WO2024004747A1 - 細胞構造体の製造方法、細胞構造体および骨再生剤 - Google Patents

細胞構造体の製造方法、細胞構造体および骨再生剤 Download PDF

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cartilage
tissue
mesenchymal stem
cell
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幹人 加治屋
慎 森本
舞 吉野
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国立大学法人広島大学
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell structure, a cell structure, and a bone regenerating agent.
  • autologous bone grafting which separates bone from the mental or iliac bone and transplants it. be.
  • autologous bone grafting which separates bone from the mental or iliac bone and transplants it. be.
  • an object of the present invention is to provide a transplant material that is more suitable for clinical applications without using artificial materials.
  • one aspect of the present invention includes (a) culturing a mesenchymal stem cell aggregate in a cartilage induction medium, and (b) culturing the culture obtained in step (a) in an osteogenic differentiation medium.
  • the present invention relates to a method for manufacturing a cell structure, including the steps of:
  • Another aspect of the present invention relates to a cell structure that has cartilage-like tissue with a bone shell on at least a portion of its surface and does not contain blood vessels.
  • a bone regenerating agent that includes a cell structure having a cartilage-like tissue with a bone shell on at least a portion of its surface.
  • the present invention it is possible to provide a cell structure that has fast engraftment after transplantation and can be applied to large defect sites. That is, according to the present invention, a transplant material more suitable for clinical applications can be provided without using artificial materials.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for manufacturing a cell structure according to an embodiment of the present invention. Obtained by culturing mesenchymal stem cell clusters (clumps of MSCs/ECM complexes, hereinafter sometimes referred to as "C-MSCs") only in cartilage induction medium (hereinafter sometimes referred to as "CIM").
  • FIG. 3 is a diagram showing tissue analysis of the cartilage-like tissue obtained. The upper row shows the results of HE staining, the middle row shows the results of Alizarin Red staining, and the lower row shows the results of Safranin-O staining.
  • FIG. 3 is a diagram showing tissue analysis of a cell structure according to Example 1.
  • the first row from the top shows the results of HE staining (non-decalcified)
  • the second row from the top shows the results of Alizarin Red staining (non-decalcified)
  • the third row from the top shows the results of HE staining (decalcified).
  • the fourth row from the top shows the results of Safranin-O staining.
  • FIG. 2 is a diagram showing a micro-CT image of cartilage-like tissue obtained by culturing C-MSCs only with CIM.
  • 3 is a diagram showing a micro-CT image of a cell structure according to Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing photographs taken with and without transplantation of the cell structure according to Example 1 (immediately after transplantation in the case of transplantation) in an immunodeficient SCID mouse calvaria defect model (the right image is Example 2).
  • FIG. 2 is a diagram showing a micro-CT image after transplantation of the cell construct according to Example 1 into an immunodeficient SCID mouse calvarial defect model (Example 2).
  • the upper figure shows the overall image of the cell structure, and the lower figure shows a micro-CT image of the cross section of the straight part of the upper figure.
  • FIG. 2 is a diagram showing tissue analysis after transplantation of the cell construct according to Example 1 into an immunodeficient SCID mouse calvarial defect model (Example 2).
  • FIG. 4 is a diagram showing a photograph taken under transplantation of cartilage-like tissue (immediately after transplantation) in an immunodeficient SCID mouse calvarial defect model (Comparative Example 4).
  • FIG. 4 is a diagram showing a micro-CT image after transplantation of cartilage-like tissue into an immunodeficient SCID mouse calvarial defect model (Comparative Example 4).
  • the upper figure shows the overall image of the cartilage-like tissue
  • the lower figure shows a micro-CT image of the cross section of the straight part of the upper figure.
  • FIG. 3 is a diagram showing tissue analysis after transplantation of cartilage-like tissue into an immunodeficient SCID mouse calvarial defect model (Comparative Example 4).
  • the upper row shows the results of HE staining, and the lower row shows the results of Safranin-O staining.
  • FIG. 3 is a diagram showing tissue analysis of a fibrous cell structure obtained by culturing C-MSCs only in an osteogenic differentiation medium (hereinafter sometimes referred to as “OIM”) (Comparative Example 2).
  • OIM osteogenic differentiation medium
  • the upper row shows the results of HE staining
  • the lower row shows the results of Safranin-O staining.
  • Each center figure is an enlarged square frame above each left figure, and each right figure is an enlarged square frame below each left figure.
  • FIG. 3 is a diagram showing tissue analysis of a fibrous cell structure obtained by culturing C-MSCs in OIM and then in CIM (Comparative Example 3).
  • the upper row shows the results of HE staining, and the lower row shows the results of Safranin-O staining.
  • Each center figure is an enlarged square frame above each left figure, and each right figure is an enlarged square frame below each left figure.
  • FIG. 7 is a diagram showing tissue analysis of cartilage-like tissues obtained by culturing only in C-MSCs growth medium (left figure: Comparative Example 6) or OIM only (right figure: Comparative Example 2).
  • FIG. 2 is a diagram showing tissue analysis 4 weeks after transplantation of the cartilage-like tissue of Comparative Example 1 and the cell structure according to Example 1 into an immunodeficient SCID mouse calvarial defect model (upper panel: Comparative Example 4, lower panel). : Example 2).
  • the upper row shows the results of HE staining, Safranin-O staining, and TRAP staining from left to right.
  • FIG. 2 is a diagram showing tissue analysis 8 weeks after transplantation of the cartilage-like tissue of Comparative Example 1 and the cell structure according to Example 1 into an immunodeficient SCID mouse calvarial defect model (upper panel: Comparative Example 4, lower panel). : Example 2).
  • the upper row shows the results of HE staining, Safranin-O staining, and TRAP staining from left to right.
  • the lower row shows an enlarged view of the square frame in the upper row.
  • FIG. 8 is a diagram showing a micro-CT image and tissue analysis 8 weeks after transplantation of the cell aggregate of Comparative Example 1 and the cell structure of Example 1 into immunodeficient SCID mice subcutaneously (Top diagram: Comparative Example 5 , lower figure: Example 3).
  • the two images on the left are micro-CT images, and from the left, a 3D image and a tomographic image are shown, respectively.
  • FIG. 4 is a diagram showing tissue analysis of the obtained cell structure when a plurality of C-MSCs are adhered and cultured in the method for producing a cell structure according to an embodiment of the present invention (Example 4) .
  • the three drawings on the right are partially enlarged drawings of the drawing on the left. Furthermore, the upper row shows the results of HE staining, the middle row shows the results of Alizarin Red staining, and the lower row shows the results of Safranin-O staining.
  • the present inventors conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, the mesenchymal stem cell aggregates were produced using artificial materials by passing through a two-step process using different media.
  • a cell structure with a similar structure can be obtained.
  • the cell structure according to the present invention is useful in bone regeneration therapy because it has fast engraftment (endochondral ossification) after transplantation and can be applied to large defect sites. In particular, it makes it possible to provide reliable and effective bone regeneration medicine even to patients with large-scale bone loss.
  • step (a) a step of culturing a mesenchymal stem cell aggregate in a cartilage induction medium; and (b) a step of culturing the culture obtained in step (a) in an osteogenic differentiation medium.
  • this manufacturing method a method for manufacturing a cell structure (hereinafter referred to as "this manufacturing method"), which includes: Further, in this specification, the cell structure may be referred to as "the cell structure”.
  • the term "cell structure" refers to a three-dimensional tissue body mainly composed of cartilage-like tissue and bone shell (i.e., a three-dimensional tissue body mainly composed of cartilage primordium). ) means.
  • the cartilage-like tissue is present within the cellular structure and the bony shell is external to the cellular structure.
  • the present cell structure can be expressed as a cartilage-like tissue surrounded by a bone shell, a structure having a bone shell on the surface of the cartilage-like tissue, or the like.
  • the present cell structure has cartilage-like tissue with a bone shell on at least a portion of its surface.
  • the surface of the cartilage-like tissue in the present cell structure is preferably covered with a bone shell over a certain range from the viewpoint of increasing the engraftment rate after transplantation. At least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70% of the surface of the tissue is covered with bone shell, most preferably substantially 100%.
  • the cell structure may consist of cartilage-like tissue and bone shell, but may also contain something other than cartilage-like tissue and bone shell.
  • the cell structure may include, for example, vascular endothelial cells, fibrous tissue, osteoblasts, osteocytes, chondrocytes, stromal cells, mesenchymal stem cells, and the like.
  • cartilage primordium refers to a cartilage-like tissue covered by a bone shell, and a tissue body that has the ability to differentiate into bone.
  • the cartilage primordium according to the present invention is obtained by performing steps (a) and (b) in the present manufacturing method.
  • cartilage-like tissue refers to a population of cells composed of chondrocytes and cartilage matrix that exists inside a cartilage primordium.
  • bone shell refers to a bone-like tissue layer composed of bone matrix with mineral deposits and osteoblasts.
  • Osteoblasts are the cells that form bone and can produce bone matrix.
  • Bone matrix is an accumulation of substances produced and secreted extracellularly by cells with bone forming ability (e.g., osteoblasts), such as calcium phosphate, osteocalcin, osteopontin, and osteoblasts. It contains proteins such as nectin and collagen.
  • examples of minerals include calcium, magnesium, and phosphorus.
  • the term “mineral deposition” refers to a state in which at least calcium is deposited in the bone matrix, and in this case, magnesium or phosphorus may additionally be deposited.
  • the "bone shell” may contain, in addition to bone matrix and osteoblasts, interstitial cells such as osteocytes and periosteal cells.
  • step (a) the mesenchymal stem cell aggregate is cultured in a cartilage induction medium.
  • cartilage-like tissue can be induced in at least a portion of the mesenchymal stem cell aggregate.
