WO2024005485A1 - 사포닌 유도체 화합물 및 이를 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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    • C07H15/256—Polyterpene radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms

Definitions

  • the present disclosure relates to a saponin derivative compound and a pharmaceutical composition containing the same for preventing or treating coronavirus infection.
  • agents that inhibit SARS-CoV-2 replication include remdersivir (RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) inhibitor), nirmatrelvir (major protease (Mpro) inhibitor), and molnupiravir (RdRp inhibitor). ) showed success.
  • RdRp RNA-dependent RNA polymerase
  • Mpro major protease
  • RdRp inhibitor molnupiravir
  • the spike protein of SARS-CoV-2 is responsible for target cell recognition and virus entry into cells.
  • the S1 domain is responsible for attaching the virus to host cells, and the S2 domain is responsible for mediating membrane fusion.
  • the receptor binding domain (RBD) of the S1 domain binds to angiotensin-converting enzyme II (ACE2) for initial cell recognition.
  • ACE2 angiotensin-converting enzyme II
  • SARS-CoV-2 can then enter cells through two distinct pathways. The first is the endosome entry mechanism. Dynamin and clathrin mediate the internalization of endosomal vesicles, which further mature into endosomes and lysosomes.
  • Acidification of the inner endosome triggers activation of the cysteine protease cathepsin L, leading to proteolysis of the S2' cleavage site and exposure of the S2 domain for subsequent membrane fusion.
  • the second, non-endosomal pathway is based on a cell surface entry mechanism.
  • the host cell protease transmembrane protease serine 2 TMPRSS2
  • chloroquine and hydroxychloroquine have been evaluated as potential drugs due to their ability to inactivate capthesin L by increasing lysosomal pH during viral invasion.
  • TMPRSS2 inhibitors such as camostat and nafamostat have been evaluated as potential drugs against COVID-19 due to their ability to block virus entry on the non-endosomal cell surface.
  • these drugs showed limitations as they could only block one of the two virus entry routes.
  • the final step of virus entry for both endosomal and nonendosomal pathways involves membrane fusion.
  • protease-mediated cathepsin L or TMPRSS2
  • S2' cleavage pre-fusion conformation
  • the exposed S2 domain undergoes extensive conformational changes, and the heptad repeat 1 (HR1) domain leads to insertion of the fusion peptide into the host cell membrane.
  • HR1 heptad repeat 1
  • One embodiment seeks to provide a novel saponin derivative compound.
  • Another embodiment is intended to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating coronavirus infection containing a saponin derivative.
  • Another embodiment seeks to provide a health functional food composition for preventing or improving coronavirus infection containing a saponin derivative.
  • Another embodiment seeks to provide a composition for inhibiting cell entry of coronaviruses containing a saponin derivative.
  • One embodiment provides a saponin derivative compound represented by Formula 1 below.
  • R 1 is a C 6-20 aryl group, a C 6-20 aryl C 1-5 alkyl group, or ego;
  • R 2 is -H or -OH
  • R 3 is a polysaccharide derivative group.
  • R 1 is a C 6-10 aryl group, a C 6-10 arylC 1-5 alkyl group, or It can be.
  • R 2 may be -OH.
  • R 3 is, or , where a is an integer of 0 to 20, and b may be an integer of 0 to 20, or a may be an integer of 0 to 5, and b may be an integer of 0 to 5.
  • the saponin derivative compound represented by Formula 1 may be represented by Formula 2 below.
  • R 1 , R 2 , and R 3 are the same as those described above and are therefore omitted.
  • the saponin derivative compound represented by Formula 1 may be any one selected from the group of compounds below.
  • Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing or treating coronavirus infection, comprising the saponin derivative compound according to the above embodiment as an active ingredient.
  • Another embodiment provides a health functional food composition for preventing or improving coronavirus infection comprising the saponin derivative compound according to the embodiment as an active ingredient.
  • Another embodiment provides a composition for inhibiting cell entry of a coronavirus comprising the saponin derivative compound according to the above embodiment.
  • Another embodiment provides a method of treating coronavirus infection, comprising administering the saponin derivative compound according to the above embodiment to an individual or subject in need thereof.
  • Another embodiment provides the saponin derivative compound for use in the treatment of coronavirus infection.
  • Another embodiment provides the use of the saponin derivative compound for producing a medicament for treating coronavirus infection.
  • Another embodiment provides a method of treating coronavirus infection, characterized in that the saponin derivative compound according to the above embodiment is administered in combination.
  • the present disclosure provides a saponin derivative compound, a pharmaceutical composition containing the same for preventing or treating coronavirus infection, and a composition for inhibiting coronavirus entry into cells.
  • the saponin derivative compound according to one embodiment is characterized by including specific substituents at C3, C16, and C28, and by including the structural features, it can effectively block the path through which coronaviruses enter the cell surface.
  • Figure 1 is a diagram showing the results of analyzing the effect of the compounds of Examples 5 and 6 and platycodin D on the inhibition of entry of pSARS-CoV-2 into ACE/TMPRSS2 + cells.
  • Figure 2 is a schematic diagram of the SARS-CoV-2 S protein-mediated cell fusion process.
  • Figure 3 is a diagram showing the experimental timeline of the cell fusion assay using time-lapse imaging.
  • Figure 4 is a diagram showing still images at different time points in a time-lapse image of S-mediated cell fusion.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of analyzing the fusion between Spike-HEK293T and ACE2/TMPRSS2 + -H1299 using flow cytometry.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of analyzing the effect of the compounds of Example 5 and Example 6 on inhibiting infection by ancestral SARS-CoV-2 in Vero cells.
  • Figure 7 is a diagram showing the results of analyzing the effect of the compound of Example 6 on inhibiting infection by SARS-CoV-2 variants in Vero cells.
  • Figure 8 is a diagram showing the results of analyzing the effect of the compound of Example 6 on inhibiting infection by SARS-CoV-2-NLuc in A549-ACE2-TMPRSS2 cells.
  • Numerical ranges as used herein include lower and upper limits and all values within that range, increments logically derived from the shape and width of the range being defined, all doubly defined values, and upper and lower limits of numerical ranges defined in different forms. Includes all possible combinations of As an example, if the content of the composition is limited to 10% to 80% or 20% to 50%, the numerical range of 10% to 50% or 50% to 80% should also be interpreted as described herein. Unless otherwise specified herein, values outside the numerical range that may occur due to experimental error or rounding of values are also included in the defined numerical range.
  • the term "derivative” means that its structure is sufficiently similar to those described in this specification, and based on such structural/chemical similarity, it is believed by those skilled in the art that it exhibits the same or similar activity and use as the claimed compound, or that is claimed as a precursor. It is a comprehensive term for compounds that can be expected to induce the same or similar activities and uses as the existing compounds.
  • the concept of analog includes derivatives, salts, isomers, esters, amides, salts of esters or amides, N-oxides of the parent compound (herein TFP).
  • prevention and “treatment” used in this specification should be interpreted in the broadest sense, and “prevention” refers to treatment in patients who may be exposed to or susceptible to a disease but have not yet experienced or displayed symptoms of the disease. This means preventing one or more of the clinical symptoms of the disease from progressing. “Treatment” means any action that arrests or reduces the development of a disease or one or more clinical symptoms thereof.
  • One embodiment provides a saponin derivative compound represented by Formula 1 below.
  • R 1 is a C 6-20 aryl group, a C 6-20 aryl C 1-5 alkyl group, or ego;
  • R 2 is -H or -OH
  • R 3 is a polysaccharide derivative group.
  • R 1 is a C 6-10 aryl group, a C 6-10 arylC 1-5 alkyl group, or It can be. Or C 6-8 aryl group, C 6 aryl group, C 6-20 aryl C 1-3 alkyl group, C 6-10 aryl C 1-3 alkyl group, C 6 aryl C 1-3 alkyl group, or C 6 aryl C 1 alkyl group. It may be (benzyl group). Specifically, R 1 is It can be.
  • R 2 may be -OH.
  • R 3 is not particularly limited as long as it is a polysaccharide (polysaccharide) derivative group, and in particular, as in Comparative Example 3, if R 3 is not a single pentose sugar but a polysaccharide in which multiple sugars are linked, it is required in one embodiment. It can meet the requirements of R 3 (C28).
  • R 3 may be, where a is an integer from 0 to 20, and b is an integer from 0 to 20.
  • a may be an integer of 0 to 15, an integer of 0 to 10, an integer of 0 to 5, an integer of 0 to 3, an integer of 0 to 2, 0, 1, or 2.
  • b may be an integer of 0 to 15, an integer of 0 to 10, an integer of 0 to 5, an integer of 0 to 3, an integer of 0 to 2, 0, 1, or 2.
  • the stereochemical structure of the saponin derivative compound represented by Formula 1 may be represented by Formula 2 below.
  • R 1 (C3) is a C 6-20 aryl group, a C 6-20 arylC 1-5 alkyl group, or , and if R 2 (C16) is -H or -OH and R 3 (C28) is a polysaccharide derivative, there is no limitation on the specific structure, but an example is as follows.
  • One example includes not only the compound represented by Formula 1 and its pharmaceutically acceptable salt, but also solvates, optical isomers, hydrates, etc. that can be prepared therefrom.
  • Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing or treating coronavirus infection, comprising the saponin derivative compound according to the above embodiment as an active ingredient.
  • the coronavirus is severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-Cov), and human.
  • Coronavirus 229E HoV-229E
  • human coronavirus NL63 HoV-NL63
  • human coronavirus OC43 HoV-OC43
  • infectious bronchitis virus bovine coronavirus
  • bovine coronavirus canine coronavirus, feline coronavirus, porcine hemagglutinating encephalomyelitis It may be one or more types of viruses, mouse hepatitis virus, turkey coronavirus, infectious gastrointestinal disease virus, and rat coronavirus.
  • the compound represented by Formula 1 can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful as the salt.
  • Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid, phosphorous acid, etc., aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes.
  • Non-toxic organic acids such as dioate, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids, organic acids such as trifluoroacetic acid, acetate, benzoic acid, citric acid, lactic acid, maleic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, tartaric acid, fumaric acid, etc. get it from These pharmaceutically non-toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, and nitrate.
  • the acid addition salt can be prepared by a conventional method, for example, by dissolving the derivative of Formula 1 in an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, etc., adding an organic acid or an inorganic acid, filtering the resulting precipitate, It can be manufactured by drying, or by distilling the solvent and excess acid under reduced pressure, drying it, and crystallizing it in an organic solvent.
  • an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, etc.
  • a pharmaceutically acceptable metal salt can be prepared using a base.
  • the alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically appropriate to prepare sodium, potassium, or calcium salts as metal salts.
  • the corresponding salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable negative salt (e.g., silver nitrate).
  • the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered in various oral and parenteral dosage forms during clinical administration.
  • it can be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations contain one or more compounds and at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose ( It can be prepared by mixing lactose), gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc, etc. may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, and emulsions.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • Parenteral administration of the pharmaceutical composition may be performed by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is mixed with water along with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which is administered in ampoule or vial unit dosage form.
  • the composition may be sterilized and/or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsification accelerators, salts and/or buffers for adjusting osmotic pressure, and other therapeutically useful substances, and may be mixed, granulated, etc. using conventional methods. It can be formulated according to the coating or coating method.
  • Dosage forms for oral administration include, for example, tablets, pills, hard/soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixirs, troches, etc.
  • These dosage forms contain a diluent (e.g. lactose) in addition to the active ingredient. , dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine), lubricants (e.g. silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and/or polyethylene glycol).
  • the tablets may contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and in some cases, boron agents such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt, etc.
  • binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and in some cases, boron agents such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt, etc.
  • the releasing or boiling mixture may contain absorbents, colorants, flavoring agents, and sweeteners.
  • Another embodiment provides a health functional food composition for preventing or improving coronavirus infection containing the saponin derivative compound according to the above embodiment as an active ingredient.
  • the compound represented by Formula 1 can be added to food as is or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention or improvement).
  • the amount of the above compound in health food can be 0.1 to 90 parts by weight of the total weight of the food.
  • the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the health functional food composition has no particular restrictions on other ingredients other than containing the above compounds, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like ordinary beverages.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, etc.; Disaccharides such as maltose, sucrose, etc.; and polysaccharides, such as common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents thaumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • Another embodiment provides a method of treating coronavirus infection, comprising administering the saponin derivative compound according to the above embodiment to an individual or subject in need thereof.
  • Another embodiment provides the saponin derivative compound for use in the treatment of coronavirus infection.
  • Another embodiment provides the use of the saponin derivative compound for producing a medicament for treating coronavirus infection.
  • Another embodiment provides a method of treating coronavirus infection, characterized in that the saponin derivative compound according to the above embodiment is administered in combination.
  • Another embodiment provides a composition for inhibiting coronavirus cell entry, including the saponin derivative compound according to the above embodiment.
  • cell entry refers to the influx of viral genetic information into a host cell.
  • the saponin derivative compound is R 1 (C3) is a C 6-20 aryl group, a C 6-20 arylC 1-5 alkyl group, or and R 2 (C16) is -H or -OH, and R 3 (C28) is a polysaccharide derivative, thereby blocking both the endosome and TMPRSS2-mediated cell surface entry pathways of the coronavirus.
  • the saponin derivative compound according to one embodiment can effectively inhibit cell fusion.
  • H1299 cells (Korean Cell Line Bank, KCLB-25803) were cultured in RPMI-1640 (Gibco, USA).
  • HEK293T cells CRL-3216
  • BHK-21 Baby hamster kidney fibroblast cells, ATCC:CCL-10
  • Vero E6 cells African green monkey kidney, ATCC:CRL-1573
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • A549-ACE2-TMPRSS2 cells Human lung carcinoma epithelial cells stably expressing Human-ACE-2 and TMPRSS2 were purchased from the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) and grown in Ham's F-12K (Kaighn's) medium for 37 days.
