WO2024046999A1 - Lecithin-modified nanoscale oxygen carriers (lenox) - Google Patents

Lecithin-modified nanoscale oxygen carriers (lenox) Download PDF

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WO2024046999A1
WO2024046999A1 PCT/EP2023/073579 EP2023073579W WO2024046999A1 WO 2024046999 A1 WO2024046999 A1 WO 2024046999A1 EP 2023073579 W EP2023073579 W EP 2023073579W WO 2024046999 A1 WO2024046999 A1 WO 2024046999A1
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albumin
solution
artificial oxygen
lecithin
oxygen carrier
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PCT/EP2023/073579
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Andrea STEINBICKER
Katja FERENZ
Fabian Nocke
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Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main
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    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock

Definitions

  • the present invention relates to new, stable artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons, their production and their use as synthetic blood substitutes.
  • Perfluorocarbons are synthetically produced, perfluorinated carbon compounds (hydrocarbons whose hydrogen atoms are completely replaced by halogens, usually fluorine atoms). Due to the cavities between the individual molecules, they have a high solubility for respiratory gases such as oxygen and carbon dioxide compared to water, depending on the partial pressure, and can therefore take over or support the transport of oxygen in the blood instead of or together with erythrocytes. Oxygen uptake and release occurs two times faster than in erythrocytes and is directly proportional to the oxygen partial pressure. More than 90% of the dissolved oxygen is delivered to the tissue, achieving three times the oxygen extraction rate (oxygen delivery to the tissue) of an RBC.
  • perfluorocarbons Due to the very high carbon-fluorine binding energy, perfluorocarbons are chemically and metabolically inert, so that they do not react even with highly reactive compounds and do not form toxic degradation products. In terms of degradation, the perfluorodecalin (PFD) we use will be excreted in the air we breathe due to its high vapor pressure. High vapor pressure means that a liquid evaporates under mild conditions. Here this means that PFD comes to the lungs as a liquid and is then vaporized and exhaled.
  • PFD perfluorodecalin
  • EP0282948B1 and EP0282949B1 describe aqueous emulsions made from perfluorocarbons in which, among other things, phospholipids are used as emulsifiers. Additional emulsifier additives can also be present, such as: B. Albumin, especially bovine serum albumin (BSA). This can be present in the emulsion in an amount of 0.2-2% by weight as an “oncontic agent”.
  • CN111214459A (“Perfluorocarbon and albumin nanoparticles and application in production of tumor treating medicine thereof”) describes nanoparticles made of perfluorocarbon and albumin as a drug delivery system for “phosphonic acid drugs”.
  • a manufacturing process is described in which the “phosphonic acid drug” is in an emulsion in which, among other things: Lecithin and cholesterol may be included, to which perfluorocarbon/albumin nanoparticles are added to produce biologically active double membrane particles.
  • Lecithin and cholesterol may be included, to which perfluorocarbon/albumin nanoparticles are added to produce biologically active double membrane particles.
  • This publication therefore concerns liposomes. Nanoparticles with a shell made of albumin and lecithin are not described. The registration is not related to artificial oxygen carriers or blood substitute solutions, but to tumor therapy.
  • CN109908085A describes similar emulsions made from BSA, lecithin and perfluorocarbons.
  • the BSA does not serve as an emulsifier, but rather as an example protein for the drug carrier system.
  • nanoparticles with a shell made of albumin and lecithin are not explicitly described in the application.
  • the registration is not related to artificial oxygen carriers or blood replacement solutions, but rather to the therapy of heart failure.
  • EP0033402A1 describes a perfusate fluid which consists of a previously used crystalloid volume replacement solution (Ringer's solution) in which albumin is dissolved and which additionally contains, among other things, may contain a perfluorocarbon and an emulsifying agent.
  • the emulsifying agent can, among other things, be a phospholipid.
  • the albumin is not used as an emulsifier, but rather forms an additive in the carrier solution.
  • Jacoby C, et al. (in: Probing different perfluorocarbons for in vivo inflammation imaging by 19F MRI: image reconstruction, biological half-lives and sensitivity. NMR Biomed. 2014 Mar;27(3):261-71. doi: 10.1002/nbm.3059. Epub 2013 Dec 19. PMID: 24353148) describe PFCE emulsions that were generated by high pressure homogenization and further 10% w/w crown ether and 4% w/w purified egg lecithin E 80 S (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany) in isotonic buffer contained.
  • US 4,866,096 A describes a stable aqueous emulsion which contains 10-59% of an oxygen-transferring, saturated perfluorodecalin, triglycerides of fatty acids and 0.5-7% of a surface-active phospholipid and optionally albumin.
  • the emulsion is produced with cooling in a microfluidizer. It is also described that the emulsion is used as a synthetic blood substitute.
  • US 4,186,253 A describes the non-cooled production of a perfluorocarbon emulsion using nozzle-like emulsifiers, the emulsion being intended to be used in organ transplantation.
  • the emulsion also contains a modified Ringer's solution in which albumin is dissolved.
  • WO 94/18954 A1 describes microemulsions for use as blood substitutes which contain albumin, lecithin and perfluorodecalin.
  • perfluorocarbons are only used as artificial oxygen carriers in the form of emulsions, although the instability of the emulsions or the short half-life still cause difficulties (Lambert, E., Janjic, J.M. Quality by design approach identifies critical parameters Driving oxygen delivery performance in vitro for perfluorocarbon based artificial oxygen carriers. Sci Rep 11, 5569 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-84076-l).
  • Newer preparations e.g. Oxygent® (a 60% PFC emulsion with 58% perfluorooctyl bromide, 2% perfluorodecyl bromide and egg yolk phospholipids), work with a combination of the slightly less stabilizing (but better tolerated) phospholipids, e.g. from egg yolk and high molecular weight PFCs such as perfluorodecyl bromide (CF3(CF2)10Br), perfluorotributylamine (N(CF2CF2CF2CF3)3) or perfluoromethylcyclohexylpiperidine (C12F22N) (Ferenz KB, 2015. Artificial oxygen carriers - how long do we have to wait? Hemotherapy 25, 27-36).
  • PFCs such as perfluorodecyl bromide (CF3(CF2)10Br), perfluorotributylamine (N(CF2CF2CF2CF3)3) or perfluoromethylcyclohexy
  • the above object is achieved by a process for producing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs).
  • the method comprises the steps of a) providing a suitable aqueous albumin solution and mixing with at least one suitable artificial oxygen carrier based on perfluorocarbons, b) appropriate addition of lecithin, c) pre-emulsification by rapid stirring under suitable cooling, d) emulsification of the pre-emulsion from step c) under pressure via a high-pressure homogenizer with suitable cooling and subsequent storage for at least 30 minutes, also under suitable cooling.
  • PFOCs perfluorocarbons
  • albumin is in a concentration between 2-20%, preferably 5-10%, more preferably 5%, perfluorocarbon perfluorodecalin (PFD) in a concentration between 10-50%, preferably from 17%, lecithin in a concentration between 1-16%, preferably from 2%, in a medium selected from water and electrolytes in a plasma-like composition, preferably Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer's solution and hydroxy-ethyl -Starch, STEEN Solution, OCS solution and other crystalloid and colloidal volume replacement solutions.
  • PFD perfluorocarbon perfluorodecalin
  • the above object is achieved by an artificial oxygen carrier produced by a method according to the present invention.
  • the artificial oxygen carrier according to the invention has a higher stability compared to non-lecithin-containing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs) and can be produced directly in the typical crystalloid and colloidal volume replacement solutions, such as Sterofundin® ISO.
  • PFOCs perfluorocarbons
  • the above object is achieved by using the artificial oxygen carrier according to the present invention as a perfusion or transfusion solution or as a synthetic blood substitute.
  • the present inventors have already developed artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons, which were emulsified with 5% albumin (albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carrier, A-AOC) and which have already shown promising results (see, among others, Wrobeln A , et al. Albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers: A physico-chemical characterization and first in vivo evaluation of biocompatibility. Eur J Pharm Biopharm. 2017 Jun; 115:52-64. https://doi.Org/10.1016 /j.ejpb.2017.02.015. Epub 2017 Feb 20. PMID: 28232105).
  • Perfluorocarbon-based oxygen carriers from physics to physiology. Pfluegers Arch. 2021 Feb;473(2):139-150. Doi: 10.1007/s00424-020-02482-2. Epub 2020 Nov 3. PMID: 33141239; PMCID: PMC7607370).
  • DE102008045152A1 and EP 2 296 635 B1 relate to artificial oxygen carriers and their use.
  • the oxygen carriers are not yet stable in every carrier solution that is clinically desirable.
  • no stable emulsions could be generated in the typical crystalloid and colloidal volume replacement solutions such as Sterofundin® ISO, so the oxygen carriers cannot be used universally.
  • the above object is achieved by a process for producing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs).
  • the method first includes the step of providing a suitable aqueous albumin solution.
  • aqueous carriers suitable for use as artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons can be used.
  • the albumin is in a suitable aqueous buffer, water, a balanced full electrolyte solution for infusion therapy, such as Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer solution, STEEN solution, OCS solution and/or in hydroxyethyl starch solved.
  • a balanced full electrolyte solution for infusion therapy such as Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer solution, STEEN solution, OCS solution and/or in hydroxyethyl starch solved.
  • the typical crystalloid and colloidal volume replacement solutions, such as Sterofundin® ISO are particularly suitable.
  • the albumin used is not limited to one species.
  • a method according to the present invention is preferred, wherein the albumin is selected from Group consisting of mammalian albumin, human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA), or suitable derivatives thereof, such as pegylated albumins.
  • HSA human serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • the albumin solution is then mixed with at least one suitable artificial oxygen carrier based on perfluorocarbons.
  • All artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons can be used.
  • Lecithin is then added in a suitable manner.
  • Fat-free vegetable lecithin for example from soy with a purity of >97%, is preferred.
  • These new, stable oxygen carriers which the inventors call “Lecithin modified nanoscale oxygen carrier” (LENOX)
  • LNOX the precursors, called albumin-derived artificial oxygen carriers (A-AOCs) and organ-life fluid (OLF) in that lecithin is now added during the synthesis.
  • A-AOCs albumin-derived artificial oxygen carriers
  • OLF organ-life fluid
  • the phospholipid lecithin was also incorporated into the albumin shell.
  • the present emulsion has the advantage of not requiring any other stabilizers in addition to the two emulsifiers albumin and lecithin.
  • a method according to the present invention is therefore preferred, wherein the artificial oxygen carrier is produced or consists exclusively of the specified materials.
  • Both albumin and lecithin are already clinically approved for intravenous use.
  • the components used to produce an emulsion are first premixed to form a coarsely disperse preemulsion, which can also be referred to as a raw or preemulsion or premix. Homogenization then takes place, with the disperse phase being crushed into droplets (fine emulsification). The droplet size spectrum of the raw or preemulsion shifts significantly towards smaller drops.
  • O/W emulsions for parenteral use are usually produced by first premixing an oil phase and water phase using a rotor-stator stirrer to form a preemulsion.
  • the subsequent pre-emulsification of the mixture prepared above takes place by rapid stirring with suitable cooling.
  • the preemulsion is emulsified as above under (high) pressure via a high-pressure homogenizer, e.g. a counter-jet disperser (see e.g. DE 102018205 493 Al) with suitable cooling and subsequent storage for at least 30 minutes, also under suitable cooling.
  • a process according to the present invention is preferred, wherein the emulsification of the preemulsion takes place at a pressure between 10,000 PSI (approx. 689 bar) and 40,000 PSI (approx. 2758 bar), preferably at 30,000 PSI (2068 bar) and is optionally repeated several times , preferably between 1 and 12 times (more preferably between 5 and 10, ideally repeat 8 times)
  • the steps of the process relating in particular to homogenization and emulsification are carried out with suitable cooling at ⁇ 10 ° C or less, preferably at 4 ° C. Of course, freezing should be avoided.
  • PFOCs perfluorocarbons
  • albumin in a concentration between 2-20%, preferably 5-10%, more preferably about 5%
  • perfluorodecalin (PFD) in a concentration between about 10-50% being preferred of about 17%
  • lecithin can be emulsified in water in a concentration between about 1-16%, preferably about 2%.
  • albumin used leads, as an important advantage, to a physiological colloid osmotic pressure, with an optimum being surprisingly found at around 5%.
  • the combination PFOC + albumin + lecithin therefore leads to a stable formulation and a ready-to-use product in full electrolyte/volume replacement solution.
  • artificial oxygen carriers (AOC) with other albumin proportions are also advantageous (between 2 - 20%, 4 - 10%, 4 - 6%).
  • the emulsion is prepared at 20,000 PSI with BSA in water and the particle diameter in the emulsion is between 50 nm and 400 nm, more preferably between 60 nm and 300 nm, optimally between 70 nm and 250 nm is. See in particular Synthesis 5, below.
  • the average particle diameter in the emulsion prepared with BSA is 92.5 nm ⁇ 8.5 nm and the oxygen release is 3.99 pmol/mL ⁇ 0.20 pmol/mL.
  • a process according to the present invention is particularly preferred, in which the artificial oxygen carrier is produced exclusively from the specified materials, or albumin and lecithin are present as the only carriers and/or emulsifiers.
  • Another aspect of the present invention relates to an artificial oxygen carrier produced by a method according to the present invention.
  • an artificial oxygen carrier consisting of about 5% albumin, perfluorodecalin (PFD) at a concentration of about 17% and lecithin at a concentration of about 2% in a medium selected from water, Sterofundin® ISO, Ringerfundin® , STEEN solution, OCS solution, Ringer's solution and hydroxy-ethyl starch.
  • PFD perfluorodecalin
  • the artificial oxygen carrier according to the present invention is characterized in that it has a higher stability compared to non-lecithin-containing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs). This can be determined in particular by measuring the viscosity, particle size and distribution of the artificial oxygen carrier (see examples).
