WO2023243732A1 - 皮膚老化のバイオマーカー、皮膚老化の判定方法、皮膚老化改善物質のスクリーニング方法 - Google Patents

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雅俊 羽賀
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    • G01N2800/7042—Aging, e.g. cellular aging

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for skin aging, a method for determining skin aging, and a method for screening skin aging improving substances.
  • Non-Patent Document 1 Skin aging is a multifaceted process that is influenced by various endogenous factors (e.g., cell aging) and extrinsic factors (e.g., ultraviolet rays, irritants, etc.) (Non-Patent Document 1).
  • endogenous factors e.g., cell aging
  • extrinsic factors e.g., ultraviolet rays, irritants, etc.
  • Non-Patent Document 2 a hypothesis has been proposed that molecular changes in blood associated with aging may contribute to the aging of living organisms.
  • Non-Patent Document 3 a hypothesis has been proposed that molecular changes in blood associated with aging may contribute to the aging of living organisms.
  • the present invention aims to provide a biomarker consisting of a protein or a fragment thereof for use in determining skin aging.
  • the present invention aims to provide a method for determining skin aging in a subject, which is characterized by measuring a protein or a fragment thereof in a blood sample of the subject.
  • the present inventors discovered for the first time a blood protein that increases in a gender-specific manner with aging, leading to the completion of the present invention. Furthermore, it was also discovered for the first time that these proteins suppress collagen fiber formation in fibroblasts, suppress the secretion of collagen precursors, and cause abnormalities in the fibril structure of the extracellular matrix. It was also revealed that these proteins suppress the barrier function in the epidermis and suppress the expression of type I collagen precursor in the dermis. Based on these findings, the present inventors have developed a biomarker for use in determining skin aging, a method for determining skin aging, and a method for screening skin aging improving substances.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • Osteomodulin OMD
  • chondroadherin CH1
  • collagen type XI alpha 2 chain COL11A2
  • leucine-rich repeat-containing protein 15 LHB
  • lutropin subunit beta LHB
  • glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta CGA/LHB
  • glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta CGA/FSHB
  • Osteomodulin OMD
  • chondroadherin CH1
  • collagen type XI alpha 2 chain collagen type alpha 2 chain (collagen type alpha 2 chain (COL11A2)
  • leucine-rich repeat-containing protein 15 LRRC15
  • glycoprotein hormone alpha chain/choriogonadotropin subunit beta 3/choriogonadotropin subunit beta 7 Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)
  • lutropin subunit beta LHB
  • glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta (LHB) at least one species selected from the group consisting of glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)
  • a method for screening skin aging-improving substances comprising examining changes in the expression level or concentration of proteins or fragments thereof.
  • the skin aging biomarker of the present invention is a protein that increases with skin aging and thus serves as a physiological indicator of the progress of aging.
  • the method for determining skin aging of the present invention measures proteins that increase in aging skin, that is, the skin aging biomarker of the present invention, and determines skin aging.
  • a skin aging improving substance can be found by examining changes in the concentration of the skin aging biomarker protein of the present invention before and after ingesting a test substance. Since the skin aging-improving substance found by the method of the present invention can control symptoms related to skin aging, it can be expected to be effective against symptoms caused by progression of skin aging.
  • FIG. 2A shows an immunofluorescence image of type I collagen fibers of NHDF cells among the evaluation results regarding osteomodulin collagen production in Test Example 2.
  • FIG. 2B shows the results of collagen production among the evaluation results regarding osteomodulin collagen production in Test Example 2.
  • FIG. 2C shows a scanning electron microscope image of the extracellular matrix of NHDF among the evaluation results regarding osteomodulin collagen production in Test Example 2.
  • FIG. 2D shows the results of quantification and distribution of collagen fiber diameter among the evaluation results regarding osteomodulin collagen production in Test Example 2.
  • FIG. 3 shows the results of gene expression in Test Example 3 (A: OCLN, B: OLDN1, C: FLG, D: LOR, E: KRT1).
  • FIG. 3 shows the results of gene expression in Test Example 3 (A: OCLN, B: OLDN1, C: FLG, D: LOR, E: KRT1).
  • FIG. 3 shows the results of gene expression in Test Example 3 (A: OCLN, B: OLDN1, C: FLG, D: LOR,
  • FIG. 4A shows H&E staining of HSE among the results of histological analysis of human skin equivalent (HSE) in Test Example 4.
  • FIG. 4B shows the measurement results of transepidermal water loss (TEWL) among the results of the histological analysis of human skin equivalent (HSE) in Test Example 4.
  • FIG. 4C shows immunostaining of KRT1/KRT14 among the results of histological analysis of human skin equivalent (HSE) in Test Example 4.
  • FIG. 4D shows immunostaining of FLG/CLDN1 among the results of histological analysis of human skin equivalent (HSE) in Test Example 4.
  • FIG. 4E shows Ki67 immunostaining among the results of histological analysis of human skin equivalent (HSE) in Test Example 4.
  • FIG. 4A shows H&E staining of HSE among the results of histological analysis of human skin equivalent (HSE) in Test Example 4.
  • FIG. 4B shows the measurement results of transepidermal water loss (TEWL) among the results of the histological analysis of
  • FIG. 4F shows the results of the gene expression levels of KRT1, FLG, LOR, OCLN, and CLDN1 in the epidermis of HSE, among the results of histological analysis of human skin equivalent (HSE) in Test Example 4.
  • FIG. 4G shows the results of the gene expression level of COL1A1 in the dermis of HSE, among the results of histological analysis of human skin equivalent (HSE) in Test Example 4.
  • FIG. 5A shows an immunostaining fluorescence image of type I collagen fibers of NHDF cells among the results of evaluation regarding collagen production of CHAD and LRRC15 in Test Example 5.
  • FIG. 5B shows the results of the collagen production amount among the evaluation results regarding collagen production of CHAD and LRRC15 in Test Example 5.
  • the biomarker according to this embodiment is an aging biomarker, which means a factor that changes with aging, and is capable of determining and predicting aging, particularly aging conditions such as the degree of progress of skin aging. Further, by determining and predicting aging using the biomarker according to this embodiment, improvement and deterioration of aging can be determined and predicted.
  • Ameliorating aging means inhibiting the aging state, inhibiting the progression of aging, and promoting reversal of aging (rejuvenation).
  • aging refers to a decline in function that occurs in individuals, organs, tissues, cells, etc. that occurs after the growth period.
  • skin aging refers to the decline in skin function that occurs with aging, and in a broader sense, it refers to the effects of various endogenous factors (e.g., cell aging) and extrinsic factors (e.g., ultraviolet rays, irritants, etc.). It refers to the decline in skin function that occurs as a result of being affected.
  • the biomarker according to this embodiment can serve as an indicator of a physiological aging state or a pathological aging state, particularly a physiological aging state or a pathological aging state of the skin.