  • SARS-CoV-2 and SARS-CoV-2 variants were purchased from Korea Centers for Disease Control and Prevention (KCDC) and grown in VeroE6 cells. Viral titers were determined by plaque assay on Vero cells. All tests using SARS-CoV-2 were conducted at Institut Pasteur Korea in accordance with the guidelines of the KNIH and using Enhanced Biosafety Level 3 (BSL-3) containment procedures in a laboratory approved for use by the KCDC.
  • KCDC Korean Centers for Disease Control and Prevention
  • SARS-CoV-2 pseudovirus was transfected with pHR-CMV-firefly luciferase plasmid (pHR-CMV-firefly) in HEK293T cells that reached 70-80% confluency using Lipofectamine 3000 transfection reagent (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's instructions. luciferase plasmid), psPAX2 packing plasmid, and SARSCoV-2 S plasmid. At 24 and 48 h after transfection, viral supernatants were collected and centrifuged at 500 ⁇ g for 5 min to remove detached cells and stored at 4°C until use.
  • H1299 cells stably expressing ACE2 (ACE2+) or ACE2 + TMPRSS2 (ACE2/TMPRSS2+) cells were seeded in 48-well plates at 60-80% confluency, followed by On each day, cells were treated with the indicated concentrations of each compound and supernatant containing pSARS-CoV-2 virus particles. After 24 hours of incubation, pSARSCoV-2 entry efficiency was quantified by measuring firefly luciferase activity in cell lysates using a luciferase assay kit (Promega, USA) and SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices, USA). .
  • H1299, Vero, and A549-AT cells were seeded in 96-well plates (5 ⁇ 103 cells/well) and treated with a constant concentration of each compound the next day. After 24 hours of incubation, WST-8 solution (Biomax, Korea) was added to each well and incubated for 1 hour at 37°C in a CO 2 incubator. The absorbance of each well was measured at 450 nm using a SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices, USA). Relative cell viability was calculated as the ratio between the average absorbance value of drug-treated samples and the average absorbance value of cells treated with DMSO.
  • ACE2/TMPRSS2+-H1299 cells expressing mRuby2 fluorescence were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells per well in a clear bottom 24-well plate (ibidi, #82426) and cultured overnight. Cells were treated with DMSO or 5 ⁇ M example compounds for 1 hour, and then 1 ⁇ 10 4 control HEK293T (no spike) or Spike-HEK293T co-expressing GFP cells were added to the culture. Fluorescence images were acquired at 37 °C every 4 min for 90 min at ⁇ 40 magnification on a Leica DMi8 microscope (Leica Microsystems, Germany).
  • ACE2/TMPRSS2+ H1299 cells expressing mRuby2 fluorescence were plated in a 12-well plate (2 ⁇ 10 5 cells/well). After overnight culture, cells were treated with 10 ⁇ M of each example compound for 30 min, and then 1 ⁇ 10 HEK293T cells expressing GFP (no spike) or co-expressing GFP and S protein (Spike-HEK293T) were seeded. After addition, it was incubated for another hour. Harvest the cell mixture using trypsin-EDTA (Gibco, USA) and analyze 1 ⁇ 10 cells for each condition to determine the percentage of GFP/mRuby double positive cells by flow cytometry (LSRFortessaTMBD Biosciences). Fusion was measured. Data were analyzed using FlowJo software.
  • A549-hACE2-TMPRSS2 cells (1.2 x 10 cells per well) were plated in white 384-well ⁇ Clear plates (Greiner Bio-One). The next day, compounds diluted 2- or 3-fold in DMSO were added to each well, and cells were infected with SARS-CoV-2-NLuc (MOI 0.01). After incubation at 37°C for 24 h, nano-luciferase substrate (Promega) was added to each well, and luciferase signal was measured using a VICTOR3TM multi-label plate reader (PerkinElmer). Cell viability was measured using the CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the relative luciferase signal of the compound-treated group was normalized to that of the uninfected control group (set at 0%) and the DMSO-treated group (set at 100%).
  • Plots for DRC were generated using Prism6 software (GraphPad, San Diego, CA) and IC 50 (half maximal inhibitory concentration) values were calculated using a nonlinear regression model.
  • PdCl 2 (MeCN) 2 300 mg, 0.589 mmol, 0.4 equiv was added to 80 mL of a 1:1 dichloromethane/methanol solution in which b3 (3 g, 2.95 mmol, 1 equiv) prepared in step 1 was dissolved. ) was added at 23°C. The resulting mixture was stirred at 23° C. for 20 hours, and then the suspension was filtered over a pad of Celite and washed with dichloromethane. The filtrate was concentrated under reduced pressure and purified by flash column chromatography (silica gel: diam. 5 cm, ht.
  • Oleanolic acid acceptor 1' (40 mg, 0.0386 mmol, 1 equiv) and perxylosyl-protected imidate donor 2' (39.3 mg, 0.0464 mmol, 1.2 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 3 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves. Boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 6 ⁇ L, 0.0464 mmol, 1.2 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 10 hours, and quenched with triethylamine.
  • BF 3 ⁇ OEt 2 BF 3 ⁇ OEt 2 , 6 ⁇ L, 0.0464 mmol, 1.2 equiv
  • Oleanolic acid acceptor 1' 49.3 mg, 0.0476 mmol, 1 equiv
  • peracetyl-protected imidate donor a 61.9 mg, 0.0571 mmol, 1.2 equiv
  • it was dissolved in 5 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves.
  • Boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 7 ⁇ L, 0.0571 mmol, 1.2 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 7 hours, and then reacted with triethylamine.
  • Oleanolic acid acceptor 1' (54.5 mg, 0.0526 mmol, 1 equiv) and perxylosyl-protected imidate donor b (91.5 mg, 0.0632 mmol, 1.2 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 3 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves. Boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 8 ⁇ L, 0.0632 mmol, 1.2 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 8 hours, and then reacted with triethylamine.
  • BF 3 ⁇ OEt 2 8 ⁇ L, 0.0632 mmol, 1.2 equiv
  • Echinocystic acid acceptor 9' 25 mg, 0.0369 mmol, 1 equiv
  • peracetyl-protected imidate donor a 40 mg, 0.0369 mmol, 1 equiv
  • it was dissolved in 3 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves.
  • Boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 5 ⁇ L, 0.0369 mmol, 1 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 7 hours, and then stirred with triethylamine. Quenched.
  • Echinocystic acid acceptor 13' (56 mg, 0.048 mmol, 1 equiv) and peracetyl-protected imidate donor a (62.5 mg, 0.0577 mmol, 1.2 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 5 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves. Boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 6 ⁇ L, 0.048 mmol, 1 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 8 hours, and then stirred with triethylamine.
  • BF 3 ⁇ OEt 2 6 ⁇ L, 0.048 mmol, 1 equiv
  • Echinocystic acid acceptor 13' (36 mg, 0.0309 mmol, 1 equiv) and peracetyl-protected imidate donor c (48.2 mg, 0.0371 mmol, 1.2 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 3 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves.
  • Oleanolic acid acceptor 16' (57.8 mg, 0.116 mmol, 1 equiv) and peracetyl-protected imidate donor a (151 mg, 0.139 mmol, 1.2 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 5 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves. Boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 17 ⁇ L, 0.139 mmol, 1.2 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 10 hours, and then reacted with triethylamine.
  • BF 3 ⁇ OEt 2 Boron trifluoride diethyl etherate
  • Oleanolic acid acceptor 1' (738 mg, 0.713 mmol, 1 equiv) and peracetyl-protected imidate donor 18' (300 mg, 0.713 mmol, 1 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 20 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves. Boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 88 ⁇ L, 0.713 mmol, 1 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 5 hours, and then stirred with triethylamine. Quenched.
  • step 1 20' (211 mg, 0.354 mmol) and triphenylphosphine (PPh 3 , 232 mg, 0.884 mmol, 2.5 equiv) prepared in step 1 were premixed in a stirred 1,4-dioxane (5 mL) solution.
  • Echinocystic acid acceptor 21' (54.8 mg, 0.0984 mmol, 1 equiv) and peracetyl-protected imidate donor a (128 mg, 0.118 mmol, 1.2 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 5 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves. Boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 15 ⁇ L, 0.118 mmol, 1.2 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 7 hours, and then reacted with triethylamine.
  • BF 3 ⁇ OEt 2 Boron trifluoride diethyl etherate
  • Echinocystic acid acceptor 25' (55.7 mg, 0.0509 mmol, 1 equiv) and peracetyl-protected imidate donor a (66.2 mg, 0.0611 mmol, 1.2 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 4 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves.
  • Echinocystic acid acceptor 27' (32.8 mg, 0.0285 mmol, 1 equiv) and peracetyl-protected imidate donor a (37 mg, 0.0342 mmol, 1.2 equiv) were dried by azeotropically removing water with toluene. Then, it was dissolved in 3 mL of dichloromethane using 4 ⁇ molecular sieves.
  • boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⁇ OEt 2 , 5 ⁇ L, 0.0285 mmol, 1.0 equiv) was added to the reaction solution at -78 °C, stirred at -78 °C for 9 hours, and triethyl Quenched with amine.
  • SARS-CoV-2 S-pseudotype lentivirus pHR-CMV-firefly luciferase, psPAX2 packing, and SARS-CoV-2 S plasmid-containing pSARS-CoV-2
  • H1299 cells expressing ACE2 ACE2 + , Assay System for Endosomal Virus Entry
  • Comparative Examples 1 and 4 without C3 saccharide had low activity (IC 50 >10 ⁇ M), confirming that C3-glucose is essential for inhibiting virus entry into cells.
  • the length and composition of the C28 saccharide are important for the antiviral activity of saponin derivatives.
  • Comparative Example 2 without a saccharide moiety at C28 and Comparative Example 3 with a single arabinose moiety at C28 did not show any significant inhibition of pSARS-CoV-2 cell entry (IC 50 > 10 ⁇ M).
  • Example 1 with a xylose-based disaccharide linked through a ⁇ -1,3-glycosidic bond at C28 and Example 3 with a xylose-based tetrasaccharide linked through a ⁇ -1,3-glycosidic bond at C28, respectively. It showed an inhibitory effect on virus entry with an IC 50 of 7.59 ⁇ M and 8.84 ⁇ M.
  • Saponin derivative Example 2 synthesized by linking glucose to C3 and a tetrasaccharide (compound 6) to C28, exhibited a virus entry inhibitory effect (IC 50 : 1.33 ⁇ M) comparable to platycodin D.
  • Comparative Example 5 in which both C3 and C28 were glycosylated and C16 was acetylated, did not affect pSARS-CoV-2 cell entry.
  • Example 5 in which the acetyl group was removed at C16, inhibited cell infection by pSARS-CoV-2 with an IC 50 of 0.64 ⁇ M.
  • Example 6 showed an IC 50 of 0.65 ⁇ M for pSARS-CoV-2 cell entry, and Comparative Example 6, in which the C28 ester residue was reduced to an ether group, did not show an inhibitory effect due to rapid structural distortion.
  • Example 5 and Example 6 which showed the strongest inhibitory effect against pSARS-CoV-2 in ACE2 + cells, were tested using H1299 cells overexpressing both ACE2 and TMPRSS2 (ACE2/TMRPSS2 + ). As a result, both Example 5 and Example 6 inhibited the entry of pSARS-CoV-2 into ACE2/TMRPSS2+ with IC 50s of 0.65 ⁇ M and 0.61 ⁇ M, respectively ( Figure 1). This was about two times higher antiviral efficiency than platycodin D (IC 50 : 1.34 ⁇ M). Through this, it was confirmed that Example 5 and Example 6 block both the endosome and TMPRSS2-mediated cell surface entry pathways of the coronavirus.
  • Examples 5 and 6 inhibit SARS-CoV-2 infection with IC 50s of 1.04 ⁇ m and 1.42 ⁇ m, respectively.
  • Examples 5 and 6 were more potent at entering ancestral SARS-CoV-2 into Vero cells than Chloroquine (IC 50 : 5.64 ⁇ m) and Remdesivir (IC 50 : 4.68 ⁇ m). It was shown to inhibit (Figure 6).
  • Example 6 was alpha (B.1.1.7_UK, IC 50 : 1.59 ⁇ m), beta (B.1.351_South Africa, IC 50 : 1.59 ⁇ m), gamma (P.1_Brazil, IC 50 : 1.46 ⁇ m), delta It effectively inhibited the infection of Vero cells against various SARS-CoV-2 strains, including (B.1.617.2_India, IC 50 : 1.67 ⁇ m), and omicron (B.1.1.529_multiple countries, IC 50 : 1.45 ⁇ m).
  • Example 6 the virus entry inhibition effect according to Example 6 was analyzed in A549-ACE2-TMPRSS2 cells overexpressing both ACE2 and TMPRSS2 using the SARS-CoV-2-NLuc recombinant virus. As a result, it was confirmed that Example 6 effectively inhibited virus entry with an IC 50 of 2.01 ⁇ m (FIG. 8).

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Abstract

본 개시는 사포닌 유도체 화합물 및 이를 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 코로나바이러스의 세포 진입 억제용 조성물을 제공한다. 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물은 C3, C16 및 C28에 특정 치환기를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 구조적 특징을 포함함으로써 코로나바이러스가 세포 표면에 진입하는 경로를 효과적으로 차단하는 효과를 구현할 수 있다.

