WO2024005045A1 - ヘアピン核酸組成物 - Google Patents

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WO2024005045A1
WO2024005045A1 PCT/JP2023/023904 JP2023023904W WO2024005045A1 WO 2024005045 A1 WO2024005045 A1 WO 2024005045A1 JP 2023023904 W JP2023023904 W JP 2023023904W WO 2024005045 A1 WO2024005045 A1 WO 2024005045A1
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nucleic acid
hairpin
hairpin nucleic
protein
bases
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PCT/JP2023/023904
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晃充 岡本
邦彦 森廣
壮秀 安田
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国立大学法人東京大学
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to hairpin nucleic acid compositions, and protein capture compositions, protein function inhibiting compositions, and pharmaceutical compositions containing the same.
  • Nucleic acid drugs are molecular target therapeutic drugs based on nucleic acid molecules that specifically bind to target nucleic acids or proteins and suppress their functions. Nucleic acid medicines are attracting attention as new medicines for diseases that were previously difficult to treat, and in fact, in the 2010s, technological new drugs targeting the liver such as Givlaari were born in Japan and overseas. (Non-patent Document 1). However, practical application of nucleic acid drugs, especially for cancer, has not yet been achieved.
  • Nucleic acid drugs that have been marketed to date have mainly been antisense nucleic acids and siRNAs that inhibit the translation and splicing process by hybridizing sequence-specifically to target mRNAs.
  • siRNAs that inhibit the translation and splicing process by hybridizing sequence-specifically to target mRNAs.
  • research on aptamers and decoy nucleic acids that target proteins has been vigorously pursued.
  • decoy nucleic acids are promising nucleic acid molecules as anticancer drugs. Decoy nucleic acids are particularly promising because they can also act on nucleic acid binding proteins such as transcription factors. Many of these nucleic acid-binding proteins regulate the expression of various genes in a single molecule, making them promising therapeutic targets; however, they often lack sites to which low-molecular-weight compounds can bind, making drug discovery difficult. It's also a difficult target.
  • the use of decoy nucleic acids which are nucleic acid medicines, makes it possible to capture and/or inactivate these proteins, potentially enabling treatments that are not possible with low-molecular-weight medicines.
  • decoy nucleic acids have low cell selectivity, have high off-target effects, and are likely to exhibit side effects on normal cells. Furthermore, if the dosage is set low in order to keep these side effects constant, sufficient medicinal efficacy will not be obtained.
  • nucleic acid drugs that strongly act on nucleic acid binding proteins such as transcription factors only in target cells with high specificity.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid drug that can cell-specifically capture and/or inactivate nucleic acid binding proteins that are difficult to develop.
  • the present inventors have succeeded in generating and amplifying a decoy nucleic acid specifically for cancer cells using a hairpin nucleic acid having a protein binding motif of a transcription factor. It has become clear that based on this, sufficient medicinal efficacy can be obtained in a cell-specific manner.
  • the present invention is based on the new findings and provides the following.
  • a hairpin nucleic acid composition comprising an initiation hairpin nucleic acid and a paired hairpin nucleic acid, wherein the initiation hairpin nucleic acid is capable of hybridizing with a target RNA, and the paired hairpin nucleic acid is capable of hybridizing with the initiation hairpin nucleic acid. wherein the initiating hairpin nucleic acid and the pairing hairpin nucleic acid both contain a portion of a double-stranded protein binding motif, and the hybridization forms a double-stranded nucleic acid structure containing the protein binding motif.
  • the hairpin nucleic acid composition comprising an initiation hairpin nucleic acid and a paired hairpin nucleic acid, wherein the initiation hairpin nucleic acid is capable of hybridizing with a target RNA, and the paired hairpin nucleic acid is capable of hybridizing with the initiation hairpin nucleic acid. wherein the initiating hairpin nucleic acid and the pairing hairpin nucleic acid both contain a portion of a double-strand
  • the starting hairpin nucleic acid includes a target RNA-binding domain that hybridizes with a target RNA, and a paired hairpin binding domain that hybridizes with the paired hairpin nucleic acid, and the paired hairpin nucleic acid includes the paired hairpin binding domain.
  • the hairpin nucleic acid composition according to [1] wherein the target RNA binding domain and the paired hairpin binding domain include all or part of the protruding region.
  • [7] The hairpin nucleic acid composition according to any one of [1] to [6], wherein the starting hairpin nucleic acid and the paired hairpin nucleic acid are included in a vector.
  • a pharmaceutical composition comprising the hairpin nucleic acid composition according to any one of [1] to [7].
  • [11] The pharmaceutical composition according to [10] for preventing or treating a disease selected from the group consisting of cancer, immune system disease, inflammatory disease, and neurodegenerative disease.
  • a double-stranded nucleic acid structure containing a protein binding motif can be formed in cells expressing target RNA.
  • a protein of interest can be captured in cells expressing target RNA.
  • the function of the target protein can be inhibited in cells expressing the target RNA.
  • composition of the present invention it is possible to obtain an effect based on the capture of the target protein at the target site.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a typical structure of the hairpin nucleic acid of the present invention.
  • A shows the structure of a set of an initiating hairpin nucleic acid ((I)) with an overhanging 5' end and a pairing hairpin nucleic acid ((II)) with an overhanging 5' end.
  • B shows the structure of a set of an initiating hairpin nucleic acid ((I)) with an overhanging 3' end and a pairing hairpin nucleic acid ((II)) with an overhanging 3' end.
  • X indicates a protruding region
  • Y and Y' indicate a stem region
  • Z indicates a loop region
  • a thin vertical line indicates that two nucleic acid strands are hybridized.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the outline of the double-stranded nucleic acid structure forming reaction of the present invention.
  • X indicates a protruding region
  • Y and Y' indicate a stem region
  • Z indicates a loop region
  • a thin vertical line indicates that two nucleic acid strands are hybridized.
  • FIG. 2 is a diagram showing the secondary structure of the hairpin nucleic acid of the present invention designed in Example 2.
  • Figure 3A shows the starting hairpin nucleic acid (HP1) and
  • Figure 3B shows the pairing hairpin nucleic acid (HP2).
  • double-headed arrows indicate the position of part of the NF- ⁇ B binding motif possessed by each hairpin nucleic acid.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the outline of the double-stranded nucleic acid structure forming reaction of the present invention.
  • X indicates a protruding region
  • Y and Y' indicate a stem region
  • Z indicates a loop region
  • FIG. 2 is a diagram showing that a double-stranded nucleic acid structure was formed by the hairpin nucleic acid of the present invention in the presence of miR-21.
  • “HP1” indicates the starting hairpin nucleic acid
  • “HP2” indicates the paired hairpin nucleic acid
  • "-" indicates that the molecule was not added
  • “+” indicates that the molecule was added.
  • “dimer” refers to a formed double-stranded nucleic acid structure.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of a gel shift method for confirming the binding of NF- ⁇ B to the hairpin nucleic acid of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in fluorescence intensity when a hairpin nucleic acid is introduced into HEK293T cells that hardly express miR-21.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes in fluorescence intensity when a hairpin nucleic acid is introduced into A549 cells expressing miR-21.
  • HP1 (Quencher) indicates HP1 modified with the quenching molecule Dabcyl
  • HP2 (Fluorophore) indicates HP2 modified with the fluorescent molecule FAM.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes in NF- ⁇ B activity when a hairpin nucleic acid is introduced into MRC-5 cells that hardly express miR-21.
  • HP1+HP2 indicates that both HP1 and HP2 have been introduced.
  • “-” indicates that they were not introduced, and “+” indicates that they were introduced.
  • error bars indicate standard deviation, and "ns” indicates that there was no significant difference.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes in NF- ⁇ B activity when a hairpin nucleic acid is introduced into A549 cells expressing miR-21.
  • FIG. 3 is a diagram showing the percentage of cells in the G1 phase when a decoy nucleic acid or a hairpin nucleic acid for E2F is introduced into MDA-MB-231 cells.
  • the range surrounded by vertical lines indicates the range of the amount of nucleic acid in cells remaining in the G1 phase, and the value shown in % indicates the percentage of cells in the G1 phase.
  • a first aspect of the invention is a hairpin nucleic acid composition comprising an initiating hairpin nucleic acid and a pairing hairpin nucleic acid capable of forming a double-stranded nucleic acid structure comprising a protein binding motif.
  • the hairpin nucleic acid composition of the present invention can capture a nucleic acid-binding protein of interest (hereinafter simply referred to as "protein of interest”), and the protein-capturing composition of the present invention can capture protein functions. It can be an active ingredient in inhibitory compositions and pharmaceutical compositions.
  • hairpin nucleic acid refers to a single-stranded nucleic acid that can form a hairpin structure.
  • hairpin structure refers to a secondary structure of a nucleic acid that is formed by a single-stranded nucleic acid and includes one set of a stem structure Y, a loop structure Z, and a protruding region X.
  • Figures 1A and B show schematic diagrams of hairpin nucleic acids.
  • the hairpin nucleic acid herein includes a protrusion region X, a stem region Y, a loop region Z, and a stem region Y' in this order.
  • the term "5' end protruding type ((I) and (II) in FIG. 1A)” refers to a type of hairpin nucleic acid that includes a protruding region X at the 5' end.
  • the 5' end protruding hairpin nucleic acid includes a protruding region X, a stem region Y, a loop region Z, and a stem region Y' in order from the 5' end.
  • “3' end protruding type ((I) and (II) in FIG. 1B)” refers to a type of hairpin nucleic acid that includes a protruding region X at the 3' end.
  • the 3'-end protruding hairpin nucleic acid includes a stem region Y', a loop region Z, a stem region Y, and a protruding region X in order from the 5' end.
  • the “stem structure” is a structure in which two stem regions (Y and Y') containing base sequences that can hybridize with each other form a double strand.
  • a “loop structure” is a loop-like structure formed by a loop region (Z) made of a single-stranded nucleic acid.
  • protruding region (X) refers to a nucleic acid region that constitutes a protruding end, and recognizes a sequence complementary to the base sequence exposed in a single-stranded state.
  • the "overhanging end” refers to a single-stranded nucleic acid region adjacent to either or both of the free ends (ends not adjacent to loop region Z) of the stem region (Y or Y').
  • the length of the protruding region X is not particularly limited, but may be, for example, 5 to 15 bases. Specifically, for example, it is 5 or more bases, 6 or more bases, 9 or more bases, 10 or more bases, or 11 or more bases.
  • the protruding region X can be, for example, 15 bases or less, 14 bases or less, 13 bases or less, 12 bases or less, 11 bases or less, 10 bases or less, 9 bases or less, 8 bases or less, or 7 bases or less.
  • the overhanging region X is located at the end of the hairpin nucleic acid.
  • stem region (Y and Y') refers to a nucleic acid region that hybridizes with each other within a molecule to form a stem structure. At least both ends of each stem region consist of mutually complementary bases.
  • the length of each stem region is not particularly limited, but can be, for example, independently 10 to 20 bases. Specifically, for example, each base is independently 10 or more bases, 11 or more bases, 12 or more bases, 13 or more bases, or 14 or more bases. In addition, the length of each stem region should be independently, for example, 20 bases or less, 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, 16 bases or less, 15 bases or less, 14 bases or less, or 13 bases or less. Can be done.
  • “Stem region Y (Y)” refers to a stem region adjacent to protrusion region X. Further, “stem region Y' (Y')” refers to a stem region that is not adjacent to the protrusion region X.
  • the "loop region (Z)" refers to a nucleic acid region located between the two stem regions in a single-stranded structure.
  • the length of the loop region Z is not particularly limited, but can be, for example, 3 to 20 bases. Specifically, for example, 3 bases or more, 4 bases or more, 5 bases or more, 6 bases or more, 7 bases or more, 8 bases or more, 9 bases or more, 10 bases or more, 11 bases or more, 12 bases or more, 13 bases or more , 14 or more bases, or 15 or more bases.
  • the loop region Z can be, for example, 20 bases or less, 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, 16 bases or less, 15 bases or less, 14 bases or less, or 13 bases or less.
  • protein-binding motif refers to the smallest unit of a double-stranded sequence motif that is recognized by a nucleic acid-binding protein of interest.
  • herein refers to a double-stranded sequence motif to which a protein of interest can bind.
  • a protein binding motif to which a transcription factor binds is referred to herein as a "transcription factor binding motif.”
  • a part of a protein-binding motif refers to a sequence that includes at least a part of a protein-binding motif and that cannot be bound to a protein of interest. Examples of the part of the protein-binding motif include a base sequence containing addition, deletion, and/or substitution of bases, and/or modified nucleotides in at least one of the nucleic acid strands constituting the protein-binding motif.
  • double-stranded nucleic acid structure refers to a nucleic acid structure formed by an initiating hairpin nucleic acid and a paired hairpin nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid structure contains a (complete) protein binding motif and is capable of binding the protein of interest.
  • target RNA refers to RNA that serves as the starting point for the double-stranded nucleic acid structure forming reaction by the hairpin nucleic acid composition of the present invention.
  • the target RNA limits the conditions under which a double-stranded nucleic acid structure is formed by the hairpin nucleic acid composition of the invention.
  • the starting hairpin nucleic acid can specifically hybridize to the target RNA.
  • the type of target RNA is not particularly limited. Specifically, for example, mRNA (including, for example, mature mRNA, mRNA precursor, modified mRNA, etc.), non-coding RNA (ncRNA): microRNA (miRNA) and long non-coding RNA (lncRNA) ), and natural antisense RNA.
  • the target RNA herein is mRNA or miRNA.
  • miR-21 refers to miRNA having a full-length base sequence of 22 bases as shown in SEQ ID NO: 1, and its variants, homologs, modifications, and derivatives.
  • the expression of miR-21 is known to be increased in many cancers, and it is known to be involved in cell proliferation, cell death, DNA damage response, etc.
  • Hybridize or “hybridizable” refers to polynucleotides having mutually complementary base sequences base pairing to form a fully or partially complementary double strand.
  • “Complementary” refers to a relationship in which nucleic acid bases can form base pairs with each other via hydrogen bonds. This corresponds to so-called Watson-Crick base pairs (natural base pairs) or Hoogsteen type base pairs.
  • vector refers to a delivery means that contains a nucleotide fragment of interest and transfers the nucleotide fragment into a host in order to integrate it into the host's DNA or to propagate or express it within the host.
  • main vectors include plasmid vectors and virus vectors.
  • Vectors herein further include any other material capable of carrying a nucleic acid molecule and delivering it to a host, such as liposomes, exosomes and nanoparticles.
  • expression vector refers to a vector that contains a nucleotide fragment of interest in an expressible state.
  • the term "state capable of expression” refers to a state in which the desired nucleotide fragment is expressed from the vector within the host if the conditions are right. Specifically, it means that the nucleotide fragment of interest is placed under the control of a promoter within an expression vector.
  • Capturing refers to trapping a substance on or inside another substance. In particular, as used herein, it refers to keeping the protein of interest bound to a protein binding motif.
  • protein function inhibition refers to inhibiting the function that the protein can originally perform.
  • the degree of inhibition and the method of inhibition are not particularly limited.
  • immune system disease refers to a disease characterized by an abnormality of the immune system. Specific examples include autoimmune diseases and inflammatory diseases.
  • Autoimmune disease refers to a disease that causes an immune response to self-antigens. Specifically, for example, Hashimoto's thyroiditis, Graves' disease, lupus, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, hemolytic anemia, systemic lupus erythematosus, celiac disease, Crohn's disease, colitis, type I diabetes, scleroderma, psoriasis. etc.
  • Inflammatory disease refers to a disease characterized by high levels of inflammation or degeneration in tissue. Inflammatory diseases as used herein include both chronic inflammatory diseases and acute inflammatory diseases. Specifically, for example, celiac disease, vasculitis, lupus, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), irritable bowel syndrome, atherosclerosis, arthritis, ankylosing spondylitis, Crohn's disease, colitis, hepatitis. (eg, viral hepatitis such as chronic active hepatitis and non-viral hepatitis), dermatitis, psoriasis, etc.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • neurodegenerative disease refers to a disease in which the structure of nerve tissue degenerates over time. Specifically, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease, macular degeneration, multiple sclerosis, muscular dystrophy, Niemann-Pick disease, osteoporosis, rheumatoid arthritis, etc. can be mentioned. Many of these are induced by the accumulation of specific proteins.
  • Statistically significant means that there is a significant difference between the measured value of the test subject and the control value when the difference is statistically processed. For example, if the risk ratio (significance level) of the obtained value is small, specifically if it is smaller than 5% (p ⁇ 0.05), if it is smaller than 1% (p ⁇ 0.01), if it is smaller than 0.1% (p ⁇ 0.001).
  • the "p (value)” shown here indicates the probability that the test statistic happens to be that value in the distribution based on the null hypothesis. Therefore, the smaller "p” is, the lower the probability that the test statistic will be that value, meaning that the null hypothesis is more likely to be rejected.
  • the testing method for statistical processing is not particularly limited, and any known testing method that can determine the presence or absence of significance may be used as appropriate. For example, Student's t-test method, covariate analysis of variance, etc. can be used.
  • the hairpin nucleic acid compositions of the present invention include an initiating hairpin nucleic acid and a pairing hairpin nucleic acid capable of forming a double-stranded nucleic acid structure containing a protein binding motif, each hairpin nucleic acid containing a portion of the protein binding motif.
  • the hairpin nucleic acid composition of the present invention forms a double-stranded nucleic acid structure in the presence of target RNA
  • the target RNA binds to the target RNA binding domain of the starting hairpin nucleic acid
  • the hairpin structure (particularly the stem structure) of the starting hairpin nucleic acid is cleaved ("step 1" in FIG. 2).
  • the paired hairpin binding domain of the starting hairpin nucleic acid is then exposed as a single-stranded structure, allowing the starting hairpin binding domain of the paired hairpin nucleic acid to hybridize.
  • the hairpin structure (particularly the stem structure) of the paired hairpin nucleic acid is cleaved ("step 2" in FIG. 2).
  • the target RNA is sandwiched between the target RNA domain of the paired hairpin nucleic acid that can hybridize with each other and the target RNA binding domain of the starting hairpin nucleic acid.
  • the target RNA gradually dissociates from the starting hairpin nucleic acid ("step 3" in FIG. 2).
  • a double-stranded nucleic acid structure is formed by the starting hairpin nucleic acid and the paired hairpin nucleic acid, and the target RNA becomes free again. Since the released target RNA repeatedly mediates the above-mentioned double-stranded nucleic acid structure formation reaction as a catalyst, double-stranded nucleic acid structures are formed one after another (steps 1 to 3 in FIG. 2). Since the formed double-stranded nucleic acid structure has a double-stranded protein-binding motif, if the target nucleic acid-binding protein is present, the target protein binds to the double-stranded nucleic acid structure.
  • initiating hairpin nucleic acid is a hairpin nucleic acid that is capable of hybridizing with target RNA and includes a portion of a double-stranded protein binding motif.
  • the starting hairpin nucleic acid includes a target RNA binding domain and a paired hairpin binding domain (FIG. 2).
  • Target RNA binding domain refers to the nucleic acid region in the starting hairpin nucleic acid that hybridizes with the target RNA.
  • the target RNA binding domain includes all or part of the protruding region X.
  • the target RNA binding domain includes all or part of protruding region X and the following all or part of stem region Y (FIG. 2).
  • the target RNA binding domain is capable of hybridizing with all or part of the target RNA, and the base sequence of this domain is complementary to the target RNA at least at both ends of the domain.
  • “Paired hairpin binding domain” refers to a nucleic acid region that hybridizes with a paired hairpin nucleic acid in a starting hairpin nucleic acid. In particular, it refers to a region of nucleic acid that hybridizes to a paired hairpin nucleic acid while the initiating hairpin nucleic acid hybridizes to a target RNA. Therefore, there are no bases that belong to both domains redundantly.
  • the paired hairpin binding domain comprises all or part of the stem region Y' ( Figure 2).
  • the paired hairpin binding domain is capable of hybridizing with the starting hairpin binding domain of the paired hairpin nucleic acid, and the base sequences of both domains are complementary to each other at least at both ends of each domain.
  • the starting hairpin nucleic acid can contain one or more bases in addition to the target RNA binding domain and the paired hairpin binding domain. These bases can be used in the starting hairpin nucleic acid, for example, as spacer sequences between the target RNA binding domain and the paired hairpin binding domain, and as terminal sequences linked to the free ends of the target RNA binding domain and/or the paired hairpin binding domain. can exist as
  • the starting hairpin nucleic acid and the paired hairpin nucleic acid have base sequences capable of forming a hairpin structure including the protruding region X
  • the starting hairpin nucleic acid includes a base sequence that cannot hybridize with the paired hairpin nucleic acid. included.
  • the position of such a base sequence is not particularly limited as it varies depending on the design of the hairpin nucleic acid, it is located, for example, in the protruding region X and/or stem region Y' of the starting hairpin nucleic acid.
  • hybridization can be determined using a method known in the art. For example, it can be determined based on base identity.
  • a second nucleic acid having a base sequence that has a certain level of base identity or more with a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the first nucleic acid is capable of hybridizing with the first nucleic acid.
  • hybridization occurs when the base identity is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%. It is possible.
  • base identity refers to aligning the base sequences of two polynucleotides and, if necessary, introducing a gap in one of the base sequences to achieve the highest degree of base identity between the two. It refers to the ratio (%) of identical bases in one polynucleotide to the total number of bases in the other polynucleotide. The percent identity was determined using a known program such as the homology search program BLAST (Basic local alignment search tool; Altschul, S. F. et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990). Easy to determine. Additionally, a second nucleic acid that has a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the first nucleic acid and in which multiple bases are replaced with other bases is usually capable of hybridizing with the first nucleic acid. It is.