  • PFOCs perfluorocarbons
  • Another aspect of the present invention relates to a synthetic blood substitute comprising the artificial oxygen carrier according to the present invention.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of the artificial oxygen carrier according to the present invention as a perfusion or transfusion solution or as a synthetic blood substitute.
  • Another aspect of the present invention relates to the artificial oxygen carrier according to the present invention for use in the treatment and prevention of oxygen deficiency and/or blood deficiency in an organ or patient, particularly in a human.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for treating and/or preventing oxygen deficiency and/or blood deficiency in an organ or patient, comprising the use of the artificial oxygen carrier according to the present invention as a perfusion or transfusion solution or as a synthetic blood substitute, in particular a person.
  • the composition of the oxygen carrier according to the invention preferably consists of albumin, perfluorodecalin (PFD) and lecithin in water, the concentration of albumin being between 2-20%, preferably 5-10%, more preferably about 5%, the PFD Concentration between 10-50% (preferably 17%) and the lecithin concentration between 1-16% (preferably 2%).
  • the mean particle diameter with BSA is 92.5 nm ⁇ 8.5 nm and the oxygen release is 3.99 pmol/mL ⁇ 0.20 pmol/mL.
  • the addition of lecithin also surprisingly leads to significantly improved physicochemical properties of the nanoparticles obtained in this way compared to the previous OLF particles based only on albumin.
  • the oxygen carriers according to the invention (LENOX) are significantly smaller, less polydisperse and less cloudy than the previous OLF oxygen carriers (Fig. 1). They can be synthesized in particular with HSA as well as BSA and are stable in a larger temperature range (-20 to +100 °C).
  • the oxygen carriers according to the invention are long-term compatible with Ringer's solution, Sterofundin® ISO ( Figure 3), Ringerfundin®, STEEN solution, OCS solution and 6% HES (130/0.4) and can be used directly in these solutions synthesize stably.
  • Ringer's solution Sterofundin® ISO ( Figure 3)
  • Ringerfundin® Ringerfundin®
  • STEEN solution OCS solution
  • 6% HES 6% HES
  • the oxygen carriers according to the invention have very good properties in terms of stability, viscosity, particle size and oxygen release.
  • Figure 1 Viscosity curve of the OLF particles in comparison to the LENOX (example synthesis I, HSA).
  • Figure 2 Diameter (A) and polydispersion index (B) of the OLF particles compared to the LENOX (example synthesis I, HSA).
  • Figure 4 Diameter and polydispersion index of the OLF particles and the LENOX, synthesized in Sterofundin® ISO (example synthesis II).
  • FIG. 5 Microscopy images of OLF particles (state of the art) synthesized in Ringer solution (A), HES 6% (B) and Sterofundin® ISO (C).
  • the noisy background in images B and C suggests that these emulsions are destroyed.
  • the emulsion in image A is still intact, but shows particles > 1 pm.
  • the LENOX (example synthesis I, BSA) are not visible in the microscope because they are below the resolution limit (D).
  • the artifacts in image D are caused by residues on the Neubauer chamber and do not come from the emulsion drops.
  • Figure 7 Viscosity of the OLF particles and the LENOX (example synthesis II) before and after storage for 4 h at 37 °C.
  • perfluorodecalin HP F2 Chemicals, Lancashire, UK
  • Millipore water Q-Pod, Merck, Darmstadt, DE
  • albumin fraction V bovine serum albumin, Roth, Düsseldorf, DE
  • Albunorm human serum albumin, Octapharma, Langenfeld, DE
  • Lecithin (97%, Roth, Düsseldorf, DE) was also used for the newly developed oxygen carrier (LENOX).
  • Sterofundin® ISO B.Braun, Melsungen, DE
  • HES 6% Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE
  • Ringer's solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE
  • the particle size and the polydispersion index were determined using dynamic light scattering (Stabino Nano-flex, Particle Metrix, Inning am Ammersee, DE).
  • the oxygen capacity was measured with a respirometer (O2k, Oroboros Instruments, Innsbruck, AUT) and the turbidity with a photometer (Specord S600, Analytik) ena, Jena, DE).
  • the viscosity was determined using a rheometer (MCR 92, Anton Paar, Ostfildern, DE). The viscosity was determined at two different shear rates because some emulsions exhibited non-Newtonian behavior. A very low shear rate (50/s) and a physiological shear rate (645/s) were chosen.
  • Organ Life Fluid particles The synthesis of the pure Organ Life Fluid particles (OLF particles) corresponded to that in patent application DE102021211272.2.
  • 20 mL albumin (BSA or HSA) and 4 mL PFD were introduced and pre-emulsified with an Ultra-Turrax (T25 Basic, IKA-Werke, Staufen, DE) at 9,500 revolutions/min.
  • the preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed once at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar).
  • the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
  • Synthesis I-IV is carried out with a pressure of 30,000 PSI and a cycle rate of eight times, from Synthesis V onwards the pressure changes to 20,000 PSI and the cycle number changes to seven times.
  • LENOX For the synthesis of LENOX, 20 mL of a 5% albumin solution (bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA)) and 4 mL of PFD were presented. 0.4 g of lecithin was added to the 2-phase mixture and pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The pre-emulsion was then placed in the microfluidizer and the entire thing was processed eight times at a pressure of 30,000 PSI (approx. 2068 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of HES (6%).
  • BSA bovine serum albumin
  • 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution.
  • the mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax at 9,500 revolutions/min.
  • the preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed eight times at a pressure of 30,000 PSI (approx. 2068 bar).
  • the dispenser coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
  • the OriginPro® software (version 2020) was used for the statistical evaluation of the analysis data.
  • the experimental data presented below are the mean values of the groups ⁇ standard deviation. The standard deviation is shown in the form of error bars.
  • the LENOX have an average particle diameter of 92.5 ⁇ 8.5 nm (Synthesis I, BSA) or 123.5 ⁇ 2.2 nm (Synthesis I, HSA) and release 3.99 ⁇ 0.2 pmol of oxygen per mL Sample free (at 17 vol.%).
  • the emulsion has properties of a Newtonian fluid, with the viscosity only changing minimally as the shear rate increases. Compared to the LENOXs, the OLF particles form a non-Newtonian fluid, and the viscosity changes significantly as the shear rate changes (see Figure 1).
  • the mean particle diameter and the polydispersion index are significantly different between the OLF particles (HSA) and the LENOXs.
  • HSA OLF particles
  • a visually visible difference between the OLF emulsion and the LENOX emulsion is the turbidity.
  • the LENOX emulsion (Synthesis I, HSA) is significantly (*p ⁇ 0.001) more transparent to light with a wavelength of 860 nm than the OLF emulsion.
  • the OLF emulsion appears very cloudy, whereas the LENOXs emulsion appears clear.
  • both the OLF particles and the LENOX were synthesized in different perfusion media (Ringer's solution, Sterofundin® ISO and HAES 6%).
  • Ringer's solution an intact emulsion was created with both the OLF particles and the LENOX.
  • the OLF particles were visible under a light microscope, whereas the LENOX particles were too small to be seen under a light microscope.
  • the OLF particles When synthesized in Ringer's solution, the OLF particles are significantly larger than the LENOX particles in the same medium. Strong background noise can be seen in the light microscope images of the OLF particles in HES 6% and in Sterofundin® ISO. This is a sign of a destroyed emulsion. This means that no stable OLF emulsions are formed in HES 6% and in Sterofundin® ISO.
  • LENOX are significantly smaller, less polydisperse and less cloudy than the OLF particles.
  • LENOX can be synthesized with both HSA and BSA.
  • LENOX are more stable at different temperatures (-20 to +100 °C).
  • LENOX are compatible with Ringer solution, Sterofundin® ISO, STEEN solution, OCS solution and HAES 6%, OLF particles show incompatible behavior (viscosity, stability, etc.) in many of these solutions.
  • the particle size distribution was determined by dynamic light scattering (DLS) with Nano-flex (Microtrac). The refractive indices were adopted from previous work. The high and low temperature viscosity was determined individually for each batch and each test. After a zero measurement for 300 s with water, 1 ml of the sample was filled into a 2 mL reaction vessel and measured three times for 300 s.
  • DLS dynamic light scattering
  • Nano-flex Microtrac
  • a rheometer (MCR 92, Anton Paar) was used to measure the shear rate-dependent viscosity.
  • the software internal calibration process was used to set up and calibrate the device. For the measurement, 1 mL of the sample was placed on the measuring table and the system was put into measuring mode. The system was heated to 20 °C and the viscosity was measured at different shear rates. Immediately after the first measurement, the system was heated to 37 °C and the measurement was repeated to determine the high-temperature viscosity.
  • Oxygen release was measured using an SDR SensorDish Reader (PreSens) under hypoxic conditions.
  • PreSens SDR SensorDish Reader
  • 0.5 ml of water or saline solution was prepared per well in a special 24-well plate equipped with oxygen sensors (OxoDish OD 24, PreSens). This plate was stored under a hypoxic workstation (Whitley H35) (1% O2, 5% CO2, 94% N2) until the oxygen level no longer changed.
  • 2.5 mL of the sample was transferred to a gas-tight flask and oxygenated with 100% O2 at a gas flow of 0.5 mL/min for 15 minutes.
  • 0.5 ml of the previously oxygenated sample was added to each well and the oxygen release was measured until the value returned to baseline.
  • Zeta potential The zeta potential was determined by stream potential measurement (Stabino Zeta, Microtrac). For the zeta potential measurements, 1 ml of the sample was filled into the specific volumetric flask and the flask was connected to the measuring system (Stabino, Microtrac). The sample was measured ten times for 10 s each and the results were averaged.
  • LENOX For the synthesis of LENOX, 20 mL of a 5% albumin solution (bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA)) and 4 mL of PFD were presented. 0.4 g of lecithin was added to the 2-phase mixture and pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed seven times at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of HES (6%).
  • BSA bovine serum albumin
  • 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution.
  • the mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min).
  • the preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed seven times at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
  • BSA bovine serum albumin
  • bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of Sterofundin ISO.
  • PFD bovine serum albumin
  • lecithin 4 mL of lecithin were added to this solution.
  • the mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min).
  • the pre-emulsion was then placed into the microfluidizer and at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar) the entire volume was cycled through the microfluidizer seven times.
  • PSI approximately 1379 bar
  • d stands for the hydrodynamic diameter of the particles and S for the range of the particle size distribution.
  • dlO means that 10% of the measured particles are exactly the same size or smaller than the specified particle diameter, d50 corresponds to 50% and d90 corresponds to 90%.
  • dlO 75 nm means that 10% of the measured particles were 75 nm or smaller.
  • Viscosity (at 200 s' 1 ):
  • LENOX was stored upright in completely filled 2 mL reaction vessels at 4 °C. The emulsion was analyzed every 7 days for a period of 42 days. Each batch of LENOX was divided into six reaction vessels so that one closed vessel was used each day and the already opened vessels were discarded.
  • Viscosity (at 200 s' 1 )

Abstract

The present invention relates to a novel type of composition for developing stable synthetic perfluoro-hydrocarbon-based oxygen carriers, the manufacturing thereof, and the use thereof as a synthetic blood and oxygen substitute carrier and as a volume replacement.

Description

Lecithin-modifizierte nanoskalierte Sauerstoffträger (LENOX) Lecithin-modified nanoscaled oxygen carriers (LENOX)
Die vorliegende Erfindung betrifft neue, stabile künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, deren Herstellung und ihre Verwendung als synthetischer Blutersatz. The present invention relates to new, stable artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons, their production and their use as synthetic blood substitutes.
Hintergrund der Erfindung Background of the invention
Perfluorcarbone (PFCs) sind synthetisch hergestellte, perfluorierte Kohlenstoffverbindungen (Kohlenwasserstoffe, deren Wasserstoff-Atome vollständig durch Halogene, meist Fluor- Atome ersetzt sind). Aufgrund von Hohlräumen zwischen den einzelnen Molekülen weisen sie im Vergleich zu Wasser, in Abhängigkeit vom Partialdruck, eine hohe Löslichkeit für respiratorische Gase wie Sauerstoff und Kohlendioxid auf und können daher anstelle von oder auch zusammen mit Erythrozyten den Sauerstofftransport im Blut übernehmen bzw. diesen unterstützen. Die Sauerstoffaufnahme und -abgabe erfolgt zwei Mal schneller als bei Erythrozyten und direkt proportional zum Sauerstoffpartialdruck. Mehr als 90% des gelösten Sauerstoffs werden an das Gewebe abgegeben, wodurch die dreifache Sauerstoff- Extraktionsrate (Sauerstoffabgabe an das Gewebe) eines Erythrozyten erreicht wird. Aufgrund der sehr hohen Kohlenstoff-Fluor Bindungsenergie sind Perfluorcarbone chemisch und metabolisch inert, so dass sie auch mit hochreaktiven Verbindungen keine Reaktion eingehen und keine toxischen Abbauprodukte bilden. Bezüglich des Abbaus wird das von uns verwendete Perfluorodecalin (PFD), aufgrund seines hohen Dampfdrucks mit der Atemluft ausgeschieden werden. Hoher Dampfdruck bedeutet, dass eine Flüssigkeit unter milden Bedingungen evaporiert. Hier bedeutet das, dass PFD als Flüssigkeit zur Lunge kommt und dann verdampft und ausgeatmet wird. Perfluorocarbons (PFCs) are synthetically produced, perfluorinated carbon compounds (hydrocarbons whose hydrogen atoms are completely replaced by halogens, usually fluorine atoms). Due to the cavities between the individual molecules, they have a high solubility for respiratory gases such as oxygen and carbon dioxide compared to water, depending on the partial pressure, and can therefore take over or support the transport of oxygen in the blood instead of or together with erythrocytes. Oxygen uptake and release occurs two times faster than in erythrocytes and is directly proportional to the oxygen partial pressure. More than 90% of the dissolved oxygen is delivered to the tissue, achieving three times the oxygen extraction rate (oxygen delivery to the tissue) of an RBC. Due to the very high carbon-fluorine binding energy, perfluorocarbons are chemically and metabolically inert, so that they do not react even with highly reactive compounds and do not form toxic degradation products. In terms of degradation, the perfluorodecalin (PFD) we use will be excreted in the air we breathe due to its high vapor pressure. High vapor pressure means that a liquid evaporates under mild conditions. Here this means that PFD comes to the lungs as a liquid and is then vaporized and exhaled.
