WO2024034098A1 - 分離媒体の連続使用方法 - Google Patents

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WO2024034098A1
WO2024034098A1 PCT/JP2022/030683 JP2022030683W WO2024034098A1 WO 2024034098 A1 WO2024034098 A1 WO 2024034098A1 JP 2022030683 W JP2022030683 W JP 2022030683W WO 2024034098 A1 WO2024034098 A1 WO 2024034098A1
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electrophoresis
separation medium
run
capillary
sample
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PCT/JP2022/030683
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Inventor
宏一 加藤
基博 山崎
功 原浦
周志 隅田
麻美 寺門
Original Assignee
株式会社日立ハイテク
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to a method for continuous use of a separation medium.
  • Genomic medicine is one of the technologies that is attracting the most attention. Genomic medicine literally applies an individual's genetic information to diagnosis and applies medical care appropriate to each individual patient.
  • a DNA sequencer is a device for reading sequence information of genes. In other words, a DNA sequencer can be said to be one of the typical analysis devices.
  • the Human Genome Project which aimed to analyze the entire nucleotide sequence of the human genome, was completed in 2003.
  • Technology related to DNA sequencing has progressed greatly from that time to today, and various technologies related to various sequences have been developed.
  • next-generation sequencing is characterized by carrying out sequence decoding in massively parallel fashion. Thanks to this technological innovation, it is now possible to sequence the human genome for less than $1,000.
  • the DNA reading method called Sanger method used in capillary sequencing which was adopted by the Human Genome Project, is still considered the golden standard in DNA sequencing. The reason for this is that the accuracy of reading bases is high and the analysis cost per sample is superior to other methods such as next-generation sequencing. Therefore, the Sanger method used in capillary sequencing is still an indispensable technology in research sites around the world.
  • capillary sequencers have established such a strong position in the research field is the application of liquid polymers that can be used as separation media inside capillaries.
  • liquid polymers that can be used as separation media inside capillaries.
  • electrophoresis can be performed by filling the channel with the liquid polymer without creating a gel. Measurement can be continued by replacing the liquid polymer in the flow path after each measurement. In other words, the user's labor for gel preparation can be saved.
  • Non-Patent Document 1 investigates whether multiple analyzes can be performed with one filling of a capillary with liquid polymer using a Beckman capillary sequencer. It is being verified. This verification has shown that the analysis performance deteriorates as the number of analyzes increases with one liquid polymer filling.
  • capillary arrays used in DNA sequencing usually use solid glass that has not been chemically modified, and its surface is covered with hydroxyl groups.
  • the buffer used in capillary sequencing is an aqueous solution with a pH of around 8.0, and the glass surface of the capillary is negatively charged. Positive ions in the aqueous solution are adsorbed on the glass surface, but when a high voltage is applied to the capillary array in this state, the positive ions on the glass surface are dragged away, generating an electroosmotic flow. Since this electroosmotic flow has the function of degrading the DNA separation performance, the effectiveness of suppressing the electroosmotic flow greatly affects the analysis results.
  • the liquid polymer serves as a DNA separation medium, and at the same time, it also has the role of adsorbing to the glass surface and preventing electroosmotic flow.
  • the decomposition products of urea have the function of inhibiting the adsorption of liquid polymer to the glass surface.
  • the electroosmotic flow increases with the decomposition of urea, and the DNA separation performance deteriorates.
  • analysis process in a capillary sequencer can be divided into four steps: (1) polymer fill to the capillary array, (2) pre-run, (3) sample injection, and (4) electrophoresis.
  • (2) pre-run is a process in which a voltage is applied only to the liquid polymer for about 3 minutes after filling the capillary array with the liquid polymer. This step is essential for removing impurities in the liquid polymer and is considered necessary to prepare a separation medium environment optimal for analysis.
  • Non-Patent Document 4 reports that the application of pre-run significantly improves the separation of proteins in slab gels.
  • Thermo Fisher Science currently holds 90% of the capillary sequencer market.
  • Thermo Fisher Science sells not only equipment, but also reagents and analysis software, providing customers with comprehensive sample-to-answer solutions.
  • due to its strong oligopoly running costs for capillary sequences remain high, and the black box nature of the equipment hinders customers' flexibility.
  • Thermo Fisher Science is trying to ease customers' freedom by offering a wide variety of electrophoresis devices.
  • a specific reason why running costs remain high is that the protocol for replacing the liquid polymer, which is the DNA separation medium, for each analysis is provided to customers in a form that does not allow for changes. In other words, if a customer fills a capillary array with a liquid polymer once, the customer is limited to only one analysis using the liquid polymer. In other words, customers cannot perform multiple analyzes on a single liquid polymer fill.
  • liquid polymers are the most expensive reagents required for capillary sequence analysis, making it difficult for customers to reduce running costs for analysis.
  • Patent Document 1 discloses an electrophoretic analysis method in which heat generated by each capillary is radiated from an electrode via a thermally conductive medium, and the temperature of each capillary during electrophoresis is kept at a temperature above room temperature and below 80°C. has been done. Patent Document 1 states that with such a configuration, deterioration of the gel can be prevented and electrophoretic analysis can be performed repeatedly using the same gel.
  • Patent Document 2 discloses a capillary electrophoresis device that is equipped with a detector for detecting separated components and a means for determining the completion of electrophoresis of a sample migrating in a capillary (a means for determining completion of electrophoresis). has been done.
  • This electrophoresis completion determination means determines the intensity of a signal peak corresponding to each component in the sample detected by the detector, and when the determined intensity is lower than a predetermined value, It is determined that the electrophoresis has ended.
  • Patent Document 2 describes that with such a configuration, when the gel, which is an electroseparation medium, is used repeatedly for multiple analyzes without replacing it, the measurement start time for the second and subsequent times can be calculated without excess or deficiency. It is stated that. Furthermore, Patent Document 2 states that by adopting such a configuration, it is possible to avoid the risk of introducing multiple samples into the capillary at the same time and to avoid unnecessary lengthening of the electrophoresis time, and to It is stated that accurate analysis can be performed multiple times.
  • next sample is sequentially injected into the injection end of a capillary electrophoresis gel at time n (T S - T F ), and the polynucleotide having the slowest electrophoretic mobility among the immediately preceding samples is determined.
  • a method for performing electrophoresis comprising performing electrophoresis on a next sample such that the polynucleotide having the fastest electrophoretic mobility passes through a detection window of an electrophoresis system before a polynucleotide in the next sample.
  • 6,002,201 describes that with such a configuration, in a typical embodiment, a total of up to about 25 runs can be performed using the same capillary polyacrylamide gel for all samples without washing out or replacing the capillary gel. is described as being performed in the same capillary electrophoresis gel as used for electrophoresis.
  • Patent Document 1 states that "electrophoresis analysis can be performed repeatedly using the same gel", but there is no mention of performing the above-mentioned pre-run.
  • Patent Document 3 states that "the same capillary polyacrylamide gel is used for electrophoresis of all samples” and "the same capillary polyacrylamide gel is used for electrophoresis without washing out or replacing the capillary gel. Although there is a description that "electrophoresis is carried out sequentially in a capillary electrophoresis gel", there is no description that the pre-run described above is performed.
  • Patent Document 2 describes pre-phoresis (pre-run), [0022] describes sample introduction, and [0024] describes electrophoresis. [0026] of Patent Document 2 describes that after the analysis is completed, sample introduction and electrophoresis are performed according to the above-mentioned procedure. Note that [0020] of Patent Document 2 states that the standard sample and analysis sample are not introduced into the capillary during preliminary migration. However, Patent Document 2 does not clarify whether the above-mentioned procedure includes gel filling and pre-phoresis. Further, in Patent Document 2, the timing at which gel filling is performed is not made clear in the explanation of the overall operation after [0020].
  • Patent Documents 1 to 3 all use gel as the separation medium, and there is no description of the structure when a liquid polymer is used as the separation medium, nor is there any description that would suggest it. . Therefore, although the inventions described in Patent Documents 1 to 3 have been proposed, the problem of reducing the running cost of analysis when using a liquid polymer as a separation medium remains unsolved.
  • An object of the present invention is to provide a method for continuous use of a separation medium that can reduce the running cost of analysis when a liquid polymer is used as the separation medium.
  • a method for continuous use of a separation medium according to the present invention that solves the above problems includes a separation medium filling step of filling a capillary with a separation medium, and a first pre-run step of performing a pre-run by applying a voltage to the capillary filled with the separation medium. a first sample injection step in which a first sample is injected into the capillary into which the pre-run has been performed; and a first electrophoresis step in which a first electrophoresis is performed by applying a voltage to the capillary into which the first sample has been injected.
  • a second pre-run step in which a pre-run is performed by applying a voltage to the capillary after the first electrophoresis step; a second sample injection step in which the next sample is injected into the capillary that has undergone the second pre-run step; a second electrophoresis step of performing electrophoresis for the next time by applying a voltage to a capillary into which the next time's sample has been injected, the second pre-run step, the second sample injection step and the second electrophoresis step;
  • the electrophoresis step is repeated a preset number of times.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram illustrating the configuration of an electrophoresis apparatus to which a method for continuous use of a separation medium according to an embodiment of the present invention can be applied.
  • 1 is a top schematic diagram illustrating the configuration of an electrophoresis apparatus to which a method for continuous use of a separation medium according to an embodiment of the present invention can be applied.
  • 3 is a sectional view taken along IIIa-IIIa in FIG. 2.
  • FIG. FIG. 3B is an enlarged view of part IIIb in FIG. 3A.
  • 1 is a schematic diagram illustrating a control configuration of an electrophoresis apparatus to which a method for continuous use of a separation medium according to an embodiment of the present invention can be applied.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating the content of a method for continuous use of a separation medium according to a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a graphical user interface (GUI) for setting the frequency of filling a separation medium in a separation medium filling step.
  • GUI graphical user interface
  • 2 is a flowchart illustrating processing in a microcomputer, electrophoresis, etc. after a user inputs the filling frequency of a separation medium using an input/output device, regarding the method for continuous use of a separation medium according to the first embodiment of the present invention. It is a flowchart explaining the content of the conventional method of filling a separation medium for each analysis.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing DNA base sequences around 400 bp and waveform data in the first run (1st), third run (3rd), and eighth run (8th) of Example 1.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing the DNA base sequence and waveform data around 600 bp in the first run (1st), third run (3rd), and eighth run (8th) of Example 1.
  • 3 is a graph showing the statistical value of the adjacent read length (CRL) for each number of sample injections (Injection ID) of Example 1 and Example 2, that is, the number of runs from 1st to 6th.
  • 3 is a graph comparing the statistical values of the total CRL of Example 1 and Example 2 when the number of sample injections is from 1 to 6 (up to Injection 6).
  • 3 is a graph continuously showing the change in CRL in DNA sequence analysis in Example 4 when the number of sample injections (Injection ID) is 1 to 16, that is, the number of runs is 1 to 16.
  • 12 is a graph continuously showing changes in EQ in fragment analysis in Example 4 when the number of sample injections (Injection ID) is 1 to 12, that is, the number of runs is 1 to 12.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram for comparing and explaining the difference in analysis time between runs.
  • 3 is a table showing the run times of the 1st to 10th runs of the four capillaries (Cap 1 to 4) in Example 4.
  • this method of use a method for continuous use of a separation medium according to an embodiment of the present invention (hereinafter, sometimes simply referred to as “this method of use”) will be described in detail with reference to the drawings as appropriate.
  • this method of use substantially the same or similar configurations are given the same reference numerals, and if the description is redundant, the description may be omitted.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram illustrating the configuration of an electrophoresis apparatus 1 to which this usage method can be applied.
  • FIG. 2 is a top schematic diagram illustrating the configuration of the electrophoresis device 1 to which this usage method can be applied.
  • 3A is a cross-sectional view taken along IIIa-IIIa in FIG. 2.
  • FIG. 3B is an enlarged view of part IIIb in FIG. 3A.
  • FIG. 4 is a schematic diagram illustrating the control configuration of the electrophoresis apparatus 1 to which this usage method can be applied.
  • an electrophoresis apparatus 1 (hereinafter sometimes simply referred to as "this apparatus 1") to which this usage method can be applied includes an autosampler unit 150 located at the bottom of the apparatus, and an irradiation unit 150 located at the top of the apparatus.
  • the detection/thermal chamber unit 160 can be roughly divided into two units.
  • the autosampler unit 150 has a Y-axis driver 85 mounted on the sampler base 80, and can drive in the Y-axis.
  • a Z-axis driver 90 is mounted on the Y-axis driver 85 and can drive in the Z-axis.
  • a sample tray 100 is mounted on the Z-axis driver 90 . Then, as shown in FIGS. 1 and 2, the user sets the separation medium container 20, the anode buffer container 30, the cathode buffer container 40, and the sample container 50 on the sample tray 100.
  • the sample container 50 is set on the X-axis driver 95 mounted on the sample tray 100, and only the sample container 50 can be driven in the X-axis on the sample tray 100.
  • a liquid feeding mechanism 60 is also mounted on the Z-axis drive body 90. This liquid feeding mechanism 60 is arranged below the separation medium container 20.
  • the irradiation detection/constant temperature chamber unit 160 includes a constant temperature chamber unit 110 and a constant temperature chamber door 120, and can maintain a constant temperature inside.
  • An irradiation detection unit 130 is mounted behind the constant temperature bath unit 110, and can perform detection during electrophoresis.
  • a user sets the capillary array 10 in which a plurality of capillaries 125 (see FIG. 3B) are grouped together in the constant temperature bath unit 110, performs electrophoresis while keeping the capillary array 10 at a constant temperature in the constant temperature bath unit 110, and then performs electrophoresis in the irradiation detection unit. Detection is performed at 130.
  • the constant temperature bath unit 110 is also equipped with an electrode 115 for dropping to GND when applying a high voltage for electrophoresis.
  • the capillary array 10 includes a load header 126, a capillary head 127, a detection section 128, and the like.