  • Physiological aging is a decline in physiological function that inevitably progresses with age
  • pathological aging refers to a decline in function that causes a pathological condition.
  • the biomarkers according to this embodiment are biomarkers for use in determining skin aging, and include osteomodulin (OMD), chondroadherin (CHAD), collagen type XI alpha 2 chain ( collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2), leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15), glycoprotein hormone alpha chain/choriogonadotropin subunit beta 3/choriogonadotropin subunit Beta 7 (Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)), lutropin subunit beta (LHB), glycoprotein hormone alpha chain/Lutropin subunit beta ( A protein selected from the group consisting of glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta (CGA/LHB)) and glycoprotein hormone alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB) or a fragment thereof.
  • OMD osteomodulin
  • the above proteins or fragments thereof are a group of proteins that increase in the blood with aging, especially in women, and act on skin cells to accelerate aging.
  • Each of the above-mentioned biomarker proteins is a conventionally known protein and has the characteristics shown in Tables 1-1 and 1-2.
  • the biomarker proteins according to this embodiment include osteomodulin (OMD), chondroadherin (CHAD), and leucine.
  • OMD osteomodulin
  • CHCD chondroadherin
  • leucine leucine-rich repeat-containing protein 15
  • the size of the protein of the biomarker is preferably 180 kDa or less, more preferably 150 kDa or less, even more preferably 120 kDa or less, even more preferably 80 kDa or less, and particularly preferably 66 kDa or less, from the viewpoint of sensitivity in determining skin aging.
  • a body fluid sample such as blood, serum, plasma, urine, secretion, interstitial fluid, synovial fluid, cerebrospinal fluid, lymph fluid, etc.
  • blood, serum, and plasma are more preferred, and serum and plasma are even more preferred.
  • the protein or fragment thereof is contained in a subject sample, preferably a body fluid sample, more preferably a blood sample, even more preferably a serum sample.
  • the above-mentioned subject is preferably a mammal or a human, more preferably a human, and even more preferably a biological female human.
  • an increase in the expression or concentration of the protein or its fragment in a subject sample (preferably in a body fluid sample, more preferably in a blood sample, still more preferably in a serum sample)
  • Figure 2 shows the progression of skin aging in a subject.
  • a reduction in the expression or concentration of the protein or fragment thereof in a subject sample (preferably a body fluid sample, more preferably a blood sample, even more preferably a serum sample) improves skin aging in the subject. shows.
  • the subject sample After the subject sample is collected from the subject, it may be appropriately prepared according to the measurement method.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • RIA radioimmunoassay
  • immunoprecipitation Western blotting, etc.
  • ELISA is preferred because it is simple.
  • a sample containing a biomarker protein according to this embodiment is exposed to a solid support (eg, a microtiter plate, etc.).
  • a solid support eg, a microtiter plate, etc.
  • Biomarker proteins in a sample are immobilized on a support and directly detected using an enzyme-conjugated antibody or the like specific to the biomarker proteins.
  • the method for determining skin aging of the present invention uses osteomodulin (OMD), chondroadherin (CHAD), and collagen type XI alpha 2 chain in a blood sample of a subject. (COL11A2)), leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15), Glycoprotein hormones alpha chain/choriogonadotropin subunit beta 3/choriogonadotropin subunit beta 7 chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)), lutropin subunit beta (LHB), glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin at least one protein selected from the group consisting of glycoprotein hormones alpha chain/follitropin subunit beta (CGA/FSHB); A method for determining skin aging in a subject, characterized by measuring fragments.
  • the method for determining skin aging includes (i) measuring the amount or concentration of each of the above proteins or fragments thereof in a body fluid sample of a subject, preferably a blood sample of a subject, more preferably a serum sample of a subject; and (ii) determining skin aging of the subject by comparing the measured value obtained in (i) with a reference value serving as a standard for determining skin aging.
  • the reference value may be a body fluid level of a healthy individual, preferably a blood level, more preferably a serum level, or may be an average value for healthy individuals of the subject's age, or may be a previous measurement of the subject. It may be a value, or it may be an average value for people who have the same situation as the subject.
  • the measured value obtained in step (i) is higher than the reference value, it is determined that skin aging is more advanced than the standard, or that skin aging is more advanced than before.
  • the measured value obtained in step (i) above is lower than the standard value, it means that skin aging is slower than normal, the progress of skin aging is slower than normal, or skin aging has improved from before. It is determined that the progression of skin aging has been suppressed or that the reversal of skin aging (rejuvenation) has occurred.
  • the progress state of skin aging can be appropriately evaluated using biomarkers.
  • the above-mentioned protein or fragment thereof used in the method corresponds to the above-mentioned biomarker of the present invention, and the description in the section on biomarkers (paragraphs 0012 to 0022) can be applied to the specific explanation.
  • the screening method for skin aging-improving substances of the present invention includes osteomodulin (OMD), chondroadherin (CHAD), and collagen in blood samples of a subject before and after ingesting a test substance.
  • OMD osteomodulin
  • CHCD chondroadherin
  • collagen collagen in blood samples of a subject before and after ingesting a test substance.
  • collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2), leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15), glycoprotein hormone alpha chain/choriogonadotropin subunit beta 3/Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7), lutropin subunit beta (LHB), glycoprotein hormone alpha chain glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta (CGA/LHB) and glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB) It is characterized by examining changes in the expression level or concentration of at least one protein selected from the group or its fragment.
  • the screening method for a skin aging improving substance includes (i) measuring the amount or concentration of the protein or its fragment in a blood sample of a subject before ingesting the test substance; (iii) After a certain period of time from step (ii) above, determining the amount of the protein or its fragment (same as that measured in step (i) above) in the blood sample of the subject; Step of measuring concentration, (iv) Comparing the measured values of (i) and (iii) above, if the value of (iii) is lower than (i), or if the values of (i) and (iii) are the same This includes the step of determining that the test substance is a skin aging improving substance, and determining that the test substance is not a skin aging improving substance if the value of (iii) is higher than (i).
  • the method of the present invention it is possible to find healthcare materials, pharmaceutical materials, cosmetic materials, etc. that improve or prevent skin aging, suppress the progression of skin aging, and promote reversal of aging (rejuvenation).
  • the above-mentioned protein or fragment thereof used in the method corresponds to the above-mentioned biomarker of the present invention, and the description in the section on biomarkers (paragraphs 0012 to 0022) can be applied to the specific explanation.
  • test examples but the present invention is not limited thereto.
  • blending amounts in the following test examples and the like indicate mass % unless otherwise specified.
  • test conditions such as culture conditions in each test example were the same, except for the difference in the substances added, unless otherwise specified.
  • controls and negative controls were provided for every test to accurately evaluate the effects of the biomarkers of the present invention.