  • a plurality of objects refers to a number of 2 or more. Specifically, for example, 2 to 60 pieces, 2 to 45 pieces, 2 to 30 pieces, 2 to 14 pieces, 2 to 10 pieces, 2 to 8 pieces, 2 to 6 pieces, 2 to 5 pieces, 2 to 4 pieces Refers to one or two or three.
  • Hybridization conditions are not particularly limited, but may be various stringency conditions such as low stringency conditions and high stringency conditions.
  • Low stringency conditions means conditions under which nucleic acids are likely to hybridize.
  • Low stringency conditions refer to conditions of low temperature and high salt concentration in washing after hybridization. For example, post-hybridization washing is performed at 42°C to 50°C using a buffer containing, for example, 5x SSC and 0.1% SDS.
  • High stringency conditions refer to environmental conditions that are unlikely to cause non-specific hybridization. Under highly stringent conditions, a nucleic acid having a target base sequence can form a hybrid, but a nucleic acid having a non-specific base sequence cannot substantially form a hybrid.
  • high stringency conditions refer to conditions with low salt concentration and high temperature.
  • the low salt concentration here specifically refers to, for example, 15-750mM, preferably 15-500mM, 15-300mM, or 15-200mM.
  • the high temperature mentioned here is specifically, for example, 50 to 68°C or 55 to 70°C.
  • Specific high stringency conditions include, for example, washing at 65°C with 0.1x SSC and 0.1% SDS.
  • 1x SSC contains 150mM sodium chloride and 15mM sodium citrate.
  • the hairpin structure of the starting hairpin nucleic acid is preferably cleaved to form a single-stranded structure in the presence of target RNA under physiological conditions in mammals. Whether or not a hairpin structure cleaves under physiological conditions can be confirmed using techniques known in the art. For example, judgments can be made using in vitro experimental systems using cell-free systems, cell systems, in vivo experimental systems, in silico analysis using the amount of free energy change in the hairpin structure formation reaction as an indicator, or a combination of these. Can be done. As specific in vitro experimental systems, in vivo experimental systems, and in silico analysis methods that can be used for determination, for example, the methods exemplified in the Examples of the present application may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • hairpin structure formation reaction refers to a reaction in which a single-stranded nucleic acid changes from a linear form to a hairpin form to form a hairpin structure.
  • the term "free energy change” refers to the net amount of energy supplied from the external environment to the reaction system through a certain reaction when temperature and pressure conditions are constant. Particularly relevant here is the net amount of energy supplied from the external environment in the hairpin structure formation reaction. For example, if the reaction product is thermodynamically more stable than the starting material, the free energy change will be negative because the reaction system loses energy through the reaction.
  • the amount of free energy change in the present invention includes, for example, both the Gibbs free energy change amount ( ⁇ G) and the Helmholtz free energy change amount ( ⁇ F).
  • the amount of free energy change in the hairpin structure formation reaction is not particularly limited. Generally, the lower the amount of free energy change in the hairpin structure formation reaction, the harder it is to cleave the hairpin structure, and the higher the amount, the easier it is to cleave the hairpin structure.
  • the amount of free energy change is, for example, -40 to -30 kcal/mol. Specifically, for example, it is -40 kcal/mol or more, -39 kcal/mol or more, -38 kcal/mol or more, -37.5 kcal/mol or more, -37 kcal/mol or more, or -36.5 kcal/mol or more.
  • the amount of free energy change is, for example, -30kcal/mol or less, -31kcal/mol or less, -32kcal/mol or less, -32.5kcal/mol or less, -33kcal/mol or less, -33.5kcal/mol or less, -34kcal /mol or less, -34.5kcal/mol or less, or -35kcal/mol or less.
  • the amount of free energy change can be determined using known software used to predict the stability of higher-order structure of nucleic acids, such as NUPAK.
  • Paired hairpin nucleic acid “Paired hairpin nucleic acid ( Figure 1 (II))” is a hairpin nucleic acid that is capable of hybridizing with the starting hairpin nucleic acid and includes a portion of a double-stranded protein binding motif. .
  • the paired hairpin nucleic acid includes an initiation hairpin binding domain and a target RNA domain (FIG. 2).
  • “Initiation hairpin binding domain” refers to a nucleic acid region in a paired hairpin nucleic acid that hybridizes with the paired hairpin binding domain of the initiation hairpin nucleic acid.
  • the initiation hairpin binding domain includes all or part of the overhanging region X.
  • the initiation hairpin binding domain comprises all or part of the protruding region followed by all or part of the stem region Y ( Figure 2).
  • the base sequences of the initiation hairpin binding domain and the paired hairpin binding domain of the initiation hairpin nucleic acid are complementary to each other at least at both ends of each domain.
  • Target RNA domain refers to a nucleic acid region in paired hairpin nucleic acids that has a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of the target RNA and can hybridize.
  • the target RNA domain includes all or part of the stem region Y' ( Figure 2).
  • the target RNA domain can hybridize with all or part of the target RNA binding domain of the starting hairpin nucleic acid, and the base sequences of both domains are complementary to each other at least at both ends of the target RNA domain.
  • the paired hairpin nucleic acid can contain one or more bases in addition to the initiation hairpin binding domain and the target RNA domain. These bases may be present in paired hairpin nucleic acids, for example, as spacer sequences between the initiation hairpin binding domain and the target RNA domain, and as terminal sequences linked to the free ends of the initiation hairpin binding domain and/or the target RNA domain. obtain.
  • both the starting hairpin nucleic acid and the paired hairpin nucleic acid usually have base sequences capable of forming a hairpin structure containing the protruding region Contains base sequences that cannot be grown into soybeans.
  • the position of such a base sequence is not particularly limited as it varies depending on the design of the hairpin nucleic acid, it is located, for example, in the stem region Y' of the paired hairpin nucleic acid.
  • both domains of the paired hairpin nucleic acid may have one or more overlapping bases.
  • each domain constituting the hairpin nucleic acid is not particularly limited. For example, 10 bases or more, 11 bases or more, 12 bases or more, 13 bases or more, 14 bases or more, 15 bases or more, 16 bases or more, 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more, 20 bases or more, 21 bases or more, or 22 bases or more. Further, each domain is, for example, 55 bases or less, 50 bases or less, 40 bases or less, 30 bases or less, 25 bases or less, 24 bases or less, or 23 bases or less.
  • each domain is not particularly limited as long as it contains a sequence that can hybridize to the nucleic acid to be hybridized.
  • each domain can include one or more bases that are unrelated to the sequence of the nucleic acid to which it is bound.
  • the manner in which the domains hybridize with each other is not particularly limited, but preferably, when the domains hybridize with each other, the other domains of each hairpin nucleic acid hybridize with each other.
  • the target RNA binding domain of the starting hairpin nucleic acid molecule and the target RNA domain of the paired hairpin nucleic acid molecule are They are arranged at positions where they can hybridize with each other. Therefore, the 3'-end domain of one hairpin nucleic acid and the 5'-end domain of the other hairpin nucleic acid are usually capable of hybridization.
  • the mode of hybridization between the starting hairpin nucleic acid and the target RNA is not particularly limited.
  • the base sequence of the hybridizable region is not particularly limited as long as it can hybridize with the target base sequence.
  • a specific hybridizable base sequence consists of, for example, the following sequence: (1) A base sequence that is completely complementary to the target sequence to be hybridized; (2) A base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted, or added to (1).
  • All or part of each domain may be capable of hybridizing to all or part of domains of multiple types of target RNA or multiple types of hairpin nucleic acids.
  • the target RNA-binding domain of the initiation hairpin nucleic acid and the initiation hairpin-binding domain of the paired hairpin nucleic acid preferably include all or part of the protruding region X. include.
  • these domains may be a continuous region including all or part of the protruding region It may be a continuous region including the entire stem region Y' and a part of the stem region Y'.
  • the sequence in the protruding region X that can hybridize with the target RNA or the paired hairpin binding domain is 4 or more bases, 5 or more bases, 6 or more bases, 7 or more bases, or 8 or more bases.
  • sequences in stem region Y that can hybridize with the target RNA or the paired hairpin binding domain include 2 bases or more, 3 bases or more, 4 bases or more, 5 bases or more, 6 bases or more, 7 bases or more, 8 bases or more. At least 9 bases, at least 10 bases, at least 11 bases, at least 12 bases, at least 13 bases, at least 14 bases, at least 15 bases, or at least 16 bases.
  • the paired hairpin binding domain of the starting hairpin nucleic acid and the target RNA domain of the paired hairpin nucleic acid preferably include all or part of the stem region Y'. including.
  • these domains may be continuous regions that include part of stem region Y, all of loop region Z, and all of stem region Y', or may be continuous regions that include only part of stem region Y'. It may be a region.
  • the hairpin nucleic acid has an overhanging end adjacent to the stem region Y', it may include all or part of the overhanging end.
  • the sequence in the stem region Y' that can hybridize with the initiation hairpin binding domain or the target RNA binding domain includes 4 or more bases, 5 or more bases, 6 or more bases, 7 or more bases, 8 or more bases, It is 9 or more bases, 10 or more bases, 11 or more bases, 12 or more bases, 13 or more bases, 14 or more bases, or 15 or more bases.
  • Double-stranded nucleic acid structure The hairpin nucleic acid of the present invention forms a double-stranded nucleic acid structure containing a protein binding motif in the presence of target RNA. Double-stranded nucleic acid structures can bind proteins of interest.
  • the specific structure of the double-stranded nucleic acid structure is not particularly limited as long as it contains a double-stranded protein-binding motif and can bind the protein of interest.
  • it may contain a plurality or types of protein-binding motifs, it may have a single-stranded portion, or it may form an arbitrary three-dimensional structure such as a branched structure.
  • the length of the double-stranded nucleic acid structure is not particularly limited as long as it includes a complete protein binding motif.
  • the length of the double-stranded nucleic acid structure may be longer than the length of the protein-binding motif.
  • the length of the double-stranded nucleic acid structure may be 1 base pair or more, 2 base pairs or more, or 3 base pairs longer than the length of the protein-binding motif.
  • base pairs or more 5 base pairs or more, 6 base pairs or more, 7 base pairs or more, 8 base pairs or more, 9 base pairs or more, 10 base pairs or more, 11 base pairs or more, 12 base pairs or more, 13 base pairs 14 base pairs or more, 15 base pairs or more, 16 base pairs or more, 17 base pairs or more, 18 base pairs or more, 19 base pairs or more, 20 base pairs or more, 21 base pairs or more, 22 base pairs or more, 23 base pairs It is sufficient that the length is 24 base pairs or more or 25 base pairs or more.
  • the length of the single-stranded portion in the double-stranded nucleic acid structure is not particularly limited.
  • the total number of bases in the single-stranded portion is 3 to 25 bases, 4 to 24 bases, 5 to 23 bases, 6 to 20 bases, 7 to 20 bases, 8 to 15 bases, 9 to It can be 15 bases, 10-15 bases, 8-14 bases, 9-14 bases, 10-14 bases, 8-13 bases, 9-13 bases, and 10-13 bases.
  • the number of bases in the stem region of the paired hairpin nucleic acid that pairs with the stem region of the starting hairpin nucleic acid during formation of the double-stranded nucleic acid structure is not particularly limited. For example, 10 base pairs or less, 9 base pairs or less, 8 base pairs or less, 7 base pairs or less, 6 base pairs or less, 5 base pairs or less, 4 base pairs or less, 3 base pairs or less, 2 base pairs or less, 1 base pair It can be as follows.
  • Both the initiating hairpin nucleic acid and the pairing hairpin nucleic acid contain a portion of a double-stranded protein binding motif to which the protein of interest can bind. In other words, both hairpin nucleic acids do not contain a protein binding motif in a state in which the protein of interest can bind.
  • a part of the protein-binding motif contained in the hairpin nucleic acid includes additions, deletions, and/or substitutions of bases, and/or non-natural nucleotides and/or modified nucleotides in at least one nucleic acid strand constituting the protein-binding motif.
  • a portion of the protein binding motif in each hairpin nucleic acid includes a single-stranded portion.
  • the single-stranded portion in this case is not particularly limited, but includes, for example, all or part of the protrusion region X and/or loop region Z.
  • one or both nucleic acid strands may form a bulge structure due to the formation of non-complementary base pairs as a result of addition, deletion, and/or substitution of bases in one nucleic acid strand.
  • the portion is treated as a single-stranded portion herein.
  • the specific length of the single-stranded portion of the part of the protein-binding motif in each hairpin nucleic acid is not particularly limited.
  • it can be 1 or more bases, 2 or more bases, 3 or more bases, 4 or more bases, 5 or more bases, 6 or more bases, 7 or more bases, 8 or more bases, or 9 or more bases.
  • one of the nucleic acid strands constituting the protein-binding motif may include a non-natural nucleotide and/or a modified nucleotide.
  • the types of non-natural nucleotides and modified nucleotides in this case are not particularly limited as long as their presence prevents binding to the protein of interest.
  • Such non-natural nucleotides and modified nucleotides include nucleotides containing modified bases and/or modified sugars, nucleoside mimetics, and the like. Specific examples include nucleotides having a 2'-OMe group, bicyclic nucleosides, and the like.
  • the hairpin nucleic acid of the present invention preferably includes a single-stranded portion of the protein-binding motif, or a modified nucleotide in one of the nucleic acid strands constituting the protein-binding motif.
  • the starting hairpin nucleic acid and/or the pairing hairpin nucleic acid include a portion of a protein binding motif that includes a single-stranded portion.
  • the hairpin nucleic acid of the present invention preferably does not contain unnatural nucleotides or modified nucleotides in the sequence constituting the protein binding motif in the double-stranded nucleic acid structure.
  • unnatural nucleotides or modified nucleotides in the sequence constituting the protein binding motif in the double-stranded nucleic acid structure.
  • base additions, deletions and/or substitutions, and/or non-natural nucleotides and/or modified nucleotides may be present in the stem region Y' It is preferable that the partial region of the protein binding motif contained in the stem region Y contains them, and the partial region of the protein binding motif contained in the stem region Y does not contain them.
  • each hairpin nucleic acid preferably contains the full-length sequence of at least one of the nucleic acid strands constituting the protein-binding motif.
  • the double-stranded nucleic acid structure formed as a result of hybridization of the starting hairpin nucleic acid and the paired hairpin nucleic acid contains a protein binding motif consisting of double strands to which the protein of interest can bind.
  • the protein binding motif formed here includes the minimum unit of the recognition sequence of the protein of interest.
  • the minimum unit sequence of the recognition sequence of a nucleic acid binding protein and the protein that binds thereto can be determined by known methods. For example, known databases such as Transfac, WordSpy, T-Reg Comparator, MOTIF, TFBIND, TFSEACH, and JASPAR can be used. It can also be determined based on experiments using DNA footprinting, gel mobility shift assays, or other known methods, and/or predicted based on known consensus sequence motifs.
  • a protein binding motif in a double-stranded nucleic acid structure has one nucleic acid strand derived from the starting hairpin nucleic acid and the other nucleic acid strand derived from the paired hairpin nucleic acid.
  • the specific sequence and structure of the protein-binding motif in this double-stranded nucleic acid structure is not particularly limited as long as it can bind to the protein of interest.
  • a protein binding motif in a double-stranded nucleic acid structure may or may not include non-natural and/or modified nucleotides, but preferably does not contain non-natural or modified nucleotides.
  • the protein binding motif of the double-stranded nucleic acid structure does not include nucleotides containing modified bases or modified sugars, or nucleoside mimetics.
  • the number of protein binding motifs contained in the double-stranded nucleic acid structure may be one, or may be multiple and/or multiple types. When a plurality of motifs are included, their types are not particularly limited. For example, the multiple sequence motifs may all be the same sequence motif or may include multiple types of sequence motifs. The number of proteins that bind to each sequence motif is not particularly limited. For example, a sequence motif to which one or more proteins can bind can be used.
  • the type of protein to be bound is not particularly limited. Any protein can be used as long as it can bind to a nucleic acid molecule, and examples thereof include transcription factors and polymerases.
  • the protein is preferably a transcription factor.
  • the protein binding motif includes a transcription factor binding motif.
  • the protein may be, for example, a protein involved in a particular disease. Specifically, for example, the proteins include inflammation-related factors, cell cycle-related factors, drug resistance-related factors, and the like.
  • inflammation-related factors refer to proteins that are affected during inflammation. Inflammation-related factors herein include both pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors. Specific inflammation-related factors include, for example, various interleukins (including, for example, IL-1, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , etc.), NF- ⁇ B family proteins, STAT family proteins, HIF proteins, etc. . Inflammation-related factors herein include, for example, proteins known to be associated with diseases such as cancer and immune system diseases.
  • NF- ⁇ B family proteins are transcription factors that are activated by various intracellular and extracellular stimuli such as cytokines, bacteria, and viral products, and their abnormal expression is thought to be involved in many inflammatory diseases. ing. NF- ⁇ B family proteins include NF- ⁇ B1, NF- ⁇ B12, REL, RELA, RELB, etc. For example, an exemplary amino acid sequence of human NF- ⁇ B1 protein is shown in SEQ ID NO:2.
  • the protein binding motif recognized by NF- ⁇ B family proteins is a sequence motif composed of a double strand consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • cell cycle-related factors refer to proteins involved in the progression of the cell cycle.
  • Specific cell cycle-related factors include, for example, E2F family proteins (including, for example, IL-1, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , etc.), ORC family proteins, RB family proteins, and the like.
  • Cell cycle related factors herein include, for example, proteins known to be associated with diseases such as cancer and immune system diseases.
  • E2F family proteins are known as transcription factors involved in cell cycle control, DNA repair, and chromosome maintenance, and include a DNA-binding domain, a dimerization domain that determines the interaction with differentiation-regulating transcription factor protein (DP), It has protein domains with conserved amino acid sequences within the family, such as a transcriptional activation domain rich in acidic amino acids.
  • E2F family proteins E2F1 to E2F8.
  • an exemplary amino acid sequence for human E2F1 protein is shown in SEQ ID NO:5.
  • protein binding motifs recognized by E2F family proteins include 5'-TTT(C/G)(G/C)CGC-3' and 5'-GCG(G/C)(C/G)AAA-3 (In the sequence, (C/G) indicates that it can be either C or G.)
  • drug resistance-related factor refers to a protein that is involved in the function of increasing the resistance of diseased cells such as tumor cells to drugs.
  • the drug resistance-related factors herein include, for example, transcription factors that control the expression of multidrug resistance genes such as the ABC superfamily genes.
  • Specific drug resistance-related factors include, for example, NF-Y, Sp1, YB-1, AP-1, ZIC5, and the like. Recognition sequences for these transcription factors are known in the art.
  • the hairpin nucleic acid of the present invention does not form a complete protein-binding motif in the absence of target RNA, it is not affected by the hairpin nucleic acid of the present invention even if the protein of interest is expressed in the cell. Therefore, the expression mode of the protein that binds to the protein binding motif is not particularly limited.
  • a protein may be expressed systemically regardless of the timing or presence or absence of stimulation, or may be expressed conditionally.
  • Condition-specific expression includes, for example, tissue-specific, cell-specific, period-specific, or expression in response to stimuli such as extracellular signals.
  • the protein only needs to be able to bind to the sequence motif under specific conditions, and does not need to be able to stably bind under any conditions.
  • the protein of the present invention also includes a methylated CpG-binding protein that does not bind to a protein depending only on the sequence of a sequence motif, but can bind only when it contains a specific modification.
  • the conditions under which a protein can bind to a sequence motif may be met at the time of production and use of the hairpin nucleic acid composition of the present invention, or may be met through an intracellular reaction.
  • Target RNA The starting hairpin nucleic acid is capable of hybridizing with the target RNA.
  • the target RNA serves as the starting point for the formation reaction of a double-stranded nucleic acid structure based on the hairpin nucleic acid of the present invention, and the hairpin nucleic acid composition of the present invention can specifically capture a protein of interest in cells expressing the target RNA. Therefore, the target RNA may be any RNA expressed in cells that capture the protein of interest. Furthermore, RNA that is not expressed in other cells, such as normal cells, can be suitably used. Preferably, it is RNA that is specifically expressed in cells that capture the protein of interest.
  • the expression mode of the target RNA is not particularly limited.
  • the target RNA may be expressed systemically regardless of the timing or presence or absence of stimulation, or may be expressed condition-specifically.
  • Condition-specific expression includes, for example, tissue-specific, cell-specific, period-specific, or expression in response to stimuli such as extracellular signals.
  • the target RNA include RNA that is expressed condition-specifically, particularly RNA that is expressed cell-specifically.
  • the cells in which the target RNA is expressed are not particularly limited. Specifically, for example, they are cancer cells, inflammatory cells, or immune cells. Inflammatory cells and immune cells in which the target RNA is expressed preferably exhibit abnormal activity.
  • abnormal activity refers to activity that is markedly or significantly suppressed or promoted compared to activity in normal cells.
  • the term "highly expressed" for a specific gene refers to a markedly or significantly increased expression level compared to the expression level in normal cells.
  • immune cells refer to cells involved in immunity. Specific examples include lymphocytes, macrophages, and dendritic cells. Examples of lymphocytes include T cells, B cells, NK cells, and plasma cells. Immune cells herein are preferably cells that have abnormal activity in immune system diseases.