  • a load header 126 is attached to one end of the capillary array 10.
  • the load header 126 becomes the end of the capillary array 10 on the cathode side.
  • a capillary head 127 is attached to the other end of the capillary array 10.
  • the capillary head 127 is a bundle of capillaries 125 that are pressure-tight and sealed, and is a detachable, pressure-tight member.
  • the capillary head 127 becomes the anode side end of the capillary array 10.
  • capillaries 125 are arranged in a plane at regular intervals.
  • the irradiation detection unit 130 irradiates the capillaries 125 arranged in the detection section 128 with light. Then, the detection unit 128 detects fluorescence etc. generated from the sample electrophoresing in each capillary 125 by light irradiation.
  • the capillary array 10 is set in the constant temperature bath unit 110.
  • the separation medium container 20, the anode buffer container 30, the cathode buffer container 40, and the sample container 50 can be driven in the YZ axis by the autosampler unit 150, and only the sample container 50 can be further driven in the X axis. be able to.
  • the separation medium container 20, anode side buffer container 30, cathode side buffer container 40, and sample container 50 can be automatically connected to any position by the movement of the autosampler unit 150 to the set capillary array 10. .
  • the anode buffer container 30 set on the sample tray 100 includes an anode cleaning tank 31, an anode electrophoresis buffer tank 32, and a sample introduction buffer tank 33.
  • the cathode buffer container 40 includes a waste liquid tank 41, a cathode cleaning tank 42, and a cathode electrophoresis buffer tank 43.
  • the separation medium container 20, the anode buffer container 30, the cathode buffer container 40, and the sample container 50 are arranged in a positional relationship as shown in FIG.
  • the anode buffer container 30 is placed on the sample tray 100 on the front side of the apparatus (the side where the constant temperature chamber door 120 opens and closes) and on the left side.
  • the separation medium container 20 is arranged at the back of the anode side buffer solution container 30.
  • the sample container 50 is arranged on the sample tray 100 on the front side and right side of the apparatus.
  • the cathode side buffer container 40 is arranged at the back of the sample container 50.
  • the positional relationship between the anode side and the cathode side when connecting to the capillary array 10 is "separation medium container 20 - waste liquid tank 41", “anode side cleaning tank 31 - cathode side cleaning tank 42", “anode side "Buffer tank for electrophoresis 32 - buffer tank for cathode electrophoresis 43” and “buffer tank for sample introduction 33 - sample container 50".
  • the separation medium container 20 is inserted and set into the guide 101 embedded in the sample tray 100.
  • the separation medium container 20 contains a separation medium.
  • a separation medium For example, it is preferable to use a liquid polymer as the separation medium.
  • the liquid feeding mechanism 60 in the present apparatus 1 can suitably and automatically fill the capillary 125 (see FIG. 3B) with the separation medium and discharge the separation medium from the capillary 125.
  • the liquid feeding mechanism 60 is arranged such that a plunger 61 built into the liquid feeding mechanism 60 is located below the separation medium container 20 . When the plunger 61 pushes up a cylinder (not shown) provided in the separation medium container 20, the separation medium (not shown) in the separation medium container 20 is introduced into the capillary 125 via the capillary head 127.
  • the left side of the capillary array 10 in FIG. 3A becomes the anode side, and the right side becomes the cathode side.
  • the autosampler unit 150 moves to the position of "anode side electrophoresis buffer tank 32 - cathode side electrophoresis buffer tank 43", high voltage is applied to the cathode side capillary array 10, and the cathode side buffer tank 40 is moved. Electrophoresis is performed by flowing the electrode 115 to GND through the anode side buffer container 30.
  • the individual capillaries 125 constituting the capillary array 10 are fixed through metal hollow electrodes 124, respectively.
  • the hollow electrode 124 is provided in a part of the capillary 125 (from the cathode side end to the load header 126).
  • the tip 125a of the capillary 125 protrudes from the hollow electrode 124 by about 0.5 mm.
  • the length of the capillary 125 protruding from the hollow electrode 124 is not limited to 0.5 mm.
  • all of the hollow electrodes 124 provided in each capillary 125 are attached to the load header 126 (see FIG. 3A) in an integrated state.
  • All hollow electrodes 124 are connected to a high voltage power source 122 via a load header 126. Since the high voltage power supply 122 applies a negative voltage to the hollow electrode 124, the hollow electrode 124 operates as a cathode electrode when a voltage is applied to the hollow electrode 124, such as during electrophoresis or sample injection.
  • the voltage control mechanism includes a microcontroller 141, a controller 142, a high voltage power supply 122, a first ammeter 121, and a second ammeter 123.
  • the microcomputer 141 uses the separation medium filled in the capillary array 10 to check the energization state of the anode-side electrophoresis buffer tank 32 and the cathode-side electrophoresis buffer tank 43.
  • the microcomputer 141 then outputs the confirmed result of the energization state to an input/output device (not shown).
  • the input/output device includes, for example, a touch panel.
  • the controller 142 controls the application of voltage to the current-carrying path by controlling the high-voltage power supply 122, the movement of the sample tray 100, the movement of the sample container 50 by the X-axis driver 95, and the like.
  • the high voltage power supply 122 applies voltage to the energized path based on the control of the controller 142.
  • the energizing path includes the hollow electrode 124, the electrophoresis buffer filled in the cathode-side electrophoresis buffer tank 43 (or the sample in the sample container 50), and the anode-side electrophoresis buffer tank 32. (or it may be the buffer solution filled in the sample introduction buffer tank 33), and the electrode 115. More specifically, since the high voltage power supply 122 generates a voltage (negative voltage) lower than the GNDs 129a and 129b, the current flow when a negative voltage is applied by the high voltage power supply 122 is the flow shown by the broken line arrow in FIG. becomes.
  • the current flows in the order of GND 129a ⁇ second ammeter 123 ⁇ electrode 115 ⁇ capillary array 10 ⁇ hollow electrode 124 ⁇ first ammeter 121 ⁇ high voltage power supply 122. Therefore, the current path is GND 129a ⁇ second ammeter 123 ⁇ electrode 115 ⁇ capillary array 10 ⁇ hollow electrode 124 ⁇ first ammeter 121 ⁇ high voltage power supply 122.
  • the high voltage power supply 122 is electrically connected to the hollow electrode 124 via the first ammeter 121 and to the electrode 115 via the second ammeter 123.
  • a voltage of several tens of kilovolts is applied to both ends, an electric field is generated in the direction from the hollow electrode 124 to the electrode 115.
  • This electric field causes a negatively charged sample such as a nucleic acid to move from the cathode-side tip 125a of the capillary 125 (see FIG. 3B) toward the detection section 128 (see FIG. 3A).
  • a negatively charged sample eg, DNA
  • the first ammeter 121 detects the current flowing from the high voltage power supply 122 to the hollow electrode 124 and transmits the current value to the microcomputer 141. Further, the second ammeter 123 detects the current flowing from the electrode 115 to the GND 129a, and transmits the current value to the microcomputer 141.
  • a second ammeter 123 is usually used to check the current value and its fluctuations. The reason is that the second ammeter 123 more directly reflects the value of the current flowing through the electrophoresis path.
  • the value indicated by the first ammeter 121 includes the current value of the leakage, but the value indicated by the second ammeter 123
  • the figures shown do not include earth leakage.
  • the net amount of current flowing through the electrophoresis path is detected.
  • a medium with relatively high resistance compared to metal such as a buffer solution or a separation medium (for example, liquid polymer)
  • a connection such as a block or capillary 125.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating the content of the method for continuous use of a separation medium according to the first embodiment of the present invention. This usage method is applied to the electrophoresis device 1.
  • this usage method includes a separation medium filling step S1, a first pre-run step S2, a first sample injection step S3, a first electrophoresis step S4, and a second It includes a pre-run step S5, a second sample injection step S6, and a second electrophoresis step S7. Then, in this usage method, the second pre-run step S5, the second sample injection step S6, and the second electrophoresis step S7 are repeated a preset number of times (n times).
  • the separation medium filling step S1 is a step of filling the capillary 125 with a separation medium.
  • the capillary 125 can be filled with the separation medium by the liquid feeding mechanism 60 described above.
  • the first pre-run step S2 is a step in which a voltage is applied to the capillary 125 filled with the separation medium to perform a pre-run.
  • Pre-run is the application of voltage to the separation medium prior to electrophoresis of the sample.
  • the sample tray 100 is appropriately driven in the X-axis, Y-axis, and Z-axis, and the positional relationship between the anode side and the cathode side in connection with the capillary array 10 is adjusted to the "anode side electrophoresis buffer tank". 32-cathode side electrophoresis buffer tank 43'', and by applying a voltage.
  • the first pre-run step S2 can be performed under general conditions, for example, 60° C. x 3 minutes x 15 kV.
  • the first sample injection step S3 is a step of injecting the first sample into the capillary 125 that has undergone the pre-run.
  • the sample tray 100 is appropriately driven in the X-axis, Y-axis, and Z-axis, so that the positional relationship between the anode side and the cathode side in connection with the capillary array 10 is "sample introduction buffer tank 33".
  • sample introduction buffer tank 33 - sample container 50'' and applying a voltage.
  • the first sample injection step S3 can be performed at, for example, 60° C. x 4 seconds x 1.2 kV.
  • the first electrophoresis step S4 is a step in which a voltage is applied to the capillary 125 into which the first sample is injected to perform the first electrophoresis.
  • the sample tray 100 is appropriately driven in the X-axis, Y-axis, and Z-axis, and the positional relationship between the anode side and the cathode side in connection with the capillary array 10 is adjusted to the "anode side electrophoresis buffer solution". This can be done by applying a voltage to the tank 32 - cathode side electrophoresis buffer tank 43.
  • the first electrophoresis step S4 can be performed at, for example, 60° C. x 30 minutes x 7.5 kV.
  • the second pre-run step S5 is a step in which a voltage is applied to the capillary 125 after the first electrophoresis step S4 to perform a pre-run.
  • the separation medium in the capillary 125 is not discarded and re-injected (i.e., the separation medium is replaced), which is normally done after the analysis in the previous electrophoresis (run), but the previous run is performed.
  • a pre-run for the next sample analysis (second pre-run step S5) is performed using the separation medium used in step S5.
  • a run means that a potential difference is generated between both ends of the capillary 125 by the high-voltage power supply 122, so that the sample added to the separation medium is migrated into the capillary 125.
  • the sample is detected by the irradiation detection unit 130.
  • the second sample injection step S6 is a step of injecting the next sample into the capillary 125 in which the second pre-run step S5 was performed.
  • the second sample injection step S6 can be performed in the same manner as the first sample injection step S3.
  • the second electrophoresis step S7 is a step in which a voltage is applied to the capillary 125 into which the sample for the next time has been injected to perform electrophoresis for the next time.
  • the second electrophoresis step S7 can be performed in the same manner as the first electrophoresis step S4.
  • the second pre-run step S5, the second sample injection step S6, and the second electrophoresis step S7 are repeated a preset number of times (n times).
  • the separation medium is filled in one separation medium filling step S1. Finish the analysis using the separated separation medium. Thereafter, the process returns to the separation medium filling step S1, the separation medium in the capillary 125 is replaced, and each step after the first pre-run step S2 is performed using the new separation medium as described above. In this usage method, this is performed a desired number of times.
  • the filling frequency (f times) of the separation medium in this specification means that a new Refers to filling the separation medium (refilling frequency of the separation medium).
  • the number of repetitions (n times) of the second pre-run step S5, the second sample injection step S6, and the second electrophoresis step S7 is "the frequency of filling the separation medium in the separation medium filling step S1 - 1 time" (f -1 time) and can be set.
  • the filling frequency (f times) of the separation medium is set to 4 times
  • the settings include one run of the first electrophoresis step S4 and three runs of the second electrophoresis step S7. Included in set.
  • the set number of repetitions of the second pre-run step S5, the second sample injection step S6, and the second electrophoresis step S7 is thereby set. (n times) is set.
  • the number of repetitions (n times) of the second pre-run step S5, the second sample injection step S6, and the second electrophoresis step S7 is the number of times the second and subsequent runs are performed using the separation medium used in the first run. means.
  • this usage method can reduce the frequency of filling a separation medium, such as a liquid polymer, which is the most expensive reagent among the reagents required for capillary sequence analysis, thereby reducing the running cost of analysis.
  • the user can also arbitrarily set the number of repetitions (n times) of the second pre-run step S5, second sample injection step S6, and second electrophoresis step S7.
  • the set number of repetitions of these steps (that is, the number of repetitions of the run in the second electrophoresis step S7) is, for example, 1 time, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times. , 9 times, 10 times, 11 times, 12 times, 13 times, 14 times, 15 times, 16 times, 17 times, 18 times, 19 times, 20 times, 21 times, 22 times, 23 times, 24 times or 25 times
  • the number of times may be 26 times or more.
  • the set number of times (n times) for repeating the above steps can be arbitrarily set depending on the state of the sample, such as the deterioration state of the separation medium and the length of the DNA chain.
  • the set number of times is 4 to 5 times in one filling of the separation medium (total number of runs 5 to 6 times, that is, the frequency of filling the separation medium 5 to 6 times).
  • the number of times to be set may be 3 times in one filling of the separation medium (total number of runs: 4 times, that is, the frequency of filling the separation medium 4 times). Can be done.
  • the frequency of filling the separation medium (f times) in the separation medium filling step S1 can be input using an input/output device (not shown) connected to the microcomputer 141, for example.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of a graphical user interface (GUI) for setting the separation medium filling frequency in the separation medium filling step S1.
  • GUI graphical user interface
  • the input/output device can display a GUI for inputting the separation medium filling frequency (f times).
  • the user inputs, for example, "every 4 injection” or "4" into “Polymer exchange frequency” in the lower column of the GUI shown in FIG. 6, or selects "4" using a radio button. By doing so, the frequency of filling the separation medium can be set to four times.
  • the set number of repetitions (n times) of the above-described process can also be input in the same manner as the filling frequency (f times) of the separation medium.
