • Chromatograms were evaluated using Analyst® Instrument Control and Data Processing Software. Peaks were integrated and toxin concentration was determined from the calibration series. The amount of adsorbed uremic toxin was determined from the concentration difference between the control and the samples. The adsorption capacity was then determined by dividing the mass of adsorbed toxins by the mass of the crystals.
  • qPCR Quantitative polymerase chain reaction
  • Reverse transcription was performed using 1 pg total RNA (600 ng), random hexamers, and Verso reverse transcriptase (Thermo Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • gene expression levels were quantified using SYBR Green I dye chemistry on a LightCycler 480 system (Roche Applied Sciences).
  • the following primers were used for relative quantification of targeted gene expression - for human TNF-alpha: forward primer 5'-GCCCAGGCAGTCAGATCATCT-3' (SEQ ID NO: 8), reverse primer 5'-TTGAGGTTTGCTACAACATGG-3' (SEQ ID NO : 9) and for human beta-actin: forward primer 5'-CAACCGCGAGAAGATGAC-3' (SEQ ID NO: 10), reverse primer 5'-GTCCATCACGATGCCAGT-3' (SEQ ID NO: 11). Data were presented as the mean level of gene expression relative to the expression of the reference gene ( ⁇ -actin).
  • Platelets from three donors were isolated by centrifugation at 260 g for 15 min. After a second centrifugation step, platelets were resuspended in Hepes buffer pH 6.6 (10 mM Hepes, 136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2 mM MgCh and 5 mM glucose). Platelet suspensions were centrifuged again in the presence of 1:15 acid citrate dextrose (ACD) and 1 U mL' 1 apyrase and then in Hepes buffer pH 7.45 (10 mM Hepes, 136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2 mM MgCh , 5 mM glucose and 0.1% BSA) resuspended.
  • ACD 1:15 acid citrate dextrose
  • Ftn (neg) nanoparticle subunits and the cysteine-containing variants Ftn (neg) -3xCys (with 3 cysteine residues) and Ftn (neg) 4xCys (with 4 cysteine residues) are given below.
  • Variants with only one (Ftn (neg) -lxCys) and two cysteine residues (Ftn (neg) -2xCys) are also shown.
  • Ftn (neg) the mutations compared to the wild-type H chain (SEQ ID NO: 1) are given.
  • the cysteine residues in the cysteine-containing variants are highlighted by underlining.
  • Ftn (neg) (SEQ ID NO: 12): Variant with increased negative charge on the outer surface; A18E, C90E, C102E, K86Q, H105E TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPES GLAEYLFDKH TLGDSDNES
  • Ftn (neg) -3xCys (SEQ ID NO: 13): variant with 3 cysteine residues on the inner surface; K53C, E64C, C130A, K143C
  • Ftn (neg) -4xCys (SEQ ID NO: 14): variant with 4 cysteine residues on the inner surface;
  • Ftn (neg) -lxCys (SEQ ID NO: 15): variant with 1 cysteine residue on the inner surface;
  • Ftn (neg) -2xCys SEQ ID NO: 16: variant with 2 cysteine residues on the inner surface;
  • binding point stands here for Toxin binding sites formed by mere amino acid replacement (without additional functionalization).
  • Ftn (neg) -Ap4 (SEQ ID NO: 17): Variant with reduced negative surface charge in the area of the inner cavity; E61V, E62A, D131F, E140W
  • Ftn (neg) -Ap4-3A (SEQ ID NO: 18): Variant with reduced negative surface charge in
  • Ftn (neg) -Ap7 (SEQ ID NO: 19): variant with 7 hydrophobic amino acids on the inner surface; E61V, E62A, H128F, D131W, N139V, E140W, K143V
  • Ftn (neg) -Apl6 (SEQ ID NO: 20): variant with 16 hydrophobic amino acids on the inner surface; K49V, Y54F, H57W, Q58L, E61V, E62A, H65L, H128F, H136Y, D131W, H136Y N139V, E140W, K143V, E147L, H151Y, N154A
  • Ftn (neg) -dock03 (SEQ ID NO: 21): Variant with a binding site on the inner surface near the triple channel; E64R, H65K, K68E, K71R, Q75D, R76K, H128E, D131E, F132H, T135K, H136R, Y137H, N139R, E140R
  • Ftn (neg) -dock23 (SEQ ID NO: 22): variant with a binding site on the inner surface in the middle of the subunit; H57E, Q58R, H60I, E61G, E64G, K68D, T135D, H136K, Y137H, N139E, E140K, A144N
  • Ftn (neg) -dock43 (SEQ ID NO: 23): variant with a binding site on the inner surface near the E-helix; H57E, Q58R, E64R, H65K, K68E, T135D, H136R, Y137H, N139R, E140R, E147Y
  • Ftn (neg) -Ap4-3A-dock43 (SEQ ID NO: 24): Variant with reduced negative surface charge in the area of the inner cavity and on the pores, as well as increased pore size, and also with a binding site on the inner surface near the E- Helix; E61V, E62A, T122A, D123A, N125A D131F, H57E, Q58R, E64R, H65K, K68E, T135D, H136R, Y137H, N139R, E140R, E147Y AKYFLER SHVARRKAEELMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLAAAKADPHLCFFIEDRHLRRQVKAIKYLGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES
  • the assembly into a macroscopic material with the apoferritin nanoparticle according to the invention as a building block was achieved by batch crystallization techniques (see above).
  • a protein solution was gently mixed with constant shaking while the precipitant solution was added. After about 24 hours the first crystals could be observed.
  • the size of the crystals can be adjusted by changing the protein and precipitant concentration.
  • the crystals were fixed with a crosslinking agent.
  • Initial experiments were carried out with glutaraldehyde. However, when tested for stability in a 60 mg mL' 1 BSA solution chosen to simulate the high protein content of blood, the crystals dissolve. Therefore, stabilization was carried out using a sulfo-SMCC cross-linker, which enabled stable fixation by maintaining the adsorption capacity.
  • hydrophobic ligands were introduced into the inner cavity of the apoferritin nanoparticles according to the invention.
  • the invention provides a modular material that can be adapted to the type of ligand.
  • a generic site for the modification was achieved by incorporating cysteine residues that can be modified by their thiol group as an anchor site for chemical derivatization.
  • native cysteine residues were replaced with alanine residues to prevent modification at undesirable positions.
  • Important design criteria for the introduction of cysteine residues on the cavity surface were the distance between the sites and the accessibility to solvents Surface area (solvent-accessible surface area, SASA).
  • a high SASA value should correspond to high reactivity.
  • ferritin variants with three and four introduced cysteines per subunit were designed, named Ftn (neg) -3xCys and Ftn (neg) - 4xCys.
  • the total number of anchor sites per assembled protein cage is therefore 72 or 96 with 24 subunits and 3 or 4 cysteine residues.
  • the mutations were introduced into the Ftn( neg) gene using Quik-Change mutagenesis techniques and the variants were introduced into E. co/z- Bacteria overexpressed.
  • the a-halocarbonyls 2-iodo-N-phenylacetamide (Phe) were used to chemically modify cysteine thiol groups. used.
  • Apoferritin nanoparticles functionalized with the above compounds are referred to as Ftn(neg)-Phe and Ftn(neg)-C10.
  • the overall strategy for chemically modifying the inner surface and then assembling it into one Heterogeneous material is basically as follows: First, the protein cage is broken down into its subunits under acidic conditions. When decomposed, the thiol groups are easily accessible to the haloacetamide derivatives. The molecules to be bound themselves are not soluble in an aqueous solution.
  • the functionalization is carried out in a solution containing high proportions of ethanol to facilitate the solubility of the hydrophobic molecules.
  • the mixture is diluted and the protein cage can reassemble.
  • the resulting chromatogram shows a similar elution volume to the unfunctionalized cage (not shown), indicating complete reconstruction of the protein cage. This finding is confirmed in negative-stained TEM images showing intact cage structures (not shown).
  • the SEC of functionalized Ftn (neg) -4xCys shows a slight shift towards a higher elution volume coupled with a slightly increased size, which agrees well with the results of dynamic light scattering (DLS) measurements.
  • DLS dynamic light scattering
  • the respective sample was incubated in solutions of three different uremic toxins indoxyl sulfate (IS), p-cresyl sulfate (pCS) and phenylacetic acid (PheAc) at concentrations that would be expected in a terminal CNK patient [26, 33, 34], After incubation for 3 h, the PBUT concentration in the supernatant and the respective control samples was determined by HPLC-MS/MS techniques. The absolute values are determined by comparison with a calibration experiment that was carried out at the beginning of each experimental setup and every 20 samples. In addition, controls were measured shortly before each sample to ensure direct comparability.
  • IS uremic toxins indoxyl sulfate
  • pCS p-cresyl sulfate
  • PheAc phenylacetic acid
  • toxin PheAc For the toxin PheAc, no significant increase in adsorption could be observed after the incorporation of the hydrophobic molecules.
  • the material was compared to samples of noncrystalline protein material prepared by adding a cross-linker to a protein solution and incubating overnight (not shown). The resulting material was tested for its adsorption capacity towards IS. It could no significant difference was found between the two types of materials, indicating that the macroscopic shape of the material does not influence the adsorption of the IS.
  • the capacities of the protein-based adsorbent according to the invention are in a similar range, but are smaller than the values of other published materials, for example the P87 zeolites with capacities of up to 1000 pg mL-1 [35] or carbon-based adsorbents with capacities of up to 3200 pg mL-1 [36] in relation to IS.
  • the adsorbent with the highest capacity published to date is a zirconium-based MOF with a capacity of up to 156 mg g' 1 [24], Nevertheless, these materials are good adsorption materials in themselves and efforts need to be made to improve their Improve biocompatibility.
  • the protein-based material according to the invention has intrinsic biocompatibility. The adsorption capacity can be adjusted and further improved.
  • endothelial cells and isolated platelets were incubated with the crystalline material.
  • Endothelial cells show no expression of tumor necrosis factor-a (TNF-a), indicating no endotoxin contamination from the bacterial origin of the material (Fig. 4d).
  • Platelets showed no activation, indicating that the material did not induce blood clotting (Fig. 4c).
  • Similar results were obtained for crystals cross-linked with glutaraldehyde (not shown).
  • no major difference was observed between the chemically modified and unmodified protein materials, suggesting that functionalization did not affect biocompatibility.
  • the synthesized material according to the invention based on the bottom-up assembly of protein cages shows good suitability for blood purification applications.
  • the resulting material shows stability in blood-like systems and good adsorption of three PBUTs. Crystalline and non-crystalline adsorption materials exhibit similar behavior.
  • up to 96 water-insoluble aliphatic and phenylic molecules were incorporated into the cavity of the ferritin protein cage through the introduction of anchor sites. After modification No decrease in biocompatibility could be observed. An increase in adsorption capacity due to the chemical modifications can be observed.
  • hydrophobic ligands for example amphiphilic ligands
  • hydrophobic and hydrophilic ligands or the modification of the amino acid residues in the vicinity of the ligands
  • the adsorption capacity can most likely be further increased, since PBUTs have hydrophobic and hydrophilic properties.
  • the modular character of the material according to the invention enables adaptation for other applications, for example treatment strategies for heavy metal poisoning by incorporating chelating agents.
  • positively charged amino acids can be introduced around the anchor sites to satisfy the negative charge of the PBUTs while binding the hydrophobic part of the toxins to the inserted molecules. All these modifications to the inner surface do not affect the assembly of the material.
  • Efficient adsorption onto the apoferritin nanoparticles according to the invention can also be achieved by a suitable combination of amino acids with hydrophobic, aromatic, polar or charged side chains, whereby binding sites are created inside the protein container in the unfunctionalized protein.
  • This is shown as an example in Figure 5b.
  • the delocalized and hydrophobic ring system of the IS is bound by the ring system of the amino acid tyrosine, while the polar negatively charged sulfate group is stabilized by partially positively charged nitrogen atoms in the amino acid histidine.
  • the binding affinity of the proteins to the toxins was determined using “ligand docking” protocols from the Rosetta software package.
  • amino acids of the apoferritin nanoparticles can be specifically exchanged in order to change the properties of the apoferritin nanoparticles.
  • the mass transport into the area of the inner cavity can further be achieved by modifications in the area of the
  • Triple channel can be improved.
  • Binding sites created by amino acid exchange can be combined with modifications that improve mass transport to further improve adsorption.
  • variants with more than one binding site per apoferritin subunit are also possible.
  • Ftn (neg) -Apl6 was developed (SEQ ID NO: 20) .
  • the four charged amino acids at positions 61, 62, 131, and 140 were replaced by nonpolar derivatives (D at position 131 not by F, but by W), and twelve additional nonpolar amino acids were introduced at surface-exposed positions.
  • the adsorption capacities of Ftn (neg) -Ap4 and Ftn (neg) -Apl6 were determined in comparison to Ftn (neg) for both crystalline and non-crystalline forms (see Fig. 6; crystalline forms left bars; non-crystalline forms right bars) .
  • Ftn (neg) -Ap4 and Ftn (neg) -Apl6 were determined in comparison to Ftn (neg) for both crystalline and non-crystalline forms (see Fig. 6; crystalline forms left bars; non-crystalline forms right bars) .
  • the binding sites are located near the triple channel (Ftn (neg) -dock03), in the center of the subunit (Ftn (neg) -dock23) and near the 4-fold channel (Ftn (neg) -dock43) .
  • the variant Ftn(neg)-03 showed the highest adsorption capacity with a value almost doubled.
  • the adsorption capacity of this variant was determined for the adsorbent material with non-crystalline morphology and compared with the results for unmodified Ftn (neg) and the previously mentioned variants ( Figure 9). The measured values indicate that individual positive effects due to different modifications can be added up by combining mutations in a structure.
  • the Ftn (neg) -Ap4-3 A-43 variant showed the highest adsorption capacities of all variants examined in this study.
  • the advantage of simply changing the properties of the apoferritin nanoparticles according to the invention through amino acid exchange is that the proteins can be used without further chemical modification. This reduces the likelihood of allergic reactions or other side effects and makes it cheaper to produce than functionalized versions. Stronger binding points can be designed. Furthermore, the present invention opens up the possibility of providing further apoferritin nanoparticles or apoferritin nanoparticle compositions with further improved affinity, possibly adapted to specific toxins.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Toxin-Bindemittel für die Hämodialyse. Die Erfindung stellt ein Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse bereit, wobei das Apoferritin-Nanopartikel Apoferritin-Untereinheiten umfasst, die zu dem Apoferritin-Nanopartikel zusammengesetzt einen inneren Hohlraum ausbilden, und wobei das Apoferritin-Nanopartikel in seinem inneren Hohlraum keine Nanopartikel enthält. Darüber hinaus stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, eine Sorptionskartusche sowie ein Dialysesystem bereit.

Description

TOXIN-BINDEMITTEL FÜR DIE HÄMODIALYSE
Die Erfindung betrifft neue Toxin-Bindemittel für die Hämodialyse.
Etwa 9 % der Weltbevölkerung leiden unter chronischen Nierenerkrankung (CNK) in verschiedenen schweren Ausprägungen [1], Im weiteren Verlauf haben die Betroffenen eine deutlich höhere Anfälligkeit gegenüber kardiovaskulären Erkrankungen [2], So starben im Jahr 2017 1,2 Millionen Menschen an den direkten Folgen einer CNK und nochmal 1,4 Millionen Menschen an kardiovaskulären Erkrankungen, die auf eine CNK zurückzuführen sind [1], Das hohe kardiovaskuläre Risiko konnte auf diverse urämische Toxine wie Indoxylsulfat (IS) und para-Kresyl sulfat (pCS) zurückgeführt werden [3 ]-[ 10] . Diese Toxine können selbst mit verlängerten oder häufigeren Behandlungen im Rahmen des herkömmlichen Hämodialyseverfahren nur begrenzt vom Plasma abgetrennt werden [11], Die Toxine binden aufgrund ihres teilweise hydrophoben Charakters an Plasmaproteine (z.B. Serumalbumin), was die effiziente Diffusion durch die Poren der Dialysemembranen verhindert [12, 13], Daher spricht man auch von proteingebundenen urämischen Toxinen (protein-bound uremic toxins, PBUT). Im Schnitt sind 95 % des IS und pCS proteingebunden [14], was ihre geringe Abtrennungseffizienz bei Hämodialyseverfahren erklärt.