Description

사포닌 유도체 화합물 및 이를 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 개시는 사포닌 유도체 화합물 및 이를 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
코로나 바이러스로 인한 반복되는 질병은 지난 20년 동안 우리를 위협해 왔다. 2002-2003년 SARS(중증급성호흡기증후군)의 발병으로 8,400명 이상이 감염되어 전 세계적으로 900명 이상이 사망했다. MERS-CoV(중동호흡기중후군 코로나바이러스)는 메르스 사태를 일으켰고, 2012년 이후 858명 이상의 사망자를 냈다. 최근 SARS-CoV-2 매개 COVID-19(코로나바이러스 2019)의 대유행은 2019년 처음 발생한 이후 전 세계적으로 5억명 이상의 환자와 610만명 이상의 사망자를 냈다. 우리는 다른 코로나바이러스로 인한 미래의 사람과 동물의 공통 전염병이 재발할 가능성을 더이상 배제할 수 없다. 따라서 광범위한 바이러스 등급에 걸쳐 적용할 수 있는 치료 전략의 개발이 필수적이다.
항바이러스제의 개발을 위해서는 바이러스 수명 주기의 다양한 단계를 표적으로 삼을 수 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2 복제를 억제하는 제제는 렘데르시비르(RNA 의존성 RNA폴리머라제(RdRp) 억제제), 니르마트렐비르(주 프로테아제(Mpro) 억제제), 몰누피라비르(RdRp 억제제)에 의해 성공을 보였다. SARS-CoV-2에 대한 이러한 초기 약물은 바이러스 복제를 억제하여 숙주 세포 내부에서 작동하므로 부작용을 일으킬 수 있는 숙주 세포 생리를 변경할 가능성이 있다. 예를 들어, 몰누피라비르는 동물 세포 분석에서 장기 유전독성 부작용을 암시하는 숙주 돌연변이 유발 효과를 나타냈다(S. Zhou, C. S. Hill et al., β-D-N4-hydroxylcytidine inhibits SARSCoV-S through lethal mutagenesis but is also mutagenic to mammalian cells. J. Infect. Dis. 224 (2021) 415-419). 따라서 세포 침습이 덜한 대체 표적 및 동시 약물 개발의 식별은 현재 FDA 승인 약물을 보완할 수 있는 보다 안전한 치료 방법을 제공할 수 있다. 그런 점에서, 본 발명자들은 잠재적인 치료의 개입 시점으로서 SARS-CoV-2 수명 주기의 첫 단계인 바이러스 진입에 초점을 맞췄다.
SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 표적 세포 인식 및 세포로의 바이러스 진입을 담당한다. S1 도메인은 숙주 세포에 바이러스를 부착하는 역할을 하고, S2 도메인은 막 융합을 매개하는 역할을 한다. S1 도메인의 수용체 결합 도메인(RBD)은 초기 세포 인식을 위해 안지오텐신 전환 효소 II(ACE2)에 결합한다. 그런 다음 SARS-CoV-2는 두 가지 별개의 경로를 통해 세포에 들어갈 수 있다. 첫번째는 엔도솜 진입 메커니즘이다. 디나민(dynamin)과 클라트린(clathrin)은 엔도솜과 리소좀으로 더 성숙되는 엔도솜 소포의 인터널리제이션(internalization)을 매개한다. 내부 엔도솜의 산성화는 시스테인 프로테아제 카텝신 L 활성화를 유발하여 S2' 절단 부위의 단백질 분해 및 후속 막 융합을 위한 S2 도메인의 노출을 유발한다. 두번째인 비엔도솜 경로는 세포 표면 진입 메커니즘을 기반으로 한다. RBD가 ACE2에 결합할 때, 숙주 세포 프로테아제인 TMPRSS2(transmembrane protease serine 2) 세포 표면에서 S2' 부위를 절단하고 결과적인 막융합을 위해 S2 도메인을 해방시킨다. 특히 클로로퀸(chloroquine)과 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)은 바이러스 내 침입 동안 리소좀 pH를 상승시켜 카프테신 L을 비활성화시키는 능력으로 인해 잠재적인 약물로 평가받았다. 한편, 카모스타트(camostat), 나파모스타트(nafamostat)와 같은 TMPRSS2 억제제는 비엔도솜 세포 표면의 바이러스 진입을 차단하는 능력으로 인해 COVID-19에 대한 잠재적 약물로 평가되었다. 그러나 이들 약물은 두가지 바이러스 진입 경로 중 하나만 차단할 수 있어 한계를 보였다.
엔도솜 및 비엔도솜 경로 모두에 대한 바이러스 진입의 마지막 단계는 막 융합을 포함한다. 프로테아제 매개(카텝신 L 또는 TMPRSS2) S2' 절단(융합 전 형태) 후, 노출된 S2 도메인은 광범위한 입체구조 변화를 겪게 되며, 헵타드 반복 1(HR1) 도메인은 숙주 세포막에 융합 펩타이드 삽입을 유도한다.
HR2의 접힘(folding)은 분자의 동일한 말단에 융합 펩티드와 막관통 세그먼트를 근접하게 배치하여 반융합 상태로 이어지고 결국 융합 기공을 생성한다. S2 도메인은 다양한 코로나바이러스 중에서 가장 잘 보존된 모티프 중 하나이다. 따라서 S2 도메인 매개 막 융합은 광범위한 항바이러스 치료제 개발을 위한 매력적인 개입지점이다.
일 구현예는 신규한 사포닌 유도체 화합물을 제공하고자 한다.
다른 일 구현예는 사포닌 유도체를 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
다른 일 구현예는 사포닌 유도체를 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하고자 한다.
다른 일 구현예는 사포닌 유도체를 포함하는 코로나바이러스의 세포 진입 억제용 조성물을 제공하고자 한다.
일 구현예는 하기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000001
상기 화학식 1에서,
R1은 C6-20아릴기, C6-20아릴C1-5알킬기 또는
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000002
이고;
R2는 -H 또는 -OH이고; 및
R3은 폴리사카라이드 유도체 그룹이다.
일 실시예에서, 상기 R1은 C6-10아릴기, C6-10아릴C1-5알킬기 또는
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000003
일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 R2는 -OH일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 R3은,
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000004
또는
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000005
이고, 상기 a는 0 내지 20의 정수이고, 상기 b는 0 내지 20의 정수일 수 있고, 또는 상기 a는 0 내지 5의 정수이고, 상기 b는 0 내지 5의 정수일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000006
상기 화학식 2에서, 상기 R1, R2, R3의 정의는 전술한 바와 동일하므로 생략한다.
일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물은 하기 화합물 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
(1)
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000007
;
(2)
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000008
;
(3)
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000009
;
(4)
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000010
;
(5)
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000011
; 및
(6)
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000012
.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 일 구현예는 기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을 포함하는 코로나바이러스의 세포 진입 억제용 조성물을 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을, 이를 필요로 하는 개체나 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 치료방법을 제공한다.
다른 일 구현예는 코로나바이러스 감염증의 치료에 사용하기 위한 상기 사포닌 유도체 화합물을 제공한다.
다른 일 구현예는 코로나바이러스 감염증 치료용 약제의 제조하기 위한 상기 사포닌 유도체 화합물의 용도(use)를 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을 병용투여하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증의 치료방법을 제공한다.
본 개시는 사포닌 유도체 화합물 및 이를 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 코로나바이러스의 세포 진입 억제용 조성물을 제공한다. 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물은 C3, C16 및 C28에 특정 치환기를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 구조적 특징을 포함함으로써 코로나바이러스가 세포 표면에 진입하는 경로를 효과적으로 차단하는 효과를 구현할 수 있다.
도 1은 실시예 5 및 실시예 6 화합물과 플라티코딘 D의 pSARS-CoV-2의 ACE/TMPRSS2+ 세포로의 진입 억제 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 SARS-CoV-2 S 단백질 매개의 세포 융합 과정을 도식화한 도면이다.
도 3은 타임 랩스 이미징을 이용한 세포 융합 분석법의 실험 타임라인을 나타낸 도면이다.
도 4는 S-매개 세포 융합의 타임 랩스 영상에서 서로 다른 시점의 정지 영상을 나타낸 도면이다.
도 5는 유세포 분석법을 이용하여 Spike-HEK293T와 ACE2/TMPRSS2+-H1299 사이의 융합을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 5 및 실시예 6 화합물의 Vero 세포에서 조상 SARS-CoV-2에 의한 감염 억제 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 6 화합물의 Vero 세포에서 SARS-CoV-2 변종에 의한 감염 억제 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예 6 화합물의 A549-ACE2-TMPRSS2 세포에서 SARS-CoV-2-NLuc에 의한 감염 억제 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
본 명세서에 기재된 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 일 구현예에 따른 기술이 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함한다", "구비한다", "함유한다", 또는 "가진다"는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미하며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함한다. 일 예로써 조성의 함량이 10% 내지 80% 또는 20% 내지 50%으로 한정된 경우 10% 내지 50% 또는 50% 내지 80%의 수치범위도 본 명세서에 기재된 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함된다.
이하 본 명세서에서 특별한 정의가 없는 한, “약”은 명시된 값의 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이내의 값으로 고려될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도체"는 이의 구조가 본 명세서에 기재된 것들과 충분히 유사하며, 이러한 구조적/화학적 유사성을 기준으로 당업자가 청구된 화합물과 동일하거나 유사한 활성 및 용도를 나타내거나, 전구체로서 청구된 화합물과 동일하거나 유사한 활성 및 용도를 유도할 것으로 예상할 수 있는 화합물을 포괄적으로 총칭하는 것이다. 상기 유사체는 모 화합물(본원에서, TFP)의 유도체, 염, 이성질체, 에스테르, 아미드, 에스테르 또는 아미드의 염, N-산화물을 포함하는 개념이다.
이하 본 명세서에서 사용되는 용어 "예방" 및 "치료"는 최광의의 개념으로 해석되어야 하며, "예방"이란, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 질환의 증상을 아직 경험하거나 드러내지 아니한 환자에게서 질환의 임상적 증상 중하나 이상이 진행되지 아니하도록 하는 것을 의미한다. "치료"란, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증상의 발달을 저지 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
일 구현예는 하기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000013
상기 화학식 1에서,
R1은 C6-20아릴기, C6-20아릴C1-5알킬기 또는
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000014
이고;
R2는 -H 또는 -OH이고; 및
R3은 폴리사카라이드(polysaccharide) 유도체 그룹이다.
상기 화학식 1의 특징적인 탄소자리에 번호를 표시하면 다음과 같다.
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000015
일 실시예에서, 상기 R1은 C6-10아릴기, C6-10아릴C1-5알킬기 또는
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000016
일 수 있다. 또는 C6-8아릴기, C6아릴기, C6-20아릴C1-3알킬기, C6-10아릴C1-3알킬기, C6아릴C1-3알킬기 또는 C6아릴C1알킬기(벤질기)일 수 있다. 구체적으로 상기 R1은
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000017
일 수 있다.
일 실시예에서 R2는 -OH일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 R3은 폴리사카라이드(다당체) 유도체 그룹이면 특별히 제한되지 않으며, 특히 비교예 3에서와 같이 R3이 단일 오탄당이 아니라 복수의 당이 연결된 다당체라면 일 실시예에서 요구하는 R3(C28)의 요건을 충족할 수 있다.
R3의 구체적인 예를 들자면,
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000018
또는
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000019
일 수 있고, 이때 상기 a는 0 내지 20의 정수이고, 상기 b는 0 내지 20의 정수이다. 또는 상기 a는 0 내지 15의 정수, 0 내지 10의 정수, 0 내지 5의 정수, 0 내지 3의 정수, 0 내지 2의 정수, 0, 1, 또는 2일 수 있다. 또는 상기 b는 0 내지 15의 정수, 0 내지 10의 정수, 0 내지 5의 정수, 0 내지 3의 정수, 0 내지 2의 정수, 0, 1, 또는 2일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물의 입체화학 구조를 구체적으로 예를 들자면, 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000020
상기 화학식 2에서, 치환기 R1, R2 및 R3은 상기 전술한 바와 동일하므로 이하 설명을 생략한다.
일 실시예에 따른 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물은 R1(C3)이 C6-20아릴기, C6-20아릴C1-5알킬기 또는
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000021
이고, R2(C16)이 -H 또는 -OH이고, R3(C28)이 폴리사카라이드 유도체라면 그 구체적인 구조에 제한이 없으나, 일 예시를 들자면 다음과 같다.
(1)
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000022
;
(2)
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;
(3)
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;
(4)
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;
(5)
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; 및
(6)
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000027
.
일 실시예는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 코로나바이러스는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (MERS-Cov), 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 NL63 (HCoV-NL63), 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 감염성 기관지염 바이러스, 소과 코로나바이러스, 개과 코로나바이러스, 고양이과 코로나 나바이러스, 돼지 적혈구 응집 뇌척수염 바이러스, 마우스 간염바이러스, 칠면조 코로나바이러스, 전염성 위장 병 바이러스, 및 랫트 코로나 바이러스 중 어느 1종 이상일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트리플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
상기 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 비경구 투여시에는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의할 수 있다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
일 실시예에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또한, 일 실시예에 따른 건강기능식품 조성물은 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다
나아가, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을, 이를 필요로 하는 개체나 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 치료방법을 제공한다.
다른 일 구현예는 코로나바이러스 감염증의 치료에 사용하기 위한 상기 사포닌 유도체 화합물을 제공한다.
다른 일 구현예는 코로나바이러스 감염증 치료용 약제의 제조하기 위한 상기 사포닌 유도체 화합물의 용도(use)를 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을 병용투여하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증의 치료방법을 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 사포닌 유도체 화합물을 포함하는 코로나바이러스이 세포 진입(entry) 억제용 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 진입(entry)"은 바이러스의 유전정보가 숙주가 되는 세포 내로 유입되는 것을 의미한다.
일 실시예에 따를 사포닌 유도체 화합물은 R1(C3)이 C6-20아릴기, C6-20아릴C1-5알킬기 또는
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000028
이고, R2(C16)이 -H 또는 -OH이고, R3(C28)이 폴리사카라이드 유도체인 구조를 포함함으로써, 코로나바이러스의 엔도솜 및 TMPRSS2 매개 세포 표면 진입 경로를 모두 차단할 수 있다.