  • create a field called "Number of repetitions of 2nd electrophoresis” in the GUI and enter, for example, "3 times" or "3” in this field.
  • the number of repetitions of the above-described process can be set to three times.
  • the process returns to the second pre-run process S5 and repeats the second pre-run process S5. , a second sample injection step S6 and a second electrophoresis step S7 are performed.
  • FIG. 7 is a flowchart illustrating processing, electrophoresis, etc. in the microcomputer 141 after the user inputs the filling frequency of the separation medium using the input/output device, regarding the continuous use method of the separation medium according to the first embodiment of the present invention. be.
  • the user inputs the filling frequency of the separation medium (step S11).
  • the microcomputer 141 is set to discard the old separation medium from the capillary 125 and fill the capillary 125 with a new separation medium when the total number of runs reaches four.
  • step S12 analysis is started (step S12).
  • the microcomputer 141 determines whether electrophoresis is the first time (step S13). If electrophoresis is the first time (Yes in step S13), the microcomputer 141 issues an instruction to fill the separation medium (step S14), and the apparatus 1 performs the separation medium filling step S1.
  • step S15 the microcomputer 141 issues an instruction to perform a prerun (step S15), and the apparatus 1 performs a first prerun step S2.
  • step S16 sample injection
  • step S17 the apparatus 1 performs the first electrophoresis step S4.
  • the microcomputer 141 issues an instruction to perform sample injection (step S16), and the apparatus 1 performs a second sample injection step S6.
  • the microcomputer 141 issues an instruction to perform electrophoresis (step S17), and the apparatus 1 performs the second electrophoresis step S7.
  • the microcomputer 141 analyzes the sample by performing the above series of flows shown in FIG. 7 a number of times set by the user.
  • this usage method can reduce the frequency of filling a separation medium, such as a liquid polymer, which is the most expensive reagent among the reagents required for capillary sequence analysis, thereby reducing the running cost of analysis.
  • FIG. 8 is a flowchart illustrating the conventional method of filling a separation medium for each analysis.
  • the conventional method includes a separation medium filling step S101, a pre-run step S102, a sample injection step S103, and an electrophoresis step S104. These steps in the conventional method shown in FIG. 8 correspond to the separation medium filling step S1, first pre-run step S2, first sample injection step S3, and first electrophoresis step S4 in the present usage method shown in FIG. 5, respectively.
  • the separation medium is filled for each analysis, so these steps are performed each time.
  • the conventional method shown in FIG. 8 does not have the second pre-run step S5, the second sample injection step S6, and the second electrophoresis step S7 in the present usage method shown in FIG. It's not something you do repeatedly. Therefore, in the conventional method, the frequency of filling the separation medium, which is the most expensive reagent among the reagents required for capillary sequence analysis, is not reduced, and the running cost of analysis remains high.
  • the present inventor conducted research to solve the problems of the present invention, and found that in the present usage method according to the first embodiment, the second pre-run step S5, the second sample injection step S6, and the second electrophoresis step S7 are set in advance. It was decided that the test would be repeated a set number of times. It has been found that the analysis performance obtained in this manner satisfies the specifications, although the waveform data is slightly degraded, as will be described later. Furthermore, it has been found that the present method of use according to the first embodiment can improve the turnaround time (TAT) compared to the conventional method shown in FIG.
  • TAT turnaround time
  • FIG. 9 is a flowchart illustrating the content of a method for continuous use of a separation medium according to a second embodiment of the present invention.
  • this usage method according to the second embodiment includes a separation medium filling step S1, a first pre-run step S2, a first sample injection step S3, a first electrophoresis step S4, and a second It includes a sample injection step S6 and a second electrophoresis step S7.
  • the second sample injection step S6 and the second electrophoresis step S7 are repeated a preset number of times (n times).
  • the present method of use according to the second embodiment differs from the present method of use according to the first embodiment, which includes the second pre-run step S5, in that it does not include the second pre-run step S5.
  • the second sample injection step S6 of the present usage method according to the second embodiment is a step of injecting the next sample into the capillary after the first electrophoresis step S4.
  • the second sample injection step S6 of the present usage method according to the first embodiment is a step of injecting the next sample into the capillary in which the second pre-run step S5 has been performed. Therefore, the second sample injection step S6 of this method of use according to the second embodiment and the second sample injection step S6 of this method of use according to the first embodiment are different in process content.
  • the second sample injection step S6 and the second electrophoresis step S7 are repeated a preset number of times (n times).
  • the present method of use according to the first embodiment repeats the second pre-run step S5, the second sample injection step S6, and the second electrophoresis step S7 a preset number of times (n times). conduct. Therefore, the method of use according to the second embodiment and the method of use according to the first embodiment are different in the content of the repeated steps.
  • This method of use according to the second embodiment and this method of use according to the first embodiment have these differences because the method of use according to the second embodiment does not include the second pre-run step S5. However, other than these, the configuration is the same.
  • the usage method according to the second embodiment will be described below, focusing on the differences from the usage method according to the first embodiment.
  • the second sample injection step S6 of the present usage method is a step of injecting the next sample (as is without performing a pre-run) into the capillary 125 after the first electrophoresis step S4. It is.
  • the present inventor conducted research to solve the problems of the present invention, and surprisingly found that the next sample was directly injected into the capillary 125 after the first electrophoresis step S4 without performing a pre-run.
  • electrophoresis that is, when the second sample injection step S6 and the second electrophoresis step S7 are performed after the first electrophoresis step S4, a prerun (second prerun in the first embodiment) is performed before the second sample injection step.
  • the electroosmotic flow becomes difficult to increase (suppressed), thereby improving the number of analyzes and the analytical performance of samples such as DNA.
  • the analysis can be completed faster. For example, in a typical capillary DNA sequencer, one analysis requires about 30 minutes, of which pre-run requires about 3 minutes. Since the pre-run is omitted when analyzing the next sample, the analysis time can be reduced by about 10%. This can be said to be an advantageous effect compared to the conventional method in which a pre-run is performed for each analysis or the present method according to the first embodiment.
  • FIG. 10 is a flowchart illustrating the processing, electrophoresis, etc. in the microcomputer 141 after the user inputs the filling frequency of the separation medium using the input/output device, regarding the continuous use method of the separation medium according to the second embodiment of the present invention. be.
  • the user inputs the filling frequency of the separation medium (step S11).
  • the microcomputer 141 is set to discard the old separation medium from the capillary 125 and fill the capillary 125 with a new separation medium when the total number of runs reaches four.
  • step S12 analysis is started (step S12).
  • the microcomputer 141 determines whether electrophoresis is the first time (step S13). If electrophoresis is the first time (Yes in step S13), the microcomputer 141 issues an instruction to fill the separation medium (step S14), and the apparatus 1 performs the separation medium filling step S1.
  • step S15 the microcomputer 141 issues an instruction to perform a prerun (step S15), and the apparatus 1 performs a first prerun step S2.
  • step S16 sample injection
  • step S17 the apparatus 1 performs the first electrophoresis step S4.
  • the microcomputer 141 analyzes the sample by performing the above series of flows shown in FIG. 10 a number of times set by the user.
  • Example 1 capillary sequence DNA base sequence analysis was performed using the flow shown in FIG. 5 and the following conditions.
  • a capillary DNA sequencer DS3000 manufactured by Hitachi High-Tech Corporation was used.
  • a liquid polymer was used as the separation medium.
  • Spectrum Compact Polymer 7 CE237A manufactured by Promega was used as the liquid polymer.
  • Sequencing Standard, BigDye TM Terminator v3.1 (manufactured by Thermo Fisher) was used for the DNA sample to be analyzed.
  • the separation medium filling step S1 was carried out in a prescribed manner on a capillary DNA sequencer.
  • the first pre-run step S2 was performed at 60°C x 3 minutes x 15 kV.
  • the first sample injection step S3 was performed at 60° C. x 4 seconds x 1.2 kV.
  • the first electrophoresis step S4 was performed at 60°C x 30 minutes x 7.5 kV.
  • the second pre-run step S5 was performed at 60°C x 3 minutes x 15 kV.
  • the second sample injection step S6 was performed at 60°C x 4 seconds x 1.2 kV.
  • the second electrophoresis step S7 was performed at 60°C x 30 minutes x 7.5 kV.
  • Example 1 the filling frequency of the separation medium was set to 8 (that is, the number of repetitions of the second pre-run step S5, second sample injection step S6, and second electrophoresis step S7 was set to 7), and this was performed in one set. A total of 16 runs were analyzed in two consecutive runs.
  • Example 2 capillary sequence DNA base sequence analysis was performed using the flow shown in FIG. 9 and the following conditions. Note that the capillary DNA sequencer, liquid polymer, and DNA sample are the same as in Example 1.
  • the separation medium filling step S1 was carried out in a prescribed manner on a capillary DNA sequencer.
  • the first pre-run step S2 was performed at 60°C x 3 minutes x 15 kV.
  • the first sample injection step S3 was performed at 60° C. x 4 seconds x 1.2 kV.
  • the first electrophoresis step S4 was performed at 60°C x 30 minutes x 7.5 kV.
  • the second sample injection step S6 was performed at 60°C x 4 seconds x 1.2 kV.
  • the second electrophoresis step S7 was performed at 60°C x 30 minutes x 7.5 kV.
  • Example 2 the filling frequency of the separation medium was also set to 8 (that is, the number of repetitions of the second sample injection step S6 and the second electrophoresis step S7 was set to 7), and this was performed twice in a row in one set. , a total of 16 runs were analyzed.
  • FIG. 11 is an explanatory diagram showing DNA base sequences around 400 bp and waveform data in the first run (1st), third run (3rd), and eighth run (8th) of Example 1.
  • the first run is the first electrophoresis after one liquid polymer filling.
  • the third run is the third electrophoresis after one liquid polymer filling.
  • the 8th run is the 8th electrophoresis after one liquid polymer filling.
  • FIG. 12 is an explanatory diagram showing DNA base sequences around 600 bp and waveform data in the first run (1st), third run (3rd), and eighth run (8th) of Example 1.
  • the first run is the first electrophoresis after one liquid polymer filling.
  • the third run is the third electrophoresis after one liquid polymer filling.
  • the 8th run is the 8th electrophoresis after one liquid polymer filling.
  • Example 2 As shown in FIGS. 11 and 12, as the number of runs after one liquid polymer filling increased, the waveform data deteriorated somewhat, but the DNA base sequence could be analyzed without problems. Specifically, there was a part around 645 bp of the 8th run shown in FIG. 12 that could not be analyzed with sufficient accuracy, but the rest could be analyzed with sufficiently high accuracy. Although illustration of Example 2 is omitted, almost the same results as Example 1 were obtained.
  • FIG. 13 is a graph showing statistical values of adjacent read lengths (CRL) for each number of sample injections (Injection ID) of Examples 1 and 2, that is, the number of runs from 1st to 6th. Note that FIG. 13 shows statistical values obtained by performing the same analysis three times independently. As shown in FIG. 13, when 600bp is set as the standard value, in both Example 1 and Example 2, the CRL clears the standard value until the fourth run, and it is possible to fully satisfy the specifications. confirmed. If 400 bp is set as the reference value, it can be seen that in both Example 1 and Example 2, the CRL was able to clear the reference value until the 6th run, and the specifications were fully satisfied. Note that the reference value can be arbitrarily changed depending on the length of the DNA base sequence to be analyzed.
  • the DNA base sequence to be analyzed is a PCR amplification product and its length can be predicted in advance, such as 300 bp or 400 bp, this can be considered as a reference value.
  • the length of the PCR amplification product is 300 bp, it was inferred from the results shown in FIG. 13 that the specifications could be fully met up to about the 8th to 10th runs.
  • Example 3 the filling frequency of the separation medium was set to 4 (that is, the number of repetitions of the second pre-run step S5, second sample injection step S6, and second electrophoresis step S7 was set to 3), and this was performed in one set. The analysis was carried out four times in a row, for a total of 16 runs. In Example 3, analysis was performed in the same manner as in Example 1 except for this.
  • Example 4 the filling frequency of the separation medium was set to 4 (that is, the number of repetitions of the second sample injection step S6 and the second electrophoresis step S7 was set to 3), and this was performed four times in a row in one set. , a total of 16 runs were analyzed. In Example 4, analysis was performed in the same manner as in Example 2 except for this.
  • FIG. 15 is a graph continuously showing the change in CRL in the DNA sequence analysis in Example 4 when the number of sample injections (Injection ID) was 1 to 16, that is, the number of runs was 1 to 16.
  • 1, 2, and 3 on the right side indicate capillary numbers. That is, FIG. 15 shows the change in CRL of the 1st to 16th runs of the three capillaries in a line graph.
  • " ⁇ " in the figure indicates the result of the first run after filling or refilling (replacing) the liquid polymer.
  • “ ⁇ ” in the figure indicates the results of the second, third, and fourth runs using the liquid polymer used in the first run.
  • FIG. 16 shows the EQ showing the maximum base length within the range in which single base separation is possible in fragment analysis in which the number of sample injections (Injection ID) in Example 4 is from 1 to 12, that is, the number of runs is from 1 to 12.
  • This is a graph continuously showing the transition of .
  • 1, 2, and 3 on the right side indicate capillary numbers. That is, FIG. 16 shows the changes in EQ of the 1st to 12th runs of the three capillaries in a line graph.
  • “ ⁇ " in the figure indicates the result of the first run after filling or refilling (replacing) the liquid polymer.
  • “ ⁇ ” in the figure indicates the results of the second, third, and fourth runs using the liquid polymer used in the first run.
  • Figure 17 shows Examples 1 and 3 in which a pre-run is performed for each run, and Examples 2 and 4 in which a pre-run is performed only during the first run after filling the liquid polymer, and is not performed in the second and subsequent runs.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram for comparing and explaining the difference in analysis time of the second run in FIG.
  • Examples 1 and 3 are similar to the conventional method in that a pre-run is performed for each run.