Eine Möglichkeit zur Verbesserung der Abtrennung von PBUTs ist die Zugabe von oralen oder intravenösen Ergänzungsmitteln. Intravenöse Ergänzungsmittel sollen die Toxine aus den Bindestellen der Plasmaproteine verdrängen und so ihren löslichen und durch Dialyse abtrennbaren Anteil erhöhen. Dies kann beispielsweise durch Ibuprofen ((A5)-2-(4- Isobutylphenyl)propionsäure) [15], Mesna (Natrium-2-sulfanylethansulfonat) [16] oder Acetylcystein [17] erreicht werden. Die effektive Abtrennung von pCS und IS wurde allerdings nur bei Zugabe von Ibuprofen untersucht. Orale Ergänzungsmittel wie das kohlenstoffbasierte AST- 120 (Kremezin®) adsorbieren die durch mikrobielle Prozesse im Darm entstehenden Toxine vor der Aufnahme in den Blutkreislauf [18] oder hemmen die Produktion entsprechender Toxine, wie das Synbiotikum NatuREN G [19], In einem systematischen Vergleich aller Studien zur Reduktion von protein-gebundenen urämischen Toxinen bis zum 02.01.2020 [20] zeigten die oben genannten Methoden eine Reduktionsrate für die Toxine IS and pCS von bis zu 44 % [18], Deutlich höhere Reduktionsraten zwischen 71 und 78 % wurden allerdings mit einer Kombination aus fraktionierter Plasmaseparation, Adsorption und Dialyse erreicht (FPAD) [20, 21], Dies zeigt, dass direkte Adsorption der proteingebundenen Toxine eine der effektivsten Methoden zur Toxinreduktion im Plasma der Patienten ist. Der Nachteil dieses Systems ist jedoch die aufwändige Plasmaseparation und Filtration zur Trennung des Albumins von den restlichen Bestandteilen des Blutes, die nicht in Kontakt mit den Adsorptionsmaterialien kommen dürfen [22], was einen routinemäßigen Einsatz sehr kostspielig macht.
Es mangelt nach wie vor an effektiven Adsorptionsmaterialien für PBUTs, die über eine ausreichende Bio- und Hämokompatibilität verfügen, um sie direkt mit dem Blut in Kontakt bringen und damit einfacher in die herkömmlichen Hämodialyse-Behandlungen integrieren zu können. Bisherige Mittel zur Adsorption von PBUTs verfügen nicht über eine Kombination aus a) hoher Affinität gegenüber den Toxinen und b) einer geeigneten Hämo- und Biokompatibilität. Aus dem Stand der Technik sind lediglich Untersuchungen zu gängigen Adsorptionsmaterialien wie zum Beispiel Aktivkohle [23], metallorganische Gerüstverbindungen [24] oder Zeolithe [25] bekannt, wobei die Studien sich jedoch hauptsächlich mit der Affinität dieser Materialien gegenüber den urämischen Toxinen befassen. Nur in wenigen Studien wird auch die Biokompatibilität der Materialien berücksichtigt [23],
In der DE 10 2016 108 017 Al sind geladene Proteincontainer zum Aufbau nanostrukturierter Materialien beschrieben, wobei die Proteincontainer aus Ferritin-Komplexen ausgebildet sind, in deren Inneren Nanopartikel eingeschlossen sein können. Solche Nanopartikel enthaltende Ferritin-Komplexe sollen u.a. auch in der Dialyse zur Entfernung hydrophober Toxine Verwendung finden können. Es sind jedoch keine entsprechenden Versuche hierzu beschrieben. In der WO 2004/001019 Al sind Nanopartikel beschrieben, die Proteinkäfige, beispielsweise bakterielle Ferritin-ähnliche Proteinkäfige, umfassen, die in ihrem Inneren mit mindestens einem Gastmaterial, zum Beispiel Metallen, beladen sind. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Adsorptionsmittel zur Abtrennung von proteingebundenen urämischen Toxinen, PBUTs, bei der Dialyse bereitzustellen, das eine möglichst hohe Affinität zu PBUTs aufweist, dabei aber über eine ausreichende Bio- und Hämokompatibilität verfügt, um direkt mit dem Blut in Kontakt gebracht werden zu können.
Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse bereit, wobei das Apoferritin-Nanopartikel Apoferritin-Untereinheiten umfasst, die zu dem Apoferritin-Nanopartikel zusammengesetzt einen inneren Hohlraum ausbilden, und wobei das Apoferritin-Nanopartikel in seinem inneren Hohlraum keine Nanopartikel enthält.
Es hat sich überraschend herausgestellt, dass Apoferritin-Nanopartikel gut zur Anwendung als Adsorptionsmittel für Toxine im Blut geeignet sind, zum Beispiel zur Abtrennung proteingebundener urämischer Toxine (PBUTs). Die Apoferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung weisen einen inneren Hohlraum (im Folgenden auch als Kavität bezeichnet) auf, in dem Toxine gebunden werden können, und weisen darüber hinaus eine hohe Bio- und Hämokompatibilität auf. Damit sind sie sehr gut geeignet, im Rahmen der Dialyse, beispielsweise der Hämodialyse, Toxine, beispielsweise PBUTs oder auch andere Toxine wie Schwermetalle, aus dem Blut zu entfernen. Sie können daher beispielsweise vorteilhaft zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung (CNK) und/oder zur Linderung der Folgen einer chronischen Nierenerkrankung (CNK) eingesetzt werden. Die Proteinhülle der Apoferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung weist Kanäle bzw. Poren auf, durch die kleine Moleküle wie beispielsweise PBUTs ins Innere des Partikels gelangen können, während größere Makromoleküle wie Protein oder Zellen zurückgehalten werden. Die Affinitiät der Ferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung zu den zu bindenden Toxinen kann gezielt eingestellt und optimiert werden, beispielsweise indem die Aminosäuresequenz von mindestens einer der Untereinheiten im Bereich des inneren Hohlraums verändert wird, so dass beispielsweise eine geeignete Anzahl hydrophober Aminosäurereste oder eine geeignete Mischung aus hydrophoben und hydrophilen Aminosäureresten vorhanden ist, oder indem ein oder mehrere Aminosäurereste mit chemischen Gruppen funktionalisiert werden. Weiterhin kann der Stofftransport in den Ferritin-Nanopartikel durch Vergrößerung oder Änderung der Oberflächenladung im Bereich der Poren verbessert werden, beispielsweise durch gezielten Austausch sterisch anspruchsvoller oder geladener Aminosäuren mit kleineren hydrophoben Aminosäuren. Die innere Oberfläche und der Bereich der Poren der Nanopartikel (Proteinkäfige) kann somit durch Sequenzmodifikation oder chemische Funktionalisierung verändert werden, um die Affinität gegenüber Toxinen zu erhöhen und/oder den Transport von Toxinen in die Nanopartikel zu erleichtern, ohne den Zusammenbau oder die Biokompatibilität zu beeinträchtigen. Die Proteinkäfige können darüber hinaus auch zu einem wohldefinierten kristallinen Material mit gleichmäßig verteilten Lösungsmittelkanälen assembliert werden. Dies gewährleistet eine hohe Reinheit des Materials, erleichtert die Handhabung sowie den Einsatz als Sorptionsmaterial, und ist auch hilfreich für die Materialcharakterisierung.
Unter „Ferritin“ (abgekürzt „Ftn“) wird ein globulärer Proteinkomplex (Sphäroprotein) verstanden, der aus 24 Protein-Untereinheiten aufgebaut ist, die einen hohlen Nanokäfig bilden, und der natürlicherweise Eisen bindet. Die Begriffe „Apoferritin“ oder „Apoferritin- Nanopartikel“ beziehen sich auf den nicht an Eisen gebundenen Proteinkomplex. Der Proteinkomplex weist einen inneren Hohlraum von etwa 6-8 nm Durchmesser auf, während der äußere Durchmesser etwa 12-13 nm beträgt (s. z.B. [28], [29]). Apoferritin kann aus identischen Untereinheiten zusammengesetzt sein, zum Beispiel ausschließlich aus der so genannten schweren Kette (H-Kette), oder aus variierenden Anteilen einer leichten (L-Kette) und einer schweren Kette (H-Kette). Die H-Kette (abgekürzt hFTN-H, HFt oder FTH) von menschlichem Ferritin wird vom FTHl-Gen kodiert und ist ein natürlicherweise etwa 21 kDa großes und 183 Aminosäuren umfassendes Protein (s. UniProtKB Nr. P02794, 2007-01-23 v2; NCBI NP 002023.2). Die leichte L-Kette (abgekürzt hFTN-L, LFt oder FTL) von menschlichem Ferritin wird vom FTL-Gen kodiert und ein natürlicherweise etwa 19,5 kDa großes und 175 Aminosäuren umfassendes Protein (s. UniProtKB Nr. P02792, 2007-01-23 v2; NCBI NP_000137.2). Sowohl die leichte Kette als auch die schwere Kette weisen eine Tertiär Struktur mit einem Bündel aus vier alpha-Helices (A, B, C und D) auf, wobei die B- und C-Helix über eine aus 18 Aminosäuren bestehende nicht-helikale Schlaufe (BC-Loop) miteinander verbunden sind. Darüber hinaus ist am C-Terminus eine fünfte alpha-Helix (E) vorhanden, die in den Hohlraum ragt. Der N-Terminus sowie die A- und C-Helix liegen auf der Außenseite des Ferritins, während die B- und D-Helix zum Inneren des Ferritins gerichtet sind. Ferritin weist Kanäle bzw. Poren in seiner Proteinhülle auf, welche den inneren Hohlraum mit der äußeren Umgebung verbinden ([28]). Dabei werden an Stellen, an denen aufgrund der räumlichen Anordnung der Apoferritin-Untereinheiten jeweils drei Apoferritin-Untereinheiten aufeinanderstoßen, Dreifachkanäle (threefold channels, triple axis channels), an Stellen, an denen jeweils vier Apoferritin-Untereinheiten aufeinanderstoßen, Vierfachkanäle (fourfold channels, quadruple axis channels) gebildet (s. z.B. [28]). Ein aus 24 Untereinheiten zusammengesetztes Apoferritin-Nanopartikel umfasst in der Regel 8 Dreifachkanäle und 6 Vierfachkanäle (s. z.B. [28]).
Die Begriffe „humanes H-Kette-Ferritin“ oder „human heavy chain ferritin“, abgekürzt HuHF, beziehen sich auf ein humanes Ferritin, dessen Untereinheiten ausschließlich aus der menschlichen schweren Kette bestehen, und nicht aus einer Mischung aus einer schwereren (H- Kette) und leichteren Kette (L-Kette). Der Begriff umfasst auch Varianten mit H-Ketten, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber der Wildtypsequenz der H-Kette (s. UniProtKB Nr. P02794, 2007-01-23 v2; NCBI NP_002023.2 für die Aminosäuresequenz der schweren Kette des humanen Ferritins) modifiziert sind.
Der Begriff „Toxin-Bindemittel“ in Bezug auf die Apoferritin-Nanopartikel bedeutet, dass die Apoferritin-Nanopartikel ein Toxin in ihrem Hohlraum, d.h. der inneren Kavität, binden, so dass es an das Apoferritin-Nanopartikel gebunden aus beispielsweise einer Körperflüssigkeit, z.B. Blut, entfernt werden kann. Die Bindung zwischen dem Toxin und dem Apoferritin- Nanopartikel ist dabei bevorzugt nichtkovalent, und kann beispielsweise durch hydrophobe Wechselwirkungen, elektrostatische Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen zustande kommen. Als Toxin kommen beispielsweise proteingebundene urämische Toxine wie Indoxylsulfat (IS) und para-Kresylsulfat (pCS), organische Schwermetallverbindungen, Schwermetallionen und andere chemische Stoffe und Verbindungen in Frage, die Eigenschaften aufweisen, die eine Bindung vorzugsweise über nichtkovalente Bindung erlauben. Auch eine kovalente Bindung ist jedoch nicht ausgeschlossen. Die Begriffe „proteingebundene urämische Toxine“ oder „proteingebundene Urämietoxine“, PBUTs, bezieht sich auf in der Regel schlecht wasserlösliche (hydrophobe) chemische Verbindungen, die im Serum an Protein gebunden vorliegen. Beispiele für PBUTs sind Indoxylsulfat (IS), para-Kresylsulfat (p-Kresylsulfat, auch p-Cresylsulfat, pCS), Phenylacetat (PheAc, PhAc), p-Hydroxyhippursäure, Kynurenin, Kynureninsäure, Indol-3-essigsäure, 3- Carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropionsäure (CMPF) und p-Kresylglucuronid (s. z.B. [37]; „Uremic Solutes Database“, „List of uremic solutes“, https://database. uremic- toxins. org/soluteList.php?sortkey=class&direction=asc, abgerufen am 25.07.2022, die 33 PBUTs auflistet).
Unter „Hämodialyse“ wird eine extrakorporale Behandlung des Blutes verstanden, bei der Stoffwechselabfallprodukte (z.B. Harnstoff, Harnsäure, Kreatinin, überschüssiges Phosphat etc.) und/oder überschüssige Flüssigkeit aus dem Blut entfernt werden. Hämodialyse wird regelmäßig eingesetzt, wenn die Nieren einer Person nicht mehr ausreichend funktional sind, zum Beispiel im Fall einer chronischen Nierenerkrankung (CNK). Der Ausdruck „zur Anwendung bei der Hämodialyse“ schließt die Anwendung im Rahmen einer Hämapharese, insbesondere eine Vollblutapharese, mit ein. Unter „Hämapharese“ wird ein Verfahren zur extrakorporalen Entfernung von bestimmten Blutbestandteilen oder von pathogenen Substanzen, Mikroorganismen oder dergleichen aus Blut verstanden (s. z.B. „Standard der Therapeutischen Apherese 2019, 29.03.2019, Deutsche Gesellschaft für Nephrologie).
Der Begriff „chronische Nierenerkrankung (CNK)“, englisch „chronic kidney disease“ (CKD) bezieht sich auf eine chronische Erkrankung der Niere, die eine allmähliche und länger (>3 Monate) andauernde Beeinträchtigung der Nierenfunktion bis hin zu einer dauerhaften Niereninsuffizienz oder vollständigem Nierenversagen beinhaltet (ICD-10-Code N18). Der Begriff bezieht sich hier insbesondere auf eine chronische Nierenerkrankung im Stadium 5 (ICD-10-Code N18.5), bei dem mit einer glomeruläre Filtrationsrate (GFR) von <15 mL/min ein Nierenersatzverfahren zur Blutreinigung benötig wird. Der Begriff „chronische Niereninsuffizienz“ wird hier gegebenenfalls synonym zu dem Begriff „chronische Nierenerkrankung“ verwendet.
Der Ausdruck, wonach das Apoferritin-Nanopartikel „in seinem inneren Hohlraum keine Nanopartikel“ enthält, bedeutet, dass der innere Hohlraum der Apoferritin-Nanopartikel leer ist, d.h. keine separaten Nanopartikel einschließt, die beispielsweise zur Bindung von Toxinen ausgestaltet sind.
Der Begriff „im Bereich des inneren Hohlraums“ in Bezug auf eine Apoferritin-Untereinheit bedeutet hier den Teil der Apoferritin-Untereinheit, insbesondere die Aminosäurereste dieser Apoferritin-Untereinheit, der zum inneren Hohlraum des Apoferritin-Nanopartikels gerichtet ist. Es handelt sich vor allem um die B-Helix (bei der schweren Kette des humanen Apoferritin die Aminosäuren 50-77), die D-Helix (bei der schweren Kette des humanen Apoferritin die Aminosäuren 128-159), die E-Helix (bei der schweren Kette des humanen Apoferritin die Aminosäuren 165-174) und die auf die E-Helix in Richtung C-Terminus folgende C-terminale Region (175-183).
Der Begriff „im Bereich eines Dreifachkanals“ in Bezug auf eine Apoferritin-Untereinheit bedeutet hier den Teil der Apoferritin-Untereinheit, insbesondere die Aminosäurereste dieser Apoferritin-Untereinheit, die sich in einem assemblierten Apoferritin-Nanopartikel an einem Dreifachkanal des Apoferritin-Nanopartikels befinden, oder Aminosäurereste, die einen unmittelbaren Einfluss auf den Transport eines Toxins in das Innere des Apoferritin- Nanopartikels haben, d.h. deren Austausch zu einer Erleichterung des Toxintransports in das Innere des Apoferritin-Nanopartikels führt. Es kann sich beispielsweise um die Aminosäuren am Ende der C-Helix und Anfang der D-Helix handeln (bei der schweren Kette des humanen Apoferritin beispielsweise die Aminosäuren 118 bis 141, bevorzugt 120-140). Der Begriff schließt auch Aminosäuren an der Außenseite der Apoferritin-Untereinheit ein. „Erleichterter Toxintransport“ (oder auch „verbesserter Toxintransport“) bedeutet hier, dass bei Inkubation mit einer vorgegebenen Toxinkonzentration unter geeigneten Bedingungen innerhalb einer gegebenen Zeitspanne bei einem im Bereich des Dreifachkanals veränderten Apoferritin- Nanopartikel im Vergleich zu einem nicht im Bereich des Dreifachkanals veränderten Apoferritin-Nanopartikel eine größere Anzahl Toxinmoleküle in den Hohlraum gelangt. Anstelle des Begriffs „Dreifachkanal“ wird hier synonym gegebenenfalls auch der Ausdruck „Pore“ verwendet.
Der Begriff „im Bereich eines Vierfachfachkanals“ in Bezug auf eine Apoferritin-Untereinheit bedeutet hier den Teil der Apoferritin-Untereinheit, insbesondere die Aminosäurereste dieser Apoferritin-Untereinheit, die sich an einem Vierfachkanal des Apoferritin-Nanopartikels befinden. Im Bereich des Vierfachfachkanals befinden sich beispielsweise die Aminosäuren M 158, L 165, Y 168, L 169, H 173 (s. z.B. [41]). Der Begriff schließt Aminosäurereste der jeweiligen Untereinheit ein, die sich in einem assemblierten Apoferritin-Nanopartikel an einem Vierfachkanal des Apoferritin-Nanopartikels befinden, beispielsweise in einem assemblierten Apoferritin-Nanopartikel den Vierfachkanal auskleiden oder an den Öffnungen des Kanals liegen, oder Aminosäurereste, die einen unmittelbaren Einfluss auf die Gestalt, beispielsweise den Durchmesser, oder die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Kanals haben.