  • ⁇ Cell culture and materials> ⁇ Dermal fibroblasts: Newborn normal human dermal fibroblasts (NHDFs (NB)), lot number 05882 (Kurabo, Osaka, Japan) were used, and 10% fetal bovine serum and 1% antibiotics and antifungal agents were added. Cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA). - Cultured human keratinocytes: Newborn normal human epidermal keratinocytes (NHEK (NB)), lot number 7609 (Kurabo, Osaka, Japan) were used and cultured in Humedia-KG2 medium (Kurabo, Japan).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • - Cultured human keratinocytes Newborn normal human epidermal keratinocytes (NHEK (NB)), lot number 7609 (Kurabo, Osaka, Japan) were used and cultured in Humedia-KG2 medium (Kurabo, Japan
  • -Cell culture conditions Cultured at 37°C in a 5% CO 2 incubator.
  • - Recombinant human OMD (ab27632) was obtained from Abcam (Cambridge, UK).
  • - Pro-Collagen 1 ELISA kit Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA, DY6220-05 was purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA).
  • ⁇ Method> ⁇ Method for counting the number of viable cells: It was stained with Hoechst 33342 (Dojindo, Kumamoto, Japan) and counted with ImageXpress® (Molecular Devices, California, USA).
  • NHDF ⁇ Scanning electron microscope (SEM): NHDF was plated using a similar protocol to that sample. Recombinant OMD (0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, or 1 ⁇ M) was added to the treatment groups. After 6 days of treatment, the NHDF was fixed with a fixative and the sample was subjected to SEM observation.
  • SEM Sccanning electron microscope
  • This cDNA was mixed with SYBR TM Green PCR Master Mix and primers for KRT1, KRT10, OCLN, CLDN1, FLG, LOR, IVL, KRT1, KRT10, COL1A1, p21, and OMD (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, US). qPCR was performed using a real-time PCR device (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's protocol. Transcript levels were normalized to GAPDH.
  • TEWL transepidermal water loss
  • LDH -Lactic dehydrogenase assay: Performed using Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan) according to the instructions.
  • HSE Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit
  • 100 ⁇ l of medium was transferred to a 96-well plate and LDH assay was performed.
  • proteins such as OMD were added and left to stand for 48 hours, and then 100 ⁇ l of the supernatant was transferred to a 96-well plate and LDH assay was performed.
  • This cluster is composed of eight proteins: osteomodulin (OMD), chondroadherin (CHAD), collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2), and leucine.
  • LRRC15 Rich repeat-containing protein 15
  • CGA / CGB3 / CGB7 Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3 /Choriogonadotropin subunit beta 7
  • LHB lutropin subunit beta
  • CGA/LHB glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta
  • CGA/FSHB glycoprotein hormones alpha chain/follitropin subunit beta
  • Figure 1 shows the results of a detailed analysis of age-related changes in these eight proteins.
  • these eight proteins decreased between ages 20 and 40 and increased between ages 45 and 55.
  • these proteins increased in abundance around age 65 and gradually decreased with age. Therefore, these eight proteins were found to vary specifically in women.
  • the present inventors have identified osteomodulin (OMD), chondroadherin (CHAD), leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15), glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7), Because the size of lutropin subunit beta (LHB), glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta (CGA/LHB), and glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB) is less than 66 kDa, they can pass through blood vessels in the skin. Because it can reach the skin tissue, it was thought that it would affect the skin tissue and cells.
  • the present inventors have revealed that OMD suppresses the production of type I collagen in fibroblasts and reduces the diameter of collagen fibers.
  • OMD was thought to suppress the gene expression of OCLN, CLDN1, LOR, and KRT1 in NHEK and promote the decline of barrier function.
  • RNA extraction For quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), the epidermis and dermis of HSE were separated with forceps. Before RNA extraction, tissues were crushed with Biomasher II (Nippi, Tokyo, Japan), centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 min, and the supernatant was used for extraction with an RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). .
  • NHDFs were plated in a 24-well plate at a density of 38,000 cells per well and cultured overnight in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic-antimycotin. The next day, the medium was replaced with DMEM (without fetal bovine serum) supplemented with 1% antibiotic-antimycoplasma agent and 1 mg/ml L-ascorbic acid (013-12061, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan). . OMD (0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, 5 ⁇ M) was added to the treatment groups.
  • FIG. 4F shows that HSE containing OMD suppressed the expression level of COL1A1 in the dermis.
  • OMD changes the shape of dermal fibroblasts into an elongated one, which is thought to be due to the disappearance of extracellular collagen and irregular cytoskeletal signal transmission.
  • OMD affects the aggregates of collagen fibers and the diameter of collagen fibers, it is possible that OMD reduces the quality of type I collagen. It is also known that menopausal skin has higher extensibility and laxity than non-menopausal skin, and OMD, which increases with age, has been shown to affect the diameter size of collagen fibers. It was thought that this might be the cause.
  • OMD Since the quality of collagen, such as orientation and fiber width, changes with endogenous aging playing a more central role, OMD, which reduces the quality and quantity of collagen in the skin, is a biological It is believed to be particularly useful as a marker.
  • OMD which increases with age, is a useful biomarker because it affects both the epidermis and dermis of the skin.
  • OMD is a useful biomarker for determining skin aging, so by targeting OMD in cells and tissues and examining changes in its expression level and concentration, we can screen for OMD-inhibiting components and OMD production-suppressing components. It is thought that it is possible to screen for ingredients that have the effect of suppressing aging of the dermis and epidermis.
  • the amount of type I collagen in the culture supernatant under each condition was measured by collagen I ⁇ I enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The measured value of each sample was calculated when the measured value of the negative control was set as 100 (FIG. 5B).
  • a control was prepared by adding only L-ascorbic acid without adding CHAD or LRRC15.
  • a negative control was one in which L-ascorbic acid and protein (CHAD, LRRC15) were not added.
  • the control to which L-ascorbic acid was added showed high staining intensity, but the staining intensity was significantly lower in fibroblasts to which 1 ⁇ M OMD, CHAD, and LRRC15 were added in addition to L-ascorbic acid. decreased.
  • the ELISA results showed that type I collagen production was suppressed in fibroblasts supplemented with 1 ⁇ M OMD, CHAD, and LRRC15. In particular, the effect of suppressing type I collagen production in fibroblasts to which CHAD and LRRC15 were added was remarkable.
  • CHAD and LRRC15 which are proteins of 66 kDa or less, can pass through blood vessels in the skin and reach the skin tissue, so if the blood concentration increases due to aging, etc. It is thought to have a greater effect on cells.
  • the present invention is applicable to all technical fields that require biomarkers for determining skin aging and their use, detection of the progress state of skin aging, determination of skin aging, and screening of skin aging improving substances, such as skin aging. It can be used to detect the occurrence of symptoms, predict the degree of symptom progression, predict the risk of symptom progression, investigate the causes of skin aging, confirm the effect of suppressing skin aging by drugs, etc., and confirm the therapeutic effect of skin aging. It can be used particularly in fields such as medicine, cosmetics, and food.