  • Examples 1 and 3 also in the conventional method, a pre-run is performed for each run, so in the second run, the points shown by the two-dot dashed line on the left in the upper explanatory diagram of FIG. Voltage is being applied for the pre-run shown in section B at the beginning of the analysis.
  • the pre-run is not performed in the second and subsequent runs after filling the liquid polymer. There is no need to apply voltage for pre-run as shown in part B of the explanatory diagram. Therefore, it was confirmed that in Examples 2 and 4, the analysis time could be shortened for the second and subsequent runs after filling the liquid polymer.
  • the horizontal axis in the upper explanatory diagram and the lower explanatory diagram of FIG. 17 indicates an index of analysis time.
  • the index from the start of analysis to the end is about 300
  • Examples 2 and 4 shown in the lower explanatory diagram of FIG. the number of indicators from the start to the end of the analysis is approximately 265. From these results, it was confirmed that Examples 2 and 4 can shorten the analysis time by about 10% compared to Examples 1 and 3 (and the conventional method).
  • FIG. 18 is a table showing the run times of the 1st to 10th runs of the four capillaries (Cap 1 to 4) in Example 4.
  • the table shown in FIG. 18 shows these run times [min], average run time [min], average run time specifications [min], and judgments for the average run time specifications (Average run time spec) [min].
  • Run time spec judge Migration time uniformity (MT Uniformity), Migration time uniformity specification (Spec), and Judgment for migration time uniformity specification (MT Uniformity) ge) and It shows.
  • the run time was longer for all Caps 1 to 4, so the average run time was also longer. Therefore, the second run could not satisfy the average run time specification of 30 min or less, and the determination regarding the average run time specification was Fail.
  • the other runs 1st, 3rd to 10th were passed. Furthermore, as shown in the table of FIG. 18, the total run time was 25 to 30 minutes, with some variation.
  • the uniformity of electrophoresis time in all cases met the specification for uniformity of electrophoresis time of 5.0% or less, and all runs 1 to 10 passed.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and includes various modifications.
  • the embodiments described above have been described in detail to explain the present invention in an easy-to-understand manner, and the present invention is not necessarily limited to having all the configurations described.
  • Electrophoresis device (this device) 10 Capillary array 20 Separation medium container 30 Anode side buffer container 31 Anode side cleaning tank 32 Anode side electrophoresis buffer tank 33 Sample introduction buffer tank 40 Cathode side buffer container 41 Waste liquid tank 42 Cathode side cleaning tank 43 Cathode Side electrophoresis buffer tank 50 Sample container 60 Liquid feeding mechanism 61 Plunger 80 Sampler base 85 Y-axis driver 90 Z-axis driver 95 X-axis driver 100 Sample tray 101 Guide 110 Thermostat unit 115 Electrode 120 Thermostat door 121 First ammeter 122 High voltage power supply 123 Second ammeter 124 Hollow electrode 125 Capillary 125a Tip 126 Load header 127 Capillary head 128 Detection section 129a, 129b GND 130 Irradiation detection unit 141 Microcomputer 142 Controller 150 Autosampler unit 160 Irradiation detection/Thermostat unit S1 Separation medium filling process S2 First pre-run process S3 First sample

Landscapes

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Abstract

分離媒体として液体ポリマを用いる場合において、分析のランニングコストを低減できる分離媒体の連続使用方法を提供する。本発明に係る分離媒体の連続使用方法は、キャピラリーに分離媒体を充填する分離媒体充填工程（Ｓ１）と、プレランを行う第１プレラン工程（Ｓ２）と、キャピラリーに１回目の試料を注入する第１試料注入工程（Ｓ３）と、電圧を印加して１回目の電気泳動を行う第１電気泳動工程（Ｓ４）と、前記第１電気泳動工程（Ｓ４）後にプレランを行う第２プレラン工程（Ｓ５）と、前記第２プレラン工程（Ｓ５）を行ったキャピラリーに次回分の試料を注入する第２試料注入工程（Ｓ６）と、次回分の電気泳動を行う第２電気泳動工程（Ｓ７）と、を有し、前記第２プレラン工程（Ｓ５）、前記第２試料注入工程（Ｓ６）および前記第２電気泳動工程（Ｓ７）を予め設定された設定回数繰り返して行う。

Description

分離媒体の連続使用方法
　本発明は、分離媒体の連続使用方法に関する。
　６０歳以上の人口が総人口に対して占める割合は今後増大し、いずれの先進国でも超高齢化社会を迎える。それを背景として人々の健康への関心は近年非常に高まっており、健康・長寿を維持するためのヘルスケア技術に関心が集まっている。その中でもゲノム医療は最も注目されている技術の一つである。ゲノム医療は文字どおり個人の遺伝子情報を診断に適用し、個々の患者にふさわしい医療を適用しようというものである。その遺伝子の配列情報を読み取るための装置がＤＮＡシーケンサーである。つまり、ＤＮＡシーケンサーは代表的な分析装置の一つであるといえる。
　ヒトのゲノムの全塩基配列の解析を目論んだヒトゲノム計画は２００３年に完了した。ＤＮＡシーケンスに関する技術は当時から今日まで大きく進展し、様々なシーケンスに関する様々な技術が開発された。その中でも次世代シーケンシングと呼ばれる技術は、超並列に配列解読を実施することを特徴としている。この技術革新により、現在ではヒトゲノムを１０００ドル以下で解読できるようになっている。
　しかしながら、依然としてヒトゲノム計画で採用された、キャピラリーシーケンスにおいて用いられるサンガー法というＤＮＡ読み取り方法は、ＤＮＡシーケンスにおけるゴールデンスタンダードとされている。その理由は、読み取り塩基精度が高く、かつ次世代シーケンシングなど他手法に対する１サンプルあたりの分析コストの優位性があるためである。従って、このキャピラリーシーケンシングで用いるサンガー法は現在でも世界各国の研究現場でなくてはならない技術となっている。
　研究現場において、キャピラリーシーケンサーが確固とした地位を確立した理由の一つとして、キャピラリー内の分離媒体を可能とした液体ポリマの適用を挙げることができる。キャピラリーシーケンサーが普及する以前は２枚のゲル板の間に固化させたゲルを用いてＤＮＡの分離を実施するのが一般的であった。しかし、このゲルの作製には労力を要するため、ユーザーの負担となっていた。しかし、液体ポリマを用いることで、ゲルを作成せずに、流路に液体ポリマを充填することで電気泳動を実施できることが判明した。液体ポリマは計測毎に流路内の液体ポリマを置換することで計測を継続できる。つまりユーザーのゲル作製の労力を省くことができる。
　液体ポリマであればキャピラリーはそのままで、分離媒体である液体ポリマのみ交換すれば、連続して計測を実施することができる。また、固体の分離媒体（ゲル）を用いるマイクロ流路チップにおいてはゲルが固化しているため、チップそのものを計測毎に廃棄し、新たなチップを準備する必要がある。これがランニングコストの増大を招き、ユーザーの負担となっている。このような状況の中、容易に交換が可能な液体ポリマはキャピラリーシーケンサーの有利な特徴の一つとなっている。
　また、キャピラリーシーケンサーのユーザーの最も大きな要求の一つとして、ランニングコストの低減がある。キャピラリーシーケンサーで用いる試薬には陽極側緩衝液、陰極側緩衝液、液体ポリマなどがあるが、それらの中でも最も高価な試薬は、ＤＮＡを分離する媒体である液体ポリマである。この最も高価である液体ポリマにおけるランニングコストを低減するために、非特許文献１では、ベックマン社のキャピラリーシーケンサーを用いて、キャピラリーに対する１回の液体ポリマ充填で複数の分析が可能であるかどうかを検証している。この検証においては、１回の液体ポリマ充填では分析回数を重ねるにつれ、分析性能が劣化していく結果が示されている。結論としては“Replacement of the separation matrix is simple and is not worth compromising the results with its reuse”（（キャピラリーの）液体ポリマの置換は簡単であり、液体ポリマの再利用によって実験結果を損なうべきではない）と言及されている。換言すると、液体ポリマの再利用は分析性能を損なうため、分析毎に液体ポリマを交換することが強く推奨されている。
　複数回の分析が液体ポリマの劣化を及ぼす原因は、液体ポリマに含有されるウレアの分解である。一般にキャピラリーシーケンサーにおける泳動分析は６０℃の温度環境下で１５ｋＶ程度の高電圧をキャピラリー末端に印加することで実施される。ウレアは２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離させる働きを持つが、非特許文献２によると、ウレアは高温で分解するという問題を持っている。
　また、ＤＮＡシーケンシングで使用するキャピラリーアレイは通常化学的な修飾を施していない無垢のガラスを用いており、その表面は水酸基で覆われている。一方、キャピラリーシーケンシングで使用するバッファはｐＨ８．０付近の水溶液であり、キャピラリーのガラス表面は負に帯電することになる。このガラス表面には水溶液中の正イオンが吸着するが、この状態でキャピラリーアレイに高電圧を印加すると、ガラス表面の正イオンが引きずられることにより電気浸透流が発生する。この電気浸透流はＤＮＡの分離性能を劣化させる働きを持つため、電気浸透流の抑制の良し悪しは分析結果に大きく影響する。ここで、液体ポリマはＤＮＡの分離媒体であると同時に、ガラス表面に吸着し、電気浸透流を防ぐ役割も持つ。しかし、非特許文献３によると、ウレアの分解産物は、液体ポリマのガラス表面への吸着を阻む働きを持つ。結果として、ウレアの分解に伴い電気浸透流が増大し、ＤＮＡの分離性能が低下してしまう。
　なお、キャピラリーシーケンサーにおける分析の工程は、（１）キャピラリーアレイへのポリマフィル、（２）プレラン、（３）サンプルインジェクション、（４）電気泳動の４つの工程に分けることができる。
　そのうち（２）のプレランはキャピラリーアレイへ液体ポリマを充填した後、液体ポリマのみに電圧を３分ほど印加するプロセスである。この工程は、液体ポリマ中の不純物の除去に必須であり、分析に至適な分離媒体環境を整えるために必要であると考えられている。非特許文献４ではプレランの適用によりスラブゲルにおけるタンパクの分離が大幅に向上することが報告されている。