  • inflammatory cells refer to cells involved in inflammatory reactions. Specific examples include eosinophils, neutrophils, basophils, mast cells, and type II innate lymphocytes. Inflammatory cells herein are preferably cells that have abnormal activity in inflammatory diseases.
  • RNA is not particularly limited, for example, miR-21 and the like can be suitably used.
  • miR-21 refers to miRNA having a full-length base sequence of 22 bases as shown in SEQ ID NO: 1, and its variants, homologs, modifications, and derivatives.
  • the expression of miR-21 is known to be increased in many cancers, and it is known to be involved in cell proliferation, cell death, DNA damage response, etc.
  • the starting hairpin nucleic acid and the paired hairpin nucleic acid contained in the hairpin nucleic acid composition of the present invention may be of either a 5' end protruding type or a 3' end protruding type, but preferably the starting hairpin
  • Both the nucleic acid and the paired hairpin nucleic acid include a protruding region at the 3' end or 5' end, and both are preferably 5' end protruding type or 3' end protruding type hairpin nucleic acids.
  • the hairpin nucleic acid composition may contain multiple types of starting hairpin nucleic acids and/or multiple types of paired hairpin nucleic acids.
  • each hairpin nucleic acid the length and free energy change amount of each region may or may not be the same.
  • the cleavage reaction of the hairpin structure of the hairpin nucleic acid that is the most difficult to cleave is considered to be the rate-limiting step of the reaction.
  • the free energy change of the hairpin structure formation reaction of the starting hairpin nucleic acid can be lower than the free energy change of the paired hairpin nucleic acid.
  • the hairpin nucleic acid composition of the present invention can additionally contain any hairpin nucleic acid.
  • the specific functions of these hairpin nucleic acids are not particularly limited, but for example, hairpin nucleic acids that regulate the formation of a double-stranded nucleic acid structure, hairpin nucleic acids that regulate, modify, or amplify the function of the formed double-stranded nucleic acid structure, etc. Can be mentioned.
  • hairpin nucleic acids that regulate the formation of double-stranded nucleic acid structures include hairpin nucleic acids that inhibit the formation of double-stranded nucleic acid structures in the presence of specific RNA.
  • hairpin nucleic acid that regulates, alters, or amplifies the function of the formed double-stranded nucleic acid structure for example, a hairpin nucleic acid that can hybridize to the single-stranded part of the double-stranded nucleic acid structure, and a double-stranded nucleic acid structure
  • hairpin nucleic acids in which a double-stranded nucleic acid structure forming reaction is induced using the single-stranded portion that is first exposed as a target sequence.
  • composition of this embodiment includes: Additional components may include nucleic acid molecules such as shRNA that directly control gene transcription and translation processes.
  • the nucleic acid molecule herein can be produced by any method. For example, produced in whole or in part by chemical synthesis methods (e.g., using an automated synthesizer) or by enzymatic processes (e.g., without limitation, polymerase, ligase or restriction enzyme reactions) can do.
  • chemical synthesis methods e.g., using an automated synthesizer
  • enzymatic processes e.g., without limitation, polymerase, ligase or restriction enzyme reactions
  • Each hairpin nucleic acid constituting the hairpin nucleic acid composition of the present invention may be composed of DNA and/or RNA nucleotides. Furthermore, each hairpin nucleic acid can include natural and/or non-natural nucleotides as constituent nucleotides. The type, number, position, etc. of the natural nucleotides and non-natural nucleotides included are not particularly limited.
  • Nucleotide refers to a compound containing a phosphate group covalently bonded to the sugar moiety of a nucleoside.
  • a "nucleoside” is a combination of a base and a sugar.
  • the nucleobase (also known as base) portion of a nucleoside is typically a heterocyclic base portion.
  • the phosphate group can be linked to the 2', 3', or 5' hydroxyl moiety of the sugar.
  • Oligonucleotides are formed by the covalent bonding of adjacent nucleosides to each other to form linear polymeric oligonucleotides. Within the oligonucleotide structure, phosphate groups are generally considered to form the internucleoside linkages of the oligonucleotide.
  • natural nucleotides include deoxyribonucleotides found in DNA and ribonucleotides found in RNA.
  • deoxyribonucleotides and ribonucleotides may also be referred to as “DNA nucleotides” and “RNA nucleotides,” respectively.
  • natural nucleosides as used herein includes deoxyribonucleosides found in DNA and ribonucleosides found in RNA.
  • deoxyribonucleosides and ribonucleosides may also be referred to as “DNA nucleosides” and “RNA nucleosides,” respectively.
  • Non-natural nucleotide refers to any nucleotide other than naturally occurring nucleotides and includes modified nucleotides and nucleotide mimetics.
  • non-natural nucleoside refers to any nucleoside other than naturally occurring nucleosides, and includes modified nucleosides and nucleoside mimetics.
  • modified nucleotide refers to a nucleotide having one or more of a modified sugar moiety, a modified internucleoside bond, and a modified nucleobase.
  • modified nucleoside refers to a nucleoside having a modified sugar moiety and/or a modified nucleobase.
  • Nucleic acids comprising non-natural oligonucleotides are preferred over natural forms due to properties such as, for example, enhanced cellular uptake, enhanced affinity for nucleic acid targets, increased stability in the presence of nucleases, or increased inhibitory activity. There are cases.
  • modified internucleoside linkage refers to an internucleoside linkage that has a substitution or any change from a naturally occurring internucleoside linkage (i.e., a phosphodiester linkage).
  • Modified internucleoside bonds include internucleoside bonds that include a phosphorus atom and internucleoside bonds that do not include a phosphorus atom.
  • Representative phosphorus-containing internucleoside linkages include phosphodiester linkages, phosphorothioate linkages, phosphorodithioate linkages, phosphotriester linkages, methylphosphonate linkages, methylthiophosphonate linkages, boranophosphate linkages, and phosphoroamidate linkages.
  • a phosphorothioate bond refers to an internucleoside bond in which a sulfur atom replaces the non-bridging oxygen atom of a phosphodiester bond.
  • Methods for preparing phosphorus-containing and non-phosphorus-containing linkages are well known.
  • the modified internucleoside linkage is one that is more resistant to nucleases than naturally occurring internucleoside linkages.
  • modified nucleobase or “modified base” means any nucleobase other than adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil.
  • unmodified nucleobase or “unmodified base” (natural nucleobase) refers to the purine bases adenine (A) and guanine (G), and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C), and Meaning uracil (U).
  • modified nucleobases include bases into which substituents have been introduced.
  • the type of base into which a substituent is introduced is not particularly limited. It may be either a pyrimidine base or a purine base.
  • a pyrimidine base may be at the 3'-position, 4'-position, 5'-position, 6'-position, or a combination thereof;
  • a purine base may be at the 2'-position, 6'-position, 7'-position, It may be at the 8' position or a combination thereof.
  • Specific modified bases include, for example, 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylated cytosine, 5-carboxylated cytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5-iodocytosine, or N4- Methylcytosine; 2-aminoadenine, N6-methyladenine, 7-deazaadenine, 8-haloadenine, 8-aminoadenine, 8-thioladenine, 8-thioalkyladenine, 8-hydroxyladenine or 8-bromoadenine; 2-thio -Thymine; N2-methylguanine, 6-methylguanine, 7-deazaguanine, 7-methylguanine, 8-haloguanine, 8-aminoguanine, 8-thiolguanine, 8-thioalkylguanine, 8-hydroxylguanine or 8-bromo Guanine; 5-methyluracil, N3-methyluracil
  • a "modified sugar” is defined as having a substitution and/or any change from a natural sugar moiety (i.e., a sugar moiety found in DNA (2'-H) or RNA (2'-OH)).
  • Nucleic acids herein may optionally include one or more modified nucleosides, including modified sugars.
  • Sugar modifications may confer enhanced nuclease stability, increased binding affinity, or some other beneficial biological property to nucleic acids.
  • a nucleoside may include a chemically modified ribofuranose ring moiety.
  • Examples of chemically modified ribofuranose rings include, but are not limited to, addition of substituents (including 5' and 2' substituents), bicyclic nucleic acids (bridged nucleic acids, BNA ), formation of S, N(R), or C(R 1 )(R 2 ) of the ribosyl ring oxygen atom (R, R 1 and R 2 are each independently H, C 1 -C 12 alkyl, or representing a protecting group), and combinations thereof.
  • nucleosides having modified sugar moieties include, but are not limited to, 5'-vinyl, 5'-methyl, 4'-S, 2'-F (2'-fluoro group), Nucleosides containing 2'- OCH3 (2'-OMe group or 2'-O - methyl group) and 2'-O( CH2 ) 2OCH3 substituents are mentioned.
  • "2'-modified sugar” means a furanosyl sugar modified at the 2' position.
  • bicyclic nucleoside refers to a modified nucleoside that includes a bicyclic sugar moiety. Nucleic acids containing bicyclic sugar moieties are commonly referred to as bridged nucleic acids (BNA). Nucleosides that include a bicyclic sugar moiety are sometimes referred to herein as “bridged nucleosides.”
  • a bicyclic sugar may be a sugar in which the carbon atom at the 2' position and the carbon atom at the 4' position are bridged by two or more atoms.
  • Examples of bicyclic sugars are known to those skilled in the art.
  • One subgroup of nucleic acids (BNAs) that contain bicyclic sugars are 4'-(CH 2 ) p -O-2', 4'-(CH 2 ) p -CH 2 -2', 4'-( CH 2 ) p -S-2', 4'-(CH 2 ) p -OCO-2', 4'-(CH 2 ) n -N(R 3 )-O-(CH 2 ) m -2' [
  • p, m and n represent an integer of 1 to 4, an integer of 0 to 2, and an integer of 1 to 3, respectively; and
  • R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, Cross-linked by
  • R 1 and R 2 are typically hydrogen atoms, but any other may be a substituent.
  • each substituent may be the same or different from each other.
  • R 1 and R 2 include, for example, each independently a hydroxyl protecting group for nucleic acid synthesis, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, an acyl group, a sulfonyl group, Silyl group, phosphate group, phosphate group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, or -P(R 4 )R 5 [Here, R 4 and R 5 may be the same or different.
  • BNAs include methyleneoxy(4'- CH2 -O-2')BNA (LNA (Locked Nucleic Acid®)), also known as 2',4'-BNA.
  • ⁇ -L-methyleneoxy(4'-CH 2 -O-2')BNA or ⁇ -D-methyleneoxy(4'-CH 2 -O-2')BNA ethyleneoxy( 4'-( CH2 ) 2 -O-2')BNA (also known as ENA), ⁇ -D-thio(4'-CH2 - S-2')BNA, aminooxy(4'- CH2 -ON( R3 )-2')BNA, oxyamino(4'- CH2 -N( R3 )-O-2')BNA (also known as 2',4'-BNA NC) ), 2',4'-BNA coc , 3'-amino-2',4'-BNA, 5'-methyl BNA, (4'-CH( CH3 )-O-2')BNA (as cEt BNA) (also known as cMOE BNA), (4'-CH(CH 2 OCH 3 )-O-2')
  • nucleobase moiety (natural, modified, or a combination thereof) may be maintained for hybridization with an appropriate nucleic acid target.
  • Nucleoside mimetics herein include structures used to replace sugars, sugars and bases, or sugars, bases and linkages at one or more positions of an oligomeric compound. Nucleoside mimetics include, for example, morpholino, cyclohexenyl, cyclohexyl, tetrahydropyranyl, bicyclic or tricyclic sugar mimetics, eg, nucleoside mimetics with non-furanose sugar units. "Nucleotide mimetics” include structures that are used to replace nucleosides and linkages at one or more positions of an oligomeric compound.
  • Peptide Nucleic Acid is a nucleotide mimetic that has a main chain in which N-(2-aminoethyl)glycine is linked via an amide bond instead of sugar.
  • “Mimetic” refers to groups that replace sugars, nucleobases, and/or internucleoside linkages. Generally, mimetics are used in place of the sugar or sugar-internucleoside linkage combination, and the nucleobase is maintained for hybridization to the target of choice.
  • the specific mode of modification is not particularly limited.
  • different modifications can be made independently to nucleotides within the same nucleic acid molecule.
  • one nucleotide may be subjected to multiple types of modifications.
  • Nucleotides include modified internucleoside linkages (e.g., phosphorothioate linkages) and modified sugars (e.g., 2'-O-methyl modified sugars or bicyclic sugars), for example, to confer resistance to enzymatic cleavage. be able to.
  • modified nucleobases eg, 5-methylcytosine
  • modified sugars eg, 2'-O-methyl modified sugars or bicyclic sugars.
  • one or more of the starting hairpin nucleic acid and the pairing hairpin nucleic acid is free of natural nucleosides and unmodified nucleotides over its entire length.
  • sequence region constituting the protein binding motif in the double-stranded nucleic acid structure preferably does not contain unnatural nucleosides and modified nucleotides.
  • the hairpin nucleic acid composition of the present invention can be designed using miR-21 as the target RNA.
  • the procedure is as described above except that miR-21 is used as the target RNA, and the specific sequences of the target protein and hairpin nucleic acid in this case are not particularly limited.
  • the protein of interest can be NF- ⁇ B and/or E2F.
  • the starting hairpin nucleic acid is a base sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
  • the base sequence can be a base sequence including the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, or added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the paired hairpin nucleic acid may include a base sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, a base sequence including the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, or one or more base sequences in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. It can be a base sequence in which bases are deleted, substituted, or added.
  • any nucleotide can be a non-natural nucleoside and/or a modified nucleotide.
  • the specific position of the nucleotide is not particularly limited, for example, the nucleotide of the stem region Y' (for example, a nucleotide having adenine as a base) can be a non-natural nucleoside and/or a modified nucleotide.
  • the nucleotides corresponding to positions 36, 43, and/or 47 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 can be used as non-natural nucleosides and/or modified nucleotides.
  • the sequence of the paired hairpin nucleic acid containing a specific modification include, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the starting hairpin nucleic acid is a nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 8.
  • the base sequence can be a base sequence including the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, or added to the base sequence shown in SEQ ID NO:8.
  • the paired hairpin nucleic acid may be a base sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, a base sequence including the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, or one or more base sequences in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. It can be a base sequence in which bases are deleted, substituted, or added.
  • any nucleotide can be a non-natural nucleoside and/or a modified nucleotide.
  • the specific position of the nucleotide is not particularly limited, for example, the nucleotide of the stem region Y' (for example, a nucleotide having thymidine as a base) can be a non-natural nucleoside and/or a modified nucleotide.
  • the nucleotide corresponding to position 36 and/or position 38 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 can be a non-natural nucleoside and/or a modified nucleotide.
  • the non-natural nucleosides and/or modified nucleotides in this case are preferably nucleotides or nucleotide mimetics containing modified sugars and/or modified bases.
  • Examples of the sequence of the paired hairpin nucleic acid containing a specific modification include, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the starting hairpin nucleic acid and/or the pairing hairpin nucleic acid may be included in a vector.
  • the type of vector is not particularly limited. Examples include viruses, plasmids, cosmids, and artificial chromosomes, as well as liposomes, nanoparticles, micelles, intelligent gels, and the like.
  • Viruses include various vectors derived from retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, etc. Plasmids include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, and the like. Artificial chromosomes include Human Artificial Chromosomes (HACs), Mouse Artificial Chromosomes (MACs), Yeast Artificial Chromosomes (YACs), Bacterial Artificial Chromosomes (BACs), and Includes P1-derived artificial chromosomes (PACs), etc.
  • HACs Human Artificial Chromosomes
  • MACs Mouse Artificial Chromosomes
  • YACs Yeast Artificial Chromosomes
  • BACs Bacterial Artificial Chromosomes
  • PACs P1-derived artificial chromosomes
  • nanoparticles examples include the targeted nanoparticle delivery system described in Davis M E, et al., Nature, 2010, 464: 1067-1070, and examples of liposomes include membrane-penetrating peptide-bound liposomes. , SNALPs, etc. Liposomes may be prepared in the form of cholesterol conjugates. Furthermore, the RNAi delivery system described in Castanotto D. & Rossi J J., Nature, 2009, 457, 426-433 can also be used.
  • the hairpin nucleic acid composition of the present invention induces the formation of a double-stranded nucleic acid structure in the presence of target RNA, and binds to a specific protein via the protein binding motif contained in the formed double-stranded nucleic acid structure. can do. If target RNA is present and a reaction to form a double-stranded nucleic acid structure is induced, a large number of double-stranded nucleic acid structures will be formed, and therefore a large number of target proteins will bind in proportion to the number of protein-binding motifs. Thereby, by capturing the target protein, effects such as inhibiting the function of the target protein, reducing the free target protein, and suppressing aggregation are brought about.
  • a protein that protects cancer cells from the immune system eg, NF- ⁇ B signal pathway-related protein
  • its function can be inhibited.
  • a protein that exists in many cells eg, cell cycle checkpoint factors, etc.
  • the function of the target RNA can be inhibited only in specific cells that express it.
  • These effects can be measured by administering the hairpin nucleic acid composition to a subject (e.g., experimental animals, cultured cells, etc.), and administering the hairpin for a certain period of time, e.g., 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours later.
  • a subject e.g., experimental animals, cultured cells, etc.
  • administering the hairpin for a certain period of time e.g., 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours later.
  • This can be carried out by measuring an index of the effect after 6 hours, 12 hours, 1 day, or several days (for example, 1 to 7 or 2 to 7 days).
  • the purpose is to stress cells
  • it can be carried out by measuring indicators of cell stress such as cell survival rate, cell stress markers, cell death markers, etc.
  • measurement of the amount of free protein e.g. expression of genes subject to transcriptional regulation, products of enzymatic reactions catalyzed, and This can be carried out by measuring the amount of signal pathway activity, etc.).
  • the level of an indicator or product that is expected to be reduced by application of the hairpin nucleic acid composition of the invention is decreased or is expected to be increased compared to a negative control (e.g., vehicle administration).
  • a negative control e.g., vehicle administration
  • the level of an index or the like increases compared to the negative control, it can be determined that the hairpin nucleic acid composition of the present invention has exerted its effect.
  • the amount of change in level in this case is not particularly limited. Specifically, it is shown that a hairpin nucleic acid composition can produce the desired effect if it is changed, for example, by at least 10%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, or at least 40%. Alternatively, for example, it may be determined whether the desired effect can be brought about by checking whether the change is statistically significant.
  • the second aspect of the invention is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the hairpin nucleic acid composition according to the first aspect as an active ingredient, and induces the formation of a double-stranded nucleic acid structure at a target site containing target RNA.
  • a desired effect based on the binding of a target protein to a double-stranded nucleic acid structure can be obtained at a target site.
  • the constituent components of the pharmaceutical composition of this embodiment will be explained.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes the hairpin nucleic acid composition according to the first aspect as an essential component and a carrier as an optional component. Each component will be specifically explained below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an effective amount of the hairpin nucleic acid composition according to the first aspect as an essential active ingredient. Since the structure of the hairpin nucleic acid composition has been described in detail in the first aspect, a detailed explanation thereof will be omitted here.
  • the form of the hairpin nucleic acid composition contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain each hairpin nucleic acid separately as an active ingredient, or may contain a vector encompassing the hairpin nucleic acid composition. Moreover, it can contain multiple types of hairpin nucleic acid compositions.
  • each hairpin nucleic acid composition may, for example, have different target RNAs, different protein binding motifs, or different target RNAs or protein binding motifs but only in specific sequences or modifications. good.
  • one or more other active ingredients may be included.
  • Effective amount is the amount necessary for the hairpin nucleic acid composition to perform its function as an active ingredient, and which causes little or no harmful side effects to the subject to whom it is applied. say. This effective amount may vary depending on various conditions such as subject information, route of administration, and number of administrations. The final decision is made by the judgment of the person administering the drug, including a doctor, veterinarian, pharmacist, etc.
  • the term "subject” refers to a subject to whom the hairpin nucleic acid composition, pharmaceutical composition, protein capture composition, and protein function inhibition composition of the present invention is applied.
  • Subjects include not only individuals but also organs, tissues, and cells. If the subject is an individual, any animal including humans may be applicable. For example, other than humans, various livestock, poultry, pets, experimental animals, etc. can be mentioned.
  • the subject may be an individual with abnormal protein expression or abnormal cells, or an individual in need of treatment or prevention of a disease.
  • subject information refers to various individual information of the applicable living body. For example, if the subject is a human, the information includes age, weight, sex, diet, health condition, degree of progression and severity of disease, drug sensitivity, presence or absence of concomitant drugs, etc.
  • target site refers to a biological site containing target cells.
  • target cell refers to a cell that is expected to exhibit the effects of the hairpin nucleic acid composition of the present invention.
  • the target cells are cells that express the target RNA and/or cells that highly express the target RNA.
  • the cell of interest may be a cell that further expresses a protein of interest capable of binding to the protein binding motif.
  • composition of the present invention can contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients commonly used in the pharmaceutical art. For example, solvents, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, pH adjusters, stabilizers, fragrances, excipients, vehicles, preservatives, binders, diluents, tonicity agents, sedatives. , buffers, coatings, lubricants, colorants, thickeners, solubility aids, and other additives.
  • the solvent may be, for example, water or another pharmaceutically acceptable aqueous solution, or a pharmaceutically acceptable organic solvent (eg, vegetable oil, etc.).
  • aqueous solutions include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, phosphate buffers, and sodium acetate buffers.