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Abstract

本発明は、皮膚老化の判定における使用のための、タンパク質又はそのフラグメントからなる、バイオマーカーを提供することを目的とする。あるいは、被験体の血液サンプル中のタンパク質又はそのフラグメントを測定することを特徴とする、被験体における皮膚老化の判定方法を提供することを目的とする。あるいは、被験体に被験物質を摂取させる前後の被験体の血液サンプル中のタンパク質又はそのフラグメントの発現レベル又は濃度の変化を調べることを特徴とする、皮膚老化改善物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。　本発明は、皮膚老化の判定における使用のための、オステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択されるタンパク質又はそのフラグメントからなる、バイオマーカーである。

Description

皮膚老化のバイオマーカー、皮膚老化の判定方法、皮膚老化改善物質のスクリーニング方法
　本特許出願は、２０２２年６月１７日に出願された米国仮出願第６３／３５３，０７０号及び２０２２年９月６日に出願された米国仮出願第６３／４０３，９９１号の優先権を主張し、これらの内容はFlorence. et al.(2023).IFSCC Magazine,26(1),7-16.でパブリッシュされ、その全体が参照により本書に組み込まれる。
　本発明は、皮膚老化のバイオマーカー、皮膚老化の判定方法、皮膚老化改善物質のスクリーニング方法に関する。
　皮膚の老化は、様々な内因性要因（例えば細胞老化）と外因性要因（例えば紫外線、刺激物等）の影響を受ける多面的なプロセスである（非特許文献１）。
　循環器系を共有するような若齢マウスと老齢マウスとの間のパラバイオシスに関し、若齢血清に存在する因子が老齢マウスの組織や臓器に再生作用を示す一方で、若齢マウスの臓器には老齢血清由来の因子による変性作用が見られることが報告されている（非特許文献２）。これに基づき、加齢に伴う血液中の分子変化が生体の老化に寄与しているのではないかという仮説が提唱されている（非特許文献３）。しかし、血液中のタンパク質の変化が皮膚に及ぼす影響についての研究は、まだ十分とは言えない。特に皮膚の加齢の内在的要因として、血中タンパク質の変化による影響は十分に知られていない。
Zhang, S., & Duan, E. (2018). Cell transplantation, 27(5), 729-738. Conboy, I. et al. (2005). Nature, 433(7027), 760-764. Lehallier, B. et al. (2019). Nature medicine, 25(12), 1843-1850
　本発明は、皮膚老化の判定における使用のための、タンパク質又はそのフラグメントからなる、バイオマーカーを提供することを目的とする。あるいは、被験体の血液サンプル中のタンパク質又はそのフラグメントを測定することを特徴とする、被験体における皮膚老化の判定方法を提供することを目的とする。あるいは、被験体に被験物質を摂取させる前後の被験体の血液サンプル中のタンパク質又はそのフラグメントの発現レベル又は濃度の変化を調べることを特徴とする、皮膚老化改善物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、加齢に伴い、性別特異的に増加する血液中タンパク質を初めて見出し、本発明を完成するに至った。更に、これらのタンパク質が線維芽細胞におけるコラーゲン線維形成を抑制し、コラーゲン前駆体の分泌を抑制し、細胞外マトリクスのフィブリル構造に異常を起こすことも初めて見出した。また、これらのタンパク質は、表皮におけるバリア機能を抑制し、真皮におけるＩ型コラーゲン前駆体の発現を抑制することも明らかにした。これらの知見に基づき、本発明者らは皮膚老化判定における使用のためのバイオマーカー、皮膚老化の判定方法、皮膚老化改善物質のスクリーニング方法を開発した。
　すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］皮膚老化の判定における使用のための、オステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択されるタンパク質又はそのフラグメントからなる、バイオマーカー。
［２］上記タンパク質又はそのフラグメントが、被験体の血液サンプル中に含まれる、［１］に記載のバイオマーカー。
［３］被験体の血液サンプル中の上記タンパク質又はそのフラグメントの発現の増加、又は濃度の増加が、被験体の皮膚老化の進行を示す、［２］に記載のバイオマーカー。
［４］被験体の血液サンプル中の上記タンパク質又はそのフラグメントの発現の低下、又は濃度の減少が、被験体の皮膚老化の改善を示す、［２］に記載のバイオマーカー。
［５］被験体の血液サンプル中のオステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はそのフラグメントを測定することを特徴とする、被験体における皮膚老化の判定方法。
［６］被験体に被験物質を摂取させる前後の被験体の血液サンプル中のオステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はそのフラグメントの発現レベル又は濃度の変化を調べることを特徴とする、皮膚老化改善物質のスクリーニング方法。
　本発明の皮膚老化のバイオマーカーは、皮膚の老化により増加するため、老化の進行を示す生理学的指標になるタンパク質である。本発明の皮膚老化の判定方法は、老化が進行している皮膚で増加するタンパク質、すなわち本発明の皮膚老化のバイオマーカーを測定し、皮膚老化を判定する。本発明の皮膚老化改善物質のスクリーニング方法によると、被験物質の摂取前後での本発明の皮膚老化のバイオマーカータンパク質の濃度の変化を調べ、皮膚老化改善物質を見出すことができる。本発明の方法によって見出される皮膚老化改善物質は、皮膚老化に関する症状を制御することができるため、皮膚老化が進行することによって起こる症状に対して効果を奏することが期待できる。
８種類のタンパク質について女性および男性の経年のｚスコアの軌跡を示す。 図２Ａは、試験例２におけるOsteomodulinのコラーゲン産生に関する評価結果のうち、NHDF細胞のＩ型コラーゲン線維の免疫蛍光画像を示す。 図２Ｂは、試験例２におけるOsteomodulinのコラーゲン産生に関する評価結果のうち、コラーゲン産生量の結果を示す。 図２Ｃは、試験例２におけるOsteomodulinのコラーゲン産生に関する評価結果のうち、NHDFの細胞外マトリックスの走査型電子顕微鏡画像を示す。 図２Ｄは、試験例２におけるOsteomodulinのコラーゲン産生に関する評価結果のうち、コラーゲン線維径の定量化と分布の結果を示す。 図３は、試験例３における遺伝子発現の結果を示す（Ａ：OCLN、Ｂ：OLDN1、Ｃ：FLG、Ｄ：LOR、Ｅ：KRT1）。 図４Ａは、試験例４におけるヒト皮膚等価物（HSE）の組織学的解析の結果のうち、HSEのH＆E染色を示す。 図４Ｂは、試験例４におけるヒト皮膚等価物（HSE）の組織学的解析の結果のうち、経表皮水分損失（TEWL）の測定結果を示す。 図４Ｃは、試験例４におけるヒト皮膚等価物（HSE）の組織学的解析の結果のうち、KRT1/KRT14の免疫染色を示す。 図４Ｄは、試験例４におけるヒト皮膚等価物（HSE）の組織学的解析の結果のうち、FLG/CLDN1の免疫染色を示す。 図４Ｅは、試験例４におけるヒト皮膚等価物（HSE）の組織学的解析の結果のうち、Ki67の免疫染色を示す。 図４Ｆは、試験例４におけるヒト皮膚等価物（HSE）の組織学的解析の結果のうち、HSEの表皮におけるKRT1、FLG、LOR、OCLN、およびCLDN1の遺伝子発現量の結果を示す。 図４Ｇは、試験例４におけるヒト皮膚等価物（HSE）の組織学的解析の結果のうち、HSEの真皮におけるCOL1A1の遺伝子発現量の結果を示す。 図５Ａは、試験例５におけるCHAD、LRRC15のコラーゲン産生に関する評価の結果のうち、NHDF細胞のＩ型コラーゲン線維の免疫染色蛍光画像を示す。 図５Ｂは、試験例５におけるCHAD、LRRC15のコラーゲン産生に関する評価の結果のうち、コラーゲン産生量の結果を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