또한, 일 실시예에 따른 상기 사포닌 유도체 화합물은 세포 융합을 효과적으로 억제할 수 있는 효과를 구현할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 일 구현 양태의 일부를 예시하는 것일 뿐이므로, 본 명세서에 기재된 기술이 이에 한정되는 것으로 해석해서는 안된다.
<실험 방법>
세포배양
H1299 세포 (Korean Cell Line Bank, KCLB-25803)는 RPMI-1640 (Gibco, USA)에서 배양되었다. HEK293T 세포 (CRL-3216) 및 BHK-21 (Baby hamster kidney fibroblast cells, ATCC:CCL-10) 및 Vero E6 세포 (African green monkey kidney, ATCC:CRL-1573)는 American Type Culture Collection (ATCC Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, ATCC) 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Gyeongsan, Republic of Korea)에서 37 ℃, 5% CO2로 유지하였고, 10% 열-불활성화 태아 소 혈청(FBS) 및 1x 항생제-항진균제 용액(Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 보충하였다. Human-ACE-2 및 TMPRSS2를 안정적으로 발현하는 A549-ACE2-TMPRSS2 세포(Human lung carcinoma epithelial cells)는 National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC)에서 구입하였으며, Ham's F-12K (Kaighn's) 배지에서 37 ℃, 5% CO2 조건에서 성장시켰으며, 10% 열-불활성화 태아 소 혈청(FBS) 및 2 mg/mL Geneticin(G418), 200μg/ml Hygromycin B 및 1x 항생제-항진균제 용액(Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 보충하였다.
바이러스
조상 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-2 변종은 Korea Centers for Disease Control and Prevention (KCDC)에서 구입하였으며, VeroE6 세포에서 증식시켰다. 바이러스 역가는 Vero 세포에서 플라크 분석에 의해 결정하였다. SARS-CoV-2를 이용한 모든 시험은 KNIH의 가이드라인에 따라 한국파스퇴르연구소에서 수행되었으며, KCDC에서 사용하도록 승인된 실험실에서 BSL-3(Enhanced Biosafety Level 3) 봉쇄 절차를 사용하여 수행하였다.
SARS-CoV-2 pseudovirus 생산 및 pSARS-CoV-2 진입 분석
SARS-CoV-2 pseudovirus는 70-80% confluency에 도달한 HEK293T 세포를 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 3000 형질감염 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 pHR-CMV-반딧불이 루시퍼라제 플라스미드(pHR-CMV-firefly luciferase plasmid), psPAX2 패킹 플라스미드(psPAX2 packing plasmid) 및 SARSCoV-2 S 플라스미드로 동시 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 및 48시간에 바이러스 상청액을 수집하고 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 분리된 세포를 제거하고 사용할 때까지 4°C에서 보관하였다.
pSARS-CoV-2 진입 분석의 경우, ACE2(ACE2+) 또는 ACE2 + TMPRSS2(ACE2/TMPRSS2+) 세포를 안정적으로 발현하는 H1299 세포를 60-80% 컨플루언시로 48웰 플레이트에 접종한 후, 다음 날, 세포를 표시된 농도의 각 화합물과 pSARS-CoV-2 바이러스 입자를 포함하는 상청액으로 처리했다. 24시간 배양 후, pSARSCoV-2 진입 효율은 루시퍼라제 분석 키트(Promega, USA) 및 SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 세포 용해물에서 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정하여 정량화했다.
세포 생존율 분석
H1299, Vero 및 A549-AT 세포를 96-웰 플레이트(5×103 세포/웰)에 시딩하고 다음날 일정 농도의 각 화합물로 처리하였다. 24시간 배양 후 각 웰에 WST-8 용액(Biomax, Korea)을 첨가하고 CO2 인큐베이터에서 37°C로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 흡광도는 SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 상대 세포 생존율은 약물 처리된 샘플의 평균 흡광도 값과 DMSO로 처리된 세포의 평균 흡광도 값 사이의 비율로 계산하였다.
타임랩스 이미징을 이용한 세포 융합 분석
mRuby2 형광을 발현하는 ACE2/TMPRSS2+-H1299 세포를 투명한 바닥 24웰 플레이트(ibidi, #82426)에 웰당 1×105개 세포로 접종하고 밤새 배양하였다. 세포를 DMSO 또는 5 μM의 실시예 화합물로 1시간 동안 처리한 다음, 대조군 HEK293T(spike 없음) 또는 Spike-HEK293T 공동발현 GFP 세포 1×104개를 배양물에 첨가하였다. 형광 이미지는 Leica DMi8 현미경(Leica Microsystems, Germany)에서 x40 배율로 90분 동안 4분마다 37 ℃에서 획득했다.
유세포 분석을 이용한 세포 융합 분석
mRuby2 형광을 발현하는 ACE2/TMPRSS2+ H1299 세포를 12웰 플레이트(2×105개 세포/웰)에 플레이팅하였다. 하룻밤 배양 후, 세포를 10 μM의 각 실시예 화합물로 30분 동안 처리한 다음, GFP(spike 없음)를 발현하거나 GFP 및 S 단백질을 공동 발현하는(Spike-HEK293T) 1×104개의 HEK293T 세포를 첨가한 후 1시간 더 배양하였다. trypsin-EDTA(Gibco, USA)를 사용하여 세포 혼합물을 수확하고 각 조건에 대해 1×104 세포를 분석하여 유세포 분석기(LSRFortessa™BD Biosciences)에 의해 GFP/mRuby 이중 양성 세포의 백분율을 결정함으로써 세포 융합을 측정하였다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
SARS-CoV-2-NLuc 항바이러스 분석
A549-hACE2-TMPRSS2 세포(웰당 1.2 x 104개 세포)를 흰색 384-웰 μClear 플레이트(Greiner Bio-One)에 플레이팅했다. 다음날, DMSO에서 2배 또는 3배 희석된 화합물을 각 웰에 첨가하고 세포를 SARS-CoV-2-NLuc(MOI 0.01)로 감염시켰다. 37 ℃에서 24시간 동안 배양한 후 나노 루시퍼라제 기질(Promega)을 각 웰에 첨가하고 루시퍼라제 신호를 VICTOR3TM 다중 라벨 플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 측정했다. 제조사의 지침에 따라 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 세포 생존력을 측정했다. 화합물 처리 그룹의 상대적 루시퍼라제 신호는 비감염 대조군(0%로 설정) 및 DMSO 처리 그룹(100%로 설정)의 신호로 정규화하였다. DRC에 대한 플롯은 Prism6 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA)를 사용하여 생성되었고 IC50(최대 억제 농도의 절반) 값은 비선형 회귀 모델을 사용하여 계산하였다.
통계적 분석
데이터는 2개 또는 3개의 독립적인 실험의 대표값이며, 3 개의 샘플의 평균 ±SEM 값으로 제시되었다. 결과는 Student's t-test 또는 one-way ANOVA에 이어 Tukey's post hoc test를 사용하여 분석되었으며 p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다(*P < 0.05; ****P < 0.0001; NS 유의하지 않음). Prism v.9.0.0(GraphPad Software)을 통계 분석에 사용했다.
실시예 및 비교예의 사포닌 유도체 합성을 위해 다음의 화합물을 먼저 합성하였다.
화합물 a의 합성
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000029
[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6 (220 mg, 0.261 mmol, 0.04 equiv) in THF (10 mL) 용액을 탈기한 후, 수소 대기 하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 투명한 용액으로 얻어진 활성화된 이리듐 촉매 용액을 a1 (2.8 g, 9.77 mmol) in THF에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, 짧은 실리카 컬럼으로 정제하였다. 잔류물과 a2 (1.5 g, 6.51 mmol, 1 equiv)를 톨루엔으로 물을 제거하여 건조시켰다. 80 mL 아세토나이트릴에 용해시킨 후, NIS (2.2 g, 9.77 mmol, 1.5 equiv)를 첨가한 후 실온에서 TfOH (26 μL, 0.293 mmol, 0.03 equiv)를 첨가하였다. 반응물을 10분 동안 교반하고 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 4 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:4)로 정제하여 무색 오일의 a3 (2.1 g, 70%)을 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000030
상기 단계 1에서 제조한 a3 (2.1 g, 4.59 mmol) in methanol 용액에 5 mol/L 소듐 메톡사이드 (4.6 mL, 22.9 mmol, 5 equiv) 용액을 23 ℃에서 첨가하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 농축시킨 후 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 5 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:2)로 정제하여 무색 오일의 a4 (1.62 g, 85%)를 제조하였다.
[단계 3]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000031
다이사카라이드 이미데이트 도너 a5 (418 mg, 0.496 mmol, 1 equiv) 및 상기 단계 2에서 제조한 a4 (205 mg, 0.496 mmol, 1 equiv)를 톨루엔으로 물을 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄에 용해시켰다. 반응용액에 TMS·OTf (18 μL, 0.0986 mmol, 0.2 equiv)를 -40 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 -40 ℃에서 30분 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 chromatography (silica gel: diam. 4 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:3 to 1:1)로 정제하여 흰색 고체의 a6 (369 mg, 68%)을 제조하였다.
[단계 4]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000032
상기 단계 3에서 제조한 a6 (369 mg, 0.335 mmol) in 15 mL methaol 용액에 5 mol/L 소듐 메톡사이드 용액 1.7 mL을 처리하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료되면 메탄올을 제거한 후 잔류물을 TFA/H2O 4:1 혼합물 (8 mL)로 실온에서 처리한 후, 반응물을 농축하고 밤새 펌프-건조시켰다. 그 다음 15 mL 다이클로로메탄에 용해시킨 잔류물을 아세트산 무수물 (1.3 mL, 13.4 mmol, 40 equiv), 트리에틸아민 (7.0 mL, 50.2 mmol, 150 equiv) 및 (다이메틸아미노)피리딘 (2 mg, 0.0167 mmol, 0.05 equiv)로 처리하였다. 이어서 반응 용액을 농축시킨 후 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 4 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:1)로 정제하여 흰색 고체의 a7 (248 mg, 76%)를 제조하였다.
[단계 5]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000033
상기 단계 4에서 제조한 a7를 용해시킨 디클로로메탄/메탄올이 1:1로 혼합된 용액 30 mL에 PdCl2(MeCN)2 (124 mg, 0.476 mmol, 0.3 equiv)를 23 ℃에서 첨가한 후, 결과물을 23 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 현탁액을 셀라이트 패드로 여과한 후 디클로로메탄으로 세척하였다. 여액을 감압하에 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 5 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 2:1)로 정제하여 헤미아세탈 중간체를 얻었다. 얻어진 헤미아세탈을 23 ℃에서 트리클로로아세토나이트릴 (Cl3CCN, 0.37 mL, 3.70 mmol, 3.5 equiv) 및 탄산세슘 (Cs2CO3, 35 mg, 0.106 mmol, 0.1 equiv) in dichloromethane (15 mL)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 5 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 2:1)로 정제하여 흰색 고체의 a (853 mg, 50%)를 제조하였다.
화합물 b의 합성
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000034
다이사카라이드 이미데이트 도너 b1 (461 mg, 0.545 mmol, 1 equiv) 및 어셉터 b2 (195 mg, 0.545 mmol)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 10 mL에 용해시켰다. 반응 용액에 TMS·OTf (20 μL, 0.109 mmol, 0.2 equiv)를 -40 ℃에서 첨가한 후, -40 ℃에서 30분 동안 교반하고 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 4 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:10)로 정제하여 흰색 고체의 b3 (252 mg, 44%)를 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000035
상기 단계 1에서 제조한 b3 (3 g, 2.95 mmol, 1 equiv)를 용해시킨 디클로로메탄/메탄올이 1:1로 혼합된 용액 80 mL에 PdCl2(MeCN)2 (300 mg, 0.589 mmol, 0.4 equiv)를 23 ℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 23 ℃에서 20시간 동안 교반한 후 현탁액을 셀라이트 패드 상에서 여과하고 디클로로메탄으로 세척하였다. 여액을 감압하에 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 5 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:6)로 정제하여 헤미아세탈 중간체를 얻었다. 얻어진 헤미아세탈을 트리클로로아세토나이트릴 (Cl3CCN, 435 μL, 4.34 mmol, 3.5 equiv) 및 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0] undec-7-ene (DBU, 13 μL, 0.0868 mmol, 0.07 equiv) in dichloromethane (30 mL)로 23 ℃에서 처리하였다. 생성된 혼합물을 23 ℃에서 23시간 동안 교반한 후 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 5 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:8)로 정제하여 흰색 고체의 b4 (907 mg, 27%)를 제조하였다.
[단계 3]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000036
트리사카라이드 이미데이트 도너 b4 (187mg, 0.163 mmol, 1 equiv) 및 어셉터 b2 (58 mg, 0.163 mmol, 1 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 8 mL에 용해시켰다. 반응 용액에 TMS·OTf (6 μL, 0.0326 mmol, 0.2 equiv)를 -40 ℃에서 첨가한 후, -40 ℃에서 30분 동안 교반하고 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축시킨 후 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:12)로 정제한 후 흰색 고체의 b5 (75 mg, 34%)를 제조하였다.
[단계 4]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000037
상기 단계 3에서 제조한 b5 (49.5 mg, 0.0368 mmol, 1 equiv)를 용해시킨 디클로로메탄/메탄올이 1:1로 혼합된 용액 4 mL에 PdCl2(MeCN)2 (4.8 mg, 0.0184mmol, 0.5 equiv)를 23 ℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 23 ℃에서 20시간 동안 교반한 후 현탁액을 셀라이트 패드 상에서 여과하고 디클로로메탄으로 세척하였다. 여액을 감압하에 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 2 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:5 to 1:4)로 정제하여 헤미아세탈 중간체를 얻었다. 얻어진 헤미아세탈을 트리클로로아세토나이트릴 (Cl3CCN, 6 μL, 0.0646 mmol, 3.5 equi) 및 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0] undec-7-ene (DBU, 3 μL, 0.0186 mmol, 1 equiv) in dichloromethane (3 mL)로 23 ℃에서 처리하였다. 생성된 혼합물을 23 ℃에서 23시간 동안 교반한 후 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 2 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:4)로 정제하여 흰색 고체의 b (24.3 mg, 51%)를 제조하였다.