  • the adjuvant include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • the above-mentioned carrier is used to avoid or suppress the decomposition of the hairpin nucleic acid composition, which is the active ingredient, in vivo by enzymes, etc., as well as to facilitate formulation and administration methods, and to maintain the dosage form and drug efficacy. Yes, you can use it as needed.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is such that the hairpin nucleic acid composition according to the first aspect, which is an active ingredient, is delivered to a target site without being inactivated by decomposition or the like, and its effect is achieved in vivo.
  • the hairpin nucleic acid composition according to the first aspect which is an active ingredient
  • the specific dosage form varies depending on the dosage form and/or prescription conditions.
  • the administration form of the pharmaceutical composition of the present invention can be broadly divided into oral administration and parenteral administration. If the method of administration is parenteral administration, the preferred dosage form is a liquid formulation that can be administered directly to the target site or administered systemically via the circulatory system. Examples of liquid preparations include injections. Injectables are mixed with the above-mentioned excipients, elixirs, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, pH regulators, etc., as appropriate, in the unit dosage form required by generally accepted pharmaceutical practice. It can be formulated by In addition, ointments, plasters, cataplasms, transdermal preparations, lotions, inhalants, aerosols, eye drops, and suppositories may also be used.
  • each of the above dosage forms are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art.
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention it may be formulated according to conventional methods in the technical field.
  • the hairpin nucleic acid composition of the present invention has excellent solubility in water, Japanese Pharmacopoeia dissolution test second solution, or Japanese Pharmacopoeia disintegration test second solution, and pharmacokinetics (e.g., drug half-life in blood, brain distribution). , metabolic stability, CYP inhibition) and low toxicity (e.g., acute toxicity, chronic toxicity, genotoxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, drug interaction, carcinogenicity, phototoxicity, etc.) as a medicine. It also has excellent properties as a medicinal product, such as the ability to reduce side effects (for example, suppressing excessive sedation and avoiding lamellar necrosis).
  • the preferred administration form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited.
  • it may be administered orally or parenterally.
  • parenterally Usually used parenterally.
  • parenteral administration examples include intramuscular administration, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration (including implanted continuous subcutaneous administration), intradermal administration, tracheal/bronchial administration, rectal administration, and blood transfusion.
  • administration intratumoral administration, juxtatumoral administration (eg, intradermal or subcutaneous administration near the tumor), intraventricular administration, intrathecal administration, nasal administration, and intramuscular administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention exerts additive effects within cells.
  • effectiveness can be improved by leaving a certain interval between administrations (for example, half a day or more).
  • Target disease The disease to which the pharmaceutical composition of the present invention is applicable is not particularly limited.
  • neurological diseases central nervous system diseases, metabolic diseases, tumors (e.g., malignant tumors (cancer)), infectious diseases, immune system diseases (e.g., autoimmune diseases, allergic diseases, and inflammatory diseases), and abnormalities.
  • diseases associated with abnormal expression of specific proteins or the presence of abnormal cells, such as protein storage diseases can be targeted.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be aimed, for example, at the treatment of diseases selected from the group consisting of cancer, autoimmune diseases, inflammatory diseases, and abnormal protein storage diseases (e.g., neurodegenerative diseases). .
  • the malignant tumor (cancer) in this specification includes, for example, leukemia, seminoma, melanoma, teratoma, lymphoma, neuroblastoma, glioma, prostate cancer, uterine cancer, endometrial cancer, and cervical cancer.
  • Cancer including ovarian cancer, adrenal cancer, thyroid cancer, skin cancer, head and neck cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, breast cancer and lung cancer, and their metastases.
  • an anticancer drug containing the hairpin nucleic acid composition of the present invention as an active ingredient can be made with the same structure as the pharmaceutical composition of this embodiment.
  • the anticancer agent of the present invention can optionally additionally contain other anticancer agents.
  • the target cancer may be any of the cancers mentioned above.
  • the target RNA can be RNA that is specifically expressed in the cancer cells to which the present invention is applied and/or RNA that is highly expressed specifically in the cancer cells that are the subject of application.
  • an anti-inflammatory agent containing the hairpin nucleic acid composition of the present invention as an active ingredient can be made with the same structure as the pharmaceutical composition of this embodiment.
  • the anti-inflammatory agent of the present invention may optionally additionally contain other anti-inflammatory agents.
  • the inflammatory disease of interest may be any of the inflammatory diseases mentioned above in the definition section.
  • the target RNA can be RNA that is specifically expressed in the inflammatory cells of the application target and/or RNA that is highly expressed specifically in the inflammatory cells of the application target.
  • RNA that is specifically expressed and/or highly expressed in the cells that are the cause can be used as the target RNA. .
  • a second aspect of the invention is a protein capture composition.
  • the protein capture composition of the present invention contains the hairpin nucleic acid composition described in the first aspect as an active ingredient, and induces the formation of a double-stranded nucleic acid structure in a target cell containing target RNA.
  • a protein of interest can be captured in a target cell.
  • the constituent components of the protein capture composition of this embodiment will be explained.
  • the protein capture composition of the present invention includes a hairpin nucleic acid composition as an essential component and a carrier as an optional component. Each component will be specifically explained below.
  • the cell death promoting composition of the present invention contains an effective amount of the hairpin nucleic acid composition according to the first aspect as an essential active ingredient.
  • the basic content of the active ingredients is the same as in the pharmaceutical composition described in the second aspect, except that the desired effect is the capture of the protein of interest. Therefore, only the differences will be described here.
  • the protein capture composition of the present invention is intended to capture a protein of interest. Therefore, in addition to the hairpin nucleic acid composition described in the first aspect, one or more active ingredients capable of aggregating or capturing a target protein can be included as an active ingredient. Specific active ingredients include, for example, compounds capable of binding to the target protein, nucleic acids, and/or proteins.
  • the protein-trapping composition of the present invention exhibits by capturing a protein of interest.
  • the free protein of interest can be reduced by capturing the protein of interest.
  • the fourth aspect of the present invention is a protein function inhibiting composition.
  • the protein function inhibiting composition of the present invention contains the hairpin nucleic acid composition according to the first aspect as an active ingredient, and induces the formation of a double-stranded nucleic acid structure at a target site containing target RNA.
  • the function of a protein of interest can be competitively inhibited, for example, in cells of interest based on the binding of the protein of interest to a double-stranded nucleic acid structure.
  • the constituent components of the protein function inhibiting composition of this embodiment will be explained.
  • the protein function inhibiting composition of the present invention includes a hairpin nucleic acid composition as an essential component and a carrier as an optional component. Each component will be specifically explained below.
  • the protein function inhibiting composition of the present invention contains an effective amount of the hairpin nucleic acid composition according to the first aspect as an essential active ingredient.
  • the basic content of the active ingredients is the same as in the pharmaceutical composition described in the second aspect, except that the desired effect is inhibition of protein function. Therefore, only the differences will be described here.
  • the protein function inhibiting composition of the present invention is aimed at inhibiting protein function. Therefore, as an active ingredient, one or more active ingredients capable of inhibiting protein function can be included in addition to the hairpin nucleic acid composition described in the first aspect. Specific active ingredients include, for example, gene expression suppressors (e.g., antisense nucleic acids, short hairpin nucleic acids, etc.) and function inhibitors at the protein level (e.g., antibodies, aptamers, competitive inhibitors, etc.). .
  • gene expression suppressors e.g., antisense nucleic acids, short hairpin nucleic acids, etc.
  • function inhibitors at the protein level e.g., antibodies, aptamers, competitive inhibitors, etc.
  • the protein function-inhibiting composition of the present invention inhibits proteins other than proteins that directly bind to a protein-binding motif, such as proteins that indirectly bind to a double-stranded nucleic acid structure via a protein that binds to a protein-binding motif. It's okay.
  • Example 1 Evaluation of the formation efficiency of double-stranded nucleic acid structure by cell-free system> (the purpose) In a cell-free experimental system, the ability of hairpin nucleic acids to form double-stranded nucleic acid structures was investigated.
  • Method 1 Design of hairpin nucleic acids Using miR-21 (SEQ ID NO: 1) as a target RNA, a hairpin nucleic acid set containing part of the NF- ⁇ B binding motif was designed using the online software NUPACK (http://www.nupack.org/). did. The sequence of each hairpin nucleic acid is shown in Table 1, and the hairpin structure is shown in FIG.
  • Each designed hairpin nucleic acid was chemically synthesized using an automatic nucleic acid synthesizer.
  • miR-21 was added to a final concentration of 0.1 in a TE buffer solution containing an initiating hairpin nucleic acid (HP1) and/or a pairing hairpin nucleic acid (HP2) each at a concentration of 1 ⁇ M. It was added to give a concentration of ⁇ M, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, the reaction solution was analyzed by 10% polyacrylamide gel electrophoresis. SYBR TM Gold (Thermo Fischer Scientific) was used to stain the gel, and Gel Doc EZ (Bio-Rad) was used to photograph the gel.
  • HP1 initiating hairpin nucleic acid
  • HP2 a pairing hairpin nucleic acid
  • Example 2 Evaluation of protein capture ability of double-stranded nucleic acid structure> (the purpose) The ability of protein-binding motifs on double-stranded nucleic acid structures to capture proteins was investigated.
  • HP1 and HP2 each have a part of the NF- ⁇ B recognition sequence (Fig. 3, double-headed arrow).
  • the starting hairpin nucleic acid and the pairing hairpin nucleic acid were each used at a concentration of 0.1 ⁇ M.
  • the nucleotide at the 3' end of one of the hairpin nucleic acids was modified with FAM for detection.
  • Table 2 shows the sequences of the hairpin nucleic acids used in Examples 2 and 3.
  • miR-21 was added to a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing hairpin nucleic acid at a final concentration of 10 nM, and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • Recombinant NF- ⁇ B (Cayman Chemical) was added to the reaction solution at a final concentration of 50 ng/ ⁇ L, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. NF- ⁇ B binding was detected using a gel shift method. First, this reaction solution was subjected to 8% polyacrylamide gel electrophoresis. Band detection was performed by detecting FAM fluorescence using Gel Doc TM EZ Imager (BioRad; excitation wavelength 430 nm to 460 nm).