  • mesenchymal stem cell aggregates are composed of at least a plurality of mesenchymal stem cells and extracellular matrix proteins (for example, type I collagen, etc.) produced by the cells themselves. It is a structured cell aggregate, meaning a cell aggregate that is not in a two-dimensional flat sheet shape but in a three-dimensional granular shape or the like. Normally, when mesenchymal stem cells are cultured in an adherent manner, they proliferate two-dimensionally (that is, proliferate in a sheet form) to form a cell sheet.
  • a mesenchymal stem cell aggregate can be obtained by suspension culture. Specifically, for example, a mesenchymal stem cell aggregate can be obtained by the step (a') described below.
  • the mesenchymal stem cells that form the mesenchymal stem cell aggregate are not particularly limited as long as they are mesenchymal stem cells that have osteogenic differentiation ability and cartilage differentiation ability.
  • Such mesenchymal stem cells include, for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, periodontal ligament-derived mesenchymal stem cells, and gingiva-derived mesenchymal stem cells. This includes all mesenchymal stem cells that exist in the world.
  • mesenchymal stem cells derived from pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells are also included in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • the mesenchymal stem cell aggregate in step (a) may be a plurality of mesenchymal stem cell aggregates connected together.
  • step (a) and step (b) By performing step (a) and step (b) using a plurality of connected mesenchymal stem cell clusters as a starting material, an enlarged cell cluster can be obtained.
  • conventional techniques it was not possible to obtain a transplant material of a certain size or more, and when the defect site was large, it was not suitable for transplantation, but according to the present invention, a large cell mass can be provided. Very advantageous in clinical applications.
  • cartilage induction medium refers to a medium capable of inducing mesenchymal stem cells or cells derived from mesenchymal stem cells (e.g., mesenchymal stem cell aggregates) into cartilage. do.
  • the cartilage induction medium is not particularly limited as long as it falls within the above definition, and various known cartilage induction media can be used.
  • cartilage induction medium examples include serum-free and xeno-animal protein-free cartilage induction medium (XF-CIM), which is made by adding MSCgo Chondrogenic XF Human (BLG) to MSCgo Chondrogenic XF Supplement Mix (BLG);
  • XF-CIM xeno-animal protein-free cartilage induction medium
  • BLG MSCgo Chondrogenic XF Human
  • BSG MSCgo Chondrogenic XF Supplement Mix
  • Examples include serum-free Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium (manufactured by Promo Cell).
  • the cartilage induction medium may be prepared based on a known protocol, for example, high glucose DMEM (manufactured by SIGMA), 0.1 ⁇ M dexamethasone, 50 ⁇ g/ml ascorbic acid, 100 ⁇ g/ml pyruvic acid, 40 ⁇ g/ml
  • a cartilage induction medium supplemented with ml proline, 50 mg/ml ITS Premix, 10 ng/ml TGF- ⁇ 1, etc. may be used.
  • step (b) it is preferable to perform step (b) after culturing in step (a) until at least a portion of the mesenchymal stem cell aggregate contains cartilage-like tissue.
  • the culture obtained in step (a) preferably contains cartilage-like tissue.
  • a state in which at least a portion of the mesenchymal stem cell aggregate contains cartilage-like tissue refers to a state in which at least a portion of the mesenchymal stem cell aggregate contains cartilage-like tissue by culturing in a cartilage induction medium. means a state induced by The occupancy rate (induction rate) of cartilage-like tissue in the mesenchymal stem cell aggregate is, for example, 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more, and 100% or more. There may be. Whether or not a mesenchymal stem cell aggregate contains cartilage-like tissue can be determined by, for example, Safranin-O staining.
  • the culture time in step (a) is not particularly limited as long as it is the time until at least a portion of the mesenchymal stem cell aggregate contains cartilage-like tissue, but is, for example, 1 to 20 days, preferably , 1.5 to 10 days, more preferably 2 to 5 days.
  • step (a) may include the following steps: Step (a'): A step of culturing mesenchymal stem cells in a growth medium to obtain a mesenchymal stem cell aggregate.
  • Step (a') is specifically performed by the following method.
  • mesenchymal stem cells are cultured in a growth medium containing factors that produce collagen using a culture vessel such as a culture dish.
  • a culture vessel such as a culture dish.
  • mesenchymal stem cells those described in the above “Step (a)" section can be used.
  • the growth medium in step (a') may be any medium that can grow mesenchymal stem cells, and various known media can be used.
  • growth media include, for example, high glucose DMEM supplemented with 10% FBS and 50 ⁇ g/ml ascorbic acid, PRIME-XV (registered trademark) MSC Expansion XSFM (FUJIFILM) containing 100 U/ml penicillin, and 100 ⁇ g/ml streptomycin.
  • XF-GM serum-free xeno-animal protein-free growth medium made by XF-GM (manufactured by XF-GM).
  • XF-GM serum-free, xeno-animal protein-free growth medium
  • PRIME-XV registered trademark
  • MSC Expansion XSFM manufactured by FUJIFILM
  • the factor that causes mesenchymal stem cells to produce collagen is not particularly limited as long as it can cause mesenchymal stem cells to produce collagen, such as a compound or protein.
  • factors include ascorbic acid, steroids such as dexamethasone, cytokines, and the like, with ascorbic acid being preferred.
  • a sheet-like cell population (hereinafter referred to as a cell sheet) is formed. Proliferate until the periphery of the cell sheet adheres to the edge of the culture vessel and reaches confluence.
  • the edge of the cell sheet adhered to the peripheral wall of the culture vessel is separated from the culture vessel.
  • the cell sheet can be separated from the culture vessel by inserting a thin rod into the inner wall of the culture vessel to which the edge of the cell sheet is adhered and moving the rod once around the inner wall of the culture vessel. This causes the cell sheet to float.
  • This floating cell sheet wraps around itself due to self-aggregation, and forms a cluster of mesenchymal stem cells using the extracellular matrix (ECM) produced by the mesenchymal stem cells themselves. In this way, granular cell aggregates can be obtained.
  • ECM extracellular matrix
  • a cylindrical incubator with a size of 1.5 to 2.5 cm 2 cell aggregates with a particle size of 0.5 to 1.5 mm can be obtained.
  • the culture vessel for example, a 24-well plate with a surface area of 2 cm 2 may be used.
  • step (b) the culture obtained in step (a) is cultured in an osteogenic differentiation medium.
  • step (a) by culturing the culture in an osteogenic differentiation medium, a cell structure suitable for transplantation in bone regeneration therapy and the like can be produced.
  • osteoogenic differentiation medium refers to a medium capable of inducing mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cell-derived cells (e.g., mesenchymal stem cell aggregates) into bone.
  • the osteogenic differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it falls within the above definition, and various known osteogenic differentiation-inducing media can be used.
  • the osteogenic differentiation induction medium can be, for example, a serum-free induction medium or a serum-containing induction medium.
  • a serum -induced medium for example,, for example,, for example,, for example, Serrermulent, heterogeneous animal protein, non -incoming bone bone boned areas (manufactured by XF -OIM: MSCGO OSTEOGENIC XF, BLG), MESENCULT OSTEOGENIC DIFFFERENTITION (Stemcell) Made by Technologies), no serum Examples include osteoinduction medium STK3 (manufactured by Two Cells). Examples of the serum-containing induction medium include Osteoblast Growth Medium (manufactured by Takara).
  • the osteogenic differentiation induction medium may be prepared based on a known protocol, for example, high glucose DMEM with serum supplemented with 10% FBS, 0.1 ⁇ M dexamethasone, 50 ⁇ g/ml ascorbic acid, and 10 mM glycerophosphate.
  • a containing osteogenic differentiation-inducing medium or the like may be used.
  • the culture time in step (b) is not particularly limited as long as a cell structure having a cartilage-like tissue with a bone shell on at least a portion of the surface can be obtained, but is, for example, 1 to 20 days, preferably , 1.5 to 10 days, more preferably 2 to 5 days.
  • step (b) for the "mesenchymal stem cell aggregate", what is described in the above (step (a)) section is used.
  • step (c) it is not necessary to manufacture the cell structure within a limited period immediately before a transplant surgery, etc., and it is possible to prevent a situation where the transplant surgery is postponed. .
  • step (c) the cell structure obtained in step (b) is placed in a cryopreservation container such as a freezing vial together with a cryopreservative and cryopreserved.
  • a cryopreservation container such as a freezing vial together with a cryopreservative and cryopreserved.
  • a frozen cell construct for transplantation can be obtained.
  • various preservation solutions for cell freezing may be used.
  • cryopreservation solutions containing 10% DMSO (dimethyl sulfoxide), 20% FBS, and 70% DMEM commercially available Cell banker (manufactured by Takara Bio Inc.), Bambunker (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and other cryopreservation solutions.
  • Cryopreservation may be performed, for example, at a temperature of -70 to -90°C, preferably -75 to -85°C.
  • cryopreservation can be performed by various methods, such as placing a storage container in a freezer.
  • the storage container may be placed at the above temperature for 24 hours and then transferred to a liquid nitrogen tank (-196°C). Note that during cryopreservation, preliminary freezing may or may not be performed.
  • a cell structure in one embodiment of the present invention, has cartilage-like tissue with a bone shell on at least a portion of its surface and does not contain blood vessels (eg, capillaries).
  • the present cell structure is useful in bone regeneration therapy because it has fast engraftment after transplantation and can be applied to large defect sites.
  • cartilage primordia are formed during the midway stage of bone development.
  • cartilage primordia formed in vivo contain blood vessels (eg, capillaries).
  • the present cell structure is clearly different from cartilage primordia formed in vivo in that it does not contain blood vessels (eg, capillaries).
  • the size of the present cell structure is preferably a size suitable for transplantation, and is generally, for example, 0.5 to 1.5 mm in diameter, preferably 0.8 to 1.2.0 mm in diameter. .
  • the size of the cellular construct may be greater than 2.0 mm in diameter.