Aufgrund der LTnlöslichkeit von Perfluorocarbonen sowohl in Wasser als auch in Öl ist entweder eine Emulgierung oder Verkapselung erforderlich, um entsprechende PFC-basierte Sauerstoffträger (PFOCs) als Zusatz zu einem Perfusionsmedium bzw. Transfusionsmedium zu verwenden. EP0282948B1 und EP0282949B1 beschreiben wässrige Emulsionen aus Perfluorcarbonen, bei denen u. a. Phospholipide als Emulgatoren eingesetzt werden. Dabei können noch zusätzlich Emulgatorhilfsstoffe anwesend sein, wie z. B. Albumin, insbesondere bovines Serumalbumin (BSA). Dies kann in der Emulsion in einer Menge von 0,2-2 Gewichts% als „oncontic agent“ vorliegen. Due to the insolubility of perfluorocarbons in both water and oil, either emulsification or encapsulation is required to use corresponding PFC-based oxygen carriers (PFOCs) as an additive to a perfusion medium or transfusion medium. EP0282948B1 and EP0282949B1 describe aqueous emulsions made from perfluorocarbons in which, among other things, phospholipids are used as emulsifiers. Additional emulsifier additives can also be present, such as: B. Albumin, especially bovine serum albumin (BSA). This can be present in the emulsion in an amount of 0.2-2% by weight as an “oncontic agent”.
CN111214459A (“Perfluorocarbon and albumin nanoparticles and application in production of tumor treating medicine thereof ‘) beschreibt Nanopartikel aus Perfluorcarbon und Albumin als Drug-Delivery-System für “phosphonic acid drugs“. Es wird ein Herstellungsverfahren beschrieben, in dem die „phosphonic acid drug“ in einer Emulsion, in der u. a. Lecithin und Cholesterin enthalten sein kann, zu den Perfluorcarbon/ Albumin Nanopartikeln gegeben wird, um biologisch aktive Doppelmembran-Partikel zu erzeugen. Diese Publikation betrifft somit Liposomen. Nanopartikel mit einer Hülle aus Albumin und Lecithin werden nicht beschrieben. Die Anmeldung steht nicht in Zusammenhang mit künstlichen Sauerstoffträgem bzw. Blutersatz -Lösungen, sondern der Tumortherapie. CN111214459A (“Perfluorocarbon and albumin nanoparticles and application in production of tumor treating medicine thereof”) describes nanoparticles made of perfluorocarbon and albumin as a drug delivery system for “phosphonic acid drugs”. A manufacturing process is described in which the “phosphonic acid drug” is in an emulsion in which, among other things: Lecithin and cholesterol may be included, to which perfluorocarbon/albumin nanoparticles are added to produce biologically active double membrane particles. This publication therefore concerns liposomes. Nanoparticles with a shell made of albumin and lecithin are not described. The registration is not related to artificial oxygen carriers or blood substitute solutions, but to tumor therapy.
CN109908085A beschreibt ähnliche Emulsionen aus BSA, Lecithin und Perfluorcarbonen. Das BSA dient nicht als Emulgator, sondern als Beispielprotein für das Drug-Carrier-System. Nanopartikel mit einer Hülle aus Albumin und Lecithin werden aber in der Anmeldung nicht explizit beschrieben. Die Anmeldung steht auch nicht in Zusammenhang mit künstlichen Sauerstoffträgem bzw. Blutersatz -Lösungen, sondern der Therapie der Herzinsuffizienz. CN109908085A describes similar emulsions made from BSA, lecithin and perfluorocarbons. The BSA does not serve as an emulsifier, but rather as an example protein for the drug carrier system. However, nanoparticles with a shell made of albumin and lecithin are not explicitly described in the application. The registration is not related to artificial oxygen carriers or blood replacement solutions, but rather to the therapy of heart failure.
EP0033402A1 beschreibt eine Perfusatflüssigkeit, die aus einer früher verwendeten, kristalloiden Volumenersatzlösung (Ringer-Lösung) besteht, in der Albumin gelöst ist und das zusätzlich u. a. einen Perfluorkohlenstoff und ein Emulgiermittel enthalten kann. Das Emulgiermittel kann u. a. ein Phospholipid sein. Das Albumin wird in diesem Fall nicht als Emulgator eingesetzt, sondern bildet einen Zusatz in der Trägerlösung. EP0033402A1 describes a perfusate fluid which consists of a previously used crystalloid volume replacement solution (Ringer's solution) in which albumin is dissolved and which additionally contains, among other things, may contain a perfluorocarbon and an emulsifying agent. The emulsifying agent can, among other things, be a phospholipid. In this case, the albumin is not used as an emulsifier, but rather forms an additive in the carrier solution.
Jacoby C, et al. (in: Probing different perfluorocarbons for in vivo inflammation imaging by 19F MRI: image reconstruction, biological half-lives and sensitivity. NMR Biomed. 2014 Mar;27(3):261-71. doi: 10.1002/nbm.3059. Epub 2013 Dec 19. PMID: 24353148) beschreiben PFCE-Emulsionen, die durch Hochdmck-Homogenisierung erzeugt wurden und weiter 10% w/w Kronenether und 4% w/w gereinigtes Ei-Lecithin E 80 S (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany) in isotonischem Puffer enthielten. US 4 866 096 A beschreibt eine stabile wässrige Emulsion, welche 10-59% eines Sauerstoffübertragenden, gesättigten Perfluordecalins enthält, Triglyceride von Fettsäuren und 0.5-7% eines oberflächenaktiven Phospholipids sowie gegebenenfalls Albumin. Die Emulsion wird unter Kühlen in einem Mikrofluidizer hergestellt. Des Weiteren wird beschrieben, dass die Emulsion als synthetischer Blutersatz verwendet wird. Jacoby C, et al. (in: Probing different perfluorocarbons for in vivo inflammation imaging by 19F MRI: image reconstruction, biological half-lives and sensitivity. NMR Biomed. 2014 Mar;27(3):261-71. doi: 10.1002/nbm.3059. Epub 2013 Dec 19. PMID: 24353148) describe PFCE emulsions that were generated by high pressure homogenization and further 10% w/w crown ether and 4% w/w purified egg lecithin E 80 S (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany) in isotonic buffer contained. US 4,866,096 A describes a stable aqueous emulsion which contains 10-59% of an oxygen-transferring, saturated perfluorodecalin, triglycerides of fatty acids and 0.5-7% of a surface-active phospholipid and optionally albumin. The emulsion is produced with cooling in a microfluidizer. It is also described that the emulsion is used as a synthetic blood substitute.
Jägers et al. (in: "Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology", PFLÜGERS ARCHIV - EUROPEAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY, Bd. 473, Nr. 2, 3. November 2020, Seiten 139-150) beschreiben stabile Emulsionen, welche Perfluordecalin (PFD) zusammen mit Lecithin enthalten. Albumin wird in dieser Veröffentlichung ausdrücklich erwähnt als ein Emulgator, um die Stabilität der Emulsion zu erhöhen. Eine Kombination aus Albumin, Lecithin und Perfluordecalin ist jedoch nicht beschrieben. Jägers et al. (in: "Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology", PFLÜGERS ARCHIVE - EUROPEAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY, Vol. 473, No. 2, November 3, 2020, pages 139-150) describe stable emulsions containing perfluorodecalin (PFD ) contained together with lecithin. Albumin is specifically mentioned in this publication as an emulsifier to increase the stability of the emulsion. However, a combination of albumin, lecithin and perfluorodecalin has not been described.
US 4 186 253 A beschreibt die nicht gekühlte Herstellung einer Perfluorcarbon-Emulsion mittels düsenartigen Emulgatoren, wobei die Emulsion bei der Organtransplantation verwendet werden soll. Die Emulsion enthält weiterhin eine modifizierte Ringerlösung, in welcher Albumin gelöst ist. US 4,186,253 A describes the non-cooled production of a perfluorocarbon emulsion using nozzle-like emulsifiers, the emulsion being intended to be used in organ transplantation. The emulsion also contains a modified Ringer's solution in which albumin is dissolved.
WO 94/18954 Al beschreibt Mikroemulsionen für die Verwendung als Blutersatz, die Albumin, Lecithin und Perfluordecalin enthalten. WO 94/18954 A1 describes microemulsions for use as blood substitutes which contain albumin, lecithin and perfluorodecalin.
Bei den bisherigen in-vivo-Forschungsansätzen werden Perfluorcarbone als künstliche Sauerstoffträger nur in Form von Emulsionen eingesetzt, wobei unter anderem die Instabilität der Emulsionen oder die kurze Halbwertszeit noch Schwierigkeiten bereiten (Lambert, E., Janjic, J.M. Quality by design approach identifies critical parameters driving oxygen delivery performance in vitro for perfluorocarbon based artificial oxygen carriers. Sei Rep 11, 5569 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-84076-l). In previous in-vivo research approaches, perfluorocarbons are only used as artificial oxygen carriers in the form of emulsions, although the instability of the emulsions or the short half-life still cause difficulties (Lambert, E., Janjic, J.M. Quality by design approach identifies critical parameters Driving oxygen delivery performance in vitro for perfluorocarbon based artificial oxygen carriers. Sci Rep 11, 5569 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-84076-l).
Produkte wie Fluosol-DA®, Perftoran® und Oxycyte® wurden zwar in klinischen Studien geprüft, allerdings ist aufgrund von aufgetretenen Nebenwirkungen bisher keines der Präparate in Europa oder den USA zugelassen (Ferenz KB, Steinbicker AU. Artificial Oxygen Carriers- Past, Present, and Future-a Review of the Most Innovative and Clinically Relevant Concepts. J Pharmacol Exp Ther. 2019 May;369(2):300-310. doi: 10.1124/jpet.118.254664. Epub 2019 Mar 5. PMID: 30837280). Products such as Fluosol-DA®, Perftoran® and Oxycyte® have been tested in clinical studies, but none of the preparations have yet been approved in Europe or the USA due to side effects that have occurred (Ferenz KB, Steinbicker AU. Artificial Oxygen Carriers- Past, Present, and Future-a Review of the Most Innovative and Clinically Relevant Concepts. J Pharmacol Exp Ther. 2019 May;369(2):300-310. doi: 10.1124/jpet.118.254664. Epub 2019 Mar 5. PMID: 30837280).
Neuere Präparate, z.B. Oxygent® (eine 60% PFC Emulsion mit 58% Perfluoroctylbromid, 2% Perfluordecylbromid und Eigelb Phospholipiden), arbeiten mit einer Kombination aus den etwas schlechter stabilisierenden (aber besser verträglichen) Phospholipiden, z.B. aus Eigelb und hochmolekularen PFCs wie z.B. Perfluordecylbromid (CF3(CF2)10Br), Perfluortributylamin (N(CF2CF2CF2CF3)3) oder Perfluormethylcyclohexylpiperidin (C12F22N) (Ferenz KB, 2015. Künstliche Sauerstoffträger - wie lange müssen wir noch warten? Hämotherapie 25, 27-36). Newer preparations, e.g. Oxygent® (a 60% PFC emulsion with 58% perfluorooctyl bromide, 2% perfluorodecyl bromide and egg yolk phospholipids), work with a combination of the slightly less stabilizing (but better tolerated) phospholipids, e.g. from egg yolk and high molecular weight PFCs such as perfluorodecyl bromide (CF3(CF2)10Br), perfluorotributylamine (N(CF2CF2CF2CF3)3) or perfluoromethylcyclohexylpiperidine (C12F22N) (Ferenz KB, 2015. Artificial oxygen carriers - how long do we have to wait? Hemotherapy 25, 27-36).
Trotz bestimmter Fortschritte in diesem Bereich besteht immer noch das Problem, dass Perfluorkohlenwasserstoffe nicht so stabil in wässriger Lösung emulgiert werden können, dass sie effektiv als Zusatz zu einem Perfusionsmedium bzw. Transfusionsmedium verwendet werden können. Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, entsprechend verbesserte Verfahren zur Herstellung von künstlichen Sauerstoffträgem auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen und entsprechend verbesserte Zusammensetzungen bereitzustellen. Weitere Aufgaben von künstlichen Sauerstoffträgem werden der Fachperson bei der Lektüre des „Stand der Technik“ im Folgenden in einer detaillierten Beschreibung und in Abbildungen und Beispielen dargestellt. Despite certain advances in this area, there is still the problem that perfluorocarbons cannot be emulsified in aqueous solution so stably that they can be used effectively as an additive to a perfusion medium. It is therefore an object of the present invention to provide correspondingly improved processes for producing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons and correspondingly improved compositions. Further tasks of artificial oxygen carriers will be presented to the person skilled in the art when reading the “State of the Art” in a detailed description and in illustrations and examples.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von künstlichen Sauerstoffträgern auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) gelöst. Das Verfahren umfasst die Schritte von a) Bereitstellen einer geeigneten wässrigen Albuminlösung und Mischen mit mindestens einem geeigneten künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, b) Geeignetes Hinzufügen von Lecithin, c) Präemulgation durch schnelles Rühren unter geeigneter Kühlung, d) Emulgieren der Präemulsion aus Schritt c) unter Druck über einen Hochdruck-Homogeni sator unter geeigneter Kühlung und anschließender Lagerung für mindestens 30 min ebenfalls unter geeigneter Kühlung. In a first aspect of the present invention, the above object is achieved by a process for producing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs). The method comprises the steps of a) providing a suitable aqueous albumin solution and mixing with at least one suitable artificial oxygen carrier based on perfluorocarbons, b) appropriate addition of lecithin, c) pre-emulsification by rapid stirring under suitable cooling, d) emulsification of the pre-emulsion from step c) under pressure via a high-pressure homogenizer with suitable cooling and subsequent storage for at least 30 minutes, also under suitable cooling.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei Albumin in einer Konzentration zwischen 2-20 %, bevorzugt von 5-10 %, weiter bevorzugt von 5%, Perfluorkohlenwasserstoff Perfluordecalin (PFD) in einer Konzentration zwischen 10-50 %, bevorzugt von 17 %, Lecithin in einer Konzentration zwischen 1-16%, bevorzugt von 2 %, in einem Medium ausgewählt aus Wasser und Elektrolyten in einer plasma-ähnlichen Zusammensetzung, bevorzugt Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer-Lösung und Hydroxy-Ethyl-Stärke, STEEN- Solution, OCS-Lösung und anderen kristalloiden und kolloidalen Volumenersatzlösungen emulgiert werden. A method according to the present invention is preferred, wherein albumin is in a concentration between 2-20%, preferably 5-10%, more preferably 5%, perfluorocarbon perfluorodecalin (PFD) in a concentration between 10-50%, preferably from 17%, lecithin in a concentration between 1-16%, preferably from 2%, in a medium selected from water and electrolytes in a plasma-like composition, preferably Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer's solution and hydroxy-ethyl -Starch, STEEN Solution, OCS solution and other crystalloid and colloidal volume replacement solutions.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der künstliche Sauerstoffträger ausschließlich aus den angegebenen Materialien hergestellt wird. Further preferred is a method according to the present invention, wherein the artificial oxygen carrier is produced exclusively from the specified materials.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe durch einen künstlichen Sauerstoffträger gelöst, der nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt ist. In a second aspect of the present invention, the above object is achieved by an artificial oxygen carrier produced by a method according to the present invention.