Die Begriffe „redesigntes Apoferritin-Nanopartikel“ oder „redesignte Apoferritin-Untereinheit“ werden hier in Zusammenhang mit einem Apoferritin-Nanopartikel oder einer Apoferritin- Untereinheit mit einer gegenüber der Wildtypsequenz geänderten Aminosäuresequenz verwendet. Der Begriff schließt ein Apoferritin-Nanopartikel oder eine Apoferritin-Untereinheit mit veränderter Aminosäuresequenz ein, bei denen ein Teil oder sämtliche der ausgetauschten Aminosäurereste zusätzlich mit chemischen Gruppen funktionalisiert sind.
Der Begriff „funktionalisiert“ bedeutet, dass an einen geeigneten Aminosäurerest, beispielsweise Cystein, eine zusätzliche chemische Gruppierung oder ein Verbindungsrest kovalent gebunden ist. Ein Beispiel ist ein Cysteinrest, an den über dessen Thiol-Gruppe (SH- Gruppe) ein N-Phenylacetamid-Rest gebunden ist.
Der Begriff „organischer Verbindungsrest“ bezieht sich auf kohlenstoffhaltige chemische Seitengruppen oder Moleküle, die kovalent gebunden sind, beispielsweise an einen Cysteinrest. Es kann sich um einen aliphatischen oder aromatischen Verbindungsrest, wobei die Begriffe hier nicht auf reine Kohlenwasserstoffverbindungen beschränkt zu verstehen sind, sondern auch heteroaliphatische oder heteroaromatische Verbindungsreste, d.h. Verbindungsreste mit Heteroatomen wie Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor oder Schwefel, einschließt. Unter einem „aromatischen Verbindungsrest“ wird jeder Verbindungsrest verstanden, der eine aromatische oder heteroaromatische Gruppierung aufweist. Unter einem „aliphatischen Verbindungsrest“ wird jeder aliphatische oder heteroaliphatische Verbindungsrest verstanden, d.h. jeder organische Verbindungsrest, der keine aromatische Gruppe enthält.
Der Begriff „aliphatischer Verbindungsrest“ umfasst cyclische oder acyclische lineare (geradkettige) oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffverbindungsreste, die keine aromatischen Reste sind. Unter dem Begriff „heteroaliphatischer Rest“ werden aliphatische Reste verstanden, in deren Kohlenstoffgerüst ein oder mehrere C-Atome durch Heteroatome ersetzt sind, beispielsweise Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor.
Der Begriff „aromatischer Verbindungsrest" (auch als „Aryl“ bezeichnet) bezieht sich auf chemische Gruppen mit Aromatizität, einschließlich mehrgliedriger aromatischer Einzelringgruppen und multicyclischer Systeme mit mindestens einem aromatischen Ring. Beispiele für aromatische Verbindungsreste (Arylgruppen) umfassen Benzyl und Phenyl. Unter dem Begriff „heteroaromatischer Verbindungsrest" (auch „Heteroaryl“) werden aromatische Verbindungsreste verstanden, in deren Kohlenstoffgerüst ein oder mehrere C-Atome durch Heteroatome ersetzt sind, beispielsweise Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor.
Der Begriff „Dialysator“ bezieht sich auf eine austauschbare Blutreinigungseinheit eines Dialysesystems. Ein Dialysator kann beispielsweise ein Hohlfasermembranmodul sein, bei dem biokompatible semipermeable Polymermembranen in Form von Hohlfasern in einem Gehäuse angeordnet sind, so dass beispielsweise Blut durch die Hohlfasern strömen und ein Dialysat durch das Innere des Gehäuses an den Außenseiten der Hohlfasem entlang (beispielsweise im Gegenstrom zum Blutstrom) strömen kann, und vorzugsweise niedermolekulare Verbindungen wie beispielsweise Salze, Protein- oder Nukleinsäurefragmente aus dem Blut über die Membran hindurch in das Dialysat diffundieren und damit abtransportiert werden können.
Die Angabe eines Bereichs wie beispielsweise „1-10“ ist so zu verstehen, dass auch jeder Zwischenwert offenbart ist. Bei einer Angabe, die nur ganze Zahlen betreffen kann, wie beispielsweise eine Anzahl von Atomen, bedeutet dies auch, dass nur ganze Zahlen offenbart sind. Jeder engere Bereich aus einem breiteren Bereich ist durch Angabe des breiteren Bereichs ebenfalls offenbart, wobei der engere Bereich auch Bereiche umfasst, die keinen der Grenzwerte des breiteren Bereichs umfassen (z.B. einen Bereich von 2-5 aus einem Bereich von 1-10).
Aminosäuren werden hier gegebenenfalls in Form ihres Dreibuchstaben- oder Einbuchstabencodes angegeben. Eine Liste von Aminosäuren mit den entsprechenden Codes ist in der folgenden Liste wiedergegeben:
Aminosäure Dreibuchstabencode Einbuchstabencode
Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asparagin Asn N
Asparaginsäure Asp D
Cystein Cys C
Glutamin Gin Q
Glutaminsäure Glu E
Glycin Gly G
Histidin His H
Isoleucin Ile I
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Phenylalanin Phe F Prolin Pro P
Serin Ser S
Threonin Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosin Tyr Y
Valin Val V
Mutationen in Proteinsequenzen in Form von Aminosäureaustauschen sind im Format X1PX2 angegeben, wobei Xi die ursprünglich an einer Position P stehende und ausgetauschte Aminosäure (im Einbuchstabencode), X2 die nach dem Austausch anstelle der ursprünglichen Aminosäure an derselben Position stehende Aminosäure (im Einbuchstabencode) und P die Position innerhalb der Aminosäuresequenz, an der der Austausch vorgenommen wurde, bezeichnet.
Das Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse kann in Bereich des inneren Hohlraums eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweisen, beispielsweise Cysteinreste an Positionen aufweisen, an denen in der Wildtypsequenz kein Cysteinrest vorhanden ist. Die Cysteinreste können weiter funktionalisiert sein. Alternativ oder auch zusätzlich kann das Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse im Bereich eines Dreifachkanals oder Vierfachkanals eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweisen, beispielsweise einen Aminosäureaustausch, der zu einem erleichterten Transport eines Toxins in den Hohlraum des Apoferritin-Nanopartikels führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist mindestens eine der Apoferritin-Untereinheiten des Apoferritin-Nanopartikels im Bereich des inneren Hohlraums eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz auf. Für den Fall, dass das erfindungsgemäße Apoferritin-Nanopartikel aus leichter (L) und schwerer (H) Kette zusammengesetzt ist mit der generellen Struktur HnLm, wobei n und m Ganzzahlen sind und n + m = 24 ist, bedeutet dies, dass mindestens eine der Ketten, vorzugsweise eine der schweren Ketten, eine gegenüber der jeweiligen Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweist. Ist die mindestens eine der Apoferritin-Untereinheiten mit geänderter Aminosäuresequenz eine Untereinheit aus der schweren Kette, ist diese gegenüber der Wildtypsequenz der schweren Kette geändert, ist die mindestens eine der Apoferritin-Untereinheiten mit geänderter Aminosäuresequenz eine Untereinheit aus der leichten Kette, ist diese gegenüber der Wildtypsequenz der leichten Kette geändert. Im Falle eines humanen Apoferritin-Nanopartikels, d.h. eines Apoferritin- Nanopartikels aus den jeweiligen humanen Protein-Untereinheiten, ist die entsprechende Referenz die Wildtypsequenz der jeweiligen humanen Untereinheit (s. UniProtKB Nr. P02794, 2007-01-23 v2 oder NCBI NP_002023.2 für die schwere Kette, UniProtKB Nr. P02792, 2007- 01-23 v2 oder NCBI NP_000137.2 für die leichte Kette). Die Wildtypsequenz der humanen schweren Kette ist in der vorliegenden Anmeldung auch als Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, die Wildtypsequenz der humanen leichten Kette auch als Sequenz mit der SEQ ID NO: 2 wiedergegeben, wobei hier, anders als bei den oben erwähnten Datenbank- Sequenzen das N- terminale Methionin weggelassen wurde, da es nicht Teil der Sequenz des fertigen Proteins ist.
SEQ ID NO: 1 : Schwere Kette des humanen Ferritins. TTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES
SEQ ID NO: 2: Leichte Kette des humanen Ferritins.
SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEK REGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLH ALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLK HD
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse ist die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz dahingehend im Bereich des Hohlraums in ihrer Aminosäuresequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz geändert, dass das Apoferritin-Nanopartikel im Vergleich zu einem Apoferritin-Nanopartikel aus Apoferritin-Untereinheiten mit gegenüber der Wildtypsequenz unveränderter Aminosäuresequenz eine höhere Bindungsaffinität gegenüber einem Toxin aufweist. Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels ist die Änderung der Aminosäuresequenz bei mindestens einer der Apoferritin-Untereinheiten im Bereich des inneren Hohlraums vorzugsweise so ausgestaltet, dass die Bindungsaffinität eines Apoferritin- Nanopartikels mit der in seiner Aminosäuresequenz geänderten mindestens einen Untereinheit gegenüber einem aus Blut zu entfernenden Toxin höher ist als bei einem Apoferritin- Nanopartikel mit Untereinheiten, deren Aminosäuresequenz gegenüber der Wildtypsequenz unverändert ist. Die Änderung kann beispielsweise eine Erhöhung der Anzahl hydrophober Aminosäurereste vorsehen. Beispiele für Aminosäuren mit einem hydrophoben Aminosäurerest sind Alanin, Valin, Methionin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan und Phenylalanin. Es kann zur Bindung bestimmter Toxine aber auch vorteilhaft sein, einen höheren Anteil polar neutraler, saurer oder basischer Aminosäuren bei der mindestens einen Apoferritin-Untereinheit vorzusehen. Beispiele für Aminosäuren mit polaren/neutralen Aminosäureresten sind Tyrosin, Threonin, Glutamin, Glycin, Serin, Cystein und Asparagin. Beispiele für saure Aminosäuren sind Glutaminsäure und Asparaginsäure. Beispiele für basische Aminosäuren sind Lysin oder Arginin. Weiterhin kann es auch vorteilhaft sein, zur Bindung bestimmter Toxine eine bestimmte Mischung und/oder Verteilung von Aminosäuren mit hydrophoben und polaren/neutralen Aminosäureresten vorzusehen. Die Bindungsaffinität gegenüber Toxinen, beispielsweise PBUTs, von entsprechend veränderten Apoferritin-Nanopartikeln gegenüber unveränderten Apoferritin-Nanopartikeln kann vom Fachmann leicht ermittelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse weist die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums mindestens einen im Vergleich zur Wildtypsequenz zusätzlichen Cysteinrest oder einen Cysteinrest an einer anderen Position in der Sequenz auf, wobei die mindestens eine Apoferritin-Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz durch kovalente Bindung eines organischen Verbindungsrestes, z.B. eines aliphatischen oder aromatischen Verbindungsrestes, an den Cysteinrest funktionalisiert oder funktionalisierbar ist. Eine Funktionalisierung dient bevorzugt zur Erhöhung der Bindungsaffinität des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels gegenüber aus dem Blut zu entfernenden Toxinen, beispielsweise proteingebundenen urämischen Toxinen.
Besonders bevorzugt sind bei der mindestens einen Apoferritin-Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz etwaige natürlicherweise im Bereich des inneren Hohlraums vorhandene Cysteinreste durch andere Aminosäurereste, beispielsweise durch Alaninreste, ersetzt. Das erlaubt eine gezielte Positionierung der einzuführenden Cysteinreste und damit der Stellen, an denen die erfindungsgemäße Apoferritin-Untereinheit funktionalisiert werden kann. Bevorzugt werden bei der mindestens einen Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz daher etwaige im Bereich des inneren Hohlraums vorhandene Cysteinreste jeweils gegen einen anderen Aminosäurerest, z.B. einen Alaninrest, ersetzt und es wird mindestens ein Cysteinrest im Bereich des inneren Hohlraums an einer Position eingeführt, an dem im nativen Protein kein Cysteinrest vorhanden ist.
Besonders bevorzugt weist die mindestens eine Apoferritin-Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz bei dem erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse im Vergleich zur Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums zwei, drei oder vier Cysteinreste auf, an die jeweils ein organischer Verbindungsrest kovalent gebunden ist oder gebunden werden kann. Bevorzugt ist bei dieser Ausführungsform, dass im Bereich des inneren Hohlraums drei oder vier Cysteinreste vorhanden sind, die jeweils identisch oder unterschiedlich funktionalisiert oder funktionalisierbar sind. Für den Fall, dass alle 24 Untereinheiten eines erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels auf diese Weise funktionalisiert oder funktionalisierbar sind, ergibt sich damit eine Zahl von 72-96 Funktionalisierungsstellen, d.h. Stellen innerhalb des Apoferritin-Nanopartikels, die funktionalisierbar oder funktionalisiert sind. Wie oben beschrieben, sind bevorzugt etwaige Cysteinreste des nativen Proteins im Bereich des inneren Hohlraums jeweils ersetzt durch beispielsweise Alaninreste, und zumindest einer der eingeführten Cysteinreste ist an einer Position eingeführt, an der im nativen Protein kein Cysteinrest vorhanden ist. Die in einem erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel vorhandenen Funktionalisierungsstellen können identisch oder verschieden funktionalisiert sein, d.h. mit jeweils denselben oder unterschiedlichen chemischen Gruppen funktionalisiert sein.
Bei dem organischen Verbindungsrest kann es sich um einen hydrophoben, hydrophilen oder einen amphiphilen Verbindungsrest handeln. Hydrophobe Verbindungsreste sind für die Bindung von beispielsweise hydrophoben Urämietoxinen bevorzugt. Auch zur Bindung von hydrophoben Urämietoxinen kann es jedoch vorteilhaft sein, einen amphiphilen Verbindungsrest für die Funktionalisierung vorzusehen, oder unterschiedliche Cysteinreste im Bereich des inneren Hohlraums mit unterschiedlichen Verbindungsresten zu funktionalisieren, z.B. mit einer Mischung aus hydrophilen und hydrophoben Verbindungsresten. Die Einstellung der Hydrophobizität oder Hydrophilizität eines Verbindungsrestes ist dem Fachmann bekannt und kann gegebenenfalls durch Routineversuche ermittelt werden. Beispielsweise kann die Hydrophobizität eines Verbindungsrestes durch die Größe bzw. Länge eines Kohlenwasserstoffrestes beeinflusst werden, die Hydrophilizität durch Vorsehen polarer bzw. geladener Reste.