　現在、キャピラリーシーケンサー市場の９０％を保持しているのは、サーモフィッシャーサイエンス社である。サーモフィッシャーサイエンス社は装置のみならず試薬、解析ソフトの販売を行い、ｓａｍｐｌｅ　ｔｏ　ａｎｓｗｅｒとしての包括的なソリューションを顧客に提供している。しかしながら、その強大な寡占状態により、キャピラリーシーケンスにおけるランニングコストは高止まりし、装置のブラックボックス化も顧客の自由度を阻んでいる。その一方でサーモフィッシャーサイエンス社は多種の電気泳動装置などを提供することで、顧客の自由度の緩和を図っている。
　ランニングコストが高止まりする具体的な要因としては、ＤＮＡの分離媒体である液体ポリマを分析毎に交換するプロトコルが変更を許容しない形で顧客に提供されている点である。つまり、顧客がキャピラリーアレイに液体ポリマを１回充填した場合、顧客は当該液体ポリマを用いた分析は１回に限定される。換言すると、顧客は１回の液体ポリマ充填について複数の分析を実施することができない。一方、液体ポリマはキャピラリーシーケンスの分析に必要となる試薬の中で最も高価であるため、顧客は分析のランニングコストの低減を図ることが困難であった。
　このような状況下、分析のランニングコストの低減を図り得る発明が幾つか提案されている。
　例えば、特許文献１には、各キャピラリーの発熱を、熱伝導性媒体を介して電極から放熱し、電気泳動の動作中の各キャピラリーの温度を室温以上８０℃以下に保つ電気泳動分析方法が開示されている。特許文献１には、このような構成とすることにより、ゲルの劣化を阻止でき、同一ゲルを用いて繰り返し電気泳動分析できると記載されている。
　また、例えば、特許文献２には、分離された成分を検出する検知器と、キャピラリー中を泳動する試料の泳動終了を判定する手段（泳動終了判定手段）を備えているキャピラリー電気泳動装置が開示されている。この泳動終了判定手段は、前記検出器によって検出された試料中の各成分に対応する信号ピークの強度を求め、この求められる強度が所定の値より低いときに、前記試料の前記キャピラリー中での泳動を終了したと判定する。特許文献２には、このような構成とすることにより、電気分離媒体であるゲルを交換することなく複数回の分析に繰り返し使用する場合に、２回目以降の測定開始時間を過不足なく算定できると記載されている。また、特許文献２には、このような構成とすることにより、複数の試料が同時にキャピラリーに導入される危険や、泳動時間が不必要に長くなることを避けることができ、最低限の時間で複数回の正確な分析が可能となると記載されている。
　特許文献３には、逐次的に次のサンプルを時間ｎ（ＴＳ－ＴＦ）に毛管電気泳動ゲルの注入端に注入して、直前のサンプル中で最も遅い電気泳動度を有するポリヌクレオチドが次のサンプル中で最も速い電気泳動度を有するポリヌクレオチドより先に電気泳動システムの検出窓を通過するように、前記次のサンプルについて電気泳動を実行するステップを含む、電気泳動を実行する方法が開示されている。特許文献３には、このような構成とすることにより、代表的な実施態様では合計約２５回までの泳動が、毛管ゲルを洗い流したり交換したりしないで同一の毛管ポリアクリルアミドゲルが全てのサンプルの電気泳動に使用されるように、同一の毛管電気泳動ゲルで実行されると記載されている。
特開２００４－１９１２４７号公報 特開２０００－３１４７２０号公報 特表２００６－５０４０９９号公報
J. Braz. Chem. Soc., Vol. 15, No. 3, 413-420, 2004 J Forensic Sci. 2005 Jul;50(4):842-8. J Chromatogr A. 1998 May 8;806(1):157-64. J Applied Polymer. 2010 Jan, 48994
　特許文献１の［０００８］には、「同一ゲルを用いて繰り返し電気泳動分析できる」との記載はあるが、前記したプレランを行う旨の記載はない。
　同様に、特許文献３の［００１７］には、「同一の毛管ポリアクリルアミドゲルが全てのサンプルの電気泳動に使用される」との記載、および「毛管ゲルを洗い流したり交換したりしないで、同一の毛管電気泳動ゲルで逐次的に電気泳動される」との記載はあるが、前記したプレランを行う旨の記載はない。
　一方、特許文献２の［００２０］には予備泳動（プレラン）、［００２２］には試料導入、［００２４］には電気泳動について説明されている。そして、特許文献２の［００２６］には分析終了後、上述の手順で試料導入、電気泳動が行われる旨記載されている。なお、特許文献２の［００２０］には、予備泳動においては、標準試料および分析試料はキャピラリーの中には導入されないと記載されている。
　しかし、特許文献２には、上述の手順にゲルの充填と予備泳動が含まれるか明らかにされていない。また、特許文献２には、ゲルの充填をどのタイミングで行うのか、［００２０］以降の全体的な動作の説明において明らかにされていない。
　そして、特許文献１～３に記載の発明はいずれも分離媒体としてゲルを用いるものであり、分離媒体として液体ポリマを用いた場合の構成について一切記載されておらず、示唆等となる記載もない。そのため、特許文献１～３に記載されている発明が提案されているものの、分離媒体として液体ポリマを用いる場合における、分析のランニングコストの低減を図るという問題は未だ解決されていない状況にある。
　本発明は前記状況に鑑みてなされたものである。本発明の課題は、分離媒体として液体ポリマを用いる場合において、分析のランニングコストを低減できる分離媒体の連続使用方法を提供することにある。
　前記課題を解決した本発明に係る分離媒体の連続使用方法は、キャピラリーに分離媒体を充填する分離媒体充填工程と、前記分離媒体を充填したキャピラリーに電圧を印加してプレランを行う第１プレラン工程と、前記プレランを行ったキャピラリーに１回目の試料を注入する第１試料注入工程と、前記１回目の試料を注入したキャピラリーに電圧を印加して１回目の電気泳動を行う第１電気泳動工程と、前記第１電気泳動工程後のキャピラリーに電圧を印加してプレランを行う第２プレラン工程と、前記第２プレラン工程を行ったキャピラリーに次回分の試料を注入する第２試料注入工程と、前記次回分の試料を注入したキャピラリーに電圧を印加して次回分の電気泳動を行う第２電気泳動工程と、を有し、前記第２プレラン工程、前記第２試料注入工程および前記第２電気泳動工程を予め設定された設定回数繰り返して行う。
　本発明によれば、分離媒体として液体ポリマを用いる場合において、分析のランニングコストを低減できる分離媒体の連続使用方法を提供できる。
　前述した以外の課題、構成および効果は以下の実施形態の説明により明らかにされる。
本発明の一実施形態に係る分離媒体の連続使用方法を適用できる電気泳動装置の構成を説明する構成概要図である。 本発明の一実施形態に係る分離媒体の連続使用方法を適用できる電気泳動装置の構成を説明する上面概要図である。 図２のＩＩＩａ－ＩＩＩａ断面図である。 図３ＡのＩＩＩｂ部拡大図である。 本発明の一実施形態に係る分離媒体の連続使用方法を適用できる電気泳動装置の制御構成を説明する概要図である。 本発明の第１実施形態に係る分離媒体の連続使用方法の内容を説明するフローチャートである。 分離媒体充填工程による分離媒体の充填頻度を設定するためのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）の一例を示す模式図である。 本発明の第１実施形態に係る分離媒体の連続使用方法に関して、ユーザーが入出力装置で分離媒体の充填頻度を入力した後のマイコンにおける処理および電気泳動等について説明するフローチャートである。 分析毎に分離媒体を充填する従来法の内容を説明するフローチャートである。 本発明の第２実施形態に係る分離媒体の連続使用方法の内容を説明するフローチャートである。 本発明の第２実施形態に係る分離媒体の連続使用方法に関して、ユーザーが入出力装置で分離媒体の充填頻度を入力した後のマイコンにおける処理および電気泳動等について説明するフローチャートである。 実施例１の１回目のラン（１ｓｔ）、３回目のラン（３ｒｄ）、８回目のラン（８ｔｈ）における４００ｂｐ付近のＤＮＡ塩基配列および波形データを示す説明図である。 実施例１の１回目のラン（１ｓｔ）、３回目のラン（３ｒｄ）、８回目のラン（８ｔｈ）における６００ｂｐ付近のＤＮＡ塩基配列および波形データを示す説明図である。 実施例１および実施例２の試料注入回数（ＩｎｊｅｃｔｉｏｎＩＤ）、すなわち、ランの回数が１～６回目までの各回の隣接リード長（ＣＲＬ）の統計値を示すグラフである。 実施例１および実施例２の試料注入回数が１～６回まで（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ６まで）のトータルのＣＲＬの統計値を比較したグラフである。 実施例４の試料注入回数（ＩｎｊｅｃｔｉｏｎＩＤ）が１～１６、すなわち、ランの回数が１～１６回目までのＤＮＡシーケンス解析におけるＣＲＬの推移を連続的に示したグラフである。 実施例４の試料注入回数（ＩｎｊｅｃｔｉｏｎＩＤ）が１～１２、すなわち、ランの回数が１～１２回目までのフラグメント解析におけるＥＱの推移を連続的に示したグラフである。 ラン毎にプレランを行う実施例１、３と、液体ポリマ充填後、１回目のランを行うときのみプレランを行い、２回目以降のランではプレランを行わない実施例２、４とにおける、２回目のランの解析時間の差を対比して説明する説明図である。 実施例４における４つのキャピラリー（Ｃａｐ１～４）の１～１０回目のランのランタイムなどを示す表である。
　以下、適宜図面を参照して本発明の一実施形態に係る分離媒体の連続使用方法（以下、単に「本使用方法」と呼称する場合がある）について詳細に説明する。なお、実施形態の説明において、実質的に同一または類似の構成には同一の符号を付し、説明が重複する場合にはその説明を省略する場合がある。
（電気泳動装置）
　本使用方法について説明する前に、本使用方法を適用できる電気泳動装置について説明する。
　図１は、本使用方法を適用できる電気泳動装置１の構成を説明する構成概要図である。図２は、本使用方法を適用できる電気泳動装置１の構成を説明する上面概要図である。図３Ａは、図２のＩＩＩａ－ＩＩＩａ断面図である。図３Ｂは、図３ＡのＩＩＩｂ部拡大図である。図４は、本使用方法を適用できる電気泳動装置１の制御構成を説明する概要図である。
　図１に示すように、本使用方法を適用できる電気泳動装置１（以下、単に「本装置１」と呼称する場合がある）は、装置下部にあるオートサンプラーユニット１５０と、装置上部にある照射検出／恒温槽ユニット１６０の、二つのユニットに大きく分けることができる。
　オートサンプラーユニット１５０には、サンプラーベース８０の上にＹ軸駆動体８５が搭載され、Ｙ軸に駆動を行うことができる。Ｙ軸駆動体８５にはＺ軸駆動体９０が搭載され、Ｚ軸に駆動を行うことができる。Ｚ軸駆動体９０の上には試料トレイ１００が搭載される。そして、図１および図２に示すように、試料トレイ１００の上に、分離媒体容器２０、陽極側緩衝液容器３０、陰極側緩衝液容器４０、試料容器５０をユーザーがセットする。試料容器５０は、試料トレイ１００上に搭載されたＸ軸駆動体９５の上にセットされ、試料トレイ１００上で試料容器５０のみがＸ軸に駆動することができる。Ｚ軸駆動体９０には送液機構６０も搭載される。この送液機構６０は分離媒体容器２０の下方に配置される。
　図１に示すように、照射検出／恒温槽ユニット１６０には、恒温槽ユニット１１０、恒温槽ドア１２０があり、中を一定の温度に保つことができる。恒温槽ユニット１１０の後方には照射検出ユニット１３０が搭載され、電気泳動時の検出を行うことができる。恒温槽ユニット１１０の中に、キャピラリー１２５（図３Ｂ参照）を複数まとめたキャピラリーアレイ１０をユーザーがセットし、恒温槽ユニット１１０にてキャピラリーアレイ１０を恒温に保ちながら電気泳動を行い、照射検出ユニット１３０にて検出を行う。また、恒温槽ユニット１１０には、電気泳動のための高電圧印加時にＧＮＤに落とすための電極１１５も搭載されている。
　図３Ａに示すように、キャピラリーアレイ１０には、ロードヘッダ１２６、キャピラリーヘッド１２７、検出部１２８などが備えられている。
　ロードヘッダ１２６は、キャピラリーアレイ１０の一方の端部に装着されている。ロードヘッダ１２６は、キャピラリーアレイ１０の陰極側端部となる。
　キャピラリーヘッド１２７は、キャピラリーアレイ１０のもう一方の端部に装着されている。キャピラリーヘッド１２７は、耐圧機密によってキャピラリー１２５が束としてまとめられている束なり耐圧機密で着脱可能な部材である。キャピラリーヘッド１２７は、キャピラリーアレイ１０の陽極側端部となる。
　検出部１２８の内部では、キャピラリー１２５が平面状に一定の間隔で配列されている。照射検出ユニット１３０は、検出部１２８に配列されているキャピラリー１２５に光照射を行う。そして、検出部１２８は、光照射によって、それぞれのキャピラリー１２５を電気泳動している試料から発生される蛍光等を検出する。
　前記したように、キャピラリーアレイ１０は恒温槽ユニット１１０にセットされる。分離媒体容器２０、陽極側緩衝液容器３０、陰極側緩衝液容器４０、試料容器５０は、オートサンプラーユニット１５０にてＹＺ軸に駆動することができ、試料容器５０のみ、さらにＸ軸に駆動することができる。セットされたキャピラリーアレイ１０に、分離媒体容器２０、陽極側緩衝液容器３０、陰極側緩衝液容器４０、試料容器５０が、オートサンプラーユニット１５０の動きで任意の位置に自動で接続することができる。
　図２に示すように、試料トレイ１００上にセットされた陽極側緩衝液容器３０には、陽極側洗浄槽３１、陽極側電気泳動用緩衝液槽３２、試料導入用緩衝液槽３３がある。また、陰極側緩衝液容器４０には、廃液槽４１、陰極側洗浄槽４２、陰極側電気泳動用緩衝液槽４３がある。
　分離媒体容器２０、陽極側緩衝液容器３０、陰極側緩衝液容器４０、試料容器５０は図２に示すような位置関係に配置される。つまり、陽極側緩衝液容器３０は試料トレイ１００上の装置手前側（恒温槽ドア１２０が開閉する側）かつ左側に配置されている。分離媒体容器２０は陽極側緩衝液容器３０の奥に配置されている。試料容器５０は試料トレイ１００上の装置手前側かつ右側に配置されている。陰極側緩衝液容器４０は試料容器５０の奥に配置されている。これにより、キャピラリーアレイ１０との接続の際の陽極側－陰極側の位置関係は、「分離媒体容器２０－廃液槽４１」、「陽極側洗浄槽３１－陰極側洗浄槽４２」、「陽極側電気泳動用緩衝液槽３２－陰極側電気泳動用緩衝液槽４３」、「試料導入用緩衝液槽３３－試料容器５０」となる。