  • HP1 and HP2 form a double-stranded nucleic acid structure only in the presence of the target RNA (miR-21 in this case), and the protein of interest (NF- ⁇ B in this case) binds thereto. It was done.
  • Example 3 Evaluation of double-stranded nucleic acid structure formation ability in cell lines> (the purpose) We confirmed that double-stranded nucleic acid structures are formed specifically for target RNA in human cells.
  • Method 1.0 ⁇ 10 4 HEK293T cells, MDA-MB-231 cells, and A549 cells were each seeded in a 96-well multiwell plate and incubated in 100 ⁇ L of DMEM solution (containing 10% FBS and 0.5% penicillin-streptomycin). The cells were cultured until 80% confluence.
  • HP1 SEQ ID NO: 13
  • HP2 SEQ ID NO: 14
  • FAM fluorescent molecule
  • DMEM solution containing 10% FBS and 0.5% penicillin-streptomycin
  • FAM fluorescence in the collected cells was measured by flow cytometry using the Guava® easyCyte TM system (Luminex).
  • the fluorescence intensity was obtained as a relative value with the value when only FAM-modified HP2 was added as 1.
  • HP1-derived quenching molecule Dabcyl (“Quencher” in the figure) is sufficiently close to HP2-derived FAM ("Fluorophore” in the figure), which means that HP1 and HP2 have a double-stranded nucleic acid structure. This indicates that a
  • Example 4 Evaluation of protein function inhibition ability by double-stranded nucleic acid structure in cell system> (the purpose) We investigated whether it is possible to specifically inhibit the function of a target protein in target RNA in human cells.
  • Method 1.0 ⁇ 104 MRC-5 cells and A549 cells were each seeded in a 96-well multiwell plate and brought to approximately 80% confluence in 100 ⁇ L of DMEM solution (containing 10% FBS and 0.5% penicillin-streptomycin). It was cultured until
  • HP1 SEQ ID NO: 6
  • HP2 SEQ ID NO: 10
  • a Lipofectamine solution prepared using the pNF-kB/SEAP plasmid (NOVUS biologicals, LLC) instead of the hairpin nucleic acid was also added to the dish to perform lipofection.
  • This plasmid is a construct that expresses human placenta-derived secreted alkaline phosphatase (SEAP) in an NF- ⁇ B-dependent manner.
  • NFkB Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay Kit NOVUS biologicals, LLC
  • PNPP substrate pNitrophenyl phosphate
  • the concentration of the produced yellow product was quantified as NF- ⁇ B activity using a plate reader Cytation 5 (BioTek Instruments, measurement wavelength 405 nm).
  • NF- ⁇ B activity was obtained as a relative value with the concentration of yellow product when no hairpin nucleic acid was added as 1.
  • the experiment was repeated three times for MRC-5 cells and four times for A549 cells.
  • Statistical analysis was performed using Student's t-test.
  • the hairpin nucleic acid of the present invention suppresses NF- ⁇ B activity induced by TNF- ⁇ added to the medium specifically in cells expressing miR-21 (FIGS. 8 and 9).
  • the hairpin nucleic acid of the present invention forms a double-stranded nucleic acid structure specifically for target RNA, and by binding the target protein to the protein-binding motif on the double-stranded nucleic acid structure, the target protein can be isolated. It was shown that transcriptional regulatory activity can be competitively inhibited.
  • Example 5 Evaluation of the ability to inhibit the function of other proteins by double-stranded nucleic acid structure> (the purpose) Using other proteins, we confirmed that we could specifically inhibit the function of the target protein in target RNA in human cells.
  • HP1 SEQ ID NO: 8
  • HP2 SEQ ID NO: 11
  • PC positive control
  • hairpin nucleic acid or decoy nucleic acid was added to OPTI-MEM containing Lipofectamine Plus Reagent to a final concentration of 0.5 ⁇ g/ ⁇ L, and the mixed solution was added to the same amount of OPTI-MEM containing Lipofectamine LTX. It was mixed with MEM and left at room temperature for 5 minutes to equilibrate. The equilibrated Lipofectamine solution was added to the dish and lipofection was performed.
  • the collected cells were fixed in 70% ethanol for 12 hours, and after removing the ethanol, 50 ⁇ L of Propidium Iodide at a concentration of 1 mg/mL was added.
  • the amount of nucleic acid in cells was measured based on the fluorescence intensity of Propidium Iodide by flow cytometry using the Guava (registered trademark) easyCyte TM system (Luminex).
  • the hairpin nucleic acid of the present invention can strongly inhibit the function of a target protein in a cell-specific manner that expresses the target RNA, regardless of the specific type of the target protein.

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Abstract

本発明の課題は、創薬が困難な核酸結合タンパク質を細胞特異的に捕捉及び／又は機能阻害することが可能である核酸医薬を提供することである。　ヘアピン核酸を含むヘアピン核酸組成物、及びそれを有効成分として含む医薬組成物、タンパク質捕捉組成物及びタンパク質機能阻害組成物を提供する。

Description

ヘアピン核酸組成物
　本発明は、ヘアピン核酸組成物、及びそれを含むタンパク質捕捉組成物、タンパク質機能阻害組成物及び医薬組成物に関する。
　核酸医薬は、核酸分子に基づき、標的の核酸やタンパク質に特異的に結合して機能を抑制する分子標的治療薬である。核酸医薬は、従来治療が困難であった疾病に対する新たな医薬品として注目を集めており、実際に2010年代には、Givlaari等の肝臓を疾病部位とする画期的新薬が国内外で誕生している（非特許文献１）。しかし、特にがんに対する核酸医薬品の実用化は未だに達成されていない。
　これまでに上市された核酸医薬品は、主に、標的のmRNAに対して配列特異的にハイブリダイズすることでその翻訳やスプライシング過程を阻害するアンチセンス核酸及びsiRNAであった。近年では、タンパク質を標的としたアプタマーやデコイ核酸についての研究も精力的に進められている。
　特にデコイ核酸は、抗がん剤として有望な核酸分子である。デコイ核酸が特に有望視されるのは、転写因子等の核酸結合タンパク質に対しても作用可能であるためである。このような核酸結合タンパク質は一分子で多様な遺伝子の発現調節等を行っている場合が多く、治療標的として有望である一方、低分子化合物が結合可能な部位がない場合が多く、創薬が困難な標的でもある。しかしながら、核酸医薬であるデコイ核酸を使用すれば、これらのタンパク質を捕捉及び／又は不活性化することが可能となり低分子医薬ではできなかった治療が可能となる可能性がある。
　しかし、デコイ核酸を核酸医薬として実用化する上では、いくつかの問題点があり、未だ上市に至っていないのが実情である。問題点の１つは、デコイ核酸は細胞選択性が低いため、オフターゲット効果が高く、正常な細胞に対して副作用を示しやすいことである。また、この副作用を一定に抑える目的で投与量を低く設定すると十分な薬効が得られない。
　高い特異性で目的の細胞においてのみ、転写因子等の核酸結合タンパク質に対して強力に作用する核酸医薬の開発が求められていた。
承認された核酸医薬品（2021年5月時点）、国立医薬品食品衛生研究所 遺伝子医薬部 第2室
　本発明の課題は、細胞特異的に、創薬が困難な核酸結合タンパク質を捕捉及び／又は不活性化することが可能な核酸医薬を提供することである。
　上記課題を解決するために、鋭意研究を行った結果、本発明者らは、転写因子のタンパク質結合モチーフを有するヘアピン核酸を用いて、がん細胞特異的にデコイ核酸を生成し、増幅することが可能であり、これに基づいて細胞特異的に十分な薬効を得られることが明らかとなった。本発明は、当該新規知見等に基づくものであり、以下を提供する。
［１］開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸を含むヘアピン核酸組成物であって、前記開始ヘアピン核酸は標的RNAとハイブリダイズ可能であり、前記対合ヘアピン核酸は前記開始ヘアピン核酸とハイブリダイズ可能であり、前記開始ヘアピン核酸及び前記対合ヘアピン核酸は共に、二本鎖からなるタンパク質結合モチーフの一部を含み、前記ハイブリダイズにより、前記タンパク質結合モチーフを含む二本鎖核酸構造が形成される、前記ヘアピン核酸組成物。
［２］前記開始ヘアピン核酸が、標的RNAとハイブリダイズする標的RNA結合ドメイン、及び前記対合ヘアピン核酸とハイブリダイズする対合ヘアピン結合ドメインを含み、前記対合ヘアピン核酸が、前記対合ヘアピン結合ドメインとハイブリダイズする開始ヘアピン結合ドメイン、及び前記標的RNA結合ドメインとハイブリダイズする標的RNAドメインを含み、前記開始ヘアピン核酸及び前記対合ヘアピン核酸は共に、3'末端又は5'末端に突出領域を含み、前記標的RNA結合ドメイン及び前記対合ヘアピン結合ドメインは、前記突出領域の全部又は一部を含む、［１］に記載のヘアピン核酸組成物。
［３］前記標的RNAドメインの長さが、前記開始ヘアピン結合ドメインの長さ以下である、［２］に記載のヘアピン核酸組成物。
［４］前記タンパク質結合モチーフが転写因子結合モチーフを含む、［１］～［３］のいずれかに記載のヘアピン核酸組成物。
［５］前記標的RNAが、mRNA又はmiRNAである、［１］～［４］のいずれかに記載のヘアピン核酸組成物。
［６］前記標的RNAが、細胞特異的に発現するRNAである、［１］～［５］のいずれかに記載のヘアピン核酸組成物。
［７］前記開始ヘアピン核酸及び前記対合ヘアピン核酸がベクターに包含されている、［１］～［６］のいずれかに記載のヘアピン核酸組成物。
［８］目的のタンパク質を捕捉する、［１］～［７］のいずれかに記載のヘアピン核酸組成物。
［９］目的のタンパク質の機能を阻害する、［１］～［７］のいずれかに記載のヘアピン核酸組成物。
［１０］［１］～［７］のいずれかに記載のヘアピン核酸組成物を含む、医薬組成物。
［１１］がん、免疫系疾患、炎症性疾患及び神経変性疾患からなる群から選択される疾患を予防又は治療するための、［１０］に記載の医薬組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる米国仮出願番号63/356,286の開示内容を包含する。
　本発明のヘアピン核酸組成物によれば、標的RNAを発現する細胞においてタンパク質結合モチーフを含む二本鎖核酸構造を形成することができる。
　本発明のタンパク質捕捉組成物によれば、標的RNAを発現する細胞において目的のタンパク質を捕捉することができる。
　本発明のタンパク質機能阻害剤によれば、標的RNAを発現する細胞において目的のタンパク質の機能を阻害することができる。
　本発明の医薬組成物によれば、標的部位において、目的のタンパク質の捕捉に基づく効果を得ることができる。
本発明のヘアピン核酸の典型的な構造を示した模式図である。Ａは、5'末端突出型の開始ヘアピン核酸（(I)）と5'末端突出型の対合ヘアピン核酸（(II)）のセットの構造を示す。Ｂは、3'末端突出型の開始ヘアピン核酸（(I)）と3'末端突出型の対合ヘアピン核酸（(II)）のセットの構造を示す。図中、Xは突出領域を、Y及びY'はステム領域を、Zはループ領域を示し、細縦線は2本の核酸鎖がハイブリダイズしていることを示す。 本発明の二本鎖核酸構造形成反応の概要を模式的に示す図である。図中、Xは突出領域を、Y及びY'はステム領域を、Zはループ領域を示し、細縦線は2本の核酸鎖がハイブリダイズしていることを示す。 実施例２において設計した本発明のヘアピン核酸の二次構造を示す図である。図３Aは開始ヘアピン核酸（HP1）を示し、図３Bは対合ヘアピン核酸（HP2）を示す。図中、両矢印は各ヘアピン核酸が有するNF-κB結合モチーフの一部の位置を示す。 本発明のヘアピン核酸によりmiR-21の存在下において二本鎖核酸構造が形成されたことを示す図である。図中、「HP1」は開始ヘアピン核酸を示し、「HP2」は対合ヘアピン核酸を示し、「－」はその分子を添加しなかったこと、「＋」はその分子を添加したことを示す。また、「二量体」は形成された二本鎖核酸構造を示す。 本発明のヘアピン核酸へのNF-κBの結合を確認するゲルシフト法の結果を示す図である。図中、「HP1」は開始ヘアピン核酸を示し、「HP2」は対合ヘアピン核酸を示し、「－」はその分子を添加しなかったこと、「＋」はその分子を添加したことを示す。また、「二量体」は形成された二本鎖核酸構造を示し、「二量体＋NF-κB」はNF-κBと二本鎖核酸構造の複合体を示す。 miR-21をほぼ発現しないHEK293T細胞にヘアピン核酸を導入した場合における蛍光強度の変化を示す図である。図中、「HP1(Quencher)」は消光分子Dabcylで修飾したHP1を示し、「HP2(Fluorophore)」は蛍光分子ＦＡＭで修飾したHP2を示す。また、「－」はその分子を導入しなかったこと、「＋」はその分子を導入したことを示す。 miR-21を発現するA549細胞にヘアピン核酸を導入した場合における蛍光強度の変化を示す図である。図中、「HP1(Quencher)」は消光分子Dabcylで修飾したHP1を示し、「HP2(Fluorophore)」は蛍光分子ＦＡＭで修飾したHP2を示す。また、「－」はその分子を導入しなかったこと、「＋」はその分子を導入したことを示す。 miR-21をほぼ発現しないMRC-5細胞にヘアピン核酸を導入した場合におけるNF-κB活性の変化を示す図である。図中、「HP1＋HP2」はHP1及びHP2をいずれも導入したことを示す。また、「－」はそれらを導入しなかったこと、「＋」はそれらを導入したことを示す。図中、エラーバーは標準偏差を示し、「ns」は有意差が無かったことを示す。 miR-21を発現するA549細胞にヘアピン核酸を導入した場合におけるNF-κB活性の変化を示す図である。図中、「HP1＋HP2」はHP1及びHP2をいずれも導入したことを示す。また、「－」はそれらを導入しなかったこと、「＋」はそれらを導入したことを示す。図中、エラーバーは標準偏差を示し、「＊＊＊」はp値が0.001未満であることを示す。 MDA-MB-231細胞にE2Fに対するデコイ核酸又はヘアピン核酸を導入した場合における、G1期の細胞の割合を示す図である。図中、縦線で囲まれた範囲はG1期に留まっている細胞の核酸量の範囲を示し、%で示された値はG1期の細胞の割合を示す。
１．ヘアピン核酸組成物
１－１．概要
　本発明の第１の態様はタンパク質結合モチーフを含む二本鎖核酸構造を形成可能な開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸を含むヘアピン核酸組成物である。本発明のヘアピン核酸組成物は、目的の核酸結合タンパク質（以下、本明細書において、単に「目的のタンパク質」と略称する）を捕捉することができ、また本発明のタンパク質捕捉組成物、タンパク質機能阻害組成物及び医薬組成物の有効成分となり得る。
１－２．定義
　本明細書で頻用する用語について、以下で定義する。
　本明細書において「ヘアピン核酸」とは、ヘアピン構造を形成し得る一本鎖核酸を指す。本明細書における「ヘアピン構造」は、一本鎖核酸により形成される、ステム構造Y、ループ構造Z及び突出領域Xを1組含む核酸の二次構造を指す。図１Ａ及びＢにヘアピン核酸の模式図を示す。本明細書におけるヘアピン核酸は、突出領域X、ステム領域Y、ループ領域Z及びステム領域Y'を順に含む。
　本明細書において「5'末端突出型（図１Ａの(I)及び(II)）」とは、5'末端に突出領域Xを含むヘアピン核酸の型を指す。5'末端突出型のヘアピン核酸は、突出領域X、ステム領域Y、ループ領域Z及びステム領域Y'を5'末端から順に含む。また、本明細書において「3'末端突出型（図１Ｂの(I)及び(II)）」とは、3'末端に突出領域Xを含むヘアピン核酸の型を指す。3'末端突出型のヘアピン核酸は、ステム領域Y'、ループ領域Z、ステム領域Y及び突出領域Xを5'末端から順に含む。
　「ステム構造」は、互いにハイブリダイズ可能な塩基配列を含む2つのステム領域（Y及びY'）が二本鎖を形成してなる構造である。
　「ループ構造」は、一本鎖核酸からなるループ領域（Z）によって形成されるループ状の構造である。
　本明細書において「突出領域（X）」とは、突出末端を構成する核酸領域を指し、一本鎖状態で露出している、その塩基配列と相補的な配列等を認識する。「突出末端」とは、ステム領域（Y又はY'）の遊離末端（ループ領域Zとの非隣接末端）のいずれか又は両方に隣接する一本鎖からなる核酸領域を指す。本明細書において突出領域Xの長さは特に限定しないが、例えば、5～15塩基とすることができる。具体的には、例えば、5塩基以上、6塩基以上、9塩基以上、10塩基以上又は11塩基以上である。また、突出領域Xは、例えば、15塩基以下、14塩基以下、13塩基以下、12塩基以下、11塩基以下、10塩基以下、9塩基以下、8塩基以下又は7塩基以下とすることができる。好ましくは、突出領域Xはヘアピン核酸の末端に位置する。
　本明細書において「ステム領域（Y及びY'）」とは、分子内で互いにハイブリダイズしてステム構造を形成する核酸領域を指す。各ステム領域の少なくとも両末端は互いに相補的な塩基からなる。各ステム領域の長さは特に限定しないが、例えば、それぞれ独立に10～20塩基とすることができる。具体的には、例えば、それぞれ独立に10塩基以上、11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上又は14塩基以上である。また、各ステム領域の長さは、それぞれ独立に、例えば、20塩基以下、19塩基以下、18塩基以下、17塩基以下、16塩基以下、15塩基以下、14塩基以下又は13塩基以下とすることができる。「ステム領域Y（Y）」とは、突出領域Xに隣接するステム領域を指す。また、「ステム領域Y'（Y'）」とは、突出領域Xに隣接しないステム領域を指す。
　本明細書において「ループ領域（Z）」とは、一本鎖構造において前記2つのステム領域の間に位置する核酸領域を指す。ループ領域Zの長さは特に限定しないが、例えば、3～20塩基とすることができる。具体的には、例えば、3塩基以上、4塩基以上、5塩基以上、6塩基以上、7塩基以上、8塩基以上、9塩基以上、10塩基以上、11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上又は15塩基以上である。また、ループ領域Zは、例えば、20塩基以下、19塩基以下、18塩基以下、17塩基以下、16塩基以下、15塩基以下、14塩基以下又は13塩基以下とすることができる。
　本明細書において「タンパク質結合モチーフ」とは、目的の核酸結合タンパク質が認識する二本鎖からなる配列モチーフの最小単位を指す。特に、本明細書では、目的のタンパク質が結合可能な二本鎖からなる配列モチーフを指す。例えば、転写因子が結合するタンパク質結合モチーフは、本明細書において「転写因子結合モチーフ」と称する。ここで、「タンパク質結合モチーフの一部」とは、タンパク質結合モチーフの少なくとも一部の配列を含み、目的のタンパク質が結合できない配列をいう。タンパク質結合モチーフの一部としては、例えば、タンパク質結合モチーフを構成する少なくとも一方の核酸鎖に塩基の付加、欠失及び／若しくは置換、及び／又は修飾ヌクレオチドを含む塩基配列等が挙げられる。
　本明細書において「二本鎖核酸構造」とは、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸によって形成される核酸構造を指す。二本鎖核酸構造は（完全な）タンパク質結合モチーフを含み、目的のタンパク質が結合可能である。
　本明細書において「標的RNA」とは、本発明のヘアピン核酸組成物による二本鎖核酸構造形成反応の起点となるRNAを指す。標的RNAは、本発明のヘアピン核酸組成物によって二本鎖核酸構造が形成される条件を限定する。標的RNAには開始ヘアピン核酸が特異的にハイブリダイズし得る。標的RNAの種類は特に限定しない。具体的には、例えば、mRNA（例えば、成熟mRNA、mRNA前駆体、及び修飾mRNA等を含む）、ノンコーディングRNA（non-coding RNA（ncRNA）：マイクロRNA（miRNA）及びロングノンコーディングRNA（lncRNA）等を含む）、及びナチュラルアンチセンスRNA等が挙げられる。好ましくは、本明細書における標的RNAはmRNA又はmiRNAである。
　本明細書において「miR-21」とは、配列番号１に表される全長が22塩基の塩基配列を有するmiRNA、及びその変異体、相同体、修飾体及び誘導体をいう。miR-21は多くのがんにおいて発現が上昇していることが知られており、細胞増殖や細胞死、DNA損傷応答等に関与することが知られている。
　「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズ可能」とは、互いに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが塩基対合して、完全に又は部分的に相補的な二本鎖を形成することを指す。
　「相補的」とは、核酸塩基が水素結合を介して、互いに塩基対合を形成し得る関係をいう。いわゆるワトソン-クリック塩基対（天然型塩基対）又はフーグスティーン型塩基対が該当する。
　本明細書において「ベクター」とは、目的のヌクレオチド断片を含み、宿主DNAに組込み、又は宿主内で増殖させ又は発現させるためにそのヌクレオチド断片を宿主に移入させる運搬手段を指す。主なベクターとしては、例えば、プラスミドベクターやウイルスベクター等が挙げられる。本明細書におけるベクターには、さらにリポソーム、エクソソーム及びナノ粒子等、核酸分子を担持し、宿主へと運搬可能な任意のその他の物質を含む。
　本明細書において「発現ベクター」とは、目的のヌクレオチド断片を発現可能な状態で含むベクターを指す。
　本明細書において「発現可能な状態」とは、条件が整えば宿主内でベクターから目的のヌクレオチド断片が発現する状態を指す。具体的には、目的のヌクレオチド断片が発現ベクター内でプロモーターの制御下に配置されることをいう。
　「捕捉」とは、ある物質を他の物質の表面又は内部にとらえることをいう。特に、本明細書においては、目的のタンパク質をタンパク質結合モチーフに結合させた状態にとどめることを指す。
　本明細書において「タンパク質機能阻害」とは、そのタンパク質が本来発揮し得る機能を阻害することを指す。阻害の程度や阻害の方法は特に限定しない。
　本明細書において「免疫系疾患」とは、免疫系の異常に特徴づけられる疾患を指す。具体的には、例えば、自己免疫疾患及び炎症性疾患等が挙げられる。
　「自己免疫疾患」とは、自己抗原に対して免疫応答を生じる疾患を指す。具体的には、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、Ｉ型糖尿病、強皮症、乾癬等が挙げられる。
　「炎症性疾患」とは、組織における高レベルの炎症又は変性を特徴とする疾患を指す。本明細書における炎症性疾患は、慢性炎症性疾患及び急性炎症性疾患のいずれも含む。具体的には、例えば、セリアック病、脈管炎、狼瘡、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、過敏性腸症候群、アテローム性動脈硬化症、関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、大腸炎、肝炎（例えば、慢性活動性肝炎等のウイルス性肝炎や非ウイルス性肝炎）、皮膚炎及び乾癬等が挙げられる。
　本明細書において「神経変性疾患」とは、神経組織の構造が経時的に変性する疾患を指す。具体的には、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、黄斑変性、多発性硬化症、筋ジストロフィ、ニーマン・ピック病、骨粗しょう症及び関節リウマチ等が挙げられる。これらの多くは、特定のタンパク質が蓄積することにより誘導される。