Bei dem organischen Verbindungsrest kann es sich beispielsweise um eine Acetamidyl- Verbindung der allgemeinen Struktur -CH2-C(0)-NH-R handeln. Der Rest R kann ein aliphatischer, heteroaliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Rest sein. Im Falle aliphatischer und heteroaliphatischer Reste ist eine maximale Kettenlänge, d.h. eine maximale Anzahl von den Verbindungsrest zusammensetzenden Atomen, von 35 Atomen bevorzugt, besonders bevorzugt eine maximale Kettenlänge von 34, 33, 32, 31 oder 30 Atomen. Im Falle aromatischer und heteroaromatischer Reste sind elektronenarme aromatische Systeme bevorzugt, die effektive 7t-7t Wechselwirkungen mit elektronenreichen aromatischen Systemen der Toxine erlauben. Beispiele für elektronenarme aromatische Reste sind zum Beispiel 3,4,5- trinitrophenyl-, 3,4,5-trihalogenyl- (z.B. 3,4,5-trifluorophenyl-) oder 3,4,5- tris(trihalogenylmethyl)phenylrest (z.B. 3,4,5-tris(trifluoromethyl)phenylreste). Beispiele für elektronenarme heteroaromatische Gruppen sind Pyridin, Chinolin oder Isochinolin, deren elektronenarmer Charakter weiter mit elektronenziehenden Substituenten wie Nitrogruppen, tertiären Aminogruppen, positiv geladenen Gruppen oder Halogenatomen verstärkt werden kann. Bei aromatischen und heteroaromatischen Resten ist eine Molekülgröße von maximal 45, vorzugsweise maximal 44, 43, 42, 41 oder 40 Atomen bevorzugt, d.h. Reste, die aus maximal 45, vorzugsweise maximal 44, 43, 42, 41 oder 40 Atomen, einschließlich Heteroatomen, zusammengesetzt sind. Weiter bevorzugt ist bei aromatischen und heteroaromatischen Resten eine Molekülgröße von maximal 39 Atomen, besonders bevorzugt maximal 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 oder 30 Atomen. Da der überwiegende Anteil der PBUTs unter physiologischen Bedingungen eine negative Formalladung trägt, sind amphiphile Verbindungsreste mit einer Kombination aus hydrophoben Gruppen mit positiv geladenen Gruppen bevorzugt. Beispiele für unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Gruppen sind primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre Amine. Im Falle von heteroaliphatischen Verbindungen ist es bevorzugt, wenn diese Gruppen in der Kette enthalten sind. Abhängig von der Geometrie des zu bindenden Toxins könnten diese Gruppen auch alternierend in der Kette eingebaut werden, wobei bevorzugt eine maximale Kettenlänge von 35 Atomen, besonders bevorzugt 34, 33, 32, 31 oder 30 Atomen, nicht überschritten wird. Im Falle aromatischer und heteroaromatischer Reste sind die geladenen Gruppen bevorzugt in geeigneter Symmetrie zum aromatischen oder heteroaromatischen System angeordnet. Auch hier ist es bevorzugt, wenn dabei eine maximale Molekülgröße des Verbindungsrestes nicht überschritten wird, bevorzugt eine Molekülgröße von 45, vorzugsweise 44, 43, 42, 41 oder 40 Atomen, weiter bevorzugt eine Molekülgröße von 39 Atomen, besonders bevorzugt 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 oder 30 Atomen nicht überschritten wird. Für Toxine wie das -Kresylsulfat oder Phenylessigsäure eignen sich zum Beispiel l-amino-2 -phenylethyl- oder l,l-diamino-2-phenylethylreste. Bevorzugte Verbindungsreste zur Bindung proteingebundener Urämietoxine, die kovalent an den mindestens einen zusätzlichen oder an einer anderen Position in der Sequenz angeordneten Cysteinrest gebunden werden können oder gebunden sind, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-phenylacetamidyl, N-decylacetamidyl, N-( l-amino-2 -phenylethyl)acetamidyl, N-( l-amino-2 -phenylpropyl)acetamidyl, N-( l-amino-2 -phenylbutyll)acetamidyl, N-(l, 1- di ami no-2-phenyl ethyl )acetamidyl, N-(l, l-diamino-2-phenylpropyl)acetamidyl, N-(l, 1- diamino-2-phenylbutyll)acetamidyl, N-(3,4,5-tris(trifluoromethyl)phenyl)acetamidyl, N-(3,4,5- trinitrophenyl)acetamidyl, N-(l-amino-2-(3,4,5-trinitrophenyl)ethyl)acetamidyl und N-(2- (heptylamino)ethyl)acetamidyl. Die genannten Verbindungen werden bevorzugt über die Acetamid-Gruppe an den Cysteinrest kovalent gebunden. Hierzu können halogenierte Acetamid-Derivate eingesetzt werden, die mit der Thiol-Gruppe des Cysteins reagieren. Weiterhin ist es selbstverständlich auch möglich, andere geeignete Kopplungsgruppen, beispielsweise Haloalkyl- oder Maleimid-Derivate, für die Bindung an die Thiol-Gruppe zu verwendet.
Bei dem organischen Verbindungsrest kann es sich beispielsweise auch um einen Chelatbildner handeln, der Schwermetalle wie beispielsweise Blei, Antimon, Arsen, Cadmium, Nickel, Quecksilber, Thallium oder Uran, bindet. Beispiele für Chelatbildner (Komplexbildner) sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Dimercaptobernsteinsäure (DMSA) oder Dimercaptopropansulfonsäure (DMPS). Der Begriff „ Schwerin etall“ schließt Schwermetallionen ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse ist die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz - alternativ oder zusätzlich zu einer Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums - dahingehend im Bereich eines Dreifachkanals in ihrer Aminosäuresequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz geändert, dass der Transport eines Toxins in den Hohlraum des Apoferritin- Nanopartikels durch den Dreifachkanal gegenüber einem Apoferritin-Nanopartikel mit unveränderter Aminosäuresequenz erleichtert ist. Bei dieser Ausführungsform kann die Aminosäuresequenz mindestens einer Apoferritin-Untereinheit gegenüber der Wildtypsequenz lediglich im Bereich eines Dreifachkanals geändert sein, beispielsweise um lediglich den Transport in das Apoferritin-Nanopartikel hinein zu erleichtern, ohne dass auch Änderungen an der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums vorhanden sind, oder die Aminosäuresequenz mindestens einer Apoferritin-Untereinheit kann gegenüber der Wildtypsequenz auch im Bereich eines Dreifachkanals geändert sein, zusätzlich zu einer Änderung an der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums. Es ist bevorzugt, dass an mindestens zwei, vorzugsweise drei einen Dreifachkanal ausbildenden Apoferritin- Untereinheiten mindestens eine Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des Dreifachkanals vorhanden ist. Beispielsweise können jeweils eine, zwei, drei oder mehr, beispielsweise bis zu 12, Aminosäureänderungen an einer, zwei oder drei der einen Dreifachkanal ausbildenden Apoferritin-Untereinheiten vorhanden sein. Bei Änderungen an zwei oder drei der Apoferritin-Untereinheiten können diese bei jeder Untereinheit jeweils identisch oder verschieden sein, sind aber vorzugsweise identisch. Besonders bevorzugt ist ein Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse, das aus identischen Untereinheiten zusammengesetzt ist, welche jeweils identische Änderungen an der Aminosäuresequenz gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich eines Dreifachkanals aufweisen, beispielsweise mindestens an einer, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf oder zwölf Positionen von Aminosäuren im Bereich des Dreifachkanals. Wie bereits erwähnt, können diese Änderungen allein oder auch in Kombination mit einer Änderung von Aminosäuren im Bereich des inneren Hohlraums vorliegen.
Bei dem im Rahmen einer Hämodialyse mit Hilfe des erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikels zu bindenden Toxin handelt es sich bevorzugt um ein proteingebundenes urämisches Toxin, das bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Indoxyl sulfat, para-Kresyl sulfat, Phenylacetat und p-Hydroxyhippursäure.
Bei dem erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse weisen vorzugsweise mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten eine gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums und/oder im Bereich eines Dreifachkanals und/oder im Bereich eines Vierfachkanals geänderte Aminosäuresequenz auf. Vorzugsweise sind die Untereinheiten, aus denen das erfindungsgemäße Apoferritin-Nanopartikel zusammengesetzt ist, hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz identisch. Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Apoferritin- Nanopartikel wie oben beschrieben gemäß einer Ausführungsform durch Einführung von Cysteinresten, die mit geeigneten chemischen Verbindungsresten funktionalisiert sind, geändert, wobei bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten in gleicher Weise modifiziert und funktionalisiert sind. In einer Ausführungsform, bei der das Apoferritin-Nanopartikel im Bereich eines Dreifachkanals eine geänderte Aminosäuresequenz aufweist, sei es allein oder in Kombination mit einer geänderten Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums, weisen vorzugsweise mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten eine gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich eines Dreifachkanals geänderte Aminosäuresequenz auf.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse weisen vorzugsweise mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten eine gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums und/oder im Bereich eines Dreifachkanals und/oder im Bereich eines Vierfachkanals geänderte Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 13-24. Es ist dabei bevorzugt, dass die Untereinheiten mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz jeweils dieselbe Sequenz aufweisen. Wenn beispielsweise ein erfindungsgemäßes Apoferritin- Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse 24 Untereinheiten mit einer gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums und/oder im Bereich eines Dreifachkanals und/oder im Bereich eines Vierfachkanals geänderten Aminosäuresequenz aufweist, haben die 24 Untereinheit bevorzugt dieselbe Aminosäuresequenz, beispielsweise die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 24. Bevorzugt haben die Untereinheiten eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, oder SEQ ID NO: 24.
Es ist besonders bevorzugt, dass das Apoferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung ausschließlich aus Untereinheiten bestehend aus der schweren Kette, besonders bevorzugt der humanen schweren Kette zusammengesetzt ist. Die Kette kann hinsichtlich der Aminosäuresequenz auch der an der Außenseite liegenden Proteinbereiche (z.B. die Helizes A und C) gegenüber der Wildtypsequenz geändert sein, beispielsweise zur Herstellung einer bestimmten äußeren Ladung, beispielsweise einer negativen oder positiven Ladung. Darüber hinaus ist es besonders bevorzugt, dass das Apoferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung keine Cysteinreste auf der Außenseite der Nanopartikel aufweist, sondern gegebenenfalls ausschließlich im inneren Hohlraum, so dass eine Funktionalisierung mit einem organischen Verbindungsrest ausschließlich an den Cysteinresten im inneren Hohlraum erfolgt. Eine Funktionalisierung kann erfolgen, indem das Apoferritin-Nanopartikel unter geeigneten Bedingungen in seine Untereinheiten disassembliert wird und die einzelnen Untereinheiten anschließend funktionalisiert werden. Nach Wiederherstellung der ursprünglichen Bedingungen bilden die Untereinheiten von selbst wieder das Apoferritin-Nanopartikel zurück. Geeignete Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in [31], [38], [39] sowie weiter unten beschrieben.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung auch eine Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse, umfassend mehrere erfindungsgemäße Apoferritin- Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach dem oben beschriebenen ersten Aspekt der Erfindung. Eine derartige Zusammensetzung kann vorteilhaft als ein Adsorptionsmaterial zur Bindung von Toxinen im Blut eingesetzt werden, beispielsweise zur Bindung von proteingebundenen urämischen Toxinen (PBUTs) oder zur Bindung von Schwermetallen.
Bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse können die mehreren erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse in amorpher Form oder in einer definierten Anordnung, beispielsweise in einer kristallinen Form, vorliegen. Unter einer in amorpher Form vorliegenden Zusammensetzung von Apoferritin-Nanopartikeln wird hier eine Zusammensetzung aus Apoferritin-Nanopartikeln verstanden, bei der die Apoferritin- Nanopartikel nur unter Ausbildung einer ungeordneten bzw. unbestimmten, insbesondere nichtkristallinen, Struktur untereinander verbunden sind. Eine definierte, z.B. kristalline, Anordnung von erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikeln kann auf eine dem Fachmann bekannte Weise erreicht werden (s. z.B. [31]). Im Falle einer Anordnung in zum Beispiel kristalliner Form sind die in der Anordnung enthaltenen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse vorzugsweise untereinander quervernetzt. Ein solches Adsorptionsmaterial weist erfindungsgemäße Apoferritin- Nanopartikel als Proteinkäfige auf, die zu einem definierten kristallinen Material mit gleichmäßig verteilten Lösungsmittelkanälen assembliert sind. Dies ist nicht nur für vorteilhaft zur Erzielung einer hohen Reinheit des Materials, sondern auch für die Handhabung beim Einsatz als Sorptionsmaterial vorteilhaft. Beispielsweise lassen sich die untereinander zu einem kristallinen Gebilde vernetzten Apoferritin-Nanopartikel als Ganzes handhaben und beispielsweise von Blut trennen. Die Form des Kristalls kann beispielsweise an die Form des Hohlraums einer Sorptionskartusche angepasst werden. In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können die mehreren erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse beispielsweise in Wasser oder einer wässrigen Lösung, beispielsweise einer geeigneten wässrigen Pufferlösung, vorliegen. Die wässrige Lösung ist vorzugsweise eine biokompatible bzw. pharmazeutisch akzeptable Lösung, in der die Nanopartikel stabil sind. In einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Sorptionskartusche, die in ihrem Inneren mehrere Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach dem ersten Aspekt der Erfindung oder eine Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach dem zweiten Aspekt der Erfindung umfasst. Eine erfindungsgemäße Sorptionskartusche kann beispielsweise so ausgestaltet sein, dass sie in ein Dialysesystem integrierbar ist. Dazu weist die Sorptionskartusche vorzugsweise einen Eingang für die Zufuhr von Blut und einen Ausgang zur Ausfuhr des Blutes auf.
Vorzugsweise ist die Sorptionskartusche so ausgestaltet, dass die mehreren Apoferritin- Nanopartikel, oder die mehrere Apoferritin-Nanopartikel umfassende Zusammensetzung, in der Sorptionskartusche durch geeignete Mittel in der Sorptionskartusche zurückgehalten werden. Beispielsweise können die mehreren Apoferritin-Nanopartikel oder die Zusammensetzung in einem ersten Kompartiment innerhalb der Sorptionskartusche enthalten sein, das über eine oder mehrere Membranen von einem zweiten Kompartiment innerhalb der Sorptionskartusche getrennt ist, wobei die Membran oder die Membranen für ungebundene Toxinmoleküle und/oder für Proteine mit daran gebundenen Toxinmolekülen durchlässig sind, nicht jedoch für die Apoferritin-Nanopartikel. Blut, das von Toxinmolekülen, z.B. PBUTs, gereinigt werden soll, kann beispielsweise durch das zweite Kompartiment geleitet werden. Im Blut vorhandene Toxinmoleküle können, in freier Form oder gegebenenfalls auch an Protein gebunden, über die Membran(en) hinweg in das erste Kompartiment gelangen, z.B. durch Diffusion, und dort von den erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikeln gebunden werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sorptionskartusche sind die mehreren Apoferritin-Nanopartikel oder die Zusammensetzung jedoch so in der Sorptionskartusche angeordnet, dass beim Betrieb, z.B. in einem Dialysesystem, ein direkter Kontakt mit dem aufzureinigenden Blut erfolgt. In dieser bevorzugten Ausführungsform befindet sich eine kristalline oder nichtkristalline (amorphe) Zusammensetzung der Apoferritin-Nanopartikel innerhalb der Sorptionskartusche oder zumindest innerhalb eines Kompartiments innerhalb der Sorptionskartusche, wobei Blut direkt mit der Zusammensetzung innerhalb der Sorptionskartusche kontaktiert werden kann. In dieser Form bildet das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial einen unlöslichen (amorphen oder kristallinen) Feststoff, der deutlich größer ist als die Bestandteile des Blutes (z.B. Erythrozyten mit ca. 2,5 pm). Der Größenunterschied macht die Abtrennung einfach. Das Sorptionsmaterial kann durch relativ grobe Filter zurückgehalten werden, während das Blut die Sorptionskartusche durchströmt. Hier erweist sich insbesondere die Biokompatibilität des erfindungsgemäßen Materials als vorteilhaft, da es nicht erforderlich ist, das Sorptionsmaterial vom Blut zu trennen, wodurch nicht nur ein engerer Kontakt zwischen dem Sorptionsmaterial und den abzutrennenden Toxinen ermöglicht, sondern und auch eine Integration in bestehende Dialysesysteme erleichtert wird.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung ein Dialysesystem, umfassend einen Dialysator und mindestens eine Sorptionskartusche nach dem dritten Aspekt der Erfindung.
Die mindestens eine Sorptionskartusche kann in Flussrichtung des zu dialysierenden Blutes dem Dialysator a) vorgeschaltet, b) nachgeschaltet oder c) in einem Nebenkreislauf zum Dialysekreislauf angeordnet sein.
In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Dialyse von Blut, vorzugsweise menschlichem Blut, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Blutes mit einem erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder mit einer Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung. Der Schritt des Inkontaktbringens erfolgt bevorzugt über eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um ein im Blut enthaltenes Toxin, beispielsweise ein PBUT oder ein Schwermetall, an die erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel oder die Zusammensetzung zu binden. Die Zusammensetzung kann die Apoferritin-Nanopartikel in amorpher oder vernetzter (kristalliner) umfassen. Der Begriff „Inkontaktbringen“ umfasst hier insbesondere ein direktes Inkontaktbringen von Blut mit den Apoferritin-Nanopartikeln oder der Zusammensetzung, d.h. ohne Trennung durch eine beispielsweise semipermeable Membran. Das erfindungsgemäße Dialyseverfahren ist besonders vorteilhaft zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung (CNK) und/oder zur Linderung der Folgen einer chronischen Nierenerkrankung (CNK). In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung daher auch ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Patienten mit einer chronischen Nierenerkrankung (CNK) und/oder zur therapeutischen Linderung der Folgen einer chronischen Nierenerkrankung (CNK), umfassend ein Verfahren zur Dialyse von Blut gemäß dem obigen fünften Aspekt der Erfindung.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen und Ausführungsbeispiele rein zu Veranschaulichungszwecken näher erläutert.
Figur 1. Schematische Darstellung von Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels. A. Schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikels mit Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums; B. Schematische Darstellung eines Apoferritin-Nanopartikels mit Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums mit funktionalisierten Cystein-Resten; C. Schematische Darstellung eines Apoferritin-Nanopartikels mit Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich eines Dreifachkanals; D. Schematische Darstellung eines Apoferritin-Nanopartikels mit Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums (mit Funktionalisierung eines Cysteinrests), und mit zusätzlicher Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich eines Dreifachkanals.
Figur 2. Schematische Darstellung einer kristallartigen Anordnung (unterer Teil der Abbildung) mehrerer erfindungsgemäßer Apoferritin-Nanopartikel, zusammengesetzt aus Apoferritin- Nanopartikeln aus Figur 1 (oberer Teil der Abbildung).
Figur 3. Schematische Darstellung von Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen Dialysesystems. A. Dialysesystem mit vorgeschalteter erfindungsgemäßer Sorptionskartusche; B. Dialysesystem mit nachgeschalteter erfindungsgemäßer Sorptionskartusche; C. Dialysesystem mit erfindungsgemäßer Sorptionskartusche in einem Nebenkreislauf.