　図３Ａに示すように、分離媒体容器２０は試料トレイ１００に埋め込まれたガイド１０１の中に挿入してセットされる。分離媒体容器２０には分離媒体が収容されている。分離媒体としては、例えば、液体ポリマを用いることが好ましい。このようにすると、本装置１における送液機構６０により好適かつ自動的にキャピラリー１２５（図３Ｂ参照）に分離媒体を充填したり、キャピラリー１２５から分離媒体を排出したりできる。送液機構６０は、送液機構６０に内蔵されたプランジャ６１が、分離媒体容器２０の下方になるように配置される。プランジャ６１が分離媒体容器２０に設けられているシリンダ（不図示）を押し上げることで分離媒体容器２０内の分離媒体（不図示）がキャピラリーヘッド１２７を介してキャピラリー１２５内に導入される。
　電気泳動の際、キャピラリーアレイ１０の図３Ａにおける左側が陽極側となり、右側が陰極側となる。オートサンプラーユニット１５０が「陽極側電気泳動用緩衝液槽３２－陰極側電気泳動用緩衝液槽４３」の位置に移動し、陰極側のキャピラリーアレイ１０に高電圧がかかり、陰極側緩衝液容器４０、陽極側緩衝液容器３０を介し、電極１１５にてＧＮＤに流すことで電気泳動を行う。
　図３Ｂに示すように、キャピラリーアレイ１０を構成する個々のキャピラリー１２５は、それぞれ金属製の中空電極１２４を通して固定されている。なお、中空電極１２４はキャピラリー１２５の一部（陰極側端部からロードヘッダ１２６まで）に設けられている。
　図３Ｂに示すように、キャピラリー１２５の先端１２５ａが中空電極１２４から０．５ｍｍ程度突出している状態となっている。なお、中空電極１２４から突出するキャピラリー１２５の長さは０．５ｍｍに限らない。さらに、それぞれのキャピラリー１２５に備えられている中空電極１２４のすべては一体となっている状態でロードヘッダ１２６（図３Ａ参照）に装着される。そして、すべての中空電極１２４はロードヘッダ１２６を介して高圧電源１２２に接続されている。高圧電源１２２は負電圧を中空電極１２４に印加するため、電気泳動時や試料注入時など、電圧が中空電極１２４に印加される際に中空電極１２４は陰極電極として動作する。
　図４に示すように、電圧制御機構は、マイクロコントローラ（マイコン）１４１、コントローラ１４２、高圧電源１２２、第一電流計１２１、および第二電流計１２３を備える。
　マイコン１４１は、キャピラリーアレイ１０に充填されている分離媒体を用いて、陽極側電気泳動用緩衝液槽３２および陰極側電気泳動用緩衝液槽４３の通電状態を確認する。そして、マイコン１４１は、確認した通電状態の結果を入出力装置（不図示）に出力する。入出力装置は、例えば、タッチパネルなどで構成されている。
　コントローラ１４２は高圧電源１２２を制御することによる通電路への電圧の印加、試料トレイ１００の移動、Ｘ軸駆動体９５による試料容器５０の移動などを制御する。
　高圧電源１２２は、コントローラ１４２の制御に基づいて、通電路に電圧を印加する。通電路は、中空電極１２４、陰極側電気泳動用緩衝液槽４３に満たされた電気泳動用緩衝液（あるいは試料容器５０内の試料である場合もある）、陽極側電気泳動用緩衝液槽３２に満たされた電気泳動用緩衝液（あるいは試料導入用緩衝液槽３３に満たされた緩衝液である場合もある）、電極１１５である。より具体的には、高圧電源１２２は、ＧＮＤ１２９ａ、１２９ｂより低い電圧（負電圧）を発生するため、高圧電源１２２によって負電圧が印加された際の電流の流れは図４の破線矢印で示す流れとなる。つまり、電流は、ＧＮＤ１２９ａ→第二電流計１２３→電極１１５→キャピラリーアレイ１０→中空電極１２４→第一電流計１２１→高圧電源１２２の順に流れる。よって、通電路は、ＧＮＤ１２９ａ→第二電流計１２３→電極１１５→キャピラリーアレイ１０→中空電極１２４→第一電流計１２１→高圧電源１２２となる。
　高圧電源１２２は、第一電流計１２１を介して中空電極１２４と、第二電流計１２３を介して電極１１５と導通している。この両端に、数十キロボルトの電圧を印加すると、中空電極１２４から電極１１５の方向に電界が生じる。この電界により、負に帯電した核酸等の試料は、キャピラリー１２５の陰極側の先端１２５ａ（図３Ｂ参照）から検出部１２８（図３Ａ参照）へ向かって移動する。これにより、図４の矢印Ａ１の方向に負の電荷を有する試料（例えば、ＤＮＡ）が泳動される。
　この際、第一電流計１２１は、高圧電源１２２から中空電極１２４に流れる電流を検出し、その電流値をマイコン１４１に送信する。また、第二電流計１２３は、電極１１５からＧＮＤ１２９ａに流れる電流を検出し、その電流値をマイコン１４１に送信する。電流値およびその変動のチェックには、通常、第二電流計１２３を使用する。その理由は、第二電流計１２３が電気泳動路を流れる電流値をより直接的に反映しているためである。第一電流計１２１と第二電流計１２３の間に漏電などがあったときに、第一電流計１２１が示す値は漏電の電流値も含めているのに対して、第二電流計１２３が示す数値は漏電の分は含まれない。つまり、電気泳動路を流れる正味の電流量が検出される。第一電流計１２１と第二電流計１２３の間は緩衝液や分離媒体（例えば、液体ポリマ）など金属に比べて比較的抵抗の大きい媒体が介在する部分で、さらにブロックやキャピラリー１２５などの接続部が多く存在する。従って、第一電流計１２１を経由した回路は漏電が発生し易い部分であるといえる。
（分離媒体の連続使用方法）
　次に、本使用方法について説明する。図５は、本発明の第１実施形態に係る分離媒体の連続使用方法の内容を説明するフローチャートである。
　本使用方法は電気泳動装置１に適用される。
（第１実施形態）
　図５に示すように、第１実施形態に係る本使用方法は、分離媒体充填工程Ｓ１と、第１プレラン工程Ｓ２と、第１試料注入工程Ｓ３と、第１電気泳動工程Ｓ４と、第２プレラン工程Ｓ５と、第２試料注入工程Ｓ６と、第２電気泳動工程Ｓ７と、を有する。
　そして、本使用方法は、前記第２プレラン工程Ｓ５、前記第２試料注入工程Ｓ６および前記第２電気泳動工程Ｓ７を予め設定された設定回数（ｎ回）繰り返して行う。
　分離媒体充填工程Ｓ１は、キャピラリー１２５に分離媒体を充填する工程である。キャピラリー１２５への分離媒体の充填は、前記した送液機構６０により行うことができる。
　第１プレラン工程Ｓ２は、前記分離媒体を充填したキャピラリー１２５に電圧を印加してプレランを行う工程である。プレランとは、試料の電気泳動に先立って分離媒体に電圧を印加することである。プレランを行うことで、分離媒体中の不純物を除去でき、分析に至適な分離媒体環境を整えることができる。プレランは、試料を注入せずに行う。第１プレラン工程Ｓ２は、試料トレイ１００をＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸に適宜駆動させて、キャピラリーアレイ１０との接続における陽極側－陰極側の位置関係が「陽極側電気泳動用緩衝液槽３２－陰極側電気泳動用緩衝液槽４３」となるようにし、電圧を印加することで行うことができる。第１プレラン工程Ｓ２は、一般的な条件、例えば、６０℃×３分×１５ｋＶで行うことができる。
　第１試料注入工程Ｓ３は、前記プレランを行ったキャピラリー１２５に１回目の試料を注入する工程である。第１試料注入工程Ｓ３は、試料トレイ１００をＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸に適宜駆動させて、キャピラリーアレイ１０との接続における陽極側－陰極側の位置関係が「試料導入用緩衝液槽３３－試料容器５０」となるようにし、電圧を印加することで行うことができる。第１試料注入工程Ｓ３は、例えば、６０℃×４秒×１．２ｋＶで行うことができる。
　第１電気泳動工程Ｓ４は、前記１回目の試料を注入したキャピラリー１２５に電圧を印加して１回目の電気泳動を行う工程である。第１電気泳動工程Ｓ４は、試料トレイ１００をＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸に適宜駆動させて、キャピラリーアレイ１０との接続における陽極側－陰極側の位置関係が「陽極側電気泳動用緩衝液槽３２－陰極側電気泳動用緩衝液槽４３」となるようにし、電圧を印加することで行うことができる。第１電気泳動工程Ｓ４は、例えば、６０℃×３０分×７．５ｋＶで行うことができる。
　第２プレラン工程Ｓ５は、前記第１電気泳動工程Ｓ４後のキャピラリー１２５に電圧を印加してプレランを行う工程である。つまり、本使用方法では、前回の電気泳動（ラン）で分析を行った後に通常行われるキャピラリー１２５内の分離媒体の廃棄および再注入（すなわち、分離媒体の交換）を行わずに、前回のランで使用した分離媒体のままで次回の試料分析のプレラン（第２プレラン工程Ｓ５）を行う。なお、ランとは、高圧電源１２２によって、キャピラリー１２５の両端に電位差が生じることで、分離媒体に加えた試料がキャピラリー１２５に泳動されることである。ランの実行中、照射検出ユニット１３０による試料の検出が行われる。
　第２試料注入工程Ｓ６は、前記第２プレラン工程Ｓ５を行ったキャピラリー１２５に次回分の試料を注入する工程である。第２試料注入工程Ｓ６は、第１試料注入工程Ｓ３と同様にして行うことができる。
　第２電気泳動工程Ｓ７は、前記次回分の試料を注入したキャピラリー１２５に電圧を印加して次回分の電気泳動を行う工程である。第２電気泳動工程Ｓ７は、第１電気泳動工程Ｓ４と同様にして行うことができる。
　そして、前記したように、本使用方法は、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７を予め設定された設定回数（ｎ回）繰り返して行う。本使用方法は、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の一連の工程を予め設定された設定回数繰り返して行ったら、１回の分離媒体充填工程Ｓ１で充填した分離媒体での分析を終了する。その後、分離媒体充填工程Ｓ１に戻ってキャピラリー１２５内の分離媒体を交換し、新しい分離媒体で第１プレラン工程Ｓ２以降の各工程を前記したとおりに行う。本使用方法では、これを所望の回数行う。
　ここで、本明細書における分離媒体の充填頻度（ｆ回）とは、１回充填した分離媒体に対して行う複数回のランの合計数が所定の数（ｆ回）に達するごとに、新しい分離媒体を充填すること（分離媒体の再充填度数）をいう。すなわち、分離媒体の充填頻度（ｆ回）は、１回の分離媒体の充填に対して１回の第１電気泳動工程Ｓ４と、ｎ回繰り返して行われる第２電気泳動工程Ｓ７との合計ラン数を意味する。つまり、ｆ回＝１＋ｎ回である。換言すれば、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返し回数（ｎ回）は、「分離媒体充填工程Ｓ１による分離媒体の充填頻度－１回」（ｆ－１回）で算出し、設定できる。例えば、分離媒体の充填頻度（ｆ回）を４回で設定すると、その設定内容には、１回の第１電気泳動工程Ｓ４のランと３回の第２電気泳動工程Ｓ７のランとが１セットで含まれる。このように、本態様とした場合、分離媒体の充填頻度（ｆ回）を設定すると、それにより、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返しの設定回数（ｎ回）が設定される。
　一方、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返し回数（ｎ回）は、１回目のランで用いた分離媒体を用いて行う２回目以降のランの回数をいう。
　前述したように、本使用方法では、１回充填した分離媒体を複数回のランで使用する。従って、本使用方法は、キャピラリーシーケンスの分析に必要となる試薬の中で最も高価な分離媒体、例えば、液体ポリマの充填頻度を低減でき、それにより、分析のランニングコストを低減できる。
　ここで、本実施形態においては、ユーザーにより第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返しの設定回数（ｎ回）を任意に設定することもできる。これらの工程の繰り返しの設定回数（すなわち、第２電気泳動工程Ｓ７によるランの繰り返し回数）は、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回または２５回などとすることができるが、２６回以上であってもよい。第１電気泳動工程Ｓ４のランが１回あるので、設定した繰り返しの設定回数が例えば５回である場合、１回充填した分離媒体で、合計６回のランを行うことになる。このように、本態様では、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返しの設定回数（ｎ回）を予め設定しておくことにより、１回の分離媒体の充填ごとに、１回の第１電気泳動工程Ｓ４のランと、任意に設定したｎ回の第２電気泳動工程Ｓ７のランとを１セットで行うことができる。
　なお、前記した工程の繰り返しの設定回数（ｎ回）は、分離媒体の劣化状況やＤＮＡ鎖の長さなどの試料の状態に応じて任意に設定可能である。設定回数は、例えば、ＤＮＡ鎖が３００ｂｐ程度の長さであれば、１回の分離媒体の充填で４～５回（合計ラン数５～６回、すなわち分離媒体の充填頻度５～６回）などとすることができる。また、設定回数は、例えば、ＤＮＡ鎖が６００ｂｐ程度の長さであれば、１回の分離媒体の充填で３回（合計ラン数４回、すなわち分離媒体の充填頻度４回）などとすることができる。
　分離媒体充填工程Ｓ１による分離媒体の充填頻度（ｆ回）の入力は、例えば、マイコン１４１に接続された入出力装置（不図示）により行うことができる。図６は、分離媒体充填工程Ｓ１による分離媒体の充填頻度を設定するためのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）の一例を示す模式図である。図６に示すように、入出力装置は、分離媒体の充填頻度（ｆ回）を入力するためのＧＵＩを表示できる。
　ユーザーは、図６に示すＧＵＩのうち、下方の欄の「Ｐｏｌｙｍｅｒ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ」に、例えば、「ｅｖｅｒｙ　４　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」や「４」などと入力したり、ラジオボタンで「４」を選択したりすることにより、分離媒体の充填頻度を４回と設定することができる。
　図６において図示はしないが、前記した工程の繰り返しの設定回数（ｎ回）の入力も分離媒体の充填頻度（ｆ回）と同様にして行うことができる。例えば、前記した入出力装置に前記した工程の繰り返しの設定回数（ｎ回）を入力するためのＧＵＩを表示させるとよい。前記した工程の繰り返しの設定回数（ｎ回）を入力するため、ＧＵＩ中に、「Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　２ｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」という欄を設け、これに、例えば、「３　ｔｉｍｅｓ」や「３」などと入力したり、ラジオボタンで「３」を選択したりすることにより、前記した工程の繰り返しの設定回数を３回と設定することができる。