  • the size of the cell structure is preferably more than 2.0 mm in diameter, more preferably more than 2.5 mm in diameter, even more preferably more than 3.0 mm in diameter, and especially Preferably, the diameter is greater than 3.5 mm.
  • the size of the cell structure may be larger, for example, 5.0 mm or more, preferably 6.0 mm, and not more than 1 cm. It's okay. According to the present invention, the size of the present cell structure can be adjusted as appropriate based on the size of the defect site at the transplant destination.
  • the method for increasing the size of the present cell structure is not particularly limited, but for example, a plurality of mesenchymal stem cell aggregates are connected in a skewered state, and step (a) and step (b) in the present production method are performed.
  • a plurality of mesenchymal stem cell aggregates are connected in a skewered state, and step (a) and step (b) in the present production method are performed.
  • step (a) and step (b) in the present production method are performed.
  • One example is to implement the following. Large-sized cell structures can be produced, for example, by the method described in Examples.
  • the present cell structure is manufactured by the present manufacturing method.
  • the present cell structure may be a frozen cell structure (also referred to as a "frozen cell structure").
  • C-MSCs can be produced from MSCs separated from a patient, a cell structure can be further produced, and the function and homogeneity of the cell structure can be tested in advance. Then, only those of a certain quality are selected through inspection and can be cryopreserved as frozen cell structures. This makes it possible to reliably supply quality-controlled cell structures for transplantation on the day of transplantation, and to prevent the transplant surgery from being postponed.
  • a frozen cell structure retains its shape even after thawing and does not lose cell function, so it exhibits tissue regeneration ability when transplanted into a defective tissue, for example.
  • the present inventors speculate as follows about the reason why a frozen cell structure can exhibit tissue regeneration ability even after thawing. That is, the present inventors previously revealed that C-MSCs can maintain their three-dimensional structure and cell activity even after being immersed in a cryopreservation solution and cryopreserved at -80°C or below (International Publication No. No. 2017/187941, Motoike et al., 2018, Stem Cell Res Ther). This is because the abundant extracellular matrix proteins such as collagen that form C-MSCs exert a protective effect against damage caused by ice crystals during cryopreservation.
  • the frozen cell structure can be thawed by various methods, such as taking out the cryopreservation container in which the frozen cell structure is stored from the freezer, etc., and placing it at room temperature, or placing it in a hot bath (e.g., 40 to 60°C). It can be done with
  • a bone regenerating agent (hereinafter referred to as "the present bone regenerating agent”) is provided, which includes a cell structure having a cartilage-like tissue with a bone shell on at least a portion of its surface.
  • the present bone regeneration agent is useful in bone regeneration therapy because it contains a cell structure that has rapid engraftment after transplantation and can be applied to large defect sites.
  • the bone regenerating agent may contain any additives in addition to the cell structure.
  • additives include, for example, pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients, and the like.
  • Pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients, etc. are well known in the pharmaceutical art and are available from, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (ed. A. R. Gennaro, 1985). The selection of pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients can be readily selected by those skilled in the art according to the intended therapeutic format and standard pharmaceutical practice.
  • the bone regenerating agent may further contain any binding agent, lubricant, suspending agent, etc., and a substance that promotes engraftment of the cell structure.
  • the substance that promotes engraftment of the cell structure include fibrin glue and the like.
  • the amount of the additive contained in the present bone regenerating agent is not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • This bone regeneration agent is used for the purpose of bone regeneration, and the bones to which it can be applied are not particularly limited, and can be applied to any bone.
  • it can be suitably applied to bone regeneration therapy for intractable fractures, periodontitis, rheumatoid arthritis, necrosis of the femoral head, osteogenesis imperfecta, osteoporosis, and cases of extensive bone defects after bone removal.
  • the present bone regenerating agent can also be applied to sites other than bone defects.
  • Sites other than bone defects include, but are not particularly limited to, subcutaneous tissues and the like.
  • the present bone regenerating agent induces endochondral ossification not only in bone defect areas but also in other sites, thereby inducing bone regeneration.
  • Species to which this bone regenerating agent is applied are not particularly limited, but include, for example, humans, cows, boars, pigs, sheep, goats, horses, mice, rats, hamsters, squirrels, rabbits, dogs, cats, ferrets, etc. mammals, preferably humans.
  • bone regenerating agent "bone shell”, “cartilage-like tissue”, and “cell structure” are described in [2. Method for producing cell structure] and [3. Cell Structures] are incorporated herein by reference.
  • a method for treating a bone disease comprises administering the present cell structure or the present bone regeneration agent to a subject suffering from a bone disease.
  • the administration of the present cell structure or the present bone regeneration agent is usually intended for transplantation, but includes any method applied in bone regeneration therapy.
  • Bone diseases are not particularly limited, but include, for example, the above-mentioned intractable fractures, periodontitis, rheumatoid arthritis, necrosis of the femoral head, osteogenesis imperfecta, osteoporosis, and cases of extensive bone loss after bone removal.
  • treatment means an act that brings about a therapeutic effect on a subject in need of treatment.
  • the therapeutic effect is a concept that includes preventive effects and therapeutic effects, and may include, for example, the following types of effects.
  • the dosage of the present cell structure or the present bone regenerating agent can be determined by a person skilled in the art depending on the extent of the defect site, the severity of the disease, the degree of decrease in systemic bone metabolic capacity, age, etc. It can be set as appropriate.
  • the present cell construct or the present bone regenerating agent is provided for use in the treatment of bone diseases.
  • a cell comprising (a) a step of culturing a mesenchymal stem cell aggregate in a cartilage induction medium, and (b) a step of culturing the culture obtained in step (a) in an osteogenic differentiation induction medium.
  • Method of manufacturing the structure ⁇ 2> The manufacturing method according to ⁇ 1>, wherein the cell structure has cartilage-like tissue including a bone shell on at least a portion of its surface.
  • ⁇ 3> The manufacturing method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the mesenchymal stem cell aggregate is a plurality of mesenchymal stem cell aggregates connected.
  • the mesenchymal stem cell aggregate is cultured until at least a portion thereof contains cartilage-like tissue, and then the step (b) is performed, ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • the manufacturing method according to any one of. ⁇ 5> The manufacturing method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, further including the following steps before step (a): (a') A step of culturing mesenchymal stem cells in a growth medium to obtain a mesenchymal stem cell aggregate.
  • ⁇ 6> Having a cartilage-like tissue with a bone shell on at least a part of the surface, A cellular structure that does not contain blood vessels.
  • a bone regenerating agent comprising a cell structure having cartilage-like tissue with a bone shell on at least a portion of its surface.
  • MSCs Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) purchased from Lonza were seeded in a 48-well culture plate (Corning) at a cell density of 1.0 ⁇ 10 5 cells/well. The cells were grown in a serum-free, xeno-animal protein-free growth medium (XF-GM) consisting of PRIME-XV (registered trademark) MSC Expansion XSFM (manufactured by FUJIFILM) containing 100 U/ml penicillin and 100 ⁇ g/ml streptomycin. The cells were cultured for 4 days to produce sufficient ECM.
  • XF-GM serum-free, xeno-animal protein-free growth medium
  • PRIME-XV registered trademark
  • MSC Expansion XSFM manufactured by FUJIFILM
  • MSCs/ECM complex was transferred to an ultra-low-binding plate (manufactured by Iwaki) and cultured in XF-GM for 3 days to form spherical cell aggregates of C-MSCs with a diameter of approximately 800 to 1000 ⁇ m. Obtained.
  • C-MSCs were cultured in XF-CIM medium for 17 or 24 days (Comparative Example 1), C-MSCs were cultured in XF-OIM medium for 17 days or 24 days (Comparative Example 2), C-MSCs were cultured in XF-OIM for 10 days, then cultured in XF-CIM for 7 days (Comparative Example 3), and C-MSCs were suspended in growth medium (XF-GM) (250 ⁇ l/well) for 17 days. The cultured one (Comparative Example 6) was used.
  • HE staining alizarin red staining, safranin-O staining, and micro-CT imaging were performed using the following methods.
  • ⁇ HE staining, Alizarin red staining, Safranin-O staining The obtained sample (cell structure or cartilage-like tissue) was washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde, and embedded in paraffin. Serial sections of 8 ⁇ m were prepared and stained with HE staining and alizarin red. In addition, in order to observe the histological structure, the obtained sample (cell structure or cartilage-like tissue) was decalcified with 10% ethylenediaminetetraacetic acid, embedded in paraffin, and 8 ⁇ m sections were prepared and stained with HE. and safranin-O staining.
  • ⁇ Micro CT photography> The obtained sample (cell structure or cartilage-like tissue) was washed with PBS and then imaged with a micro CT (Skyscan 1176, Bruker, Billerica, MA, USA).
  • the imaging conditions were a tube voltage of 50 kV, a tube current of 0.5 mA, a pixel size of 8 ⁇ m, a step angle of 0.5 degrees, and an exposure time of 230 ms.
  • Example 1 in which C-MSCs were cultured in XF-CIM and then cultured in XF-OIM, as shown in FIG. A cell structure was obtained that had a shell and inside it contained a cartilage-like tissue (a cell aggregate consisting of a cartilage matrix and chondrocytes contained therein) that was stained red with safranin-O (Fig. 3, 1st row). 2nd row, 4th row). Furthermore, upon demineralization and observation, no cell death was observed in the outer layer where this mineral was deposited, but cells existing inside the osteoid matrix were observed (third row in Figure 3).
  • cartilage-like tissue a cell aggregate consisting of a cartilage matrix and chondrocytes contained therein
  • the animals were sacrificed 4 and 8 weeks after transplantation, and the calvaria were taken out and photographed using micro-CT, and the bone tissues were observed using HE staining, Safranin-O staining, and TRAP staining.
  • Micro-CT imaging, HE staining, Safranin-O staining, and TRAP staining were performed using the following methods.