Figur 4. Ergebnisse von Adorptionsversuchen mit funktionalisierten Apoferritin-Nanopartikeln zur Bindung von PBUTs. a), b), c) Adsorptionskapazität von unbehandelten und funktionalisiertem Ferritin gegenüber repräsentativen PBUTs in Konzentrationen, die in CNK- Patientenblut zu erwarten sind [26], d) Lichtmikroskopisches Bild der als Adsorptionsmittel dienende Kristalle aus Ftn-Phe. e) Verhältnis von phosphorylierten AKT zu AKT als Maß für Aktivierung von Blutplättchen und damit verbundene Blutgerinnung f) Relative Konzentration von TMF a mRNA in Endothelial-Zellen. Ftn(neg)-Phe: mit 2-Iodo-N-phenylacetamid (Phe) funktionalisierte Ftn(neg Apoferritin-Nanopartikel; Ftn(neg)-C10: mit 2-Brom-N-decylacetamid (CIO) funktionalisierte Ftn(neg)- Apoferritin-Nanopartikel.
Figur 5. a) Adsorptionskapazität von gentechnisch modifizierten Ferritinvarianten gegenüber Indoxyl sulfat. Ftn(neg)-Dock: Variante mit Toxinbindestelle (Sequenz: Ftn(neg)-dock03, SEQ ID NO: 21); Ftn(neg)-Ap: Variante mit verringerter negativer Oberflächenladung auf der inneren Oberfläche (Sequenz: Ftn(neg)-Ap4, SEQ ID NO: 17); Ftn(neg)-Ap-Kanal: Variante mit verringerter negativen Oberflächenladung auf der inneren Oberfläche und im Bereich des Dreifachkanals (Sequenz: Ftn(neg)-Ap4-3A, SEQ ID NO: 18). b) Indoxyl sulfat und seine Interaktionen mit drei Seitenketten in einer designten Toxinbindestelle (Computermodell).
Figur 6. Adsorptionskapazität von kristallinen (links) und nichtkristallinen (rechts) gentechnisch modifizierten erfindungsgemäßen Ferritinvarianten gegenüber Indoxylsulfat (IS). Ftn(neg): Apoferritin-Nanopartikel-Variante mit erhöhter negativer Ladung auf der äußeren Oberfläche (SEQ ID NO: 12); Ftn(neg)-Ap4: Variante mit 4 Mutationen gegenüber Ftn(neg) und dadurch veränderter verringerter negativer Oberflächenladung auf der inneren Oberfläche (SEQ ID NO: 17); Ftn(neg)-Apl6: Variante mit 16 Mutationen gegenüber Ftn(neg) und dadurch veränderter verringerter negativer Oberflächenladung auf der inneren Oberfläche (SEQ ID NO: 20).
Figur 7. Adsorptionskapazität von kristallinen gentechnisch modifizierten erfindungsgemäßen Ferritinvarianten mit speziell entwickelten Bindungsstellen gegenüber Indoxylsulfat (IS) im Vergleich zu Ftn(neg). Ftn(neg)-03 (= Ftn(neg)-dock03, SEQ ID NO: 21); Ftn(neg)-23 (= Ftn(neg)- dock23, SEQ ID NO: 22); Ftn(neg)-43 (= Ftn(neg)-dock43, SEQ ID NO: 22). Figur 8. Adsorptionskapazität von kristallinen gentechnisch modifizierten erfindungsgemäßen Ferritinvarianten mit speziell entwickelten Bindungsstellen gegenüber para-Kresylsulfat (pCS) und Phenylacetat (PhAc) im Vergleich zu Ftn(neg). Ftn(neg)-03 (= Ftn(neg)-dock03, SEQ ID NO:
21); Ftn(neg)-23 (= Ftn(neg)-dock23, SEQ ID NO: 22); Ftn(neg)-43 (= Ftn(neg)-dock43, SEQ ID NO:
22).
Figur 9. Adsorptionskapazität einer kristallinen gentechnisch modifizierten erfindungsgemäßen Ferritinvariante (Ftn(neg)-Ap4-3A-dock43; SEQ ID NO: 24) mit kombinierten Sequenzmodifikationen gegenüber Indoxylsulfat (IS) im Vergleich zu Ftn(neg) und den Varianten Ftn(neg)-Ap4 (SEQ ID NO: 17), Ftn(neg)-Ap4-3A (SEQ ID NO: 18) und Ftn(neg)- dock43 (SEQ ID NO: 23). Ftn(neg)-43 = Ftn(neg)-dock43; Ftn(neg)-Ap4-3A-43 = Ftn(neg)-Ap4-3A- dock43.
Figur 1 zeigt eine stark vereinfachte und schematische Darstellung von Ausführungsformen erfindungsgemäßer Apoferritin-Nanopartikel 1 zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse. Wie aus Figur 1 ersichtlich ist, weisen die Apoferritin-Nanopartikel 1 eine allgemein sphärische Gestalt auf, mit einer von Apoferritin-Untereinheiten 2 gebildeten Proteinhülle, die einen inneren Hohlraum 4 einschließt, und in der Kanäle 3 an den Schnittstellen zwischen den Apoferritin-Untereinheiten 2 gebildet sind, durch die Toxine aus der äußeren Umgebung beispielsweise durch Diffusion in den inneren Hohlraum 4 gelangen und dort gebunden werden können, beispielsweise durch hydrophobe Wechselwirkung. In Figur 1 sind schematisch vier einzelne Apoferritin-Nanopartikel 1 dargestellt, wobei in Figur 1 A eine Ausführungsform dargestellt ist, bei der im Bereich des inneren Hohlraums 4 Sequenzmodifikationsstellen 5 angeordnet sind, d.h. Stellen, an denen Modifikationen der Aminosäuresequenz der Apoferritin-Untereinheiten 2 vorgenommen wurden, d.h. einzelne Aminosäuren oder ganze Aminosäuresequenzbereiche gegenüber der Wildtypsequenz der jeweiligen Apoferritin-Untereinheit 2 gegen andere Aminosäuren oder Aminosäuresequenzbereiche ausgetauscht wurden. Eine Funktionalisierung von Aminosäuren, z.B. Cysteinresten, wurde hier nicht vorgenommen. Eine Bindung von Toxinen kann beispielsweise durch hydrophobe Wechselwirkung mit an den Sequenzmodifikationsstellen 5 vorgesehenen hydrophoben Aminosäureresten erfolgen. Bei der in Figur 1B dargestellten Ausführungsform eines Apoferritin-Nanopartikels 1 zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse wurden zunächst etwaige vorhandene native Cysteinreste durch Alanin ersetzt und anschließend an vier Sequenzmodifikationsstellen 5 vier Aminosäuren durch Cystein ersetzt, welches an dessen SH-Gruppe mit einem kovalent daran gebundenen organischen Verbindungsrestes (hier beispielhaft ein N-phenylacetamidyl-Rest) funktionalisiert wurde. In dem Beispiel sind vier Cysteinreste mit einem hydrophoben organischen Verbindungsrest für die Bindung von Urämietoxinen funktionalisiert. In Figur IC ist schematisch eine Ausführungsform eines Apoferritin-Nanopartikels 1 zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse dargestellt, bei der lediglich Sequenzmodifikationsstellen 5 im Bereich eines Dreifachkanals vorgesehen sind, d.h. eine lediglich im Bereich eines Dreifachkanals gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz vorhanden ist. In Figur IC ist schematisch eine Ausführungsform eines Apoferritin-Nanopartikels 1 zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse dargestellt, bei der neben Sequenzmodifikationsstellen 5 im Bereich eines Dreifachkanals auch Sequenzmodifikationsstellen 5 im Bereich des inneren Hohlraums 4 vorhanden sind, wobei hier beispielhaft eine der Sequenzmodifikationsstellen 5 als funktionalisierte Sequenzmodifikationsstelle 5 dargestellt ist.
In Figur 2 ist schematisch die Assemblierung von erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikeln 1 (oberer Teil der Abbildung) zu einer kristallartigen angeordneten Zusammensetzung 100 (unterer Teil der Abbildung) dargestellt. Die Apoferritin-Nanopartikel 1 können unter geeigneten Bedingungen zu einem wohldefinierten makroskopischen kristallinen Material mit gleichmäßig verteilten Lösungsmittelkanälen assembliert werden. Dies gewährleistet eine hohe Reinheit des Materials sowie eine einfache Handhabung, und ist auch hilfreich für die Materi al Charakterisierung. Zur Fixierung der Anordnung können die Apoferritin-Nanopartikel 1 gegebenenfalls untereinander quervernetzt werden.
In Figur 3 ist schematisch ein erfindungsgemäßes Dialysesystem 200 in verschiedenen Ausführungsformen dargestellt. Figur 2A zeigt eine Ausführungsform, bei der eine Sorptionskartusche 201 einem Dialysator 202, hier ein Hohlfasermembranmodul, in durch die Pfeile angegebenen Flussrichtung des Blutes vorgeschaltet ist. Die Flussrichtung wird durch eine entsprechende Pumpe, die hier nicht dargestellt ist, bestimmt. Die Körpergrenze ist hier schematisch durch die gestrichelte Linie 203 angedeutet. Über eine Leitung 205, z.B. ein Schlauch, wird Blut zur Sorptionskartusche 201 geleitet. In der Sorptionskartusche 201 befindet sich ein erfindungsgemäßes Adsorptionsmaterial, z.B. eine Zusammensetzung 100 in Form einer kristallinen Anordnung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung. Das Blut kann in direkten Kontakt mit der die erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel 1 enthaltenden Zusammensetzung 100 gebracht werden. Etwaige im Blut enthaltene, z.B. an Proteine gebundene Urämietoxine, können von dem Adsorptionsmaterial gebunden werden. Das von Toxinen befreite oder zumindest abgereicherte Blut wird zum Dialysator 202 und weiter über eine zum Körper führende Leitung 204 in den Körper des Patienten zurückgeführt. Ein Dialysatkreislauf 206 kann für einen Austausch bzw. einen Gegenstrom von Dialysat sorgen.
In Figur 3B ist ein erfindungsgemäßes Dialysesystem 200 dargestellt, bei dem die erfindungsgemäße Sorptionskartusche 201 dem Dialysator 202 in Fließrichtung des Blutes nachgeschaltet ist. Ansonsten entspricht das Dialysesystem 200 in dieser Ausführungsform der in Figur 3 A dargestellten Ausführungsform, so dass für weitere Details auf die dortigen Ausführungen verwiesen wird. Auch hier kommt das von Toxinen zu befreiende oder ab zureichemde Blut in der Sorptionskartusche 201 direkt mit den Apoferritin-Nanopartikel 1 bzw. einer die Apoferritin-Nanopartikel 1 umfassenden Zusammensetzung 100 in Kontakt.
In Figur 3C ist ein erfindungsgemäßes Dialysesystem 200 dargestellt, bei dem die erfindungsgemäße Sorptionskartusche 201 mit erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikeln 1 in einem Nebenkreislauf 207 zum Blutkreislauf angeordnet ist. Anstelle oder zusätzlich zu einem hier nicht dargestellten Dialysatkreislauf kann Adsorptionsmaterial in den Dialysator 202 geführt werden, um aus dem Blut über die Membranen der Hohlfasem übertretende Toxine zu binden. Bei dieser Ausführungsform kommt das aufzureinigende Blut nicht in direkten Kontakt mit den Apoferritin-Nanopartikel 1 bzw. einer die Apoferritin-Nanopartikel 1 umfassenden Zusammensetzung 100. Beispiele
1. Chemische Modifikation (Funktionalisierung) der inneren Oberfläche von Apoferritin- Nanopartikeln
Apoferritin-Nanopartikel gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurden durch chemische Modifikation der inneren Oberfläche mit kleinen hydrophoben Molekülen hergestellt. Dazu wurde das Protein gentechnisch so verändert, dass die Aminosäure Cystein nur an bestimmten exponierten Stellen an der inneren Oberfläche vorhanden ist. Diese Aminosäure verfügt als einzige Aminosäure in dem inneren Hohlraum über eine Thiol-Gruppe in ihrer Seitenkette, welche als Ankerpunkt für die Reaktion mit hydrophoben Molekülen genutzt wurde. Der Protein-Container kann unter sauren Bedingungen (pH-Wert von 2) in seine Untereinheiten fragmentiert werden. Die inneren Cysteine können anschließend mit den hydrophoben Molekülen funktionalisiert werden. Es wurden die Moleküle 2-Iodo-N- phenylacetamid und 2-Bromo-N-decylacetamid verwendet, die in Folge einer Substitutionsreaktion an die Thiolgruppe binden können. Da eine Thiolgruppe ausschließlich im Cystein vorkommt und das modifizierte Protein diese nur innerhalb der Kavität enthält, wird so selektiv nur die innere Oberfläche mit hydrophoben Gruppen modifiziert. Die vollständige Funktionalisierung kann durch eine signifikante Zunahme der Masse des Proteins durch ESI- MS Messungen verifiziert werden. Auf diese Weise kann auch ermittelt werden, ob jedes Cystein funktionalisiert wurde. Bisher können bis zu 96 hydrophobe Moleküle pro Nanopartikel eingebaut werden. Nach der Funktionalisierung lässt sich eine erhöhte Adsorptionskapazität für das IS und pCS sowie für Phenylacetat messen, wie aus Fig. 3a ersichtlich ist.
Material und Methoden
Allgemeines
Alle Chemikalien wurden aus kommerziellen Quellen bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Sofern möglich, wurden alle Lösungen mit Reinstwasser (hergestellt mit einem Purelab-Flex-2-System, spezifischer Widerstand 18,2 Mfi cm) und Reagenzien in Analysequalität hergestellt, sofern nichts anderes angegeben ist.
Mutagenese
Die Einführung von Cystein-Ankerstellen wurde durch mehrere Zyklen ortsspezifischer QuikChange™-Mutagenese mittels eines Protokolls zu einer zweistufigen Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt [30], Die verwendeten Primer für die verschiedenen Mutationsstellen sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1. Primersequenzen (in 5 '-3 '-Richtung) für PCR-Protokoll zur Mutagenes
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Eine Mischung aus 2,9 pL pET-22b(+)-Plasmid enthaltend das interessierende Gen (7 ng pL x), 1 pL 10 mM dNTP-Mix, 5 pL Reaktionspuffer lOx (100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-HCl pH 8,8, 20 mM MgSO4, 1 % Triton® X-100, 1 mg mL 1 nukleasefreies Rinderserumalbumin (BSA)), 1 pL Pfu-DNA-Polymerase (2,5 U pL ') und 38,1 pL Reinstwasser wurde hergestellt. Die Mischung wurde halbiert und 1 pL Forward- oder Reverse- Primer (10 pmol pL ') wurden jedem Röhrchen hinzugefügt. Ein PCR-Thermocycler (Eppendorf Mastercycler Nexus PCR Cycler) wurde vorbereitet durch einen anfänglichen Heizschritt für 30 s bei 95 °C. Der erste Schritt des PCR-Protokolls bestand aus 3 Zyklen von 30 s Denaturierung bei 95 °C, Tempern für 1 min bei 61 °C, gefolgt von Elongation für 6 min bei 68 °C. Nach den ersten 3 Zyklen wurden die getrennten Mischungen mit den Forward- und Reverse-Primem vereinigt und die PCR wurde für 16 weitere Zyklen fortgesetzt mit den gleichen Parametern wie bei den ersten 3 Zyklen, gefolgt von einer finalen Elongationsphase für 10 min bei 68 °C zum Abschluss der PCR. Der Verdau des elterlichen Plasmids wird durchgeführt durch Zugabe von 1 pL Dpnl (10 U pL 1 ) und Inkubation über Nacht bei 37 °C. Dpnl wird deaktiviert durch 20 min Erhitzen auf 80°C und die Mischung wird mit dem NucleoSpin® Gel und PCR Clean-Up-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Calcium-kompetente E. coli DH5a Zellen wurden mit 200 ng des gereinigten Plasmids für 30 min auf Eis inkubiert, gefolgt von einem Hitzeschock für 45 s bei 42 °C. Als nächstes wurden die Zellen für 1 h in „Super Otimal Broth“ (SOB) Medium inkubiert, bei 1000 g zentrifugiert, in 100 pL Medium resuspendiert, auf einer LB-Agarplatte ausplattiert und 16 h bei 37 °C inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde aufgenommen und über Nacht inkubiert bei 37 °C und 250 U/min in 5 mL sterilem LB-Medium, ergänzt mit 150 pg mL 1 Ampicillin. Am nächsten Tag wurden die Plasmide mit dem NucleoSpin® Plasmid Miniprep-Kit gemäß den Angaben des Herstellers extrahiert.
Die Sequenz wurde bestätigt durch Mischen von 500 ng Plasmid mit 25 pmol T7 Forward- oder Revers-Primer in 10 pL Lösung und Einsenden zur DNA-Sequenzierung (Eurofins Genomics).. Plasmide mit den gewünschten Mutationen wurden dann als Stamm-Plasmide für die weitere Mutagenese ausgewählt, bis alle 5 Mutationen vorhanden waren.