　本使用方法では、分離媒体の充填頻度が予め設定された回数（ｆ回）を達成したら、換言すると、合計ラン回数がｆ回を達成したら（さらに換言すると、ｆ－１回で算出されて設定される前記した工程の繰り返しの設定回数（ｎ回）を達成したら）（図５のステップＳ８でＹｅｓ）、１回の分離媒体の充填で行う全ての分析（ラン）を終了する。その後、分離媒体充填工程Ｓ１に戻ってキャピラリー１２５内の分離媒体を交換し、新しい分離媒体で第１プレラン工程Ｓ２以降の各工程を前記したとおりに行う。
　一方、分離媒体充填工程Ｓ１の頻度が予め設定された回数（ｆ回）を達成していない場合、換言すると、合計ラン回数がｆ回を達成していない場合（さらに換言すると、ｆ－１回で算出されて設定される前記した工程の繰り返しの設定回数（ｎ回）を達成していない場合）（図５のステップＳ８でＮｏ）、第２プレラン工程Ｓ５に戻って、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７を行う。
　図７は、本発明の第１実施形態に係る分離媒体の連続使用方法に関して、ユーザーが入出力装置で分離媒体の充填頻度を入力した後のマイコン１４１における処理および電気泳動等について説明するフローチャートである。
　図７に示すように、ユーザーが、分離媒体の充填頻度を入力する（ステップＳ１１）。図７の例では、例えば、分離媒体の充填頻度を「４」と入力する（ｆ＝４）。これにより、マイコン１４１は、合計ラン数が４回を達成したら、キャピラリー１２５から古い分離媒体を廃棄して、新たな分離媒体をキャピラリー１２５に充填すると設定される。また、マイコン１４１では、「分離媒体の充填頻度－１」を算出し、前記した工程の繰り返しの設定回数が設定される（ｎ＝３）。
　そして、ユーザーがラン開始のキーを入力すると、分析が開始される（ステップＳ１２）。マイコン１４１は、電気泳動が初回か否かを判断する（ステップＳ１３）。電気泳動が初回である場合（ステップＳ１３でＹｅｓ）、マイコン１４１は分離媒体の充填を行う旨の指示を出し（ステップＳ１４）、本装置１で分離媒体充填工程Ｓ１を行う。
　次いで、マイコン１４１はプレランを行う旨の指示を出し（ステップＳ１５）、本装置１で第１プレラン工程Ｓ２を行う。
　次いで、マイコン１４１は試料注入を行う旨の指示を出し（ステップＳ１６）、本装置１で第１試料注入工程Ｓ３を行う。
　次いで、マイコン１４１は電気泳動を行う旨の指示を出し（ステップＳ１７）、本装置１で第１電気泳動工程Ｓ４を行う。
　電気泳動終了後、マイコン１４１は、合計ラン数が、入力された分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成したか否かを判断する（ステップＳ１８）。合計ラン数が分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成していない場合（ステップＳ１８でＮｏ）、マイコン１４１は、ラン開始のキー入力直後に戻って、次に行う電気泳動が初回か否かを判断する（ステップＳ１３）。
　次に行う電気泳動は初回ではないので（ステップＳ１３でＮｏ）、マイコン１４１は、プレランを行う旨の指示を出し（ステップＳ１５）、本装置１で第２プレラン工程Ｓ５を行う。
　次いで、マイコン１４１は試料注入を行う旨の指示を出し（ステップＳ１６）、本装置１で第２試料注入工程Ｓ６を行う。
　次いで、マイコン１４１は電気泳動を行う旨の指示を出し（ステップＳ１７）、本装置１で第２電気泳動工程Ｓ７を行う。
　電気泳動終了後、マイコン１４１は、合計ラン数が、入力された分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成したか否かを判断する（ステップＳ１８）。合計ラン数が分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成していない場合（ステップＳ１８でＮｏ）、マイコン１４１は、再びラン開始のキー入力直後に戻って、次に行う電気泳動が初回か否かを判断し（ステップＳ１３でＹｅｓまたはＮｏ）、当該判断に従って、本装置１に対して前述した指示を出す（ステップＳ１４またはステップＳ１５に進む）。
　合計ラン数が分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成している場合（ステップＳ１８でＹｅｓ）、マイコン１４１は、本装置１にラン終了の旨の指示を出し（ステップＳ１９）、本装置１はランを終了する。
　マイコン１４１は、ユーザーが設定した回数、図７に示す上記の一連のフローを行って試料の分析を行う。
　このように、本使用方法は、設定された分離媒体の充填頻度において、電気泳動が初回ではない場合は分離媒体の充填を行わない。従って、本使用方法は、キャピラリーシーケンスの分析に必要となる試薬の中で最も高価な分離媒体、例えば、液体ポリマの充填頻度を低減でき、それにより、分析のランニングコストを低減できる。
　ここで、本使用方法と、分析毎に分離媒体を充填する従来法との比較を行う。
　図８は、分析毎に分離媒体を充填する従来法の内容を説明するフローチャートである。
　図８に示すように、従来法は、分離媒体充填工程Ｓ１０１と、プレラン工程Ｓ１０２と、試料注入工程Ｓ１０３と、電気泳動工程Ｓ１０４と、を有する。
　図８に示す従来法におけるこれらの工程はそれぞれ、図５に示す本使用方法における分離媒体充填工程Ｓ１、第１プレラン工程Ｓ２、第１試料注入工程Ｓ３および第１電気泳動工程Ｓ４に相当する。
　図８に示す従来法は、分析毎に分離媒体を充填するので、毎回これらの工程を行う。つまり、図８に示す従来法は、図５に示す本使用方法における第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７を有しておらず、また、それらの工程を繰り返し行うものでもない。そのため、従来法は、キャピラリーシーケンスの分析に必要となる試薬の中で最も高価な分離媒体の充填頻度が低減されず、分析のランニングコストは高いままである。
　本発明者は、本発明の課題を解決するため研究したところ、第１実施形態に係る本使用方法で、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７を予め設定された設定回数繰り返して行うこととした。このようにして得られる分析性能は、後述するように、波形データはやや劣化するものの、十分に仕様を満たすことを見出した。また、第１実施形態に係る本使用方法は、図８に示す従来法と比べ、ターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）の向上が得られることを見出した。
（第２実施形態）
　次に、第２実施形態に係る本使用方法について説明する。図９は、本発明の第２実施形態に係る分離媒体の連続使用方法の内容を説明するフローチャートである。
　図９に示すように、第２実施形態に係る本使用方法は、分離媒体充填工程Ｓ１と、第１プレラン工程Ｓ２と、第１試料注入工程Ｓ３と、第１電気泳動工程Ｓ４と、第２試料注入工程Ｓ６と、第２電気泳動工程Ｓ７と、を有する。
　そして、本使用方法は、前記第２試料注入工程Ｓ６および前記第２電気泳動工程Ｓ７を予め設定された設定回数（ｎ回）繰り返して行う。
　第２実施形態に係る本使用方法は、第２プレラン工程Ｓ５を有していない点で、第２プレラン工程Ｓ５を有している第１実施形態に係る本使用方法と相違している。
　また、第２実施形態に係る本使用方法の第２試料注入工程Ｓ６は、第１電気泳動工程Ｓ４後のキャピラリーに次回分の試料を注入する工程である。これに対し、第１実施形態に係る本使用方法の第２試料注入工程Ｓ６は、第２プレラン工程Ｓ５を行ったキャピラリーに次回分の試料を注入する工程である。従って、第２実施形態に係る本使用方法の第２試料注入工程Ｓ６と、第１実施形態に係る本使用方法の第２試料注入工程Ｓ６とは、工程の内容が相違している。
　また、第２実施形態に係る本使用方法は、前記第２試料注入工程Ｓ６および前記第２電気泳動工程Ｓ７を予め設定された設定回数（ｎ回）繰り返して行う。これに対し、第１実施形態に係る本使用方法は、前記第２プレラン工程Ｓ５、前記第２試料注入工程Ｓ６および前記第２電気泳動工程Ｓ７を予め設定された設定回数（ｎ回）繰り返して行う。従って、第２実施形態に係る本使用方法と第１実施形態に係る本使用方法とでは、繰り返して行う工程の内容が相違している。
　第２実施形態に係る本使用方法と第１実施形態に係る本使用方法とは、第２実施形態に係る本使用方法が第２プレラン工程Ｓ５を有していないことによりこれらの相違点を有しているが、これら以外は同様の構成である。
　以下、第２実施形態に係る本使用方法について、第１実施形態に係る本使用方法との相違点を中心に説明する。
　前記したように、第２実施形態に係る本使用方法の第２試料注入工程Ｓ６は、第１電気泳動工程Ｓ４後のキャピラリー１２５に次回分の試料を（プレランを行わずにそのまま）注入する工程である。本発明者は、本発明の課題を解決するため研究したところ、驚くべきことに、第１電気泳動工程Ｓ４後のキャピラリー１２５に次回分の試料を、プレランを行わずにそのまま注入して次回の電気泳動を行うと、すなわち、第１電気泳動工程Ｓ４の後に第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７を行うと、第２試料注入工程前にプレラン（第１実施形態における第２プレラン工程Ｓ５）を行う場合と比較して、分析回数の増大、ターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）の向上、分析性能の向上などが得られることを見出した。これらの効果は、プレランを省略し、分離媒体の劣化が抑制されることになったために齎されたものである。分離媒体の劣化としては、例えば、ウレアの分解などが挙げられる。すなわち、第２実施形態に係る本使用方法は、第２プレラン工程Ｓ５を省くことでプレランによって生じるウレアの分解を抑制し、ウレアの分解産物による液体ポリマなどの分離媒体のガラス表面への吸着を阻む働きを低減する。その結果、電気浸透流が増大し難くなり（抑制され）、それにより、例えば、ＤＮＡなどの試料の分析回数および分析性能が向上する。また、プレランを行わないのでその分、分析を早く終わらせることができる。例えば、一般的なキャピラリーＤＮＡシーケンサーでは、１回の分析に約３０分の時間が必要であり、プレランはそのうちの約３分を必要とする。次回分の試料の分析にあたって、プレランを省略するので、分析時間を約１０％短縮できる。これは、分析毎にプレランを行う従来法や第１実施形態に係る本使用方法と比較して有利な効果であるといえる。
　図１０は、本発明の第２実施形態に係る分離媒体の連続使用方法に関して、ユーザーが入出力装置で分離媒体の充填頻度を入力した後のマイコン１４１における処理および電気泳動等について説明するフローチャートである。
　図１０に示すように、ユーザーが、分離媒体の充填頻度を入力する（ステップＳ１１）。図１０の例では、例えば、分離媒体の充填頻度を「４」と入力する（ｆ＝４）。これにより、マイコン１４１は、合計ラン数が４回を達成したら、キャピラリー１２５から古い分離媒体を廃棄して、新たな分離媒体をキャピラリー１２５に充填すると設定される。また、マイコン１４１では、「分離媒体の充填頻度－１」を算出し、前記した工程の繰り返しの設定回数が設定される（ｎ＝３）。
　そして、ユーザーがラン開始のキーを入力すると、分析が開始される（ステップＳ１２）。マイコン１４１は、電気泳動が初回か否かを判断する（ステップＳ１３）。電気泳動が初回である場合（ステップＳ１３でＹｅｓ）、マイコン１４１は分離媒体の充填を行う旨の指示を出し（ステップＳ１４）、本装置１で分離媒体充填工程Ｓ１を行う。
　次いで、マイコン１４１はプレランを行う旨の指示を出し（ステップＳ１５）、本装置１で第１プレラン工程Ｓ２を行う。
　次いで、マイコン１４１は試料注入を行う旨の指示を出し（ステップＳ１６）、本装置１で第１試料注入工程Ｓ３を行う。
　次いで、マイコン１４１は電気泳動を行う旨の指示を出し（ステップＳ１７）、本装置１で第１電気泳動工程Ｓ４を行う。
　電気泳動終了後、マイコン１４１は、合計ラン数が、入力された分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成したか否かを判断する（ステップＳ１８）。合計ラン数が分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成していない場合（ステップＳ１８でＮｏ）、マイコン１４１は、ラン開始のキー入力直後に戻って、次に行う電気泳動が初回か否かを判断する（ステップＳ１３）。
　次に行う電気泳動は初回ではないので（ステップＳ１３でＮｏ）、マイコン１４１は、試料注入を行う旨の指示を出し（ステップＳ１６）、本装置１で第２試料注入工程Ｓ６を行う。
　次いで、マイコン１４１は電気泳動を行う旨の指示を出し（ステップＳ１７）、本装置１で第２電気泳動工程Ｓ７を行う。
　電気泳動終了後、マイコン１４１は、合計ラン数が、入力された分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成したか否かを判断する（ステップＳ１８）。合計ラン数が分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成していない場合（ステップＳ１８でＮｏ）、マイコン１４１は、再びラン開始のキー入力直後に戻って、次に行う電気泳動が初回か否かを判断し（ステップＳ１３でＹｅｓまたはＮｏ）、当該判断に従って、本装置１に対して前述した指示を出す（ステップＳ１４またはステップＳ１６に進む）。
　合計ラン数が分離媒体の充填頻度（ｆ＝４）を達成している場合（ステップＳ１８でＹｅｓ）、マイコン１４１は、本装置１にラン終了の旨の指示を出し（ステップＳ１９）、本装置１はランを終了する。
　マイコン１４１は、ユーザーが設定した回数、図１０に示す上記の一連のフローを行って試料の分析を行う。
　次に、本使用方法の実施例を説明する。
〔１〕検討１
＜実施例１＞
　実施例１は図５に示すフローおよび次の条件でキャピラリーシーケンスＤＮＡ塩基配列解析を行った。キャピラリーＤＮＡシーケンサーは、日立ハイテク社製ＤＳ３０００を用いた。分離媒体として、液体ポリマを用いた。液体ポリマは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｃｏｍｐａｃｔ　Ｐｏｌｙｍｅｒ７（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＣＥ２３７Ａ）を用いた。解析対象となるＤＮＡサンプルは、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＢｉｇＤｙｅＴＭ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いた。
＜実施例１の条件＞
　分離媒体充填工程Ｓ１は、キャピラリーＤＮＡシーケンサーにおいて定められた方法で行った。
　第１プレラン工程Ｓ２は、６０℃×３分×１５ｋＶで行った。
　第１試料注入工程Ｓ３は、６０℃×４秒×１．２ｋＶで行った。
　第１電気泳動工程Ｓ４は、６０℃×３０分×７．５ｋＶで行った。
　第２プレラン工程Ｓ５は、６０℃×３分×１５ｋＶで行った。
　第２試料注入工程Ｓ６は、６０℃×４秒×１．２ｋＶで行った。   