  • ⁇ Micro CT photography> The obtained sample (mouse calvaria) was washed with PBS and then imaged with a micro CT (Skyscan 1176, Bruker, Billerica, MA, USA).
  • the imaging conditions were a tube voltage of 50 kV, a tube current of 0.5 mA, a pixel size of 8 ⁇ m, a step angle of 0.5 degrees, and an exposure time of 230 ms.
  • mice calvaria was fixed with 4% paraformaldehyde, decalcified with 10% ethylenediaminetetraacetic acid, and then embedded in paraffin. Sections of 8 ⁇ m were prepared and stained with HE and safranin-O.
  • TRAP staining After washing the paraffin-embedded thin section with PBS, add TRAP staining solution (tartrate solution/produced phosphatase substrate solution) from the TRAP staining kit (294-67001, manufactured by Wako) and incubate at 37°C for 10 minutes. I let it happen. Note that in TRAP staining, osteoclasts are stained.
  • Example 2 In the transplantation of a cell structure prepared by culturing C-MSCs in XF-CIM and then in XF-OIM (Example 2), bone-like tissue formation occurred in the defect area (Fig. 7 ).
  • Example 2 although some cartilage-like tissue stained with Safranin-O remained, a bone marrow-like structure with invasion of blood vessels and blood cells was observed, indicating that it had undergone a mode of endochondral ossification. It was found that bone formation had occurred ( Figure 8). Furthermore, in Example 2, the cartilage matrix was resorbed 4 weeks after implantation, and invasion of blood vessels and TRAP-positive osteoclasts were observed there (FIG. 15).
  • ⁇ Micro CT photography> The obtained sample (subcutaneous implantation site) was washed with PBS and then imaged with a micro CT (Skyscan 1176, Bruker, Billerica, MA, USA).
  • the imaging conditions were a tube voltage of 50 kV, a tube current of 0.5 mA, a pixel size of 8 ⁇ m, a step angle of 0.5 degrees, and an exposure time of 230 ms.
  • the present invention can be suitably used in fields such as regenerative medicine.

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Abstract

人工材料を用いることなく、臨床適用により適した移植材料を提供することを課題とする。（ａ）間葉系幹細胞集塊を軟骨誘導培地で培養する工程、および（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養物を骨分化誘導培地で培養する工程、を含む、細胞構造体の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。

Description

細胞構造体の製造方法、細胞構造体および骨再生剤
　本発明は、細胞構造体の製造方法、細胞構造体および骨再生剤に関する。
　重篤な骨折、感染症、もしくは腫瘍を原因とした骨摘出術後の患者に対して、最も理想的な骨再生療法は、オトガイや腸骨から骨を分離して移植する自家骨移植術である。しかし、自家骨は採取量に制限があり、採取部の侵襲・術後疼痛・感染のリスクがあり、実際には適応できないケースが多い。
　そこで、骨組織の性質を模倣する人工骨の開発研究や、骨形成能を有する間葉系幹細胞（以下、「ＭＳＣｓ」と称する場合がある。）を人工材料と混和して移植する研究が盛んになされてきた。また、ＭＳＣｓに予め骨分化誘導を施すことで、骨芽細胞の性質を高めて膜性骨化の様式による骨再形成を目指す方法が多数検討されてきた（特許文献１～２、非特許文献１～２）。
国際公開第２０１７／１８７９４１号 国際公開第２０２０／２２６０４３号 MIZUHO KITAOKA et al., Clumps of a mesenchymal stromal cell/extracellular matrix complex can be a novel tissue engineering therapy for bone regeneration, CYTOTHERAPY, 17巻, 7号, pp. 860-873, 2015 Souta Motoike et al., Clumps of Mesenchymal Stem Cell/Extracellular Matrix Complexes Generated with Xeno-Free Conditions Facilitate Bone Regeneration via Direct and Indirect Osteogenesis, INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, 20巻, 16号, 2019 Susumu Horikoshi et al., Clumps of Mesenchymal Stem Cells/Extracellular Matrix Complexes Generated with Xeno-Free Chondro-Inductive Medium Induce Bone Regeneration via Endochondral Ossification, BIOMEDICINES, 9巻, 10号, 2021
　しかし、人工骨と間葉系幹細胞等とを組み合わせた従来技術では、生体にとって異物となる人工材料を用いるため望ましくないという課題があった。また、人工材料を用いない技術も本発明者らにより開発されていたが、臨床適用においては、改善の余地があった。特に、移植後の生着の観点、および大きな欠損部位への適用の観点から、改善の余地があった。
　そこで、本発明の目的は、人工材料を用いることなく、臨床適用により適した移植材料を提供することにある。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、間葉系幹細胞集塊を、異なる培地を用いた２段階の工程を経ることにより、移植に適した細胞構造体を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の一態様は、（ａ）間葉系幹細胞集塊を軟骨誘導培地で培養する工程、および（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養物を骨分化誘導培地で培養する工程、を含む、細胞構造体の製造方法に関する。
　また、本発明の別の一態様は、表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有し、血管を含まない、細胞構造体に関する。
　さらに、本発明の別の一態様は、表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有する細胞構造体を含む、骨再生剤に関する。
　本発明によれば、移植後の生着が早く、大きな欠損部位にも適用可能な細胞構造体を提供できる。すなわち、本発明によれば、人工材料を用いることなく、臨床適用により適した移植材料を提供することができる。
本発明の一実施形態に係る、細胞構造体の製造方法を示す概略図である。 間葉系幹細胞集塊（Ｃｌｕｍｐｓ　ｏｆ　ＭＳＣｓ／ＥＣＭ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ、以下「Ｃ－ＭＳＣｓ」と称する場合がある。）を軟骨誘導培地（以下、「ＣＩＭ」と称する場合がある。）のみで培養して得られた軟骨様組織の組織解析を示す図である。上段は、ＨＥ染色の結果を示し、中段は、アリザリンレッド染色の結果を示し、下段は、サフラニン－Ｏ染色の結果を示す。また、上段および下段の各中央図は、各左図の上の四角枠を拡大したものであり、上段および下段の各右図は、各左図の下の四角枠を拡大したものである。さらに、中段の中央図は、左図の四角枠を拡大したものである。 実施例１に係る細胞構造体の組織解析を示す図である。上から１段目は、ＨＥ染色（非脱灰）の結果を示し、上から２段目は、アリザリンレッド染色（非脱灰）の結果を示し、上から３段目は、ＨＥ染色（脱灰）の結果を示し、上から４段目は、サフラニン－Ｏ染色の結果を示す。また、１段目、３段目、および４段目の各中央図は、各左図の上の四角枠を拡大したものであり、１段目、３段目、および４段目の各右図は、各左図の下の四角枠を拡大したものである。さらに、２段目の中央図は、左図の四角枠を拡大したものである。 Ｃ－ＭＳＣｓをＣＩＭのみで培養して得られた軟骨様組織のマイクロＣＴ画像を示す図である。 実施例１に係る細胞構造体のマイクロＣＴ画像を示す図である。 免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルにおいて、実施例１に係る細胞構造体の移植の有無下（移植有りの場合は移植直後）で撮影した写真を示す図である（右図が実施例２）。 免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルへの、実施例１に係る細胞構造体の移植後のマイクロＣＴ画像を示す図である（実施例２）。上図は、細胞構造体の全体像を示し、下図は、上図直線部の断面のマイクロＣＴ画像を示す。 免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルへの、実施例１に係る細胞構造体の移植後の組織解析を示す図である（実施例２）。