［バイオマーカー］
　本実施形態に係るバイオマーカーは、老化バイオマーカーであり、加齢にともなって変動するファクターを意味し、老化、特に皮膚老化の進行度等の老化状態を判定、予測できるものである。また、本実施形態に係るバイオマーカーによる老化の判定、予測によって、老化の改善および改悪を判定、予測できる。老化の改善とは、老化状態の抑止、老化の進行抑制、老化の逆行促進（若返り）を意味する。ここで、老化とは、成長期を過ぎておこる個体、器官、組織、細胞などに現れる機能の低下を意味する。皮膚老化とは、狭義には、加齢に伴って現れる皮膚の機能低下を意味し、広義には、様々な内因性要因（例えば細胞老化）と外因性要因（例えば紫外線、刺激物等）の影響を受けて現れる皮膚の機能低下を意味する。本実施形態に係るバイオマーカーは、生理的老化状態や病的老化状態、特に皮膚の生理的老化状態や病的老化状態の指標となりえる。生理的老化は加齢とともに必然的に進行する生理的な機能低下であり、病的老化は病的状態を引き起こすような機能の低下を意味する。
　本実施形態に係るバイオマーカーは、皮膚老化の判定における使用のためのバイオマーカーであり、オステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択されるタンパク質又はそのフラグメントからなる。
　上記タンパク質又はそのフラグメントは、加齢に伴い、特に女性において、血液中で増加するタンパク質群であり、皮膚細胞に対して老化を促進させる方向に作用するものである。上記バイオマーカーの各タンパク質は従来公知のタンパク質であり、表１－１及び１－２に示す特徴を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本実施形態に係るバイオマーカーのタンパク質としては、皮膚老化の判定の感度の観点から、上記８種のうち、オステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）が好ましい。バイオマーカーのタンパク質のサイズとしては、皮膚老化の判定の感度の観点から、１８０ｋＤａ以下が好ましく、１５０ｋＤａ以下がより好ましく、１２０ｋＤａ以下が更に好ましく、８０ｋＤａ以下が更により好ましく、６６ｋＤａ以下が特に好ましい。
　本実施形態に係るバイオマーカーを測定する際には、被験体試料として体液サンプルを用いることが好ましく、例えば、血液、血清、血漿、尿、分泌物、間質液、滑液、髄液、リンパ液が挙げられ、これらのうち、血液、血清、血漿がより好ましく、血清、血漿がさらに好ましい。上記タンパク質又はそのフラグメントは、被験体試料、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプル、さらに好ましくは血清サンプル中に含まれる。
　上記被験体としては、哺乳動物、ヒトが好ましく、ヒトがより好ましく、生物学上の女性のヒトがさらに好ましい。
　本実施形態に係るバイオマーカーにおいては、被験体試料中（好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプル、さらに好ましくは血清サンプル中）の上記タンパク質又はそのフラグメントの発現の増加、又は濃度の増加が、被験体の皮膚老化の進行を示す。逆に、被験体試料中（好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプル、さらに好ましくは血清サンプル中）の上記タンパク質又はそのフラグメントの発現の低下、又は濃度の減少が、被験体の皮膚老化の改善を示す。被験体試料は、被検体から採取した後に、測定方法に合わせて適切に調製してもよい。
　上記被験体試料を用いて本実施形態に係るバイオマーカーの発現量、濃度等を測定する方法としては、各タンパク質の従来公知の検出方法、測定方法を用いることができる。例えば、ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降法、ウェスタンブロット等が挙げられ、中でもELISAが簡便であり好ましい。
　ELISAの一実施形態では、本実施形態に係るバイオマーカータンパク質を含有するサンプルを、固体の支持体（例えば、マイクロタイタープレート等）に曝す。サンプル中のバイオマーカータンパク質が支持体に固定され、バイオマーカータンパク質に特異的な酵素共役抗体等を用いて直接検出される。
［皮膚老化の判定方法］
　本発明の皮膚老化の判定方法は、被験体の血液サンプル中のオステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はそのフラグメントを測定することを特徴とする、被験体における皮膚老化の判定方法である。
　本実施形態に係る皮膚老化の判定方法は、（i）被験体の体液サンプル、好ましくは被験体の血液サンプル、より好ましくは被験体の血清サンプル中の上記各タンパク質又はそのフラグメント量又は濃度を測定することと、(ii)（i）で得られた測定値と、皮膚老化判定の基準となる基準値とを比較して被験体の皮膚老化を判定すること、を含むことを特徴とする。上記基準値は、健常な個体の体液レベル、好ましくは血液レベル、より好ましくは血清レベルとしてもよいし、上記被験体の年齢の健常人における平均値としてもよいし、上記被験体の以前の測定値であってもよいし、上記被験体と同様の状況を有する人における平均値であってもよい。上記工程(i)で得られた測定値が、上記基準値よりも高い場合には、皮膚老化が標準より進んでいる、又は以前より皮膚老化が進んだと判定される。逆に上記工程(i)で得られた測定値が、上記基準値よりも低い場合には、皮膚老化が標準より遅れている、皮膚老化の進行が標準より遅い、以前より皮膚老化が改善した、皮膚老化の進行が抑制された、又は皮膚老化の逆行（若返り）が起こったと判定される。本実施形態の判定方法によると、バイオマーカーにより皮膚老化の進行状態を適切に評価することができる。なお、当該方法において使用する上記タンパク質又はそのフラグメントは、上述の本発明のバイオマーカーに該当し、具体的な説明はバイオマーカーの項（００１２～００２２段落）の記載を適用できる。
［皮膚老化改善物質のスクリーニング方法］
　本発明の皮膚老化改善物質のスクリーニング方法は、被験体に被験物質を摂取させる前後の被験体の血液サンプル中のオステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はそのフラグメントの発現レベル又は濃度の変化を調べることを特徴とする。