Der erfindungsgemäße künstliche Sauerstoffträger weist eine höhere Stabilität gegenüber nicht Lecithin-haltigen künstlichen Sauerstoffträgern auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) auf und kann direkt in den typischen kristalloiden und kolloidalen Volumenersatzlösungen, wie etwa Sterofundin® ISO hergestellt werden. The artificial oxygen carrier according to the invention has a higher stability compared to non-lecithin-containing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs) and can be produced directly in the typical crystalloid and colloidal volume replacement solutions, such as Sterofundin® ISO.
In einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe durch die Verwendung des künstlichen Sauerstoffträgers gemäß der vorliegenden Erfindung als Perfusions- oder Transfusionslösung oder als synthetischer Blutersatz gelöst. In a third aspect of the present invention, the above object is achieved by using the artificial oxygen carrier according to the present invention as a perfusion or transfusion solution or as a synthetic blood substitute.
Von Seiten der vorliegenden Erfinder wurden auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, bereits künstliche Sauerstoffträger entwickelt, die mit 5 % Albumin emulgiert wurden (albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carrier, A-AOC) und die bereits vielversprechende Ergebnisse zeigten (siehe u.a., Wrobeln A, et al. Albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers: A physico-chemical characterization and first in vivo evaluation of biocompatibility. Eur J Pharm Biopharm. 2017 Jun; 115:52-64. https://doi.Org/10.1016/j.ejpb.2017.02.015. Epub 2017 Feb 20. PMID: 28232105). The present inventors have already developed artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons, which were emulsified with 5% albumin (albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carrier, A-AOC) and which have already shown promising results (see, among others, Wrobeln A , et al. Albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers: A physico-chemical characterization and first in vivo evaluation of biocompatibility. Eur J Pharm Biopharm. 2017 Jun; 115:52-64. https://doi.Org/10.1016 /j.ejpb.2017.02.015. Epub 2017 Feb 20. PMID: 28232105).
Bisher konnten diese Sauerstoffträger erfolgreich zur Gewebeoxygenierung im Blutaustauschmodell (in der Ratte) sowie zur Prävention der Taucherkrankheit (in der Ratte) eingesetzt werden (Wrobeln A, Jägers J, Quinting T, Schreiber T, Kirsch M, Fandrey J, Ferenz KB. Albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers can avoid hypoxic tissue damage in massive hemodilution. Sei Rep. 2020 Jul 20; 10(1): 11950. Doi: 10.1038/s41598-020- 68701-z. PMID: 32686717; PMCID: PMC7371727, Mayer D, Guerrero F, Goanvec C, Hetzel L, Linders J, Ljubkovic M, Kreczy A, Mayer C, Kirsch M, Ferenz KB. Prevention of Decompression Sickness by Novel Artificial Oxygen Carriers. Med Sei Sports Exerc. 2020 Oct;52(10):2127-2135. Doi: 10.1249/MSS.0000000000002354. PMID: 32251255.). Auch im Bereich der Transplantationsmedizin konnten die Erfinder an extrakorporal perfundierten Organen (Organe ausserhalb des Organismus, wie isoliertes Herz oder isolierte Niere) eine erfolgreiche Gewebeoxygenierung zeigen (Jägers J, Wrobeln A, Ferenz KB. Perfluorocarbon- based oxygen carriers: from physics to physiology. Pflügers Arch. 2021 Feb;473(2):139-150. Doi: 10.1007/s00424-020-02482-2. Epub 2020 Nov 3. PMID: 33141239; PMCID: PMC7607370). So far, these oxygen carriers have been successfully used for tissue oxygenation in the blood exchange model (in the rat) and for the prevention of diving sickness (in the rat) (Wrobeln A, Jägers J, Quinting T, Schreiber T, Kirsch M, Fandrey J, Ferenz KB. Albumin- derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers can avoid hypoxic tissue damage in massive hemodilution. Be Rep. 2020 Jul 20; 10(1): 11950. Doi: 10.1038/s41598-020-68701-z. PMID: 32686717; PMCID: PMC7371727, Mayer D, Guerrero F, Goanvec C, Hetzel L, Linders J, Ljubkovic M, Kreczy A, Mayer C, Kirsch M, Ferenz KB. Prevention of Decompression Sickness by Novel Artificial Oxygen Carriers. Med Sei Sports Exerc. 2020 Oct;52(10):2127-2135. Doi: 10.1249/MSS.0000000000002354. PMID: 32251255.). In the field of transplantation medicine, the inventors were also able to demonstrate successful tissue oxygenation on extracorporeally perfused organs (organs outside the organism, such as an isolated heart or kidney) (Jägers J, Wrobeln A, Ferenz KB. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. Pfluegers Arch. 2021 Feb;473(2):139-150. Doi: 10.1007/s00424-020-02482-2. Epub 2020 Nov 3. PMID: 33141239; PMCID: PMC7607370).
DE102008045152A1 und EP 2 296 635 Bl betreffen künstliche Sauerstoffträger und ihre Verwendung. Allerdings sind die Sauerstoffträger bisher nicht in jeder Trägerlösung stabil, die klinisch wünschenswert ist. Insbesondere in den typischen kristalloiden und kolloidalen Volumenersatzlösungen wie Sterofundin® ISO konnten keine stabilen Emulsionen generiert werden, somit sind die Sauerstoffträger nicht universell einsetzbar. DE102008045152A1 and EP 2 296 635 B1 relate to artificial oxygen carriers and their use. However, the oxygen carriers are not yet stable in every carrier solution that is clinically desirable. In particular, no stable emulsions could be generated in the typical crystalloid and colloidal volume replacement solutions such as Sterofundin® ISO, so the oxygen carriers cannot be used universally.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird - wie oben erwähnt - die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von künstlichen Sauerstoffträgem auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) gelöst. Das Verfahren umfasst zunächst den Schritt von Bereitstellen einer geeigneten wässrigen Albuminlösung. In a first aspect of the present invention - as mentioned above - the above object is achieved by a process for producing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs). The method first includes the step of providing a suitable aqueous albumin solution.
Grundsätzlich sind alle für die Verwendung im Rahmen als künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen geeigneten wässrigen Träger verwendbar. Bevorzugt wird das Albumin in einem geeigneten, wässrigen Puffer, Wasser, einer ausbalancierten vollen Elektrolytlösung für die Infusionstherapie, wie z.B. Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer- Lösung, STEEN-Solution, OCS-Lösung und/oder in Hydroxy-Ethyl-Stärke gelöst. Besonders geeignet sind die typischen kristalloiden und kolloidalen Volumenersatzlösungen, wie etwa Sterofundin® ISO. In principle, all aqueous carriers suitable for use as artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons can be used. Preferably, the albumin is in a suitable aqueous buffer, water, a balanced full electrolyte solution for infusion therapy, such as Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer solution, STEEN solution, OCS solution and/or in hydroxyethyl starch solved. The typical crystalloid and colloidal volume replacement solutions, such as Sterofundin® ISO, are particularly suitable.
Grundsätzlich ist das verwendete Albumin nicht auf eine Spezies beschränkt. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Albumin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säugetier-Albumin, humanem Serumalbumin (HSA) und bovinem Serumalbumin (BSA), oder geeigneten Derivaten davon, wie etwa pegylierten Albuminen. In principle, the albumin used is not limited to one species. A method according to the present invention is preferred, wherein the albumin is selected from Group consisting of mammalian albumin, human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA), or suitable derivatives thereof, such as pegylated albumins.
Anschließend wird die Albuminlösung mit mindestens einem geeigneten künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen vermischt. Es können alle künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen verwendet werden. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Perfluordecalin, Perfluordecylbromid, Perfluortributylamin, Perfluormethylcyclohexylpiperidin, Perfluordichloroctan, Perfluortertbutylcyclohexan, Perfluor- 15 -kronen-5 -ether, Dodecafluorpentan, Perfluoroctylbromid und Perfluorocyclohexan. Weiter geeignet sind künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen wie publiziert in Wesseler (Eugene P. Wesseler, Ronald Iltis, Leland C. Clark, The solubility of oxygen in highly fluorinated liquids, Journal of Fluorine Chemistry, Volume 9, Issue 2, 1977, Pages 137-146, ISSN 0022-1139, https://doi.org/10.1016/S0022-1139(00)82152-1), dort insbesondere in Tabelle 2. The albumin solution is then mixed with at least one suitable artificial oxygen carrier based on perfluorocarbons. All artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons can be used. Preferred is a process according to the present invention, wherein the artificial oxygen carrier based on perfluorohydrocarbons is selected from the group consisting of perfluorodecalin, perfluorodecyl bromide, perfluorotributylamine, perfluoromethylcyclohexylpiperidine, perfluorodichlorooctane, perfluorotertbutylcyclohexane, perfluoro-15-crown-5-ether, dodecafluoropentane, perfluorooctyl bromide and Perfluorocyclohexane. Further suitable are artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons as published in Wesseler (Eugene P. Wesseler, Ronald Iltis, Leland C. Clark, The solubility of oxygen in highly fluorinated liquids, Journal of Fluorine Chemistry, Volume 9, Issue 2, 1977, Pages 137-146, ISSN 0022-1139, https://doi.org/10.1016/S0022-1139(00)82152-1), especially in Table 2.
Anschließend wird auf geeignete Weise Lecithin hinzugefügt. Bevorzugt ist fettfreies pflanzliches Lecithin, zum Beispiel aus Soja mit einer Reinheit von >97%. Diese neuen, stabilen Sauerstoffträger, die von den Erfindern als „Lecithin modified nanoscale oxygen carrier“ (LENOX) bezeichnet werden, unterscheiden sich von den bisherigen Sauerstoffträgern, den Vorläufern, genannt albumin-derived artificial oxygen carrier (A-AOCs) und organ-life fluid (OLF) dadurch, dass nun neu Lecithin bei der Synthese zugesetzt wird. Zur Verbesserung wurde neben einem höheren Betriebsdruck der herstellenden Maschine und einer mehrzyklischen Synthese, zusätzlich das Phospholipid Lecithin in die Albuminhülle eingebaut. Durch diese Änderungen konnten verschiedene Stabilitätsprobleme der bisher bekannten Emulsionen vollständig beseitigt werden. Lecithin ist ein Gemisch aus Phosphatidylcholin und anderen Phospholipiden und Bestandteil tierischer sowie pflanzlicher Zellmembranen. Lecithin is then added in a suitable manner. Fat-free vegetable lecithin, for example from soy with a purity of >97%, is preferred. These new, stable oxygen carriers, which the inventors call “Lecithin modified nanoscale oxygen carrier” (LENOX), differ from the previous oxygen carriers, the precursors, called albumin-derived artificial oxygen carriers (A-AOCs) and organ-life fluid (OLF) in that lecithin is now added during the synthesis. To improve this, in addition to a higher operating pressure of the manufacturing machine and a multi-cycle synthesis, the phospholipid lecithin was also incorporated into the albumin shell. These changes made it possible to completely eliminate various stability problems of the previously known emulsions. Lecithin is a mixture of phosphatidylcholine and other phospholipids and is a component of animal and plant cell membranes.
Die vorliegende Emulsion hat den Vorteil, neben den beiden Emulgatoren Albumin und Lecithin keine weiteren Stabilisatoren zu benötigen. Bevorzugt ist daher ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der künstliche Sauerstoffträger ausschließlich aus den angegebenen Materialien hergestellt wird, bzw. besteht. Sowohl Albumin als auch Lecithin sind bereits zur intravenösen Anwendung klinisch zugelassen. Üblicherweise werden die zur Herstellung einer Emulsion verwendeten Komponenten zunächst zu einer grob dispersen Präemulsion, welche auch als Roh- oder Präemulsion bzw. Prämix bezeichnet werden kann, vorgemischt. Anschließend erfolgt ein Homogenisieren, wobei eine Tropfenzerkleinerung der dispersen Phase stattfindet (Feinemulgieren). Dabei verschiebt sich das Tropfengrößenspektrum der Roh- bzw. Präemulsion deutlich hin zu kleineren Tropfen. O/W-Emulsionen für eine parenterale Anwendung werden üblicherweise hergestellt, indem zunächst eine Ölphase und Wasserphase mittels eines Rotor- Stator-Rührers zu einer Präemulsion vorgemischt werden. The present emulsion has the advantage of not requiring any other stabilizers in addition to the two emulsifiers albumin and lecithin. A method according to the present invention is therefore preferred, wherein the artificial oxygen carrier is produced or consists exclusively of the specified materials. Both albumin and lecithin are already clinically approved for intravenous use. Usually, the components used to produce an emulsion are first premixed to form a coarsely disperse preemulsion, which can also be referred to as a raw or preemulsion or premix. Homogenization then takes place, with the disperse phase being crushed into droplets (fine emulsification). The droplet size spectrum of the raw or preemulsion shifts significantly towards smaller drops. O/W emulsions for parenteral use are usually produced by first premixing an oil phase and water phase using a rotor-stator stirrer to form a preemulsion.