上段は、ＨＥ染色の結果を示し、下段は、サフラニン－Ｏ染色の結果を示す。 免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルにおいて、軟骨様組織の移植下（移植直後）で撮影した写真を示す図である（比較例４）。 免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルへの、軟骨様組織の移植後のマイクロＣＴ画像を示す図である（比較例４）。上図は、軟骨様組織の全体像を示し、下図は、上図直線部の断面のマイクロＣＴ画像を示す。 免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルへの、軟骨様組織の移植後の組織解析を示す図である（比較例４）。上段は、ＨＥ染色の結果を示し、下段は、サフラニン－Ｏ染色の結果を示す。 Ｃ－ＭＳＣｓを骨分化誘導培地（以下、「ＯＩＭ」と称する場合がある。）のみで培養して得られた線維性細胞構造体の組織解析を示す図である（比較例２）。上段は、ＨＥ染色の結果を示し、下段は、サフラニン－Ｏ染色の結果を示す。また、各中央図は、各左図の上の四角枠を拡大したものであり、各右図は、各左図の下の四角枠を拡大したものである。 Ｃ－ＭＳＣｓをＯＩＭで、次いでＣＩＭで培養して得られた線維性細胞構造体の組織解析を示す図である（比較例３）。上段は、ＨＥ染色の結果を示し、下段は、サフラニン－Ｏ染色の結果を示す。また、各中央図は、各左図の上の四角枠を拡大したものであり、各右図は、各左図の下の四角枠を拡大したものである。 Ｃ－ＭＳＣｓ増殖培地のみ（左図：比較例６）またはＯＩＭのみ（右図：比較例２）で培養して得られた軟骨様組織の組織解析を示す図である。上段は、ＨＥ染色の結果を示し、中段は、サフラニン－Ｏ染色の結果を示し、下段は、アリザリンレッド染色の結果を示す。また、各例において、右図は、左図の四角枠の拡大図を示す。 免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルへの、比較例１の軟骨様組織、および実施例１に係る細胞構造体の移植４週後の組織解析を示す図である（上図：比較例４、下図：実施例２）。各例において、上段は、左から順に、ＨＥ染色、サフラニン－Ｏ染色、およびＴＲＡＰ染色の結果を示す。また、各例において、下段は、上段の四角枠の拡大図を示す。 免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルへの、比較例１の軟骨様組織、および実施例１に係る細胞構造体の移植８週後の組織解析を示す図である（上図：比較例４、下図：実施例２）。各例において、上段は、左から順に、ＨＥ染色、サフラニン－Ｏ染色、およびＴＲＡＰ染色の結果を示す。また、各例において、下段は、上段の四角枠の拡大図を示す。 免疫不全ＳＣＩＤマウス皮下への、比較例１の細胞集塊、および実施例１に係る細胞構造体の移植８週後の撮影写真を示す図である（左図：比較例５、右図：実施例３）。 免疫不全ＳＣＩＤマウス皮下への、比較例１の細胞集塊、および実施例１に係る細胞構造体の移植８週後のマイクロＣＴ画像、および組織解析を示す図である（上図：比較例５、下図：実施例３）。各例において、左２つがマイクロＣＴ画像であり、それぞれ、左から３Ｄ画像、および断層画像を示す。また、右２つが、組織解析を示す図であり、それぞれ、左からＨＥ染色、およびサフラニン－Ｏ染色の結果を示す。 本発明の一実施形態に係る、細胞構造体の製造方法において、複数のＣ－ＭＳＣｓを接着して培養した場合の、得られた細胞構造体の組織解析を示す図である（実施例４）。右３つの図面は、左の図面の一部を拡大したものである。また、上段は、ＨＥ染色の結果を示し、中段は、アリザリンレッド染色の結果を示し、下段は、サフラニン－Ｏ染色の結果を示す。
　本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、本細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
　〔１．本発明の概要〕
　上述の通り、骨再生の自家骨移植術では、採取量の制限、採取部の侵襲・術後疼痛・感染のリスク等の問題により、実際には適応できないケースが多い。
　そこで、骨組織の性質を模倣する人工骨の開発研究や、骨形成能を有するＭＳＣｓを人工材料と混和して移植する研究や、ＭＳＣｓに予め骨分化誘導を施すことで、骨芽細胞の性質を高めて膜性骨化の様式による骨再形成を目指す方法が多数検討されてきた。しかし、未だ決定的な治療法としては確立されていない。
　一方、生体の四肢骨の発生期や、骨折の治癒メカニズムは、軟骨組織が吸収され骨組織に置き換わる軟骨内骨化の様式を経ることが古くから知られている。ここで、軟骨内骨化が生じる直前の段階の組織である骨殻を纏った軟骨原基様組織を生体外で製造可能になれば、生体の発生／治癒過程を模倣する骨再生療法が確立し得ると、本発明者らは考えて、以前に、軟骨内骨化の様式による骨再形成を目指す方法を報告した（非特許文献３）。
　さらに、本発明者らは、当該着想に基づき、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、間葉系幹細胞集塊を、異なる培地を用いた２段階の工程を経ることにより、人工材料を用いることなく、移植に適した細胞構造体を提供できることを見出した。具体的には、間葉系幹細胞集塊を軟骨誘導培地で培養した後、培地を骨分化誘導培地に替えてさらに培養することにより、移植後の生着が早く、大きな欠損部位にも適用可能な細胞構造体が得られることを見出した。
　本発明に係る細胞構造体は、移植後の生着（軟骨内骨化）が早く、大きな欠損部位にも適用可能であるため、骨再生療法において有用である。とりわけ、大規模骨喪失患者に対しても確実かつ有効な骨再生医療の提供を可能にする。
　〔２．細胞構造体の製造方法〕
　本発明の一実施形態において、（ａ）間葉系幹細胞集塊を軟骨誘導培地で培養する工程、および（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養物を骨分化誘導培地で培養する工程、を含む、細胞構造体の製造方法（以下、「本製造方法」と称する。）を提供する。また、本明細書において、前記細胞構造体を「本細胞構造体」と称する場合もある。
　本明細書において、「細胞構造体」とは、主として、軟骨様組織と骨殻とから構成される、立体的な組織体（すなわち、主として、軟骨原基で構成される、立体的な組織体）を意味する。本発明の一実施形態において、軟骨様組織は、細胞構造体の内部に存在し、骨殻は、細胞構造体の外部に存在する。本細胞構造体は、骨殻を纏った軟骨様組織、軟骨様組織の表面に骨殻を備える構造体等と換言することができる。
　本発明の一実施形態において、本細胞構造体は、表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有する。本発明の一実施形態において、本細胞構造体中の軟骨様組織の表面は、移植後の生着率を高める観点から、骨殻により一定範囲以上覆われていることが好ましく、例えば、軟骨様組織の表面の５０％以上、好ましくは、６０％以上、より好ましくは、７０％以上が骨殻で覆われており、実質的に１００％骨殻で覆われていていることが最も好ましい。
　本発明の一実施形態において、本細胞構造体は、軟骨様組織および骨殻からなるものであってもよいが、軟骨様組織および骨殻以外のものを含んでいてもよい。本細胞構造体は、例えば、血管内皮細胞、線維性組織、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、間質系細胞、間葉系幹細胞等を含み得る。
　本明細書において、「軟骨原基」とは、骨殻に覆われた軟骨様組織であり、骨への分化能を有する組織体を意味する。本発明に係る軟骨原基は、本製造方法において、工程（ａ）および（ｂ）を実施することにより得られる。
　本明細書において、「軟骨様組織」とは、軟骨原基の内部に存在する、軟骨細胞と軟骨基質で構成された細胞の集団を意味する。
　本明細書において、「骨殻」とは、ミネラルが沈着した骨基質と骨芽細胞とから構成される骨様組織層を意味する。骨芽細胞は、骨の元となる細胞であり、骨基質を産生し得る。また、骨基質は、骨形成能を有する細胞（例えば、骨芽細胞）によって産生されて細胞外に分泌された物質が蓄積したものであり、例えば、リン酸カルシウム等であって、オステオカルシンやオステオポンチン、オステオネクチン、コラーゲン等のタンパク質を含むものである。また、ミネラルとしては、例えば、カルシウム、マグネシウム、リン等が挙げられる。前記「ミネラルの沈着」とは、骨基質に少なくともカルシウムが沈着している状態を意味し、この場合、付加的にマグネシウムまたはリンが沈着していてもよい。ミネラルの沈着の有無の確認には、例えば、カルシウムに対して結合する色素であるアリザリンレッドを用いて、組織切片を染色する方法が利用できるが、これに限定されず、骨基質におけるミネラルの存在を確認できる方法であれば、他の任意の方法を利用することができる。「骨殻」は、骨基質、骨芽細胞の他に、骨細胞、骨膜細胞等の間質系細胞等を含んでいてもよい。
　（工程（ａ））
　工程（ａ）では、間葉系幹細胞集塊を軟骨誘導培地で培養する。間葉系幹細胞集塊を軟骨誘導培地で培養することにより、当該間葉系幹細胞集塊の少なくとも一部に軟骨様組織を誘導することができる。
　本明細書において、「間葉系幹細胞集塊（Ｃ－ＭＳＣｓ）」とは、少なくとも複数の間葉系幹細胞と、前記細胞自身が産生した細胞外基質タンパク質（例えば、Ｉ型コラーゲン等）とで構成された細胞集塊であり、２次元的な平たいシート状ではなく、３次元的な粒状等の形状の細胞集塊を意味する。通常、間葉系幹細胞を接着培養すると、二次元的に増殖し（すなわち、シート状に増殖して）、細胞シートが形成されるが、当該細胞シートを培養容器から剥離した後に、細胞シートを浮遊培養することにより、間葉系幹細胞集塊が得られる。具体的には、例えば、後述する工程（ａ’）により、間葉系幹細胞集塊を得ることができる。
　間葉系幹細胞集塊を形成する間葉系幹細胞は、骨分化能と軟骨分化能を有する間葉系幹細胞であれば特に限定されない。そのような間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、歯根膜由来間葉系幹細胞、歯肉由来間葉系幹細胞等の生体に存在する間葉系幹細胞全般が挙げられる。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から誘導する間葉系幹細胞もまた、本発明の間葉系幹細胞に含まれる。
　本発明の一実施形態において、工程（ａ）における間葉系幹細胞集塊は、間葉系幹細胞集塊が複数連結されたものであってもよい。間葉系幹細胞集塊が複数連結されたものを出発材料として、工程（ａ）および工程（ｂ）を実施することにより、大型化した細胞塊を得ることができる。従来の技術では、一定以上の大きさの移植材料が得られず、欠損部位が大きい場合には、移植に不適であったが、本発明によれば、大型化した細胞塊を提供できるため、臨床適用において極めて有利である。