Herstellung und Reinigung von Ferritin-Cystein-Varianten
Die Herstellung von negativ geladenen Ferritinvarianten (Ftn(neg)) und Cy stein tragenden Varianten wurde vorgenommen wie zuvor veröffentlicht [31], Zuerst wurden Calciumkompetente E. coli BL21-Gold(DE3)-Zellen für 10 min auf Eis aufgetaut. Dann wurde 1 pL von 40 ng pL'1 Plasmidlösung zu den Zellen gegeben und die Mischung für 30 min auf Eis inkubiert. Hitzeschock wurde durchgeführt durch Inkubieren der Mischung bei 42 °C für 45 s, gefolgt von 2 min Inkubation auf Eis. Die Zellen wurden in 1 ml SOB-Medium suspendiert und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden bei 1000 g zentrifugiert und 1 ml der Mischung wurde entfernt. Das Zellpellet wurde in der restlichen Lösung resuspendiert und auf einer LB- Agarplatte mit 150 pg ml-1 Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zur Herstellung von Vorkulturen wurden Kolonien von transformierten E. coli BL21-Gold(DE3)- Zellen (Agilent) über Nacht in 5 ml sterilem LB-Miller-Medium, ergänzt mit 150 pg ml’1 Natrium-Ampicillin, bei 37°C und 180 U/min inkubiert. Dann wurden 400 ml Terrific-Broth (TB)-Medium, mit 150 pg ml’1 Natrium-Ampicillin, mit 4 ml der Vorkultur angeimpft. Die Zellen wurden bei 37°C und 180 U/min angezogen, bis eine ODeoo von 0,6 erreicht wurde. Die Proteinüberexpression wurde induziert durch die Zugabe von Isopropyl-ß-D-1- Thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0,25 mM, und die Zellen wurden für weitere 48 h bei 18°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 g geerntet. Pellets wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
Zellen aus 400 ml Kultur wurden in 20 ml Puffer (50 mM Tris, pH 7,5, 0,3 M NaCl) resuspendiert. Die Zelllyse wurde durch Beschallung (60% Amplitude) für sechsmal 1 min auf Eis mit 1 min Pause dazwischen mit einem Vibra-Cell VCX-130 Ultraschallprozessor (Sonics) erreicht. Die resultierende Suspension wurde bei 14.000 g für 20 min zentrifugiert, um die Zelltrümmer von den löslichen Proteinen zu trennen. Die Denaturierung der meisten E.coli- Proteine wurde durch Erhitzen des Überstands auf 65 °C für 10 min in einem Wasserbad erreicht. Die denaturierten Proteine wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 14.000 g abgetrennt. In der Lösung verbliebene Proteine wurden mit Ammoniumsulfat bei einer Endkonzentration von 70 % seiner Sättigungskonzentration ausgefällt, gefolgt von einer 20- minütigen Zentrifugation bei 14.000 g. Nach Umpuffem des Pellets in 10 ml Puffer (50 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl) wurde die Ammoniumsulfat-Präzipitation wiederholt. Das resultierende Pellet wurde in 50 ml IEC-Ladepuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl) gelöst und durch lonenaustauschchromatographie (IEC) mit einem linearen Gradienten von 0,15 bis 1 M NaCl unter Verwendung einer 5 ml HiTrap™ Q HP -Anionenaustauschsäule (Cytiva) gereinigt. Alle Ftn(neg)-4xCys enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und mit einer Sartorius Vivaspin® Turbo 15 (MWCO 30.000) Filtereinheit auf ein Endvolumen von 2 ml konzentriert. Abschließend wurde die Probe mittels Gelfiltration mit einer HiLoad 16/600 Superdex™ 200 pg Säule gereinigt. Alle Chromatographieschritte wurden auf einem Äkta pure System von Cytiva durchgeführt. Alle Ftn(neg)-4xCys enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Funktionalisierung mit 2-Iod-N-phenylacetamid
5 mg Ftn(neg)-3xCys oder Ftn(neg)-4xCys wurden für 4 h in Zerlegungspuffer (10 mM Phosphat; 50 mM NaCl, pH 2) inkubiert. Nach 3 /i h wurden 10 Äquivalente (Äq.) (bezogen auf jedes Cystein) Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP, Iris Biotech GmbH) aus einer 10 mg mL’1 Stammlösung zur Lösung zugegeben. Anschließend wurde die Lösung mit Reassemblierungspuffer (50 M Tris, 50 mM NaCl, pH 7,6) auf 15 mL aufgefüllt und mit einem Membranfilter (Sartorius Vivaspin Turbo 15; 30 kDa MWCO) auf ein Endvolumen von 200 pl konzentriert. Erneut wurden 10 Äq. TCEP zugegeben und die Lösung auf ein Volumen von 2 mL aufgefüllt. Der pH-Wert wurde mit IM NaOH oder HCl auf 7,6 eingestellt. Anschließend wurden 2 mL Ethanol mit 20 Äq. 2-Iod-N-phenylacetamid (aber GmbH) zu der Lösung gegeben und die Mischung wurde für 1 h bei 300 U/min im Dunkeln gerührt. Anschließend wurde die Lösung wird mit Reassemblierungspuffer auf ein Gesamtvolumen von 30 ml aufgefüllt. Das Protein reassemblierte sich über Nacht. Schließlich wurde die Lösung auf 2 ml eingeengt und über Geifiltration auf einer HiLoad 16/600 Superdex™ 200 pg-Säule gereinigt. Proteinhaltige Fraktionen wurden gesammelt und zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Funktionalisierung mit 2-Brom-N-decylacetamid
Die Funktionalisierung folgt genau dem Protokoll für die Funktionalisierung mittels 2-Iodo-N- phenylacetamid. Allerdings wurde während der Funktionalisierungsreaktion die Protein/TCEP- Lösung nicht auf 2 mL, sondern auf 800 pL aufgefüllt, und dann wurden 3,2 ml Ethanol, das 40 Äq. 2-Brom-N-decylacetamid (Sigma-Aldrich) enthält, zu der Lösung zugegeben. Alle anderen Schritte wurden dem Protokoll zu 2-Iod-N-Phenylacetamid entsprechend durchgeführt. Hanging-Drop-Kristallisation
Die Kristallisation kleiner Proteinmengen oder funktionalisierter Proteinvarianten erfolgte über die Technik der Dampfdiffusion mit hängenden Tropfen. Reservoirlösung (100 mM Tris, 500 mM MgOAc, pH 8,5) wurde in einem manuellen Plattenset mit 24 Vertiefungen hergestellt. Tropfen wurden auf silikonisierten Deckgläsern (Jena Bioscience) durch Mischen von 2 pL Reservoirlösungen mit 1 pL 50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7,5 Puffer und 1 pL der jeweiligen Ferritin-Variante hergestellt. Die Platten wurden bei 25°C inkubiert. Nach einem Tag waren erste Kristalle sichtbar.
Batch-Kristallisation
Zur Kristallisation größerer Mengen von Ftn(neg) und funktionalisierter Varianten von Ftn(neg) wurde Batch-Kristallisationsansatz basierend auf einem Protokoll von Rayment verwendet [32], Für ein Standard-Experiment wurden 250 pL eines 50 mM Tris 1 M NaCl pH 7,5 Puffers sorgfältig mit gleichen Mengen von Ftn(neg)-Stammlösung mit einer Konzentration von 12 mg mL’1 in 50 mM Tris 0,3 M NaCl pH 7,5 Puffer gemischt. Anschließend wurden 500 pL der Fällungsmittellösung (133 mM Tris, 333 mM MgOAc, pH 8,5) wird unter ständigem Schütteln zugetropft. Die Mischung wurde 7 Tage ruhend bei Umgebungstemperatur von 20 °C gelagert, bevor die Kristalle fixiert wurden.
Kristallfixierung
Für die Adsorptionsexperimente wurde eine Erhöhung der Stabilität der Kristalle vorgenommen. Dazu wurden sie mit dem Vernetzer Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl 4-(N- maleimidomethyl)cyclohexan-l-carboxylat, Sigma-Aldrich) fixiert. Die Kristalle wurden 2 min bei 1000 g abzentrifugiert. In einem Standardversuch mit einer Gesamtmasse von 3 mg Kristallen wurde die Kristallisationslösung entfernt, bis 246 pL übrig waren. Anschließend wurden 64 pL einer frisch zubereiteten wässrigen Sulfo-SMCC-Lösung mit 4,8 mg mL 1 hinzugegeben, was zu einer Endkonzentration von 1 mg mL 1 führte. Die Mischung wurde 4 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und anschließend mit Reinstwasser auf 1 mL aufgefüllt. Die Kristalle wurden durch Zentrifugation bei 1500 g für 2 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Kristalle anschließend in Reinstwasser resuspendiert. Das Verfahren wurde bis zu dreimal wiederholt, um die Kristalle von restlichem Vernetzungsmittel frei zu waschen. Das Material wurde bis zur weiteren Verwendung bei einer Umgebungstemperatur von 20°C gelagert. Kristalle wurden unter einem Leica S9D-Mikroskop mit einer FlexaCamCl fotografiert.
Zur Fixierung mit Glutaraldehyd (Merck) wurden zu 1 ml Kristalllösung, die 3 mg Kristalle enthält, 50 pl einer 2,5 % wässrigen Glutaraldehydlösung zugegeben, was zu einer Endkonzentrierung von 0,00119 % führte. Kristalle wurden für 4 h inkubiert und anschließend dreimal mit Reinstwasser gewaschen. Die Kristalle wurden bis zur weiteren Verwendung bei 20°C gelagert.
Nach der Glutaraldehyd-Vernetzung lösen sich die Kristalle noch in einer 60 mg mL’1 BSA- Lösung. Durch einen zusätzlichen Fixierungsschritt konnte die Stabilität erhöht werden. Der Vorgang wurde wiederholt, aber die Kristalle wurden vor dem Waschen lediglich für 10 min inkubiert. Toxin-Adsorptionsassays zeigten jedoch eine signifikant verringerte Adsorptionskapazität. Es wird angenommen, dass die Polymerisation des Glutaraldehyds zu einer Blockierung der Poren führt.
Herstellung von nichtkristallinem Adsorbens
500 pL einer 6 mg mL’1 Proteinlösung wurden mit 25 pL 2,5%iger Glutaraldehydlösung versetzt. Eine vollständige Durchmischung wurde durch dreimaliges vorsichtiges Auf- und Abpipettieren der Lösung sichergestellt. Das Gemisch wurde über Nacht bei einer Umgebungstemperatur von 20°C gehalten. Am nächsten Tag bildete sich ein weißer Niederschlag. Das Material wurde dreimal mit Reinstwasser gewaschen und bis zur weiteren Verwendung bei 20°C gelagert. ESI-MS-Messungen
Die Proteinprobe wurde mit einem Amicon® Ultra 0,5 ml (MWCO 30.000 Da) Zentrifugalfilter auf ultrareines Wasser umgepuffert. Die Proteinprobe wird mit Reinstwasser auf ein Volumen von 500 pL aufgefüllt, auf etwa 20 pL konzentriert und auf 500 pL nachgefüllt. Die Umpufferung wird 5mal wiederholt und die Konzentration wurde zwischen 0,15 und 0,2 mg ml 1 eingestellt. Die Masse der Proteine wurde mit Elektronenspray-Ionisationszeit-Flugzeit- Massenspektrometrie (Agilent 6224 ESI-TOF) bestimmt. Die Messung erfolgte im positiven Modus.
Toxin- Assay
Zur Bestimmung der urämischen Toxin- Adsorptionskapazität der Ferritin-Varianten wurden Adsorptionsexperimente durchgeführt. Alle Lösungen und Proben wurden in Glaswaren (Macherey-NAGEL Vials N9) gehandhabt, da in anfänglichen Experimenten eine Adsorption der Toxine an den Polypropylenwänden der Reaktionsröhrchen beobachtet wurde.
Zunächst wird eine Stammlösung des gewünschten Toxins mit einer Konzentration von 50 pg mL’1 für pCS und IS und 500 pg mL’1 für PheAc hergestellt. Aus den anfänglichen Stammlösungen wird eine Eichreihe mit Konzentrationen von 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 0,7 und 1 pg mL’1 zur späteren Bestimmung der absoluten Toxinkonzentrationen in den Proben hergestellt.
Die Stammlösungen wurden weiter verdünnt, um die endgültigen urämischen Toxinkonzentrationen zu erreichen, die bei einem CNK-Patienten im Stadium 5 erwartet werden (41 mg L'1 für pCS, [33] 44 mg L'1 für IS [26] und 474 mg L'1 für PheAc [34]). Das Adsorptionsmittel wurde 2 min bei 1500 g abzentrifugiert und der komplette Überstand von der Probe entfernt. 150 pL der jeweiligen Toxinlösung wurden zugegeben und die Kristalle 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Zusätzlich wurden 150 pL der Toxinlösung als Kontrolle inkubiert. Von allen Proben wurden drei Aliquots von 10 pl entnommen und 100-fach in Reinstwasser verdünnt. Schließlich wurden die Kristalle mit Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gewogen.
Die Urämietoxin-Konzentration wurde durch ein Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (RP-HPLC) mit einer C18-Säule (Zorbax Extend-C18, Agilent), gekoppelt an ein Elektronenspray-Ionisations-Quadrupol-Liner- lonenfallen-Massenspektrometer (ESI-QTRAP), quantifiziert. Als Lösungsmittel wurde eine Mischung aus Wasser in HPLC-Qualität (LiChrosolv® Merck) und Acetonitril (LiChrosolv® Merck), beide mit Zusatz von 0,1 % Ameisensäure (Honeywell Fluka), verwendet. Die spezifischen Zusammensetzungen bei jedem Schritt während des 15-minütigen Chromatographieprogramms sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2. Sequenz des HPLC-Programms
Figure imgf000039_0001
Vor jeder mit den Kristallen inkubierten Probe wurde die Kontrolle gemessen.
Chromatogramme wurden mit der Analyst® Instrument Control and Data Processing Software ausgewertet. Peaks wurden integriert und die Toxinkonzentration wurde aus der Kalibrierungsreihe bestimmt. Aus der Konzentrationsdifferenz zwischen der Kontrolle und den Proben wurde die Menge an adsorbiertem Urämietoxin bestimmt. Die Adsorptionskapazität wurde dann bestimmt, indem die Masse der adsorbierten Toxine durch die Masse der Kristalle dividiert wurde.
Quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (qPCR) der mRNA-Expression in Endothelzellen der menschlichen Aorta Humane Aorta-Endothelzellen (hAoECs) (Promocell) wurden in einem Endothelial Cell Growth Medium MV (Promocell) kultiviert. Die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen (15 x 104 Zellen/Vertiefung) bei 80 % Konfluenz ausgesät und für 6 h mit 100 ng mb1 Lipopolysacchariden (LPS) oder funktionalisierten oder unfunktionalisierten Proteinkristallen inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung des RNAeasy- Minikits (Qiagen) extrahiert. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung von 1 pg Gesamt-RNA (600 ng), Zufall shexameren und Verso-Reverse-Transkriptase (Thermo Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Für die Echtzeit-PCR wurden die Genexpressionsniveaus unter Verwendung der SYBR Green I-Farbstoffchemie auf einem LightCycler 480-System (Roche Applied Sciences) quantifiziert. Die folgenden Primer wurden zur relativen Quantifizierung der gezielten Genexpression verwendet - für humanes TNF-alpha: Forward-Primer 5'-GCCCAGGCAGTCAGATCATCT-3' (SEQ ID NO: 8), Reverse-Primer 5'- TTGAGGGTTTGCTACAACATGG-3' (SEQ ID NO: 9) und für humanes Beta-Actin: Forward-Primer 5'-CAACCGCGAGAAGATGAC-3' (SEQ ID NO: 10), Reverse-Primer 5'- GTCCATCACGATGCCAGT-3' (SEQ ID NO: 11). Die Daten wurden als mittleres Niveau der Genexpression relativ zur Expression des Referenzgens (ß-Actin) dargestellt.
Blutplättchen-Aktivierungsassay
Die Blutplättchen von drei Spendern wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 260 g isoliert. Nach einem zweiten Zentrifugationsschritt wurden Blutplättchen in Hepes-Puffer pH 6,6 (10 mM Hepes, 136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 2 mM MgCh und 5 mM Glucose) resuspendiert. Thrombozytensuspensionen wurden in Gegenwart von 1 :15 saurer Citratdextrose (ACD) und 1 U mL’1 Apyrase erneut zentrifugiert und anschließend in Hepes-Puffer pH 7,45 (10 mM Hepes, 136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 2 mM MgCh, 5 mM Glucose und 0,1 % BSA) resuspendiert. 15 x 106 Blutplättchen wurden für 15 min mit 4 nmol L'1 Thrombin in Gegenwart von 2 mmol L'1 CaCh oder verschiedenen Proteinkristallen inkubiert. Die Thrombozyten wurden mit 4 % SDS-Lysepuffer (200 mmol L'1 Tris, 600 mmol L'1 NaCl, 4 % SDS) einschließlich EDTA-freiem Halt-Protease-Inhibitor-Cocktail (1 : 10; Sigma-Aldrich) und Halt- Phosphatase-Inhibitor-Cocktail lysiert (1 : 10; Sigma-Aldrich). Die Proteinmenge wurde gemäß dem Protokoll für den DC-Proteinassay (Bio-Rad) quantifiziert. Eine gleiche Proteinmenge aus jeder Probe wurde durch 10 % SDS-Polyacrylamid-Gel elektrophorese aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembranen übertragen und mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Als primäre Antikörper wurden Anti -p-Akt- Antikörper (1 : 1000;
Zellsignalisierung) und Anti-Tubulin (1 : 1000; Zellsignalisierung) verwendet. Die Blots wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Ein zweiter Anti -Kaninchen- Antikörper (1 : 1000;
Zellsignalisierung) wurde verwendet und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Immunreaktive Banden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz sichtbar gemacht, und Densitometrie wurde unter Verwendung von „Quantity One Software“ (Bio-Rad Laboratories) durchgeführt.