So erfolgt auch erfmdungsgemäß die anschließende Präemulgation des oben hergestellten Gemisches (das gewöhnlich noch in Phasen getrennt vorliegt) durch schnelles Rühren unter geeigneter Kühlung. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Präemulgation durch schnelles Rühren mit einem Homogenisator bei zwischen 8.000 und 12.000 Umdrehungen/min, wie z.B. mit einem Ultra-Turrax® bei 9.500 Umdrehungen/min durchgeführt wird. According to the invention, the subsequent pre-emulsification of the mixture prepared above (which is usually still separated into phases) takes place by rapid stirring with suitable cooling. Preferred is a process according to the present invention, wherein the pre-emulsification is carried out by rapid stirring with a homogenizer at between 8,000 and 12,000 revolutions/min, such as with an Ultra-Turrax® at 9,500 revolutions/min.
Als letzter Schritt erfolgt das Emulgieren der Präemulsion wie oben unter (Hoch-) Druck über einen Hochdruckhomogenisator, z.B. einen Gegenstrahldispergator (siehe z.B. DE 102018205 493 Al) unter geeigneter Kühlung und anschließender Lagerung für mindestens 30 min ebenfalls unter geeigneter Kühlung. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Emulgieren der Präemulsion bei einem Druck zwischen 10.000 PSI (ca. 689 bar) und 40.000 PSI (ca. 2758 bar), bevorzugt bei 30.000 PSI (2068 bar) stattfindet und gegebenenfalls mehrfach wiederholt wird, bevorzugt zwischen 1 und 12 Male (weiter bevorzugt zwischen 5 und 10, optimalerweise 8-mal wiederholen) As a final step, the preemulsion is emulsified as above under (high) pressure via a high-pressure homogenizer, e.g. a counter-jet disperser (see e.g. DE 102018205 493 Al) with suitable cooling and subsequent storage for at least 30 minutes, also under suitable cooling. A process according to the present invention is preferred, wherein the emulsification of the preemulsion takes place at a pressure between 10,000 PSI (approx. 689 bar) and 40,000 PSI (approx. 2758 bar), preferably at 30,000 PSI (2068 bar) and is optionally repeated several times , preferably between 1 and 12 times (more preferably between 5 and 10, ideally repeat 8 times)
Die Schritte des Verfahrens betreffend insbesondere die Homogenisierung und Emulgation werden unter geeigneter Kühlung bei < 10 °C oder geringer, bevorzugt bei 4 °C. Natürlich soll dabei ein Einfrieren vermieden werden. The steps of the process relating in particular to homogenization and emulsification are carried out with suitable cooling at <10 ° C or less, preferably at 4 ° C. Of course, freezing should be avoided.
Den Erfindern ist es nun erstmals gelungen, künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) zu synthetisieren, die mit lediglich den drei Bestandteilen Albumin, Lecithin und PFD ohne weitere Zusatzstoffe (wie zB Triblock Copolymere wie Pluronic) eine hohe Stabilität aufweisen und sich zudem direkt in einer klinisch zugelassenen kristalloiden oder kolloidalen Volumenersatzlösung (bevorzugt Sterofundin® ISO) und anderen Trägerlösungen stabil herstellen lassen, was vorher nicht möglich war. The inventors have now succeeded for the first time in synthesizing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs), which have high stability with only the three components albumin, lecithin and PFD without any other additives (such as triblock copolymers such as Pluronic) and are also directly in one clinically approved crystalloid or colloidal volume replacement solution (preferably Sterofundin® ISO) and other carrier solutions can be produced in a stable manner, which was not possible before.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei Albumin in einer Konzentration zwischen 2-20 %, bevorzugt von 5-10 %, weiter bevorzugt von etwa 5%, Perfluordecalin (PFD) in einer Konzentration zwischen etwa 10-50%, bevorzugt von etwa 17%, Lecithin in einer Konzentration zwischen etwa 1-16%, bevorzugt von etwa 2%, in Wasser emulgiert werden. Particularly preferred is a method according to the present invention, with albumin in a concentration between 2-20%, preferably 5-10%, more preferably about 5%, and perfluorodecalin (PFD) in a concentration between about 10-50% being preferred of about 17%, lecithin can be emulsified in water in a concentration between about 1-16%, preferably about 2%.
Der verwendete Anteil an Albumin führt als wichtiger Vorteil zu einem physiologischen kolloidosmotischen Druck, wobei überraschenderweise ein Optimum bei etwa 5% gefunden wurde. Die Kombination PFOC + Albumin + Lecithin führt daher in Vollelektrolyt/Volumenersatz -Lösung zu einer stabilen Formulierung und einem ready -to-use- Produkt. Für eine stabile Formulierung sind aber auch artificial oxygen carrier (AOC) mit anderen Albuminanteilen vorteilhaft (zwischen 2 - 20 %, 4 - 10 %, 4 - 6%). The proportion of albumin used leads, as an important advantage, to a physiological colloid osmotic pressure, with an optimum being surprisingly found at around 5%. The combination PFOC + albumin + lecithin therefore leads to a stable formulation and a ready-to-use product in full electrolyte/volume replacement solution. For a stable formulation, artificial oxygen carriers (AOC) with other albumin proportions are also advantageous (between 2 - 20%, 4 - 10%, 4 - 6%).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet „etwa“ eine Abweichung von ± 10%, wenn nicht anders angegeben. In the context of the present invention, “about” means a deviation of ± 10% unless otherwise stated.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Emulsion bei 20.000 PSI mit BSA in Wasser hergestellt wird und der Partikeldurchmesser in der Emulsion zwischen 50 nm und 400 nm, weiter bevorzugt zwischen 60 nm und 300 nm, optimalerweise zwischen 70 nm und 250 nm beträgt. Siehe dazu insbesondere Synthese 5, unten. Particularly preferred is a method according to the present invention, wherein the emulsion is prepared at 20,000 PSI with BSA in water and the particle diameter in the emulsion is between 50 nm and 400 nm, more preferably between 60 nm and 300 nm, optimally between 70 nm and 250 nm is. See in particular Synthesis 5, below.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der mittlere Partikeldurchmesser in der Emulsion, hergestellt mit BSA, 92,5 nm ± 8,5 nm und die Sauerstofffreisetzung 3,99 pmol/mL ± 0,20 pmol/mL beträgt. Particularly preferred is a method according to the present invention, wherein the average particle diameter in the emulsion prepared with BSA is 92.5 nm ± 8.5 nm and the oxygen release is 3.99 pmol/mL ± 0.20 pmol/mL.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der künstliche Sauerstoffträger ausschließlich aus den angegebenen Materialien hergestellt wird, bzw. Albumin und Lecithin als einzige Träger und/oder Emulgatoren vorhanden sind. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen künstlichen Sauerstoffträger, der nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt ist. A process according to the present invention is particularly preferred, in which the artificial oxygen carrier is produced exclusively from the specified materials, or albumin and lecithin are present as the only carriers and/or emulsifiers. Another aspect of the present invention relates to an artificial oxygen carrier produced by a method according to the present invention.
Bevorzugt ist ein künstlicher Sauerstoffträger gemäß der vorliegenden Erfindung, bestehend aus etwa 5% Albumin, Perfluorodecalin (PFD) in einer Konzentration von etwa 17% und Lecithin in einer Konzentration von etwa 2% in einem Medium ausgewählt aus Wasser, Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, STEEN-Solution, OCS-Lösung, Ringer-Lösung und Hydroxy -Ethyl-Stärke. Preferred is an artificial oxygen carrier according to the present invention, consisting of about 5% albumin, perfluorodecalin (PFD) at a concentration of about 17% and lecithin at a concentration of about 2% in a medium selected from water, Sterofundin® ISO, Ringerfundin® , STEEN solution, OCS solution, Ringer's solution and hydroxy-ethyl starch.
Der künstliche Sauerstoffträger gemäß der vorliegenden Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass er eine höhere Stabilität gegenüber nicht Lecithin-haltigen künstlichen Sauerstoffträgem auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) aufweist. Dies kann insbesondere durch Messung der Viskosität, der Partikelgröße und -Verteilung des künstlichen Sauerstoffträgers bestimmt werden (siehe Beispiele). The artificial oxygen carrier according to the present invention is characterized in that it has a higher stability compared to non-lecithin-containing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs). This can be determined in particular by measuring the viscosity, particle size and distribution of the artificial oxygen carrier (see examples).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen synthetischen Blutersatz, umfassend den künstlichen Sauerstoffträger gemäß der vorliegenden Erfindung. Another aspect of the present invention relates to a synthetic blood substitute comprising the artificial oxygen carrier according to the present invention.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des künstlichen Sauerstoffträgers gemäß der vorliegenden Erfindung als Perfusions- oder Transfusionslösung oder als synthetischen Blutersatz. A further aspect of the present invention relates to the use of the artificial oxygen carrier according to the present invention as a perfusion or transfusion solution or as a synthetic blood substitute.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft den künstlichen Sauerstoffträger gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Behandlung und Prävention von Sauerstoffmangel und/oder Blutmangel in einem Organ oderPatienten, insbesondere bei einem Menschen. Another aspect of the present invention relates to the artificial oxygen carrier according to the present invention for use in the treatment and prevention of oxygen deficiency and/or blood deficiency in an organ or patient, particularly in a human.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung und/oder der Prävention von Sauerstoffmangel und/oder Blutmangel in einem Organ oder Patienten, umfassend die Verwendung des künstlichen Sauerstoffträgers gemäß der vorliegenden Erfindung als Perfusions- oder Transfusionslösung oder als synthetischen Blutersatz, insbesondere bei einem Menschen. Die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Sauerstoffträgers (LENOX) besteht bevorzugt aus Albumin, Perfluorodecalin (PFD) und Lecithin in Wasser, wobei die Konzentration von Albumin zwischen 2-20 %, bevorzugt von 5-10 %, weiter bevorzugt von etwa 5%, die PFD- Konzentration zwischen 10-50% (bevorzugt 17%) und die Lecithin-Konzentration zwischen 1- 16% (bevorzugt 2%) beträgt. Der mittlere Partikel durchmesser beträgt mit BSA 92,5 nm ± 8,5 nm und die Sauerstofffreisetzung beträgt 3,99 pmol/mL ± 0,20 pmol/mL. A further aspect of the present invention relates to a method for treating and/or preventing oxygen deficiency and/or blood deficiency in an organ or patient, comprising the use of the artificial oxygen carrier according to the present invention as a perfusion or transfusion solution or as a synthetic blood substitute, in particular a person. The composition of the oxygen carrier according to the invention (LENOX) preferably consists of albumin, perfluorodecalin (PFD) and lecithin in water, the concentration of albumin being between 2-20%, preferably 5-10%, more preferably about 5%, the PFD Concentration between 10-50% (preferably 17%) and the lecithin concentration between 1-16% (preferably 2%). The mean particle diameter with BSA is 92.5 nm ± 8.5 nm and the oxygen release is 3.99 pmol/mL ± 0.20 pmol/mL.
Die Zugabe von Lecithin führt zudem überraschenderweise zu wesentlich verbesserten physikochemischen Eigenschaften der so erhaltenen Nanopartikel gegenüber den bisherigen nur auf Albumin basierten OLF-Partikel. Die erfindungsgemäßen Sauerstoffträger (LENOX) sind deutlich kleiner, weniger polydispers und weniger trüb als die bisherigen OLF Sauerstoffträger (Abb. 1). Sie lassen sich insbesondere mit HSA als auch BSA synthetisieren und sind in einem größeren Temperaturbereich (-20 bis +100 °C) stabil. The addition of lecithin also surprisingly leads to significantly improved physicochemical properties of the nanoparticles obtained in this way compared to the previous OLF particles based only on albumin. The oxygen carriers according to the invention (LENOX) are significantly smaller, less polydisperse and less cloudy than the previous OLF oxygen carriers (Fig. 1). They can be synthesized in particular with HSA as well as BSA and are stable in a larger temperature range (-20 to +100 °C).
Darüber hinaus weisen sie eine wesentlich geringere Viskosität als die OLF-Partikel auf (Abb. 2). Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Sauerstoffträger jedoch langfristig kompatibel mit Ringer-Lösung, Sterofundin® ISO (Abbildung 3), Ringerfundin®, STEEN- Solution, OCS- Lösung und 6% HES (130/0,4) und lassen sich in diesen Lösungen direkt und stabil synthetisieren. Bisher war es beispielsweise nicht möglich, stabile Sauerstoffträger ohne weitere Hilfsstoffe in zugelassenen Volumenersatzlösungen wie beispielsweise Sterofundin® ISO zu synthetisieren. In addition, they have a significantly lower viscosity than the OLF particles (Fig. 2). In particular, however, the oxygen carriers according to the invention are long-term compatible with Ringer's solution, Sterofundin® ISO (Figure 3), Ringerfundin®, STEEN solution, OCS solution and 6% HES (130/0.4) and can be used directly in these solutions synthesize stably. To date, for example, it has not been possible to synthesize stable oxygen carriers without additional auxiliary materials in approved volume replacement solutions such as Sterofundin® ISO.
Die erfindungsgemäßen Sauerstoffträgerweisen sehr gute Eigenschaften hinsichtlich Stabilität, Viskosität, Partikelgröße und Sauerstoffabgabe auf. The oxygen carriers according to the invention have very good properties in terms of stability, viscosity, particle size and oxygen release.