　「統計的に有意」とは、被験対象の測定値と対照値の差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。例えば、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、具体的には5％より小さい場合（p<0.05）、1％より小さい場合（p<0.01）、0.1％より小さい場合（p<0.001）が挙げられる。ここに示す「p（値）」は、統計学的検定において、帰無仮説に基づいた分布の中で、検定統計量が偶然その値になる確率を示す。したがって「p」が小さいほど、検定統計量がその値となる確率は低く、帰無仮説が棄却されやすいことを意味する。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、共変量分散分析等を用いることができる。
１－３．構成
　本発明のヘアピン核酸組成物はタンパク質結合モチーフを含む二本鎖核酸構造を形成可能な開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸を含み、各ヘアピン核酸はタンパク質結合モチーフの一部を含む。
　以下、図２を参照して本発明のヘアピン核酸組成物が標的RNAの存在下で二本鎖核酸構造を形成する過程の概要を説明する。標的RNAが開始ヘアピン核酸の標的RNA結合ドメインに結合することで開始ヘアピン核酸のヘアピン構造（特にステム構造）が開裂する（図２中、「step 1」）。すると、開始ヘアピン核酸の対合ヘアピン結合ドメインが一本鎖構造として露出し、対合ヘアピン核酸の開始ヘアピン結合ドメインがハイブリダイズ可能となる。この２つのドメインがハイブリダイズすることで、対合ヘアピン核酸のヘアピン構造（特にステム構造）が開裂する（図２中、「step 2」）。すると、互いにハイブリダイズ可能な対合ヘアピン核酸の標的RNAドメインと開始ヘアピン核酸の標的RNA結合ドメインの間に標的RNAが挟まれる形となる。開始ヘアピン核酸と対合ヘアピン核酸のハイブリダイゼーションが進むと、標的RNAが開始ヘアピン核酸から徐々に解離する（図２中、「step 3」）。その結果、開始ヘアピン核酸と対合ヘアピン核酸による二本鎖核酸構造が形成されると共に、標的RNAは再び遊離状態となる。遊離した標的RNAは、上述の二本鎖核酸構造形成反応を触媒として繰り返し媒介するため、二本鎖核酸構造が次々と形成される（図２中、step 1～3）。形成された二本鎖核酸構造は二本鎖からなるタンパク質結合モチーフを有するため、目的の核酸結合タンパク質が存在する場合には、その目的のタンパク質は二本鎖核酸構造に結合する。
　以下、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸のそれぞれについて具体的に説明する。
（１）開始ヘアピン核酸
　「開始ヘアピン核酸（図１(I)）」とは、標的RNAとハイブリダイズ可能であり、二本鎖からなるタンパク質結合モチーフの一部を含むヘアピン核酸である。
　上述の性質を満たす限り具体的な構成は特に限定しないが、典型的には、開始ヘアピン核酸は標的RNA結合ドメイン及び対合ヘアピン結合ドメインを含む（図２）。
　「標的RNA結合ドメイン」は、開始ヘアピン核酸における標的RNAとハイブリダイズする核酸領域を指す。通常、標的RNA結合ドメインは突出領域Xの全部又は一部を含む。具体的には、例えば、標的RNA結合ドメインは、突出領域Xの全部又は一部、及びそれに続くステム領域Yの全部又は一部を含む（図２）。標的RNA結合ドメインは、標的RNAの全部又は一部とハイブリダイズ可能であり、このドメインの塩基配列は、少なくともドメインの両末端は標的RNAと相補的である。
　「対合ヘアピン結合ドメイン」は、開始ヘアピン核酸における対合ヘアピン核酸とハイブリダイズする核酸領域を指す。特に、開始ヘアピン核酸が標的RNAとハイブリダイズした状態で対合ヘアピン核酸とハイブリダイズする核酸領域を指す。したがって、両ドメインに重複して属する塩基は存在しない。具体的には、例えば、対合ヘアピン結合ドメインは、ステム領域Y'の全部又は一部を含む（図２）。対合ヘアピン結合ドメインは、対合ヘアピン核酸の開始ヘアピン結合ドメインとハイブリダイズ可能であり、また両ドメインの塩基配列は、少なくともそれぞれのドメインの両末端で互いに相補的である。
　開始ヘアピン核酸は、標的RNA結合ドメイン及び対合ヘアピン結合ドメイン以外にも1個又は複数個の塩基を含むことができる。これらの塩基は、開始ヘアピン核酸において、例えば、標的RNA結合ドメイン及び対合ヘアピン結合ドメイン間でスペーサー配列として、また標的RNA結合ドメイン及び／又は対合ヘアピン結合ドメインの遊離末端に連結された末端配列として存在し得る。
　通常、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸の両方が突出領域Xを含むヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有するために、開始ヘアピン核酸には対合ヘアピン核酸とハイブリダイズすることができない塩基配列が含まれる。そのような塩基配列の位置はヘアピン核酸の設計によって異なるため特に限定しないが、例えば、開始ヘアピン核酸の突出領域X及び／又はステム領域Y'に位置する。
　ハイブリダイズ可能であるかどうかは、当技術分野において公知の方法を用いて知ることができる。例えば、塩基同一性に基づいて知ることができる。通常、第1の核酸の塩基配列と完全に相補的な塩基配列と塩基同一性が一定以上の塩基配列を有する第2の核酸は、第1の核酸とハイブリダイズ可能である。具体的には、例えば、塩基同一性が70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上又は100％の場合にハイブリダイズ可能である。本明細書において「塩基同一性」とは、二つのポリヌクレオチドの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じて、いずれかの塩基配列にギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、一方のポリヌクレオチドの全塩基数に対する他方のポリヌクレオチドの同一塩基の割合（％）をいう。％同一性は、相同性検索プログラムBLAST（Basic local alignment search tool；Altschul, S. F. et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990）検索等の公知のプログラムを用いて容易に決定できる。また、通常、第1の核酸の塩基配列と完全に相補的な塩基配列において複数個の塩基が別の塩基に置換された塩基配列を有する第2の核酸は、第1の核酸とハイブリダイズ可能である。
　また、本明細書において「複数個」とは、2以上の個数を指す。具体的には、例えば、2～60個、2～45個、2～30個、2～14個、2～10個、2～8個、2～6個、2～5個、2～4個又は2～3個を指す。
　ハイブリダイズ条件は特に限定しないが、例えば、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件等の様々なストリンジェントな条件であり得る。「低ストリンジェントな条件」とは、核酸がハイブリダイズしやすい条件を意味する。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、低温かつ高塩濃度な条件をいう。例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば5×SSC、0.1％ SDSを含むバッファーを用いて42℃～50℃で洗浄する条件である。「高ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリダイゼーションを生じ難い環境条件をいう。高ストリンジェントな条件下では、標的塩基配列を有する核酸とはハイブリッドを形成可能であるが、非特異的な塩基配列を有する核酸はハイブリッドを実質的に形成することができない。一般に高ストリンジェントな条件とは、低塩濃度で、かつ高温な条件をいう。ここでいう低塩濃度は、具体的には、例えば、15～750mM、好ましくは15～500mM、15～300mM又は15～200mMをいう。また、ここでいう高温は、具体的には、例えば、50～68℃、又は55～70℃である。具体的な高ストリンジェントな条件として、例えば、65℃、0.1×SSC及び0.1％ SDSで洗浄する条件が挙げられる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含む。
　開始ヘアピン核酸は、哺乳動物の生理学的条件下において、標的RNA存在下でヘアピン構造が開裂して一本鎖構造を形成することが好ましい。生理学的条件においてヘアピン構造が開裂するか否かは当技術分野において公知の手法を用いて確認することができる。例えば、無細胞系、細胞系を用いたin vitroの実験系、in vivoの実験系、ヘアピン構造形成反応の自由エネルギー変化量等を指標としたin silicoの解析又はこれらの組合せ等によって判断することができる。判断に使用可能な具体的なin vitroの実験系、in vivoの実験系及びin silicoの解析手法として、例えば、本願実施例において例示されている手法を用いてもよいが、それに限定しない。
　本明細書において「ヘアピン構造形成反応」とは、ヘアピン核酸において、一本鎖核酸が直鎖形態からヘアピン形態に変化してヘアピン構造が形成される反応を指す。
　本明細書において「自由エネルギー変化量」とは、温度及び圧力条件が一定の場合において、ある反応を通じて外部環境から反応系へ供給される正味のエネルギー量を指す。本明細書においては、特に、ヘアピン構造形成反応において外部環境から供給される正味のエネルギー量が該当する。例えば、出発物質と比較して反応生成物がより熱力学的に安定であれば、反応を通じて反応系がエネルギーを失うため、自由エネルギー変化量は負となる。本発明の自由エネルギー変化量には、例えば、ギブズの自由エネルギー変化量（ΔG）及びヘルムホルツの自由エネルギー変化量（ΔF）等のいずれも含まれる。
　ヘアピン構造形成反応の自由エネルギー変化量は特に限定しない。一般に、ヘアピン構造形成反応の自由エネルギー変化量は、低い程ヘアピン構造が開裂しにくく、高い程ヘアピン構造が開裂しやすい。自由エネルギー変化量は、例えば、-40～-30kcal/molである。具体的には、例えば、-40kcal/mol以上、-39kcal/mol以上、-38kcal/mol以上、-37.5kcal/mol以上、-37kcal/mol以上又は-36.5kcal/mol以上である。また、自由エネルギー変化量は、例えば、-30kcal/mol以下、-31kcal/mol以下、-32kcal/mol以下、-32.5kcal/mol以下、-33kcal/mol以下、-33.5kcal/mol以下、-34kcal/mol以下、-34.5kcal/mol以下又は-35kcal/mol以下である。自由エネルギー変化量は、NUPAK等の核酸の高次構造の安定性予測に使用される公知のソフトウェアを使用して知ることができる。
（２）対合ヘアピン核酸
　「対合ヘアピン核酸（図１(II)）」とは、開始ヘアピン核酸とハイブリダイズ可能であり、二本鎖からなるタンパク質結合モチーフの一部を含むヘアピン核酸である。
　上述の性質を満たす限り具体的な構成は特に限定しないが、典型的には、対合ヘアピン核酸は開始ヘアピン結合ドメイン及び標的RNAドメインを含む（図２）。
　「開始ヘアピン結合ドメイン」とは、対合ヘアピン核酸における、開始ヘアピン核酸の対合ヘアピン結合ドメインとハイブリダイズする核酸領域を指す。通常、開始ヘアピン結合ドメインは突出領域Xの全部又は一部を含む。具体的には、例えば、開始ヘアピン結合ドメインは、突出領域の全部又は一部、及びそれに続くステム領域Yの全部又は一部を含む（図２）。開始ヘアピン結合ドメインと、開始ヘアピン核酸の対合ヘアピン結合ドメインの塩基配列は、少なくともそれぞれのドメインの両末端で互いに相補的である。
　「標的RNAドメイン」とは、対合ヘアピン核酸における、標的RNAの塩基配列と相補的な塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列を有する核酸領域を指す。具体的には、例えば、標的RNAドメインはステム領域Y'の全部又は一部を含む（図２）。標的RNAドメインは開始ヘアピン核酸の標的RNA結合ドメインの全部又は一部とハイブリダイズ可能であり、また両ドメインの塩基配列は、少なくとも標的RNAドメインの両末端で互いに相補的である。
　対合ヘアピン核酸は、開始ヘアピン結合ドメイン及び標的RNAドメイン以外にも1個又は複数個の塩基を含むことができる。これらの塩基は、対合ヘアピン核酸において、例えば、開始ヘアピン結合ドメイン及び標的RNAドメイン間でスペーサー配列として、また開始ヘアピン結合ドメイン及び／又は標的RNAドメインの遊離末端に連結された末端配列として存在し得る。
　開始ヘアピン核酸について上述した通り、通常、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸の両方が突出領域Xを含むヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有するために、対合ヘアピン核酸には開始ヘアピン核酸とハイブリダイズすることができない塩基配列が含まれる。そのような塩基配列の位置はヘアピン核酸の設計によって異なるため特に限定しないが、例えば、対合ヘアピン核酸のステム領域Y'に位置する。
　また、対合ヘアピン核酸の両ドメインは1個又は複数個の塩基の重なりを有していてもよい。
（３）ドメイン
　ヘアピン核酸を構成する各ドメインの長さは特に限定しない。例えば、10塩基以上、11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上、15塩基以上、16塩基以上、17塩基以上、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、21塩基以上又は22塩基以上である。また、各ドメインは、例えば、55塩基以下、50塩基以下、40塩基以下、30塩基以下、25塩基以下、24塩基以下、又は23塩基以下である。
　各ドメインの配列は、ハイブリダイズする対象の核酸にハイブリダイズ可能な配列を含んでいれば特に限定しない。例えば、各ドメインは結合対象の核酸の配列と無関係な1又は複数個の塩基を含むことができる。
　ドメイン同士のハイブリダイズの様式は特に限定しないが、好ましくは、ドメイン同士がハイブリダイズした際に、各ヘアピン核酸のその他のドメインが互いにハイブリダイズする。例えば、開始ヘアピン核酸の対合ヘアピン結合ドメインと対合ヘアピン核酸の開始ヘアピン結合ドメインがハイブリダイズする場合、その開始ヘアピン核酸分子の標的RNA結合ドメインとその対合ヘアピン核酸分子の標的RNAドメインは、互いにハイブリダイズ可能な位置に配置される。そのため、通常一方のヘアピン核酸の3'末端側のドメインと他方のヘアピン核酸の5'末端側のドメインがハイブリダイズ可能である。また、開始ヘアピン核酸と標的RNAのハイブリダイズの様式は特に限定しない。
　ハイブリダイズ可能な領域の塩基配列は、対象となる塩基配列とハイブリダイズ可能であれば特に限定しない。具体的なハイブリダイズ可能な塩基配列は、例えば、以下の配列からなる：
（１）ハイブリダイズする対象配列と完全に相補的な塩基配列；
（２）（１）に対して1個又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列。
　各ドメインの全部又は一部は、複数種類の標的RNA又は複数種類のヘアピン核酸のドメインの全部又は一部にハイブリダイズ可能であり得る。
　（３－１）標的RNA結合ドメイン及び開始ヘアピン結合ドメイン
　上述の通り、開始ヘアピン核酸の標的RNA結合ドメイン及び対合ヘアピン核酸の開始ヘアピン結合ドメインは、好ましくは、突出領域Xの全部又は一部を含む。例えば、これらのドメインは、突出領域Xの全部又は一部及びそれに続くステム領域Yの全部又は一部を含む連続した領域であってもよいし、突出領域X、ステム領域Y及びループ領域Zの全部、及びステム領域Y'の一部を含む連続した領域であってもよい。例えば、突出領域Xにおける、標的RNA又は対合ヘアピン結合ドメインとハイブリダイズ可能な配列は、4塩基以上、5塩基以上、6塩基以上、7塩基以上又は8塩基以上である。また、例えば、ステム領域Yの、標的RNA又は対合ヘアピン結合ドメインとハイブリダイズ可能な配列は、2塩基以上、3塩基以上、4塩基以上、5塩基以上、6塩基以上、7塩基以上、8塩基以上、9塩基以上、10塩基以上、11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上、15塩基以上又は16塩基以上である。
　（３－２）対合ヘアピン結合ドメイン及び標的RNAドメイン
　上述の通り、開始ヘアピン核酸の対合ヘアピン結合ドメイン及び対合ヘアピン核酸の標的RNAドメインは、好ましくは、ステム領域Y'の全部又は一部を含む。例えば、これらのドメインは、ステム領域Yの一部、ループ領域Zの全部及びステム領域Y'の全部を含む連続した領域であってもよいし、ステム領域Y'の一部のみを含む連続した領域であってもよい。また、ヘアピン核酸がステム領域Y'に隣接する突出末端を有する場合、その突出末端の全部又は一部を含んでもよい。具体的には、例えば、ステム領域Y'における、開始ヘアピン結合ドメイン又は標的RNA結合ドメインとハイブリダイズ可能な配列は、4塩基以上、5塩基以上、6塩基以上、7塩基以上、8塩基以上、9塩基以上、10塩基以上、11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上又は15塩基以上である。
（４）二本鎖核酸構造
　本発明のヘアピン核酸は、標的RNAの存在下でタンパク質結合モチーフを含む二本鎖核酸構造を形成する。二本鎖核酸構造は、目的のタンパク質を結合させることができる。
　二本鎖核酸構造の具体的な構造は、二本鎖からなるタンパク質結合モチーフを含み、目的のタンパク質を結合させることが可能であれば特に限定しない。例えば、後述するようにタンパク質結合モチーフを複数又は複数種類含んでもよく、一本鎖部分を有していてもよく、枝分かれ構造等の任意の立体構造を形成してもよい。
　二本鎖核酸構造の長さは完全なタンパク質結合モチーフを含む限り特に限定しない。例えば、二本鎖核酸構造の長さはタンパク質結合モチーフの長さ以上であればよく、具体的には、例えば、タンパク質結合モチーフの長さより、1塩基対以上、2塩基対以上、3塩基対以上、4塩基対以上、5塩基対以上、6塩基対以上、7塩基対以上、8塩基対以上、9塩基対以上、10塩基対以上、11塩基対以上、12塩基対以上、13塩基対以上、14塩基対以上、15塩基対以上、16塩基対以上、17塩基対以上、18塩基対以上、19塩基対以上、20塩基対以上、21塩基対以上、22塩基対以上、23塩基対以上、24塩基対以上又は25塩基対以上長ければよい。
　二本鎖核酸構造における一本鎖部分の長さは特に限定しない。例えば、一本鎖部分の合計の塩基数は、各核酸鎖について、3～25塩基、4～24塩基、5～23塩基、6～20塩基、7～20塩基、8～15塩基、9～15塩基、10～15塩基、8～14塩基、9～14塩基、10～14塩基、8～13塩基、9～13塩基、10～13塩基とすることができる。
　二本鎖核酸構造形成時において、開始ヘアピン核酸のステム領域と対合する対合ヘアピン核酸のステム領域の塩基数は特に限定しない。例えば、10塩基対以下、9塩基対以下、8塩基対以下、7塩基対以下、6塩基対以下、5塩基対以下、4塩基対以下、3塩基対以下、2塩基対以下、1塩基対以下とすることができる。
（５）タンパク質結合モチーフ
　開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸は共に、目的のタンパク質が結合可能な二本鎖からなるタンパク質結合モチーフの一部を含む。換言すると、両ヘアピン核酸はいずれも目的のタンパク質が結合可能な状態でタンパク質結合モチーフを含まない。
　例えば、ヘアピン核酸が含むタンパク質結合モチーフの一部は、タンパク質結合モチーフを構成する少なくとも一方の核酸鎖に塩基の付加、欠失及び／若しくは置換、及び／又は非天然ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含む。具体的には、例えば、各ヘアピン核酸におけるタンパク質結合モチーフの一部は一本鎖部分を含む。この場合の一本鎖部分は特に限定しないが、例えば、突出領域X及び／又はループ領域Zの全部又は一部を含む。また、例えば、一方の核酸鎖において塩基の付加、欠失及び／又は置換が含まれる結果、非相補的な塩基対が形成されること等により一方又は両方の核酸鎖がバルジ構造等を形成する場合、本明細書においては、その部分を一本鎖部分として扱う。
　タンパク質結合モチーフの一部が一本鎖部分を含む場合、各ヘアピン核酸におけるタンパク質結合モチーフの一部が有する一本鎖部分の具体的な長さは特に限定しない。例えば、1塩基以上、2塩基以上、3塩基以上、4塩基以上、5塩基以上、6塩基以上、7塩基以上、8塩基以上又は9塩基以上とすることができる。
　また、タンパク質結合モチーフの一部が一本鎖部分を含まない場合、例えば、タンパク質結合モチーフを構成する一方の核酸鎖において非天然ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含んでもよい。この場合の非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドの種類は、その存在により目的のタンパク質が結合できなくなる限り特に限定しない。このような非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドとしては、修飾塩基及び／又は修飾糖を含むヌクレオチド、又はヌクレオシド模倣体等が挙げられる。具体的には、例えば、2'-OMe基を有するヌクレオチド、二環式ヌクレオシド等が挙げられる。
　本発明のヘアピン核酸は、好ましくは、タンパク質結合モチーフの一部が一本鎖部分を含むか、タンパク質結合モチーフを構成する一方の核酸鎖において修飾ヌクレオチドを含む。例えば、開始ヘアピン核酸及び／又は対合ヘアピン核酸が一本鎖部分を含むタンパク質結合モチーフの一部を含む。また、例えば、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸が、一本鎖部分を含むタンパク質結合モチーフの一部を含むヘアピン核酸、及び一方の核酸鎖において非天然ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むタンパク質結合モチーフの一部を含むヘアピン核酸で構成される。
　本発明のヘアピン核酸は、二本鎖核酸構造においてタンパク質結合モチーフを構成する配列に非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドを含まないことが好ましい。例えば、ヘアピン核酸中のタンパク質結合モチーフの一部が二本鎖構造で構成される場合、塩基の付加、欠失及び／又は置換、及び／又は非天然ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドはステム領域Y'に含まれるタンパク質結合モチーフの一部領域に含み、ステム領域Yに含まれるタンパク質結合モチーフの一部領域はそれらを含まないことが好ましい。
　各ヘアピン核酸に含まれるタンパク質結合モチーフ一部の大きさは特に限定しないが、好ましくは、各ヘアピン核酸はタンパク質結合モチーフを構成する少なくとも片方の核酸鎖の全長配列を含む。
　一方、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸のハイブリダイゼーションの結果形成される二本鎖核酸構造は目的のタンパク質が結合可能な二本鎖からなるタンパク質結合モチーフを含む。ここで形成されるタンパク質結合モチーフは目的のタンパク質の認識配列の最小単位を含む。核酸結合タンパク質の認識配列の最小単位の配列及びそれに結合するタンパク質は公知の方法によって知ることができる。例えば、Transfac、WordSpy、T-Reg Comparator、MOTIF、TFBIND、TFSEACH及びJASPAR等の公知のデータベースを使用することができる。また、DNAフットプリンティング、ゲル移動度シフトアッセイ又はその他公知の方法による実験に基づいて決定することができ、及び／又は公知のコンセンサス配列モチーフに基づいて予測することができる。
　二本鎖核酸構造におけるタンパク質結合モチーフは一方の核酸鎖が開始ヘアピン核酸に由来し、他方の核酸鎖が対合ヘアピン核酸に由来する。この二本鎖核酸構造におけるタンパク質結合モチーフの具体的な配列及び構造は、目的のタンパク質が結合可能であれば特に限定しない。例えば、二本鎖核酸構造におけるタンパク質結合モチーフは、非天然ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含んでも含まなくてもよいが、好ましくは非天然ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含まない。また、好ましくは、二本鎖核酸構造が有するタンパク質結合モチーフは、修飾塩基又は修飾糖を含むヌクレオチド、又はヌクレオシド模倣体を含まない。
　例えば、二本鎖核酸構造に含まれるタンパク質結合モチーフは1つであってもよく、複数及び／又は複数種類であってもよい。複数のモチーフを含む場合、その種類は特に限定しない。例えば、複数の配列モチーフが全て同じ配列モチーフであっても、複数種類の配列モチーフを含んでいてもよい。各配列モチーフに結合するタンパク質の数は特に限定しない。例えば、1種類又は複数種類のタンパク質が結合可能な配列モチーフを使用することができる。
　結合するタンパク質の種類は特に限定しない。核酸分子に結合可能なタンパク質であればよく、例えば、転写因子及びポリメラーゼ等が挙げられる。タンパク質は、好ましくは転写因子である。この場合、タンパク質結合モチーフは転写因子結合モチーフを含む。タンパク質は、例えば、特定の疾患に関与するタンパク質であってもよい。具体的には、例えば、タンパク質は、炎症関連因子、細胞周期関連因子、薬剤耐性関連因子等を含む。
　本明細書において「炎症関連因子」とは、炎症中に影響を受けるタンパク質を指す。本明細書における炎症関連因子には、炎症促進因子及び炎症抑制因子のいずれも含む。具体的な炎症関連因子としては、例えば、各種インターロイキン（例えば、IL-1、TNF-α及びIFN-β等を含む）、NF-κBファミリータンパク質、STATファミリータンパク質、及びHIFタンパク質等が含まれる。本明細書における炎症関連因子には、例えば、がん及び免疫系疾患等の疾患に関連することが知られているタンパク質が含まれる。
　例えば、NF-κBファミリータンパク質は、サイトカイン、細菌やウイルス産物等の細胞内外の様々な刺激によって活性化される転写因子であり、多くの炎症性疾患においてその異常な発現が関与しているとされている。NF-κBファミリータンパク質にはNF-κB1、NF-κB12、REL、RELA、RELB等が含まれる。例えば、ヒトNF-κB1タンパク質の例示的なアミノ酸配列は配列番号２で示される。
　例えば、NF-κBファミリータンパク質により認識されるタンパク質結合モチーフは、配列番号３及び４で示す塩基配列からなる二本鎖で構成される配列モチーフである。
　本明細書において「細胞周期関連因子」とは、細胞周期の進行に関与するタンパク質を指す。具体的な細胞周期関連因子としては、例えば、E2Fファミリータンパク質（例えば、IL-1、TNF-α及びIFN-β等を含む）、ORCファミリータンパク質、RBファミリータンパク質等が含まれる。本明細書における細胞周期関連因子には、例えば、がん及び免疫系疾患等の疾患に関連することが知られているタンパク質が含まれる。
　E2Fファミリータンパク質は、細胞周期の制御、DNA修復及び染色体の維持に関与する転写因子としてして知られ、DNA結合ドメイン、分化制御転写因子タンパク質（DP）との相互作用を決定する二量化ドメイン、酸性アミノ酸に富む転写活性化ドメイン等、ファミリー内でアミノ酸配列が保存されたタンパク質ドメインを有する。E2Fファミリータンパク質としては、E2F1～E2F8までの8つが知られている。例えば、ヒトE2F1タンパク質の例示的なアミノ酸配列は配列番号５で示される。
　例えば、E2Fファミリータンパク質により認識されるタンパク質結合モチーフは、5'-TTT(C/G)(G/C)CGC-3'及び5'-GCG(G/C)(C/G)AAA-3'からなる二本鎖で構成される配列モチーフである（配列中、（C/G）はCでもGでもよいことを示す）。
　本明細書において「薬剤耐性関連因子」とは、腫瘍細胞等の疾患細胞の薬剤に対する抵抗性を高める機能に関与するタンパク質を指す。本明細書における薬剤耐性関連因子には、例えば、ABCスーパーファミリー遺伝子群等の多剤耐性遺伝子の発現を制御する転写因子等が含まれる。具体的な薬剤耐性関連因子としては、例えば、NF-Y、Sp1、YB-1、AP-1、ZIC5等が挙げられる。これらの転写因子の認識配列は当技術分野において公知である。