화합물 c의 합성
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000038
트리사카라이드 이미데이트 도너 b4 (537 mg, 0.468 mmol, 1 equiv) 및 어셉터 a4 195 mg, 0.468 mmol, 1 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 15 mL에 용해시켰다. 반응 용액에 TMS·OTf (17 μL, 0.0936 mmol, 0.2 equiv)를 -40 ℃에서 첨가한 후, -40 ℃에서 30분 동안 교반하고 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축시킨 후 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 4 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:4)로 정제한 후 흰색 고체의 c1 (434 mg, 66%)를 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000039
상기 단계 1에서 제조한 c1 (250 mg, 0.178 mmol) in 5 mL methaol 용액에 5 mol/L 소듐 메톡사이드 용액 1.0 mL을 처리하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료되면 메탄올을 제거한 후 잔류물을 TFA/H2O 4:1 혼합물 (5 mL)로 실온에서 처리한 후, 반응물을 농축하고 밤새 펌프-건조시켰다. 그 다음 3 mL 다이클로로메탄에 용해시킨 잔류물을 아세트산 무수물 (0.67 mL, 7.13 mmol, 40 equiv), 트리에틸아민 (2.0 mL, 14.3 mmol, 80 equiv) 및 (다이메틸아미노)피리딘 (2 mg, 0.0178 mmol, 0.1 equiv)로 처리하였다. 이어서 반응 용액을 농축시킨 후 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 3:1)로 정제하여 흰색 고체의 c2 (123 mg, 58%)를 제조하였다.
[단계 3]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000040
상기 단계 2에서 제조한 c2 (110 mg, 0.092 mmol, 1 equiv)를 용해시킨 디클로로메탄/메탄올이 1:1로 혼합된 용액 10 mL에 PdCl2(MeCN)2 (12 mg, 0.046 mmol, 0.5 equiv)를 23 ℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 23 ℃에서 20시간 동안 교반한 후 현탁액을 셀라이트 패드 상에서 여과하고 디클로로메탄으로 세척하였다. 여액을 감압하에 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 3:1)로 정제하여 헤미아세탈 중간체를 얻었다. 얻어진 헤미아세탈을 트리클로로아세토나이트릴 (Cl3CCN, 0.49 mL, 0.0554 mmol, 88 equiv) 및 탄산 세슘 (Cs2CO3, 36 mg, 0.111 mmol, 2 equiv) in dichloromethane (5 mL)로 23 ℃에서 처리하였다. 생성된 혼합물을 23 ℃에서 20시간 동안 교반한 후 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 3:1)로 정제하여 흰색 고체의 c (37 mg, 31%)를 제조하였다.
<실시예 1>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000041
올레아놀산 어셉터 1' (40 mg, 0.0386 mmol, 1 equiv) 및 퍼자일로실로 보호된 이미데이트 도너 2' (39.3 mg, 0.0464 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 3 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 6 μL, 0.0464 mmol, 1.2 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 10시간 동안 교반하고 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexanes = 1:4)로 정제하여 흰색 고체의 3' (35 mg, 53%)를 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000042
상기 단계 1에서 제조한 3' (23.1 mg, 0.0134 mmol, 1 equiv)을 용해한 MeOH (3 mL) 용액에 클로로포름 5 방울, K2CO3 (33.4 mg, 0.242 mmol, 18 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새도록 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W로 퀜칭하였다. 여과를 통해 Dowex를 제거한 후, 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피 (MeOH/H2O, 5:1)로 정제하여 흰색 가루의 실시예 1 화합물 (8.3 mg, 70%)을 제조하였다.
1H NMR (900 MHz, Methanol-d4) δ 5.40 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.26 (t, J = 3.7 Hz, 1H), 4.51 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.91 (ddd, J = 11.5, 9.2, 5.3 Hz, 2H), 3.84 (dd, J = 11.9, 2.4 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 11.9, 5.5 Hz, 1H), 3.59 (td, J = 8.8, 5.5 Hz, 1H), 3.55 - 3.48 (m, 3H), 3.37 - 3.32 (m, 3H), 3.30 - 3.26 (m, 2H), 3.26 - 3.22 (m, 2H), 3.20 - 3.16 (m, 2H), 2.89 - 2.86 (m, 1H), 2.04 (td, J = 13.7, 4.0 Hz, 1H), 1.94 - 1.88 (m, 3H), 1.81 (td, J = 14.2, 4.3 Hz, 1H), 1.74 - 1.66 (m, 4H), 1.64 - 1.52 (m, 5H), 1.49 (td, J = 12.9, 4.4 Hz, 1H), 1.40 (tdd, J = 13.9, 9.1, 3.7 Hz, 2H), 1.30 (ddd, J = 13.3, 6.8, 3.6 Hz, 2H), 1.24 - 1.20 (m, 1H), 1.15 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 0.99 (td, J = 13.5, 3.7 Hz, 1H), 0.95 (s, 3H), 0.94 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.85 (s, 3H), 0.79 (s, 3H).
13C NMR (226 MHz, Methanol-d4) δ 178.1, 145.0, 124.1, 106.9, 105.9, 96.0, 91.0, 87.2, 78.4, 77.9, 77.8, 75.8, 75.4, 73.0, 71.8, 71.1, 69.6, 67.3, 67.2, 63.0, 57.2, 48.3, 47.3, 43.1, 42.7, 40.9, 40.3, 40.0, 38.0, 35.0, 34.1, 33.6, 33.5, 31.7, 29.0, 28.7, 27.2, 26.5, 24.7, 24.1, 24.1, 19.5, 17.9, 17.1, 16.2.
<실시예 2>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000043
올레아놀산 어셉터 1' (49.3 mg, 0.0476 mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 a (61.9 mg, 0.0571 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 5 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 7 μL, 0.0571 mmol, 1.2 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 7시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/dichloromethane = 1:4)로 정제하여 흰색 고체의 4' (28.8 mg, 31%)를 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000044
상기 단계 1에서 제조한 4' (18.8 mg, 0.00961 mmol, 1 equiv)을 용해한 MeOH (3 mL) 용액에 클로로포름 5 방울, K2CO3 (34.5 mg, 0.250 mmol, 26 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새도록 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W로 퀜칭하였다. 여과를 통해 Dowex를 제거한 후, 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피 (MeOH/H2O, 5:1)로 정제하여 흰색 가루의 실시예 2 화합물 (7.2 mg, 64%)을 제조하였다.
1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ 6.53 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.76 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 5.45 (t, J = 3.7 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.18 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.95 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.64 - 4.52 (m, 6H), 4.47 - 4.37 (m, 4H), 4.34 - 4.13 (m, 6H), 4.11 - 4.01 (m, 6H), 3.98 (dd, J = 10.5, 4.2 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 11.3, 9.5 Hz, 1H), 3.52 - 3.44 (m, 1H), 3.39 (dd, J = 11.7, 4.6 Hz, 1H), 3.30 (dd, J = 13.8, 4.7 Hz, 1H), 1.77 (d, J = 4.3 Hz, 3H), 1.34 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.01 (s, 6H), 0.94 (s, 3H), 0.83 (s, 3H).
13C NMR (151 MHz, Pyridine-d5) δ 176.7, 144.6, 107.3, 106.8, 106.4, 101.3, 93.8, 89.3, 87.4, 84.2, 79.2, 78.7, 78.6, 76.2, 75.7, 75.6, 75.4, 73.1, 72.3, 72.2, 71.4, 69.9, 69.4, 68.9, 67.7, 67.3, 66.3, 63.5, 63.1, 56.2, 48.4, 47.8, 46.6, 42.5, 42.1, 40.3, 39.9, 39.1, 37.4, 34.5, 33.6, 33.1, 31.3, 28.7, 27.0, 26.5, 24.2, 24.1, 23.6, 18.9, 18.8, 17.9, 17.4, 15.9.
<실시예 3>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000045
올레아놀산 어셉터 1' (54.5 mg, 0.0526 mmol, 1 equiv) 및 퍼자일로실로 보호된 이미데이터 도너 b (91.5 mg, 0.0632 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 3 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 8 μL, 0.0632 mmol, 1.2 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 8시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexanes = 1:4)로 정제하여 흰색 고체의 5' (35 mg, 29%)를 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000046
상기 단계 1에서 제조한 5' (26.4 mg, 0.0114 mmol, 1 equiv)를 용해한 MeOH (3 mL) 용액에 클로로포름 5 방울, K2CO3 (41 mg, 0.296 mmol, 26 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새도록 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W로 퀜칭하였다. 여과를 통해 Dowex를 제거한 후, 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피 (MeOH/H2O, 4:1)로 정제하여 흰색 가루의 실시예 3 화합물 (10.1 mg, 77%)을 제조하였다.
1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ 6.16 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 5.45 (t, J = 3.9 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 17.7, 7.6 Hz, 3H), 4.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.65 - 4.58 (m, 1H), 4.44 (dd, J = 11.7, 5.3 Hz, 1H), 4.36 - 4.00 (m, 20H), 3.79 (t, J = 10.6 Hz, 1H), 3.71 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 3.62 (td, J = 10.7, 5.5 Hz, 2H), 3.39 (dd, J = 11.8, 4.5 Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 13.7, 4.6 Hz, 1H), 2.21 (t, J = 15.3 Hz, 2H), 2.14 - 2.04 (m, 1H), 1.91 (t, J = 13.6 Hz, 4H), 1.79 (p, J = 13.4, 11.8 Hz, 3H), 1.61 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 1.47 - 1.37 (m, 4H), 1.32 (s, 3H), 1.26 (d, J = 8.9 Hz, 6H), 1.16 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.05 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.95 - 0.89 (m, 6H), 0.86 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
13C NMR (126 MHz, Pyridine-d5) δ 176.9, 144.4, 107.3, 106.4, 105.8, 105.7, 96.1, 89.2, 86.8, 86.7, 86.6, 79.2, 78.7, 78.6, 76.2, 75.8, 74.7, 74.6, 73.2, 72.2, 71.4, 69.4, 69.3, 69.2, 67.8, 67.6, 67.1, 67.0, 63.4, 56.2, 48.3, 47.5, 46.5, 42.5, 42.1, 40.2, 39.9, 39.1, 37.3, 34.4, 33.5, 33.0, 31.2, 28.7, 27.0, 26.5, 24.2, 24.0, 23.6, 18.9, 17.8, 17.4, 15.9.
<실시예 4>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000047
소듐 하이드라이드 (NaH, 60% dispersion in mineral oil, 26 mg, 1.07 mmol, 2.2 equiv) in DMF (10 mL) 현탁액에 0 ℃에서 6' 용액 (250 mg, 0.488 mmol, 1 equiv) in DMF (2 mL)을 아르곤 하에서 적가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반한 후, 벤질 브로마이드 (BnBr, 70 μL, 0.585 mmol, 1.2 equiv) 용액을 반응 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 23 ℃에서 데웠다. 20 시간 후, 포화 중탄산 소듐 바이카보네이트 용액 (10 mL) 및 EtOAc (10 mL)을 반응 혼합물에 첨가한 후 층을 분리하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 건조한 후 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 12)로 정제하여 무색 오일의 7' (80 mg, 27%)을 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000048
상기 단계 1에서 제조한 7' (26.4 mg, 0.0438 mmol, 1 equiv)와 2,6-루티딘 (51 μL, 0.438 mmol, 10 equiv)이 교반된 다이클로로메탄 (3 mL) 용액에 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트 (TESOTf, 79 μL, 0.35 mmol, 8 equiv)를 23 ℃에서 적가하였다. 3시간 후, 반응 혼합물에 포화 중탄산소듐 수용액 (3 mL)을 첨가한 후, 층을 분리하였다. 복합 유기상을 5% 수용성의 황산구리 (II) 5수화물 (3 mL)로 세차례 세척하였다. 유기층을 무수 황산소듐으로 건조하고 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 2 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 15)로 정제하여 무색 오일의 8' (29.2 mg, 93%)을 제조하였다.
[단계 3]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000049
상기 단계 2에서 제조된 8' (18.5 mg, 0.0258 mmol)와 트리페닐포스핀 (PPh3, 16.9 mg, 0.0645 mmol, 2.5 equiv)이 교반된 1,4-다이옥산 (2 mL) 용액에 미리 혼합된 포름산 (20 μL, 0.542 mmol, 21 equiv)/트리에틸아민 (Et3N, 72 μL, 0.516 mmol, 20 equiv) in 1,4-dioxane (1 mL) 용액 및 Pd(OAc)2 (1.1 mg, 5.16 μmol, 0.2 equiv) in 1,4-dioxane (1 mL) 용액을 23 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20시간 동안 교반한 후, 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 2 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 6)로 정제하여 흰색 고체의 9' (16.6 mg, 95%)를 제조하였다.
[단계 4]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000050
에키노시스트산 어셉터 9' (25 mg, 0.0369 mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 a (40 mg, 0.0369 mmol, 1 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 3 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 5 μL, 0.0369 mmol, 1 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 7시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 2 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexanes = 3:1)로 정제하여 흰색 고체의 10' (26 mg, 44%)를 제조하였다.
[단계 5]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000051
상기 단계 4에서 제조한 10' (25.7 mg, 0.0161 mmol, 1 equiv) in dichloromethane (0.2 mL) 용액에 얼음 욕조에서 2.5 mL 트리플루오로아세트산 in water (4:1, v/v)를 첨가하였다. 0 ℃에서 30분 동안 교반한 후 0 ℃ 용액을 농축 건조시켰다. 잔류물에 클로로포름 5 방울, 3.0 mL MeOH, and K2CO3 (40 mg, 0.289 mmol, 18 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새도록 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 9:1)로 정제하여 흰색 가루의 실시예 4 화합물(14.5 mg, 78%)을 제조하였다.