Die vorliegende Erfindung soll nun in den folgenden Beispielen mit Bezug auf die beigefügten Abbildungen weiter beschrieben werden, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der Erfindung werden alle zitierten Dokumente und Publikationen hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen. In den Abbildungen wird gezeigt: The present invention will now be further described in the following examples with reference to the accompanying figures, but is not limited thereto. For the purposes of the invention, all cited documents and publications are hereby incorporated by reference in their entirety. The figures show:
Abbildung 1 : Viskositätskurve der OLF-Partikel im Vergleich zu den LENOX (Beispielssynthese I, HSA). Abbildung 2: Durchmesser (A) und Polydispersionsindex (B) der OLF-Partikel im Vergleich zu den LENOX (Beispielssynthese I, HSA). Figure 1: Viscosity curve of the OLF particles in comparison to the LENOX (example synthesis I, HSA). Figure 2: Diameter (A) and polydispersion index (B) of the OLF particles compared to the LENOX (example synthesis I, HSA).
Abbildung 3: Transmission der OLF-Partikel und der LENOX (Beispielssynthese I, HSA). Figure 3: Transmission of the OLF particles and the LENOX (example synthesis I, HSA).
Abbildung 4: Durchmesser und Polydispersionsindex der OLF-Partikel und der LENOX, synthetisiert in Sterofundin® ISO (Beispielssynthese II). Figure 4: Diameter and polydispersion index of the OLF particles and the LENOX, synthesized in Sterofundin® ISO (example synthesis II).
Abbildung 5: Mikroskopiebilder der OLF-Partikel (Stand der Technik), synthetisiert in Ringer- Lösung (A), HES 6 % (B) und Sterofundin® ISO (C). Der verrauschte Hintergrund in Bild B und C deutet darauf hin, dass diese Emulsionen zerstört sind. Die Emulsion in Bild A ist noch intakt, zeigt jedoch Partikel > 1 pm. Die LENOX (Beispielssynthese I, BSA) sind im Mikroskop nicht sichtbar, da sie unterhalb der Auflösungsgrenze sind (D). Die Artefakte auf dem Bild D sind verursacht von Rückständen auf der Neubauerkammer und stammen nicht von den Emulsionstropfen. Figure 5: Microscopy images of OLF particles (state of the art) synthesized in Ringer solution (A), HES 6% (B) and Sterofundin® ISO (C). The noisy background in images B and C suggests that these emulsions are destroyed. The emulsion in image A is still intact, but shows particles > 1 pm. The LENOX (example synthesis I, BSA) are not visible in the microscope because they are below the resolution limit (D). The artifacts in image D are caused by residues on the Neubauer chamber and do not come from the emulsion drops.
Abbildung 6: Viskosität der OLF-Partikeln Vergleich zu den LENOX, synthetisiert in 6% HES (130/0,4) (Beispielssynthese IV). Figure 6: Viscosity of the OLF particles compared to the LENOX, synthesized in 6% HES (130/0.4) (Example Synthesis IV).
Abbildung 7: Viskosität der OLF-Partikel und der LENOX (Beispielssynthese II) vor und nach einer Lagerung über 4 h bei 37 °C. Figure 7: Viscosity of the OLF particles and the LENOX (example synthesis II) before and after storage for 4 h at 37 °C.
Beispiele Examples
Abkürzungsverzeichnis List of abbreviations
Lecithin-modifizierter Nanosauerstoffträger LENOX Lecithin-modified nanooxygen carrier LENOX
(Lecithin-modified nano oxygen carrier) (Lecithin-modified nano oxygen carrier)
Perfluordecalin PFD Perfluorodecalin PFD
AOC im Organ life fluid OLF AOC in the organ life fluid OLF
Hydroxy ethyl stärke HES Hydroxy ethyl starch HES
Universität Duisburg-Essen UDE bovines Serumalbumin BSA humanes Serumalbumin HSA University of Duisburg-Essen UDE bovine serum albumin BSA human serum albumin HSA
Perfluorcarbon basierte künstliche Sauerstoffträger PFOCs Perfluorocarbon based artificial oxygen carriers PFOCs
(Perfluorocarbon-based oxygen carrier) Albumin basierte künstliche Sauerstoffträger A-AOCs (Albumin-based artificial oxygen carrier) Künstliche Sauerstoffträger AOC (Artificial oxygen carrier) 10./50./90. Perzentil dl0/d50/d90 (Perfluorocarbon-based oxygen carrier) Albumin-based artificial oxygen carriers A-AOCs (Albumin-based artificial oxygen carrier) Artificial oxygen carriers AOC (Artificial oxygen carrier) 10./50./90. Percentile dl0/d50/d90
Spanne der Partikelgrößenverteilung S Range of particle size distribution S
Materialien und Geräte: Materials and equipment:
Für die Synthesen der künstlichen Sauerstoffträger wurden Perfluordecalin HP (F2 Chemicals, Lancashire, UK), Millipore-Wasser (Q-Pod, Merck, Darmstadt, DE) und entweder Albumin Fraktion V (bovines Serumalbumin, Roth, Karlsruhe, DE) oder Albunorm (humanes Serumalbumin, Octapharma, Langenfeld, DE) mit einem Microfluidizer (LM20, Microfluidics, Waterloo, CAN) homogenisiert, nachdem mit einem Ultraturrax (IKA) eine Präemulsion hergestellt worden war. For the syntheses of the artificial oxygen carriers, perfluorodecalin HP (F2 Chemicals, Lancashire, UK), Millipore water (Q-Pod, Merck, Darmstadt, DE) and either albumin fraction V (bovine serum albumin, Roth, Karlsruhe, DE) or Albunorm ( human serum albumin, Octapharma, Langenfeld, DE) was homogenized with a microfluidizer (LM20, Microfluidics, Waterloo, CAN) after a preemulsion had been prepared with an Ultraturrax (IKA).
Für den neu entwickelten Sauerstoffträger (LENOX) wurde noch zusätzlich Lecithin (97 %, Roth, Karlsruhe, DE) verwendet. Lecithin (97%, Roth, Karlsruhe, DE) was also used for the newly developed oxygen carrier (LENOX).
Als beispielhafte Salzlösungen wurden Sterofundin® ISO (B.Braun, Melsungen, DE), HES 6 % (Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE) und Ringer-Lösung (Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE) verwendet. Sterofundin® ISO (B.Braun, Melsungen, DE), HES 6% (Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE) and Ringer's solution (Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE) were used as exemplary salt solutions.
Die Partikelgröße und der Polydispersionsindex wurde mittels dynamischer Lichtstreuung (Stabino Nano-flex, Particle Metrix, Inning am Ammersee, DE) bestimmt. Die Sauerstoffkapazität wurde mit einem Respirometer (O2k, Oroboros Instruments, Innsbruck, AUT) und die Trübung mit einem Photometer (Specord S600, Analytik) ena, Jena, DE) gemessen. Die Viskosität wurde mit einem Rheometer (MCR 92, Anton Paar, Ostfildern, DE) bestimmt. Es wurde die Viskosität bei zwei unterschiedlichen Scherraten bestimmt, da einige Emulsionen ein nicht Newton’ sches Verhalten aufwiesen. Dabei wurde eine sehr niedrige Scherrate (50/s) und eine physiologische Scherrate (645/s) gewählt. The particle size and the polydispersion index were determined using dynamic light scattering (Stabino Nano-flex, Particle Metrix, Inning am Ammersee, DE). The oxygen capacity was measured with a respirometer (O2k, Oroboros Instruments, Innsbruck, AUT) and the turbidity with a photometer (Specord S600, Analytik) ena, Jena, DE). The viscosity was determined using a rheometer (MCR 92, Anton Paar, Ostfildern, DE). The viscosity was determined at two different shear rates because some emulsions exhibited non-Newtonian behavior. A very low shear rate (50/s) and a physiological shear rate (645/s) were chosen.
Zur Visualisierung der Mikropartikel wurde ein Lichtmikroskop (AXIO Lab. Al, Zeiss, Oberkochen, DE) verwendet. Syntheseverfahren A light microscope (AXIO Lab. Al, Zeiss, Oberkochen, DE) was used to visualize the microparticles. Synthesis process
Die Synthese der reinen Organ Life Fluid-Partikel (OLF -Partikel) entsprach der in der Patentanmeldung DE102021211272.2. Dafür wurden 20 mL Albumin (BSA oder HSA) und 4 mL PFD vorgelegt und mit einem Ultra-Turrax (T25 Basic, IKA-Werke, Staufen, DE) bei 9.500 Umdrehungen/min präemulgiert. Anschließend wurde die Präemulsion in den Mikrofluidizer gegeben, und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen einmal prozessiert. The synthesis of the pure Organ Life Fluid particles (OLF particles) corresponded to that in patent application DE102021211272.2. For this purpose, 20 mL albumin (BSA or HSA) and 4 mL PFD were introduced and pre-emulsified with an Ultra-Turrax (T25 Basic, IKA-Werke, Staufen, DE) at 9,500 revolutions/min. The preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed once at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar).
Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert. During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese I-IV wird mit einem Druck von 30.000 PSI und eine Zyklusrate von acht Mal durchgeführt, ab Synthese V ändert sich der Druck auf 20.000 PSI und die Zyklusanzahl ändert sich auf sieben Mal. Synthesis I-IV is carried out with a pressure of 30,000 PSI and a cycle rate of eight times, from Synthesis V onwards the pressure changes to 20,000 PSI and the cycle number changes to seven times.
Synthese I Synthesis I
Für die Synthese der LENOX wurden 20 mL einer 5 %-igen Albuminlösung (bovines Serum Albumin (BSA) oder humanes Serum Albumin (HSA)) und 4 mL PFD vorgelegt. Das 2- Phasen-Gemisch wurde mit 0,4 g Lecithin versetzt und mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 30.000 PSI (ca. 2068 bar) wird das gesamte acht Mal prozessiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX, 20 mL of a 5% albumin solution (bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA)) and 4 mL of PFD were presented. 0.4 g of lecithin was added to the 2-phase mixture and pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The pre-emulsion was then placed in the microfluidizer and the entire thing was processed eight times at a pressure of 30,000 PSI (approx. 2068 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese II Synthesis II
Für die Synthese der LENOX in Sterofundin® ISO wurden in 20 mL Sterofundin® ISO 1 g bovines Serumalbumin gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax bei 9.500 Umdrehungen/min präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben, und bei einem Druck von 30.000 PSI (ca. 2068 bar) wurde das gesamte Volumen acht Mal prozessiert. Während des Prozesses musste die Auslaufspule des Geräts und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX in Sterofundin® ISO, 1 g of bovine serum albumin was dissolved in 20 mL of Sterofundin® ISO. First, 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution. The mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax at 9,500 revolutions/min. The preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed eight times at a pressure of 30,000 PSI (approx. 2068 bar). During the process, the dispenser coil of the device and therefore the product had to be filled with ice be cooled. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese III Synthesis III
Für die Synthese der LENOX in Ringer-Lösung wurden in 20 mL Ringer-Lösung 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax bei 9.500 Umdrehungen/min präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben, und bei einem Druck von 30.000 PSI (ca. 2068 bar) wurde das gesamte Volumen acht Mal durch den Mikrofluidizer zyklisiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Geräts und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX in Ringer's solution, 1 g of bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of Ringer's solution. First, 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution. The mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax at 9,500 revolutions/min. The preemulsion was then placed into the microfluidizer and the entire volume was cycled through the microfluidizer eight times at a pressure of 30,000 PSI (approximately 2068 bar). During the process, the dispenser coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese IV Synthesis IV
Für die Synthese der LENOXs in Hydroxy-Ethyl-Stärke (HES, 6 %) wurden in 20 mL HES (6 %) 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax bei 9.500 Umdrehungen/min präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben, und bei einem Druck von 30.000 PSI (ca. 2068 bar) wurde das gesamte Volumen achtmal prozessiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Geräts und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert. For the synthesis of the LENOXs in hydroxyethyl starch (HES, 6%), 1 g of bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of HES (6%). First, 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution. The mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax at 9,500 revolutions/min. The preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed eight times at a pressure of 30,000 PSI (approx. 2068 bar). During the process, the dispenser coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Statistik: Statistics:
Für die statistische Auswertung der Analysedaten wurde die Software OriginPro® (Version 2020) verwendet. The OriginPro® software (version 2020) was used for the statistical evaluation of the analysis data.
Die im Folgenden dargestellten Versuchsdaten sind die Mittelwerte der Gruppen ± Standardabweichung. Die Standardabweichung wird in Form von Fehlerbalken gezeigt. Um die statistische Signifikanz zwischen zwei Datensätzen zu ermitteln, wurde die Datensätze zunächst auf eine Normalverteilung, mittels Shapiro-Wilk-Test, untersucht. Da alle Datensätze normalverteilt waren, wurden ungepaarte t-Tests bzw. einseitige ANOVA-Test mit anschließender post hoc-Analyse durchgeführt. Als signifikant unterschiedlich gelten zwei Datensätze, bei denen sich der Mittelwert der Grundgesamtheit auf einem Fehlerniveau von *p < 0,05 von der Testdifferenz unterscheidet. Liegt ein signifikanter Unterschied vor, so wurden die beiden Datensätze wie folgt markiert: p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***) and p < 0.0001 (****). Beträgt das Fehlemiveau *p > 0,05, so sind die beiden Datensätze nicht signifikant unterschiedlich (ns). Alle Datensätze bestehen aus einem Stichprobenumfang von jeweils n = 3 Proben. The experimental data presented below are the mean values of the groups ± standard deviation. The standard deviation is shown in the form of error bars. In order to determine the statistical significance between two data sets, the data sets were first examined for a normal distribution using the Shapiro-Wilk test. Since all data sets were normally distributed, unpaired t-tests or one-way ANOVA tests were carried out with subsequent post hoc analysis. Two data sets in which the mean of the population is at an error level of are considered significantly different *p < 0.05 differs from the test difference. If there is a significant difference, the two data sets were marked as follows: p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***) and p < 0.0001 (****). If the error level is *p > 0.05, the two data sets are not significantly different (ns). All data sets consist of a sample size of n = 3 samples each.