　本実施形態に係る皮膚老化改善物質のスクリーニング方法は、（i）被験物質を摂取させる前の被験体の血液サンプル中の上記タンパク質又はそのフラグメントの量又は濃度を測定する工程、（ii）被験体に被験物質を摂取させる工程、（iii）上記工程（ii）から一定期間後に、被験体の血液サンプル中の上記タンパク質又はそのフラグメント（上記工程（i）で測定したものと同じもの）の量又は濃度を測定する工程、（iv）上記（i）と（iii）の測定値を比較し、（i）より（iii）の値が低い場合、又は（i）と（iii）の値が同じ場合には、被験物質は皮膚老化改善物質であると判断し、（i）より（iii）の値が高い場合には、被験物質は皮膚老化改善物質ではないと判断する工程、を含む。本発明の方法によると、皮膚老化を改善・予防したり、皮膚老化の進行を抑制したり、老化の逆行（若返り）を促進するヘルスケア素材や医薬品素材や化粧品素材などを見出すことができる。なお、当該方法において使用する上記タンパク質又はそのフラグメントは、上述の本発明のバイオマーカーに該当し、具体的な説明はバイオマーカーの項（００１２～００２２段落）の記載を適用できる。
　以下、試験例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、以下の試験例等における配合量は特記しない限り質量％を示す。なお、各試験例における培養条件などの試験条件は、特記しない限り、添加する物質の違いを除いて、同じ条件で行った。また、全ての試験毎にコントロールやネガティブコントロールを供し、本発明のバイオマーカーの効果を正確に評価した。
　以下、試験例では特記しない限り、次の細胞培養、材料、方法を使用した。
〈細胞培養と材料〉
・真皮線維芽細胞：新生児正常ヒト真皮線維芽細胞（NHDFs（NB））、ロット番号05882（Kurabo, Osaka, Japan）を用い、１０％牛胎児血清および１％抗生物質、抗真菌剤を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM； Gibco, USA）において培養した。
・培養ヒトケラチノサイト：新生児正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK（NB））、ロット番号7609（Kurabo, Osaka, Japan）を用い、Humedia-KG2培地（Kurabo, Japan）において培養した。
・細胞の培養条件：５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。
・組換えヒトOMD（ab27632）はAbcam（Cambridge，UK）より入手した。
・プロコラーゲン1ELISAキット（Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA、DY6220-05）はR&D Systems（米国ミネソタ州ミネアポリス）より購入した。
〈方法〉
・生存細胞数の計数方法：
Hoechst 33342 (Dojindo, Kumamoto, Japan)で染色し、ImageXpress（登録商標）(Molecular Devices, California, USA)で計数した。
・走査型電子顕微鏡(SEM)：
NHDFは、そのサンプルと同様のプロトコルを用いてプレーティングした。処理群にリコンビナントOMD（０．０１μＭ、０．１μＭ、または１μＭ）を添加した。６日間処理後、NHDFを固定液で固定し、サンプルをSEM観察に供した。
・定量的リアルタイムRT-PCR：
RNeasy mini kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて培養細胞からRNAを抽出し、NanoDrop UV-Vis spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, US）を用いてRNA濃度を決定した。qPCRのために、RNAはReverTraAce qPCR RT Master Mix（東洋紡、大阪、日本）を用いて第一鎖のcDNAに逆転写された。このcDNAをSYBRTMGreen PCR Master MixとKRT1、KRT10、OCLN、CLDN1、FLG、LOR、IVL、KRT1、KRT10、COL1A1、p21、OMDのプライマー（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ、US）と混合し、リアルタイムPCR装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて製造者のプロトコルに従いqPCRを実施した。転写レベルは、GAPDHに対して正規化した。
・経表皮水分損失（TEWL）の測定：Vapometer SWL-5001とSWL2040-09プローブ（Delfin, Kuopio, Finland）を用いた。組織培養で維持されたHSEには、少なくとも１５分間、温度と湿度の環境条件に順応させた培地を使用する。同じ発明者が各HSEについて３回に分けてTEWL測定を行い、各TEWLの平均を算出してTEWL値とした。
・乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）アッセイ： Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan)を用い、説明書に従って実施した。HSEモデルについては、１００μｌの培地を９６ウェルプレートに移し、LDHアッセイを実施した。培養ヒト線維芽細胞およびケラチノサイトについては、OMD等のタンパク質を添加して４８時間静置した後、上清１００μｌを９６ウェルプレートに移し、LDHアッセイを行った。
［試験例１］血液中タンパク質のコホート解析
　本試験例では、血液中のタンパク質をクラスター化し、年齢ごとにヒートマップで可視化することにより、年齢による変化を評価した。INTERVAL cohort (Cambridge, UK)の１８～７６歳の健常者３３０１人（女性１６１６人、男性１６８５人）から３２８３個の血漿タンパク質の3K SOMAscanプロテオミクスｚスコア測定値を使用した。ｚスコアの変化は、Ｒのpheatmapパッケージ（バージョン1.0.12）を用いて、ヒトの寿命にわたって同様のダイナミクスを持つタンパク質をクラスター化することで可視化した。教師なし階層クラスタリングとクラスター化ヒートマップを用いて、女性および男性の全年齢にわたって類似した軌道を持つ血漿タンパク質をグループ化した。
　その結果、女性では年齢が上がるにつれて負のｚスコアから正のｚスコアへ変化するユニークなクラスターを認めた。このクラスターは８個のタンパク質で構成され、オステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）であることを、本発明者らは初めて見出した。
　これら８個のタンパク質の年齢による変化の詳細を解析した結果を図１に示す。女性において、これら８個のタンパク質は２０～４０歳頃に減少し、４５～５５歳頃に増加した。男性においては、これらのタンパク質は６５歳前後で存在量が増加し、年齢を経るにつれて徐々に減少した。したがって、これら８個のタンパク質は女性において特異的に変動することが分かった。
　本発明者らは、osteomodulin （OMD）、chondroadherin (CHAD)、leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)、Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)、lutropin subunit beta (LHB)、glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB）、及びglycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)のサイズが６６ｋＤａ以下であることから、皮膚の血管を通過して皮膚組織に到達することができるため、皮膚の組織や細胞に影響を与えると考えた。
［試験例２］Osteomodulinがコラーゲン産生に与える影響の評価