1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ 7.52 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.54 (s, 1H), 6.41 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.67 (t, J = 3.6 Hz, 1H), 5.30 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.58 (td, J = 8.7, 4.3 Hz, 4H), 4.49 - 4.37 (m, 4H), 4.31 (dd, J = 11.3, 4.8 Hz, 1H), 4.26 - 4.12 (m, 3H), 4.10 - 3.95 (m, 5H), 3.73 - 3.59 (m, 2H), 3.52 - 3.42 (m, 1H), 2.95 (dd, J = 11.4, 4.3 Hz, 1H), 2.82 (t, J = 13.5 Hz, 1H), 2.45 (td, J = 12.7, 4.9 Hz, 1H), 2.35 (ddd, J = 14.4, 9.3, 3.7 Hz, 2H), 2.23 (td, J = 13.5, 5.2 Hz, 1H), 2.01 - 1.94 (m, 2H), 1.83 (d, J = 5.7 Hz, 5H), 1.75 (d, J = 4.7 Hz, 3H), 1.67 - 1.21 (m, 11H), 1.17 (s, 3H), 1.12 (s, 3H), 1.08 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.90 (s, 3H).
13C NMR (126 MHz, Pyridine-d5) δ 176.3, 144.9, 140.8, 129.0, 128.2, 128.0, 106.6, 106.5, 101.4, 93.9, 87.5, 87.0, 83.9, 78.6, 75.7, 75.6, 75.4, 74.5, 73.1, 72.2, 71.7, 71.4, 70.0, 69.4, 68.9, 67.7, 67.3, 66.3, 63.3, 56.4, 50.0, 47.6, 42.5, 41.7, 40.5, 39.5, 39.0, 37.7, 36.6, 36.4, 33.9, 33.7, 32.6, 31.4, 30.4, 28.9, 27.6, 25.2, 24.3, 23.3, 19.0, 18.8, 18.0, 17.5, 16.1.
<실시예 5>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000052
11' (591 mg, 0.542 mmol, 1 equiv) 및 2,6-루티딘 (0.63 mL, 5.42 mmol, 10 equiv)이 교반된 다이클로로메탄 (20 mL) 용액에 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트 (TESOTf, 0.98 mL, 4.33 mmol, 8 equiv)를 23 ℃에서 적가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물에 포화 중탄산소듐 수용액 (20 mL)을 첨가한 후, 층을 분리하였다. 복합 유기상을 5% 수용성의 황산구리 (II) 5수화물 (20 mL)로 세차례 세척하였다. 유기층을 무수 황산소듐으로 건조하고 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 4 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 7)로 정제하여 밝은 노란색 고체의 12' (590 mg, 90%)을 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000053
12' (550 mg, 0.456 mmol)와 트리페닐포스핀 (PPh3, 299 mg, 1.14 mmol, 2.5 equiv)이 교반된 1,4-다이옥산 (10 mL) 용액에 미리 혼합된 포름산 (0.36 mL, 9.58 mmol, 21 equiv)/트리에틸아민 (Et3N, 1.27 mL, 9.12 mmol, 20 equiv) in 1,4-dioxane (3 mL) 용액 및 Pd(OAc)2 (20.5 mg, 0.0912 mmol, 0.2 equiv) in 1,4-dioxane (1 mL)을 23 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반한 후, 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 4 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 3)로 정제하여 밝은 노란색 고체의 13' (16.6 mg, 95%)를 제조하였다.
[단계 3]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000054
에키노시스트산 어셉터 13' (56 mg, 0.048 mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 a (62.5 mg, 0.0577 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 5 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 6 μL, 0.048 mmol, 1 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 8시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/dichloromethane = 1:4)로 정제하여 노란색 고체의 14' (42 mg, 42%)를 제조하였다.
[단계 4]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000055
상기 단계 3에서 제조한 14' (31.6 mg, 0.0151 mmol, 1 equiv) in dichloromethane (0.2 mL) 용액에 얼음 욕조에서 2.0 mL 트리플루오로아세트산 in water (4:1, v/v)을 첨가하였다. 0 ℃에서 30분 동안 교반한 후 0 ℃ 용액을 농축 건조시켰다. 잔류물에 클로로포름 5 방울, 3.0 mL MeOH, and K2CO3 (54.4 mg, 0.394 mmol, 26 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새도록 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 2:1)로 정제하여 흰색 가루의 실시예 5 화합물 (9.8 mg, 55%)을 제조하였다.
1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ 6.53 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.40 (br s, 1H), 5.63 (t, J = 3.7 Hz, 1H), 5.29 (s, 1H), 5.23 (dd, J = 18.4, 7.4 Hz, 2H), 4.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.65 - 4.52 (m, 6H), 4.48 - 4.38 (m, 4H), 4.29 (ddd, J = 15.8, 8.4, 3.3 Hz, 3H), 4.18 (dq, J = 20.0, 8.5, 7.7 Hz, 3H), 4.11 - 3.94 (m, 7H), 3.69 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 3.64 - 3.57 (m, 1H), 3.50 - 3.38 (m, 2H), 2.81 (t, J = 13.4 Hz, 1H), 2.44 (dt, J = 13.0, 6.8 Hz, 1H), 2.39 - 2.29 (m, 2H), 2.29 - 2.18 (m, 2H), 1.99 - 1.91 (m, 2H), 1.85 (d, J = 7.8 Hz, 5H), 1.80 - 1.72 (m, 4H), 1.65 - 1.55 (m, 2H), 1.55 - 1.42 (m, 4H), 1.32 (d, J = 9.0 Hz, 10H), 1.17 (d, J = 6.6 Hz, 5H), 1.09 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.87 (s, 3H).
13C NMR (151 MHz, Pyridine-d5) δ 176.3, 144.8, 123.2, 107.3, 106.6, 106.5, 101.4, 93.8, 89.2, 87.5, 83.8, 79.2, 78.7, 78.6, 76.2, 75.7, 75.6, 75.3, 74.5, 73.1, 72.3, 72.2, 71.3, 69.9, 69.4, 68.9, 67.7, 67.2, 66.2, 63.5, 63.2, 56.3, 50.0, 47.6, 47.5, 42.5, 41.7, 40.4, 39.9, 39.2, 37.4, 36.6, 36.4, 33.9, 33.7, 32.6, 31.3, 28.7, 27.6, 27.0, 25.2, 24.2, 18.9, 18.8, 18.0, 17.5, 16.1.
<실시예 6>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000056
에키노시스트산 어셉터 13' (36 mg, 0.0309 mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 c (48.2 mg, 0.0371 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 3 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 5 μL, 0.0371 mmol, 1.2 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 9시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 2 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexanes = 2:1)로 정제하여 흰색 고체의 15' (29.7 mg, 42%)를 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000057
상기 단계 1에서 제조한 15' (13.1 mg, 0.00569 mmol, 1 equiv) in dichloromethane (0.2 mL) 용액에 얼음 욕조에서 2.5 mL 트리플루오로아세트산 in water (4:1, v/v)을 첨가하였다. 0 ℃에서 30분 동안 교반한 후 0 ℃ 용액을 농축 건조시켰다. 잔류물에 클로로포름 5 방울, 3.0 mL MeOH, and K2CO3 (23.6 mg, 0.171 mmol, 30 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새도록 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 4:1)로 정제하여 흰색 가루의 실시예 6 화합물 (4.4 mg, 59%)을 제조하였다.
1H NMR (900 MHz, Methanol-d4) δ 5.61 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.36 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.57 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 2H), 4.52 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.49 (td, J = 3.7, 1.4 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 11.6, 5.4 Hz, 1H), 3.90 (ddd, J = 11.4, 9.1, 6.4 Hz, 3H), 3.87 - 3.81 (m, 4H), 3.79 (dd, J = 5.5, 3.9 Hz, 1H), 3.72 - 3.69 (m, 1H), 3.66 (dd, J = 11.9, 5.4 Hz, 1H), 3.60 - 3.54 (m, 3H), 3.53 - 3.47 (m, 5H), 3.43 - 3.40 (m, 1H), 3.37 - 3.33 (m, 2H), 3.30 - 3.27 (m, 3H), 3.26 - 3.22 (m, 3H), 3.21 - 3.18 (m, 2H), 3.05 (dd, J = 14.4, 4.6 Hz, 1H), 2.28 (dd, J = 14.5, 12.8 Hz, 1H), 1.95 - 1.88 (m, 10H), 1.79 - 1.74 (m, 2H), 1.70 (qd, J = 13.5, 3.7 Hz, 1H), 1.66 - 1.62 (m, 2H), 1.54 (ddd, J = 30.7, 13.4, 6.4 Hz, 3H), 1.43 - 1.38 (m, 4H), 1.36 (s, 3H), 1.30 (s, 3H), 1.29 (d, J = 4.6 Hz, 4H), 1.07 (s, 3H), 0.97 (d, J = 1.8 Hz, 6H), 0.88 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.78 (s, 3H).
13C NMR (226 MHz, Methanol-d4) δ 177.2, 144.8, 123.9, 106.9, 106.5, 105.9, 105.5, 101.5, 94.2, 91.0, 87.7, 86.9, 83.8, 78.4, 77.8, 77.8, 75.9, 75.8, 75.4, 75.4, 74.8, 74.6, 72.5, 72.2, 71.9, 71.6, 71.2, 69.7, 69.6, 69.1, 67.3, 67.3, 67.0, 66.8, 64.1, 63.0, 57.3, 50.5, 48.3, 47.9, 42.9, 42.3, 41.0, 40.4, 40.1, 38.1, 36.6, 34.4, 33.5, 32.1, 31.5, 30.9, 28.8, 27.4, 27.2, 25.2, 24.7, 19.6, 18.3, 18.1, 17.2, 16.3.
상기 실시예 1 내지 실시예 6의 화합물을 하기 표 1에 정리하였다.
실시예 No. 화학식
1
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000058
2
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000059
3
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000060
4
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000061
5
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000062
6
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000063
<비교예 1>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000064
올레아놀산 어셉터 16' (57.8 mg, 0.116mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 a (151 mg, 0.139 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 5 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 17 μL, 0.139 mmol, 1.2 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 10시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexanes = 2:1)로 정제하여 흰색 고체의 17' (74 mg, 45%)을 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000065
상기 단계 1에서 제조한 17' (65 mg, 0.0458 mmol, 1 equiv) in MeOH (3 mL) 용액에 클로로포름 5방울, 5 mol/L의 소듐 메톡사이드 (0.18 mL, 0.916 mmol, 20 equiv) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 4:1)로 정제하여 흰색 가루의 비교예 1 화합물 (27.9 mg, 61%)을 제조하였다.
1H NMR (900 MHz, Methanol-d4) δ 5.67 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 5.29 (t, J = 3.7 Hz, 1H), 5.05 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.93 - 3.87 (m, 5H), 3.85 (td, J = 8.8, 8.2, 3.6 Hz, 2H), 3.81 (dd, J = 5.4, 3.7 Hz, 1H), 3.72 (dq, J = 9.4, 6.2 Hz, 1H), 3.58 - 3.53 (m, 2H), 3.53 - 3.46 (m, 3H), 3.40 (dd, J = 9.1, 7.7 Hz, 1H), 3.35 (d, J = 17.9 Hz, 2H), 3.29 (dd, J = 9.1, 7.6 Hz, 1H), 3.23 (ddd, J = 24.0, 11.6, 10.3 Hz, 2H), 3.15 (dd, J = 11.6, 4.6 Hz, 1H), 2.91 (dd, J = 14.0, 4.6 Hz, 1H), 2.03 (td, J = 14.1, 13.5, 4.0 Hz, 1H), 1.92 - 1.88 (m, 2H), 1.78 - 1.62 (m, 6H), 1.60 - 1.54 (m, 4H), 1.48 (td, J = 12.5, 4.2 Hz, 1H), 1.42 - 1.35 (m, 3H), 1.29 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.22 (ddt, J = 13.5, 4.8, 2.7 Hz, 1H), 1.16 (s, 3H), 1.14 (ddd, J = 13.8, 4.9, 2.6 Hz, 2H), 0.98 (s, 3H), 0.95 (s, 3H), 0.94 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.78 (d, J = 1.5 Hz, 6H).
13C NMR (226 MHz, Methanol-d4) δ 177.9, 145.0, 124.0, 106.6, 105.9, 101.5, 94.0, 87.8, 84.1, 79.9, 77.8, 75.9, 75.3, 75.2, 72.5, 72.1, 71.3, 71.1, 69.8, 69.0, 67.3, 67.2, 66.9, 63.8, 56.9, 48.4, 47.3, 43.1, 42.8, 40.8, 40.0, 40.0, 38.3, 35.0, 34.2, 33.7, 33.5, 31.7, 29.2, 29.0, 28.0, 26.5, 24.7, 24.2, 23.9, 19.7, 18.3, 18.0, 16.5, 16.1.
<비교예 2>
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000066
1' (265 mg, 0.256 mmol, 1 equiv) in MeOH (8 mL) 용액에 클로로포름 5방울, K2CO3 (708 mg, 5.12 mmol, 20 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 6:1)로 정제하여 흰색 가루의 비교예 2 화합물 (108 mg, 68%)을 제조하였다.
1H NMR (600 MHz, Pyridine-d5) δ 1H NMR (600 MHz, Pyridine-d5) δ 5.50 (s, 1H), 4.97 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 11.8, 5.2 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 4.05 (dt, J = 14.0, 7.3 Hz, 2H), 3.41 (dd, J = 11.7, 4.3 Hz, 1H), 3.32 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 2.29 - 1.79 (m, 12H), 1.66 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 1.48 (dt, J = 35.8, 13.4 Hz, 5H), 1.34 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.01 (s, 6H), 0.97 (s, 3H), 0.84 (s, 3H).