Ergebnisse Results
Die LENOX besitzen einen mittleren Partikeldurchmesser von 92,5 ± 8,5 nm (Synthese I, BSA) bzw. 123,5 ± 2,2 nm (Synthese I, HSA) und setzen 3,99 ± 0,2 pmol Sauerstoff pro mL Probe frei (bei 17 vol.%). Die Emulsion besitzt Eigenschaften eines Newton‘ sehen Fluids, dabei ändert sich die Viskosität nur minimal mit zunehmender Scherrate. Im Vergleich zu den LENOXs bilden die OLF -Partikel ein nicht-Newton‘sches Fluid, und die Viskosität ändert sich maßgeblich mit Änderung der Scherrate (siehe Abbildung 1). The LENOX have an average particle diameter of 92.5 ± 8.5 nm (Synthesis I, BSA) or 123.5 ± 2.2 nm (Synthesis I, HSA) and release 3.99 ± 0.2 pmol of oxygen per mL Sample free (at 17 vol.%). The emulsion has properties of a Newtonian fluid, with the viscosity only changing minimally as the shear rate increases. Compared to the LENOXs, the OLF particles form a non-Newtonian fluid, and the viscosity changes significantly as the shear rate changes (see Figure 1).
Der mittlere Partikeldurchmesser und der Polydispersionsindex sind zwischen den OLF- Partikeln (HSA) und den LENOXs signifikant unterschiedlich. Bei den gemessenen Proben wurde ein durchschnittlicher Partikeldurchmesser von 1020,8 ± 85,9 nm für die OLF-Partikel und 123,5 ± 2,2 nm für die LENOX (Synthese I, HSA) gemessen (*p = 0,003). Mit einem Polydispersionsindex von 20,99 ± 1,33 ist die Emulsion der OLF-Partikel signifikant (*p = 0,031) polydisperser als die Emulsion der LENOX (Synthese I, HSA) mit einem Polydispersionsindex von 8,58 ± 3,28. The mean particle diameter and the polydispersion index are significantly different between the OLF particles (HSA) and the LENOXs. For the measured samples, an average particle diameter of 1020.8 ± 85.9 nm was measured for the OLF particles and 123.5 ± 2.2 nm for the LENOX (Synthesis I, HSA) (*p = 0.003). With a polydispersion index of 20.99 ± 1.33, the emulsion of the OLF particles is significantly (*p = 0.031) more polydisperse than the emulsion of LENOX (Synthesis I, HSA) with a polydispersion index of 8.58 ± 3.28.
Ein optisch sichtbarer Unterschied zwischen der OLF-Emulsion und der LENOX-Emulsion ist die Trübung. Durch die Messung der Transmission beider Emulsionen konnte gezeigt werden, dass die LENOX-Emulsion (Synthese I, HSA) signifikant (*p < 0,001) durchlässiger ist für Licht mit einer Wellenlänge von 860 nm, als die OLF-Emulsion. Somit erscheint die OLF- Emulsion stark trüb, wohingegen die LENOXs-Emulsion klar erscheint. A visually visible difference between the OLF emulsion and the LENOX emulsion is the turbidity. By measuring the transmission of both emulsions it was shown that the LENOX emulsion (Synthesis I, HSA) is significantly (*p < 0.001) more transparent to light with a wavelength of 860 nm than the OLF emulsion. Thus, the OLF emulsion appears very cloudy, whereas the LENOXs emulsion appears clear.
Um die Anwendbarkeit in einem Perfusionsmedium zu untersuchen, wurden sowohl die OLF- Partikel als auch die LENOX in unterschiedlichen Perfusionsmedien (Ringer-Lösung, Sterofundin® ISO und HAES 6 %) synthetisiert. Bei der Synthese in Sterofundin® ISO konnten signifikante Unterschiede im mittleren Partikeldurchmesser (*p = 0,019) und im Polydispersionsindex (*p = 0,001) festgestellt werden. Diese Unterschiede sind vergleichbar mit den Unterschieden in Abbildung 2. Bei der Synthese mit Ringer-Lösung entstand sowohl mit den OLF -Partikeln als auch mit den LENOX eine intakte Emulsion. Jedoch waren die OLF-Partikel unter einem Lichtmikroskop sichtbar, die LENOX Partikel waren hingegen zu klein, um sie im Lichtmikroskop zu sehen. Die OLF-Partikel sind bei der Synthese in Ringer-Lösung somit deutlich größer als die LENOX-Partikel im gleichen Medium. Auf den Aufnahmen mit dem Lichtmikroskop von den OLF-Partikeln in HES 6 % und in Sterofundin® ISO ist ein starkes Hintergrundrauschen zu erkennen. Dies ist ein Zeichen für eine zerstörte Emulsion. Somit bilden sich keine stabilen OLF -Emulsionen in HES 6 % und in Sterofundin® ISO. In order to investigate the applicability in a perfusion medium, both the OLF particles and the LENOX were synthesized in different perfusion media (Ringer's solution, Sterofundin® ISO and HAES 6%). When synthesized in Sterofundin® ISO, significant differences in the mean particle diameter (*p = 0.019) and in the polydispersion index (*p = 0.001) were found. These differences are comparable to the differences in Figure 2. During the synthesis with Ringer's solution, an intact emulsion was created with both the OLF particles and the LENOX. However, the OLF particles were visible under a light microscope, whereas the LENOX particles were too small to be seen under a light microscope. When synthesized in Ringer's solution, the OLF particles are significantly larger than the LENOX particles in the same medium. Strong background noise can be seen in the light microscope images of the OLF particles in HES 6% and in Sterofundin® ISO. This is a sign of a destroyed emulsion. This means that no stable OLF emulsions are formed in HES 6% and in Sterofundin® ISO.
Dieses Verhalten spiegelt sich auch in der Viskosität wider. Beispielsweise ist die Viskosität in HES 6 % bei den OLF-Partikeln signifikant (*p = 0,031 bei 50/s und *p = 0,037 bei 650/s) höher als bei den LENOX (Synthese IV). In Abbildung 6 sind die Viskositäten in Abhängigkeit von zwei unterschiedlichen Scherraten angegeben, da die OLF-Partikel einen starken nicht-newtonschen Charakter haben. This behavior is also reflected in the viscosity. For example, the viscosity in HES 6% is significantly higher (*p = 0.031 at 50/s and *p = 0.037 at 650/s) for the OLF particles than for the LENOX (Synthesis IV). Figure 6 shows the viscosities as a function of two different shear rates because the OLF particles have a strong non-Newtonian character.
Damit der Einfluss der Temperatur einer normothermen Perfusion (37 °C) auf die Emulsionen untersucht werden kann, wurden Proben der OLF-Partikel und der LENOX in Sterofundin® ISO (Synthese II) für 4 h bei 37 °C gelagert und die Viskosität vor und nach der Lagerung bestimmt. Dabei wurde ein signifikanter (*p > 0,001, *p = 0,003, *p = 0,007) Unterschied zwischen den beiden Emulsionen festgestellt. Die OLF-Partikel besitzen sowohl vor als auch nach der Lagerung eine deutlich höhere Viskosität als die LENOX. Lediglich nach der Lagerung bei einer Scherrate von 650/s sind beide Emulsionen nicht signifikant unterschiedlich zueinander (*p = 0,056). In order to investigate the influence of the temperature of normothermic perfusion (37 °C) on the emulsions, samples of the OLF particles and the LENOX were stored in Sterofundin® ISO (Synthesis II) for 4 h at 37 °C and the viscosity was measured before and after determined after storage. A significant (*p > 0.001, *p = 0.003, *p = 0.007) difference was found between the two emulsions. The OLF particles have a significantly higher viscosity than the LENOX both before and after storage. Only after storage at a shear rate of 650/s are both emulsions not significantly different from each other (*p = 0.056).
Zusammenfassung: Summary:
LENOX sind deutlich kleiner, weniger polydispers und weniger trüb als die OLF-Partikel.LENOX are significantly smaller, less polydisperse and less cloudy than the OLF particles.
LENOX lassen sich sowohl mit HSA als auch BSA synthetisieren. LENOX can be synthesized with both HSA and BSA.
LENOX sind stabiler bei verschiedenen Temperaturen (-20 bis +100 °C). LENOX are more stable at different temperatures (-20 to +100 °C).
LENOX sind kompatibel mit Ringer-Lösung, Sterofundin® ISO, STEEN-Solution, OCS- Lösung und HAES 6 %, OLF-Partikel zeigen in vielen dieser Lösungen ein inkompatibles Verhalten (Viskosität, Stabilität etc.). LENOX are compatible with Ringer solution, Sterofundin® ISO, STEEN solution, OCS solution and HAES 6%, OLF particles show incompatible behavior (viscosity, stability, etc.) in many of these solutions.
Weitere Versuche Methoden More attempts Methods
Dynamische Lichtstreuung Dynamic light scattering
Die Partikelgrößenverteilung wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit Nano-flex (Microtrac) bestimmt. Die Brechungsindizes wurden aus früheren Arbeiten übernommen. Die Hoch- und Tieftemperaturviskosität wurde für jede Charge und jeden Versuch einzeln bestimmt. Nach einer Nullmessung für 300 s mit Wasser wurde 1 ml der Probe in ein 2-mL- Reaktionsgefäß gefüllt und dreimal für 300 s gemessen. The particle size distribution was determined by dynamic light scattering (DLS) with Nano-flex (Microtrac). The refractive indices were adopted from previous work. The high and low temperature viscosity was determined individually for each batch and each test. After a zero measurement for 300 s with water, 1 ml of the sample was filled into a 2 mL reaction vessel and measured three times for 300 s.
Zur Analyse der Daten wurden die Perzentile dlO, d50 und d90 bestimmt. Außerdem wurde die Spannweite (S) der Partikelgrößenverteilung mit Gleichung (1) berechnet.
Figure imgf000019_0001
To analyze the data, the percentiles dlO, d50 and d90 were determined. In addition, the range (S) of the particle size distribution was calculated using Equation (1).
Figure imgf000019_0001
Viskosität viscosity
Ein Rheometer (MCR 92, Anton Paar) wurde zur Messung der schergeschwindigkeitsabhängigen Viskosität verwendet. Zur Einrichtung und Kalibrierung des Geräts wurde der softwareinterne Kalibrierungsprozess verwendet. Für die Messung wurde 1 mL der Probe auf den Messtisch gegeben und das System in den Messmodus versetzt. Das System wurde auf 20 °C aufgeheizt und die Viskosität bei verschiedenen Schergeschwindigkeiten gemessen. Unmittelbar nach der ersten Messung wurde das System auf 37 °C aufgeheizt und die Messung zur Bestimmung der Hochtemperaturviskosität wiederholt. A rheometer (MCR 92, Anton Paar) was used to measure the shear rate-dependent viscosity. The software internal calibration process was used to set up and calibrate the device. For the measurement, 1 mL of the sample was placed on the measuring table and the system was put into measuring mode. The system was heated to 20 °C and the viscosity was measured at different shear rates. Immediately after the first measurement, the system was heated to 37 °C and the measurement was repeated to determine the high-temperature viscosity.
Sauerstofffreisetzung Oxygen release
Die Messung der Sauerstofffreisetzung erfolgte mit einem SDR SensorDish Reader (PreSens) unter hypoxischen Bedingungen. Dazu wurden 0,5 ml Wasser oder Salzlösung pro Vertiefung in einer speziellen, mit Sauerstoffsensoren ausgestatteten 24-Well-Platte (OxoDish OD 24, PreSens) zubereitet. Diese Platte wurde unter einer Hypoxie-Workstation (whitley H35) (1 % O2, 5 % CO2, 94 % N2) gelagert, bis sich der Sauerstoffgehalt nicht mehr veränderte. 2,5 mL der Probe wurden in einen gasdichten Kolben überführt und 15 Minuten lang mit 100 % O2 bei einem Gasfluss von 0,5 mL/min oxygeniert. 0,5 ml der zuvor mit Sauerstoff angereicherten Probe wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Sauerstoffabgabe wurde gemessen, bis der Wert wieder den Ausgangswert erreichte. Oxygen release was measured using an SDR SensorDish Reader (PreSens) under hypoxic conditions. For this purpose, 0.5 ml of water or saline solution was prepared per well in a special 24-well plate equipped with oxygen sensors (OxoDish OD 24, PreSens). This plate was stored under a hypoxic workstation (Whitley H35) (1% O2, 5% CO2, 94% N2) until the oxygen level no longer changed. 2.5 mL of the sample was transferred to a gas-tight flask and oxygenated with 100% O2 at a gas flow of 0.5 mL/min for 15 minutes. 0.5 ml of the previously oxygenated sample was added to each well and the oxygen release was measured until the value returned to baseline.
Zeta-Potential Das Zetapotenzial wurde durch Streampotenzialmessung (Stabino Zeta, Microtrac) bestimmt. Für die Zeta-Potenzial-Messungen wurde 1 ml der Probe in den spezifischen Messkolben gefüllt und der Kolben an das Messsystem (Stabino, Microtrac) angeschlossen. Die Probe wurde zehnmal für je 10 s gemessen und die Ergebnisse wurden gemittelt. Zeta potential The zeta potential was determined by stream potential measurement (Stabino Zeta, Microtrac). For the zeta potential measurements, 1 ml of the sample was filled into the specific volumetric flask and the flask was connected to the measuring system (Stabino, Microtrac). The sample was measured ten times for 10 s each and the results were averaged.