Sequenzen
Die Aminosäuresequenzen der Ftn(neg)-Nanopartikel-Untereinheiten und der Cystein-haltigen Varianten Ftn(neg)-3xCys (mit 3 Cysteinresten) und Ftn(neg)4xCys (mit 4 Cysteinresten) sind im Folgenden angegeben. Varianten mit nur einer (Ftn(neg)-lxCys) sowie zwei Cysteinresten (Ftn(neg)-2xCys) sind ebenfalls wiedergegeben. Für Ftn(neg) sind die Mutationen gegenüber der Wildtyp-H-Kette (SEQ ID NO: 1) angegeben. Mutationen im Vergleich zu Ftn(neg) (SEQ ID NO: 12), einschließlich ursprünglich vorhandener Cy steinreste, die zu Alaninresten geändert wurden, sind angegeben. Die Cysteinreste in den Cystein-haltigen Varianten sind durch Unterstreichung hervorgehoben.
Ftn(neg), (SEQ ID NO: 12): Variante mit erhöhter negativer Ladung auf der äußeren Oberfläche; A18E, C90E, C102E, K86Q, H105E TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES
Ftn(neg)-3xCys (SEQ ID NO: 13): Variante mit 3 Cystein-Resten auf der inneren Oberfläche; K53C, E64C, C130A, K143C
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYFLHQ SHEERCHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVCAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES
Ftn(neg)-4xCys (SEQ ID NO: 14): Variante mit 4 Cystein-Resten auf der inneren Oberfläche;
K53C, E64C, C130A, K143C, S178C
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYFLHQ SHEERCHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVCAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDCDNES
Ftn(neg)-lxCys (SEQ ID NO: 15): Variante mit 1 Cystein-Rest auf der inneren Oberfläche;
K53C, C130A
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYFLHQ SHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES
Ftn(neg)-2xCys (SEQ ID NO: 16): Variante mit 2 Cystein-Resten auf der inneren Oberfläche;
K53C, E64C, C130A
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYFLHQ SHEERCHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES
Sequenzen weiterer untersuchter Varianten sind im Folgenden wiedergegeben. Mutationen im Vergleich zu Ftn(neg) (SEQ ID NO: 12) sind angegeben. Der Begriff „Bindestelle“ steht hier für Toxin-Bindestellen, die durch bloßen Aminosäureaustausch (ohne zusätzliche Funktionalisierung) gebildet wurden.
Ftn(neg)-Ap4 (SEQ ID NO: 17): Variante mit verringerter negativer Oberflächenladung im Bereich des inneren Hohlraums; E61V, E62A, D131F, E140W
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHVAREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLCFFIETHYLNWQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES
Ftn(neg)-Ap4-3A (SEQ ID NO: 18): Variante mit verringerter negativer Oberflächenladung im
Bereich des inneren Hohlraums und an den Poren, sowie vergrößerter Porengröße; E61 V,
E62A, T122A, D123A, N125A D13 IF, E140W
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHVAREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLAAAKADPHLCFFIETHYLNWQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES
Ftn(neg)-Ap7 (SEQ ID NO: 19): Variante mit 7 hydrophoben Aminosäuren auf der inneren Oberfläche; E61V, E62A, H128F, D131W, N139V, E140W, K143V
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHVAREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPFLCWFIETHYLVWQVVAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES
Ftn(neg)-Apl6 (SEQ ID NO: 20): Variante mit 16 hydrophoben Aminosäuren auf der inneren Oberfläche; K49V, Y54F, H57W, Q58L, E61V, E62A, H65L, H128F, H136Y, D131W, H136Y N139V, E140W, K143V, E147L, H151Y, N154A
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALVNFAKFFLWL SHVARELAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPFLCWFIETYYLVWQVVAIKLLGDYVTALRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES
Ftn(neg)-dock03 (SEQ ID NO: 21): Variante mit einer Bindestelle an der inneren Oberfläche in der Nähe des Dreifachkanals; E64R, H65K, K68E, K71R, Q75D, R76K, H128E, D131E, F132H, T135K, H136R, Y137H, N139R, E140R
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHEERRKAEELMRLQNDKGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLLE LHKLATDKNDPELCEHIEKRHLRRQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHT LGDSDNES
Ftn(neg)-dock23 (SEQ ID NO: 22): Variante mit einer Bindestelle an der inneren Oberfläche in der Mitte der Untereinheit; H57E, Q58R, H60I, E61G, E64G, K68D, T135D, H136K, Y137H, N139E, E140K, A144N
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLER SIGERGHAEDLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLLE LHKLATDKNDPHLCDFIEDKHLEKQVKNIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES
Ftn(neg)-dock43 (SEQ ID NO: 23): Variante mit einer Bindestelle an der inneren Oberfläche in der Nähe der E-Helix; H57E, Q58R, E64R, H65K, K68E, T135D, H136R, Y137H, N139R, E140R, E147Y
TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLER SHEERRKAEELMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLLE LHKLATDKNDPHLCDFIEDRHLRRQVKAIKYLGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES
Ftn(neg)-Ap4-3A-dock43 (SEQ ID NO: 24): Variante mit verringerter negativer Oberflächenladung im Bereich des inneren Hohlraums und an den Poren, sowie vergrößerter Porengröße, und außerdem mit einer Bindestelle an der inneren Oberfläche in der Nähe der E- Helix; E61V, E62A, T122A, D123A, N125A D131F, H57E, Q58R, E64R, H65K, K68E, T135D, H136R, Y137H, N139R, E140R, E147Y TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLER SHVARRKAEELMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLAAAKADPHLCFFIEDRHLRRQVKAIKYLGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES
Ergebnisse:
Der Zusammenbau zu einem makroskopischen Material mit dem erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel als Baustein wurde durch Batch-Kristallisationstechniken erreicht (s.o.). Eine Proteinlösung wurde vorsichtig unter ständigem Schütteln gemischt, während die Fällungsmittellösung zugegeben wurde. Nach etwa 24 h konnten erste Kristalle beobachtet werden. Die Größe der Kristalle kann durch Veränderung der Protein- und Fällungsmittelkonzentration eingestellt werden. Zur Erhöhung der Stabilität wurden die Kristalle mit einem Vemetzungsmittel fixiert. Erste Versuche wurden mit Glutaraldehyd durchgeführt. Bei Stabilitätstests in einer 60 mg mL’1 BSA-Lösung, die ausgewählt wurde, um den hohen Proteingehalt des Blutes zu simulieren, lösen sich die Kristalle jedoch auf. Daher wurde die Stabilisierung mittels eines Sulfo-SMCC-Vernetzers vorgenommen, der eine stabile Fixierung durch Aufrechterhaltung der Adsorptionskapazität ermöglichte.
Zur besseren Adsorption von hydrophoben und teilweise negativ geladenen PBUTs wurden hydrophobe Liganden in den inneren Hohlraum der erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikel eingeführt. Die Erfindung stellt ein modulares Material bereit, das an die Art des Liganden angepasst werden kann. Hierzu wurde durch Einbau von Cysteinresten, die durch ihre Thiolgruppe als Ankerstelle für die chemische Derivatisierung modifizierbar sind, eine generische Stelle für die Modifikation erreicht. Andererseits wurden native Cysteinreste durch Alaninreste ausgetauscht, um eine Modifikation an unerwünschten Positionen zu verhindern. Wichtige Gestaltungskriterien für die Einführung von Cysteinresten auf der Kavitätsoberfläche waren der Abstand zwischen den Stellen und der für Lösungsmittel zugängliche Oberflächenbereich (solvent-accessible surface area, SASA). Ein hoher SASA-Wert sollte einer hohen Reaktivität entsprechen. Zu diesem Zweck wurden Ferritin-Varianten mit drei und vier eingeführten Cysteinen pro Untereinheit mit den Bezeichnungen Ftn(neg)-3xCys und Ftn(neg)- 4xCys entworfen. Die Gesamtzahl der Ankerstellen pro zusammengesetztem Proteinkäfig beträgt damit bei 24 Untereinheiten und 3 oder 4 Cysteinresten 72 oder 96. Die Mutationen wurden mit Quik-Change-Mutagenesetechniken in das Ftn(neg)-Gen eingeführt und die Varianten wurden in E. co/z-Bakterien überexprimiert. Die Reinigung folgte dem veröffentlichten Protokoll für Ftn(neg) [31], Bei der lonenaustauschchromatographie (IEC) und der Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde im Vergleich zum Ausgangsprotein keine nennenswerte Änderung des Elutionsverhaltens beobachtet. Die Einführung der gewünschten Mutationen wurde durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) verifiziert, wobei die gefundene Masse zur berechneten Masse passte (nicht dargestellt).
Zur chemischen Modifikation von Cystein-Thiolgruppen wurden die a-Halogencarbonyle 2-Iodo-N-phenylacetamid (Phe)
Figure imgf000046_0001
verwendet. Apoferritin-Nanopartikel, die mit den obigen Verbindungen funktionalisiert sind, werden als Ftn(neg)-Phe und Ftn(neg)-C10 bezeichnet. Die Gesamtstrategie für die chemische Modifikation der inneren Oberfläche und den anschließenden Zusammenbau zu einem heterogenen Material ist grundsätzlich wie folgt: Zunächst wird der Proteinkäfig unter sauren Bedingungen in seine Untereinheiten zerlegt. Im zerlegten Zustand sind die Thiolgruppen für die Halogenacetamid-Derivate gut zugänglich. Die zu bindenden Moleküle selbst sind in einer wässrigen Lösung nicht löslich. Daher wird die Funktionalisierung in einer Lösung durchgeführt, die hohe Anteile an Ethanol enthält, um die Löslichkeit der hydrophoben Moleküle zu erleichtern. Nach Inkubation der Reaktionspartner wird die Mischung verdünnt und der Proteinkäfig kann sich wieder zusammensetzen. Nach der Reinigung durch SEC zeigt das resultierende Chromatogramm ein ähnliches Elutionsvolumen wie der unfunktionalisierte Käfig (nicht dargestellt), was auf einen vollständigen Wiederaufbau des Proteinkäfigs hinweist. Dieser Befund wird in negativ gefärbten TEM-Bildern bestätigt, die intakte Käfigstrukturen zeigen (nicht dargestellt). Die SEC von funktionalisiertem Ftn(neg)-4xCys zeigt eine leichte Verschiebung zu einem höheren Elutionsvolumen in Verbindung mit einer leicht erhöhten Größe, was gut mit den Ergebnissen der dynamischen Lichtstreuungsmessungen (DLS) übereinstimmt.
Um die erfolgreiche und vollständige Funktionalisierung der Cystein-Ankerstellen zu überprüfen, wurden ESLMS-Messungen durchgeführt. In ersten Versuchen konnten mehrere Massenpeaks pro geladener Spezies nachgewiesen werden (nicht dargestellt). Jede von ihnen konnte der Ferri tin-Untereinheit mit einem bis vier der gewünschten Moleküle zugeordnet werden, was darauf hindeutet, dass in der Probe eine Mischung aus unterschiedlichen Funktionalisierungsgraden vorhanden war. Die Feinabstimmung der Reaktionsbedingungen, insbesondere des Ethanolanteils in der Mischung, des Verhältnisses von reaktiven Molekülen zu Cysteinen und die Zugabe eines Reduktionsmittels (TCEP) ermöglichten eine reproduzierbare, vollständige Funktionalisierung aller Stellen, wie durch ESI-MS nachgewiesen werden konnte (nicht dargestellt). Die Derivatisierung wurde auch mit Röntgenkristallographie des funktionalisierten Ferritins gezeigt (nicht dargestellt). Schließlich wurden makroskopische kristalline Materialien aus den funktionalisierten Varianten unter denselben bereits oben beschriebenen Bedingungen hergestellt, was darauf hinweist, dass die Funktionalisierung die äußere Oberfläche nicht beeinflusst hat. Anschließend wurden PBUT-Adsorptionsassays mit dem unfunktionalisierten proteinbasierten Material und dem mit aliphatischen oder phenylischen Molekülen funktionalisierten Material durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde die jeweilige Probe in Lösungen von drei verschiedenen urämischen Toxinen Indoxylsulfat (IS), p-Kresylsulfat (pCS) und Phenylessigsäure (PheAc) in Konzentrationen inkubiert, die bei einem CNK-Patienten im Endstadium zu erwarten sind [26, 33, 34], Nach Inkubation für 3 h wurde die PBUT -Konzentration im Überstand und den jeweiligen Kontrollproben durch HPLC-MS/MS-Techniken bestimmt. Die Bestimmung der Absolutwerte erfolgt durch Vergleich mit einem Kalibrierungsexperiment, das zu Beginn jedes Versuchsaufbaus und alle 20 Proben durchgeführt wurde. Außerdem wurden kurz vor jeder Probe Kontrollen gemessen, um eine direkte Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Eine Herausforderung war die unspezifische Adsorption des IS an den Fläschchen der Reaktionsgefäße aus Polymeren, die jedoch durch die Umstellung auf Glasfläschchen für die Inkubation und Lagerung der Proben überwunden werden konnte. Schließlich wurde das proteinbasierte Material vakuumgetrocknet und zur Bestimmung der Masse gewogen. Die Adsorptionskapazität, also das Verhältnis der adsorbierten PBUT -Masse zur Gesamtmasse des Materials, wurde berechnet und ist in Figur 4a-c dargestellt.
Kristalle des unfunktionalisierten Proteins Ftn(neg) adsorbierten alle drei getesteten Toxine mit einer Kapazität zwischen 247 und 283 pg g 1 für pCS und IS und 2710 pg g 1 für PheAc. Der Grund für die deutlich höhere Kapazität der PheAc- Adsorption ist höchstwahrscheinlich die 10- fach höhere Konzentration des PBUTs im Assay. Bei IS und pCS führt die Funkti onalisierung mit Phenylmolekülen (Phe) zu einer Erhöhung der Adsorptionskapazität auf 458 bzw. 372 pg g ' . Für die Funkti onalisierung mit den aliphatischen Molekülen (CIO) ist nur für IS eine verstärkte Adsorption beobachtbar (Fig. 4a). Für das Toxin PheAc konnte nach dem Einbau der hydrophoben Moleküle keine signifikante Verstärkung der Adsorption beobachtet werden. Um zu testen, ob ein hochgeordnetes Material mit gleichmäßiger Verteilung von Lösungsmittelkanälen und Poren für die Adsorption vorteilhaft ist, wurde das Material mit Proben von nichtkristallinem Proteinmaterial verglichen, das durch Zugabe eines Vernetzers zu einer Proteinlösung und Inkubation über Nacht hergestellt wurde (nicht dargestellt). Das resultierende Material wurde auf seine Adsorptionskapazität gegenüber IS getestet. Es konnte kein nennenswerter Unterschied zwischen den beiden Materialarten gefunden werden, was darauf hindeutet, dass die makroskopische Form des Materials die Adsorption des IS nicht beeinflusst. Die Kapazitäten des erfindungsgemäßen proteinbasierten Adsorbens liegen in einem ähnlichen Bereich, sind aber kleiner als die Werte anderer veröffentlichter Materialien, beispielsweise der P87-Zeolithe mit Kapazitäten von bis zu 1000 pg mL-1 [35] oder kohlenstoffbasierter Adsorbentien mit Kapazitäten von bis auf 3200 pg mL-1 [36] in Bezug auf IS. Nach Wissen der Erfinder ist das Adsorbens mit der höchsten bisher veröffentlichten Kapazität ein MOF auf Zirkoniumbasis mit einer Kapazität von bis zu 156 mg g'1 [24], Dennoch sind diese Materialien an sich gute Adsorptionsmaterialien, und es müssen Anstrengungen unternommen werden, um ihre Biokompatibilität zu verbessern. Demgegenüber weist das erfindungsgemäße proteinbasierte Material eine intrinsische Biokompatibilität auf. Die Adsorptionskapazität kann angepasst und weiter verbessert werden.
Um die Biokompatibilität des erfindungsgemäßen Materials zu zeigen, wurden Endothelzellen und isolierte Blutplättchen mit dem kristallinen Material inkubiert. Endothelzellen zeigen keine Expression von Tumornekrosefaktor-a (TNF-a), was auf keine Endotoxinkontamination durch den bakteriellen Ursprung des Materials hinweist (Fig. 4d). Blutplättchen zeigten keine Aktivierung, was darauf hinweist, dass das Material keine Blutgerinnung induzierte (Fig. 4c). Ähnliche Ergebnisse wurden für mit Glutaraldehyd vernetzte Kristalle erzielt (nicht dargestellt). Außerdem war kein großer Unterschied zwischen den chemisch modifizierten und nicht modifizierten Proteinmaterialien zu beobachten, was darauf hindeutet, dass die Funktionalisierung die Biokompatibilität nicht beeinflusst hat.