<비교예 3>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000067
올레아놀산 어셉터 1' (738 mg, 0.713 mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 18' (300 mg, 0.713 mmol, 1 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 20 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 88 μL, 0.713 mmol, 1 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 5시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 4 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:3 to 1:1)로 정제하여 흰색 고체의 19' (749 mg, 81%)를 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000068
19' (50 mg, 0.0387 mmol, 1 equiv) in MeOH (5 mL) 용액에 클로로포름 5방울, K2CO3 (74 mg, 0.541 mmol, 14 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 4:1)로 정제하여 흰색 가루의 비교예 3 화합물 (15 mg, 52%)을 제조하였다.
1H NMR (900 MHz, Methanol-d4) δ 5.42 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 5.27 (t, J = 3.7 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 11.8, 4.7 Hz, 1H), 3.87 (ddd, J = 4.8, 3.2, 2.1 Hz, 1H), 3.84 (dd, J = 11.9, 2.4 Hz, 1H), 3.69 - 3.65 (m, 3H), 3.57 (dd, J = 11.8, 2.1 Hz, 1H), 3.33 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.29 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.24 (ddd, J = 9.6, 5.5, 2.4 Hz, 1H), 3.20 - 3.16 (m, 2H), 2.91 (dd, J = 14.0, 4.6 Hz, 1H), 2.03 (td, J = 13.6, 4.1 Hz, 1H), 1.95 - 1.88 (m, 3H), 1.83 - 1.66 (m, 6H), 1.64 - 1.53 (m, 5H), 1.49 (td, J = 12.9, 4.4 Hz, 1H), 1.43 - 1.36 (m, 2H), 1.34 - 1.28 (m, 2H), 1.21 (ddt, J = 13.5, 4.6, 2.6 Hz, 1H), 1.16 (s, 3H), 1.15 - 1.13 (m, 1H), 1.08 (dt, J = 14.1, 3.5 Hz, 1H), 1.05 (s, 3H), 0.99 (td, J = 13.3, 3.7 Hz, 1H), 0.95 (s, 3H), 0.94 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.85 (s, 3H), 0.79 (s, 3H).
13C NMR (226 MHz, Methanol-d4) δ 178.2, 145.1, 124.1, 106.9, 96.0, 91.0, 78.4, 77.8, 75.8, 73.8, 71.8, 71.4, 68.6, 66.5, 63.0, 57.2, 48.3, 47.3, 43.1, 42.7, 40.9, 40.3, 40.0, 38.0, 35.0, 34.1, 33.7, 33.5, 31.7, 29.0, 28.7, 27.2, 26.5, 24.7, 24.2, 24.0, 19.5, 17.9, 17.2, 16.2.
<비교예 4>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000069
6' (205 mg, 0.4 mmol, 1 equiv) in pyridine (5 mL) 용액에 4-다이메틸아미노피리딘 (DMAP, 49 mg, 0.4 mmol, 1 equiv) 및 무수 아세트산 (Ac2O, 378 μL, 4.0 mmol, 10 equiv)을 23 ℃에서 첨가하였다. 20시간 후, 에틸 아세테이트 (10 mL) 및 물 (10 mL)을 반응 혼합물에 첨가한 후 유기층을 분리하였다. 복합 유기상을 5% 수용성의 황산구리 (II) 5수화물 (10 mL)로 세차례 세척하였다. 유기층을 무수 황산소듐으로 건조하고 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 9)로 정제하여 흰색 고체의 20' (238 mg, 99%)을 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000070
상기 단계 1에서 제조한 20' (211 mg, 0.354 mmol) 및 트리페닐포스핀 (PPh3, 232 mg, 0.884 mmol, 2.5 equiv)이 교반된 1,4-다이옥산 (5 mL) 용액에 미리 혼합된 포름산 (0.28 mL, 7.42 mmol, 21 equiv)/트리에틸아민 (Et3N, 1.0 mL, 7.07 mmol, 20 equiv) in 1,4-dioxane (3 mL) 용액 및 Pd(OAc)2 (15.8 mg, 0.0707 mmol, 0.2 equiv) in 1,4-dioxane (1 mL)을 23 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 14시간 동안 교반한 후, 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 2)로 정제하여 흰색 고체의 21' (193 mg, 98%)을 제조하였다.
[단계 3]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000071
에키노시스트산 어셉터 21' (54.8 mg, 0.0984 mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 a (128 mg, 0.118 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 5 mL에 용해시켰다. 반응용액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 15 μL, 0.118 mmol, 1.2 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 7시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/dichloromethane = 1:2)로 정제하여 흰색 고체의 22' (79 mg, 54%)를 제조하였다.
[단계 4]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000072
22' (26.4 mg, 0.021 mmol, 1 equiv) in MeOH (3 mL) 용액에 클로로포름 5방울, K2CO3 (58 mg, 0.42 mmol, 20 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 5:1)로 정제하여 흰색 가루의 비교예 4 화합물 (4.3 mg, 19%)을 제조하였다.
1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ 6.60 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.28 (s, 1H), 5.67 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 5.65 - 5.61 (m, 1H), 5.28 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.67 - 4.52 (m, 5H), 4.48 (dt, J = 10.2, 3.9 Hz, 1H), 4.40 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 11.2, 4.8 Hz, 1H), 4.26 - 4.13 (m, 3H), 4.11 - 3.99 (m, 5H), 3.70 (dd, J = 11.2, 9.5 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 13.9, 4.7 Hz, 1H), 3.49 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.42 (dd, J = 10.9, 5.1 Hz, 1H), 2.41 - 2.32 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.14 - 2.06 (m, 1H), 1.99 - 1.91 (m, 2H), 1.83 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.79 (d, J = 5.4 Hz, 3H), 1.76 - 1.71 (m, 2H), 1.66 (dt, J = 13.4, 6.8 Hz, 2H), 1.56 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 1.46 (s, 3H), 1.38 (d, J = 13.1 Hz, 4H), 1.24 (s, 3H), 1.14 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 0.92 (s, 3H).
13C NMR (126 MHz, Pyridine-d5) δ 174.9, 170.3, 142.9, 124.7, 106.7, 106.5, 101.5, 94.2, 87.4, 84.0, 78.6, 78.4, 77.1, 75.9, 75.8, 75.4, 73.2, 72.2, 71.4, 69.4, 69.0, 68.9, 67.7, 67.3, 65.6, 62.5, 56.3, 48.7, 47.5, 47.0, 41.9, 41.2, 40.4, 39.8, 39.4, 37.7, 35.8, 33.8, 33.2, 31.9, 31.1, 29.1, 28.5, 27.1, 24.8, 24.2, 22.3, 19.1, 18.8, 17.9, 16.9, 16.1.
<비교예 5>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000073
모노사카라이드 이미데이트 도너 23' (1.1 g, 1.44 mmol, 1 equiv) 및 어셉터 6' (740 mg, 1.44 mmol, 1 equiv)를 톨루엔으로 물을 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 15 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 반응용액에 TMS·OTf (13 μL, 0.0722 mmol, 0.05 equiv)를 0 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 2시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 4 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexane = 1:4)로 정제하여 흰색 고체의 11' (793 mg, 50%)을 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000074
상기 단계 1에서 제조한 11' (146 mg, 0.134 mmol, 1 equiv) in pyridine (5 mL) 용액에 4-다이메틸아미노피리딘 (DMAP, 16.3 mg, 0.134 mmol, 1 equiv) 및 무수 아세트산 (Ac2O, 126 μL, 1.34 mmol, 10 equiv)을 23 ℃에서 첨가하였다. 20시간 후, 에틸 아세테이트 (10 mL) 및 물 (10 mL)을 반응 혼합물에 첨가한 후 유기층을 분리하였다. 복합 유기상을 5% 수용성의 황산구리 (II) 5수화물 (10 mL)로 세차례 세척하였다. 유기층을 무수 황산소듐으로 건조하고 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 4)로 정제하여 흰색 고체의 24' (103 mg, 68%)을 제조하였다.
[단계 3]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000075
상기 단계 2에서 제조한 24' (96 mg, 0.0847 mmol) 및 트리페닐포스핀 (PPh3, 56 mg, 0.212 mmol, 2.5 equiv)이 교반된 1,4-다이옥산 (3 mL) 용액에 미리 혼합된 포름산 (67 μL, 1.78 mmol, 21 equiv)/트리에틸아민 (Et3N, 236 μL, 1.69 mmol, 20 equiv) in 1,4-dioxane (1 mL) 용액 및 Pd(OAc)2 (9.5 mg, 0.0424 mmol, 0.5 equiv) in 1,4-dioxane (1 mL)을 23 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 14시간 동안 교반한 후, 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 2)로 정제하여 흰색 고체의 25' (70 mg, 76%)을 제조하였다.
[단계 4]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000076
에키노시스트산 어셉터 25' (55.7 mg, 0.0509 mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 a (66.2 mg, 0.0611 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 4 mL에 용해시켰다. 그 다음 반응액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 8 μL, 0.0611 mmol, 1.2 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 8시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexanes = 2:1)로 정제하여 흰색 고체의 26' (63 mg, 61%)을 제조하였다.
[단계 5]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000077
26' (47 mg, 0.0233 mmol, 1 equiv) in MeOH (5 mL) 용액에 클로로포름 5방울, K2CO3 (90 mg, 0.653 mmol, 28 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 5:1)로 정제하여 흰색 가루의 비교예 5 화합물 (13.7 mg, 48%)을 제조하였다.
1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ 6.58 (s, 1H), 6.26 (s, 1H), 5.65 (s, 1H), 5.60 (t, J = 3.7 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.67 - 4.50 (m, 6H), 4.48 - 4.12 (m, 10H), 4.04 (tt, J = 16.1, 8.2 Hz, 7H), 3.69 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 14.3, 4.7 Hz, 1H), 3.51 - 3.43 (m, 1H), 3.35 (dd, J = 11.8, 4.6 Hz, 1H), 2.43 - 2.27 (m, 2H), 2.26 - 2.19 (m, 1H), 2.16 (s, 3H), 2.10 (dd, J = 13.7, 5.3 Hz, 1H), 2.02 - 1.94 (m, 1H), 1.93 - 1.80 (m, 3H), 1.76 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 1.68 (qd, J = 16.8, 14.3, 5.8 Hz, 3H), 1.48 (s, 3H), 1.45 - 1.40 (m, 1H), 1.35 (dd, J = 13.0, 4.6 Hz, 2H), 1.32 (s, 3H), 1.30 - 1.16 (m, 4H), 1.13 (s, 3H), 1.00 (d, J = 3.2 Hz, 9H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
13C NMR (151 MHz, Pyridine-d5) δ 174.9, 170.3, 142.9, 107.3, 106.7, 106.4, 101.4, 94.1, 89.2, 87.4, 83.9, 79.2, 78.7, 78.6, 77.1, 76.2, 75.8, 75.8, 75.3, 73.1, 72.3, 72.2, 71.4, 69.4, 69.0, 68.9, 67.7, 67.3, 65.6, 63.5, 62.5, 56.2, 48.7, 47.4, 46.9, 41.9, 41.1, 40.4, 39.9, 39.1, 37.3, 35.8, 33.8, 33.7, 33.1, 31.9, 31.1, 28.6, 27.1, 27.0, 24.8, 24.1, 22.3, 18., 18.74, 17.9, 17.4, 16.0.
<비교예 6>
[단계 1]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000078
티오닐 클로라이드 (SOCl2, 14 μL, 0.197 mmol, 2 equiv)를 13' (115 mg, 0.0987 mmol, 1 equiv) 및 피리딘 (80 μL, 0.987 mmol, 10 equiv) in dichloromethane (5 mL)의 빙냉 용액에 적가하였다. 3시간 후, 대부분의 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 2 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 6)로 정제하여 아실 클로라이드 중간체를 제조하였다. 고체 테트라뷰틸암모늄 보로하이드라이드 (Bu4NBH4, 44.3 mg, 0.172 mmol, 2 equiv)를 아실 클로라이드 중간체 (102 mg, 0.0861 mmol, 1 equiv) in dichloromethane (3 mL)의 빙냉 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 3시간 동안 교반한 후, 중탄산 소듐 포화용액 (3 mL)으로 희석하였다. 수성 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 무수 황산소듐으로 건조한 후 감압 농축하였다. 생성된 미정제 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 3 cm, ht. 7 cm; eluent: ethyl acetate : hexanes = 1 : 2)로 정제하여 흰색 고체의 27' (80 mg, 70%)을 제조하였다.
[단계 2]
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000079
에키노시스트산 어셉터 27' (32.8 mg, 0.0285 mmol, 1 equiv) 및 퍼아세틸로 보호된 이미데이트 도너 a (37 mg, 0.0342 mmol, 1.2 equiv)를 톨루엔으로 물을 공비 제거하여 건조시켰다. 그 다음 4 Å의 분자체(molecular sieves)를 이용하여 디클로로메탄 3 mL에 용해시켰다. 그 다음 반응액에 보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (BF3·OEt2, 5 μL, 0.0285 mmol, 1.0 equiv)를 -78 ℃에서 첨가한 후, -78 ℃에서 9시간 동안 교반한 후 트리에틸아민으로 퀜칭하였다. 이어서 용액을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (silica gel: diam. 2 cm, ht. 9 cm; eluent: ethyl acetate/hexanes = 2:1)로 정제하여 중간체를 제조하였다. 중간체에 클로로포름 5방울, 3.0 mL MeOH, and K2CO3 (13.9 mg, 0.100 mmol, 26 equiv)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 23 ℃에서 밤새 교반한 후, 과량의 시약을 Dowex 50W으로 퀜칭하였다. Dowex를 여과를 통해 제거한 후 여액을 진공 농축하였다. 잔류물을 역상 실리카겔 크로마토그래피 (MeOH/H2O, 4:1)로 정제하여 흰색 가루의 비교예 6 화합물 (2.0 mg, 6%)을 제조하였다.