　本明細書において、「軟骨誘導培地（ＣＩＭ）」とは、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の細胞（例えば、間葉系幹細胞集塊）を軟骨に誘導することが可能な培地を意味する。軟骨誘導培地は、上記定義に含まれるものであれば特に限定されず、公知である種々の軟骨誘導培地を用いることができる。軟骨誘導培地としては、例えば、ＭＳＣｇｏ　Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ　ＸＦ，Ｈｕｍａｎ（BLG社製）にＭＳＣｇｏ　Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ　ＸＦ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｍｉｘ（BLG社製）を添加した血清不含・異種動物タンパク質不含軟骨誘導培地（ＸＦ－ＣＩＭ）、血清不含のＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Promo Cell社製）等が挙げられる。また、軟骨誘導培地は、公知のプロトコールに基づいて調製したものでもよく、例えば、高グルコースＤＭＥＭ（SIGMA社製）に、０．１μＭ　デキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸、１００μｇ／ｍｌ　ピルビン酸、４０μｇ／ｍｌ　プロリン、５０ｍｇ／ｍｌ　ＩＴＳ　Ｐｒｅｍｉｘ、１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ－β１を添加した軟骨誘導培地等が使用され得る。
　本発明の一実施形態において、工程（ａ）において、間葉系幹細胞集塊の少なくとも一部が軟骨様組織を含む状態となるまで培養した後、前記工程（ｂ）を行うことが好ましい。換言すれば、工程（ａ）で得られた培養物は、軟骨様組織を含むことが好ましい。これにより、移植により適した細胞構造体を得ることができる。
　本明細書において、「間葉系幹細胞集塊の少なくとも一部が軟骨様組織を含む状態」とは、間葉系幹細胞集塊の少なくとも一部が、軟骨誘導培地での培養により、軟骨様組織に誘導された状態を意味する。間葉系幹細胞集塊中の軟骨様組織の占有率（誘導率）は、例えば、３０％以上であり、好ましくは、５０％以上であり、より好ましくは、８０％以上であり、１００％であってもよい。間葉系幹細胞集塊が軟骨様組織を含むか否かは、例えば、サフラニン－Ｏ染色等により、判定することができる。
　工程（ａ）における培養時間は、間葉系幹細胞集塊の少なくとも一部が軟骨様組織を含む状態となるまでの時間であれば特に限定されないが、例えば、１～２０日間であり、好ましくは、１．５～１０日間であり、より好ましくは、２～５日間である。
　本発明の一実施形態において、工程（ａ）の前に以下の工程を含んでいてもよい：
　工程（ａ’）：間葉系幹細胞を増殖培地で培養し、間葉系幹細胞集塊を得る工程。
　工程（ａ’）は、具体的には以下の方法により行われる。まず、間葉系幹細胞を、培養皿等の培養器を用い、コラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地で培養する。間葉系幹細胞としては、前記「工程（ａ）」の項で記載したものが使用され得る。
　工程（ａ’）における増殖培地は、間葉系幹細胞を増殖させ得る培地であればよく、公知である種々の培地を用いることができる。増殖培地としては、例えば、高グルコースＤＭＥＭに、１０％　ＦＢＳと５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸を添加した培地、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、および１００μg／ｍｌ　ストレプトマイシン含有のＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）　ＭＳＣ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ＸＳＦＭ（FUJIFILM社製）からなる血清不含・異種動物タンパク質不含増殖培地（ＸＦ－ＧＭ）等が挙げられる。好ましくは、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、および１００μg／ｍｌ　ストレプトマイシン含有のＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）　ＭＳＣ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ＸＳＦＭ（FUJIFILM社製）からなる血清不含・異種動物タンパク質不含増殖培地（ＸＦ－ＧＭ）である。この培地を用いると、後の工程（すなわち、工程（ａ）および工程（ｂ））において、より再現度高く、細胞構造体を作製できる。
　また、間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子としては、化合物、タンパク質等、結果として間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させ得るものであれば特に限定されない。そのような因子としては、例えば、アスコルビン酸、デキサメタゾン等のステロイド、サイトカイン等が挙げられ、アスコルビン酸であることが好ましい。
　間葉系幹細胞が増殖すると、シート状の細胞集団（以下、細胞シート）が形成される。細胞シートの周囲が培養器の縁に接着し、コンフルエントに達するまで増殖させる。
　その後、培養器の周壁に接着した細胞シートの縁を培養器から離間させる。例えば、細い棒体を細胞シートの縁が接着している培養器の内壁に差し込み、培養器の内壁に沿って棒体を一周移動させることにより、細胞シートを培養器から離間させることができる。これにより、細胞シートは浮遊することになる。
　この浮遊する細胞シートは、自己凝集作用によりくるまっていき、間葉系幹細胞自身が産生する細胞外マトリクス（ＥＣＭ：extracellular matrix）を利用して塊状の間葉系幹細胞集塊となる。このようにして、粒状の細胞集塊を得ることができる。
　なお、培養器は１．５～２．５ｃｍ２の円筒状のものを用いると、０．５～１．５ｍｍの粒径の細胞集塊が得られる。培養器としては、例えば、表面積２ｃｍ２の２４ウェルプレート等を用いればよい。
　（工程（ｂ））
　工程（ｂ）では、前記工程（ａ）で得られた培養物を骨分化誘導培地で培養する。工程（ａ）後に、前記培養物を骨分化誘導培地で培養することにより、骨再生療法等における移植に適した細胞構造体を作製することができる。
　本明細書において、「骨分化誘導培地（ＯＩＭ）」とは、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の細胞（例えば、間葉系幹細胞集塊）を骨に誘導することが可能な培地を意味する。骨分化誘導培地は、上記定義に含まれるものであれば特に限定されず、公知である種々の骨分化誘導培地を用いることができる。骨分化誘導培地は、例えば、血清不含誘導培地または血清含有誘導培地であり得る。血清不含誘導培地としては、例えば、血清不含・異種動物タンパク質不含骨誘導培地（ＸＦ－ＯＩＭ：ＭＳＣｇｏ　Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ＸＦ、BLG社製）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ　Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（STEMCELL Technologies社製）、血清不含骨誘導培地ＳＴＫ３（ツーセル社製）等が挙げられる。血清含有誘導培地としては、例えば、Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（タカラ社製）等が挙げられる。また、骨分化誘導培地は、公知のプロトコールに基づいて調製したものでもよく、例えば、高グルコースＤＭＥＭに、１０％　ＦＢＳ、０．１μＭ　デキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸、１０ｍＭ　グリセロフォスフェートを添加した血清含有骨分化誘導培地等が使用され得る。
　工程（ｂ）における培養時間は、表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有する細胞構造体が得られる時間であれば特に限定されないが、例えば、１～２０日間であり、好ましくは、１．５～１０日間であり、より好ましくは、２～５日間である。
　工程（ｂ）において、「間葉系幹細胞集塊」については、前記（工程（ａ））の項において記載したものが援用される。
　本発明の一実施形態において、工程（ｂ）の後に、さらに以下の工程を含んでいてもよい：
　工程（ｃ）：工程（ｂ）で得られた細胞構造体を凍結保存剤とともに凍結保存する工程。
　本製造方法において、工程（ｃ）を含むことにより、移植手術等において、直前の限られた期間内に細胞構造体の製造を行う必要がなく、移植手術が延期される事態を防ぐことができる。
　工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られた細胞構造体を、凍結保存剤とともに凍結用バイアル等の凍結保存用の容器に入れ、凍結保存する。このようにして、移植用の凍結細胞構造体を得ることができる。凍結保存剤としては、種々の細胞凍結用の保存液を用いればよく、例えば、１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、２０％ＦＢＳ、および７０％ＤＭＥＭを含有する凍結保存液の他、市販のＣｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ（タカラバイオ株式会社製）、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（和光純薬工業株式会社製）等の凍結保存液が挙げられる。
　凍結保存は、例えば、－７０～－９０℃、好ましくは、－７５～－８５℃の温度で行えばよい。また、凍結保存は、保存容器をフリーザーに入れる等、種々の手法で行うことができる。また、一カ月以上の長期保存を行う場合は、保存容器を上記温度に２４時間置いた後、液体窒素タンク（－１９６℃）に移してもよい。なお、凍結保存に際し、予備凍結は行ってもよいし、行わなくてもよい。
　〔３．細胞構造体〕
　本発明の一実施形態において、表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有し、血管（例えば、毛細血管）を含まない、細胞構造体を提供する。本細胞構造体は、移植後の生着が早く、大きな欠損部位にも適用可能であるため、骨再生療法において有用である。
　生体内では、骨発生の途中段階で、軟骨原基が形成される。しかし、生体内で形成される軟骨原基は、血管（例えば、毛細血管）を含んでいる。これに対して、本細胞構造体は、血管（例えば、毛細血管）を含まない点で、生体内で形成される軟骨原基とは明らかに異なる。
　本細胞構造体のサイズは、移植に適したサイズであることが好ましく、一般には、例えば、直径０．５～１．５ｍｍであり、好ましくは、直径０．８～１．２．０ｍｍである。本発明の一実施形態において、欠損部位が大きい場合には、本細胞構造体のサイズは、直径２．０ｍｍ超であり得る。従来の技術では、直径２．０ｍｍ超の移植材料を作製するのは困難であったが、本発明では、細胞塊を大型化することに成功しており、臨床適用において極めて有利である。欠損部位が大きい場合、本細胞構造体のサイズは、好ましくは、直径２．０ｍｍ超であり、より好ましくは、直径２．５ｍｍ超であり、さらに好ましくは、直径３．０ｍｍ超であり、特に好ましくは、直径３．５ｍｍ超である。また、本発明の一実施形態において、本細胞構造体のサイズは、さらに大きいサイズであり得て、例えば、５．０ｍｍ以上であり、好ましくは、６．０ｍｍであり、１ｃｍを超えるものであってもよい。本発明によれば、移植先の欠損部位の大きさに基づいて、本細胞構造体のサイズを適宜調整できる。