　第２電気泳動工程Ｓ７は、６０℃×３０分×７．５ｋＶで行った。
　実施例１は、分離媒体の充填頻度を８（すなわち、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返し設定回数を７）で設定し、これを１セットで２回連続して行い、合計１６ランの分析を行った。
＜実施例２＞
　実施例２は、図９に示すフローおよび次の条件でキャピラリーシーケンスＤＮＡ塩基配列解析を行った。なお、キャピラリーＤＮＡシーケンサー、液体ポリマおよびＤＮＡサンプルは実施例１と同様である。
＜実施例２の条件＞
　分離媒体充填工程Ｓ１は、キャピラリーＤＮＡシーケンサーにおいて定められた方法で行った。
　第１プレラン工程Ｓ２は、６０℃×３分×１５ｋＶで行った。
　第１試料注入工程Ｓ３は、６０℃×４秒×１．２ｋＶで行った。
　第１電気泳動工程Ｓ４は、６０℃×３０分×７．５ｋＶで行った。
　第２試料注入工程Ｓ６は、６０℃×４秒×１．２ｋＶで行った。
　第２電気泳動工程Ｓ７は、６０℃×３０分×７．５ｋＶで行った。
　実施例２も、分離媒体の充填頻度を８（すなわち、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返し設定回数を７）で設定し、これを１セットで２回連続して行い、合計１６ランの分析を行った。
　実施例１の分析の結果の一部を図１１および図１２に示す。
　図１１は、実施例１の１回目のラン（１ｓｔ）、３回目のラン（３ｒｄ）、８回目のラン（８ｔｈ）における４００ｂｐ付近のＤＮＡ塩基配列および波形データを示す説明図である。１回目のランは１回の液体ポリマ充填後における初回の電気泳動である。３回目のランは１回の液体ポリマ充填後における３回目の電気泳動である。８回目のランは１回の液体ポリマ充填後における８回目の電気泳動である。
　図１２は、実施例１の１回目のラン（１ｓｔ）、３回目のラン（３ｒｄ）、８回目のラン（８ｔｈ）における６００ｂｐ付近のＤＮＡ塩基配列および波形データを示す説明図である。１回目のランは１回の液体ポリマ充填後における初回の電気泳動である。３回目のランは１回の液体ポリマ充填後における３回目の電気泳動である。８回目のランは１回の液体ポリマ充填後における８回目の電気泳動である。
　図１１および図１２に示すように、１回の液体ポリマ充填後のランの回数が増えると、波形データはやや劣化するものの、ＤＮＡ塩基配列は問題なく解析することができた。具体的には、図１２に示す８回目のランの６４５ｂｐ付近に十分な精度で解析できない部分があったが、それ以外は十分高い精度で解析できた。
　実施例２については図示を省略するが、実施例１とほぼ同様の結果となった。
　図１３は、実施例１および実施例２の試料注入回数（ＩｎｊｅｃｔｉｏｎＩＤ）、すなわち、ランの回数が１～６回目までの各回の隣接リード長（ＣＲＬ）の統計値を示すグラフである。なお、図１３は、３回独立に同じ解析を行って得た統計値を示している。
　図１３に示すように、６００ｂｐを基準値として定めた場合、実施例１および実施例２のいずれも、４回目のランまでＣＲＬが当該基準値をクリアしており、十分に仕様を満たすことが確認された。仮に、４００ｂｐを基準値として定めた場合は、実施例１および実施例２のいずれも、６回目のランまでＣＲＬが当該基準値をクリアできており、十分に仕様を満たすことが分かる。なお、基準値は、解析したいＤＮＡ塩基配列の長さに応じて任意に変更できる。例えば、解析したいＤＮＡ塩基配列がＰＣＲ増幅産物であり、その長さが３００ｂｐや４００ｂｐなどのように予め予想できる場合には、それを基準値として検討することができる。例えば、ＰＣＲ増幅産物の長さが３００ｂｐの場合、図１３に示す結果から、８～１０回目のラン程度までは十分に仕様を満たすことができると推察された。
　図１４は、実施例１および実施例２の試料注入回数が１～６回まで（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ６まで）のトータルのＣＲＬの統計値を比較したグラフである（ｐ＝０．０４７２１）。図１４に示すように、実施例１および実施例２のいずれにおいても十分に仕様を満たすことが確認された。また、実施例２は実施例１よりもＣＲＬが高い傾向にあることが確認された。これは、実施例２では、第２プレラン工程Ｓ５を行わなかったので、液体ポリマに含まれるウレアの分解が抑制されたためと結論付けられた。
〔２〕検討２
　検討２では、分離媒体の充填頻度を変更して、実施例１、２と同様の条件でキャピラリーシーケンスＤＮＡ塩基配列解析を行った。具体的には、次のようにして解析を行った。
＜実施例３＞
　実施例３は、分離媒体の充填頻度を４（すなわち、第２プレラン工程Ｓ５、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返し設定回数を３）で設定し、これを１セットで４回連続して行い、合計１６ランの分析を行った。実施例３は、これ以外は実施例１と同様にして解析を行った。
＜実施例４＞
　実施例４は、分離媒体の充填頻度を４（すなわち、第２試料注入工程Ｓ６および第２電気泳動工程Ｓ７の繰り返し設定回数を３）で設定し、これを１セットで４回連続して行い、合計１６ランの分析を行った。実施例４は、これ以外は実施例２と同様にして解析を行った。
　図１５は、実施例４の試料注入回数（ＩｎｊｅｃｔｉｏｎＩＤ）が１～１６、すなわち、ランの回数が１～１６回目までのＤＮＡシーケンス解析におけるＣＲＬの推移を連続的に示したグラフである。図中、右側の１、２、３は、キャピラリーの番号を示している。すなわち、図１５は３つのキャピラリーの１～１６回目までのランのＣＲＬの推移を折れ線グラフで示している。また、図中の「▲」は、液体ポリマを充填または再充填（交換）した後、１回目のランの結果を示している。図中の「□」は、１回目のランで用いた液体ポリマを用い、２回目、３回目および４回目のランを行った結果を示している。
　図１５に示すように、１～３のキャピラリーの個体差により分析の調子が良かったものとそうでなかったものがあり、１回の液体ポリマ充填後のランの回数が増えると、ＣＲＬがやや低下するものがあった。しかし、ＤＮＡ塩基配列は問題なく解析することができた。このことから、ＣＲＬの基準を６００ｂｐとした場合（解析したいＤＮＡ塩基配列の長さが６００ｂｐの場合）は、分離媒体の充填頻度を４とすれば十分な仕様を満たすことが確認された。なお、図１５に示す結果から、例えば、ＣＲＬの基準が５００ｂｐ以下であれば（解析したいＤＮＡ塩基配列の長さが５００ｂｐ以下であれば）、分離媒体の充填頻度を５以上に増やしても十分な仕様を満たすことができると推察された。
　また、図１６は、実施例４の試料注入回数（ＩｎｊｅｃｔｉｏｎＩＤ）が１～１２、すなわち、ランの回数が１～１２回目までのフラグメント解析における一塩基分離が可能な範囲の最大塩基長を示すＥＱの推移を連続的に示したグラフである。図中、右側の１、２、３は、キャピラリーの番号を示している。すなわち、図１６は３つのキャピラリーの１～１２回目までのランのＥＱの推移を折れ線グラフで示している。また、図中の「▲」は、液体ポリマを充填または再充填（交換）した後、１回目のランの結果を示している。図中の「□」は、１回目のランで用いた液体ポリマを用い、２回目、３回目および４回目のランを行った結果を示している。
　図１６に示すように、１～３のキャピラリーの個体差により分析の調子が良かったものとそうでなかったものがあり、１回の液体ポリマ充填後のランの回数が増えると、ＥＱがやや低下するものがあった。しかし、ＤＮＡ塩基配列は問題なく解析することができた。このことから、ＥＱの基準を４００ｂｐとした場合（解析したいＤＮＡ塩基配列の長さが４００ｂｐの場合）は、分離媒体の充填頻度を４とすれば十分な仕様を満たすことが確認された。なお、図１６に示す結果から、例えば、ＥＱの基準が２００ｂｐ以下であれば（解析したいＤＮＡ塩基配列の長さが２００ｂｐ以下であれば）、分離媒体の充填頻度を５以上に増やしても十分な仕様を満たすことができると推察された。
　図１７は、ラン毎にプレランを行う実施例１、３と、液体ポリマ充填後、１回目のランを行うときのみプレランを行い、２回目以降のランではプレランを行わない実施例２、４とにおける、２回目のランの解析時間の差を対比して説明する説明図である。なお、ラン毎にプレランを行うという点については、実施例１、３と従来法とは同様であるといえる。
　図１７に示すように、実施例１、３は（従来法も）ラン毎にプレランを行うので、２回目のランにおいて、図１７の上の説明図中、左側の二点破線で示されている解析開始初期のＢ部で示されるプレランのための電圧印加を行っている。
　これに対し、実施例２、４は、液体ポリマ充填後の２回目以降のランではプレランを行わないので、２回目のランにおいて、図１７の下の説明図に示すように、図１７の上の説明図のＢ部で示されるプレランのための電圧印加が不要となる。従って、実施例２、４は、液体ポリマ充填後の２回目以降のランについては解析時間を短縮できることが確認された。具体的には、図１７の上の説明図および下の説明図における横軸は解析時間の指標を示している。図１７の上の説明図に示される実施例１、３では、解析開始から終了までの指標は約３００となっているのに対し、図１７の下の説明図に示される実施例２、４では、解析開始から終了までの指標は約２６５となっている。これらのことから、実施例２、４は、実施例１、３（および従来法）に対して、約１０％解析時間を短縮できることが確認された。
　図１８は、実施例４における４つのキャピラリー（Ｃａｐ１～４）の１～１０回目のランのランタイムなどを示す表である。図１８に示す表は、これらのランタイム［ｍｉｎ］と、平均ランタイム（Ａｖｅｒａｇｅ　ｒｕｎ　ｔｉｍｅ）［ｍｉｎ］と、平均ランタイムの仕様（Ａｖｅｒａｇｅ　ｒｕｎ　ｔｉｍｅ　ｓｐｅｃ）［ｍｉｎ］と、平均ランタイムの仕様に対する判定（Ａｖｅｒａｇｅ　ｒｕｎ　ｔｉｍｅ　ｓｐｅｃ　ｊｕｄｇｅ）と、泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ）の均一性（ＭＴ　Ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ）と、泳動時間の均一性の仕様（Ｓｐｅｃ）と、泳動時間の均一性の仕様に対する判定（ＭＴ　Ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ　ｊｕｄｇｅ）とを示している。
　図１８の表に示すように、２回目のランはＣａｐ１～４のいずれもランタイムが長くなったため、平均ランタイムも長くなった。そのため、２回目のランは平均ランタイムの仕様３０ｍｉｎ以下を満たすことができず、平均ランタイムの仕様に対する判定が不合格（Ｆａｉｌ）となった。その他の１、３～１０回目のランは合格（Ｐａｓｓ）となった。また、図１８の表に示すように、トータルでみるとランタイムは２５分～３０分であり、若干ばらつきが生じていた。
　一方、泳動時間の均一性はいずれも泳動時間の均一性の仕様５．０％以下を満たしており、１～１０ラン目の全てが合格であった。
　以上、本発明に係る分離媒体の連続使用方法について実施形態および実施例により詳細に説明したが、本発明は前記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かり易く説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、それぞれの実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　１　　　電気泳動装置（本装置）
　１０　　キャピラリーアレイ
　２０　　分離媒体容器
　３０　　陽極側緩衝液容器
　３１　　陽極側洗浄槽
　３２　　陽極側電気泳動用緩衝液槽
　３３　　試料導入用緩衝液槽
　４０　　陰極側緩衝液容器
　４１　　廃液槽
　４２　　陰極側洗浄槽
　４３　　陰極側電気泳動用緩衝液槽
　５０　　試料容器
　６０　　送液機構
　６１　　プランジャ
　８０　　サンプラーベース
　８５　　Ｙ軸駆動体
　９０　　Ｚ軸駆動体
　９５　　Ｘ軸駆動体
　１００　試料トレイ
　１０１　ガイド
　１１０　恒温槽ユニット
　１１５　電極
　１２０　恒温槽ドア
　１２１　第一電流計
　１２２　高圧電源
　１２３　第二電流計
　１２４　中空電極
　１２５　キャピラリー
　１２５ａ　先端
　１２６　ロードヘッダ
　１２７　キャピラリーヘッド
　１２８　検出部
　１２９ａ、１２９ｂ　ＧＮＤ
　１３０　照射検出ユニット
　１４１　マイコン
　１４２　コントローラ
　１５０　オートサンプラーユニット
　１６０　照射検出／恒温槽ユニット
　Ｓ１　　分離媒体充填工程
　Ｓ２　　第１プレラン工程
　Ｓ３　　第１試料注入工程
　Ｓ４　　第１電気泳動工程
　Ｓ５　　第２プレラン工程
　Ｓ６　　第２試料注入工程
　Ｓ７　　第２電気泳動工程

Claims (4)

  1. 　キャピラリーに分離媒体を充填する分離媒体充填工程と、
    　前記分離媒体を充填したキャピラリーに電圧を印加してプレランを行う第１プレラン工程と、
    　前記プレランを行ったキャピラリーに１回目の試料を注入する第１試料注入工程と、
    　前記１回目の試料を注入したキャピラリーに電圧を印加して１回目の電気泳動を行う第１電気泳動工程と、
    　前記第１電気泳動工程後のキャピラリーに電圧を印加してプレランを行う第２プレラン工程と、
    　前記第２プレラン工程を行ったキャピラリーに次回分の試料を注入する第２試料注入工程と、
    　前記次回分の試料を注入したキャピラリーに電圧を印加して次回分の電気泳動を行う第２電気泳動工程と、
    　を有し、
    　前記第２プレラン工程、前記第２試料注入工程および前記第２電気泳動工程を予め設定された設定回数繰り返して行う、分離媒体の連続使用方法。
  2. 　キャピラリーに分離媒体を充填する分離媒体充填工程と、
    　前記分離媒体を充填したキャピラリーに電圧を印加してプレランを行う第１プレラン工程と、
    　前記プレランを行ったキャピラリーに１回目の試料を注入する第１試料注入工程と、
    　前記１回目の試料を注入したキャピラリーに電圧を印加して１回目の電気泳動を行う第１電気泳動工程と、
    　前記第１電気泳動工程後のキャピラリーに次回分の試料を注入する第２試料注入工程と、
    　前記次回分の試料を注入したキャピラリーに電圧を印加して次回分の電気泳動を行う第２電気泳動工程と、
    　を有し、
    　前記第２試料注入工程および前記第２電気泳動工程を予め設定された設定回数繰り返して行う、分離媒体の連続使用方法。
  3. 　請求項１または請求項２において、
    　前記分離媒体が、液体ポリマである、分離媒体の連続使用方法。
  4. 　請求項１または請求項２において、
    　前記分離媒体充填工程による前記分離媒体の充填頻度が、グラフィカルユーザーインターフェースにより設定される、分離媒体の連続使用方法。
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