　本試験例では、Osteomodulin（OMD）のコラーゲン産生への影響を評価した。具体的には、培養正常ヒト線維芽細胞（NHDF）に各濃度のOMDを添加して６日間培養し、Ｉ型コラーゲンを免疫染色して蛍光画像を得た（図２Ａ）。コラーゲンＩαＩの酵素結合免疫吸着法（ELISA）により各条件におけるＩ型コラーゲン量を測定した（図２Ｂ）。OMDの添加濃度は図中に示す。OMDを添加しないものをコントロール（Ctrl）とした。走査型電子顕微鏡を使用してNHDFの細胞外マトリックスを観察した結果を図２Ｃに示す。さらに、走査型電子顕微鏡画像から少なくとも６００個のフィブリルを解析し、NHDFのコラーゲン線維径の定量化および分布を解析した結果を図２Ｄに示す。
　図２Ａに示す通り、Ｉ型コラーゲンは細胞外コンパートメントで染色され、OMDを添加した線維芽細胞で染色強度は低かった。図２Ｂに示す通り、ELISAの結果、線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン産生は、添加したOMDの濃度依存的に抑制された。図２Ｃに示す通り、OMDを添加した場合は、コントロールと比較して細胞外マトリックスにおけるコラーゲン線維が細くなっていることが観察され、OMDによりコラーゲンの会合が抑制されることが分かった。図２Ｄに示す通り、OMDを添加したNHDFでは、コントロールでのコラーゲン線維の平均直径である４０ｎｍより小さい直径を有するコラーゲン繊維が増加していた（図２Ｄの４０ｎｍのバーはコントロールとの比較を分かりやすくするための補助線である）。
　本発明者らによって、OMDは線維芽細胞においてＩ型コラーゲンの産生を抑制し、コラーゲン線維の径を小さくすることが明らかになった。
［試験例３］Osteomodulinが皮膚バリア機能関連遺伝子発現に与える影響の評価
　本試験例では、OMDによる皮膚バリア機能関連遺伝子発現への影響を評価した。具体的には、ヒトケラチノサイト（NHEK）にOMDを０．１μＭ又は１μＭとなるように添加し、タイトジャンクション遺伝子OCLNおよびCLDN1、末端分化マーカーFLGおよびLOR、表皮分化マーカーKRT1の遺伝子発現を測定した。参照遺伝子としてGAPDHを使用した。OMDを添加しないこと以外は同じ条件で試験を行ったものをコントロールとした。結果を図３Ａ～図３Ｅに示す。
　NHEKにOMDを添加すると、タイトジャンクション遺伝子OCLNおよびCLDN1と、末端分化マーカーLOR、表皮分化マーカーKRT1の発現は、コントロールよりも低下した（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｄ、図３Ｅ）。末端分化マーカーFLGの発現は、コントロールと同程度であった（図３Ｃ）。なお、OMD添加による細胞毒性の有無を確認する目的で、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出アッセイを行ったところ、OMD添加群とコントロールとでＬＤＨ放出において差を認めなかった。この結果から、OMDによる細胞毒性は各遺伝子発現の評価に影響を及ぼしていないことが確認された。
ことから、
　以上のことから、OMDはNHEKにおいてOCLN、CLDN1、LOR、KRT1の遺伝子発現を抑制し、バリア機能の低下を促進すると考えられた。
［試験例４］Osteomodulinがヒト皮膚等価物(HSE) モデルに与える影響の評価
　本試験例では、ヒト皮膚等価物(HSE)モデル（T-skinTM、EPISKIN SA）を１μＭのOMDを添加した培地で５日間培養し、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）で固定し、パラフィンに包埋してH＆E染色と免疫染色を行った（図４Ａ）。また、上記５日間培養後の細胞について経表皮水分損失（TEWL）を測定した（図４Ｂ）。
　定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のために、HSEの表皮と真皮を鉗子で分離した。RNA抽出の前に、組織をBiomasherII（ニッピ、東京、日本）で潰し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をRNeasy Mini Kit（Qiagen、Hilden、ドイツ）での抽出に用いた。
　NHDFを２４ウェルプレートに１ウェルあたり３８，０００個の密度でプレーティングし、１０％ウシ胎児血清と１％抗生物質－抗マイコチンを添加したDMEM中で一晩培養した。翌日、培地を１％抗生物質－抗マイコプラズマ剤と１ｍｇ／ｍｌ　Ｌ－アスコルビン酸（013-12061、富士フイルム和光純薬株式会社、日本、大阪）を添加したDMEM（ウシ胎児血清なし）に交換した。処理群にOMD（０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭ）を添加した。６日間処理した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｉ型コラーゲンを標的とする一次抗体（C2456、モノクローナル、Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国およびNB600-408、ポリクローナル、Novus Biologicals、コロラド、米国）と４℃で一晩インキュベートした。次にAlexa488-またはAlexa546コンジュゲート二次抗体を用い、３７℃で１時間インキュベートした。HSE組織切片を、Ki67（ab16667, Abcam, Cambridge, UK）、KRT1（ab185628, Abcam）、KRT14（ab7800, Abcam）、FLG（ab17808, Abcam）、およびCLDN1（ab211737, Abcam）を標的とする一次抗体と３７℃で２時間インキュベートした。次に、Alexa488またはAlexa594コンジュゲート二次抗体を用い、３７℃（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US）で１時間インキュベートした。サンプルを検査し、オールインワン蛍光顕微鏡BZ-X800（キーエンス、大阪、日本）を用いて画像を撮影した。なお、OMDを添加しないことを除いて上記と同じ条件のものをコントロール（Ctrl）とした。
　図４Ａに示す通り、OMDを添加したHSEでは、表皮の肥厚が観察され、細胞核の周囲に観察される空胞様構造物の数が増加した。図４Ｂに示す通り、OMDを添加したHSEでは、TEWLが増加し、表皮のバリア機能が抑制された。また、図４Ｃに示す通り、コントロールのHSEではKRT1が勾配を持った分布をしているのに対し、OMDを添加したHSEでは、基底部上部の表皮に集中して確認され、OMD添加によってHSEにおけるKRT1分布に異常が生じた。この作用機序により、OMDによる表皮のバリア機能抑制が生じると考えられた。図４Ｄに示す通り、FLG/CLDN1の免疫染色による染色領域について、コントロールのHSEではFLGとCLDN1の染色領域が明確に分離して見られたが、OMDを添加したHSEでは染色領域が顆粒層上に重複して見られた。図４Ｅに示す通り、OMDを添加したHSEでは、コントロールと比較してKi67陽性細胞が減少しており、内在性老化の兆候を示す指標の一種である「基底層の細胞の増殖抑制」を確認した。図４Ｆに示す通り、OMDを添加したHSEでは、コントロールと比較して炎症性サイトカインネットワークに関与するKRT1の遺伝子発現が抑制され、末端分化遺伝子FLG、LOR、タイトジャンクション遺伝子OCLNの遺伝子発現も抑制されたことから、皮膚がOMDに暴露されることで、皮膚のバリア機能が抑制されることが分かった。図４Ｇでは、OMDを添加したHSEでは、真皮においてCOL1A1の発現量が抑制されたことを示す。