　本発明のヘアピン核酸は、標的RNAが存在しない条件では完全なタンパク質結合モチーフが形成されないため、その細胞において目的のタンパク質が発現していても、本発明のヘアピン核酸による影響を受けない。そのため、タンパク質結合モチーフに結合するタンパク質の発現様式は特に限定しない。例えば、タンパク質は、全身性に時期や刺激の有無にかかわらず発現していてもよいし、条件特異的に発現していてもよい。条件特異的な発現には、例えば、組織特異的に、細胞特異的に、時期特異的に、又は細胞外シグナル等の刺激に反応して発現すること等が含まれる。
　また、タンパク質は、特定の条件下において配列モチーフに結合可能であればよく、いかなる条件下でも安定して結合可能である必要はない。例えば、配列モチーフの配列のみによってはタンパク質は結合せず、特定の修飾を含む時のみ結合が可能なメチル化CpG結合タンパク質等も本発明のタンパク質に含まれる。配列モチーフにタンパク質が結合可能な条件は、本発明のヘアピン核酸組成物の作製及び使用時点で満たされていてもよく、細胞内での反応を通じて満たされてもよい。
（６）標的RNA
　開始ヘアピン核酸は標的RNAとハイブリダイズ可能である。標的RNAは本発明のヘアピン核酸に基づく二本鎖核酸構造の形成反応の起点となり、本発明のヘアピン核酸組成物は標的RNAを発現する細胞特異的に目的のタンパク質を捕捉等することができる。そのため、標的RNAは目的のタンパク質を捕捉する細胞において発現するRNAであればよい。また、それ以外の細胞、例えば、正常細胞では発現していないRNAを好適に使用することができる。好ましくは、目的のタンパク質を捕捉する細胞において特異的に発現するRNAである。
　標的RNAの発現様式は特に限定しない。例えば、標的RNAは、全身性に時期や刺激の有無にかかわらず発現していてもよいし、条件特異的に発現していてもよい。条件特異的な発現には、例えば、組織特異的に、細胞特異的に、時期特異的に、又は細胞外シグナル等の刺激に反応して発現すること等が含まれる。標的RNAとして、例えば、条件特異的に発現するRNA、特に細胞特異的に発現するRNAが挙げられる。この場合、標的RNAが発現する細胞は特に限定しない。具体的には、例えば、がん細胞、炎症細胞又は免疫細胞である。標的RNAが発現する炎症細胞及び免疫細胞は、好ましくは、異常な活性を示す。
　本明細書において「異常な活性」とは、正常な細胞における活性と比較して、顕著に、又は有意に活性が抑制又は促進されていることを指す。
　本明細書において特定の遺伝子が「高発現している」とは、正常な細胞における発現量と比較して、顕著に、又は有意に発現量が増加していることを指す。
　本明細書において「免疫細胞」とは、免疫に関与する細胞を指す。具体的には、リンパ球、マクロファージ及び樹状細胞等が挙げられる。リンパ球としては、例えば、T細胞、B細胞、NK細胞及び形質細胞等がある。本明細書における免疫細胞は、好ましくは、免疫系疾患において異常な活性を有する細胞である。
　本明細書において「炎症細胞」とは、炎症反応に関与する細胞を指す。具体的には、例えば、好酸球、好中球、好塩基球、肥満細胞、及びII型自然リンパ球等が挙げられる。本明細書における炎症細胞は、好ましくは、炎症性疾患において異常な活性を有する細胞である。
　具体的な標的RNAは特に限定しないが、例えば、miR-21等を好適に使用することができる。
　本明細書において「miR-21」とは、配列番号１に表される全長が22塩基の塩基配列を有するmiRNA、及びその変異体、相同体、修飾体及び誘導体をいう。miR-21は多くのがんにおいて発現が上昇していることが知られており、細胞増殖や細胞死、DNA損傷応答等に関与することが知られている。
（７）ヘアピン核酸組成物
　本発明のヘアピン核酸組成物に含まれる開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸は、それぞれ5'末端突出型及び3'末端突出型のいずれでもよいが、好ましくは、開始ヘアピン核酸及び前記対合ヘアピン核酸は共に3'末端又は5'末端に突出領域を含み、共に5'末端突出型又は3'末端突出型のヘアピン核酸であることが好ましい。
　ヘアピン核酸組成物は複数種類の開始ヘアピン核酸及び／又は複数種類の対合ヘアピン核酸を含んでいてもよい。
　各ヘアピン核酸において、各領域の長さや自由エネルギー変化量は同一であっても、同一でなくてもよい。一般に、一連の二本鎖核酸構造の形成反応に関与するヘアピン核酸のうち、最も開裂しにくいヘアピン核酸のヘアピン構造の開裂反応がその反応の律速段階とされる。例えば、開始ヘアピン核酸のヘアピン構造形成反応の自由エネルギー変化量を、対合ヘアピン核酸の自由エネルギー変化量より低くすることができる。
　また、例えば、本発明のヘアピン核酸組成物は追加で任意のヘアピン核酸を含むことができる。それらヘアピン核酸の具体的な機能は特に限定しないが、例えば、二本鎖核酸構造の形成調節するヘアピン核酸や、形成された二本鎖核酸構造の機能を調節、改変又は増幅するヘアピン核酸等が挙げられる。二本鎖核酸構造の形成調節するヘアピン核酸としては、例えば、特定のRNAの存在下で二本鎖核酸構造の形成を阻害するヘアピン核酸等が挙げられる。また、形成された二本鎖核酸構造の機能を調節、改変又は増幅するヘアピン核酸としては、例えば、二本鎖核酸構造の一本鎖部分にハイブリダイズ可能なヘアピン核酸や、二本鎖核酸構造で始めて露出する一本鎖部分を標的配列として二本鎖核酸構造形成反応が誘導されるヘアピン核酸等が挙げられる。本発明の開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸はいずれも、遺伝子の転写や翻訳の過程を直接調節したり、遺伝情報を改変する活性を持たないことが好ましいが、本態様の組成物には、追加の成分としてshRNA等の遺伝子の転写や翻訳過程を直接制御する核酸分子等を含んでもよい。
　本明細書における核酸分子は、任意の方法により作製することができる。例えば、化学的合成法により（例えば自動合成装置を使用して）、又は酵素的工程（例えば、限定するものではないが、ポリメラーゼ、リガーゼ又は制限酵素反応）により、全体的に又は部分的に作製することができる。
　本発明のヘアピン核酸組成物を構成する各ヘアピン核酸は、DNA及び／又はRNAヌクレオチドで構成されてもよい。また、各ヘアピン核酸は、構成するヌクレオチドとして天然の及び／又は非天然のヌクレオチドを含むことができる。含まれる天然ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドの種類、数及び位置等は特に限定しない。
（７－１）非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド
　「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を含む化合物をいう。「ヌクレオシド」は、塩基及び糖の組合せである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基としても知られる）部分は、通常は、複素環式塩基部分である。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の2'、3'、又は5'ヒドロキシル部分に連結可能である。オリゴヌクレオチドは、互いに隣接するヌクレオシドの共有結合によって形成され、直鎖ポリマーオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成するとみなされている。
　本明細書において「天然ヌクレオチド」は、DNA中に見られるデオキシリボヌクレオチド及びRNA中に見られるリボヌクレオチドを含む。本明細書において、「デオキシリボヌクレオチド」及び「リボヌクレオチド」は、それぞれ、「DNAヌクレオチド」及び「RNAヌクレオチド」と称することもある。
　同様に、本明細書において「天然ヌクレオシド」は、DNA中に見られるデオキシリボヌクレオシド及びRNA中に見られるリボヌクレオシドを含む。本明細書において、「デオキシリボヌクレオシド」及び「リボヌクレオシド」は、それぞれ、「DNAヌクレオシド」及び「RNAヌクレオシド」と称することもある。
　「非天然ヌクレオチド」は、天然ヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドを指し、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド模倣体を含む。同様に、本明細書において「非天然ヌクレオシド」は、天然ヌクレオシド以外の任意のヌクレオシドを指し、修飾ヌクレオシド及びヌクレオシド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、及び修飾核酸塩基のいずれか1つ以上を有するヌクレオチドを意味する。本明細書において「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸は、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の特性により、天然型よりも好ましい場合がある。
　本明細書において「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステル結合）からの置換又は任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指す。修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むヌクレオシド間結合、及びリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、及びホスホロアミデート結合が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子を硫黄原子に置換したヌクレオシド間結合を指す。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は周知である。修飾ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性が天然に存在するヌクレオシド間結合よりも高い結合であることが好ましい。
　本明細書において「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル以外のあらゆる核酸塩基を意味する。「非修飾核酸塩基」又は「非修飾塩基」（天然核酸塩基）とは、プリン塩基であるアデニン（A）及びグアニン（G）、並びにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）、及びウラシル（U）を意味する。修飾核酸塩基の例としては、例えば、置換基を導入された塩基が挙げられる。置換基が導入される塩基の種類は特に限定しない。ピリミジン塩基及びプリン塩基のいずれであってもよい。また、置換基が導入される位置は特に限定しない。例えば、ピリミジン塩基であれば、3'位、4'位、5'位、6'位又はこれらの組合せであってよく、プリン塩基であれば、2'位、6'位、7'位、8'位又はこれらの組合せであってよい。具体的な修飾塩基としては、例えば、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミル化シトシン、5-カルボキシル化シトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン又はN4-メチルシトシン；2-アミノアデニン、N6-メチルアデニン、7-デアザアデニン、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、8-チオールアデニン、8-チオアルキルアデニン、8-ヒドロキシルアデニン又は8-ブロモアデニン；2-チオ-チミン；N2-メチルグアニン、6-メチルグアニン、7-デアザグアニン、7-メチルグアニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグアニン、8-チオアルキルグアニン、8-ヒドロキシルグアニン又は8-ブロモグアニン；5-メチルウラシル、N3-メチルウラシル、6-メチルウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシル、5-ヒドロキシウラシル、シュードウラシル又はメチルシュードウラシル；ヒポキサンチン又はキサンチン；及びこれらの誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
　本明細書において「修飾糖」とは、天然糖部分（すなわち、DNA（2'-H）又はRNA（2'-OH）中に認められる糖部分）からの置換及び／又は任意の変化を有する糖を指す。本明細書における核酸は、場合により、修飾糖を含む1つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。糖修飾により、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合親和性の増加、又は他の何らかの有益な生物学的特性が核酸に付与される場合がある。例えば、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含んでもよい。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定するものではないが、置換基（5'及び2'置換基を含む）の付加、非ジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸（架橋核酸、BNA）の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、又はC(R1)(R2)（R、R1及びR2は、それぞれ独立して、H、C1-C12アルキル、又は保護基を表す）での置換、及びそれらの組合せ等が挙げられる。
　本明細書において、修飾糖部分を有するヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、5'-ビニル、5'-メチル、4'-S、2'-F（2'-フルオロ基）、2'-OCH3（2'-OMe基若しくは2'-O-メチル基）、及び2'-O(CH2)2OCH3置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。2'位の置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、-O-アリル、-O-C1-C10アルキル、-OCF3、-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、及び-O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)から選択することができ、各Rm及びRnは、独立して、H又は置換若しくは非置換C1-C10アルキルである。本明細書において「2'-修飾糖」は、2'位で修飾されたフラノシル糖を意味する。
　本明細書で使用する際、「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式糖部分を含む核酸は、一般に架橋核酸（bridged nucleic acid、BNA）と称される。本明細書において、二環式糖部分を含むヌクレオシドは、「架橋ヌクレオシド」と称することもある。
　二環式糖は、2'位の炭素原子及び4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている糖であってよい。二環式糖の例は当業者に公知である。二環式糖を含む核酸（BNA）の1つのサブグループは、4'-(CH2)p-O-2'、4'-(CH2)p-CH2-2'、4'-(CH2)p-S-2'、4'-(CH2)p-OCO-2'、4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'［式中、p、m及びnは、それぞれ1～4の整数、0～2の整数、及び1～3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基（蛍光若しくは化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内又は核内局在化シグナルペプチド等）を表す］により架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有するものである。また、BNAの3'位の炭素原子上のOR2置換基及び5'位の炭素原子上のOR1置換基に関し、R1及びR2は、典型的には水素原子であるが、その他任意の置換基であってもよい。例えば、それぞれの置換基は互いに同一であっても異なっていてもよい。具体的なR1及びR2としては、例えば、それぞれ独立に、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、又は-P(R4)R5［ここで、R4及びR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1～5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1～5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1～6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、又は1～5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す］等が挙げられる。このようなBNAの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA（LNA（Locked Nucleic Acid(登録商標)）、2',4'-BNAとしても知られている）、例えば、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA若しくはβ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNA（ENAとしても知られている）、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNA（2',4'-BNANCとしても知られている）、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA（cEt BNAとしても知られている）、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA（cMOE BNAとしても知られている）、アミドBNA(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)（AmNAとしても知られている）、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸（scpBNAとしても知られている）及び当業者に公知の他のBNAが挙げられる。
　修飾糖の調製方法は、当業者に周知である。修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分（天然、修飾、又はそれらの組合せ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持されてよい。
　本明細書における「ヌクレオシド模倣体」は、オリゴマー化合物の1つ以上の位置において糖、糖及び塩基、又は糖、塩基及び結合を置換するために使用される構造体を含む。ヌクレオシド模倣体としては、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環式又は三環式糖模倣体、例えば、非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣体が挙げられる。「ヌクレオチド模倣体」は、オリゴマー化合物の1つ以上の位置において、ヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造体を含む。ヌクレオチド模倣体としては、例えば、ペプチド核酸又はモルホリノ核酸（-N(H)-C(=O)-O-又は他の非ホスホジエステル結合によって結合されるモルホリノ）が挙げられる。ペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid、PNA）は、糖の代わりにN-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合した主鎖を有するヌクレオチド模倣体である。「模倣体」とは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間結合を置換する基を指す。一般に、模倣体は、糖又は糖－ヌクレオシド間結合の組合せの代わりに使用され、核酸塩基は、選択される標的に対するハイブリダイゼーションのために維持される。
　修飾の具体的な態様は特に限定しない。例えば、同一核酸分子中のヌクレオチドに独立して異なる修飾を行うことができる。また、例えば、1つのヌクレオチドにおいて複数種類の修飾がなされていてもよい。例えば、酵素的切断に対する抵抗性を与える等の目的で、ヌクレオチドに、修飾ヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエート結合）及び修飾糖（例えば、2'-O-メチル修飾糖又は二環式糖）を含めることができる。また、例えば、修飾核酸塩基（例えば、5-メチルシトシン）及び修飾糖（例えば、2'-O-メチル修飾糖又は二環式糖）を含めることができる。また、例えば、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸のうち1種類以上が全長にわたって天然ヌクレオシド及び非修飾ヌクレオチドを含まない。
　また、上述した通り、二本鎖核酸構造においてタンパク質結合モチーフを構成する配列領域には、非天然ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを含まないことが好ましい。
　修飾の選択は、当業者であれば、核酸医薬に関連する文献（例えば、WO 2007/143315等）の説明等を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。また、修飾の目的は特に限定しない。例えば、ヘアピン核酸及び二本鎖核酸構造の、安定化、検出及び薬理機能の発揮のために修飾を行うことができる。
（７－２）miR-21を標的RNAとするヘアピン核酸組成物
　本発明のヘアピン核酸組成物は標的RNAをmiR-21として設計することができる。標的RNAとしてmiR-21を使用する以外は上述の通りであり、この場合の目的のタンパク質及びヘアピン核酸の具体的な配列は特に限定しない。具体的には、例えば、目的のタンパク質をNF-κB及び／又はE2Fとすることができる。
　例えば、本発明のヘアピン核酸組成物が標的RNAをmiR-21とし、目的のタンパク質をNF-κBとする場合、開始ヘアピン核酸は、配列番号６で示す塩基配列をからなる塩基配列、配列番号６で示す塩基配列を含む塩基配列、又は配列番号６で示す塩基配列において1個又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列とすることができる。また、例えば、対合ヘアピン核酸は、配列番号７で示す塩基配列をからなる塩基配列、配列番号７で示す塩基配列を含む塩基配列、又は配列番号７で示す塩基配列において1個又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列とすることができる。
　この場合、任意のヌクレオチドを非天然ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオチドとすることができる。そのヌクレオチドの具体的な位置は特に限定しないが、例えば、ステム領域Y'のヌクレオチド（例えば、塩基としてアデニンを有するヌクレオチド）を非天然ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオチドとすることができる。具体的には、例えば、配列番号７で示す塩基配列における36位、43位及び／又は47位に対応するヌクレオチドを非天然ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオチドとすることができる。具体的な修飾を含む対合ヘアピン核酸の配列としては、例えば、配列番号９で示す塩基配列等が挙げられる。
　また、例えば、本発明のヘアピン核酸組成物が標的RNAをmiR-21とし、目的のタンパク質をE2Fとする場合、開始ヘアピン核酸は、配列番号８で示す塩基配列をからなる塩基配列、配列番号８で示す塩基配列を含む塩基配列、又は配列番号８で示す塩基配列において1個又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列とすることができる。また、例えば、対合ヘアピン核酸は、配列番号９で示す塩基配列をからなる塩基配列、配列番号９で示す塩基配列を含む塩基配列、又は配列番号９で示す塩基配列において1個又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列とすることができる。
　この場合、任意のヌクレオチドを非天然ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオチドとすることができる。そのヌクレオチドの具体的な位置は特に限定しないが、例えば、ステム領域Y'のヌクレオチド（例えば、塩基としてチミジンを有するヌクレオチド）を非天然ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオチドとすることができる。具体的には、例えば、配列番号９で示す塩基配列における36位及び／又は38位に対応するヌクレオチドを非天然ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオチドとすることができる。この場合の非天然ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオチドは、好ましくは修飾糖及び／又は修飾塩基を含むヌクレオチド又はヌクレオチド模倣体を使用することが好ましい。具体的な修飾を含む対合ヘアピン核酸の配列としては、例えば、配列番号１１で示す塩基配列等が挙げられる。
（８）ベクター
　本発明のヘアピン核酸組成物において、開始ヘアピン核酸及び／又は対合ヘアピン核酸がベクターに包含されていてもよい。ベクターの種類は特に限定しない。例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド、及び人工染色体の他、リポソーム、ナノ粒子、ミセル、インテリジェントゲル等を挙げることができる。
　ウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に由来する種々のベクターが含まれる。プラスミドには、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等が含まれる。人工染色体には、ヒト人工染色体（HAC; Human Artificial Chromosome）、マウス人工染色体（ＭAC; Mouse Artificial Chromosome）、酵母人工染色体（YAC; Yeast Artificial Chromosome）、菌人工染色体（BAC; Bacterial Artificial Chromosome）、及びP1由来人工染色体（PAC; P1-derived Artificial Chromosome）等が含まれる。
　また、ナノ粒子としては、例えば、Davis M E, et al., Nature, 2010, 464: 1067-1070に記載の標的ナノ粒子伝達システム等が挙げられ、リポソームとしては、例えば、膜透過ペプチド結合リポソーム、SNALPs等が挙げられる。リポソームは、コレステロール結合体の形態に調製してもよい。また、Castanotto D. & Rossi J J., Nature, 2009, 457, 426-433に記載のRNAi伝達システム等を転用することもできる。
１－４．効果
　本発明のヘアピン核酸組成物は、標的RNAの存在下で二本鎖核酸構造の形成を誘導し、形成された二本鎖核酸構造に含まれるタンパク質結合モチーフを介して、特定のタンパク質と結合することができる。標的RNAが存在し、二本鎖核酸構造の形成反応が誘導されれば二本鎖核酸構造が多数形成されるため、目的のタンパク質がタンパク質結合モチーフの数に応じて多数結合する。これにより、目的のタンパク質を捕捉することによって、目的のタンパク質の機能を阻害したり、遊離した目的のタンパク質を減少させたり、凝集を抑制したりといった効果をもたらす。例えば、がん細胞を免疫系から保護するタンパク質（例えば、NF-κBシグナル経路関連タンパク質）を目的のタンパク質とすることにより、その機能を阻害することができる。また、例えば、多くの細胞に存在するタンパク質（例えば、細胞周期チェックポイント因子等）を目的のタンパク質とすることにより、標的RNAを発現する特定の細胞においてのみその機能を阻害することができる。
　これらの効果の測定は、ヘアピン核酸組成物を被験体（例えば、実験動物及び培養細胞等）に投与し、一定の期間、例えば、30分後、1時間後、2時間後、3時間後、6時間後、12時間後、1日後又は数日後（例えば1～7又は2～7日後）に、その効果の指標を測定すること等によって実施することができる。具体的には、例えば、細胞へのストレスを目的とする場合、細胞の生存率、細胞ストレスマーカー、細胞死マーカー等の細胞ストレスの指標等の測定等により実施することができる。また、例えば、タンパク質の捕捉の場合、その遊離タンパク質量の測定、そのタンパク質の機能に関連する反応生成物（例えば、転写の調節を受ける遺伝子の発現、触媒される酵素反応の生成物、及び媒介されるシグナル経路の活性等）の量の測定等によって実施することができる。