　本細胞構造体のサイズを大きくする方法としては、特に限定されないが、例えば、複数の間葉系幹細胞集塊を串刺しにした状態で連結し、本製造方法における工程（ａ）および工程（ｂ）を実施することが挙げられる。サイズの大きな細胞構造体は、例えば、実施例に記載の方法で製造できる。
　本発明の一実施形態において、本細胞構造体は、本製造方法により製造される。
　本発明の一実施形態において、本細胞構造体は、凍結された細胞構造体（「凍結細胞構造体」とも称する。）であってもよい。患者から分離したＭＳＣからＣ－ＭＳＣｓを作製し、さらに細胞構造体を作製して、その細胞構造体の機能や均一性を事前に検査することができる。そして、検査により一定品質のもののみを選別し、凍結細胞構造体として凍結保存され得る。これにより、品質管理された移植用の細胞構造体を移植日当日に確実に供給することが可能になり、移植手術が延期されるという事態を防ぐことができる。
　凍結細胞構造体は、融解後もその形態を保持し、細胞機能を失うことがないため、例えば、欠損組織に移植することで組織再生能を発揮する。本発明者らは、凍結細胞構造体が融解後も組織再生能を発揮できる理由について、以下のように推定している。すなわち、本発明者らは以前に、Ｃ－ＭＳＣｓを凍結保存液に浸漬し、－８０℃以下で凍結保存した後も、３次元的構造と細胞活性とを維持できることを明らかにした（国際公開第２０１７／１８７９４１号、Motoike et al., 2018, Stem Cell Res Ther）。これは、Ｃ－ＭＳＣｓを形作るコラーゲン等の豊富な細胞外基質タンパク質が、凍結保存時の氷晶による傷害に対して、保護効果を発揮するためである。ここで、本細胞構造体は、Ｃ－ＭＳＣｓと同様に豊富なコラーゲンを含むため、凍結保存後も軟骨内骨化による骨形成能を損なわないと推定される。なお、凍結細胞構造体の融解は、凍結細胞構造体が保存されている凍結保存容器をフリーザー等から取り出し、室温に置くことや、温浴（例えば、４０～６０℃）に置く等、種々の方法で行うことができる。
　〔４．骨再生剤〕
　本発明の一実施形態において、表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有する細胞構造体を含む、骨再生剤（以下、「本骨再生剤」と称する。）を提供する。本骨再生剤は、移植後の生着が早く、大きな欠損部位にも適用可能な細胞構造体を含むため、骨再生療法において有用である。
　本発明の一実施形態において、本骨再生剤は、前記細胞構造体以外に任意の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤としては、例えば、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤等が挙げられる。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤等は、薬学分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤の選択は、意図される治療形式および標準的薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択され得る。
　また、本発明の一実施形態において、本骨再生剤は、任意の結合剤、滑沢剤、懸濁剤等、および前記細胞構造体の生着を促進する物質をさらに含み得る。前記細胞構造体の生着を促進する物質としては、例えば、フィブリン糊等が挙げられる。
　本骨再生剤に含まれる前記添加剤の量は、特に限定されず、当業者により適宜設定され得る。
　本骨再生剤は、骨再生を目的として用いられ、適用可能な骨は特に限定されず、任意の骨に適用可能である。例えば、難治骨折、歯周炎、関節リウマチ、大腿骨頭壊死、骨形成不全症、骨粗鬆症、骨摘出後の広範囲骨欠損症例に対する骨再生療法等に好適に適用可能である。
　また、本発明の一実施形態において、本骨再生剤は、骨欠損部以外の部位に適用することもできる。骨欠損部以外の部位としては、特に限定されないが、例えば、皮下組織等が挙げられる。本骨再生剤は、骨欠損部の骨再生のみならず、それ以外の部位においても、速やかに軟骨内骨化を生じさせ、骨再生を誘導する。
　本骨再生剤を適用する対象の種としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、リス、ウサギ、イヌ、ネコ、フェレット等の哺乳動物が挙げられ、好ましくは、ヒトである。
　本骨再生剤において、「骨殻」、「軟骨様組織」および「細胞構造体」については、前記〔２．細胞構造体の製造方法〕および〔３．細胞構造体〕の項において記載したものが援用される。
　〔５．その他〕
　本発明の一実施形態において、骨疾患を患う対象に、本細胞構造体または本骨再生剤を投与することを含む、骨疾患の処置方法を提供する。
　本発明の一実施形態において、本細胞構造体または本骨再生剤の投与は、通常は、移植を意図するが、骨再生療法で適用される任意の方法が含まれる。
　骨疾患としては、特に限定されないが、例えば上記した、難治骨折、歯周炎、関節リウマチ、大腿骨頭壊死、骨形成不全症、骨粗鬆症、骨摘出後の広範囲骨欠損症例等が挙げられる。
　本明細書において「処置」とは、処置を必要とする対象に対して処置効果をもたらす行為を意味する。処置効果とは、予防効果および治療効果を包含する概念であり、例えば、以下の類型の効果であり得る。
　（１）本細胞構造体または本骨再生剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の発症を防止する、またはリスクを低減する。
　（２）本細胞構造体または本骨再生剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の再発を防止する、またはリスクを低減する。
　（３）本細胞構造体または本骨再生剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、またはリスクを低減する。
　（４）本細胞構造体または本骨再生剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。
　（５）本細胞構造体または本骨再生剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または進行を防止する。
　（６）本細胞構造体または本骨再生剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または進行速度を低減する。
　本発明の一実施形態において、本細胞構造体または本骨再生剤の投与量は、欠損部位の範囲、疾患の重篤度、全身的骨代謝能の低下度、年齢等に応じて、当業者により、適宜、設定され得る。
　本発明の別の一実施形態において、骨疾患の処置における使用のための本細胞構造体または本骨再生剤を提供する。
　また、本発明の他の一実施形態において、骨疾患の処置用医薬の製造における、本細胞構造体の使用を提供する。
＜１＞（ａ）間葉系幹細胞集塊を軟骨誘導培地で培養する工程、および
　（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養物を骨分化誘導培地で培養する工程、を含む、細胞構造体の製造方法。
＜２＞前記細胞構造体が、表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有する、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞前記間葉系幹細胞集塊は、間葉系幹細胞集塊が複数連結されたものである、＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞前記工程（ａ）において、前記間葉系幹細胞集塊の少なくとも一部が軟骨様組織を含む状態となるまで培養した後、前記工程（ｂ）を行う、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の製造方法。
＜５＞工程（ａ）の前に、さらに以下の工程を含む、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の製造方法：
　（ａ’）間葉系幹細胞を増殖培地で培養し、間葉系幹細胞集塊を得る工程。
＜６＞表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有し、
　血管を含まない、細胞構造体。
＜７＞前記細胞構造体が、直径２．０ｍｍ超である、＜６＞に記載の細胞構造体。
＜８＞表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有する細胞構造体を含む、骨再生剤。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　〔１．間葉系幹細胞の培養および細胞構造体の作製〕
　（Ｃ－ＭＳＣｓの作製）
　Lonza社から購入したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を４８ウェル培養プレート（Corning社製）に１．０×１０５　細胞／ウェルの細胞密度で播種した。当該細胞を、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、および１００μg／ｍｌ　ストレプトマイシン含有のＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）　ＭＳＣ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ＸＳＦＭ（FUJIFILM社製）からなる血清不含・異種動物タンパク質不含増殖培地（ＸＦ－ＧＭ）で４日間培養し、十分なＥＣＭを産生させた。これを、マイクロピペットチップを用いて鈍的に剥離し、ＥＣＭとＭＳＣｓとから構成される細胞シートの状態で浮遊させた。得られたＭＳＣｓ／ＥＣＭ複合体をｕｌｔｒａ－ｌｏｗ－ｂｉｎｄｉｎｇプレート（Iwaki社製）に移し、ＸＦ－ＧＭで３日間培養することで、直径８００～１０００μｍ程の球形をした細胞集塊Ｃ－ＭＳＣｓを得た。
　（Ｃ－ＭＳＣｓからの細胞構造体の誘導）
　得られたＣ－ＭＳＣｓを、ＭＳＣｇｏ　Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ　ＸＦ,　Ｈｕｍａｎ（BLG社製）にＭＳＣｇｏ　Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ　ＸＦ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
　Ｍｉｘ（BLG社製）を添加した血清不含・異種動物タンパク質不含軟骨誘導培地（ＸＦ－ＣＩＭ）(２５０μｌ／ウェル）にて、浮遊培養を継続した。ＸＦ－ＣＩＭ培養の１０日後に、２５０μｌ／ウェルで血清不含・異種動物タンパク質不含骨誘導培地（ＸＦ－ＯＩＭ：ＭＳＣｇｏ　Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ＸＦ（BLG社製））に培地替えし、７日間または１４日間培養を行った。この培養の間、２日ごとに培地替えを行った（実施例１）。
　比較対象として、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＣＩＭ培地で１７日間または２４日間培養したもの（比較例１）、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＯＩＭ培地で１７日間または２４日間培養したもの（比較例２）、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＯＩＭで１０日間培養し、次いで、ＸＦ－ＣＩＭで７日間培養したもの（比較例３）、Ｃ－ＭＳＣｓを増殖培地（ＸＦ－ＧＭ）(２５０μｌ／ウェル）で１７日間浮遊培養したもの（比較例６）を用いた。