1H NMR (900 MHz, Methanol-d4) δ 5.26 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 5.24 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.00 - 3.96 (m, 1H), 3.91 (ddd, J = 11.5, 5.4, 2.6 Hz, 2H), 3.88 (dd, J = 3.4, 1.8 Hz, 1H), 3.87 - 3.80 (m, 3H), 3.77 - 3.70 (m, 3H), 3.68 - 3.64 (m, 2H), 3.59 - 3.55 (m, 2H), 3.52 - 3.45 (m, 3H), 3.43 (dd, J = 9.1, 7.7 Hz, 1H), 3.40 (d, J = 0.6 Hz, 1H), 3.35 - 3.32 (m, 3H), 3.30 - 3.21 (m, 6H), 3.21 - 3.17 (m, 2H), 2.24 (t, J = 13.4 Hz, 1H), 1.98 - 1.90 (m, 4H), 1.86 (dt, J = 14.3, 4.5 Hz, 2H), 1.77 (td, J = 12.8, 4.7 Hz, 2H), 1.73 - 1.68 (m, 2H), 1.67 - 1.63 (m, 2H), 1.58 (dd, J = 16.3, 12.4 Hz, 3H), 1.47 - 1.41 (m, 2H), 1.39 (s, 3H), 1.37 (dd, J = 14.9, 3.0 Hz, 2H), 1.29 (d, J = 5.8 Hz, 3H), 1.08 (s, 3H), 0.99 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.87 (d, J = 2.1 Hz, 6H).
13C NMR (226 MHz, Methanol-d4) δ 145.4, 123.7, 106.9, 106.6, 106.0, 103.7, 101.4, 91.0, 87.9, 84.4, 79.6, 78.5, 77.9, 75.9, 75.7, 75.3, 75.3, 75.0, 74.2, 72.5, 72.1, 71.9, 71.1, 69.9, 69.4, 68.7, 68.4, 67.3, 67.0, 66.1, 63.0, 57.3, 48.4, 44.4, 42.8, 41.2, 40.8, 40.4, 40.2, 38.0, 37.3, 35.0, 34.1, 33.6, 31.8, 30.9, 28.7, 27.6, 27.2, 25.3, 24.7, 19.7, 19.6, 18.3, 17.8, 17.3, 16.5.
상기 비교예 1 내지 비교예 6의 화합물을 하기 표 2에 정리하였다.
비교예
No.		 화학식
1
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000080
2
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000081
3
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000082
4
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000083
5
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000084
6
Figure PCTKR2023008863-appb-img-000085
<실험예 1> pSARS-CoV-2의 ACE2 + 로의 진입 억제 효과 분석
pSARS-CoV-2의 ACE2+로의 진입 억제 효과를 분석하기 위하여, SARS-CoV-2 S-유사형 렌티바이러스(pHR-CMV-firefly luciferase, psPAX2 packing, 및 SARS-CoV-2 S 플라스미드가 포함된 pSARS-CoV-2)를 이용하였다. 초기 분석을 위해, ACE2를 발현하는 H1299 세포(ACE2+, 엔도솜 바이러스 진입을 위한 분석 시스템)을 사용하였다. 시험은 세포를 사포닌 유도체 및 pSARS-CoV-2 바이러스 입자를 함유하는 상등액으로 처리하고 24시간 배양한 후, pSARS-CoV-2 진입 효율을 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase) 활성을 측정하여 정량화했다 (표 3).
분석 결과, C3 당류가 없는 비교예 1 및 비교예 4는 그 활성이 낮았으며(IC50>10 μM), 이를 통해 바이러스의 세포 진입 억제에 C3-포도당이 필수적이라는 것을 확인할 수 있었다. 또한, C28 당류의 길이와 구성이 사포닌 유도체의 항바이러스 활성에 중요함을 확인할 수 있었다. C28에 사카라이드(saccharide) 모이어티가 없는 비교예 2 및 C28에 단일 아라비노스(arabinose) 모이어티가 있는 비교예 3은 pSARS-CoV-2 세포 진입에 대한 어떠한 현저한 억제를 나타내지 않았다 (IC50>10 μM). C28에 β-1,3-글리코시드 결합을 통해 연결된 자일로스 기반 이당류가 있는 실시예 1 및 C28에 β-1,3-글리코시드 결합을 통해 연결된 자일로스 기반 사당류가 있는 실시예 3은 각각 7.59 μM 및 8.84 μM의 IC50으로 바이러스 진입 억제 효과를 나타냈다. C3에 글루코스 및 C28에 4당류 (화합물 6)를 연결함으로써 합성된 사포닌 유도체 실시예 2는 플라티코딘 D에 필적하는 바이러스 진입 억제 효과 (IC50: 1.33 μM)를 나타냈다.
C3 및 C28 모두가 글리코실화 되고, C16이 아세틸화된 비교예 5는 pSARS-CoV-2 세포 진입에 영향을 미치지 않았다. 반면 C16에 아세틸 그룹이 해제된 실시예 5는 0.64 μM의 IC50으로, pSARS-CoV-2에 의한 세포 감염을 억제했다. 실시예 6은 pSARS-CoV-2 세포 진입에 대해 0.65 μM의 IC50을 보여주었으며, C28 에스테르 잔기를 에테르 그룹으로 환원시킨 비교예 6은 급격한 구조적 왜곡으로 인해 억제 효과가 나타나지 않았다.
IC50 in ACE2+ (μM)
플라티코딘 D 1.03
실시예 1 7.59
실시예 2 1.33
실시예 3 8.84
실시예 4 3.86
실시예 5 0.68
실시예 6 0.65
비교예 1 > 10
비교예 2 > 10
비교예 3 > 10
비교예 4 > 10
비교예 5 > 10
비교예 6 > 10
<실험예 2> pSARS-CoV-2의 ACE/TMPRSS2 + 로의 진입 억제 효과 분석
ACE2+ 세포에서 pSARS-CoV-2에 대해 가장 강한 억제효과를 나타낸 실시예 5 및 실시예 6을 이용하여 ACE2 및 TMPRSS2(ACE2/TMRPSS2+)를 모두 과발현하는 H1299 세포를 사용하여 시험하였다. 그 결과 실시예 5 및 실시예 6 모두 각각 0.65 μM와 0.61 μM의 IC50으로 pSARS-CoV-2의 ACE2/TMRPSS2+ 진입을 억제했다 (도 1). 이는 플라티코딘 D (IC50: 1.34 μM) 보다 약 2배 더 높은 항바이러스 효율이었다. 이를 통해 실시예 5 및 실싱예 6이 코로나바이러스의 엔도솜 및 TMPRSS2 매개 세포 표면 진입 경로를 모두 차단하는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 세포 융합 억제 효과 분석
GFP 표지된 S 단백질(Spike-HEK293T)을 과발현하는 HEK293T 세포와 mRuby 표지된 ACE2/TMPRSS2+(ACE2/TMPRSS2+-H1299)를 발현하는 H1299로 구성된 세포 융합 분석법을 통해 두 세포주 사이의 직접적인 세포간 융합과, 실시예 화합물에 의한 억제를 분석하였다. 타임랩스 현미경을 통해 Spike-HEK293T가 점차적으로 ACE2/TMPRSS2+-H1299에 가깝게 이동하며, 일단 접촉 상호작용이 시작되면, ACE2/TMPRSS2+-H1299와 빠르게 융합하는 것을 확인할 수 있었다. 융합된 세포는 표면에 S 단백질을 나타내었으며, 이웃 ACE2/TMPRSS2+-H1299 후속융합을 일으켰고 다핵 세포로 이어졌다(도 2).
mRUBY로 표지된 ACE2/TMPRSS2+-H1299를 각각 실시예 5 및 실시예 6과 반응시킨 결과(도 3) 세포간 융합이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 반면 비교예 2를 전처리한 경우에는 세포 융합을 억제하는 효과를 확인할 수 없었다.
다음으로 이종 세포 융합체를 정량적 측정을 위해 Spike-HEK293T (1x104 cells)와 ACE2/TMPRSS2+-H1299 (2x105 cells)를 1시간 동안 반응시킨 후 유세포 분석기로 분석하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과 대부분의 GFP-양성 Spike-HEK293T가 mRuby2-양성 ACE2/TMPRSS2+-H1299와 융합되어 약 4%의 이중 양성 하이브리드 세포를 생성하는 것을 확인할 수 있었다. DMSO 또는 비교예 2를 사용한 시험은 세포 융합에 대한 어떠한 억제 효과를 나타내지 않았다. 그러나 실시예 5 및 실시예 6은 하이브리드 세포의 형성을 효과적으로 차단하는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> 바이러스 감염 억제 효과 분석
바이러스 감염 억제 효과를 분석하기 위하여, ACE2의 풍부한 발현을 보이지만 TMPRSS2의 발현이 부족한 원숭이 유래 Vero 세포에서 조상 SARS-CoV-2에 대한 실시예 5 및 실시예 6의 억제 효과를 시험하였다. 그 결과 실시예 5 및 실시예 6은 각각 1.04 μm 및 1.42 μm의 IC50으로 SARS-CoV-2 감염을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 5 및 실시예 6은 클로로퀸(Chloroquine)(IC50: 5.64 μm) 및 렘데시비르(Remdesivir)(IC50: 4.68 μm)보다 Vero 세포로의 조상 SARS-CoV-2 진입을 더 강력하게 억제하는 것으로 나타났다 (도 6).
한편 새롭게 등장한 SARS-CoV-2 변종은 S 단백질을 암호화하는 유전자에 돌연변이를 일으켜 ACE2에 대한 결합을 강화한다. 실시예 화합물이 SARS-CoV-2 변종에 대해 융합 억제 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 시험한 결과를 도 7에 나타내었다. 그 결과 실시예 6은 alpha (B.1.1.7_UK, IC50: 1.59 μm), beta (B.1.351_South Africa, IC50: 1.59 μm), gamma (P.1_Brazil, IC50: 1.46 μm), delta (B.1.617.2_India, IC50: 1.67 μm), 및 omicron (B.1.1.529_multiple countries, IC50: 1.45 μm)를 포함한 다양한 SARS-CoV-2 변종에 대한 Vero 세포의 감염을 효과적으로 억제하였다.
다음으로 SARS-CoV-2-NLuc 재조합 바이러스를 사용하여 ACE2와 TMPRSS2를 모두 과발현하는 A549-ACE2-TMPRSS2 세포에서 실시예 6에 의한 바이러스 진입 억제 효과를 분석하였다. 그 결과 실시예 6은 2.01 μm의 IC50으로 바이러스 진입을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (도 8).
이상, 일 구현예를 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 일 구현예의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것이 아니며, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000086
    상기 화학식 1에서,
    R1은 C6-20아릴기, C6-20아릴C1-5알킬기 또는
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000087
    이고;
    R2는 -H 또는 -OH이고; 및
    R3은 폴리사카라이드 유도체 그룹이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 C6-10아릴기, C6-10아릴C1-5알킬기 또는
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000088
    인, 사포닌 유도체 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 R1은
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000089
    인, 사포닌 유도체 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 R2는 -OH인, 사포닌 유도체 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 R3은,
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000090
    또는
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000091
    이고, 상기 a는 0 내지 20의 정수이고, 상기 b는 0 내지 20의 정수인, 사포닌 유도체 화합물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 a는 0 내지 5의 정수이고,
    상기 b는 0 내지 5의 정수인, 사포닌 유도체 화합물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 것인, 사포닌 유도체 화합물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000092
    상기 화학식 2에서,
    R1은 C6-20아릴기, C6-20아릴C1-5알킬기 또는
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000093
    이고;
    R2는 -H 또는 -OH이고; 및
    R3은 폴리사카라이드 유도체 그룹이다.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물은 하기 화합물 군에서 선택되는 어느 하나인, 사포닌 유도체 화합물:
    (1)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000094
    ;
    (2)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000095
    ;
    (3)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000096
    ;
    (4)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000097
    ;
    (5)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000098
    ; 및
    (6)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000099
    .
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000100
    상기 화학식 1에서,
    R1은 C6-20아릴기, C6-20아릴C1-5알킬기 또는
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000101
    이고;
    R2는 -H 또는 -OH이고; 및
    R3은 폴리사카라이드 유도체 그룹이다.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 R1은 C6-10아릴기, C6-10아릴C1-5알킬기 또는
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000102
    인, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 R1은
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000103
    인, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 R2는 -OH인, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 R3은,
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000104
    또는
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000105
    이고, 상기 a는 0 내지 20의 정수이고, 상기 b는 0 내지 20의 정수인, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 a는 0 내지 5의 정수이고,
    상기 b는 0 내지 5의 정수인, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 것인, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000106
    상기 화학식 2에서,
    R1은 C6-20아릴기, C6-20아릴C1-5알킬기 또는
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000107
    이고;
    R2는 -H 또는 -OH이고; 및
    R3은 폴리사카라이드 유도체 그룹이다.
  16. 제9항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 사포닌 유도체 화합물은 하기 화합물 군에서 선택되는 어느 하나인, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (1)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000108
    ;
    (2)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000109
    ;
    (3)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000110
    ;
    (4)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000111
    ;
    (5)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000112
    ; 및
    (6)
    Figure PCTKR2023008863-appb-img-000113
    .
  17. 제9항에 있어서,
    상기 코로나바이러스는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2)인, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제1항에 따른 사포닌 유도체 화합물을 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  19. 제1항에 따른 사포닌 유도체 화합물을 포함하는 코로나바이러스의 세포 진입 억제용 조성물.
PCT/KR2023/008863 2022-06-26 2023-06-26 사포닌 유도체 화합물 및 이를 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Ceased WO2024005485A1 (ko)

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