　更年期の女性の皮膚は、matrisome産生の低下から乾燥状態へと変化することが知られているが、加齢と共に増加するOMDが表皮のバリア機能を低下させ、コラーゲン産生やコラーゲン線維形成を抑制することがその一因であると考えられる。このことから、OMDは皮膚老化の判定における有用なバイオマーカーとなると考えられた。
　また、OMDが真皮線維芽細胞の形状を伸長型に変化させることは、細胞外コラーゲンの消失や細胞骨格のシグナル伝達が不規則になることによるものであると考えられる。
　OMDがコラーゲン線維の集合体やコラーゲン線維の直径に影響を与えることから、OMDはＩ型コラーゲンの質を低下させている可能性が考えられる。また、更年期の皮膚は非更年期の皮膚と比較して、伸展性や弛緩性が高いことが知られているが、加齢と共に増加するOMDがコラーゲン線維の直径サイズに影響を与えていることが原因となって起こっている可能性が考えられた。
　配向性や繊維幅などのコラーゲンの質は、内因性老化がより中心的な役割を担って変化することから、皮膚のコラーゲンの質と量を低下させるOMDは、皮膚老化を判定するためのバイオマーカーとして特に有用であると考えられる。
　Ｉ型コラーゲンの産生量と質が損なわれると、シワやたるみ等が発生し、皮膚の外観に悪い影響を及ぼす。また、老化した肌や更年期の肌において、肌の乾燥は不快感やバリア機能の低下を引き起こすことから、大きな懸念事項である。加齢と共に増加するOMDは皮膚の表皮と真皮の両方に影響を与えることから有用なバイオマーカーであると言える。
　OMDは皮膚老化を判定するための有用なバイオマーカーであることから、細胞や組織中のOMDをターゲットとして、その発現量や濃度の変化を調べることにより、OMD阻害成分、OMD産生抑制成分をスクリーニングし、真皮と表皮の老化抑制の効果を奏する成分をスクリーニングすることができると考えられる。
［試験例５］CHAD、LRRC15がコラーゲン産生に与える影響の評価
　本試験例では、chondroadherin（以下、CHADともいう）、leucine-rich repeat-containing protein 15（以下、LRRC15ともいう）のコラーゲン産生への影響を評価した。具体的には、培養正常ヒト線維芽細胞（NHDF）に１ｍｇ／ｍｌ　Ｌ－アスコルビン酸（Vitamin C）（013-12061、富士フイルム和光純薬株式会社、日本、大阪）並びに、OMD、CHADまたはLRRC15を１μＭ添加して６日間培養し、Ｉ型コラーゲンを免疫染色して蛍光画像を得た（図５Ａ）。コラーゲンＩαＩの酵素結合免疫吸着法（ELISA）により各条件における培養上清中のＩ型コラーゲン量を測定した。ネガティブコントロールの測定値を１００とした場合の各サンプルの測定値を算出した（図５Ｂ）。CHAD、LRRC15を添加せずに、Ｌ－アスコルビン酸のみ添加したものをコントロールとした。Ｌ－アスコルビン酸およびタンパク質（CHAD、LRRC15）を添加しないものをネガティブコントロールとした。
　図５Ａに示す通り、Ｌ－アスコルビン酸を添加したコントロールは高い染色強度を示したが、Ｌ－アスコルビン酸に加えて１μＭのOMD、CHAD、LRRC15を添加した線維芽細胞では、染色強度は顕著に低下した。図５Ｂに示す通り、ELISAの結果、Ｉ型コラーゲンの産生は、１μＭのOMD、CHAD、LRRC15を添加した線維芽細胞で抑制された。特にCHAD、LRRC15を添加した線維芽細胞でのＩ型コラーゲン産生抑制効果は顕著であった。
　本発明者らによって、CHAD、LRRC15によりＩ型コラーゲンの産生は抑制され、コラーゲン線維の形態や分泌状態は乱れることが明らかにされた。OMDと同様に、６６ｋＤａ以下のタンパク質であるCHAD、LRRC15は皮膚の血管を通過して皮膚組織に到達することができるため、加齢等によって血中濃度が上昇した場合には、皮膚の組織や細胞へより大きな影響を及ぼすと考えられる。
　本発明は、皮膚老化の判定のためのバイオマーカー、及びその使用、皮膚老化の進行状態の検出、皮膚老化の判定、皮膚老化改善物質のスクリーニングを必要とする全ての技術分野、例えば、皮膚老化による症状の発生の検出、症状進行度の予測、症状の進行リスク予測、皮膚老化の原因究明、医薬品等による皮膚老化の抑制効果の確認、皮膚老化の治療効果の確認等に利用することができ、特に医薬、化粧、食品等の分野に利用可能である。

Claims (6)

  1. 　皮膚老化の判定における使用のための、オステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択されるタンパク質又はそのフラグメントからなる、バイオマーカー。
  2. 　上記タンパク質又はそのフラグメントが、被験体の血液サンプル中に含まれる、請求項１に記載のバイオマーカー。
  3. 　被験体の血液サンプル中の上記タンパク質又はそのフラグメントの発現の増加、又は濃度の増加が、被験体の皮膚老化の進行を示す、請求項２に記載のバイオマーカー。
  4. 　被験体の血液サンプル中の上記タンパク質又はそのフラグメントの発現の低下、又は濃度の減少が、被験体の皮膚老化の改善を示す、請求項２に記載のバイオマーカー。
  5. 　被験体の血液サンプル中のオステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はそのフラグメントを測定することを特徴とする、被験体における皮膚老化の判定方法。
  6. 　被験体に被験物質を摂取させる前後の被験体の血液サンプル中のオステオモジュリン（osteomodulin （OMD））、コンドロアドヘリン（chondroadherin (CHAD)）、コラーゲンＸＩ型　アルファ２鎖（collagen type XI alpha 2 chain (COL11A2)）、ロイシン－リッチリピート－含有タンパク質１５（leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ３／コリオゴナドトロピン　サブユニット　ベータ７（Glycoprotein hormones alpha chain/Choriogonadotropin subunit beta 3/Choriogonadotropin subunit beta 7 (CGA / CGB3 / CGB7)）、ルトロピン　サブユニット　ベータ（lutropin subunit beta (LHB)）、グリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／ルトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ lutropin subunit beta （CGA/LHB））、及びグリコプロテイン　ホルモン　アルファ鎖／フォリトロピン　サブユニット　ベータ（glycoprotein hormones alpha chain/ follitropin subunit beta (CGA/FSHB)）から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はそのフラグメントの発現レベル又は濃度の変化を調べることを特徴とする、皮膚老化改善物質のスクリーニング方法。
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DATABASE UniProtKB 25 May 2022 (2022-05-25), ANONYMOUS : "RecName: Full=Osteomodulin", XP093118194, Database accession no. Q99983 *
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