　また、例えば、本発明のヘアピン核酸組成物の適用により減少が期待される指標や生成物のレベルが、陰性対照（例えばビヒクル投与）と比較して減少している場合、又は増加が期待される指標等のレベルが陰性対照と比較して増加している場合に、本発明のヘアピン核酸組成物が効果を発揮したと判断することができる。この場合のレベルの変化量は特に限定しない。具体的には、例えば、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、又は少なくとも40％変化している場合に、ヘアピン核酸組成物が目的の効果をもたらし得ることが示される。あるいは、例えば、統計学的に変化が有意であるかを確認することによって目的の効果をもたらし得るかどうかを判断してもよい。
２．医薬組成物
２－１．概要
　本発明の第２の態様は医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、第１態様に記載のヘアピン核酸組成物を有効成分として含み、標的RNAを含む目的の部位において二本鎖核酸構造の形成を誘導する。本発明の医薬組成物を使用することで、目的の部位において、二本鎖核酸構造への目的のタンパク質の結合に基づく所望の効果を得ることができる。
２－２．構成
　本態様の医薬組成物の構成成分について説明する。本発明の医薬組成物は、必須の構成成分として第１態様に記載のヘアピン核酸組成物を有効成分として含み、任意選択可能な構成成分として担体を含む。以下、各構成成分について具体的に説明をする。
（１）有効成分
　本発明の医薬組成物は、必須の有効成分として第１態様に記載のヘアピン核酸組成物を有効量含む。ヘアピン核酸組成物の構成については第１態様で詳述していることから、ここでの具体的な説明は省略する。本発明の医薬組成物が含むヘアピン核酸組成物の形態は特に限定しない。例えば、本発明の医薬組成物は有効成分として、各ヘアピン核酸を別々に含んでもよく、ヘアピン核酸組成物を包含するベクターを含んでもよい。また、複数種類のヘアピン核酸組成物を含むことができる。その場合、各ヘアピン核酸組成物は例えば、標的RNAが互いに異なってもよく、タンパク質結合モチーフが互いに異なってもよく、具体的な配列や修飾が異なるのみで標的RNAやタンパク質結合モチーフが異なってもよい。本発明の医薬組成物によって達成する所望の効果に応じて、他に1以上の有効成分を含むことができる。
　「有効量」とは、ヘアピン核酸組成物が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する被験体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。最終的には医師、獣医師又は薬剤師等をはじめとする投与者の判断によって決定される。
　本明細書において「被験体」とは、本発明のヘアピン核酸組成物、医薬組成物、タンパク質捕捉組成物及びタンパク質機能阻害組成物を適用する対象をいう。被験体は、個体の他、器官、組織、及び細胞を含む。被験体が個体の場合、ヒトを含むあらゆる動物が該当し得る。例えば、ヒト以外では、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等が挙げられる。限定はしないが、被験体は、タンパク質の発現異常又は異常な細胞を有する個体や、疾患の治療又は予防が必要な個体であってもよい。
　本明細書において「被験体の情報」とは、適用する生体の様々な個体情報である。例えば、被験体がヒトであれば、年齢、体重、性別、食生活、健康状態、疾患の進行度や重症度、薬剤感受性、併用薬物の有無等を含む。
　本明細書において「目的の部位」とは、目的の細胞を含む生体部位を指す。本明細書において「目的の細胞」とは、本発明のヘアピン核酸組成物による効果の発揮が想定される細胞を指す。具体的には、目的の細胞は標的RNAを発現する細胞及び／又は標的RNAを高発現している細胞である。さらに、例えば、目的の細胞は、タンパク質結合モチーフに結合可能な目的のタンパク質をさらに発現する細胞であってもよい。
（２）担体
　本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、香料、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、増粘剤、溶解助剤、及び他の添加剤が挙げられる。
　溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤（例えば、植物性油等）のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　上記担体は、有効成分であるヘアピン核酸組成物の生体内での酵素等による分解を回避又は抑制する他、製剤化や投与方法を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
（３）剤形
　本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分である第１態様に記載のヘアピン核酸組成物を分解等により不活化させることなく、標的部位まで送達し、生体内でその有効成分の薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。
　具体的な剤形は、投与形態及び／又は処方条件によって異なる。本発明の医薬組成物の投与形態は、経口投与と非経口投与に大別することができる。投与方法が非経口投与であれば、好ましい剤形は、対象部位への直接投与又は循環系を介した全身投与が可能な液剤である。液剤の例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、前記賦形剤、エリキシル剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。その他、軟膏、硬膏剤（plaster）、パップ剤（cataplasm）、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、及び坐剤であってもよい。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。本発明の医薬組成物の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。
　本発明のヘアピン核酸組成物は、水、日本薬局方溶出試験第２液、又は日本薬局方崩壊試験第２液に対する溶解性に優れ、体内動態（例、血中薬物半減期、脳内移行性、代謝安定性、CYP阻害）に優れ、毒性が低く（例えば、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、薬物相互作用、がん原性、光毒性等の点から医薬として、より優れている）、かつ副作用も少ない（例えば、過沈静（sedation）の抑制、層状壊死の回避）等の医薬品として優れた性質も有する。
（４）投与形態及び投与量
　本明細書において、本発明の医薬組成物の好ましい投与形態は特に限定しない。例えば、経口投与又は非経口投与であればよい。通常は非経口投与で使用される。
　非経口投与の具体例として、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与（埋め込み型持続皮下投与を含む）、皮内投与、気管／気管支投与、直腸投与、輸血による投与、腫瘍内投与、腫瘍近傍投与（例えば、腫瘍近傍における皮内投与又は皮下投与）、脳室内投与、髄腔内投与、経鼻投与、及び筋肉内投与が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は反復投与でも細胞内において効果が相加的に働く。また、反復投与する場合、ある程度の投与間隔（例えば、半日以上）をおいた方が有効性を向上させることができる。
（５）適用対象疾患
　本発明の医薬組成物の適用対象となる疾患は、特に限定しない。例えば、神経疾患、中枢神経系疾患、代謝性疾患、腫瘍（例えば、悪性腫瘍（がん））、感染症、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び炎症性疾患）、及び異常タンパク質蓄積症といった特定のタンパク質の異常な発現や異常な細胞の存在を伴う疾患を対象とすることができる。本発明の医薬組成物は、例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び異常タンパク質蓄積症（例えば、神経変性疾患）からなる群から選択される疾患の治療を目的とすることができる。
　本明細書における悪性腫瘍（がん）は、例えば、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、前立腺がん、子宮がん子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん、副腎がん、甲状腺がん、皮膚がん、頭頸部がん、消化器がん、膵がん、乳がん及び肺がん並びにそれらの転移を含む。
　例えば、がんを適用疾患とする場合、本態様の医薬組成物と同様の構成により、本発明のヘアピン核酸組成物を有効成分として含む抗がん剤とすることができる。
　本発明の抗がん剤は任意で他の抗がん剤を追加で含むことができる。
　この場合、対象となるがんは上述した任意のがんであってよい。また、標的RNAは適用対象のがん細胞特異的に発現しているRNA及び／又は適用対象のがん細胞特異的に高発現しているRNAとすることができる。
　また例えば、炎症性疾患を適用疾患とする場合、本態様の医薬組成物と同様の構成により、本発明のヘアピン核酸組成物を有効成分として含む抗炎症剤とすることができる。
　本発明の抗炎症剤は任意で他の抗炎症剤を追加で含むことができる。
　この場合、対象となる炎症性疾患は、定義の項で上述した任意の炎症性疾患であってよい。また、標的RNAは適用対象の炎症細胞特異的に発現しているRNA及び／又は適用対象の炎症細胞特異的に高発現しているRNAとすることができる。また、例えば、炎症反応の原因となっている細胞がある場合は、その原因となっている細胞で特異的に発現している及び／又は高発現しているRNAを標的RNAとすることができる。
３．タンパク質捕捉組成物
３－１．概要
　本発明の第２の態様はタンパク質捕捉組成物である。本発明のタンパク質捕捉組成物は、第１態様に記載のヘアピン核酸組成物を有効成分として含み、標的RNAを含む目的の細胞において二本鎖核酸構造の形成を誘導する。本発明のタンパク質捕捉組成物を使用することで、目的の細胞において、目的のタンパク質を捕捉することができる。
３－２．構成
　本態様のタンパク質捕捉組成物の構成成分について説明する。本発明のタンパク質捕捉組成物は、必須の構成成分としてヘアピン核酸組成物を有効成分として含み、任意選択可能な構成成分として担体を含む。以下、各構成成分について具体的に説明する。
　本発明の細胞死促進組成物は、必須の有効成分として第１態様に記載のヘアピン核酸組成物を有効量含む。所望の効果が目的のタンパク質の捕捉であることを除けば、有効成分の基本的内容は、第２態様に記載の医薬組成物に準ずる。したがって、ここでは相違点のみを記載する。
　本発明のタンパク質捕捉組成物は目的のタンパク質の捕捉を目的としている。したがって、有効成分として、第１態様に記載のヘアピン核酸組成物以外に目的のタンパク質の凝集や捕捉が可能な有効成分を1以上含むことができる。具体的な有効成分としては、例えば、目的のタンパク質に結合可能な化合物、核酸及び／又はタンパク質等が挙げられる。
　本発明のタンパク質捕捉組成物に使用される担体や剤形等の基本的内容は、第２態様の医薬組成物に準ずる。したがって、ここでの詳細な説明は省略する。
　本発明のタンパク質捕捉組成物が、目的のタンパク質を捕捉することにより発揮する効果は特に限定しない。例えば、目的のタンパク質を捕捉するにより遊離状態の目的のタンパク質を減少させることができる。また、例えば、目的のタンパク質を捕捉することにより、目的のタンパク質を細胞中の特定の位置に配置することができる。これにより、例えば、他のタンパク質等との相互作用を促進又は抑制することができる。
４．タンパク質機能阻害組成物
４－１．概要
　本発明の第４の態様はタンパク質機能阻害組成物である。本発明のタンパク質機能阻害組成物は、第１態様に記載のヘアピン核酸組成物を有効成分として含み、標的RNAを含む目的の部位において二本鎖核酸構造の形成を誘導する。本発明のタンパク質機能阻害組成物を使用することで、例えば、目的の細胞において、二本鎖核酸構造への目的のタンパク質の結合に基づき目的のタンパク質の機能を競合阻害することができる。
４－２．構成
　本態様のタンパク質機能阻害組成物の構成成分について説明する。本発明のタンパク質機能阻害組成物は、必須の構成成分としてヘアピン核酸組成物を有効成分として含み、任意選択可能な構成成分として担体を含む。以下、各構成成分について具体的に説明をする。
　本発明のタンパク質機能阻害組成物は、必須の有効成分として第１態様に記載のヘアピン核酸組成物を有効量含む。所望の効果がタンパク質機能阻害であることを除けば、有効成分の基本的内容は、第２態様に記載の医薬組成物に準ずる。したがって、ここでは相違点のみを記載する。
　本発明のタンパク質機能阻害組成物はタンパク質機能阻害を目的としている。したがって、有効成分として、第１態様に記載のヘアピン核酸組成物以外にタンパク質機能阻害が可能な有効成分を1以上含むことができる。具体的な有効成分としては、例えば、遺伝子発現抑制剤（例えば、アンチセンス核酸及びショートヘアピン核酸等）やタンパク質レベルでの機能阻害剤（例えば、抗体、アプタマー及び拮抗阻害剤等）等が挙げられる。
　本発明のタンパク質機能阻害組成物に使用される担体や剤形等の基本的内容は、第２態様の医薬組成物に準ずる。したがって、ここでの詳細な説明は省略する。
　本発明のタンパク質機能阻害組成物は、例えば、タンパク質結合モチーフに結合するタンパク質を介して二本鎖核酸構造に間接的に結合するタンパク質等、タンパク質結合モチーフに直接結合するタンパク質以外が阻害対象であってもよい。
＜実施例１：無細胞系による二本鎖核酸構造の形成効率の評価＞
（目的）
　無細胞系の実験系において、ヘアピン核酸による二本鎖核酸構造の形成能を調べた。
（方法）
１．ヘアピン核酸の設計
　miR-21（配列番号１）を標的RNAとし、NF-κB結合モチーフの一部を有するヘアピン核酸セットをオンラインソフトウェアNUPACK（http://www.nupack.org/）を用いて設計した。各ヘアピン核酸の配列を表１に示し、そのヘアピン構造を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　設計した各ヘアピン核酸は核酸自動合成機を用いて化学合成した。
２．二本鎖核酸構造の形成能の評価
　各ヘアピン核酸セットについて、開始ヘアピン核酸（HP1）及び／又は対合ヘアピン核酸（HP2）をそれぞれ1μMの濃度で含むTE緩衝溶液にmiR-21を終濃度0.1μMとなるように添加し、その混合液を室温で1時間静置した。静置後に反応溶液を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。ゲルの染色にはSYBRTM Gold（Thermo Fischer Scientific社）を用い、ゲルの撮影はGel Doc EZ（Bio-Rad社）を用いて行った。
（結果）
　結果を図４に示す。
　miR-21非存在下では、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸の両方が存在している条件下でも二本鎖核酸構造（図４中、「二量体」）は形成されなかった（図４、左から3列目）。しかし、miR-21存在下では、添加したヘアピン核酸のほとんどが二本鎖核酸構造を形成した（図４、左から4列目）。この結果から、miR-21存在下で特異的に二本鎖核酸構造の形成が誘導されることが示された。
＜実施例２：二本鎖核酸構造のタンパク質の捕捉能の評価＞
（目的）
　二本鎖核酸構造上のタンパク質結合モチーフのタンパク質の捕捉能を調べた。
（方法）
　HP1及びHP2はそれぞれNF-κBの認識配列の一部を有している（図３、両矢印）。本実施例では、開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸をそれぞれ0.1μMの濃度で用いた。一方のヘアピン核酸の3'末端のヌクレオチドは、検出用のFAMで修飾した。表２に実施例２及び３で使用したヘアピン核酸の配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ヘアピン核酸を含むリン酸緩衝溶液（pH 7.4）にmiR-21を終濃度10nMで添加し、室温で1時間静置して反応させた。反応溶液にレコンビナントNF-κB（Cayman Chemical社）を終濃度50ng/μLで添加し、30分静置した。NF-κBの結合の検出は、ゲルシフト法を用いて行った。まず、この反応溶液を8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。バンドの検出はGel DocTM EZ Imager（BioRad社；励起波長 430nm～460nm）を用いたFAMの蛍光の検出により行った。
　結果を図５に示す。
　実施例１で示した通り、miR-21存在下でHP1及びHP2は二本鎖核酸構造を形成した（図５中、「二量体」）。そこにNF-κBを添加した場合には、泳動度が低下し、バンドが上にシフトした（図５中、右列）。これにより、形成された二本鎖核酸構造にNF-κBが結合したことが確認された（図５中、「二量体＋NF-κB」）。
　以上から、HP1及びHP2は標的RNA（この場合はmiR-21）の存在下でのみ二本鎖核酸構造を形成し、目的のタンパク質（この場合はNF-κB）がそこに結合することが示された。
＜実施例３：細胞系における二本鎖核酸構造形成能の評価＞
（目的）
　ヒト細胞中で標的RNA特異的に二本鎖核酸構造が形成されることを確認した。
（方法）
　1.0×104個のHEK293T細胞、MDA-MB-231細胞、A549細胞をそれぞれ96wellのマルチウェルプレートに播種し、100μLのDMEM溶液（10%FBS及び0.5%ペニシリン－ストレプトマイシンを含有）の中で約80%コンフルエントになるまで培養した。
　開始ヘアピン核酸としては、消光分子Dabcylで修飾したHP1（配列番号１３）を用い、対合ヘアピン核酸としては、蛍光分子ＦＡＭで修飾したHP2（配列番号１４）をそれぞれ0.5μg/μLの濃度で用いた。
　0.5μLのLipofectamine Plus Reagent（Thermo Fisher Scientific社）を含む25μLのOPTI-MEMに対合ヘアピン核酸のみ、又は開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸を添加し、さらに、その混合溶液を1μLのLipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific社）を含む25μLのOPTI-MEMと混合して室温で5分間静置して平衡化した。平衡化したLipofectamine溶液をディッシュに添加してリポフェクションした。
　リポフェクションの2時間後に100μLのDMEM溶液（10%FBS及び0.5%ペニシリン－ストレプトマイシンを含有）で培地交換を行い、培地交換の24時間後に、トリプシン-EDTAを用いて細胞を回収した。
　Guava（登録商標）easyCyteＴＭシステム（Luminex）を用いたフローサイトメトリーにより、回収した細胞におけるＦＡＭの蛍光を測定した。
　蛍光強度は、FAM修飾されたHP2のみを添加した場合の値を1とした相対値として取得した。
（結果）
　結果を図６及び７に示す。
　miR-21をほぼ発現しないヒト胚性腎臓HEK293T細胞では、HP2のみを添加した場合とHP1及びHP2の両方を添加した場合で蛍光強度の変化は見られなかった（図６)。この結果は、同様にmiR-21をほとんど発現しないヒト胎児肺由来細胞であるMRC-5細胞においても確認された（データ示さず）。一方、miR-21を発現するヒト肺胞基底上皮腺がん細胞であるA549細胞にヘアピン核酸を導入した結果、検出されるHP2のFAM由来の蛍光がHP1を添加した場合に顕著に低下した（図７）。これは、A549細胞ではHP1由来の消光分子Dabcyl（図中、「Quencher」）がHP2由来のFAM（図中、「Fluorophore」）に十分近接したこと、つまり、HP1及びHP2が二本鎖核酸構造を形成したことを示す。
　以上の結果から、今回設計したHP1及びHP2が、標的RNAであるmiR-21を発現する細胞でのみハイブリダイズし、二本鎖核酸構造を形成することが示された。
＜実施例４：細胞系における二本鎖核酸構造によるタンパク質の機能阻害能の評価＞
（目的）
　ヒト細胞中で標的RNA特異的に目的のタンパク質の機能を阻害できるか調べた。
（方法）
　1.0×104個のMRC-5細胞及びA549細胞を、それぞれ96wellのマルチウェルプレートに播種し、100μLのDMEM溶液（10%FBS及び0.5%ペニシリン－ストレプトマイシンを含有）の中で約80%コンフルエントになるまで培養した。
　ヘアピン核酸としては、実施例１で用いたHP1（配列番号６）及びHP2（配列番号１０）をそれぞれ0.5μg/μLの濃度で用いた。
　0.5μLのLipofectamine Plus Reagentを含む25μLのOPTI-MEMにHP1及びHP2を添加し、さらに、その混合溶液を1μLのLipofectamine LTXを含む25μLのOPTI-MEMと混合して室温で5分間静置して平衡化した。平衡化したLipofectamine溶液をディッシュに添加してリポフェクションした。
　この際、同様にヘアピン核酸の代わりにpNF-kB/SEAPプラスミド（NOVUS biologicals, LLC）を用いて調製したLipofectamine溶液もディッシュに添加してリポフェクションを行った。このプラスミドはNF-κB依存的にヒト胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）を発現するコンストラクトである。
　リポフェクションの2時間後に100μLのDMEM溶液（10%FBS及び0.5%ペニシリン－ストレプトマイシンを含有）で培地交換を行い、その4時間後に0.1ng/mLの濃度でTNF-α（PeproTech社）を含むDMEM（10%FBS及び0.5%ペニシリン－ストレプトマイシンを含有）を用いてさらに培地を交換した。TNF-αの添加の24時間後に培養液を回収した。
　回収した培養液において、製造者の推奨プロトコルに従いNFkB Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay Kit（NOVUS biologicals, LLC）を用いて酵素反応を行った。この酵素反応では、基質であるpNitrophenyl phosphate（PNPP）からSEAPの活性により黄色産物が産生される。産生された黄色産物の濃度をNF-κB活性としてプレートリーダーCytation 5（BioTek Instruments社：測定波長 405nm）を用いて定量した。
　NF-κB活性はヘアピン核酸を添加しなかった場合の黄色産物の濃度を1とした相対値として取得した。
　実験は、MRC-5細胞については3回反復、A549細胞については4回反復で行った。統計解析はスチューデントのt検定により行った。
（結果）
　結果を図８及び９に示す。
　miR-21をほぼ発現しないMRC-5細胞では、ヘアピン核酸の添加の有無によりNF-κB活性は有意に変化しなかった（図８）。一方、miR-21を発現するA549にヘアピン核酸を導入した結果、NF-κB活性は有意に減少した（図９）。
　本発明のヘアピン核酸によって、培地に添加されたTNF-αによって誘導されたNF-κBの活性がmiR-21を発現する細胞特異的に抑制されることが示された（図８及び９）。
　以上の結果から、本発明のヘアピン核酸によって、標的RNA特異的に二本鎖核酸構造が形成され、二本鎖核酸構造上のタンパク質結合モチーフに目的のタンパク質を結合させることにより、目的のタンパク質の転写調節活性を競合阻害できることが示された。
＜実施例５：二本鎖核酸構造による他のタンパク質の機能阻害能の評価＞
（目的）
　ヒト細胞中で標的RNA特異的に目的のタンパク質の機能を阻害できることを他のタンパク質を用いて確認した。
（方法）
　3.0×105個のヒト乳がん細胞MDA-MB-231細胞を24wellのマルチウェルプレートに播種し、500μLのDMEM溶液（10%FBS及び0.5%ペニシリン－ストレプトマイシンを含有）の中で約90%コンフルエントになるまで培養した。
　ヘアピン核酸としては、以下の表３に示すHP1（配列番号８）及びHP2（配列番号１１）をそれぞれ0.5μg/μLの濃度で用いた。また、陽性対照（PC）として配列番号１５に示すE2Fに対する公知のデコイ核酸を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例４と同様にLipofectamine Plus Reagentを含むOPTI-MEMに終濃度が0.5μg/μLとなるようにヘアピン核酸又はデコイ核酸を添加し、さらに、その混合溶液をLipofectamine LTXを含む同量のOPTI-MEMと混合して室温で5分間静置して平衡化した。平衡化したLipofectamine溶液をディッシュに添加してリポフェクションした。
　リポフェクションの2時間後にDMEM溶液（10%FBS及び0.5%ペニシリン－ストレプトマイシンを含有）で培地交換を行い、培地交換の24時間後に、トリプシン-EDTAを用いて細胞を回収した。
　回収した細胞を70%エタノール中で12時間かけて固定し、エタノールを除去した後に1mg/mLの濃度のPropidium Iodideを50μL添加した。Guava（登録商標）easyCyteＴＭシステム（Luminex）を用いたフローサイトメトリーによりPropidium Iodideの蛍光強度に基づいて細胞の核酸量を測定した。
（結果）
　結果を図１０に示す。
　HP2のみを導入した対照群においてはG1期の細胞の割合は48%であった。また、陽性対照としてE2Fに対する公知のデコイ核酸を用いた場合、E2Fにより促進されるS期への侵入が阻害され、G1期に留まっている細胞の割合は54%と増加した。これに対し、本発明のヘアピン核酸を導入した場合は、G1期に留まっている細胞の割合が60%となり、公知のデコイ核酸以上のE2Fの機能阻害作用を示した。
　以上の結果から、目的のタンパク質の具体的な種類にかかわらず、本発明のヘアピン核酸により標的RNAを発現する細胞特異的に目的のタンパク質の機能を強力に阻害できることが示された。

Claims (11)

  1. 　開始ヘアピン核酸及び対合ヘアピン核酸を含むヘアピン核酸組成物であって、
    　前記開始ヘアピン核酸は標的RNAとハイブリダイズ可能であり、
    　前記対合ヘアピン核酸は前記開始ヘアピン核酸とハイブリダイズ可能であり、
    　前記開始ヘアピン核酸及び前記対合ヘアピン核酸は共に、二本鎖からなるタンパク質結合モチーフの一部を含み、
    　前記ハイブリダイズにより、前記タンパク質結合モチーフを含む二本鎖核酸構造が形成される、
    前記ヘアピン核酸組成物。
  2. 　前記開始ヘアピン核酸が、標的RNAとハイブリダイズする標的RNA結合ドメイン、及び前記対合ヘアピン核酸とハイブリダイズする対合ヘアピン結合ドメインを含み、
    　前記対合ヘアピン核酸が、前記対合ヘアピン結合ドメインとハイブリダイズする開始ヘアピン結合ドメイン、及び前記標的RNA結合ドメインとハイブリダイズする標的RNAドメインを含み、
    　前記開始ヘアピン核酸及び前記対合ヘアピン核酸は共に、3'末端又は5'末端に突出領域を含み、
    　前記標的RNA結合ドメイン及び前記対合ヘアピン結合ドメインは、前記突出領域の全部又は一部を含む、
    請求項１に記載のヘアピン核酸組成物。
  3. 　前記標的RNAドメインの長さが、前記開始ヘアピン結合ドメインの長さ以下である、請求項２に記載のヘアピン核酸組成物。
  4. 　前記タンパク質結合モチーフが転写因子結合モチーフを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘアピン核酸組成物。
  5. 　前記標的RNAが、mRNA又はmiRNAである、請求項１～４のいずれか一項に記載のヘアピン核酸組成物。
  6. 　前記標的RNAが、細胞特異的に発現するRNAである、請求項１～５のいずれか一項に記載のヘアピン核酸組成物。
  7. 　前記開始ヘアピン核酸及び前記対合ヘアピン核酸がベクターに包含されている、請求項１～６のいずれか一項に記載のヘアピン核酸組成物。
  8. 　目的のタンパク質を捕捉する、請求項１～７のいずれか一項に記載のヘアピン核酸組成物。
  9. 　目的のタンパク質の機能を阻害する、請求項１～７のいずれか一項に記載のヘアピン核酸組成物。
  10. 　請求項１～７のいずれか一項に記載のヘアピン核酸組成物を含む、医薬組成物。
  11. 　がん、免疫系疾患、炎症性疾患及び神経変性疾患からなる群から選択される疾患を予防又は治療するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
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