　（細胞構造体の組織学的評価）
　ＨＥ染色・アリザリンレッド染色・サフラニン－Ｏ染色、およびマイクロＣＴ撮影を、以下の方法で行った。
　＜ＨＥ染色・アリザリンレッド染色・サフラニン－Ｏ染色＞
　得られたサンプル（細胞構造体または軟骨様組織）をＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋を行った。８μｍの連続切片を作成し、ＨＥ染色およびアリザリンレッド染色を行った。また、組織学的構造を観察するために、得られたサンプル（細胞構造体または軟骨様組織）を１０％　エチレンジアミンテトラ酢酸にて脱灰処理後、パラフィン包埋し、８μｍ切片を作成しＨＥ染色およびサフラニン－Ｏ染色を行った。
　＜マイクロＣＴ撮影＞
　得られたサンプル（細胞構造体または軟骨様組織）をＰＢＳで洗浄後、マイクロＣＴ（Skyscan 1176, Bruker, Billerica, MA, USA）で撮影した。撮影条件は、管電圧５０ｋＶ、管電流０．５ｍＡ、ピクセルサイズ８μｍ、ステップ角度０．５度、露光時間２３０ｍｓで行った。
　（結果-１）
　Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＣＩＭのみで培養した比較例１では、図２に示すように、サフラニン－Ｏに濃染する軟骨様組織が形成され（図２の下段）、その内部には軟骨細胞が豊富に観察された。しかし、アリザリンレッドに染まるようなミネラルの沈着は生じなかった（図２の中段）。
　また、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＯＩＭのみで培養した比較例２では、外周のミネラル沈着が生じなかった（図１４の右図の下段）。また、軟骨様組織も形成されず（図１２の下段、図１４の右図の中段）、線維性の構造を主とした細胞集塊であった。
　さらに、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＯＩＭで培養し、次いで、ＸＦ－ＣＩＭで培養した比較例３では、アリザリンレッドに染まるような外周のミネラル沈着が生じなかった（図示せず）。また、図１３の下段に示すように、軟骨様組織も形成されず、線維性の構造を主とした細胞集塊であった。
　加えて、Ｃ－ＭＳＣｓを増殖培地（ＸＦ－ＧＭ）のみで培養した比較例６では、細胞塊が収縮し、線維性の組織のままであった（図１４の左図）。
　一方、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＣＩＭで培養し、次いで、ＸＦ－ＯＩＭで培養して作製した実施例１では、図３に示すように、外周にはアリザリンレッドに濃染するミネラルの沈着した骨殻を有し、内部にはサフラニン－Ｏに赤く濃染する軟骨様組織（軟骨基質とそれに内包される軟骨細胞からなる細胞集塊）を有する細胞構造体が得られた（図３の１段目、２段目、４段目）。さらに、脱灰して観察すると、このミネラルが沈着する外層において、細胞死は認められず、類骨様基質の内部に存在する細胞が観察された（図３の３段目）。
　また、比較例１の細胞集塊、および実施例１の細胞構造体について、マイクロＣＴ撮影を行ったところ、比較例１の細胞集塊では不透過物は認められず、ミネラルの沈着は生じていないことが確認できた（図４）。一方、実施例１の細胞構造体は、球形の外周を不透過物が形作り、内部は空洞様に撮影された（図５）。
　これらの結果より、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＣＩＭで培養し、次いで、ＸＦ－ＯＩＭで培養することにより、骨殻を備える軟骨様組織を有する細胞構造体が作製できることが示された。
　〔２．細胞構造体の免疫不全マウス頭蓋冠骨欠損への移植〕
　得られた細胞構造体の移植による骨再生効果を検討するために、免疫不全ＳＣＩＤマウス頭蓋冠欠損モデルを用いた。すなわち、免疫不全ＳＣＩＤマウスの頭蓋冠に、トレフィンバーを用いて、直径２．４ｍｍ骨欠損を作製した。この作製した欠損部に対し、１個の細胞構造体または軟骨様組織を、人工材料などを用いることなく直接移植した（実施例２：実施例１の細胞構造体を移植（図６）、比較例４：比較例１の軟骨様組織を移植（図９））。移植４週後および８週後に動物を屠殺し、頭蓋冠を取り出しマイクロＣＴによる撮影を行った後に、ＨＥ染色・サフラニン－Ｏ染色、およびＴＲＡＰ染色にて骨組織の観察を行った。マイクロＣＴ撮影、ＨＥ染色・サフラニン－Ｏ染色、およびＴＲＡＰ染色は、以下の方法で行った。
　＜マイクロＣＴ撮影＞
　得られたサンプル（マウス頭蓋冠）をＰＢＳで洗浄後、マイクロＣＴ（Skyscan 1176, Bruker, Billerica, MA, USA）で撮影した。撮影条件は、管電圧５０ｋＶ、管電流０．５ｍＡ、ピクセルサイズ８μｍ、ステップ角度０．５度、露光時間２３０ｍｓで行った。
　＜ＨＥ染色・サフラニン－Ｏ染色＞
　マイクロＣＴ撮影後のマウス頭蓋冠を、４％パラホルムアルデヒドで固定後、１０％　エチレンジアミンテトラ酢酸にて脱灰処理を行い、次いで、パラフィン包埋した。８μｍの切片を作成し、ＨＥ染色およびサフラニン－Ｏ染色を行った。
　＜ＴＲＡＰ染色＞
　上述のパラフィン包埋後の薄切切片をＰＢＳで洗浄後、ＴＲＡＰ染色キット（294-67001、Wako社製）のＴＲＡＰ染色液（酒石酸溶液・産生フォスファターゼ基質液）を加え、３７℃で１０分間作用させた。なお、ＴＲＡＰ染色では、破骨細胞が染色される。
　（結果-２）
　移植４週後において、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＣＩＭのみで作製した軟骨様組織の移植（比較例４）では、マイクロＣＴ撮影によって欠損部に不透過物が観察された（図１０）。しかし、ＨＥ染色・サフラニン－Ｏ染色によって、その不透過物内部は軟骨基質であり、骨形成は未完成であることが分かった（図１１）。すなわち、比較例４では、大部分が軟骨基質軟からなる組織が認められ、ＴＲＡＰ染色に陽性の破骨細胞はほとんど存在していなかった（図１５）。また、移植８週後になると、軟骨基質が吸収し、血管の侵入と破骨細胞が観察された（図１６）。
　一方、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＣＩＭで培養し、次いで、ＸＦ－ＯＩＭで培養して作製した細胞構造体の移植（実施例２）では、欠損部に骨様組織形成を生じていた（図７）。また、実施例２では、サフラニン－Ｏに染色される軟骨様組織が一部残存していたものの、血管・血球系細胞の侵入を伴う骨髄様構造が認められ、軟骨内骨化の様式を経た骨形成が生じたことが分かった（図８）。さらに、実施例２では、移植４週後には軟骨基質が吸収し、そこに血管の侵入とＴＲＡＰ陽性の破骨細胞が観察された（図１５）。加えて、移植８週後には、軟骨基質は完全に消失し、骨髄構造を有する骨組織が観察された（図１６）。比較例４との比較により、実施例２では、より早く軟骨内骨化が生じ、より確実な骨再生が行われることが示された。
　〔３．細胞構造体の免疫不全マウス皮下への移植〕
　得られた細胞構造体の骨欠損部以外における移植の効果を検討するために、免疫不全ＳＣＩＤマウスを用いた。すなわち、免疫不全ＳＣＩＤマウスの背側の皮膚を切開し、細胞構造体または軟骨様組織を、人工材料などを用いることなく直接移植した（実施例３：実施例１の細胞構造体を移植、比較例５：比較例１の軟骨様組織を移植）。移植８週後に、肉眼所見、ならびにマイクロＣＴによる撮影、およびＨＥ染色・サフラニン－Ｏ染色にて移植組織の状態を確認した。マイクロＣＴ撮影、およびＨＥ染色・サフラニン－Ｏ染色は、以下の方法で行った。
　＜マイクロＣＴ撮影＞
　得られたサンプル（皮下移植部位）をＰＢＳで洗浄後、マイクロＣＴ（Skyscan 1176, Bruker, Billerica, MA, USA）で撮影した。撮影条件は、管電圧５０ｋＶ、管電流０．５ｍＡ、ピクセルサイズ８μｍ、ステップ角度０．５度、露光時間２３０ｍｓで行った。
　＜ＨＥ染色・サフラニン－Ｏ染色＞
　マイクロＣＴ撮影後の皮下移植部位を、４％パラホルムアルデヒドで固定後、１０％　エチレンジアミンテトラ酢酸にて脱灰処理を行い、次いで、パラフィン包埋した。８μｍの切片を作成し、ＨＥ染色およびサフラニン－Ｏ染色を行った。
　（結果-３）
　移植８週後において、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＣＩＭで培養し、次いで、ＸＦ－ＯＩＭで培養して作製した細胞構造体の移植（実施例３）では、血管の流入した移植体が肉眼所見で確認できた（図１７の右図）。さらに、その移植体は、軟骨基質が完全に吸収されており、骨髄構造を有する骨組織であった（図１８）。
　一方、Ｃ－ＭＳＣｓをＸＦ－ＣＩＭのみで作製した軟骨様組織の移植（比較例５）では、一部骨様組織が観察されたものの、血流に乏しく、軟骨基質の残存した軟骨内骨化途中のような組織体が観察された（図１７および１８）。
　以上の結果から、比較例５との比較により、実施例３では、骨欠損部ではなく、皮下組織においても、より早く軟骨内骨化が生じ、より確実な骨再生が行われることが示された。
　〔４．細胞塊複合化よる細胞構造体の大型化〕
　上記〔１．間葉系幹細胞の培養および細胞構造体の作製〕に記載の培養工程における３日目から（すなわち、Ｃ－ＭＳＣｓが得られた後）、Ｃ－ＭＳＣｓの細胞塊を４粒、滅菌したステンレス針に串刺しにし、６ｃｍディッシュ／５ｍｌ培地で、互いに接着した状態で培養を継続した（実施例４）。
　（結果-４）
　ＸＦ－ＣＩＭ　１０日間＋ＸＦ－ＯＩＭ　７日間での培養終了時点（１７日目）には、Ｃ－ＭＳＣｓの細胞塊が互いに融合し、５ｍｍ以上の棒状の大型細胞構造体を作製することができた（図１９）。
　本発明は、再生医療等の分野において、好適に利用することができる。

Claims (8)

  1. 　（ａ）間葉系幹細胞集塊を軟骨誘導培地で培養する工程、および
    　（ｂ）前記工程（ａ）で得られた培養物を骨分化誘導培地で培養する工程、を含む、細胞構造体の製造方法。
  2. 　前記細胞構造体が、表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記間葉系幹細胞集塊は、間葉系幹細胞集塊が複数連結されたものである、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　前記工程（ａ）において、前記間葉系幹細胞集塊の少なくとも一部が軟骨様組織を含む状態となるまで培養した後、前記工程（ｂ）を行う、請求項１または２に記載の製造方法。
  5. 　工程（ａ）の前に、さらに以下の工程を含む、請求項１または２に記載の製造方法：
    　（ａ’）間葉系幹細胞を増殖培地で培養し、間葉系幹細胞集塊を得る工程。
  6. 　表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有し、
    　血管を含まない、細胞構造体。
  7. 　前記細胞構造体が、直径２．０ｍｍ超である、請求項６に記載の細胞構造体。
  8. 　表面の少なくとも一部に骨殻を備える軟骨様組織を有する細胞構造体を含む、骨再生剤。

     
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