Insgesamt zeigt sich die gute Eignung des erfindungsgemäßen synthetisierten Materials basierend auf der Bottom-up-Assemblierung von Proteinkäfigen für Blutreinigungsanwendungen. Das resultierende Material zeigt Stabilität in blutähnlichen Systemen und eine gute Adsorption von drei PBUTs. Kristalline und nichtkristalline Adsorptionsmaterialien weisen ein ähnliches Verhalten auf. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass durch die Einführung von Ankerstellen bis zu 96 wasserunlösliche aliphatische und phenylische Moleküle in den Hohlraum des Ferri tin-Proteinkäfigs eingebaut wurden. Nach der Modifikation konnte keine Abnahme der Biokompatibilität beobachtet werden. Eine Erhöhung der Adsorptionskapazität aufgrund der chemischen Modifikationen ist zu beobachten. Durch Vorsehen anderer als ausschließlich hydrophober Liganden, beispielsweise amphiphiler Liganden, einer Mischung aus hydrophoben und hydrophilen Liganden oder der Modifikation der Aminosäurereste in der Umgebung der Liganden, kann die Adsorptionskapazität sehr wahrscheinlich noch gesteigert werden, da PBUTs hydrophobe und hydrophile Eigenschaften aufweisen. Der modulare Charakter des erfindungsgemäßen Materials ermöglicht eine Adaption für andere Anwendungen, beispielsweise Behandlungsstrategien bei Schwermetallvergiftungen durch Einbau von Chelatbildnern. Darüber hinaus können durch genetische Modifikationen positiv geladene Aminosäuren um die Ankerstellen herum eingeführt werden, um die negative Ladung der PBUTs zu befriedigen, während der hydrophobe Teil der Toxine an die eingefügten Moleküle gebunden wird. All diese Modifikationen an der Innenfläche haben keinen Einfluss auf den Zusammenbau des Materials.
2. Modifikation der inneren Oberfläche und des Kanalbereichs von erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikeln (ohne zusätzliche chemische Funktionalisierung).
Eine effiziente Adsorption an die erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel kann auch durch eine geeignete Kombination von Aminosäuren mit hydrophoben, aromatischen, polaren oder geladenen Seitenketten erreicht werden, wodurch bereits im unfunktionalisierten Protein Bindestellen im Inneren des Proteincontainer geschaffen werden. Dies ist beispielhaft in Figur 5b gezeigt. Hier wird das delokalisierte und hydrophobe Ringsystem des IS von dem Ringsystem der Aminosäure Tyrosin gebunden, während die polare negativ geladene Sulfatgruppe von partial positiv geladenen Stickstoffatomen in der Aminosäure Histidin stabilisiert wird. Zum Design dieser Proteinvarianten wurde mit Hilfe von „Ligand-Docking“- Protokollen des Softwarepakets Rosetta die Bindungsaffinität der Proteine zu den Toxinen bestimmt. Anschließend wurden im Computermodell zufällig diverse Aminosäuren im Protein verändert und die Affinität ein weiteres Mal bestimmt. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis keine Affinitätssteigerung mehr zu beobachten war. Die auf diese Weise designten Proteincontainer wurden im Labor hergestellt, sind weiterhin löslich und assemblieren zu vollständigen Containern. Die eingeführten Mutationen wurden durch ESI-MS Messungen bestätigt. Varianten mit erhöhter Affinität für IS wurden designt und erfolgreich hergestellt. Adsorptionsmittel aus diesen Varianten zeigten teilweise eine deutlich erhöhte Adsorptionskapazität gegenüber dem entsprechenden Toxin, wie in Fig. 5a (Ftn(neg)- Dock = Ftn(neg)-dock03, SEQ ID NO: 21) zu erkennen ist.
Weiterhin können Aminosäuren des Apoferritin-Nanopartikel gezielt ausgetauscht werden, um die Eigenschaften des Apoferritin-Nanopartikel zu verändern. Beispielsweise konnte durch Austausch von negativ geladenen Aminosäuren mit hydrophoben Aminosäuren das negative Oberflächenpotential im Bereich der inneren Kavität reduziert werden. Dadurch konnte eine deutliche Erhöhung der Adsorptionskapazität für die unter physiologischen Bedingungen ebenfalls negativ geladenen PBUTs erreicht werden (Figur 5a, Ftn(neg)-Ap = Ftn(neg)-Ap4, SEQ ID NO: 17). Da der modifizierte Bereich in der Nähe des Dreifachkanals liegt, kann angenommen werden, dass die erhöhte Adsorption auf einem verbesserten Stofftransport in den Inneren Bereich des Apoferritin-Nanopartikel zurückzuführen ist. Der Stofftransport in den Bereich der inneren Kavität kann weiterhin durch Modifikationen im Bereich des
Dreifachkanals verbessert werden. Beispielsweise führte der Austausch von Aminosäuren mit geladenen oder sterisch anspruchsvollen Resten mit der Aminosäure Alanin zu einer deutlichen Erhöhung der Adsorptionskapazität (Figur 5a, Ftn(neg)-Ap+Kanal = Ftn(neg)-Ap4-3 A, SEQ ID NO: 18). Durch Aminosäureaustausch geschaffene Bindestellen können mit Modifikationen, die den Stofftransport verbessern, kombiniert werden, um die Adsorption weiter zu verbessern. Außerdem sind auch Varianten mit mehr als einer Bindestelle pro Apoferritin-Untereinheit möglich.
Bei der oben schon erwähnten Variante Ftn(neg)-Ap4 (SEQ ID NO: 17) wurden Aminosäuren mit negativ geladenen Seitenketten, wie Glutamin- und Asparaginsäure, an vier Positionen (E61, E62, D131 und El 40) pro Untereinheit im inneren Hohlraum durch unpolare oder aromatische Derivate (E61V, E62A, D131F und E140W) ersetzt. Anhand des Oberflächenpotentials zeigte sich eine Verschiebung der Polarität von negativ nach ungeladen (nicht dargestellt). Allerdings verblieb ein negativ geladener Bereich auf der inneren Oberfläche, da die verantwortlichen Aminosäuren teilweise im Proteinrückgrat verborgen sind und Mutationen an diesen Stellen weggelassen wurden, um die Stabilität des Proteins aufrechtzuerhalten. Da die eingeführten Aminosäuren hydrophobe oder sogar aromatische Seitenketten tragen, ist es möglich, dass diese Reste auch als Adsorptionsstellen für die teilweise hydrophoben PBUTs fungieren können. Um unterscheiden zu können, ob mögliche Auswirkungen auf die Adsorptionskapazitäten auf eine allgemeine Verringerung der negativen Oberflächenladung oder auf eine spezifische Adsorption an hydrophobe Reste zurückzuführen sind, wurde eine weitere Variante mit der Bezeichnung Ftn(neg)-Apl6 entwickelt (SEQ ID NO: 20). Wie bei der Ap4-Variante wurden die vier geladenen Aminosäuren an den Positionen 61, 62, 131 und 140 durch unpolare Derivate (D an Position 131 nicht durch F, sondern durch W) ersetzt und zwölf zusätzliche unpolare Aminosäuren an oberflächenexponierten Positionen eingeführt.
Die Adsorptionskapazitäten von Ftn(neg)-Ap4 und Ftn(neg)-Apl6 wurden im Vergleich zu Ftn(neg) sowohl für kristalline als auch für nichtkristalline Formen ermittelt (s. Fig. 6; kristalline Formen linke Balken; nichtkristalline Formen rechte Balken). Beim Vergleich der Adsorptionskapazitäten der kristallinen Materialien gegenüber Indoxylsulfat (IS) konnte kein signifikanter Unterschied zwischen unmodifiziertem (Ftn(neg) und modifiziertem Ferritin (Ftn(neg)-Ap4, Ftn(neg)-Apl6) festgestellt werden (s. Fig. 6). Für das nichtkristalline Material konnte bei beiden Ap-Varianten jedoch eine deutliche Steigerung der Adsorptionskapazität beobachtet werden. Trotz der 12 zusätzlichen hydrophoben Aminosäuren ist die Adsorptionskapazität von Ftn(neg)-Apl6 ähnlich der von Ftn(neg)-Ap4. Die Verringerung der negativen Oberflächenladung scheint daher der Hauptgrund für die erhöhte PB UT -Adsorption zu sein. Das stimmt mit der Annahme überein, dass die Einführung hydrophober Moleküle nahezu keine signifikante Verbesserung der Adsorptionskapazität mit sich bringt, und die Änderung in der Absorptionskapazität auf eine allgemeine Verringerung negativer Ladungen zurückzuführen ist. Neben der Reduzierung der negativen Ladung im inneren Hohlraum und in den Poren des Proteinkäfigs wurde eine weitere Strategie zur Erhöhung der Adsorption von PBUTs verfolgt. Um sowohl den polaren als auch den hydrophoben Teil der PBUTs zu stabilisieren, wurde die Schaffung einer eindeutigen Bindungsstelle durch Einführung geeigneter Aminosäuren angestrebt. Zu diesem Zweck wurden Liganden-Docking-Protokolle der Rosetta-Software-Suite (s. [40]) eingesetzt. Als Ligand wurde IS eingesetzt. Drei weitere mögliche Ferritin-Varianten wurden ermittelt, Ftn(neg)-dock03 (SEQ ID NO: 21), Ftn(neg)-dock23 (SEQ ID NO: 22) und Ftn(neg)-dock43 (SEQ ID NO: 22). Die Bindungsstellen befinden sich in der Nähe des Dreifach- Kanals (Ftn(neg)-dock03), im Zentrum der Untereinheit (Ftn(neg)-dock23) und in der Nähe des 4- fach-Kanals (Ftn(neg)-dock43).
Die Adsorptionskapazitäten der neuen Varianten in Bezug auf IS wurden für kristalline Anordnungen bestimmt und sind in Figur 7 dargestellt. Wie aus Figur 7 ersichtlich, konnte die Adsorptionskapazität für alle drei Varianten im Vergleich zu unmodifiziertem Ftn(neg) deutlich verbessert werden (Ftn(neg)-03 = Ftn(neg)-dock03, Ftn(neg)-23 = Ftn(neg)-dock23, Ftn(neg)-43 = Ftn(neg)-dock43). Die Variante Ftn(neg)-03 zeigte die höchste Adsorptionskapazität mit einem nahezu verdoppelten Wert.
Die speziell für IS entwickelten drei Varianten Ftn(neg)-dock03, Ftn(neg)-dock23 und Ftn(neg)- dock43 wurden auch hinsichtlich ihrer Adsorptionskapazität gegenüber pCS und PheAc bestimmt, wie in Abbildung 8 dargestellt. Hier konnte ein interessanter Trend beobachtet werden: Während für IS die Varianten Ftn(neg)-03 und -43 beide besser abschnitten als Ftn(neg)- 23, schnitt die Variante Ftn(neg)-23 in Bezug auf pCS- und PheAc-Adsorption besser ab die anderen Varianten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Art Selektivität in den Bindungsstellen eingeführt werden kann, indem auf einzigartige Merkmale der Toxine abgezielt wird.
Es wurde darüber hinaus getestet, ob die verschiedenen Merkmale zur Erhöhung der Bindungskapazität der Proteine in einer Struktur kombiniert werden können. Die Mutationen, die die Bindungsstelle in Ftn(neg)-43 aufbauen, wurden mit den Mutationen von Ftn(neg)-Ap4-3 A kombiniert, um die Oberflächenladung am inneren Hohlraum und dem Dreifachkanal zu verringern, wodurch sich die Variante Ftn(neg)-Ap4-3A-43 ergab.
Die Adsorptionskapazität dieser Variante wurde für das Adsorbermaterial mit nichtkristalliner Morphologie bestimmt und mit den Ergebnissen für unmodifiziertes Ftn(neg) und die zuvor genannten Varianten verglichen (Figur 9). Die Messwerte deuten darauf hin, dass einzelne positive Effekte aufgrund unterschiedlicher Modifikationen durch die Kombination der Mutationen in einer Struktur addiert werden können. Die Variante Ftn(neg)-Ap4-3 A-43 zeigte die höchsten Adsorptionskapazitäten aller in dieser Studie untersuchten Varianten.
Der Vorteil einer bloßen Änderung der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikel durch Aminosäureaustausch ist, dass die Proteine ohne weitere chemische Modifikation verwendet werden können. Dies senkt die Wahrscheinlichkeit für allergische Reaktionen oder weitere Nebeneffekte und macht es in seiner Herstellung kostengünstiger als funktionalisierte Varianten. Stärkere Bindestellen können designt werden. Weiterhin eröffnet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, weitere Apoferritin-Nanopartikel oder Apoferritin- Nanopartikel-Zusammensetzungen mit weiter verbesserter, gegebenenfalls an bestimmte Toxine angepasster, Affinität bereitzustellen.
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Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse, wobei das Apoferritin-Nanopartikel Apoferritin-Untereinheiten umfasst, die zu dem Apoferritin-Nanopartikel zusammengesetzt einen inneren Hohlraum ausbilden, und wobei das Apoferritin-Nanopartikel in seinem inneren Hohlraum keine Nanopartikel enthält.
2. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der Apoferritin-Untereinheiten im Bereich des inneren Hohlraums und/oder im Bereich eines Dreifachkanals und/oder im Bereich eines Vierfachkanals eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweist.
3. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach Anspruch 2, wobei die mindestens eine Apoferritin-Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums mindestens einen im Vergleich zur Wildtypsequenz zusätzlichen oder an einer anderen Position in der Sequenz angeordneten Cysteinrest aufweist, und wobei die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz durch kovalente Bindung eines organischen Verbindungsrestes an den Cysteinrest funktionalisiert oder funktionalisierbar ist.
4. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach Anspruch 3, wobei die mindestens eine Apoferritin-Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums zwei, drei oder vier Cysteinreste aufweist, an die jeweils ein organischer Verbindungsrest kovalent gebunden ist.
5. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach Anspruch 3 oder 4, wobei der an den mindestens einen zusätzlichen oder an einer anderen Position in der Sequenz angeordneten Cysteinrest kovalent gebundene organische Verbindungsrest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-phenylacetamidyl, N- decylacetamidyl, N-(l-amino-2-phenylethyl)acetamidyl, N-(l-amino-2- phenylpropyl)acetamidyl, N-(l-amino-2-phenylbutyll)acetamidyl, N-(l, l-diamino-2- phenylethyl)acetamidyl, N-(l, l-diamino-2-phenylpropyl)acetamidyl, N-(l, l-diamino-2- phenylbutyll)acetamidyl, N-(3,4,5-tris(trifluoromethyl)phenyl)acetamidyl, N-(3,4,5- trinitrophenyl)acetamidyl, N-(l-amino-2-(3,4,5-trinitrophenyl)ethyl)acetamidyl und N-(2- (heptylamino)ethyl)acetamidyl.
6. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz dahingehend im Bereich des Hohlraums in ihrer Aminosäuresequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz geändert ist, dass das Apoferritin-Nanopartikel im Vergleich zu einem Apoferritin-Nanopartikel aus Apoferritin-Untereinheiten mit gegenüber der Wildtypsequenz unveränderter Aminosäuresequenz eine höhere Bindungsaffinität gegenüber einem Toxin aufweist.
7. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz dahingehend im Bereich eines Dreifachkanals in ihrer Aminosäuresequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz geändert ist, dass der Transport eines Toxins in den Hohlraum des Apoferritin-Nanopartikels gegenüber einem Apoferritin-Nanopartikel mit unveränderter Aminosäuresequenz erleichtert ist.
8. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Toxin ein proteingebundenes urämisches Toxin ist, das bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Indoxyl sulfat, Para-Kresyl sulfat, Phenylacetat und p-Hydroxyhippursäure.
9. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Apoferritin-Nanopartikel aus 24 Apoferritin-Untereinheit zusammengesetzt ist, und mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweisen.
10. Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach Anspruch 9, wobei die Untereinheiten eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 13-24, bevorzugt aus einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, oder SEQ ID NO: 24.
11. Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse, umfassend mehrere Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach Anspruch 11, wobei die mehreren Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin- Bindemittel bei der Hämodialyse nach einem der Ansprüche 1 bis 10 untereinander quervernetzt sind.
13. Sorptionskartusche, umfassend in ihrem Inneren mehrere Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eine Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach einem der Ansprüche 11 oder 12.
14. Sorptionskartusche nach Anspruch 13, wobei die mehreren Apoferritin-Nanopartikel oder die Zusammensetzung in einem ersten Kompartiment innerhalb der Sorptionskartusche enthalten sind, das über eine oder mehrere Membranen von einem zweiten Kompartiment innerhalb der Sorptionskartusche getrennt ist, wobei die Membran oder die Membranen für ungebundene Toxinmoleküle und/oder für Proteine mit daran gebundenen Toxinmolekülen durchlässig sind, nicht jedoch für die Apoferritin-Nanopartikel.
15. Dialysesystem, umfassend einen Dialysator und mindestens eine Sorptionskartusche nach einem der Ansprüche 13 oder 14.
16. Dialysesystem nach Anspruch 15, wobei die mindestens eine Sorptionskartusche in Flussrichtung des zu dialysierenden Blutes dem Dialysator a) vorgeschaltet, b) nachgeschaltet oder c) in einem Nebenkreislauf zum Dialysekreislauf angeordnet ist.
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