Weitere Synthesen Further syntheses
Synthese V Synthesis V
Für die Synthese der LENOX wurden 20 mL einer 5 %-igen Albuminlösung (bovines Serum Albumin (BSA) oder humanes Serum Albumin (HSA)) und 4 mL PFD vorgelegt. Das 2- Phasen-Gemisch wurde mit 0,4 g Lecithin versetzt und mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen siebenmal prozessiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX, 20 mL of a 5% albumin solution (bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA)) and 4 mL of PFD were presented. 0.4 g of lecithin was added to the 2-phase mixture and pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed seven times at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese VI Synthesis VI
Für die Synthese der LENOX in Hydroxy-Ethyl-Stärke (HES, 6 %) wurden in 20 mL HES (6 %) 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen siebenmal prozessiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX in hydroxyethyl starch (HES, 6%), 1 g of bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of HES (6%). First, 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution. The mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed seven times at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese VII Synthesis VII
Für die Synthese der LENOX in Natriumchlorid (NaCl, 0,9 %) wurden in 20 mL NaCl (0,9 %) 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen sieben Mal durch den Mikrofluidizer zyklisiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX in sodium chloride (NaCl, 0.9%), 1 g of bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of NaCl (0.9%). First, 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution. The mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The preemulsion was then placed into the microfluidizer and the entire volume was cycled through the microfluidizer seven times at a pressure of 20,000 PSI (approximately 1379 bar). During the process, the outlet coil of the device must and therefore the product can also be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese VIII Synthesis VIII
Für die Synthese der LENOX in Ringer-Lösung wurden in 20 mL Ringer-Lösung 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen sieben Mal durch den Mikrofluidizer zyklisiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX in Ringer's solution, 1 g of bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of Ringer's solution. First, 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution. The mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The preemulsion was then placed into the microfluidizer and the entire volume was cycled through the microfluidizer seven times at a pressure of 20,000 PSI (approximately 1379 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese IX Synthesis IX
Für die Synthese der LENOX in STEEN Solution wurden zu 20 mL STEEN Solution zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra- Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen sieben Mal durch den Mikrofluidizer zyklisiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX in STEEN Solution, 4 mL PFD and then 0.4 g lecithin were added to 20 mL STEEN Solution. The mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The preemulsion was then placed into the microfluidizer and the entire volume was cycled through the microfluidizer seven times at a pressure of 20,000 PSI (approximately 1379 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Synthese X Synthesis X
Für die Synthese der LENOX in Sterofundin ISO wurden in 20 mL Sterofundin ISO 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen siebenmal durch den Mikrofluidizer zyklisiert Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert. For the synthesis of LENOX in Sterofundin ISO, 1 g of bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of Sterofundin ISO. First, 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution. The mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The pre-emulsion was then placed into the microfluidizer and at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar) the entire volume was cycled through the microfluidizer seven times. During the process, the outlet coil of the device and thus also the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
Basisdaten der Synthesen Die nachfolgenden Daten beziehen sich jeweils auf eine unverdünnte Synthese, so, wie sie aus dem Mirkofluidizer resultiert. Basic data of the syntheses The following data refers to an undiluted synthesis as it results from the Microfluidizer.
Synthese V Synthesis V
Partikel größenverteilun : Particle size distribution:
In nachfolgender Tabelle steht d für den hydrodynamischen Durchmesser der Partikel und S für die Spannbreite der Partikelgrößenverteilung. dlO bedeutet, dass 10% der gemessenen Partikel genau gleich groß oder kleiner als der angegebene Partikeldurchmesser sind, d50 entsprechend 50% und d90 entsprechend 90%. dlO 75 nm bedeutet also, dass 10% der gemessenen Partikel 75 nm oder kleiner waren.
Figure imgf000022_0001
In the table below, d stands for the hydrodynamic diameter of the particles and S for the range of the particle size distribution. dlO means that 10% of the measured particles are exactly the same size or smaller than the specified particle diameter, d50 corresponds to 50% and d90 corresponds to 90%. dlO 75 nm means that 10% of the measured particles were 75 nm or smaller.
Figure imgf000022_0001
Zeta-Potential: -72,9 ± 0,7 mV Zeta potential: -72.9 ± 0.7 mV
Viskosität (bei 200 s'1): Viscosity (at 200 s' 1 ):
20 °C: 1,85 ± 0,10 mPa-s (n = 6) 20 °C: 1.85 ± 0.10 mPa-s (n = 6)
37 °C: 1,21 ± 0,07 mPa-s (n = 6) 37 °C: 1.21 ± 0.07 mPa-s (n = 6)
Sauerstofffreisetzung: 309 ± 94 hPa (n = 6) Oxygen release: 309 ± 94 hPa (n = 6)
Langzeitstabilität Long-term stability
LENOX wurde in vollständig gefüllten 2-mL-Reaktionsgefäßen stehend bei 4 °C gelagert. Die Emulsion wurde alle 7 Tage über einen Zeitraum von 42 Tagen analysiert. Jede Charge LENOX wurde auf sechs Reaktionsgefäße aufgeteilt, so dass jeden Tag ein geschlossenes Gefäß verwendet wurde und die bereits geöffneten Gefäße verworfen wurden. LENOX was stored upright in completely filled 2 mL reaction vessels at 4 °C. The emulsion was analyzed every 7 days for a period of 42 days. Each batch of LENOX was divided into six reaction vessels so that one closed vessel was used each day and the already opened vessels were discarded.
Viskosität:
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Viscosity:
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Partikelgrößenverteilung :
Figure imgf000023_0002
Particle size distribution:
Figure imgf000023_0002
S auer stofffrei Setzung Tag 0: 309 ± 94 hPa Tag 42: 379 ± 75 hPa Oxygen-free settlement Day 0: 309 ± 94 hPa Day 42: 379 ± 75 hPa
LENOX in verschiedenen Perfusionslösungen LENOX in various perfusion solutions
Die Kompatibilität von LENOX mit klinisch relevanten kristalloiden und kolloidalen Lösungen ist für eine mögliche Anwendung unabdingbar. Kolloidale Volumenersatzlösungen finden in der klinischen Anwendung nur noch in Ausnahmesituationen Anwendung, sind aber in der präklinischen Forschung weit verbreitet. Aus diesem Grund wurden LENOX in verschiedenen Lösungen synthetisiert und analysiert. The compatibility of LENOX with clinically relevant crystalloid and colloidal solutions is essential for possible use. Colloidal volume replacement solutions are only used in clinical applications in exceptional situations, but are widely used in preclinical research. For this reason, LENOX were synthesized and analyzed in various solutions.
Synthese VI, Synthese VII, Synthese VIII, Synthese IX und Synthese X Synthesis VI, Synthesis VII, Synthesis VIII, Synthesis IX and Synthesis X
Partikelgröße
Figure imgf000023_0003
Viskosität (bei 200 s'1)
Figure imgf000024_0001
particle size
Figure imgf000023_0003
Viscosity (at 200 s' 1 )
Figure imgf000024_0001
S auer stofffrei Setzung :
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Oxygen-free Settlement:
Figure imgf000024_0002
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Claims

Patentansprüche Patent claims
1. Verfahren zur Herstellung von künstlichen Sauerstoffträgern auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs), umfassend a) Bereitstellen einer geeigneten wässrigen Albuminlösung und Mischen mit mindestens einem geeigneten künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, b) Geeignetes Hinzufügen von Lecithin, c) Präemulgation durch schnelles Rühren unter geeigneter Kühlung, d) Emulgieren der Präemulsion aus Schritt c) unter Druck über einen Mikrofluidizer unter geeigneter Kühlung und anschließender Lagerung für mindestens 30 min ebenfalls unter geeigneter Kühlung. 1. A process for producing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs), comprising a) providing a suitable aqueous albumin solution and mixing with at least one suitable artificial oxygen carrier based on perfluorocarbons, b) suitable addition of lecithin, c) pre-emulsification by rapid stirring under suitable cooling, d) emulsifying the preemulsion from step c) under pressure via a microfluidizer under suitable cooling and subsequent storage for at least 30 minutes, also under suitable cooling.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Albumin geeignet in einem wässrigen Puffer, Wasser, einer ausbalancierten Vollelektrolytlösung für die Infusionstherapie, wie z.B. Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, STEEN- Solution, OCS-Lösung, Ringer-Lösung oder Hydroxy-Ethyl- Stärke gelöst wird. 2. The method according to claim 1, wherein the albumin is suitable in an aqueous buffer, water, a balanced complete electrolyte solution for infusion therapy, such as Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, STEEN solution, OCS solution, Ringer's solution or hydroxy-ethyl- Strength is released.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Perfluordecalin, Perfluordecylbromid, Perfluortributylamin, Perfluormethylcyclohexylpiperidin, Perfluordichloroctan, Perfluortertbutylcyclohexan, Perfluor- 15-kronen-5-ether, Dodecafluorpentan, Perfluoroctylbromid und Perfluorocyclohexan. 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the artificial oxygen carrier based on perfluorocarbons is selected from the group consisting of perfluorodecalin, perfluorodecyl bromide, perfluorotributylamine, perfluoromethylcyclohexylpiperidine, perfluorodichlorooctane, perfluorotertbutylcyclohexane, perfluoro-15-crown-5-ether, dodecafluoropentane, perfluorooctyl bromide and Perfluorocyclohexane.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Albumin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säugetier-Albumin, humanem Serumalbumin (HSA) und bovinem Serumalbumin (BSA), oder Derivaten davon. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the albumin is selected from the group consisting of mammalian albumin, human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA), or derivatives thereof.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Präemulgation durch schnelles Rühren mit einem Homogenisator bei zwischen 8000 und 12000 Umdrehungen/min, wie z.B. einem Ultra-Turrax® bei 9.500 Umdrehungen/min durchgeführt wird. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the pre-emulsification is carried out by rapid stirring with a homogenizer at between 8000 and 12000 revolutions/min, such as an Ultra-Turrax® at 9,500 revolutions/min.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Emulgieren der Präemulsion bei einem Druck zwischen 10.000 PSI (ca. 689 bar) und 40.000 PSI (ca. 2758 bar), bevorzugt bei 6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein emulsifying the preemulsion at a pressure between 10,000 PSI (approx. 689 bar) and 40,000 PSI (approx. 2758 bar), preferably at
30.000 PSI (2068 bar) stattfindet und gegebenenfalls mehrfach wiederholt wird, bevorzugt zwischen 1 und 12, weiter bevorzugt zwischen 5 und 10, noch weiter bevorzugt 8 mal wiederholt wird. 30,000 PSI (2068 bar) takes place and is optionally repeated several times, preferably between 1 and 12, more preferably between 5 and 10, even more preferably repeated 8 times.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Kühlung bei unter 4°C, bevorzugt auf Eis durchgeführt wird. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the cooling is carried out at below 4 ° C, preferably on ice.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Albumin in einer Konzentration zwischen 2-20 %, bevorzugt von 5-10 %, weiter bevorzugt von etwa 5%, Perfluordecalin (PFD) in einer Konzentration zwischen 10-50%, bevorzugt von 17%, Lecithin in einer Konzentration zwischen 1-16%, bevorzugt von 2%, in Wasser emulgiert werden. 8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein albumin is preferred in a concentration between 2-20%, preferably from 5-10%, more preferably from about 5%, perfluorodecalin (PFD) in a concentration between 10-50% of 17%, lecithin in a concentration between 1-16%, preferably 2%, can be emulsified in water.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Emulsion bei 20.000 PSI mit BSA in Wasser hergestellt wird und der Partikeldurchmesser in der Emulsion zwischen 50 nm und 400 nm, weiter bevorzugt zwischen 60 nm und 300 nm, optimalerweise zwischen 70 nm und 250 nm beträgt. 9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the emulsion is prepared at 20,000 PSI with BSA in water and the particle diameter in the emulsion is between 50 nm and 400 nm, more preferably between 60 nm and 300 nm, optimally between 70 nm and is 250 nm.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der mittlere Partikel durchmesser mit BSA 92,5 nm ± 8,5 nm und die Sauerstofffreisetzung 3,99 pmol/mL ± 0,20 pmol/mL beträgt. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the average particle diameter with BSA is 92.5 nm ± 8.5 nm and the oxygen release is 3.99 pmol/mL ± 0.20 pmol/mL.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der künstliche Sauerstoffträger ausschließlich aus den angegebenen Materialien hergestellt wird. 11. The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the artificial oxygen carrier is produced exclusively from the specified materials.
12. Künstlicher Sauerstoffträger, der nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 hergestellt ist. 12. Artificial oxygen carrier which is produced by a method according to one of claims 1 to 11.
13. Künstlicher Sauerstoffträger nach Anspruch 12, bestehend aus 5% Albumin, Perfluorodecalin (PFD) in einer Konzentration von 17% und Lecithin in einer Konzentration von 2% in einem Medium ausgewählt aus folgenden Medien: Wasser, Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, STEEN- Solution, OCS-Lösung, Ringer-Lösung oder Hydroxy -Ethyl-Stärke. 13. Artificial oxygen carrier according to claim 12, consisting of 5% albumin, perfluorodecalin (PFD) in a concentration of 17% and lecithin in a concentration of 2% in a medium selected from the following media: water, Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, STEEN - Solution, OCS solution, Ringer's solution or hydroxy-ethyl starch.
14. Künstlicher Sauerstoffträger nach Anspruch 12 oder 13, der eine höhere Stabilität gegenüber nicht Lecithin-haltigen künstlichen Sauerstoffträgern auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) aufweist, wie durch erhöhte Viskosität des künstlichen Sauerstoffträgers bestimmt. 14. Artificial oxygen carrier according to claim 12 or 13, which has a higher stability compared to non-lecithin-containing artificial oxygen carriers based on Perfluorocarbons (PFOCs), as determined by increased viscosity of the artificial oxygen carrier.
15. Synthetischer Blutersatz, umfassend den künstlichen Sauerstoffträger nach einem der Ansprüche 12 bis 14. 15. Synthetic blood substitute, comprising the artificial oxygen carrier according to one of claims 12 to 14.
16. Verwendung des künstlichen Sauerstoffträgers nach einem der Ansprüche 12 bis 14 als Perfusions- oder Transfusionslösung oder als synthetischer Blutersatz. 16. Use of the artificial oxygen carrier according to one of claims 12 to 14 as a perfusion or transfusion solution or as a synthetic blood substitute.
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